JP5583575B2

JP5583575B2 - 感染症と関連炎症過程の治療のためのタンパク質生成物

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Publication number: JP5583575B2
Application number: JP2010500302A
Authority: JP
Inventors: フォルネス，マリアロササリアス; ソト，フランシスコロサノ
Original assignee: ユニベルシダードデバルセロナ
Priority date: 2007-03-28
Filing date: 2008-03-27
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2028-03-27
Also published as: US8691752B2; EP2143436A1; EP2143436B1; CA2681828A1; WO2008119851A1; ES2550389T3; US20100105622A1; EP2143436A4; JP2010522728A

Description

この発明は、医薬品の分野、特に、感染症及びそれに関連する炎症状態を治療的及び／又は予防的に処置する医薬の製造のためのタンパク質性の化合物に関する。

全身性微生物感染及び微生物生成物の放出により、宿主免疫細胞の活性化過剰、続いて炎症反応の悪化が生じる。敗血症(sepsis)は、この炎症を制御する免疫系の無能化を引き起こすもので、組織損傷、血管透過性の増加に至るおそれがあり、多臓器不全及びショック状態(敗血症性ショック)を引き起こしうる。

敗血症は、多くの原因に由来するが、典型的には、肺炎、外傷、手術、及び火傷、又は癌もしくはＡＩＤＳ等の病状により誘発されるおそれがある。敗血症は、通常、震え、熱、血圧低下(敗血症性ショック)、呼吸促迫、頻脈、及び皮膚損傷を伴って始まる。敗血症は、数時間内に、自発的な血管内での凝血、重度の低血圧、多臓器不全、ショック、壊疽、及び最終的には死に至らしめるおそれがある。敗血症は、ヒト及び他の動物における、高い罹患率及び死亡率(敗血症患者では７０％までの死亡率)の原因となり得る。アメリカ合衆国及びヨーロッパでは、年間１５０万人の人々が敗血症を発症している。これらの患者の３０％が１ヶ月後、２０％が６ヶ月後に死亡している。アメリカ合衆国では、敗血症は死亡原因の第１０位であり、これは、梗塞、乳癌又は肺癌により引き起こされる死亡率よりも高い。

敗血症における最も重要な治療介入は、素早い診断と処置である。敗血症の診断は困難である。その兆候のいくつか、例えば熱、頻脈、及び呼吸困難は頻繁に生じ、他の疾患によるものと混同されるおそれがある。重症の敗血症であると診断された患者は、特別な処置のために、通常は病院の集中治療室(ＩＣＵ)に配される。最初の処置は、潜在する感染を同定し、抗感染剤又は手術で除去して、感染部位を取り去ることである。敗血症を処置するための現在の方法には、抗菌剤、抗体、ペプチド、及びXigris(登録商標)としてEli Lillyから市販されているドロテコギン(drotecogin)アルファと命名された遺伝子組換えヒト活性化プロテインＣが含まれる。しかしながら、ドロテコギンアルファは、重症敗血症に関連した死亡率を５％低下させるのみで、全ての患者がこの薬剤に対してポジティブに反応するわけではない。また近年、ステロイド類も敗血症性ショックを患ってる患者に有益であることが示されている。さらに、医者は、血圧が低下しすぎるのを防止するために静脈内輸液を投与する。ある場合には、十分な血圧を達成するために(血管を収縮させる)昇圧剤が必要とされている。最後に、臓器不全が生じたならば、適切な対症療法(例えば、腎不全に対しては透析、呼吸器不全に対しては機械的人工呼吸等)が提供される。

敗血症反応における分子メディエイターに関する高レベルの過剰性のため、新規のアプローチは、敗血症カスケードにおける複数の点での介入に焦点があてられていると思われる。進行の初期段階でのいくつかの候補薬剤は、骨髄細胞に発現する誘発性レセプター-１(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-1; ＴＲＥＭ-１)レセプターアンタゴニスト(Merck & Co Inc and BioXell SpA)；及びスーパー抗原アンタゴニスト(Atox Bio Ltd)、スーパー抗原と称されるStaphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)及びStreptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)により生成される致死性細菌毒のファミリーの作用をブロックする短鎖ペプチド；免疫調節ホルモン(IRH, Hollis-Eden Pharmaceuticals Inc.)、免疫系及び代謝機能を制御する自己免疫及び抗炎症剤；及びグラム陰性敗血症を処置するためのアデノシンＡ１レセプターアンタゴニスト(Endacea Inc.)である。開発下にある他の分子は、Ｔｏｌｌ様レセプター４アンタゴニスト(Takeda及びEisai)；抗ＴＮＦαポリクローナル抗体断片(Protherics)；ウシ腸由来のアルカリホスファターゼ(AM-Pharma)；酸化窒素を中和するノラチオール(Norathiol)(Medinox)；及び2006年に欧州規制機関から販売承認を受けているトランスジェニック抗トロンビンＩＩＩＡＴｒｙｎ(登録商標)(GTC Biotherapeutics)、及びアメリカ合衆国における後期臨床試験にあるものである。

敗血症を処置するために他のアプローチが提案されており、例えば抗ＩＬ-８抗体(米国特許出願第2003021783A号)、抗ＩＬ-１８抗体(米国特許第20030008822A号)、抗Ｃ５ａ抗体及びＣ末端切断Ｃ５ａペプチド(米国特許第20020165138A号)、ケモカイン類及びケモカイン断片(米国特許第20020155094A号)、プロテインＣとＢＰＩ抗体の併用(米国特許第20020044929A号)、ＣＯＸ-２インヒビター(米国特許第20020006915A号)、藻類のリポ多糖類(米国特許第6534648号)、及びＴＮＦ-αに対する抗体及び細菌性リポ多糖類(米国特許第6315999号)に対する抗体の使用等である。しかしながら、重篤な感染の処置においては、過去数十年の間にかなり進歩しているのにもかかわらず、敗血症の発生率及び敗血症による死亡率は増加し続けている。よって、感染症及びこれらの感染症に関する炎症状態を予防及び処置するための新規の方法及び組成物を提供することが所望されている。

本発明者は、主としてリンパ系の細胞により発現する細胞表面レセプターであるヒトＣＤ６の外部ドメインが、グラム陰性菌及びグラム陽性菌由来のリポ多糖類(ＬＰＳ)及びリポタイコ酸(ＬＴＡ)等の保存された微生物構造に結合可能であることを見出した。驚くべきことに、ＬＰＳ-ＣＤ６相互作用は、哺乳動物において最も重要なＬＰＳレセプターのＣＤ１４とＬＰＳとの相互作用について報告されているものと大きさが同様な比較的高い親和性を示す。ＣＤ６は、スカベンジャーレセプターシステインリッチ(ＳＲＣＲ)ドメインを有する他のレセプターであるＳｐαよりも約１０倍強固にＲｅ-ＬＰＳに結合する。これらのデータにより、ＣＤ６の組換え型の腹腔内投与は、マウスにおいてＬＰＳにより誘発される敗血症性ショックに起因する致死効果を無効にするという発見に至っている。従って、ＣＤ６は、敗血症性ショック症候群、及び感染症に関連する他の炎症性疾患の治療介入に対する治療可能性を有している。

自然免疫反応は、微生物病原体の保存産物で、宿主に共有されず、生存に必須である、いわゆる病原体関連分子パターン(ＰＡＭＰｓ)を認識するという複数の非多型生殖細胞系にコードされたレセプターの能力に依存している。パターン認識レセプター(ＰＲＲｓ)は、主として食細胞(顆粒球、マクロファージ、樹状細胞)及び上皮障壁細胞により発現する。それらのいくつかは、多様な微生物成分と直接相互作用することが示されている。ここで、本発明者は、驚くべきことに、ヒトリンパ球において発現するＳＲＣＲスーパーファミリーのメンバーであるＣＤ６が、グラム陽性菌及びグラム陰性菌、並びに他の微生物(ウイルス、真菌)構造体に結合することを見出した。ＣＤ６の主として報告されている役割は、Ｔ細胞の活性化及び分化シグナルの調節である。さらに驚くべきことに、ＣＤ６は、微生物成分の存在を検知する能力を有している。これは、この活性がＣＤ１４及びＳｐα等のレセプターを発現するマクロファージに関連しているため、リンパ球の驚くべき活性である。興味あることに、競合結合実験では、ＣＤ６の細菌表面との相互作用が特異的であることが示されている。ＣＤ６とは異なり、ＣＤ５の外部ドメインを含む組換え型は、細菌又はＬＰＳには結合しない。また、データには、ＣＤ６が、分子の独立した非重複部位を介して、ＬＴＡ及びＬＰＳに結合することが示されている。

ＣＤ６の存在により細菌凝集が誘発される。Ｃａ^２＋の存在下でＣＤ６により誘発されるＬＰＳの凝集と併せて、細菌の凝集データには、ＣＤ６が、侵入細菌並びにＬＰＳ粒子の大きさ増加の一因である可能性が示されている。これにより、循環からの粒子排除が促進され、敗血症が致命的であり得る症例において、後に続く炎症過程を低減する。従って、ＬＰＳ投与の１時間前に、マウスに単一用量(２５μｇ)のＣＤ６を投与すると、ＣＤ５又は生理食塩水による処置と比較して、それらの生存率を有意に向上(７０％まで)させると同時に、これらのマウスにおける炎症誘発性のサイトカイン類であるＴＮＦ-α、ＩＬ-１β及びＩＬ-６の血清レベルについて有意な減少を誘導する。

低レベルの可溶性ＣＤ６が、ＥＬＩＳＡアッセイにより、正常なヒト血清中に見出されているが、その生化学的特徴付けは現在まで達成されていない。アフィニティークロマトグラフィー技術を使用することにより、ＣＤ６の組換え型と同様の分子量(ＭＷ)、抗体反応性、及び細胞結合特性を有し、ヒトＣＤ６の外部ドメインのみからなる天然の可溶性ＣＤ６(ｎｓＣＤ６)タンパク質が、プール化ヒト血清から精製された。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて共有するＬＰＳへの結合能と共に、これらのデータには、ＣＤ６がＣＤ６の循環型の生物活性を保持しており、天然ＣＤ６(約５．２７ｎｇ／ｍｌの濃度で血清中に存在)の入手性が低いの研究では、組換えＣＤ６の使用が有効であることが示されている。またこれらの結果によれば、患者への投与には、組換え型のＣＤ６の潜在的使用が有効である。

従って、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における、感染症、又は感染症に関連した炎症状態、又は感染病原体からの誘導産物の存在に関連した炎症性疾患を治療的及び／又は予防的に処置する医薬を製造するためのＣＤ６生成物の使用に関する。

また本発明は、有効量のＣＤ６生成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物における、感染症、又は感染症に関連した炎症状態、又は感染病原体からの誘導産物の存在に関連した炎症性疾患を治療的及び／又は予防的に処置するための方法として記載される。

本発明の特定の実施態様では、感染症は微生物感染である。さらなる特定の実施態様では、微生物感染は、細菌感染(グラム陰性又はグラム陽性菌)、寄生虫感染、ウイルス感染、真菌感染、及びそれらの組合せ(複数微生物感染)からなる群から選択される。

他の特定の実施態様では、感染症は敗血症である。ここで使用される場合、「敗血症(septicemia)」なる用語は、血流に任意の微生物が存在することを意味する。特に敗血症は、菌血症、ウイルス血症、真菌血症、寄生虫血症及びそれらの組合せからなる群から選択される。

生存微生物の存在は、感染症に関連した炎症状態のほとんどの場合に見出される一方、２０％〜３０％の患者は、任意の供給源から同定された微生物を有さないが、それらから誘導された産物を有する。よって、他の実施態様では、炎症状態は、感染病原体からの誘導産物に関する。特に、感染病原体は、細菌、寄生虫、ウイルス、真菌、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

敗血症は、全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ)と呼ばれる全身反応の兆候を伴う感染の存在又は存在の虞と定義される。敗血症の定義について、文献「Severe sepsis and septic shock: review of the literature and emergency department management guidelines」, H.B. Nguyenら, Ann. Emergency Med. 2006, vol. 48, pp. 28-54が参照される。敗血症は、通常、細菌感染(グラム陽性又はグラム陰性菌)に起因するが、他の病原体に起因する可能性もある。しかしながら、殆どの場合、敗血症はグラム陰性菌感染に起因する。しかしながら、この場合、敗血症に起因する損傷及び兆候は、細菌により引き起こされるばかりでなく、内毒素又はＬＰＳとして知られている細菌細胞壁の成分によっても引き起こされる。ＬＰＳ分子はグラム陽性菌の外膜に遍在する糖脂質である。ＬＰＳは、免疫系が侵入細胞を破壊する時に放出される。放出されたＬＰＳは単球、マクロファージ、及び内皮細胞に結合し、様々なメディエイター、例えばＴＮＦ-α及びインターロイキン類(ＩＬ-１、ＩＬ-６、及びＩＬ-８)の生成を惹起する。過剰のＴＮＦ-α、ＩＬ-１、ＩＬ-６及びＩＬ-８の生成は、敗血症の重篤な型の主要原因である。

本発明の特定の実施態様では、炎症状態はＳＩＲＳである。他の特定の実施態様では、炎症状態は敗血症である。ＳＩＲＳは次のうちの２又はそれ以上の存在として定義される：(１)３８℃を超えるか、又は３６℃未満の温度；(２)９０拍／分を越える脈拍数；(３)２０呼吸／分を越える呼吸速度(又は３２ｔｏｒｒ未満のＰＣＯ_２)；及び(４)１２０００／ｍｍ^３を越えるか又は４０００／ｍｍ^３未満の白血球数、又は１０％を越える未熟杆状球(band)型。

他の特定の実施態様では、炎症状態は重症敗血症である。重症白血病は、一又は複数の臓器不全を伴う敗血症であると定義される。臓器不全は、急性肺損傷；凝固異常；血小板減少症；異常な精神状態；腎臓、肝臓又は心不全；又は乳酸アジドーシスを伴う低灌流と定義することができる。

最後に、他の特定の一実施態様では、炎症状態は敗血症性ショックである。敗血症性ショックは、敗血症と難治性低血圧の存在、すなわち収縮期血圧が９０ｍｍＨｇ未満、平均動脈圧が６５ｍｍＨｇ未満、又は２０〜４０ｍｌ／ｋｇの晶質液投与に対して無反応なベースラインと比較して、収縮期血圧において４０ｍｍＨｇの低下と定義される。よって、敗血症性ショックは、事実上、重症敗血症の一形態である。

感染源は、体中の多くの場所の何れかでありうる。敗血症に至りうる感染の通常の部位には、次のものが含まれる：
− 虫垂の炎症(虫垂炎)、憩室炎、腸管障害、腹腔の感染(腹膜炎)、及び胆嚢又は肝臓の感染；
− 脳又は脊髄の炎症又は感染；
− 肺感染、例えば肺炎；
− 静脈内カテーテルにより生じた傷又は開口部を介した皮膚感染、蜂巣炎(皮膚の結合組織の炎症)；
− 尿路感染症、特に患者が尿を排出するために導尿カテーテルを有している場合；
− 歯科及び婦人科の検査及び処置；
− 刃物による又は貫通型の外傷、手術、及び心内膜炎。

ＣＤ６生成物の定義
ＣＤ６レセプターは、胸腺細胞、成熟Ｔ細胞、及びＢ１ａＢ細胞サブセットの膜で発現するリンパ系に特異的な表面糖タンパク質であるが、脳のある種の領域におけるＣＤ６発現も報告されている。ＣＤ６レセプターは、ＳＲＣＲと称されるシステインリッチ細胞外ドメインの一又はいくつかの繰り返しの存在により特徴付けられるＳＲＣＲサブファミリーに属する(M.R. Sarriasら, 「The Scavenger Receptor Cysteine-Rich (SRCR) domain: an ancient and highly conserved protein module of the innate immune system」, Crit. Rev. Immunol. 2004, vol. 24, pp. 1-37を参照)。その細胞外領域は、専ら、３つの連続したＳＲＣＲドメインからなる。機能上、それは、Ｔ(ＴＣＲ／ＣＤ３)及びＢ(ＢＣＲ)細胞に存在する抗原特異性レセプター複合体に物理的に結合し、そこでＣＤ６は、そのレセプター複合体により送達される活性化及び分化シグナルの正又は負の調節に寄与している。ＣＤ６がその天然リガンドＡＬＣＡＭに結合すること(「Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule」、CD166としても既知) (Bowenら, 「Adhesion Molecules, Their Receptors, and Their Regulation: Analysis of CD6-Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule (ALCAM/CD166) Interactions」, Transplantation Proceedings, 31, 795-796を参照)、Ｉｇスーパーファミリーの広範囲に発現する接着分子であることは十分に認められている。

ここで使用される場合、「ＣＤ６生成物」なる用語は、ＣＤ６外部ドメイン又はその断片を含む生成物であることを意味する。外部ドメインは、膜から離間した柄領域と介在配列を有する３つのＳＲＣＲドメインを意味する。適切なＣＤ６生成物には、ＣＤ６外部ドメイン又はその断片の天然、合成、又は生物学的に活性な組換えポリペプチド；ハイブリッド融合タンパク質又はその断片を含む、ＣＤ６外部ドメイン又はその断片の生物学的に活性なポリペプチド変異体；又はＣＤ６外部ドメイン又はその断片の生物学的に活性なポリペプチド類似体が含まれる。類似体には、一又は複数のアミノ酸が種々のアミノ酸で置き換えられた生成物が含まれる。保存的アミノ酸置換が好ましい。
ＣＤ６生成物は、哺乳動物由来、好ましくはヒト由来のものである。

ヒトＣＤ６は１００〜１３０ｋＤａである。GenBank受入番号NP_006716に記載されているヒト全長ＣＤ６タンパク質は、６６８アミノ酸を有している。外部ドメインは、３つのＳＲＣＲドメイン、介在配列、及び柄領域からなる。
特定の実施態様では、本発明のＣＤ６生成物は、配列番号：１のアミノ酸配列を含む。この配列は、３つのＳＲＣＲドメイン、介在配列、及び柄領域を含む。他の実施態様では、ＣＤ６生成物はマウスＣＤ６生成物である。

ＣＤ６の血漿レベルが低いため、精製血漿又は血清からＣＤ６を得ることは、工業的には実施が難しい。よって、本発明の目的のためには、遺伝子工学的な方法でＣＤ６生成物を生成することが好ましい。以下ｒＣＤ６と称される組換えＣＤ６を生産するために、当該分野で通常使用されている任意の方法を用いることができる。ｒＣＤ６を発現及び精製するための好ましい方法は、以下の実施例に記載される。この方法により、実験目的でｒＣＤ６を生成することが可能となり、多量のｒＣＤ６を生成するためには、工業的規模にスケールアップすることが必要とされる。また、本発明のＣＤ６を融合タンパク質として発現させてもよい。
ＣＤ６生成物が本発明の目的に適しているかどうか試験するために、微生物結合アッセイを使用しうる。適切なアッセイは実施例１に記載する。

本発明の教示に従えば、ＣＤ６生成物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。ＣＤ６を投与する目的は、予防(これらの疾患の発病を回避するため)及び／又は治療(これらの疾患を発病／取り込まれた場合に、それらを処置すること)でありうる。

ＣＤ６生成物は、製薬的に許容可能な形態で投与されることが理解される。当業者であれば、標準的な手順を使用し、適切な用量を確定しうる。用量は、処置される患者において炎症反応の低下が見られるという意味でのＣＤ６生成物の有効量とすべきであることが理解される。

本発明のＣＤ６生成物は、単独で、又は製薬的に許容可能な担体又は賦形剤との組成物として、投与されうる。当業者であれば、特定の投与方式に応じて、組成物を適合させるであろう。組成物は、感染症又はそれに関連する炎症状態に対する単剤、かかる薬剤の組合せ、又は状態に応じた他の治療剤との組合せとして、ＣＤ６生成物を含みうる。

特に定められない限りは、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、この発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここに記載のものに類似した又は均等な方法及び材料を、本発明の実施に使用することができる。明細書及び請求項の全体にわたって、「含む(含有する)」なる用語及びその変形態様は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は工程を排除することを意図したものではない。本発明の付加的な目的、利点及び特徴は、明細書の精査により当業者には明らかであろうし、又は本発明の実施により知得することもできるであろう。以下の実施例及び図は、例証のために提供されるものであって、本発明を限定することを意図したものではない。
実施例及び図において、ｒｓＣＤ６は、膜に結合したＣＤ６レセプターと区別される組換え的に得られた可溶性ＣＤ６外部ドメインを意味する。

図１は、グラム陽性及びグラム陰性菌へのｒｓＣＤ６の結合性を示す。Ａ)ストレプトアビジン-ＨＲＰを用いた、アフィニティー精製されビオチン標識されたタンパク質のウエスタンブロット分析。Ｂ)大腸菌及び黄色ブドウ球菌へのビオチン化タンパク質(ＢＳＡ、ｒｓＣＤ５、ｒＳｐα及びｒｓＣＤ６)の結合性。Ｃ)大腸菌又は黄色ブドウ球菌へのビオチン標識ｒｓＣＤ６及びｒＳｐαの結合のカルシウム依存性。ＴＰＡは「付加された全タンパク質」を意味する。Ｄ)増加した濃度のＬＰＳ又はＬＴＡの存在下における大腸菌及び黄色ブドウ球菌へのｒｓＣＤ６-ビオチンの競合結合アッセイ。Ｃは「競合体」を意味する。図２は、ヒト血清からアフィニティー精製された循環ＣＤ６の特徴付けを示す。Ａ)ヒト血清からのアフィニティー精製されたｎｓＣＤ６のクーマシーブルー染色。Ｂ)ビオチン標識され精製されたｎｓＣＤ６及びｒｓＣＤ６タンパク質、及びストレプトアビジン-ＨＲＰを用いた、表面ビオチン化ＨＵＴ-７８Ｔ細胞から免疫沈降された膜ＣＤ６のウエスタンブロット分析。Ｃ)ＣＤ６の細胞外領域に対して特異的なウサギポリクローナル抗血清を用いた、Ｂ)と同様のビオチン標識タンパク質のウエスタンブロット分析。Ｄ)Ｋ６５２及びＲａｊｉ細胞と、ビオチン標識ｒｓＣＤ５、ｒｓＣＤ６、ｎｓＣＤ６又はＢＳＡとの反応性のフローサイトメトリー分析。結合したタンパク質はストレプトアビジン-トリカラーを用いて検出された。Ｆ.Ｉ.は「蛍光強度」を意味し、Ｃ.Ｎ.は「細胞数」を意味する。図３は、ＬＰＳへのｒｓＣＤ６の結合性を示す。Ａ)ＬＰＳへのアフィニティー精製ｎｓＣＤ６及びｒｓＣＤ６の直接結合性を示すＥＬＩＳＡ。大腸菌から精製されたＬＰＳで、９６-ウェルマイクロタイタープレートをコーティングした。ついで、いくつかの濃度のビオチン標識ｒｓＣＤ６、ｎｓＣＤ６又はＢＳＡがウェルに添加され、結合したタンパク質がストレプトアビジン-ＨＲＰを用いて検出された。Ｒｅ-ＬＰＳへのｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５の結合性は、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ蛍光特性おける変化によりモニターされた。Ｐ.ａ.は「添加したタンパク質」を意味する。Ｂ)ｒｓＣＤ５ではなく、ｒｓＣＤ６は、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳへの結合時、蛍光異方性(「Ａ」と称する)における大幅な増加を誘発し、それは、ｒｓＣＤ６濃度の増加を伴い増加する。Ｃ)増加した量のｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５の添加時における、５２０ｎｍでのＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳの蛍光発光強度(「Ｆ」と称する)の純変化。直角双曲線に対して適合させた飽和曲線から算出した、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ／ｓＣＤ６複合体に対する見かけＫｄは、２．６９±０．３２×１０^−８Ｍであった。図４は、細胞表面ＣＤ６への大腸菌由来のＬＰＳの結合性を示す。Ａ)親及びＣＤ６.ｗｔ-形質移入２Ｇ５細胞への、増加した量のＬＰＳ-ＦＩＴＣ(０、１０、２０μｇ)の直接結合性を示すフローサイトメトリー分析。Ｃ.Ｎ.は「細胞数」を意味し、Ｆ.Ｉ.は「蛍光強度」を意味する。Ｂ)比較を簡単にするために、Ａ)の平均蛍光強度は、各細胞系に添加されたＬＰＳ-ＦＩＴＣの量に対してプロットされた。Ｇ.Ｍ.は「幾何平均(Geo Mean)」を意味する。Ｃ)２Ｇ５-ＣＤ６.ｗｔ形質移入体へのＬＰＳ-ＦＩＴＣ結合性の競合実験。増加した量(０、１０、２０μｇ)のｒｓＣＤ６の存在下、１５μｇのＦＩＴＣ-ＬＰＳ(左)又は１５μｇのｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５(右)のいずれかと共に、細胞をインキュベートした。蛍光強度はフローサイトメトリーにより分析した。図５は、ｒｓＣＤ６が細菌凝集を誘発することを示している。Ａ)ＦＩＴＣ標識された大腸菌及び黄色ブドウ球菌の懸濁液は、５ｍＭのＣａ^２＋の存在下、ｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５(２μＭ)と共に、室温(ＲＴ)で一晩インキュベートされた。それぞれ正及び負のコントロールとして、等モル濃度のｒＳｐα及びＨＳＡが使用された。蛍光顕微鏡における直接調査により、凝集が観察された。Ｂ)増加した濃度のｒｓＣＤ６の不在下(●)及び存在下における、Ｃａ^２＋依存性Ｒｅ-ＬＰＳ凝集の動態。Ｒｅ-ＬＰＳ、カルシウム及びＥＤＴＡの最終濃度は、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、２．５ｍＭ及び５ｍＭであった。ｒｓＣＤ６の最終濃度は、０．２５(○)、０．５０(△)、１．０(●)、２．０(□)μｇ／ｍｌであった。２つ実施したうちの一つの代表的実験を示す。時間はＴ(分)として示す。図６は、ＬＰＳにより誘発される敗血症性ショック後のサイトカイン血清レベル、及び生存率におけるｒｓＣＤ６及びｒｓＣＤ５の効果を示す。Ａ)生存(Ｓ)グラフ。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス(８週)は、滅菌生理食塩水(「Ｓ」と称する)(ｎ＝２６)又はｒｓＣＤ５(ｎ＝１０)又はｒｓＣＤ６(ｎ＝１６)(各２５μｇ)のいずれかを腹腔投与した１時間後、大腸菌０１１１：Ｂ４からの致死量(３０ｍｇ／ｋｇ)もＬＰＳが腹腔に注射された。生存しているマウスの割合は、グラッドパス・プリズム(Gradpath prism)４．０を使用して解析され、ｌｏｇ順位ｔ検定Ｐ値が算出された。Ｂ)ＬＰＳが投与されたマウスにおけるサイトカインの循環レベル。ＴＮＦ-α、ＩＬ-１β及びＩＬ-６の血漿レベルが、ＬＰＳ注入後、異なる時間でのＥＬＩＳＡにより定量された。データは平均±ＳＥＭとして表される。結果における統計学的差異は、両側スチューデントｔ検定により評価された。^★、統計学的に有意な差(Ｐ＜０．０５)。時間はＴ(min)として示す。図７は、酵母(出芽酵母：Saccharomices cerevisae)から抽出されたザイモサンへのｒｓＣＤ６の結合性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果において、Ａは「吸光度」、Ｚは「ザイモサン」、Ｐは黄色ブドウ球菌から精製された「ペプチドグリカン」を意味する。大腸菌(E. coli)株Ｏ１１１：Ｂ４から精製されたＬＰＳ及びＢＳＡは、正及び負のコントロールである。図８は、ＨＩＶ表面タンパク質ｇｐ１２０に結合する、ｒｓＣＤ６の結合性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果。図９は、ヒトサイトメガロウイルス粒子に結合する、ｒｓＣＤ６の結合性を示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果。

細胞
ヒトリンパ芽球様Ｂ細胞系ラジ、赤骨髄細胞系Ｋ５６２、並びに白血病Ｔ細胞系ＨＵＴ-７８を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Manassas, VA)から得た。ＣＤ５-及びＣＤ６-陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞２Ｇ５を、蛍光活性化細胞選別(ＦＡＣＳ)から得、さらに報告されている(M. Simarroら, 「The cytoplasmic domain of CD5 mediates both TCR/CD3-dependent and -independent diacylglycerol production」, J. Immunol. 1997, vol. 159, pp. 4307-4315)ようにして、Ｊｕｒｋａｔ細胞をクローニングした。２Ｇ５Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ｐＨ^β-ＣＤ６.ｗｔコンストラクトを用いて、安定して形質移入させた。簡単に述べると、野生型ＣＤ６(ｐＨ^β-ＣＤ６・ｗｔ)をコードする発現コンストラクトを、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ-制限ｐＨ^βＡＰｒ-１-ネオ哺乳動物発現ベクター内で、それぞれＣＤ６の細胞外及び細胞質領域に相当するＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ-及びＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ-制限(フェルメンタス(Fermentas)ＭＢＩ)をクローニングすることにより得た。ＣＤ６の細胞外部分を、5'TCTCGTCGACATGTGGCTCTTCTTCGGGAT3'(配列番号：２)及び5'AACTTCTTTGGGGATGGTGATGGG3'(配列番号：３)プライマー、及びテンプレートとしてｐＢＪｎｅｏ内にクローニングされたＣＤ６-ＰＢ１ｃＤＮＡ配列を使用してＰＣＲ増幅することにより得た。ＣＤ６の細胞内領域を、5'GTCACTATAGAATCTTCTGTG3'(配列番号：４)及び5'AAAGGATCCCTAGGCTGCGCTGATGTCATC3'(配列番号：５)プライマーを用い、ＨＵＴ７８ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより得た(I. Gimferrerら, 「The accessory molecules CD5 and CD6 associate on the membrane of lymphoid T cells」, J. Biol. Chem. 2003, vol. 278, pp. 8564-71を参照)。

特に示さない限りは、この研究で使用される全ての細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び１０％のＦＣＳ(GIBCO Invitrogen, Paisley, UK)が補填されたＲＰＭＩ１６４０培地(Life Technologies, Gaithesburg, MD)中で増殖させた。ヒト胎児腎臓上皮細胞系ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ(Invitrogen Life Technologies, Paisley, U.K.)を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌのジェネティシン(Ｇ４１８)、及び１０％のＦＣＳが補填されたダルベッコ変性イーグル培地(DMEM/F12; Invitrogen Life Technologies)において増殖させた。

抗体及び試薬
ｍＡｂｓＣｒｉｓ-１(抗ＣＤ５、ＩｇＧ２ａ)及び１６１．８(抗ＣＤ６、ＩｇＧ１)は、R. Vilella博士(Hospital Clinic, Barcelona, Spain)により生産された。マウス抗ヒトＣＤ６ｍＡｂｓＭＡＥ１-Ｃ１０(ＩｇＧ１)及びＳＰＶ-Ｌ１４．２(ＩｇＧ１)は、それぞれF. Sanchez-Madrid博士(Hospital de la Princesa, Madrid, Spain)(L. Cardenasら,「Phosphorylation-Dephosphorylation of the CD6 Glycoprotein Renders 2 Isoforms of 130 and 105 Kilodaltons - Effect of Serum and Protein-Kinase-C Activators」 Journal of Immunology 1990, vol. 145, pp. 1450-55を参照)及びJo Hilders博士(Bioprobe B.V., The Netherlands)により提供された。ヒトＣＤ６の細胞外領域に対するウサギポリクローナル抗血清を、ｒｓＣＤ６を用いた免疫化により研究室で生産した(I. Gimferrerら, J. Biol. Chem. 2003, vol. 278, pp. 8564-71を参照)。

次の試薬を購入した：ＨＲＰ結合ストレプトアビジン(DakoCytomation, Glostrop, Denmark); ＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇ(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); 大腸菌(Ｏ５５：Ｂ５、Ｏ２６：Ｂ６、Ｏ１１１：Ｂ４)からの精製されたＬＰＳ及び黄色ブドウ球菌からのリポタイコ酸(ＬＴＡ)、並びに大腸菌０１１１：Ｂ４からのＦＩＴＣ-ＬＰＳ(Sigma-Aldrich)。ＰＢＳ(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)は、１３７ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４であり；ＴＢＳは、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．４である。ＨＳＡは Grifols (Grifols, Barcelona, Spain)からのものであった。Ｒｅ-ＬＰＳ、Salmonella MinnesotaからのＬＰＳのＲｅ５９５変異体は、Sigmaからのものであった。フルオレセイン、及びフルオレセイン-５-イソチオシアナート(ＦＩＴＣ、異性体Ｉ)はMolecular Probes (Eugene, OR)からのものであった。Ｒｅ-ＬＰＳを溶解させるために使用されるメタノール及びクロロホルムは、ＨＰＬＣグレード(Scharlau, Barcelona)であった。

可溶性組換えタンパク質の発現及びアフィニティー精製
ヒトＣＤ６の外部ドメイン(ｒｓＣＤ６アミノ酸Ｄ２５ないしＥ３８４、未熟タンパク質ナンバリング)を、エピソーム発現系を使用し、ヒト胎児腎臓細胞(ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ)において発現させた。これらの細胞は、T. Sasaki博士及び R. Timpl博士(Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried, Germany)からの親切な提供物であるｐＣＥＰ-Ｐｕベクターのエピソーム複製を可能にする、エプスタイン・バーウイルスタンパク質ＥＢＮＡ-１を後続的に発現させる(E. Kohfeldtら, 「Properties of the extracellular calcium binding module of the proteoglycan testican」, 1997, FEBS Lett. Vol. 414, pp. 557-61を参照)。ＣＤ６の細胞外領域を、5'CTTCTAGATGACCAGCTCAACACCACCAGCA3'(配列番号：６)及び5'GCGGATCCCTA TTCTATAGTGACTGTCTGAACA3'(配列番号：７)、及びテンプレートとしてＣＤ６-ＰＢ１ｃＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅させた(W.H. Robinsonら, 「Human CD6 possesses a large, alternatively spliced cytoplasmic domain」, Eur. J. Immunol. 1995, vol. 25, pp. 276を参照)。ＰＣＲ生成物をｐＣＥＰ-Ｐｕベクター中にクローニングした。得られたコンストラクトをＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞に形質移入させた。簡単に述べると、１０ｃｍの培養皿中の１０^６細胞を、２０μｇのプラスミドを用いたリン酸カルシウム法を使用して形質移入させた。培養培地において、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン(Sigma, St. Louis, MO)を用い、形質移入体を選択した。ｒｓＣＤ６を発現する細胞形質移入体を、ＤＭＥＭ／ＦＣＳにコンフルエンス状態になるまで増殖させ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS, Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)で２回洗浄し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８、及び１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有する無血清培地(ＤＭＥＭ／Ｆ１２)と交換した。１５日以上、培地を４８−７２時間毎に収集した。組換えタンパク質を、ｍＡｂ１６８．１(抗ＣＤ６)と共有結合したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラム上でアフィニティー精製した。ついで、未結合のタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌと１％のＮＰ４０を含有するＰＢＳで洗浄した。３．５ＭのＭｇＣｌ_２を含有するＰＢＳでタンパク質を溶出させ、ＰＢＳで透析した。精製されたタンパク質の純度を還元条件下、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、またクーマシーブルー染色により評価した。

タンパク質のビオチン化
タンパク質ビオチン化を、製造者の使用説明書に従い、先に記載したようにして、ＥＺ-リンク-ＰＥＯ-マレイミド活性化ビオチン(Pierce, Perbio Science, Cheshire, UK)を用いて実施した(M.R. Sarriasら, 「A role for human SP alpha as a pattern recognition receptor」, J. Biol. Chem. 2005, vol. 280, pp. 35391-8を参照)。遊離のビオチンをHiTrap^TM脱塩カラム上、ＰＢＳに対してサンプルを交換することにより除去した(Amersham Pharmacia Biotech)。ビオチン化反応のモニタリングをウエスタンブロット分析により実施した。

菌種及び細菌結合研究
この研究において使用される大腸菌と黄色ブドウ球菌の菌株は、標準的な生化学手順を使用し、バルセロナ病院の微生物学部門で特徴付けられた臨床分離株である。通気しつつ、３７℃でＬＢ培地(ＬＢ)中で細菌を一晩増殖させ、ついで、１０分、３５００×ｇで遠心分離することにより収集した。細菌ペレットを、ｍｌ当たり１０^１０菌の最終密度になるまで、ＴＢＳ(１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．４)に再懸濁させた。寒天に細菌希釈液を蒔くことにより定量を行った。細菌へのｒｓＣＤ６の結合性を、以前に記載されたような方法に従い研究した(M.R. Sarriasら, J. Biol. Chem. 2005, vol. 280, pp. 35391-8を参照)。

ヒト血清からの可溶性ＣＤ６の精製
健康な献血者からプール化された１リットルのヒト血漿を、バルセロナ病院の血液銀行から得た。血漿を１５分、１００００ｇで遠心分離し、０．２２μｍフィルターで濾過した(Millipore, Billerica, MA, USA)。ついで、血漿を、２ｍｇ／ｍｌのアプロチニン及びロイペプチン(leupeptin)、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．０２％のアジ化ナトリウム、及び０．５％のＮＰ-４０の存在下、４℃で３０分、２０％(ｗ／ｖ)の(ＮＨ_４)_２ＳＯ_４を用いて沈殿させ、ついで、４℃で３０分、１００００ｇで遠心分離した。得られた上清を、４℃で３０分、７０％(ｗ／ｖ)の(ＮＨ_４)_２ＳＯ_４にし、ついで４℃で３０分、１００００ｇで遠心分離した。ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、１ｍＭのＰＭＳＦ及び０．０２％のアジ化ナトリウムが補填されたＰＢＳに対し、４℃で透析にかけた。透析されたタンパク質を、ＣＮＢｒ-活性化セファロース-４Ｂカラム(Amersham Pharmacia Biotech)上でアフィニティー精製し、抗ＣＤ６ｍＡｂＳＰＶ-Ｌ１４．２に吸着させた。溶出したフラクションにおけるＣＤ６の存在性を、特定のｍＡｂｓを用い、サンドイッチＥＬＩＳＡ(M. Ramos-Casalsら, 「High circulating levels of soluble scavenger receptors (sCD5 and sCD6) in patients with primary Sjogren's syndrome」 Rheumatology 2001, vol. 40, pp. 1056-9を参照)及びウエスタンブロットにより評価した。純度をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により評価した。

ＬＰＳ結合ＥＬＩＳＡアッセイ
大腸菌Ｏ５５：Ｂ５、Ｏ１１１：Ｂ４又はＯ２６：Ｂ６(Sigma)から精製された１２μｇのＬＰＳを使用し、４℃で一晩、ＰＢＳにおいて、９６-ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)をコーティングした。室温で１時間、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳを添加することにより、ウェルへの非特異的結合を防止した。ついで、いくつかの濃度のビオチン標識ＢＳＡ、ｒｓＣＤ６又はｎｓＣＤ６をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。１：１０００希釈のＨＲＰ標識ストレプトアビジン(DAKO, Glostrup, Denmark)を添加することにより結合したタンパク質を検出し、室温で３０分インキュベートした。各インキュベート工程の間、未結合のタンパク質又はＨＲＰ-ストレプトアビジンを、０．０１％のトゥイーン-２０が添加されたＰＢＳで３回洗浄した。３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン液状基質(Sigma)を添加することにより発色させ、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。同様の結果のアッセイを３回繰り返した。

ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳに対する可溶性タンパク質の結合アッセイ
蛍光Ｒｅ-ＬＰＳ誘導体(ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ)を調製し、ここで、Ｒｅ-ＬＰＳのホスホエタノールアミン基をＦＩＴＣに結合させ、以前に記載された方法により調製した(R.R. Skellyら, 「Stimulation of T-independent antibody responses by hapten-lipopolysaccharides without repeating polymeric structure」, Infect. Immun.1979, vol. 23, pp. 287-93を参照)。５×５ｍｍ路長の石英キュベットを使用し、温度制御されたキュベットホルダー(±０．１℃)を具備するＳＬＭ-アミンコ(Aminco)ＡＢ-２蛍光光度計を用いて蛍光測定を実施した。ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ(０．５μｇ／ｍｌ)の蛍光発光スペクトルを、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー(ｐＨ８)において、１５℃にて、ｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５のいずれかの存在下又は不在下にて測定した。ブランク(タンパク質単独)及びＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳサンプル(タンパク質を有する又は有さない)を４７０ｎｍで励起させ、発光スペクトルを５００〜６５０ｎｍで記録した。１５℃で、０．５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳが種々の濃度のｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５と反応した場合の、蛍光変化の時間依存性を分析することにより、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ/タンパク質複合体の見かけＫｄを得た。蛍光発光を５２０ｎｍで３０分モニターした。ＬＢＰ、ＣＤ１４、表面タンパク質Ａ、及びｒＳｐαとＲｅ-ＬＰＳとの相互作用のＫｄ測定にについては、以前に記載されたようにして、これらの実験を２回実施した(M.R. Sarriasら, J. Biol. Chem. 2005, vol. 280, pp. 35391-8; P.S. Tobiasら, 「Lipopolysaccharide binding protein-mediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD14」, J. Biol. Chem. 1995, vol. 270, pp. 10482-8; 及びI. Garcia-Verdugoら, 「Interaction of SP-A (surfactant protein A) with bacterial rough lipopolysaccharide (Re-LPS), and effects of SP-A on the binding of Re-LPS to CD14 and LPS-binding protein」, Biochemical Journal 2005, vol. 391, pp. 115-24を参照)。
以前に記載されたようにして、蛍光発光異方性測定をグラン・プリズム偏光子を用いて得た(I. Garcia-Verdugoら, Biochemical Journal 2005, vol. 391, pp. 115-24を参照)。励起及び発光波長を、それぞれ４７０及び５２０ｎｍに設定した。

細菌及びＬＰＳ凝集アッセイ
細菌凝集アッセイを、以前に記載されたようにして実施した(M.R. Sarriasら, J. Biol. Chem. 2005, vol. 280, pp. 35391-8を参照)。ｒｓＣＤ６により誘発されるＬＰＳ凝集を、記載されているように、ベックマン(Beckman)ＤＵ-６４０分光光度計において、４００ｎｍの吸光度の変化を測定することにより１５℃で調査した(I. Garcia-Verdugoら, Biochemical Journal 2005, vol. 391, pp. 115-24を参照)。簡単に述べると、まず、サンプル及び参照キュベットに、５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー(ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡにＲｅ-ＬＰＳ(１００μｇ／ｍｌ、最終濃度)が入ったものを充填した。１５℃で１０分の平衡期間後、示した濃度のｒｓＣＤ６をサンプルキュベットに添加し、４００ｎｍの吸光度の変化をモニターした。次に、Ｃａ^２＋(２．５ｍＭ)を、サンプル及び参照キュベットの双方に添加し、再度、吸光度の変化をモニターした。ＥＤＴＡ(５ｍＭ、最終濃度)を添加することにより、Ｃａ^２＋依存性ＬＰＳ凝集を逆行させた。

フローサイトメトリーアッセイ
可溶性タンパク質の細胞結合特性を、以前に記載されたようにして評価した(J. Calvoら, 「Identification of a natural soluble form of human CD5」 Tissue Antigens 1999, vol. 54, pp. 128-37を参照)。細胞表面ＣＤ６へのＬＰＳの結合性を、２Ｇ５-ＣＤ６.ｗｔ細胞系を使用することにより評価した。簡単に述べると、２×１０^５の細胞を、ブロック用バッファー(ＰＢＳと、１０％のヒトＡＢ血清、２％のＦＣＳ、及び０．０２％のアジ化ナトリウム)の存在下、種々の量の、大腸菌０１１１：Ｂ４(Sigma)からのＬＰＳ-ＦＩＴＣと共にインキュベートした。４℃でインキュベートして１時間後、洗浄用バッファー(ＰＢＳと、２％のＦＣＳ及び０．０２％のアジ化ナトリウム)で、細胞を２回洗浄した。競合研究用に、１５μｇのＦＩＴＣ-ＬＰＳを、種々の量のｒｓＣＤ５又はｒｓＣＤ６の存在下、２×１０５の２Ｇ５-ＣＤ６.ｗｔ細胞と共に、氷上で３０分インキュベートした。

ＣＤ６免疫沈降
細胞表面に結合したＣＤ６(ｍＣＤ６)の免疫沈降については、１×１０^６のＨＵＴ-７８Ｔ細胞を、製造者の使用説明書に従い、ＥＺ-リンク-ＰＥＯ-マレイミド活性化ビオチン(Pierce, Perbio Science, Cheshire, UK)を用いて表面標識した。ついで、膜をトリトンＸ-１００洗浄剤で可溶化させ、１μｇの抗ＣＤ６ｍＡｂ(１６１．８)と２０μｌの５０％プロテインＡセファロースＣＬ-４Ｂビーズ(Amersham Biosciences)を用い、４℃で２時間、タンパク質を免疫沈降させた。免疫複合体をウエスタンブロットにより、記載されたようにして分析した(I. Gimferrerら, J. Biol. Chem. 2003, vol. 278, pp. 8564-71を参照)。

ＬＰＳにより誘発される内毒素性ショック
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス(８週)に、２５０μｌ容量の滅菌生理食塩水に致死量(３０ｍｇ／ｋｇ)の大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４からのＬＰＳ(Sigma, St. Louis, MO)が入ったものを、腹腔注射した。ｒｓＣＤ５(１０匹のマウス)又はｒｓＣＤ６(１６匹のマウス)のいずれかを２５μｇ、ＬＰＳチャレンジの１時間前に投与した。対照マウスに同容量の滅菌生理食塩水(２６匹のマウス)を受容させた。生存しているマウスのパーセンテージを、グラッドパス・プリズム４．０を使用して分析し、ｌｏｇ順位ｔ検定Ｐ値を算出した。
実験手順はムルシアの大学の倫理委員会が承認しており、実験動物の世話と使用についての、スペイン(RD 1201/2005)、欧州(86/609)及び国立保険指針研究所(National Institutes of Health's Guide)の規定と適合する施設動物の世話のガイドラインに従い実施した。

サイトカイン血清レベルの測定
各グループの６匹のマウスからのプールした血清サンプルにおいて、ＴＮＦ-α、ＩＬ-１β及びＩＬ-６サイトカインの全身性放出性を、製造者の使用説明書(R&D Systems, Minneapolis, MN)に従い、ＥＬＩＳＡにより測定した。データを平均±ＳＥＭとして表す。結果における統計的差異を両側スチューデントｔ検定により評価した。

実施例１：ｒｓＣＤ６はグラム陽性及びグラム陰性菌に結合する
ヒトＣＤ６の外部ドメインが、全細菌の表面に直接結合可能であるかどうかを決定するために、D.W. Dunneら, 「The Type-I Macrophage Scavenger Receptor Binds to Gram-Positive Bacteria and Recognizes Lipoteichoic Acid」, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1994, vol. 91, pp. 1863-7に記載されたアプローチを使用した。よって、ヒトＣＤ５、ＣＤ６及びＳｐαの外部ドメインを含むビオチン標識された可溶性組換えタンパク質(ｒｓＣＤ５、ｒｓＣＤ６、及びｒＳｐα)を細菌懸濁液と共にインキュベートし、それらの細菌ペレットへの結合性を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びストレプトアビジン-ＨＲＰに対するウエスタンブロットによりさらにアッセイした。結果は、ｒｓＣＤ６がグラム陽性及び陰性菌に結合する(図１Ｂ)ことを示し、このタンパク質が細菌結合活性を有していることが示された。これに対し、ｒｓＣＤ５も負のコントロールＢＳＡのいずれも細菌懸濁液に結合しなかった。図１Ｃに示されているように、ビオチン標識されたｒｓＣＤ６の存在は、ＥＤＴＡの存在下で、大腸菌及び黄色ブドウ球菌細胞ペレットにおいて大きく低減した。これは、ｒｓＣＤ６が、グラム陽性及び陰性菌由来の細胞壁成分のＣａ^２＋依存性認識を媒介することを示している。

細菌へのｒｓＣＤ６の観察された結合性が特異的であるかどうかを決定するため、またどの細菌細胞の表面構造が認識されているかを同定するために、競合実験を設定し、そこで、ビオチン標識ｒｓＣＤ６を、大腸菌又は黄色ブドウ球菌(５×１０^７細胞)のいずれかの懸濁液の添加前に、増加する濃度の精製ＬＰＳ又はＬＴＡと共にインキュベートした。ＬＰＳ及びＬＴＡは、これらがこれらの微生物の遍在する細胞表面成分であるためにアッセイした。図１Ｄに示されるように、大腸菌へのビオチン標識ｒｓＣＤ６の結合性は、用量に依存する形で、ＬＰＳ(大腸菌由来)とは競合するが、ＬＴＡ(黄色ブドウ球菌由来)とは競合しなかった。これに対して、黄色ブドウ球菌へのｒｓＣＤ６の結合性を研究した場合、ＬＰＳはこのような相互作用に影響を及ぼさなかった。興味深いことに、この結合は、用量に依存する形で、黄色ブドウ球菌由来のＬＴＡと競合した。

実施例２：ヒト血清からのｎｓＣＤ６の精製
天然ｓＣＤ６を１ｌのプール化血漿からアフィニティー精製した。これにより、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析及びクーマシーブルー染色から推定されるように、８０ｋＤａの分子量(ＭＷ)の６μｇの単一タンパク質が生じた(図２Ａ)。観察されたＭＷは、研究室で生産された可溶性組換えＣＤ６(ｒｓＣＤ６)のものに非常に類似しており、ＣＤ６の３つの細胞外ＳＲＣＲドメインから専らなり、ＣＤ６の膜形態のもの(ｍＣＤ６)とは対照的であり、そのリン酸化の度合いに応じて、１０５〜１３０ｋＤａの範囲である。３つの異なるＣＤ６形態、すなわちヒトＨＵＴ-７８Ｔ細胞から免疫沈降させたｒｓＣＤ６、ｎｓＣＤ６及びｍＣＤ６の観察されたＭＷを図２Ｂに示す。精製ｎｓＣＤ６タンパク質を、ヒトＣＤ６の細胞外領域に対して産生されたポリクローナル抗血清を用い、ウエスタンブロットアッセイによりＣＤ６として同定した(図２Ｃ)。細胞結合実験において、ＣＤ６リガンド(ＡＬＣＡＭ／ＣＤ１６６)の差次的発現に従い、ビオチン標識ｒｓＣＤ６及びｎｓＣＤ６は双方ともＲａｊｉＢ細胞に結合したが、Ｋ５６２赤白血病細胞には結合しなかった(図２Ｄ)。

実施例３：ＬＰＳへのｒｓＣＤ６の結合性及びｒｓＣＤ６-ＬＰＳ相互作用の動態
３種の異なる大腸菌株(Ｏ５５：Ｂ５、Ｏ１１１：Ｂ４、又はＯ２６：Ｂ６)から精製したＬＰＳでプレートをコーティングし、ビオチン標識されたｒｓＣＤ６、ｎｓＣＤ６、又はＢＳＡの結合性についてアッセイする直接結合ＥＬＩＳＡから、ｒｓＣＤ６-ＬＰＳ相互作用のさらなる確認を得た。図３Ａに提示した結果には、図１における細菌結合実験に従い、天然及び組換えの可溶性ＣＤ６形態の双方が、用量に依存する形でＬＰＳに結合したことが示されている。ＢＳＡ-ＬＰＳの相互作用は観察できなかった。

次に、溶液中における、ＬＰＳ(Ｒｅ-ＬＰＳ)のｒｏｕｇｈ型変異体(Ｒｅ５９５)へのｒｓＣＤ６及びｒｓＣＤ５の結合性を、異方性及び強度のようなＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳの蛍光特性における変化を分析することにより研究した。図３Ｂには、標識されたＬＰＳ分子の蛍光異方性を測定することによる、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳへのｒｓＣＤ６及びｒｓＣＤ５の結合性が示されている。蛍光異方性測定は、励起状態の存続期間中、フルオロフォアの回転運動の速度及び程度に依存する。種々の量のｒｓＣＤ６をＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳに添加することで、ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳの異方性値のタンパク質濃度依存性増加が引き起こされ、Ｒｅ-ＬＰＳへのｒｓＣＤ６への結合により、染料の回転運動性の機械的制限が引き起こされることが示された。コントロール実験を遊離のフルオレセインを用いて実施し、これら全ての変化が染料(フルオレセイン)とｒｓＣＤ６との相互作用の結果によるのではなく、ＬＰＳ分子(データを図示せず)との相互作用によるものであることが示された。遊離のフルオレセインの蛍光発光異方性は非常に低く、３倍過剰のｒｓＣＤ６を添加することにより、影響を受けなかった(データは示さず)。他方、ｒｓＣＤ５はＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳの蛍光異方性に何の変化も引き起こさず、このタンパク質がＲｅ-ＬＰＳに結合しないことが示された。

また溶液中のＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳに、ｒｓＣＤ５ではなくｒｓＣＤ６を添加することにより、蛍光ＬＰＳの全蛍光発光強度の増加が生じた。ＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳが、増加した量のｒｓＣＤ６又はｒｓＣＤ５のいずれかと反応した場合の５２０ｎｍでの蛍光発光強度における変化の時間依存性を測定した。図３Ｃには、ｒｓＣＤ５の濃度ではなく、ｒｓＣＤ６の濃度の関数として、蛍光強度変化の大きさが増加しており、また飽和性であったことが示されている。これらの結果から、ＬＰＳへのｒｓＣＤ６の結合親和性を測定することができた。直角双曲線に対して適合させた飽和曲線から算出したＦＩＴＣ-Ｒｅ-ＬＰＳ／ｓＣＤ６複合体に対する見かけＫｄは、２．６９(±０．３２)１０^−８Ｍであった。

実施例４：細胞表面ＣＤ６へのＬＰＳの結合性
ＬＰＳ-ＣＤ６相互作用が、細胞表面に発現するレセプターと同様に生じるかどうかを測定するために、欠損したＣＤ５及びＣＤ６発現で選択されたＪｕｒｋａｔ細胞誘導体の２Ｇ５細胞のＦＩＴＣ標識ＬＰＳを用いた染色により、研究を実施した。図４Ａ及び４Ｂに示したフローサイトメトリー研究により示されるように、形質移入されていない親２Ｇ５細胞と比較して、野生型ＣＤ６を安定して発現する２Ｇ５細胞(２Ｇ５-ＣＤ６.ｗｔ)では、蛍光強度がより高かった。競合結合実験から、これらの結果をさらに確認した。増加した量のｒｓＣＤ６の存在下、単一量のＦＩＴＣ-ＬＰＳで２Ｇ５-ＣＤ６.ｗｔ細胞を染色した。これらの実験において、２Ｇ５-ＣＤ６.ｗｔ細胞へのＦＩＴＣ-ＬＰＳの結合は、負のコントロールとして使用されたｒｓＣＤ５ではなく、ｒｓＣＤ６により、用量に依存する形で阻害され(図４Ｃ)、阻害が特異的であることが示された。これらのデータから、ＬＰＳは、細胞表面のＣＤ６と相互作用が可能であることが結論付けられた。

実施例５：ｒｓＣＤ６の結合が細菌及びＬＰＳ双方の凝集に至る
図５Ａは、ｒｓＣＤ６の存在が、グラム陰性(大腸菌)並びにグラム陽性(黄色ブドウ球菌)細菌の凝集を誘発したことを示している。細菌への結合能力がないことに一致して、それが負のコントロールＨＳＡがなさないように、ｒｓＣＤ５はそれらの凝集を誘発させることができなかった。
グラム陰性菌全体へのｒｓＣＤ６の結合性は、結合バッファーにＣａ^２＋が存在することで高められるため(図１を参照)、Ｃａ^２＋の存在下でｒｓＣＤ６により誘発されるＲｅ-ＬＰＳ凝集のプロセスをさらに探求した。これは、４００ｎｍでの光吸光度の変化を測定することにより分析した(図５Ｂ)。これらの実験は、４００ｎｍで検出可能な吸光度を生じさせるためには、２００倍高いＣａ^２＋並びにＲｅ-ＬＰＳ濃度が必要であったことを除き、蛍光ＬＰＳを用いた結合研究と同じイオン条件下で実施された。図５Ｂには、ＬＰＳ分子がＣａ^２＋を含むバッファーにおいて凝集可能であり、低濃度のｒｓＣＤ６により、ＬＰＳのさらなる凝集が誘発されることが示されている。併せて、これらのデータには、Ｃａ^２＋の存在下で、ｒｓＣＤ６が細菌凝集体並びにＬＰＳの凝集体のサイズの増加に寄与していることが示唆されている。

実施例６：ｒｓＣＤ６はマウスにおいてＬＰＳ誘発性敗血症性ショックを予防する
図５のデータから、循環ＣＤ６(ｎｓＣＤ６)がＬＰＳ分子のクリアランスに寄与し得、それらの炎症効果を低下させうるという考えに至る。よって、循環ｒｓＣＤ６の量が増加すると、過剰のＬＰＳが致死に至らしめるおそれのある状況で保護効果を有するかもしれない。これを試験するために、マウスにｒｓＣＤ６を投与すると、ＬＰＳ誘発性敗血症性ショックの前で生存性が改善されるかどうかを評価した。図６Ａで観察されるように、腹腔へのＬＰＳ投与の１時間前に、マウスに、ｒｓＣＤ５ではなくｒｓＣＤ６を単独用量で２５μｇ腹腔に投与すると、生理食塩水のコントロールと比較して、生存率が有意に上昇した(７０％まで)。このデータによれば、ｒｓＣＤ６の投与は、これらマウスにおける炎症誘発性のサイトカイン類のＴＮＦ-α、ＩＬ-１β及びＩＬ-６の血漿レベルの有意な低下を誘導した(図６Ｂ)。

実施例７：酵母(Saccharomices cerevisae:出芽酵母)から抽出されたザイモサンに結合するｒｓＣＤ６
１２μｇの大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４(Sigma)から精製されたＬＰＳ、出芽酵母(Sigma)からのザイモサン、黄色ブドウ球菌(Fluka)から精製されたペプチドグリカン、又はウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を使用し、４℃で一晩、ＰＢＳ中で９６ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)をコーティングした。室温で１時間、１％のＢＳＡを含むＰＢＳを添加することにより、ウェルへの非特異的結合を防止した。ついで、いくつかの濃度のｒｓＣＤ６をウェルに添加し、室温で３時間インキュベートした。室温で１時間、１：２００希釈のビオチン標識ｍＡｂ抗ＣＤ６(ＭＡＥ)、続いて１：１０００希釈のＨＲＰ標識されたストレプトアビジン(DAKO, Glostrup, Denmark)を添加することにより、結合したタンパク質を検出し、室温で３０分インキュベートした。各インキュベート工程の間、未結合タンパク質又はＨＲＰ-ストレプトアビジンを、０．０１％のトゥイーン-２０が添加されたＰＢＳで３回洗浄した。３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン液状基質(Sigma)を添加することにより発色させ、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。同様の結果のアッセイを３回繰り返した。

図７に表された結果には、ｒｓＣＤ６が、用量に依存する形で、ザイモサン、ペプチドグリカン及びＬＰＳに結合したことが示されている。ＢＳＡ-ｒｓＣＤ６相互作用は観察することができなかった。このＥＬＩＳＡ実験には、グラム陽性菌の表面からの十分豊富な構造体のペプチドグリカンがｒｓＣＤ６によりまた認識されることが示されている。興味あることに、ｒｓＣＤ６はまた酵母ザイモサンに結合可能である。

実施例８：ｒｓＣＤ６はヒトサイトメガロウイルス粒子に結合する
１マイクログラムのポリクローナル抗ＣＭＶ抗体(BiosPacific, Emeryville, CA, USA)を使用し、４℃で一晩、ＰＢＳ中で、９６ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denmark)をコーティングした。室温で１時間、３％のＢＳＡを含むＰＢＳを添加することにより、ウェルへの非特異的結合を防止した。ついで、１マイクログラムのＣＭＶ粒子の懸濁液(ABI Advanced Biotechnologies, Maryland, USA)をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ついで、種々の濃度のｒｓＣＤ６タンパク質をウェルに添加し、室温で３時間インキュベートした。室温で１時間、１：２００希釈のビオチン標識ｍＡｂ抗ＣＤ６(ＭＡＥ)、続いて１：１０００希釈のＨＲＰ標識ストレプトアビジン(DAKO, Glostrup, Denmark)を添加することにより、結合したタンパク質を検出し、これを室温で３０分インキュベートした。各インキュベート工程の間、未結合のタンパク質又はＨＲＰ-ストレプトアビジンを、０．０１％のトゥイーン-２０が添加されたＰＢＳで３回洗浄した。３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン液状基質(Sigma)を添加することにより発色させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。同様の結果のアッセイを３回繰り返した。

図９に表された結果には、ｒｓＣＤ６が、用量に依存する形で、ＣＭＶ粒子に結合したことが示されている。抗体でコーティングされたウェルに対するＣＤ６の非特異的結合のバックグラウンドは差し引いた。これらの結果には、ｒｓＣＤがヒトサイトメガロウイルスの表面に結合可能であることが示唆されている。

実施例９：ｒｓＣＤ６はＨＩＶ表面タンパク質ｇｐ１２０に結合する
ｒｓＣＤ６を発現する細胞形質移入体からの１００μlの血清フリー培養上清を使用し、４℃で一晩(o/n)、９６-ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Denmark)をコーティングした。室温で１時間、３％のＢＳＡを含むＰＢＳを添加することにより、ウェルへの非特異的結合を防止した。ついで、種々の濃度の、ＨＩＶ由来の組換えｇｐ１２０タンパク質(Immunodiagnostics, through the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Germantown, Maryland, USA)をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。室温で１時間、２％の熱不活化ヒト血清に５００ｎｇの抗ｇｐ１２０ｍＡｂ(ｈｍＡｂ２Ｇ１２、免疫診断)、ついで１：２００希釈のＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体(DAKO, Glostrup, Denmark)を添加することにより、結合したタンパク質を検出し、これを室温で３０分インキュベートした。各インキュベート工程の間、未結合のタンパク質又はＨＲＰ-ストレプトアビジンを、０．０１％のトゥイーン-２０が添加されたＰＢＳで３回洗浄した。３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン液状基質(Sigma)を添加することにより発色させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。同様の結果のアッセイを３回繰り返した。

図８に表された結果には、ｒｇｐ１２０が、用量に依存する形で、ｒｓＣＤ６に結合したことが示されている。ウェルにおけるブロック用バッファーへのｒｓｇｐの非特異的結合バックグラウンドは差し引いた。これらの結果には、ｒｓＣＤ６が、ヒト免疫不全ウイルスの主要な外部タンパク質のｒｇｐ１２０に結合可能であることが示唆されている。

Claims

ヒトを含む哺乳動物における、グラム陽性菌及び／又はグラム陰性菌及び／又は内毒素によって誘発される敗血症を治療的及び／又は予防的に処置するための医薬であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む可溶性ＣＤ６（ｓＣＤ６）タンパク質を含有してなる医薬。
敗血症が重症敗血症である請求項１に記載の医薬。
重症敗血症が敗血症性ショックである請求項２に記載の医薬。
可溶性ＣＤ６タンパク質が組換え可溶性ＣＤ６タンパク質である請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬。
可溶性ＣＤ６タンパク質が合成可溶性ＣＤ６タンパク質である請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬。
可溶性ＣＤ６タンパク質が天然可溶性ＣＤ６タンパク質である請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬。
可溶性ＣＤ６タンパク質がヒト可溶性ＣＤ６タンパク質である請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬。
前記哺乳動物がヒトである請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬。
敗血症性ショックが内毒素誘導性敗血症性ショックである請求項３から８のいずれか一項に記載の医薬。