JP2019530664A - 抗線維症シアリダーゼ阻害剤化合物および使用の方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、抗線維症性シアリダーゼ阻害剤化合物およびそのような化合物を使用して線維症を予防または阻害する方法に関する。本開示はまた、そのような化合物を使用して線維細胞の形成またはそれらの活性を制御する方法にも関する。本化合物は、抗体と低分子を両方含んでいてもよい。本方法は、線維症患者または線維症を発症するリスクがある患者に、本化合物を患者における少なくとも１つのシアリダーゼが阻害される様式で投与するステップを含んでいてもよい。

Description

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＨＬ１１８５０７の下の政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

技術分野
本開示は、抗線維症化合物、およびそのような化合物を使用して、線維症を予防または阻害する方法に関する。本化合物は、抗体と低分子とを両方含んでいてもよい。本方法は、線維症患者または線維症を発症するリスクがある患者に、本化合物を投与するステップを含んでいてもよい。

背景
線維細胞は、傷害に対する身体の応答および炎症において重要な役割を果たす細胞の特殊な種類である。線維細胞は、それらがＣＤ１４＋末梢血単球から分化するとき形成される。線維細胞は、造血（血液産生）細胞（ＣＤ４５、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ３４）とストローマ（構造組織）細胞（Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンならびにフィブロネクチン）との両方のマーカーを発現する。成熟した線維細胞は、サイトカイン、細胞外マトリックスタンパク質、および血管新生促進分子を分泌する。

線維細胞および線維細胞が細胞外に提示または放出する分子はしばしば、瘢痕組織が発達した結果として線維症を引き起こす。傷害に応答する正常な創傷治癒の代わりに、線維症が起こると（これは、不適切な線維細胞形成または活性に起因する可能性がある）、その程度が過剰に長い時間にわたり大きすぎる場合、または不適切な位置で起こる場合、有害である。

その結果、身体における線維細胞の形成およびその活性の制御が、有害な線維症の制御を助ける可能性があり、それによって、その結果生じるあらゆる疾患または障害が回避または処置される。

要旨
本開示は、本明細書に開示される化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せを、ヒトにおける少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害するのに十分な量および時間でヒトに投与することによって、ヒトにおける線維症を予防または阻害する方法を提供する。

本開示は、本明細書に開示される化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せを、ヒトにおけるトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）の活性またはレベルを阻害するのに十分な量および時間でヒトに投与することによって、ヒトにおける線維症を予防または阻害する方法をさらに提供する。

上記の方法は、互いに組み合わせてもよく、そして、単独で、または相互排他的であることが明確でない限り組合せて、以下の追加の特徴の１つまたは複数をさらに含んでいてもよい。ｉ）化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せを投与することができる；ｉｉ）血清アミロイドタンパク質（ＳＡＰ）を脱シアリル化することにおいて少なくともヒトノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）の活性を阻害することができる；ｉｉｉ）ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトノイラミニダーゼ２（ＮＥＵ２）の活性を阻害することができる；ｉｖ）ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトノイラミニダーゼ３（ＮＥＵ３）の活性を阻害することができる；ｖ）ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトノイラミニダーゼ４（ＮＥＵ４）の活性を阻害することができる；ｖｉ）α（２，６）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害することができる；ｖｉｉ）α（２，６）結合を有する末端のシアル酸に対するヒトにおけるすべての野生型ヒトシアリダーゼの活性を阻害することができる；ｖｉｉｉ）α（２，３）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害することができる；ｉｘ）線維細胞の形成または活性化を、ＳＡＰに対するヒトシアリダーゼ活性の阻害の結果として阻害することができる；ｘ）線維細胞の形成または活性化を、ＴＧＦ−β１のレベルまたは活性に対するヒトシアリダーゼ活性の阻害の結果として阻害することができる；ｘｉ）線維芽細胞の増殖または活性化を、ＴＧＦ−β１のレベルまたは活性に対するヒトシアリダーゼ活性の阻害の結果として阻害することができる；ｘｉｉ）化合物１〜５８の少なくとも１つをヒトに全身投与することができる；ｘｉｉｉ）化合物１〜５８の少なくとも１つを、ヒトのヒトシアリダーゼ活性が異常に高い領域に局所的に投与することができる；ｘｉｖ）化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せを、ヒトにおける少なくとも２つのヒトシアリダーゼの活性を阻害するのに十分な量および時間でヒトに投与することができる。

本開示はまた、少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性部位に結合する少なくとも１つの単離されたヒトまたはヒト化モノクローナル抗体をヒトに投与することによって、ヒトにおける線維症を予防または阻害する方法であって、抗体が、ヒトにおける少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害するのに十分な量および時間で投与される、方法も提供する。

本開示は、少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性部位に結合する少なくとも１つの単離されたヒトまたはヒト化モノクローナル抗体をヒトに投与することによって、ヒトにおける線維症を予防または阻害する方法であって、抗体が、ヒトにおいてＴＧＦ−β１の活性を阻害するのに十分な量および時間で投与される方法をさらに提供する。

上記の方法は、互いに組み合わせてもよく、そして、単独で、または相互排他的であることが明確でない限り組合せて以下の追加の特徴の１つまたは複数をさらに含んでいてもよい。ｉ）ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ１の活性を阻害することができる；ｉｉ）ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ２の活性を阻害することができる；ｉｉｉ）ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ３の活性を阻害することができる；ｉｖ）ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ４の活性を阻害することができる；ｖ）α（２，６）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害することができる；ｖｉ）α（２，３）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害することができる；ｖｉｉ）α（２，６）結合を有する末端のシアル酸に対する患者におけるすべてのヒトシアリダーゼの活性を阻害することができる；ｖｉｉｉ）線維細胞の形成または活性化を、ＳＡＰに対するヒトシアリダーゼ活性の阻害の結果として阻害することができる；ｉｘ）少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性部位に結合する少なくとも２つの単離されたヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を、ヒトにおける少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害するのに十分な量および時間で投与することができる。

さらに、化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せを投与することを対象とする任意の上記の方法と、少なくとも１つの単離されたヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を投与することを対象とする方法とを組み合わせて、化合物と抗体の両方が同時に循環中にあるように、両方を、同時に、または連続して患者に投与することができる。

図は、本明細書の一部を成し、本発明のある特定の態様をさらに明らかにするために含められる。図は、本発明全体を包含するように意図されているものではなく、本発明全体を包含すると解釈されるべきではない。さらに、本発明の異なる態様は、明確にするため別個の図として例示されることが多い。これらの態様は、両立できないことが明確でない限り互いに組み合わせることができる。

図１Ａは、シアリダーゼと線維症の間のフィードバック経路の、正確な縮尺ではない概略図である。図１Ｂ〜１Ｅは、提示された濃度の組換えＮＥＵ３を用いて、無血清または血清含有培地中でインキュベートされた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清中のインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｕｅｋｉｎ）−６（ＩＬ−６）レベルのグラフである。図１Ｂでは、ヒトＰＢＭＣを無血清培地中で２日間インキュベートした。図１Ｃでは、ヒトＰＢＭＣを無血清培地中で５日間インキュベートした。図１Ｄでは、ヒトＰＢＭＣを血清含有培地中で２日間インキュベートした。図１Ｅでは、ヒトＰＢＭＣを血清含有培地中で５日間インキュベートした。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。ＮＥＵ３無添加に比べて＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｔ検定）。図１Ｆ〜１Ｇは、提示された濃度の組換えヒトＩＬ−６を用いてインキュベートされた単球（図１Ｆ）およびリンパ球（図１Ｇ）中のＮＥＵ３レベルのグラフである。グラフは、前方および側方散乱によって同定される単球（図１Ｇ）またはリンパ球（図１Ｆ）の中央値蛍光を示している。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。ＮＥＵ３の場合ＩＬ−６無添加に比べて＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、Ｓｉｄａｋの多重比較検定）。他のシアリダーゼの値は、対照と有意に異ならなかった。 同上。

図２Ａ〜２Ｅは、肺線維症を伴うおよび伴わないヒト肺におけるタンパク質シアリル化を示している。図２Ａは、ビオチン化されたＳａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ）で染色して、α（２，６）結合している末端のシアル酸が検出された、またはビオチン化されたピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）で染色して、脱シアリル化された多糖が検出された、ヒト肺切片の一組の顕微鏡写真である。ＩＬＤ＜５０％ＦＥＶ１は、肺機能が不十分な肺線維症患者からの肺切片を示す。ＣＯＰＤ＞８０％ＦＥＶ１は、肺機能が比較的正常な慢性閉塞性肺疾患患者からの肺切片を示す。バーは０．２ｍｍである。図２Ｂは、図２Ａと同様にしたヒト肺切片の定量化したレクチン（ＳＮＡ）染色のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝４である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す（ｔ検定）。図２Ｃは、抗ＮＥＵ１抗体、抗ＮＥＵ２抗体、抗ＮＥＵ３抗体、または抗ＮＥＵ４抗体で染色されたヒト肺の切片の一組の顕微鏡写真である。肺線維症は、肺機能が不十分な肺線維症患者からの肺切片を示す。ＣＯＰＤは、肺機能が比較的正常な慢性閉塞性肺疾患患者からの肺切片を示す。外側の画像バーは０．２ｍｍである。差し込みのバーは０．１ｍｍである。画像は、１群当たり患者４人を代表する。図２Ｄは、図２Ｃと同様にしたヒト肺切片の定量化した抗シアリダーゼ抗体染色のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝４である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す（ｔ検定）。図２Ｅは、図２Ｃと同様にしたヒト肺の切片の顕微鏡写真であり、抗ＮＥＵ１抗体を使用して異なる結果が得られた。バーは０．２ｍｍである。 同上。

図３Ａは、抗ＮＥＵ３抗体で染色された正常ヒト心臓の切片の顕微鏡写真である。陽性染色は赤色である。バーは０．１ｍｍである。図３Ｂは、抗ＮＥＵ３抗体で染色された拡張型心筋症患者からのヒト心臓の線維症領域の切片の顕微鏡写真である。陽性染色は赤色である。バーは０．１ｍｍである。

図４Ａは、抗ＮＥＵ３抗体で染色された正常ヒト肝臓の切片の顕微鏡写真である。陽性染色は赤色である。バーは０．１ｍｍである。図４Ｂは、抗ＮＥＵ３抗体で染色された脂肪症および線維症患者からのヒト肝臓の切片の顕微鏡写真である。陽性染色は赤色である。バーは０．１ｍｍである。

図５は、ヒトにおける線維細胞形成に対するシアリダーゼの効果ならびにヒトにおける線維細胞形成に対するシアリダーゼの存在下におけるＤＡＮＡおよびＳＡＰの効果のグラフである。ヒトＰＢＭＣを、シアリダーゼの非存在下または組換えヒトＮＥＵ１（シアリダーゼ１）、ＮＥＵ２（シアリダーゼ２）、ＮＥＵ３（シアリダーゼ３）、もしくはＮＥＵ４（シアリダーゼ４）の存在下で、無血清培地中でインキュベートした。細胞を、対照溶液中またはシアリダーゼ阻害剤Ｎ−アセチル−２，３−デヒドロ−２−デオキシノイラミン酸（ＤＡＮＡ）もしくはヒトＳＡＰの存在下でもインキュベートした。線維細胞を５日後に計数した。シアリダーゼを含まない対照のパーセントとしての数値が、グラフに報告されている。値は、平均±平均（ＳＥＭ）の標準誤差であり、ｎ＝１群当たり供血者３人である。＊は、ｐ＜０．０５を示す。＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。Ｘは、対照に比べてｐ＜０．０５を示す。線維細胞は、ＳＡＰを含み、シアリダーゼを含まない培養物またはＳＡＰおよびシアリダーゼ１を含む培養物中に検出されなかった。

図６Ａは、ＴＧＦ−β１の存在または非存在下で培養され、提示されたシアリダーゼについて染色されたＡ５４９細胞の一組の顕微鏡写真である。陽性染色は赤色である。バーは０．２ｍｍである。図６Ｂは、ＴＧＦ−β１の存在または非存在下で培養され、提示されたシアリダーゼについて染色されたヒト末梢気道上皮細胞の一組の顕微鏡写真である。陽性染色は赤色である。バーは０．２ｍｍである。図６Ｃは、ＴＧＦ−β１の存在または非存在下で培養されたヒト肺線維芽細胞の一組の顕微鏡写真である。バーは０．２ｍｍである。図６Ｄは、ＴＧＦ−β１の存在または非存在下で培養され、提示されたシアリダーゼについて染色されたヒトＰＢＭＣの一組の顕微鏡写真である。陽性染色は赤色である。バーは０．２ｍｍである。 同上。 同上。

図７Ａは、組換えヒトシアリダーゼを含んでまたは含まずに培養され、ＴＧＦ−β１について染色されたヒトＰＢＭＣの一組の顕微鏡写真である。陽性染色は桃色に見え、対比染色は青色である。バーは０．１ｍｍである。図７Ｂは、図７Ａと同様にして画像から陽性染色されたマクロファージを総細胞のパーセントとして提示するグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（ｔ検定）。図７Ｃは、図７Ａと同様にしたＰＢＭＣについての定量化したＴＧＦ−β１染色のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。図７Ｄは、組換えヒトシアリダーゼ、ＤＡＮＡ、またはオセルタミビルを含んでまたは含まずにインキュベートされたヒトＰＢＭＣについてのＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡ結果のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝７である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ｔ検定）。図７Ｅは、組換えヒトシアリダーゼを含んでまたは含まずに無血清培地中で培養され、次いでＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、またはＮＥＵ４に対する抗体で染色されたヒトＰＢＭＣの一組の顕微鏡写真である。バーは０．２ｍｍである。 同上。

図８Ａは、ビオチン化されたＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ）で染色して、α（２，３）結合しているシアル酸が検出された、またはＰＮＡで染色して、脱シアリル化された多糖が検出された、マウス肺の切片の一組の顕微鏡写真である。Ｂｌｅｏの標識を付けた切片は、肺線維症を誘導するためにブレオマイシンで処置したマウスに由来する。生理食塩水の標識を付けた切片は、生理食塩水のみで処置されたマウスに由来する。肺切片は、処置２１日後に採取された。図８Ｂは、図８Ａと同様にしたマウス肺切片についての定量化したレクチン（ＭＡＬ ＩＩ）染色のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す（ｔ検定）。図８Ｃは、抗ＮＥＵ１抗体、抗ＮＥＵ２抗体、抗ＮＥＵ３抗体、または抗ＮＥＵ４抗体で染色されたマウス肺の切片の一組の顕微鏡写真である。ブレオマイシンの標識を付けた切片は、肺線維症を誘導するためにブレオマイシンで処置したマウスに由来する。生理食塩水の標識を付けた切片は、生理食塩水のみで処置されたマウスに由来する。肺切片は、処置２１日後に採取された。外側の画像バーは０．２ｍｍである。差し込みのバーは０．１ｍｍである。画像は、１群当たりマウス３匹を代表する。図８Ｄは、図８Ｃと同様にしたマウス肺切片についての定量化した抗シアリダーゼ抗体染色のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝４である。＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す（ｔ検定）。図８Ｅは、マウス肺からの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ液）の２つのウェスタンブロットである。ＢＡＬは、肺線維症を誘導するためのブレオマイシンでの処置（Ｂｌｅｏ）または生理食塩水での処置（Ｓ）２１日後に得られた。ウェスタンブロットは、α（２，３）結合しているシアル酸を検出するためにＭＡＬ ＩＩまたは脱シアリル化された多糖を検出するためにＰＮＡで染色された。＊は、ＭＡＬ ＩＩで染色されたＢｌｅｏ試料中においてシアリル化されたタンパク質の帯域が現れる場所を示す。矢印は、脱シアリル化されたタンパク質がＰＮＡで染色されたＳおよびＢｌｅｏ試料中において現れる場所を示す。分子量をｋＤａ単位で左側に示す。画像は、１群当たりマウス３匹を代表する。図８Ｆは、マウス肺からのＢＡＬのウェスタンブロットである。ＢＡＬは、肺線維症を誘導するためのブレオマイシンでの処置または生理食塩水での処置２１日後に得られた。各群につき３つの試料が含まれる。ウェスタンブロットは、抗ＮＥＵ３抗体で染色された。分子量をｋＤａ単位で左側に示す。図８Ｇは、図８Ｆの右側のウェスタンブロットの定量化された抗ＮＥＵ３抗体染色のグラフである。値は、黒色帯域のパーセント相対密度で表現される。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊は、ｐ＜０．０５を示す（ｔ検定）。図８Ｈは、ブレオマイシン処置および生理食塩水処置マウスの肺におけるＥＬＩＳＡ定量化ＮＥＵ１のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊は、ｐ＜０．０５を示す（ｔ検定）。図８Ｉは、ブレオマイシン処置および生理食塩水処置マウスの肺におけるＥＬＩＳＡ定量化ＮＥＵ２のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊は、ｐ＜０．０５を示す（ｔ検定）。図８Ｊは、ブレオマイシン処置および生理食塩水処置マウスの肺におけるＥＬＩＳＡ定量化ＮＥＵ３のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示す（ｔ検定）。図８Ｋは、ブレオマイシン処置および生理食塩水処置マウスの肺におけるＥＬＩＳＡ定量化ＮＥＵ４のグラフである。図８Ｌは、ＮＥＵ３について染色された生理食塩水処置マウス（Ｓａｌ）およびブレオマイシン処置マウス（Ｂｌｅｏ）からの肺組織溶解物のウェスタンブロット（上側パネル）である。試料の一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢ）で染色して（下側パネル）、総タンパク質量を示した。分子量標準の位置をｋＤａ単位で左側に示す。画像は、１処置群当たりマウス３匹を代表する。図８Ｍは、図８Ｌのウェスタンブロットの定量化されたタンパク質染色のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊は、ｐ＜０．０５を示す（ｔ検定）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図９Ａ〜９Ｊは、マウスにおける線維症に対するシアリダーゼ阻害剤の効果を示している。図９Ｂ〜９Ｅおよび９Ｇ〜９Ｊでは、値は、平均±ＳＥＭである。ｎ＝１群当たりマウス３匹である。図９Ｂ〜９Ｄおよび９Ｇ〜９Ｊでは、一元配置分散分析、チューキー法によって決定して、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。図９Ａは、コラーゲンについてシリウスレッドで染色されたマウス肺切片の一組の顕微鏡写真である。バーは０．２ｍｍである。Ｂｌｅｏの標識を付けた切片は、肺線維症を誘導するためにブレオマイシンで処置したマウスに由来する。生理食塩水の標識を付けた切片は、生理食塩水のみで処置したマウスに由来する。肺切片は、処置２１日後に採取された。ＤＡＮＡの標識も付けた切片は、シアリダーゼ阻害剤ＤＡＮＡでの処置も１日目に開始したマウスに由来する。オセルタミビルの標識も付けた切片は、シアリダーゼ阻害剤オセルタミビルでの処置を１日目に開始したマウスに由来する。図９Ｂは、図９Ａと同じ群におけるマウスのシリウスレッド染色の結果を定量化するグラフである。図９Ｃは、図９Ａと同じ群において生理食塩水、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ブレオマイシンとＤＡＮＡ（Ｂｌｅｏ＋ＤＡＮＡ）、またはブレオマイシンとオセルタミビル（Ｂｌｅｏ＋オセルタミビル）での処置２１日後にＢＡＬから回収された細胞の総数のグラフである。図９Ｄは、図９Ａと同じ群において生理食塩水、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ブレオマイシンとＤＡＮＡ（Ｂｌｅｏ＋ＤＡＮＡ）、またはブレオマイシンとオセルタミビル（Ｂｌｅｏ＋オセルタミビル）での処置２１日後にＢＡＬから回収されたＣＤ１１ｂ＋細胞またはＣＤ１１ｃ＋細胞の総数のグラフである。図９Ｅは、図９Ａと同じ群において生理食塩水、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ブレオマイシンとＤＡＮＡ（Ｂｌｅｏ＋ＤＡＮＡ）、またはブレオマイシンとオセルタミビル（Ｂｌｅｏ＋オセルタミビル）での処置２１日後におけるＢＡＬ中の総タンパク質レベルのグラフである。値は、ＢＡＬタンパク質濃度×収集されたＢＡＬ体積である。図９Ｆは、コラーゲンについてシリウスレッドで染色されたマウス肺切片の一組の顕微鏡写真である。バーは０．２ｍｍである。Ｂｌｅｏの標識を付けた切片は、肺線維症を誘導するためにブレオマイシンで処理したマウスに由来する。生理食塩水の標識を付けた切片は、生理食塩水のみで処置したマウスに由来する。肺切片は、処置２１日後に採取された。ＤＡＮＡの標識も付けた切片は、ＤＡＮＡでの処置も１０日目に開始したマウスに由来する。オセルタミビルの標識も付けた切片は、オセルタミビルでの処置も１０日目に開始したマウスに由来する。図９Ｇは、図９Ｆと同じ群におけるマウスのシリウスレッド染色の結果を定量化するグラフである。図９Ｈは、図９Ｆと同じ群において生理食塩水、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ブレオマイシンとＤＡＮＡ（Ｂｌｅｏ＋ＤＡＮＡ）、またはブレオマイシンとオセルタミビル（Ｂｌｅｏ＋オセルタミビル）での処置２１日後にＢＡＬから回収された細胞の総数のグラフである。図９Ｉは、図９Ｆと同じ群において生理食塩水、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ブレオマイシンとＤＡＮＡ（Ｂｌｅｏ＋ＤＡＮＡ）、またはブレオマイシンとオセルタミビル（Ｂｌｅｏ＋オセルタミビル）での処置２１日後にＢＡＬから回収されたＣＤ１１ｂ＋細胞の総数のグラフである。図９Ｊは、図９Ｆと同じ群において生理食塩水、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）、ブレオマイシンとＤＡＮＡ（Ｂｌｅｏ＋ＤＡＮＡ）、またはブレオマイシンとオセルタミビル（Ｂｌｅｏ＋オセルタミビル）での処置２１日後におけるＢＡＬ中の総タンパク質レベルのグラフである。値は、ＢＡＬタンパク質濃度×収集されたＢＡＬ体積である。０．０５５は、ｐ＝０．０５５を示す。図９Ｋは、ＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３およびＮＥＵ４に対する抗体で染色された、図９Ｆに対応する肺組織の切片の一組の顕微鏡写真である。バーは０．２ｍｍである。図９Ｌは、図９Ｋと同じ群におけるマウスの抗ＮＥＵ１染色の結果を定量化するグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す（ｔ検定）。図９Ｍは、図９Ｋと同じ群におけるマウスの抗ＮＥＵ２染色の結果を定量化するグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す（ｔ検定）。図９Ｎは、図９Ｋと同じ群におけるマウスの抗ＮＥＵ３染色の結果を定量化するグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す（ｔ検定）。図９Ｏは、図９Ｋと同じ群におけるマウスの抗ＮＥＵ４染色の結果を定量化するグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示す（ｔ検定）。 同上。 同上。 同上。 同上。

図１０は、口腔咽頭生理食塩水または口腔咽頭ブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）処置後２１日目におけるマウス肺の小片のシアル酸含有量のグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝３である。

図１１Ａは、ブレオマイシンまたは生理食塩水で処置し、次いで生理食塩水、ＤＡＮＡ、またはオセルタミビルで処置したマウスからのＴＧＦ−β１について染色された肺組織の切片の一組の顕微鏡写真である。図１１Ｂは、図１１Ａと同様にしたマウスのＴＧＦ−β１染色の結果を定量化するグラフである。値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝１群当たりマウス３匹である。＊は、ｐ＜０．０５を示す（ｔ検定）。 同上。

本開示は、抗線維症化合物、およびそのような化合物を使用して、線維症を予防または阻害する方法に関する。化合物および方法は、線維症を生じる可能性がある、増殖を含む線維細胞形成または活性化を含む線維細胞活性を予防または阻害することもできる。

化合物は、抗体と低分子を両方含んでいてもよい。化合物は、シアリダーゼ、特にヒトシアリダーゼを阻害することができる。

方法は、化合物を線維症患者、または線維症を発症するリスクがある患者、または増殖を含む異常な線維細胞形成もしくは活性化を含む異常な線維細胞活性を有する患者に投与するステップを含んでいてもよい。化合物の投与量、投与方法、用量、および任意の反復の頻度は、化合物および達成されるべき効果に応じて変わり得る。
シアリダーゼおよび線維症

結合している多糖を有するタンパク質は、グリコシル化タンパク質と呼ばれる。グリコシル化タンパク質上の多糖の多くは、特にタンパク質に対して遠位の末端にシアル酸単糖を有する（末端のシアル酸と呼ばれる）。シアリダーゼ（ノイラミニダーゼとも呼ばれる）は、グリコシル化タンパク質上で見られる多糖からシアル酸を除去する酵素である。

シアリダーゼは、有害なウイルスおよび細菌を含む多種多様な有機体によって使用される。哺乳動物は、ＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、およびＮＥＵ４と呼ばれる４つのシアリダーゼを有する。

ＮＥＵ１は、一般に他の３つのシアリダーゼより高いレベルで発現され、大部分の組織で発現されるが、肺および気道上皮細胞では大部分の他の細胞より高いレベルで発現される。ＮＥＵ１は、リソソームおよび形質膜に位置し、その触媒ドメインは細胞の外側である。ＮＥＵ１は、α（２，６）結合を有する末端のシアル酸を優先的に脱シアリル化し、α（２，３）結合を有する末端のシアル酸をより少ない程度に脱シアリル化し、α（２，８）結合に対しても、若干の活性を有する。

ＮＥＵ２は、可溶な細胞質酵素である。ＮＥＵ２は、α（２，３）結合、α（２，６）結合、およびα（２，８）結合を有する末端のシアル酸を優先的に脱シアリル化する。

ＮＥＵ３は、形質膜結合シアリダーゼである。ＮＥＵ３は、α（２，３）結合、α（２，６）結合、およびα（２，８）結合を有する末端のシアル酸を優先的に脱シアリル化する。

ＮＥＵ４は、２つのアイソフォームを有し、一方は、ミトコンドリア局在を伴い、他方は、細胞内膜に結合している。ＮＥＵ４は、α（２，３）結合、α（２，６）結合、およびα（２，８）結合を有する末端のシアル酸を優先的に脱シアリル化する。

これらの４つのシアリダーゼの変種は、ヒトおよび他の哺乳動物において公知である。特に、一塩基多型（ＳＮＰ）の変種が公知である。

シアリダーゼは、哺乳動物における炎症に関連し、炎症により、シアリダーゼの存在が増加する。したがって、哺乳動物における炎症とシアリダーゼの間に、正のフィードバックループが存在する。

本開示は、ヒトを含む哺乳動物におけるシアリダーゼと線維症の間の新たに発見されたフィードバック経路を利用する。この経路の少なくとも一部分を図１Ａに例示する。

ＳＡＰ２０は、その正常なグリコシル化形であるとき、ＤＣ−ＳＩＧＮ３０に結合経路１２０を介して結合する。これにより、ＤＣ−ＳＩＧＮ３０が、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０の活性化を阻害経路１４０を介して阻害することになる。

ＳＡＰ２０は、その正常なグリコシル化形であるとき、Ｆｃγ受容体１（ＦｃγＲ１）４０にも結合経路１３０を介して結合することができる。これにより、ＦｃγＲ１が、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０の活性化を阻害経路１５０を介して阻害することになる。

阻害がない場合、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０は、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−６、およびＩＬ−１３を含むサイトカインを分泌することができる。これらのサイトカインは、線維芽細胞６０の形成または活性化を引き起こすように経路１６０を介して作用する。次いで、線維芽細胞６０は、続けて線維症を引き起こすことができる。

さらに、先天性免疫系細胞５０によって分泌されるＴＧＦ−β１は、先天性免疫系細胞５０の内部に増加した量で存在し、またはそうでなければ細胞外環境中に存在して、シアリダーゼ１０の発現を増加させることができる。

ＳＡＰ２０がＤＣ−ＳＩＧＮ３０、ＦｃγＲ１ ４０、または両方に結合し、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０の阻害を引き起こすと、サイトカインは分泌されず、線維芽細胞６０の形成または活性化は起こらない。

シアリダーゼ１０は、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０によるサイトカインの分泌および線維芽細胞６０の形成または活性化を促進するように一般経路１００を介して作用することができる。

経路１００は、様々な副経路を含んでいてもよいが、少なくとも１つの副経路で、シアリダーゼ１０は、末端のシアル酸をＳＡＰ多糖から切り離すようにグリコシル化ＳＡＰ２０に作用する。シアリダーゼ１０は、ＮＥＵ１であり得、グリコシル化ＳＡＰ上に存在するタイプのシアル酸結合を切断することができる。それは、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、ＮＥＵ４、またはいずれかのシアリダーゼの組合せでもあり得る。

シアル酸をグリコシル化ＳＡＰ２０から切り離すことは、経路１１０によって例示されるような、阻害過程である。シアル酸を欠いているＳＡＰ２０は、経路１２０または経路１３０を介してＤＣ−ＳＩＧＮ３０またはＦｃγＲ１ ４０に効率的に結合することができず、したがってＳＡＰ２０は、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０を阻害経路１４０および１５０を介して阻害することができない。これにより、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０が、線維芽細胞６０の形成または活性化を自由に促進する。

線維芽細胞６０の形成または活性化の促進に加えて、線維症促進性の先天性免疫系細胞５０、またはことによると線維芽細胞６０は、別の活性なシアリダーゼ１０に経路１７０を介しても作用する。したがって、経路１００および１７０を介して、線維細胞形成または活性化およびシアリダーゼ活性は、正のフィードバックループを形成する。

この正のフィードバックループは、いくつかの生物学的状況の中では有益であり得るが、線維症疾患および障害におけるとめどもない線維症にも寄与する可能性がある。したがって、本開示は、この正のフィードバックループを破壊する化合物、およびそれらを使用して、線維細胞形成または活性化の有害な効果を予防または制御する方法を提供する。

この正のフィードバックループの一例として、ＮＥＵ３は、ヒトＰＢＭＣにＩＬ−６を蓄積させ、次にＩＬ−６は、ＮＥＵ３を蓄積するようにヒトＰＢＭＣを誘導する。

別の例として、シアリダーゼは、線維症促進性の先天性免疫系細胞もしくは他の細胞に、ＴＧＦ−β１を細胞外環境中に分泌させ、または内部量を増加させ、次いでシアリダーゼ発現を増加させる。

この正のフィードバックループの第３の例として、ＮＥＵ２など１つのシアリダーゼは、ＮＥＵ３など別のシアリダーゼの発現を増加させることができる。

これらのフィードバックループ例は、すべて同じ細胞または生物系中に存在することができ、他のフィードバックループも同様にさらに存在することができる。
シアリダーゼ阻害剤

本開示は、抗線維症性シアリダーゼ阻害剤、特にヒトシアリダーゼ阻害剤、および線維症の予防または阻害におけるその使用を含む。

ヒトシアリダーゼ阻害剤は、すべて野生型の形態で単独または１つもしくは複数の活性変種も含む、すべてのヒトシアリダーゼ、ヒトシアリダーゼの部分集合、または１つのヒトシアリダーゼの酵素活性を阻害することができる。特に、シアリダーゼ阻害剤は、少なくともヒトＮＥＵ１単独、ヒトＮＥＵ２単独、ヒトＮＥＵ３単独、またはヒトＮＥＵ４単独の酵素活性を阻害することができる。酵素活性は、末端のシアル酸を有する基質を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてミカエリス−メンテンの式によって測定される率が、少なくとも５０％阻害されている場合、阻害されていると定義することができる。さらに具体的には、ヒトシアリダーゼ阻害剤は、蛍光定量的基質４ＭＵ−ＮＡＮＡ［２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてミカエリス−メンテンの式によって測定して、少なくとも１つのヒトシアリダーゼの率を少なくとも５０％阻害する化合物であり得る。

ヒトシアリダーゼ阻害剤は、ＴＧＦ−β１活性またはレベルも阻害することができ、図１Ａに記載されている正のフィードバックループを妨害し、したがって線維症を予防または阻害することもできる。
低分子シアリダーゼ阻害剤

低分子シアリダーゼ阻害剤、特にヒトシアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物を含んでいてもよい。

ＤＡＮＡとしても知られている化合物１は、ヒトＮＥＵ１を１４３μＭの酵素活性の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）で阻害する。ＤＡＮＡは、ヒトＮＥＵ２を４３μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を６１μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を７４μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の一般構造式：
を有する化合物も含んでいてもよく、式中、Ｒは、表１に提示される基である。表１は、４つのヒトシアリダーゼについて様々なＲ基のＩＣ_５０濃度も含む。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物９は、ヒトＮＥＵ２を０．５５±０．１２ｍＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

ザナミビル（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−４−グアニジノ−３−（プロプ−１−エン−２−イルアミノ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−６−カルボン酸）としても知られている化合物１０は、ヒトＮＥＵ２を０．０１７ｍＭの阻害定数（Ｋ_ｉ）で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

ペラミビル（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−［（１Ｓ）−１−アセトアミド−２−エチル−ブチル］−４−（ジアミノメチリデンアミノ）−２−ヒドロキシ−シクロペンタン−１−カルボン酸）としても知られている化合物１１は、ヒトＮＥＵ２を０．３３ｍＭのＫ_ｉで阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物１２は、ヒトＮＥＵ２を０．８８ｍＭのＫ_ｉで阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物１３は、ヒトＮＥＵ２を０．７４ｍＭのＫ_ｉで阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物１４は、ヒトＮＥＵ２を１．４ｍＭのＫ_ｉで阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の一般構造式：
を有する化合物も含んでいてもよく、式中、Ｒは、表２に提示される基である。表２は、ヒトＮＥＵ３について様々なＲ基のＩＣ_５０濃度も含む。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物２５は、ヒトＮＥＵ３を２１±８μＭのＫ_ｉで阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
（式中、Ｒは、表３に提示される基である。表３は、ヒトＮＥＵ２について様々なＲ基のＩＣ_５０濃度も含む。）
を有する化合物も含んでいてもよい。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物２９は、ヒトＮＥＵ３を３５０±１００μＭのＩＣ_５０で阻害し、ヒトＮＥＵ４を８００±４００μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物３０は、ヒトＮＥＵ３を６４０±２１０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、表４に提示される基である。表４は、ヒトＮＥＵ２について様々なＲ基のＩＣ_５０濃度も含む。）
を有する化合物も含んでいてもよい。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：

を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物３７は、ヒトＮＥＵ１を３６０±５０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ２を５９±１３μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を５４±５μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を１０００±６０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物３８は、ヒトＮＥＵ２を４４±３μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を１８０±２０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を７２０±７０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物３９は、ヒトＮＥＵ２を１３１±１３μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を４４０±３００μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を３００±２０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４０は、ヒトＮＥＵ２を７４±４μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を５０±３０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を２１０±１０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４１は、ヒトＮＥＵ２を９２０±２００μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を２４±２μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４２は、ヒトＮＥＵ２を１７３±５０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を２４±１１μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を３５０±１８０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４３は、ヒトＮＥＵ２を４０±７μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を２０±８μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４４は、ヒトＮＥＵ２を８００±３０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を５４０±３０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４５は、ヒトＮＥＵ２を１００±１３μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を３７０±８０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４６は、ヒトＮＥＵ２を８６±１７μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４７は、ヒトＮＥＵ２を６７±１８μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を７０±２０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を２００±２０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４８は、ヒトＮＥＵ１を６２０±１０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ２を２４０±２０μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を１９．７±２．３μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を６０±２０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物４９は、ヒトＮＥＵ１を２９．０±０．５μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ２を３７±５μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ３を４．７±０．３μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を４．５±０．１μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

化合物５０は、ヒトＮＥＵ２を９±１μＭのＩＣ_５０で、ヒトＮＥＵ４を２５０±４０μＭのＩＣ_５０で阻害する。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
（式中、Ｒは、表５に提示される基である。表５は、ヒトシアリダーゼについて様々なＲ基のＩＣ_５０濃度も含む。）
を有する化合物も含んでいてもよい。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、以下の構造式：
を有する化合物も含んでいてもよい。

オセルタミビル（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−［（１Ｓ）−１−アセトアミド−２−エチル−ブチル］−４−（ジアミノメチリデンアミノ）−２−ヒドロキシ−シクロペンタン−１−カルボン酸）としても知られている化合物５８は、このカルボキシレートの形態で４つのヒトシアリダーゼすべての阻害剤として活性であるが、上記の他の低分子シアリダーゼ阻害剤に比べて不十分な阻害剤である。オセルタミビルは、マウスにおいて強力なシアリダーゼ阻害剤であり、したがって非ヒト患者においてマウスにおけるその活性により近い活性を示し、低分子シアリダーゼ阻害剤として有用であり得る。

上記の化合物または他の低分子シアリダーゼ阻害剤は、少なくとも１つのヒトシアリダーゼを阻害し、ヒトにおいて線維細胞形成を予防もしくは制御し、またはヒトにおいて全身的にもしくはヒトにおいて投与領域で線維症を予防もしくは阻害するのに十分な量および時間で投与することができる。

用量は、少なくとも３μＭの全身濃度または投与領域の濃度を確立するのに十分であり得る。投与は、毎日少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または無期限とすることができる。

低分子シアリダーゼ阻害剤は、静脈内もしくは腹腔内注射、経口、局所、または吸入により投与することができる。
抗体シアリダーゼ阻害剤

抗体シアリダーゼ阻害剤は、ヒトシアリダーゼ活性を阻害するのに十分な強度または少なくとも１０^−７Ｍの結合親和性を有する、少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性部位に結合する単離されたヒトおよびヒト化抗体を含んでいてもよい。シアリダーゼ抗原は、具体的には、すべてのシアル酸に共通のカルボン酸基と結合するアルギニン三つ組み、チロシン／グルタミン酸の対、酸／塩基触媒として作用するアスパラギン酸（すべて、Ｍｏｎｔｉ Ｅ．ら、Ｓｉａｌｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ： ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｔａｉｌｏｒｅｄ ｆｏｒ ｓｅｖｅｒａｌ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．、Ａｄｖ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍ、６４巻：４０３〜４７９頁（２０１０年）で特定される）、またはこれらの抗原の任意の組合せを含んでいてもよい。

抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗体は、ヒトシアリダーゼ活性を阻害することができる抗体フラグメントをさらに含んでいてもよい。

抗体シアリダーゼ阻害剤は、少なくとも１つのヒトシアリダーゼを阻害し、ヒトにおいて線維細胞形成を予防もしくは制御し、またはヒトにおいて全身的にもしくはヒトにおいて投与領域で線維症を予防もしくは阻害するのに十分な量および時間で投与することができる。

抗体シアリダーゼ阻害剤は、静脈内もしくは腹腔内注射、局所、または吸入により投与することができる。
線維症疾患

シアリダーゼ阻害剤を使用して、哺乳動物、特にヒトにおけるいくつかの線維症疾患のいずれかで線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、例えば、肝臓、腎臓、肺、心臓および心膜、眼、皮膚、口、膵臓、消化管、脳、乳房、骨髄、骨および関節、泌尿生殖器系、がん性腫瘍を含む腫瘍、または創傷に生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、一般に、これらに限定されないが、関節リウマチ、狼瘡、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、病原性線維症、線維症疾患、日本住血吸虫感染後に形成されたものなどの線維症病変、放射線損傷、自己免疫疾患、ライム病、化学療法誘導線維症、ＨＩＶまたは感染誘導性の巣状硬化、脊髄手術瘢痕による腰椎術後疼痛症候群、腹部癒着術後瘢痕、線維嚢胞形成、脊椎損傷後の線維症、手術誘導性の線維症、粘膜線維症、透析によって引き起こされた腹膜線維症、腫瘍関連線維症、およびアダリムマブ関連肺線維症を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

具体的には、シアリダーゼ阻害剤は、肝臓において、これらに限定されないが、アルコール、薬物、および／または化学的に誘導された肝硬変、肝臓移植後の虚血再灌流傷害、壊死性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ならびに脂肪症を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、腎臓に関して、これらに限定されないが、増殖性および硬化性糸球体腎炎、腎性線維症性皮膚症、糖尿病性腎症、腎尿細管間質性線維症、および巣状分節性糸球体硬化症を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、肺に関して、これらに限定されないが、肺間質線維症、サルコイドーシス、肺線維症、特発性肺線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、びまん性肺胞障害疾患、肺高血圧、新生児気管支肺異形成、慢性喘息、および肺気腫を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。肺線維症には、これらに限定されないが、原因不明の線維化性胞隔炎、びまん性間質性線維症、特発性間質性肺臓炎、ハンマン−リッチ症候群、珪肺、石綿肺、ベリリウム症、炭坑夫塵肺、黒肺病、炭鉱労働者の疾患、坑夫喘息、炭粉症、および炭粉珪肺症を含むいくつかの下位名称または同義語がある。

シアリダーゼ阻害剤は、心臓および／または心膜に関して、これらに限定されないが、心筋線維症、アテローム性動脈硬化、冠動脈再狭窄、うっ血型心筋症、拡張型心筋症、心不全、および他の虚血後の状態を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、眼に関して、これらに限定されないが、グレーブス病の眼球突出、増殖性硝子体網膜症、前嚢白内障、角膜線維症、手術による角膜瘢痕、線維柱帯切除誘導性の線維症、進行性網膜下線維症、多巣性肉芽腫性脈絡網膜炎、および他の眼線維症などの状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、皮膚に関して、これらに限定されないが、デュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｙｔｒｅｎ’ｓ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、強皮症、ケロイド瘢痕、乾癬、熱傷による肥厚性瘢痕、アテローム性動脈硬化、再狭窄、および脊髄損傷によって引き起こされた偽性強皮症（ｐｓｕｅｄｏｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、口および／または食道に関して、これらに限定されないが、歯周病瘢痕、薬物に付随する歯肉肥大、および先天性食道狭窄を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、膵臓に関して、これらに限定されないが、膵線維症、間質リモデリング膵炎、および間質線維症を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、消化管に関して、これらに限定されないが、コラーゲン性大腸炎、絨毛萎縮、陰窩過形成、ポリープ形成、クローン病の線維症、および治癒性胃潰瘍を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、脳に関して、グリア性瘢痕組織を含むがこれに限定されない状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、乳房に関して、これらに限定されないが、線維嚢胞性疾患、および乳がんに対する線維形成反応を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、骨髄に関して、これらに限定されないが、骨髄線維症における線維症、骨髄形成異常および新生物疾患を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、骨に関して、これらに限定されないが、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、およびリウマトイドパンヌス形成を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、泌尿生殖器系に関して、これらに限定されないが、子宮内膜症、子宮筋腫、卵巣筋腫、およびパイロニー病を含む状態によって生じる線維症を予防または阻害することができる。

シアリダーゼ阻害剤は、放射線誘発損傷に関して、これらに限定されないが、頭頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、消化器がん、結腸がん、および乳がんの処置に関連している線維症を予防または阻害することができる。

以下の実施例は、本発明の態様を例示する。実施例は、本発明全体を包含するためのものではない。さらに、いくつかの実施例は、本発明の別々の実施形態を提示することができるが、そのような実施例の態様は本発明の他の変形と、そのような組合せが、当業者にとって明確に操作不可能でない限り、上記のようにまたは異なる実施例において組み合わせることができる。

別段の指定がない限り、例えばマウス試料に由来するデータについて論じるとき、これらの実施例において試験されたシアリダーゼはヒトシアリダーゼであった。

（実施例１）
シアリダーゼ活性の決定
一般に、ヒトシアリダーゼ活性を含むシアリダーゼ活性は、ｐＨが３．７〜７．４に及ぶ緩衝液の存在下で、３７℃で評価することができる。ｐＨ３．７、４．０、４．６、５．２および５．６の緩衝液は、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液である。ｐＨ５．８、６．４、７．０および８．０の緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をベースにし、１２ＮのＨＣｌまたは１ＭのＮａＯＨを添加して、ｐＨを調整する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、緩衝液に１００μｇ／ｍｌの濃度で添加する。次いで、シアリダーゼを３００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で緩衝液に添加する。次いで、シアリダーゼ阻害剤を混合物に一連の最終濃度で添加する。反応混合物を３０分間インキュベートして、阻害剤がシアリダーゼと結合できるようにする。次いで、蛍光定量的基質４ＭＵ−ＮＡＮＡ［２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩水和物を、２００μＭの最終濃度で添加する。対照反応では、添加される阻害剤がない。各反応混合物の全体積は、０．１ｍｌである。次いで、４ＭＵ−ＮＡＮＡの切断を、３６０ｎｍの励起光および４６０ｎｍの蛍光発光を用いて２０分ごとに５時間蛍光によりモニタリングする。

シアリダーゼの非存在下における蛍光を、すべての読取値から差し引く。既知濃度の４−メチルウンベリフェロンの蛍光を使用して、蛍光を生成物のモル数に変換する。

シアリダーゼが細胞外環境のｐＨにおいて酵素活性を有するかどうかを決定するために、シアリダーゼを、正常組織における細胞外のｐＨにほぼ相当するｐＨ７．０で、線維症組織における細胞外のｐＨにほぼ相当するｐＨ６．４で、またはその両方でアッセイすることができる。

アッセイ例では、組換えヒトシアリダーゼを、線維症組織において生じる可能性がある細胞外のｐＨにほぼ相当するｐＨ６．４、および正常な細胞外のｐＨにほぼ相当するｐＨ７．０でアッセイした。結果を表６に提示する。４つの組換えシアリダーゼはすべて、ｐＨ６．４およびｐＨ７．０において活性を示し、ヒトシアリダーゼは線維症組織でも正常組織でも細胞外環境において活性であり得ることが示された。

（実施例２）
ヒトＰＢＭＣにおけるＮＥＵ３およびＩＬ−６が関与する正のフィードバック経路
ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−６産生に対するＮＥＵ３の効果を決定するために、書面により同意し、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ被験者治験審査委員会から特定の承認を得た健常志願者から、ヒト末梢血を収集した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ＰＢＭＣを血液から単離した。ＰＢＭＣは、９６ウェルの平底組織培養プレート（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）の各ウェル中において、１０％仔ウシ血清（ＢＣＳ）（ＶＷＲ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＶＷＲ）および２ｍＭのグルタミン（ＶＷＲ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＶＷＲ）を１ウェル当たり最終体積２００μｌで用いて、１０^５細胞／ｍｌで培養した。細胞は、Ｐｉｌｌｉｎｇ， Ｄ．、Ｖａｋｉｌ， Ｖ．およびＧｏｍｅｒ， Ｒ． Ｈ．、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、３５１巻、６２〜７０頁（２００９年）（参照により本明細書に組み込まれる）に既述されているように、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＶＷＲ）、１倍の非必須アミノ酸（ＶＷＲ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＶＷＲ）、２ｍＭのグルタミン（ＶＷＲ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＶＷＲ）、および１倍のＩＴＳ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充した１ウェル当たり最終体積２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０中の無血清培地中でも、１０^５細胞／ｍｌで培養した。細胞を播種すると、組換えヒトシアリダーゼＮＥＵ３（ＴＰ３１６５３７、Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を０〜５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。血清含有または不含ＲＰＭＩ−１６４０培地中でＮＥＵ３を希釈し、細胞に添加して、ウェル中の全体積を２００μｌにした。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。

培養上清を２日または５日後に収集し、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用してアッセイし、ＳｙｎｅｒｇｙＭＸプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で吸光度を読み取った。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、統計値を分析した。

結果を図１Ｂ〜１Ｅに提示する。血清の存在下または非存在下で、ＮＥＵ３は、ヒト免疫細胞によるＩＬ−６の細胞外蓄積を著しくアップレギュレートした。蓄積されたＩＬ−６レベルは、０〜２０ｐｇ／ｍｌである正常なヒト血清中ＩＬ−６レベルと同等またはそれより高かった。

ヒトＰＢＭＣによるＮＥＵ３産生に対するＩＬ−６の効果を決定するために、ＰＢＭＣは、６ウェルの組織培養プレート（ＶＷＲ）において２ｍｌ／ウェルで、組換えヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在または非存在下で上記のように無血清培地中で１０^５細胞／ｍｌで培養した。３日後に、培地を慎重に除去し、細胞を室温で１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を、３７℃で１ウェル当たり５００μｌのＡｃｃｕｔａｓｅ細胞剥離用溶液（ＶＷＲ）で６分間剥離した。上記のようにＢＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを補充したＲＰＭＩ培地を、１ウェル当たり１０００μｌ添加して、Ａｃｃｕｔａｓｅを中和した。細胞溶液を４回ピペットで取った後、細胞を１．７ｍｌの無菌マイクロチューブ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に入れ、５０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離することによって、細胞を収集した。ペレット状細胞を、１０００μｌの氷冷ＰＢＳで再懸濁し、遠心分離することによって、２回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）の氷冷パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）２００μｌに、氷上で１０分間再懸濁して、固定した。１０００μｌの氷冷ＰＢＳを添加し、細胞を遠心分離によって収集した。細胞を、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）の氷冷ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＶＷＲ）（ＰＢＳＡ）２００μｌに、氷上で１０分間再懸濁して、ブロッキングした。１０００μｌの氷冷ＰＢＳを添加し、細胞を遠心分離によって収集した。ペレットを、ＰＢＳ中０．１％（ｗ／ｖ）の氷冷トリトンＸ−１００（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ）２００μｌに再懸濁し、膜を氷上で１０分間溶解した。１０００μｌの氷冷ＰＢＳを添加し、細胞を遠心分離によって収集した。細胞を５００μｌのＰＢＳＡに再懸濁し、次いで、染色反応用に１２５μｌを遠心分離によって収集した。

染色反応用のペレット状細胞を、２％（ｗ／ｖ）ＰＢＳＡ中１μｇ／ｍｌのウサギポリクロナール抗ＮＥＵ１（ＴＡ３３５２３６、Ｏｒｉｇｅｎｅ）、抗ＮＥＵ２（ＴＡ３２４４８２、Ｏｒｉｇｅｎｅ）、抗ＮＥＵ４（ＡＰ５２８５６ＰＵ−Ｎ、Ａｃｒｉｓ／Ｏｒｉｇｅｎｅ）、無関係のウサギポリクロナール抗体（ＡＢ−１０５−Ｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、もしくは抗体不含、または０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を含む２％（ｗ／ｖ）ＰＢＳＡ中１μｇ／ｍｌの抗ＮＥＵ３（ＴＡ５９０２２８、Ｏｒｉｇｅｎｅ）１００μｌに再懸濁した。細胞を抗体と共に氷上で６０分間インキュベートした。５００μｌの氷冷ＰＢＳを添加し、細胞を遠心分離によって収集した。細胞を、１０００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁し、遠心分離することによって、２回洗浄した。次いで、細胞を、ＰＢＳＡ中ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）（１：１０００）１００μｌと共に、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を上記のように２回洗浄した。次いで、Ｃｏｘ， Ｎ．、Ｐｉｌｌｉｎｇ， Ｄ．およびＧｏｍｅｒ， Ｒ． Ｈ．、ＤＣ−ＳＩＧＮ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＳＡＰ ａｎｄ ＣＲＰ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、１１２巻、８３８５〜８３９０頁（２０１５年）（参照により本明細書に組み込まれる）に既述されているように、細胞を１００μｌのＰＢＳＡに再懸濁し、氷上で維持し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で前方および側方散乱を使用して、細胞の蛍光を分析して、単球およびリンパ球を同定した。

結果を図１Ｆおよび図１Ｇに提示する。データは、１００および１０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６が、ヒト単球およびリンパ球においてシアリダーゼＮＥＵ３のレベルを著しく増加させたことを示している。

全体的に見て、図１Ｂ〜１Ｆのデータは、組換えヒトシアリダーゼＮＥＵ３がヒト免疫系細胞において線維症促進性のサイトカインＩＬ−６のレベルを増加させる能力、および組換えヒトＩＬ−６がヒト免疫系細胞においてＮＥＵ３レベルを増加させる能力を明らかにし、ＮＥＵ３が線維症の要因になっている図１Ａに描かれたタイプの正のフィードバックループの存在が裏付けられる。これは、シアリダーゼ阻害剤が、フィードバックループのＮＥＵ３成分を阻害して、ＩＬ−６レベルを下げ、したがって線維症を阻害することによって線維症疾患に適した治療薬であることを示唆している。

（実施例３）
ヒト肺におけるシアリダーゼ
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺線維症の１つのタイプである間質性肺疾患（ＩＬＤ）の患者からの、ＨＥＰＥＳ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ（ＨＯＰＥ）固定した厚さ５μｍの連続切片のスライドガラスは、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｂｏａｒｄの特定の承認を得て、米国国立心肺血液研究所が後援する肺組織研究コンソーシアム（ＬＴＲＣ）から得た。書面による同意を得て、すべての試料を分析前に匿名化した。ＩＬＤ＜５０％の１秒間の努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）は、肺機能が不十分な肺線維症患者を示す。ＦＥＶ１は、全肺気量のレベルから始まる努力呼気段階の最初の１秒間に排出される体積である。

スライドを６０℃のイソプロパノールで１０分間処理し、次いで新鮮な６０℃のイソプロパノールでさらに１５分間処理した。スライドを、（蒸留水中ｖ／ｖ）７０％のアセトン中で２０分間、次いで蒸留水中で５分間再水和した。

次いで、いくつかのスライドを、ＰＢＳ−ＢＳＡ中２μｇ／ｍｌのビオチン化されたＳａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａ凝集素（ＳＮＡ）レクチンまたは２μｇ／ｍｌのビオチン化されたピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）レクチン（両方ともＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で製造業者の指示に従って染色した。ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎアルカリホスファターゼおよびＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄアルカリホスファターゼを製造業者の指示に従って使用して、染色を明らかにし、次いで、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。代表的な染色結果を図２Ａに提示する。ＩｍａｇｅＪを使用して定量化された染色結果を図２Ｂに提示する。肺線維症患者からの肺組織は、ＰＮＡ染色によって示されるように、ＣＯＰＤ患者より多い炭水化物全体を有するにもかかわらず、ＳＮＡ染色によって示されるように、ＣＯＰＤ患者からの肺組織より少ないα（２，６）結合を有するシアル酸を伴う多糖を含有した。これにより、肺線維症患者においては、患者が別の肺疾患を有していても線維症のない患者に比べて、シアリダーゼ活性が増加していることが示される。

抗体で他のスライドをブロッキングし、染色した。非特異的結合を、リン酸緩衝生理食塩水中２％のヌクレアーゼ不含／プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（ＶＷＲ）（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で３０分間ブロッキングし、次いで、スライドを、ＰＢＳ−ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌでウサギポリクロナール抗ＮＥＵ１抗体（ＴＡ３３５２３６、Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、抗ＮＥＵ２抗体（ＴＡ３２４４８２、Ｏｒｉｇｅｎｅ）、もしくは抗ＮＥＵ４抗体（ＡＰ５２８５６ＰＵ−Ｎ、Ａｃｒｉｓ／Ｏｒｉｇｅｎｅ）と共に、またはＰＢＳ−ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌで抗ＮＥＵ３抗体（ＴＡ５９０２２８、Ｏｒｉｇｅｎｅ）と共に、４℃で終夜インキュベートした。

次いで、スライドを、ＰＢＳを３回取り替えて３０分間にわたって洗浄し、ＰＢＳ中２マイクログラム／ｍｌのビオチン化されたロバ抗ウサギＩｇＧ（７１１−０６６−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共に３０分間インキュベートした。洗浄した後、ビオチン化された抗体を、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によって、製造業者のプロトコールに従って検出した。スライドをＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入した後、Ａ３５１００Ｕ ＣＣＤカメラ（ＯＭＡＸ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）およびＴｏｕｐＶｉｅｗ（Ｔｏｕｐｔｅｋ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｈａｎｇｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用して、画像を捕獲した。代表的な結果を図２Ｃに提示する。ＩｍａｇｅＪを使用して定量化された染色結果を図２Ｄに提示する。

これらの結果から、肺線維症患者においては、患者が別の肺疾患（４つのシアリダーゼすべてのレベルが低いことを示したＣＯＰＤ）を有していても線維症のない患者に比べて増加したレベルで、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、およびＮＥＵ４が発現していることは明らかである。ＮＥＵ１の結果については、明らかでなかった。線維症患者３人のうち２人は低レベルのＮＥＵ１のみ示したが、３人目の患者は、増加したレベルを示した（図２Ｅ）。より高い倍率の画像は、線維症病変におけるアップレギュレートされたシアリダーゼの斑状分布を示した。これらの結果から、線維症患者においてシアリダーゼの活性、特にシアリダーゼＮＥＵ２、ＮＥＵ３、およびＮＥＵ４の活性が増加することも予想される。

（実施例４）
心筋線維化におけるシアリダーゼ
正常なヒト心臓の小片および拡張型心筋症患者からの心臓の線維症領域の小片をホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、切片にした。切片は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴｅｘａｓのＪｏＡｎｎ Ｔｒｉａｌ博士から寄贈されたものであった。心臓切片のスライドをキシレン中で１０分間インキュベートして、パラフィンを除去した。次いで、切片を、順次（水中）１００％、９５％、７０％エタノール、次いで水に、ステップごとに５〜１０分間浸漬することによって水和した。切片をＰＢＳ中で５分間２回洗浄した。次いで、切片を１０ｍＭのクエン酸ナトリウム／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０に浸漬し、９７〜９８℃に予熱し、この温度で２０分間処理した。その後のステップは、別段の注記がない限り室温で行った。

切片を水中で５分間、次いでＰＢＳ中で５分間インキュベートした。切片を、２％ウシ血清アルブミン（ＶＷＲ）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＡ）で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＡを除去し、次いで、１〜２滴のアビジンブロッキング試薬（ＳＫ−２００２、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１０〜１５分間添加した。切片を５０ｍｌのＰＢＳ中で５分間２回すすいだ。切片を１〜２滴のビオチンブロッキング試薬（ＳＫ−２００２、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で１０〜１５分間インキュベートした。切片を５０ｍｌのＰＢＳ中で５分間２回すすいだ。切片を、０．０１％ＮＰ−４０ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＶＷＲ）を含む２％ＰＢＳＡ中で希釈した１μｇ／ｍｌのウサギポリクロナール抗ＮＥＵ３抗体（ＴＡ５９０２２８、Ｏｒｉｇｅｎｅ）中で、４℃にて終夜インキュベートした。切片を５０ｍｌのＰＢＳ中で１０分間２回洗浄した。次いで、切片を、２％ＰＢＳＡ中ビオチン標識を付けたロバ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（１：５０００）と共に３０分間インキュベートした。切片を５０ｍｌのＰＢＳ中で５分間２回すすいだ。切片を、２％ＰＢＳＡ中ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎアルカリホスファターゼ（Ｖｅｃｔｏｒ）（１：５００）と共に３０分間インキュベートした。切片を５０ｍｌのＰＢＳ中で各１０分間２回洗浄した。切片を５０ｍｌの水中で１回洗浄し、次いで５０ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．２中で５分間インキュベートした。切片を、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄアルカリホスファターゼ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ）と共に製造業者のプロトコールに従って５〜１０分間インキュベートした。７分後、切片を１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．２中で５分間洗浄した。切片を水中ですすぎ、Ｇｉｌｌの＃３ヘマトキシリンで１０秒間対比染色した。切片を水中で５分間１回洗浄した。次いで、スライドをＳｃｏｔｔの水道水中で３０秒間インキュベートした。切片を、順次７０％、９５％および１００％エタノール、次いでキシレンに、ステップごとに５分間浸漬することによって脱水した。切片を、永久封入剤（ＥＭＳ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）でカバーグラス下に封入した。

ＮＥＵ３の陽性染色は赤色であった。正常なヒト心臓（図３Ａ）に比べて、線維症心臓（図３Ｂ）は、ＮＥＵ３について強い染色を示した。これは、ヒト心筋線維症においてＮＥＵ３の発現が増加したことを明らかにし、他のヒト線維症について得られた結果と一致している。

（実施例５）
肝臓線維症におけるシアリダーゼ
正常なヒト肝臓の小片ならびに肝臓脂肪症および線維症患者からの肝臓の小片をホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、切片にした。切片は、Ｓａｎ ＤｉｅｇｏのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＴａｔｉａｎａ Ｋｉｓｓｅｌｅｖａ博士から寄贈されたものであった。その後の染色は、実施例４で正常および線維症ヒト心臓切片について記載されているように行った。

ＮＥＵ３の陽性染色は赤色であった。正常なヒト肝臓（図４Ａ）に比べて、脂肪症および線維症を伴う肝臓（図４Ｂ）は、ＮＥＵ３について強い染色を示した。これは、ヒト肝臓線維症においてＮＥＵ３の発現が増加したことを明らかにし、他のヒト線維症について得られた結果と一致している。

（実施例６）
ヒトにおける線維細胞形成に対するシアリダーゼの効果および線維細胞形成のＳＡＰ阻害
書面により同意し、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ被験者施設内治験審査委員会から特定の承認を得た健常成人志願者から、ヒト末梢血を収集した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液から単離した。ヒトＰＢＭＣを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１倍の非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１倍のＩＴＳ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した無血清培地（ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ基本培地（ＬＭ−０００１）、Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトシアリダーゼ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、１０μｇ／ｍｌのＤＡＮＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、または１μｇ／ｍｌのヒトＳＡＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在または非存在下でインキュベートした。５日後に、線維細胞を計数し、結果を図５に提示する。

ＮＥＵ２およびＮＥＵ４をヒトＰＢＭＣの培養物に添加すると、線維細胞形成が増強された。ＤＡＮＡは、線維細胞分化を阻害し、ＮＥＵ４による線維細胞分化の増強を阻害し、これにより、シアリダーゼ活性を低減すると、線維細胞形成を低減することができることが示された。

ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、およびＮＥＵ４は、ＳＡＰが線維細胞形成を阻害する能力を部分的に妨害し、これにより、ＳＡＰの脱シアリル化は、シアリダーゼによる線維細胞形成の増強の少なくとも部分的な原因となり得ることが示された。

しかし、ＮＥＵ１は、このアッセイにおいて線維細胞分化を増強することも、ＳＡＰを妨害することもなかった。

（実施例７）
ＴＧＦ−β１はヒト細胞におけるシアリダーゼ発現を増加させる
ＴＧＦ−β１は、線維症に強く関連しているので、シアリダーゼ発現に対するその効果を決定した。ヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９、ヒト末梢気道上皮細胞、ヒト肺線維芽細胞、およびヒト免疫細胞を、組織培養実験において使用される標準濃度である１０ｎｇ／ｍｌの組換え活性ＴＧＦ−β１と共にまたはそれを含まずに培養した。Ａ５４９細胞、気道上皮細胞、および線維芽細胞については３日後、または免疫細胞については５日後に、細胞をシアリダーゼに対する抗体で染色した。結果を図６Ａ〜４Ｄに提示する。

ＴＧＦ−β１により、Ａ５４９細胞が特徴的な形態の変化を受け、ＮＥＵ３のレベルを増加させた（図６Ａ）。ＴＧＦ−β１により、ヒト末梢気道上皮細胞もＮＥＵ３のレベルを増加させ、ＮＥＵ１のレベルを若干増加させた（図６Ｂ）。ＴＧＦ−β１は、ヒト肺線維芽細胞の増殖を増加させ、これらの細胞にＮＥＵ３のレベルを増加させた（図６Ｃ）。ＴＧＦ−β１は、ヒトＰＢＭＣの培養物中の一部の細胞においてＮＥＵ２およびＮＥＵ３のレベルを増加させた（図６Ｄ）。各図の結果は、３回の独立した実験を代表する。

したがって、シアリダーゼ発現、特にＮＥＵ３発現は、ＴＧＦ−β１によって増加される。

（実施例８）
ＮＥＵ２およびＮＥＵ３は、ＰＢＭＣによるＴＧＦ−β１の細胞内および細胞外蓄積をアップレギュレートする
シアリダーゼが細胞に細胞内および細胞外ＴＧＦ−β１を蓄積させ得るかどうかを決定するために、ヒトＰＢＭＣを、９６ウェルプレートにおいてシアリダーゼと共に、ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ無血清培地中、５×１０^５細胞／ｍｌおよび２００μｌ／ウェルで５日間培養し、次いで風乾した。細胞中または上のＴＧＦ−β１のレベルは、ＴＧＦ−β１に対する抗体で染色することによって検出した。５つの独立した試料を代表する顕微鏡写真を図７Ａに提示する。顕微鏡写真は、染色された細胞を計数し（図７Ｂ）、ＩｍａｇｅＪを使用して染色強度を定量化する（図７Ｃ）ことによって分析した。

ＰＢＭＣを、９６ウェルプレートにおいてＦｉｂｒｏＬｉｆｅ無血清培地中、５×１０^５細胞／ｍｌおよび２００μｌ／ウェルで培養した。細胞を播種するときに、組換えヒトシアリダーゼを２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、ＤＡＮＡまたはオセルタミビルを３μＭまで添加した。５日後に、ＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、培養上清を分析した。結果を図７Ｄに提示する。

ヒトＮＥＵ１およびＮＥＵ４は、ヒトＰＢＭＣに添加されると、ＴＧＦ−β１の蓄積に対して著しい効果を示さなかったが、ＮＥＵ２およびＮＥＵ３は、細胞随伴性ＴＧＦ−β１と細胞外ＴＧＦ−β１の両方を増加させた。シアリダーゼ阻害剤ＤＡＮＡまたはオセルタミビルを添加すると、細胞外ＴＧＦ−β１に対するＮＥＵ２およびＮＥＵ３の効果がブロッキングされ、これにより、ＮＥＵ２およびＮＥＵ３の効果がそれらのシアリダーゼ活性によるものであることが示された。これらのデータは、シアリダーゼが、細胞外ＴＧＦ−β１のレベルを増加させることによって線維症を増強することができる可能性があることを示唆する。

同様の実験では、抗体を使用して細胞をＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、またはＮＥＵ４について染色した。３回の実験を代表する画像を図７Ｅに示す。ＮＥＵ２は、ＰＢＭＣ中の一部の細胞にＮＥＵ３のレベルもアップレギュレートさせた。これは、あるシアリダーゼが別のシアリダーゼの発現を増加させ得ることを示し、やはり正のフィードバックループと一致している。

（実施例９）
マウス肺におけるシアリダーゼ
４〜６週齢の２０ｇのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、Ｌａｋａｔｏｓ， ＨＦ．ら、Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｌｉｃａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｗｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｌｕｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２巻：１８１〜１９９頁（２００６年）によって既述されているように、５０μＬの０．９％生理食塩水または５０μＬの０．９％生理食塩水中３Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の口腔咽頭吸引で処置した。ブレオマイシンの肺への吸引が成功したことは、吸引後に聞こえるクラッキング音を注意深く聞くことによって確認した。マウスを毎日秤量し、ブレオマイシン吸引後２１日目に、ＣＯ_２をＮＩＨガイドラインに従って使用して安楽死させた。米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って、実験を行った。Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ動物実験委員会がプロトコールを承認した。

安楽死後に、Ｌａｋａｔｏｓ， ＨＦ．ら、Ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｌｉｃａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｉｌｉｃｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｗｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｌｕｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２巻：１８１〜１９９頁（２００６年）によって既述されているように、肺を３００マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で灌流して、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を収集した。ＢＡＬを５００×ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化し、上清をエッペンドルフチューブに移した。上清を液体窒素で急速冷凍し、さらに使用するまで−２０℃で貯蔵した。

ＢＡＬ液を収集した後、マウス肺を予熱したＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）包埋剤（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）で膨張させ、次いでＯＣＴに包埋し、ドライアイスで冷凍し、次いで−８０℃で貯蔵した。６ミクロンのマウス肺凍結切片を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）顕微鏡用スライド（ＶＷＲ）に載せた。スライド上の切片を２４〜４８時間風乾させた。次いで、スライドを、室温でアセトンに２０分間固定し、１０分間風乾した。

次いで、一部のスライドを、上記のように２μｇ／ｍｌのビオチン化されたＭａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓレクチンＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、またはＰＮＡで染色した。染色の代表的な結果を図８Ａに提示する。ＩｍａｇｅＪを使用して定量化された染色結果を図８Ｂに提示する。ブレオマイシン誘導線維症マウスからの肺組織は、ＰＮＡ染色によって示されるように、線維症のないマウスからの肺組織より多い炭水化物全体を有するにもかかわらず、ＭＡＬ ＩＩ染色によって示されるように、線維症のないマウスからの肺組織より少ないα（２，３）結合を有するシアル酸を伴う多糖を含有した。これにより、線維症におけるシアリダーゼ活性の増加が示され、図２Ａ〜２Ｅのヒト肺データと組み合わせて、シアリダーゼ活性の低減が特定の結合に特異的でないことが示される。

次いで、スライドを、ＰＢＳ−ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌの抗ＮＥＵ１抗体、抗ＮＥＵ２抗体、もしくは抗ＮＥＵ４、または追加の０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％ＮＰ−４０ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）（ＰＢＳＳＮ）を含有するＰＢＳ−ＢＳＡ中０．５μｇ／ｍｌの抗ＮＥＵ３と共に、４℃で終夜インキュベートしたこと以外は全体的に以上の実施例３に記載されているように、やはりスライドをブロッキングし、染色した。

代表的な結果を図８Ｃに提示する。ＩｍａｇｅＪを使用して定量化された染色結果を図８Ｄに提示する。これらの結果から、ブレオマイシン誘導線維症マウスにおいては、線維症のないマウスに比べて、ＮＥＵ１、ＮＥＵ２、およびＮＥＵ３が増加したレベルで発現しているのは明らかである。ＮＥＵ４の増加は認められなかった。より高い倍率の画像は、線維症病変におけるアップレギュレートされたシアリダーゼの斑状分布を示した。これらの結果から、線維症時においてシアリダーゼの活性が、特にＮＥＵ１、ＮＥＵ２、およびＮＥＵ３に関して増加することも予想される。

ウェスタンブロット分析をマウスＢＡＬについても行った。２０μｌのＢＡＬ上清を、２０ｍＭのジチオスレイトールを含有するＬａｅｍｍｌｉの試料緩衝液と混合し、１００℃に５分間加熱した。試料を、４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｌｏｎｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）上にローディングした。

タンパク質を、２０％メタノールを含有するＴｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液中のポリビニリデンジフルオリド（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）膜に、製造業者のプロトコールに従って移した。膜を、４℃で１％ＢＳＡおよび５％脱脂乳タンパク質を含有するＰＢＳで終夜ブロッキングし、次いで、４℃で２μｇ／ｍｌのビオチン化されたＭＡＬ ＩＩまたはビオチン化されたＰＮＡと共に終夜インキュベートした。次いで、膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３０分にわたって洗浄し、次いで、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で１：５，０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に、室温で１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学ルミネセンス基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ペルオキシダーゼをＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して可視化した。結果を図８Ｅに示す。＊は、タンパク質が、ブレオマイシン誘導線維症マウスにおいてシアリル化の低減を示した場所を示す。矢印は、脱シアリル化されたタンパク質がこれらのマウスに存在している場所を示す。これらの結果は、線維症時におけるシアリダーゼ活性の増加と一致している。

ＢＡＬタンパク質も、２０％メタノールを含有するＴｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液中のポリビニリデンジフルオリド（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）膜に、製造業者のプロトコールに従って移した。膜を、４℃で１％ＢＳＡおよび５％脱脂乳タンパク質を含有するＰＢＳで終夜ブロッキングし、次いで、４℃で抗ノイラミニダーゼ３（ＴＡ５９０２２８、Ｏｒｉｇｅｎｅ）と共に、ＰＢＳ−ＢＳＡ中０．１８マイクログラム／ｍｌで終夜インキュベートした。次いで、膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３０分にわたって洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中ビオチン化されたロバ抗ウサギ（０．２マイクログラム／ｍｌ）（７１１−０６６−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共に、室温で１時間インキュベートした。ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中で１：５，０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に、室温で１時間さらにインキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学ルミネセンス基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ペルオキシダーゼをＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して可視化した。

結果を図８Ｆに提示し、図８Ｇで定量化する。ＮＥＵ３量の増加は、線維症のないマウスからのＢＡＬとは対照的に、ブレオマイシン誘導線維症マウスからのＢＡＬにおいて明確に示されているが、ＮＥＵ１、ＮＥＵ２、およびＮＥＵ４は検出されていない（データを示さず）。これは、線維症時におけるシアリダーゼレベル、特にＮＥＵ３のシアリダーゼレベルの増加とも一致する。

提示された処置群由来の溶解物を、総タンパク質量についてアッセイし、ＥＬＩＳＡによってＮＥＵ１（図８Ｈ）、ＮＥＵ２（図８Ｉ）、ＮＥＵ３（図８Ｊ）、またはＮＥＵ４（図８Ｋ）についてアッセイした。特に、肺組織溶解物を、ＰＢＳ中において総タンパク質量１００μｇ／ｍｌに希釈した。５５μｌの希釈された溶解物を、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに添加し、４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳ中に組換えＮＥＵ１、２、３、および４（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を系列希釈したものもインキュベートし、検量線に使用した。溶液を除去し、ウェルを、室温で振盪しながら２００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡで２時間ブロッキングした。次いで、抗ＮＥＵ１、２、３および４抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を製造業者の指示に従って、室温でＰＢＳ−ＢＳＡに１時間添加した。ＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄した後、ＰＢＳ−ＢＳＡ中ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）（１：１０００）を１時間添加した。洗浄した後、ＴＭＢ発色キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、結合している抗体を検出し、反応を１Ｎ ＨＣｌで止めた。ＳｙｎｅｒｇｙＭＸプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍおよび５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

肺組織溶解物のウェスタンブロットも調製し、抗ＮＥＵ３抗体を使用してＮＥＵ３についてアッセイし、クーマシーブリリアントブルーステインを使用して総タンパク質量についてアッセイした（図８Ｌ）。ＮＥＵ３および総タンパク質量を定量化した（図８Ｍ）。

生理食塩水対照に比べて、ブレオマイシン処置マウスは、肺溶解物において著しく高いレベルのＮＥＵ１、ＮＥＵ２およびＮＥＵ３を有したが、ＮＥＵ４を有さなかった。さらに、ウェスタンブロットでは、生理食塩水に比べて、ブレオマイシン処置マウスの肺組織溶解物は、著しくアップレギュレートされたレベルのＮＥＵ３を有した。これらの結果は、線維症時におけるシアリダーゼレベル、特にＮＥＵ３のシアリダーゼレベルの増加とも一致する。

（実施例１０）
シアリダーゼ阻害剤は、マウスにおいて線維症を低減し、シアリダーゼレベルを低減する
ＤＡＮＡは、哺乳動物のシアリダーゼすべてを阻害する。オセルタミビルは、ヒトシアリダーゼの不十分な阻害剤であるが、マウスシアリダーゼの強力な阻害剤であり、ＬＰＳ誘導マウスマクロファージシアリダーゼ活性を１μｍのＩＣ_５０で阻害する。

シアリダーゼ阻害剤が線維症を低減することを明らかにするために、マウスを口腔咽頭ブレオマイシンで処置して、実施例９について記載されている肺線維症の症状を誘導した。次いで、ブレオマイシンの投与後２４時間に開始して、マウスに１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ中ＤＡＮＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ中オセルタミビル（Ｓｉｇｍａ）を毎日腹腔内注射した。阻害剤は両方とも、極めて極性であり、したがっておそらく細胞外空間に残留したままである。２０グラムのマウスにおいて２ｍｌの細胞外空間を仮定すると、これらの用量は約３μＭになる。２１日目に、マウスを屠殺し、実施例３に記載されているように、肺のＢＡＬおよび凍結切片を得た。米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って、実験を行った。Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ動物実験委員会がプロトコールを承認した。

図９Ａ〜９Ｅは、シアリダーゼ阻害剤を毎日腹腔内注射すると、マウスブレオマイシンモデルにおいて２１日目に線維症が低減されたことを示す。図９Ａは、コラーゲンについて飽和ピクリン酸（Ｓｉｇｍａ）中０．１％シリウスレッド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）で１５分間染色された凍結切片を示す。画像は、１群当たりマウス３匹を代表する。図９Ｂは、シリウスレッド染色の定量化を示す。生理食塩水対照に比べて、ブレオマイシンは、肺におけるコラーゲン沈着（線維症）を誘導したが、このコラーゲン沈着は、ＤＡＮＡまたはオセルタミビルでの処置により減少した。これにより、シアリダーゼ活性を阻害すると、線維症が阻害されることが示された。

図９Ｃは、様々なマウスからのＢＡＬにおいて収集された細胞の総数を示す。線維症のないマウスより、ブレオマイシン誘導線維症マウスからのＢＡＬにおいて多くの細胞が収集された。シアリダーゼ阻害剤によって、収集された細胞の数が減少した。ＢＡＬ細胞数の増加は、肺液における炎症の増加を示しているので、これらの結果は、線維症時において、シアリダーゼ阻害剤は炎症を阻害することを示している。

図９Ｄは、ＢＡＬから収集されたＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ１１ｃ＋細胞の総数を示す。ＣＤ１１ｂは、炎症性好中球およびマクロファージのマーカーである。ＣＤ１１ｃは、在住肺マクロファージおよび樹状細胞のマーカーである。ブレオマイシン誘導線維症マウスでは、細胞レベルが両方のマーカーについて増加した。これらのレベルは、シアリダーゼ阻害剤によって低減され、これにより、シアリダーゼ阻害剤は炎症を阻害することができることが示された。

図９Ｅは、様々なマウスからのＢＡＬ中の総タンパク質量を示す。ブレオマイシンは、総タンパク質量の増加をもたらした。このＢＡＬ液タンパク質の増加は、シアリダーゼ阻害剤での処置によって減衰し、これにより、シアリダーゼ阻害剤は線維症時における浮腫および／または上皮障壁の破壊を阻害することが示された。

マウスを口腔咽頭ブレオマイシンで処置すると、初期の炎症が生じ、次いで線維症がブレオマイシン処置後１０日目までに始まった。処置が初期の炎症段階後に始まるときまた線維症が存在するときに、シアリダーゼ阻害剤が線維症を低減するかどうかを決定するために、マウスを口腔咽頭ブレオマイシンで処置して、上記の肺線維症の症状を誘導した。次いで、ブレオマイシンを投与後１０日目に開始して、マウスに１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ中ＤＡＮＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ中オセルタミビル（Ｓｉｇｍａ）を毎日腹腔内注射した。２１日目に、マウスを屠殺し、上記のように、肺のＢＡＬおよび凍結切片を得た。米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って、実験を行った。Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ動物実験委員会がプロトコールを承認した。

図９Ｆは、図９Ａと同様にしてコラーゲンについて染色された二組の凍結切片を示す。画像は、１群当たりマウス３匹を代表する。図９Ｇは、図９Ｆの染色の定量化を示す。生理食塩水対照に比べて、ブレオマイシンは、肺におけるコラーゲン沈着（線維症）を誘導し、このコラーゲン沈着は、１０日目に開始したＤＡＮＡまたはオセルタミビルでの処置により減少した。これにより、シアリダーゼ活性を阻害すると、既存の線維症が阻害されることが示された。図９Ｈは、様々なマウスからのＢＡＬにおいて収集された細胞の総数を示す。線維症のないマウスより、ブレオマイシン誘導線維症マウスからのＢＡＬにおいて多くの細胞が収集された。１０日目に開始したシアリダーゼ阻害剤での処置によって、収集された細胞の数が減少した。ＢＡＬ細胞数の増加は、肺液における炎症の増加を示しているので、これらの結果は、線維症が既に確立されているときに投与を開始すると、シアリダーゼ阻害剤は炎症を阻害することを示している。

図９Ｉは、ＢＡＬから収集されたＣＤ１１ｂ＋炎症性好中球およびマクロファージの総数を示す。ブレオマイシン誘導線維症マウスでは、ＣＤ１１ｂ＋細胞のレベルが増加した。これらのレベルは、１０日目に開始したシアリダーゼ阻害剤での処置によって低減され、これにより、線維症が確立された後の時点で投与を開始すると、シアリダーゼ阻害剤は炎症を阻害することができることが示された。

図９Ｊは、様々なマウスからのＢＡＬ中の総タンパク質量を示す。ブレオマイシンは、総タンパク質量の増加をもたらした。このＢＡＬ液タンパク質の増加は、１０日目に始めたシアリダーゼ阻害剤オセルタミビルでの処置によって減衰し、これにより、線維症が確立された後にシアリダーゼ阻害剤の投与が始まるとき、シアリダーゼ阻害剤は線維症時における浮腫および／または上皮障壁の破壊を阻害することが示された。

全体的に見て、図９Ａ〜９Ｊのデータは、シアリダーゼ阻害剤が線維細胞形成を低減し、線維症を予防または阻害する助けとなり得ることを示す。

図９Ｆ〜９Ｊと同様にして処置されたマウスにおいて、２１日目にＮＥＵ１、ＮＥＵ２およびＮＥＵ３染色の低減も認められた。３回の独立した実験を代表する結果を図９Ｋに提示し、ＩｍａｇｅＪによる定量化を図９Ｌ〜９Ｏに提示する。結果は、シアリダーゼ阻害剤がシアリダーゼ発現も低減することを示し、正のフィードバックループの阻害と一致している。

（実施例１１）
線維症マウス肺は、正常レベルの全シアル酸を含有する
線維症マウス肺における複合糖質上のシアル酸のレベルの低下が、全シアル酸レベルの低下によるものであるかどうかを決定するために、肺組織の小片のシアル酸含有量を決定した。０．２ｇのレゾルシノールを１０ｍｌの水に溶解した。１ｍｌの２％レゾルシノール保存液を、８ｍｌの１２Ｍ ＨＣｌと混合した。２５μｌの水中０．１Ｍ ＣｕＳＯ_４をこの溶液に添加し、体積を水で１０ｍｌに調整した。ＯＣＴ中で凍結（および図８Ｃで使用）された肺からの約１．２×１．２×１．２ｍｍの小片を収集した。ＯＣＴを融解させ、次いで、５００μｌのＰＢＳをピペットで試料に繰り返し取ることによって、肺の小片を洗浄した。これは、ＰＢＳの３等分ずつを用いて繰り返した。ＰＢＳを除去した後、肺の小片を秤量した。肺の小片を、エッペンドルフチューブ中の２００ｕｌのＰＢＳに入れた。シアル酸（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を秤量し、ＰＢＳに溶解して、一連の濃度標準を作製した。２００μｌのレゾルシノール／ＨＣｌ／ＣｕＳＯ_４溶液を、ＰＢＳ中の肺組織の小片、および２００μｌの標準液に添加した。次いで、チューブをヒートブロック中において１００℃で１５分間インキュベートし、次いで、チューブを水浴中で室温に冷却した。０．５ｍｌのイソアミルアルコールをチューブに添加し、１分間激しく振盪することによって混合した。チューブを氷水中で１５分間冷却し、次いで１０００×ｇで２分間遠心分離にかけた。１００μｌの上方のアミルアルコール相を９６ウェルプレートのウェルに移し、吸光度を４５０ｎｍおよび５８０ｎｍで読み取った。次いで、５８０ｎｍにおける吸光度を４５０ｎｍにおける吸光度から差し引き、検量線をプロットし、組織試料からの未知濃度のシアル酸を検量線から推定した。次いで、値を、シアル酸のｍｇ／組織１ｇに変換した。図１０に示されているように、対照（生理食塩水処置）肺と線維症（ブレオマイシン処置）肺のシアル酸含有量間に有意差はなかった。その場合、これにより、線維症肺において見られたシアリル化のレベルの低下はシアリダーゼ活性レベルの増加によるものであるという考えが裏付けられる。

（実施例１２）
シアリダーゼ阻害剤は、マウスにおいてＴＧＦ−β１レベルも低減する
シアリダーゼ阻害剤がマウスにおいてＴＧＦ−β１レベルも低下させることができるかどうかを決定するために、実施例９に記載されているように、マウスをブレオマイシンまたは生理食塩水で処置し、次いでブレオマイシン処置後１０日目に生理食塩水、ＤＡＮＡまたはオセルタミビルを毎日注射することを開始した。マウスを２１日目に安楽死させ、肺組織の切片をＴＧＦ−β１について染色した。結果は、図１１Ａに提示し、１群当たりマウス３匹の結果を代表する。図１１Ｂは、図１１Ａの染色のＩｍａｇｅＪによる定量化を示す。

ＤＡＮＡもオセルタミビルも、ブレオマイシン処置マウスにおいてＴＧＦ−β１レベルを低下させた。これは、ＴＧＦ−β１とシアリダーゼの間の関連と一致している。

以上に開示された主題は、例示的であって、限定的でないとみなされるべきであり、添付の特許請求の範囲は、本開示の真の趣旨および範囲内に入るような修正形態、強化形態、および他の実施形態をすべて包含するように意図されている。例えば、本開示は、ヒトシアリダーゼを阻害することに焦点を合わせているが、開示されているシアリダーゼ阻害剤は、他の哺乳動物のシアリダーゼ、特にヒトシアリダーゼと同様なタンパク質配列または構造を有するシアリダーゼに有効であり得る。他の哺乳動物のシアリダーゼに対するシアリダーゼ阻害剤の有効性は、本開示に記載の方法を使用して容易に決定することができる。さらに、本開示から、そのようなシアリダーゼ阻害剤を使用して、線維細胞および線維症に影響を及ぼす方法を適合させることができる。

Claims (32)

1. ヒトにおける線維症を予防または阻害する方法であって、化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せを、ヒトにおける少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害するのに十分な量および時間で前記ヒトに投与するステップを含む方法。
2. 化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せが投与される、請求項１に記載の方法。
3. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ１の活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
4. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ２の活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
5. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ３の活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
6. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ４の活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
7. α（２，６）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
8. α（２，３）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性が阻害される、請求項１に記載の方法。
9. 線維細胞の形成または活性化が、ＳＡＰに対するヒトシアリダーゼ活性の阻害の結果として阻害される、請求項１に記載の方法。
10. 化合物１〜５８の少なくとも１つが、前記ヒトに全身投与される、請求項１に記載の方法。
11. 化合物１〜５８の少なくとも１つが、前記ヒトのヒトシアリダーゼ活性が異常に高い領域に局所的に投与される、請求項１に記載の方法。
12. 化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せが、前記ヒトにおける少なくとも２つのヒトシアリダーゼの活性を阻害するのに十分な量および時間で前記ヒトに投与される、請求項１に記載の方法。
13. ヒトにおける線維症を予防または阻害する方法であって、化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せを、ヒトにおいてＴＧＦ−β１のレベルまたは活性を阻害するのに十分な量および時間で前記ヒトに投与するステップを含む方法。
14. 化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せが投与される、請求項１３に記載の方法。
15. 化合物１〜５８の少なくとも１つまたはその任意の組合せが、前記ヒトにおけるヒトシアリダーゼの活性をさらに阻害するのに十分な量および時間で前記ヒトに投与される、請求項１３に記載の方法。
16. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ１の活性が阻害される、請求項１５に記載の方法。
17. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ２の活性が阻害される、請求項１５に記載の方法。
18. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ３の活性が阻害される、請求項１５に記載の方法。
19. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ４の活性が阻害される、請求項１５に記載の方法。
20. α（２，６）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性が阻害される、請求項１５に記載の方法。
21. α（２，３）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性が阻害される、請求項１５に記載の方法。
22. ＴＧＦ−β１のレベルまたは活性の阻害の結果として、線維芽細胞の増殖または活性化も阻害される、請求項１３に記載の方法。
23. 化合物１〜５８の少なくとも１つが、前記ヒトに全身投与される、請求項１に記載の方法。
24. 化合物１〜５８の少なくとも１つが、前記ヒトのヒトシアリダーゼ活性が異常に高い領域に局所的に投与される、請求項１に記載の方法。
25. ヒトにおける線維症を予防または阻害する方法であって、少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性部位に結合する少なくとも１つの単離されたヒトまたはヒト化モノクローナル抗体をヒトに投与するステップを含み、ここで前記抗体が、前記ヒトにおける少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性を阻害するのに十分な量および時間で投与される、方法。
26. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ１の活性が阻害される、請求項２５に記載の方法。
27. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ２の活性が阻害される、請求項２５に記載の方法。
28. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ３の活性が阻害される、請求項２５に記載の方法。
29. ＳＡＰを脱シアリル化することにおいて少なくともヒトＮＥＵ４の活性が阻害される、請求項２５に記載の方法。
30. α（２，６）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性が阻害される、請求項２５に記載の方法。
31. α（２，３）結合を有する末端のシアル酸に対する少なくとも１つのヒトシアリダーゼの活性が阻害される、請求項２５に記載の方法。
32. 線維細胞の形成または活性化が、ＳＡＰに対するヒトシアリダーゼ活性の阻害の結果として阻害される、請求項２５に記載の方法。