WO2007102432A1 - 糖蛋白質組成物の製造方法 - Google Patents

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WO2007102432A1
WO2007102432A1 PCT/JP2007/054067 JP2007054067W WO2007102432A1 WO 2007102432 A1 WO2007102432 A1 WO 2007102432A1 JP 2007054067 W JP2007054067 W JP 2007054067W WO 2007102432 A1 WO2007102432 A1 WO 2007102432A1
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rna
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Katsuhiro Mori
Mitsuo Satoh
Yutaka Kanda
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01129—Endo-alpha-sialidase (3.2.1.129)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • the present invention relates to a cell into which a small interfering RNA (hereinafter abbreviated as siRNA) that suppresses sialidase activity, a method for producing a glycoprotein molecule using the cell, and the The present invention relates to a glycoprotein composition obtained by the production method.
  • the present invention also relates to a method for suppressing sialidase activity using siRNA.
  • Sialidase is a kind of exo-type a-glycosidase that catalyzes the initial reaction of glycan degradation by removing sialic acid, a non-reducing terminal force of glycans added to glycoproteins.
  • the function of many glycoprotein molecules changes when sialic acid residues are also removed from the non-reducing end of sugar chains added to glycoproteins by sialidase. So far, sialidase derived from bacteria and viruses has been used to elucidate the function of sialidase. For details on how sialic acid is eliminated in the body of mammals, The power was not analyzed.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Non-patent Documents 2 and 3 Mammalian endogenous sialidase is localized in the cytoplasm (Non-patent document 4), lysosomal lumen (Non-patent document 5), lysosomal membrane (Non-patent document 6) and plasma membrane (Non-patent document 6). Enzymatic properties such as substrate specificity are different.
  • cytoplasmic sialidase gene (NEU2 sialidase) as the first mammalian sialidase was revealed (Non-patent document 7), followed by lysosomal sialidase (NEU1) (Non-patent document 8) and plasma membrane sialidase (NEU3) (non-patent document 7).
  • the gene of Patent Document 9) has been cloned.
  • amino acid sequences of various sialidases including sialidases originating from microorganisms
  • the homology is not so high, but the presence of multiple aspartic acid box (Ser-X-Asp-X-Gly-X-Thr-Trp) sequences, the Phe-Arg-Ile-Pro sequence near the N-terminus, and Commonly found amino acid sequences are conserved, such as the Va ⁇ Gly-X-Gly sequence located between two aspartate box sequences.
  • amino acid residues involved in sialidase activity are highly conserved and have high similarity in amino acid conformation.
  • the crystal structure of Salmonella LT2-derived sialidase is similar to the crystal structure of human NEU2 sialidase (Non-patent Document 11).
  • NEU2 sialidase gene encodes a single-chain polypeptide consisting of 1679 bases and 379 amino acid residues.
  • NEU2 sialidase has two aspartic acid box sequences, is rich in cysteine residues and j8 sheet structure, and is known to have a three-dimensional structure similar to that of microorganism-derived sialidase.
  • This enzyme is present in the cytoplasm, works near neutral pH, and uses oligosaccharides, gandariosides, and glycoproteins as substrates. In particular, it is reported that it is highly expressed in testis and skeletal muscle and plays an important role in differentiation of skeletal muscle cells (Non-Patent Document 12).
  • Non-patent document 13 genes from Chinese hamster ovary (CHO) cells (Non-patent document 13), human skeletal muscle (Non-patent document 14), mouse brain (Non-patent document 15) and mouse thymus (Non-patent document 16) Isolated!
  • glycoproteins that are considered to be applied to pharmaceuticals are produced using genetic recombination techniques, and are derived from mammalian cells, such as CHO cells derived from Chinese nomster ovary tissue and mouse myeloma. Manufactured using cells as host cells.
  • mammalian cells such as CHO cells derived from Chinese nomster ovary tissue and mouse myeloma.
  • a sugar chain that can exhibit optimal pharmacological activity is not always added.
  • the addition of a non-reducing terminal sialic acid in the sugar chain may have a significant effect on the pharmacological activity of the administered glycoprotein, so it is important to produce and provide glycoprotein pharmaceuticals with controlled sialic acid modification. It is.
  • glycoprotein drugs in which sialic acid addition is important for the expression of pharmacological activity include erythroboyetin (EPO) and tissue-type plasminogen activator (t-PA).
  • Non-Patent Documents 17 to 19 The reason for this is that when sialic acid is eliminated, a galactose residue is exposed on the non-reducing end side, and is captured and rapidly degraded by the nascent glycoprotein receptor (galactose receptor) localized in the liver. Yes (Non-patent document 20).
  • Glycoproteins are secreted and produced by culturing transformants, which are established by stably incorporating cDNAs encoding these glycoproteins into host cells, under appropriate culture conditions for an appropriate period.
  • a variety of sugar chains are added to glycoproteins secreted into the culture medium in terms of production cell power based on the sugar chain-modifying mechanism inherent in the cells.
  • the non-reducing terminal side of mature sugar chains is negative. It is modified with a charged sialic acid residue.
  • the rate of carotage varies depending on the production strain and culture method, and it is difficult to protect the non-reducing ends of all sugar chains with sialic acid.
  • one of the main reasons for the reduction of the sialic acid addition rate is the involvement of sialidase in the production cells.
  • Non-patent Document 21 In the production of glycoprotein, sialidase, particularly NEU2 sialidase, leaks and accumulates in the culture medium from the cytoplasm of the production cells (Non-patent Document 21), and the glycoprotein sugar chain accumulated in the culture medium is also sial. The elimination of acid has become a component (Non-patent Document 22). This has been verified by production studies of multiple types of recombinant glycoproteins using CHO cells as hosts (Non-patent Documents 23 and 24).
  • Culture engineering techniques that have been developed so far to prevent the reduction of sialic acid addition rate include optimization of various culture parameters (Non-patent Document 25, Patent Document 1) and inhibition of sialidase. Examples thereof include a method of adding a substance having activity to a medium component (Non-patent Document 24, Patent Document 2).
  • the optimization of the culture parameters is carried out with the aim of maintaining the viability of the production cells at the highest possible level for a long period of time in the culturing process, since leakage of cytoplasmic power of sialidase occurs with decreasing cell viability.
  • This method a slight improvement in the rate of sialic acid addition to the glycoprotein is observed, but this is not a sufficient amount.
  • a method of adding a sialidase inhibitor as a medium component includes adding a specific inhibitor such as N-acetyl-2-2,3-dehydro-2-deoxyneuraminic acid (Neu5Ac2en).
  • a specific inhibitor such as N-acetyl-2-2,3-dehydro-2-deoxyneuraminic acid (Neu5Ac2en).
  • methods for adding relatively high concentrations of copper ions have been developed.
  • the economic burden related to the preparation of the culture medium and waste liquid treatment is large. ing.
  • non-naturally occurring compounds such as Neu5Ac2en are used in the manufacture of pharmaceuticals, consider the safety of these substances themselves and the derivatives that these substances change during culture. Must-have.
  • Non-patent Document 3 The method of inhibiting NEU2 sialidase mRNA splicing by antisense is to specifically hybridize with NEU2 sialidase mRNA based on the NEU2 sialidase cDNA sequence of the cloned CHO cells.
  • Non-Patent Document An anti-sense RNA is designed, a DNA construct for stable expression of this anti-sense RNA is introduced into glycoprotein-producing cells, and a method that can suppress the expression of NEU2 sialidase has been developed (Non-Patent Document) 26).
  • the NEU2 sialidase antisense RNA expression vector is stably introduced into CH 0 cells that produce thread-reversed DNase, thereby suppressing cytoplasmic sialidase activity to 40% and sializing the product DNase. Increases acid addition rate by up to 37%. Inhibition rate of cytoplasmic sialidase activity is insufficient.
  • Non-patent literature l Trends Biochem. Sci "10, 357-360 (1985); Glycobiology, 3, 201-217 (1993)
  • Non-Patent Document 2 J. Biochem., 107, 794-798 (1990)
  • Non-Patent Document 3 Glycoconjugate Journal vol.17,301-306 (2000)
  • Non-Patent Document 4 Journal of Biological Chemistry vol.260,6710-6716 (1985)
  • Non-Patent Document 5 European Journal of Biochemistry vol.141, 75-81 (1984)
  • Non-Patent Document 6 Journal of Biochemistry vol.107,787-793 (1990)
  • Non-Patent Document 7 Journal of Biological Chemistry vol.268,26435- 26440 (1993)
  • Non-Patent Document 8 Genes and Development vol.10,3156- 3169 (1996)
  • Non-Patent Document 9 Journal of Biological Chemistry vol.274,5004-5011 (1999)
  • Non-Patent Document 10 Pro ⁇ Natl.Acad.Sci.USA vol.90,9852--9856 (1993)
  • Non-patent literature 11 Journal of Biological Chemistry vol. 280, 469-475 (2005)
  • Non-patent literature 12 Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.221, 826-830 (1996)
  • Non-patent literature 13 Glycobiology vol.4 , 367-373 (1994)
  • Non-Patent Document 14 Genomics vol.57, 137-143 (1999)
  • Non-patent document 15 Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.258, 727-731 (1999)
  • Non-patent document 16 Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.286, 250-258 (2001)
  • Non-Patent Document 18 European Journal of Biochemistry 194, 457 (1990)
  • Non-Patent Document 19 Journal of Biological Chemistry 265, 12127 (1990)
  • Non-Patent Document 20 Blood 73, 84 (1989)
  • Non-Patent Document 21 Glycobiology vol.3, 455-463 (1993)
  • Non-Patent Document 22 BIO / TECHNOLOGY vol.13, 692 (1995)
  • Non-Patent Document 23 Biotechnology Progress vol.12, 559-563 (1996)
  • Non-Patent Document 24 Biotechnology Progress vol.20, 864-871 (2004)
  • Non-Patent Document 25 Cytotechnology vol.15, 217-221 (1994)
  • Non-Patent Document 26 Biotechnology and Bioengineering vol.60, 589-595 (1998) Patent Document 1: US Pat. No. 5,705,364
  • Patent Document 2 US Pat. No. 6,528,286
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Japanese Patent Publication No. 8-510133
  • the object of the present invention is to bind siRNA and glycoprotein compositions that suppress the expression of sialidase.
  • the amount of sialic acid contained in the sugar chain is to provide a cell into which the siRNA has been introduced, a method for producing a glycoprotein composition using the cell, and use thereof.
  • the present invention relates to the following (1) to (20).
  • the small interfering RNA is a small interfering RNA comprising the RNA selected from the group consisting of the following (a) to (d) and its complementary RNA (1) ) The cell described.
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the small interfering RNA is a small interfering RNA comprising the RNA selected from the group consisting of the following (a) to (h) and its complementary RNA (1) ) The cell described.
  • RNA whose expression suppresses the expression of sialidase in the cell; (e) RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45;
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51 one or several bases at both ends of the nucleotide sequence may be deleted, substituted, inserted and Z or added, and introduced into cells. RNA that suppresses the expression of sialidase in the cell.
  • sialidase is a protein encoded by a DNA selected from the following group forces (a) to (h):
  • sialidase is a protein from which the following group forces (a) to (1) are selected.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and having a sialidase activity.
  • mouse myeloma cell line SP2 / 0-Agl4 cells (d) mouse myeloma cell line SP2 / 0-Agl4 cells; (e) Syrian hamster kidney tissue-derived BHK cells;
  • the glycoprotein composition comprising the steps of culturing the cell according to (8) above in a medium, producing and accumulating a glycoprotein composition in the culture, collecting the glycoprotein composition from the culture, and purifying the composition. Manufacturing method.
  • the glycoprotein composition is characterized in that the glycoprotein composition has an increased amount of sialic acid per molecule of glycoprotein compared to the glycoprotein composition produced by the parent cell line (9) The method described in 1.
  • glycoprotein composition is a glycoprotein composition having a longer blood half-life than the glycoprotein composition produced by the parent cell.
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 45;
  • a recombinant DNA obtained by integrating a DNA corresponding to the RNA described in (13) or (14) above and a complementary DNA thereof into a vector.
  • the method comprises culturing the transformant according to (17) above in a medium, producing and accumulating a glycoprotein composition in the culture, collecting the glycoprotein composition from the culture, and purifying the sugar.
  • a method for producing a protein composition comprises culturing the transformant according to (17) above in a medium, producing and accumulating a glycoprotein composition in the culture, collecting the glycoprotein composition from the culture, and purifying the sugar.
  • the present invention relates to a cell into which siRNA that suppresses sialidase activity has been introduced, a method for producing a glycoprotein molecule using the cell, and a glycoprotein composition obtained by the production method.
  • the present invention also provides a method for suppressing sialidase activity using siRNA.
  • the production method of the present invention can provide a glycoprotein composition in which the amount of sialic acid added is increased as compared with conventional glycoprotein compositions.
  • FIG. 1 shows the production of plasmid FT81ib3 / pBS.
  • FIG. 2 shows the production of plasmid FT81ib3 / pAGE.
  • FIG. 3 is a diagram showing the production of plasmids pSiA to pSi38.
  • FIG. 4 is a diagram showing production of plasmid pT7 Blue Sialidase.
  • FIG. 5 shows the production of plasmid pAGELucia.
  • FIG. 6 is a diagram showing the production of plasmid pKANTEXLucia!
  • FIG. 7 is a diagram showing reporter activity when a chimeric reporter gene and a sialidase siRNA expression vector are co-introduced into CHO / DG44 cells.
  • FIG. 8 is a diagram showing the sialidase activity of a cell lysate when a sialidase siRNA expression vector is introduced into CHO / DG44 cells.
  • a cell into which siRNA that suppresses the sialidase activity of the present invention is introduced (hereinafter referred to as "the cell of the present invention") is a siRNA introduced so as to suppress the enzyme activity of intracellular sialidase. If it is a cell, such a cell is also included.
  • Sialidase is an enzyme that catalyzes a reaction in which the non-reducing end of a sugar chain added to a glycoprotein also removes sialic acid.
  • Sialidase activity refers to the activity of catalyzing a reaction that removes the non-reducing terminal strength sialic acid of a sugar chain added to a glycoprotein.
  • the siRNA that suppresses the sialidase activity is a double-stranded RNA comprising RNA and its complementary RNA force and capable of reducing the amount of intracellular sialidase mRNA. If it is! /, It can be something! / ...
  • the length of the RNA is preferably 1 to 50, more preferably 10 to 40, still more preferably 10 to 30, and most preferably 15 to 30.
  • specific RNA is preferably 1 to 50, more preferably 10 to 40, still more preferably 10 to 30, and most preferably 15 to 30.
  • RNA corresponding to DNA comprising a base sequence represented by 10 to 40 base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA comprising a base sequence represented by 10 to 40 base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • RNA corresponding to DNA comprising a base sequence represented by 10 to 40 base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a continuous 10 to 40 base sequence in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4;
  • RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22;
  • (k) RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 51;
  • RNA that suppresses the expression of sialidase In the base sequence represented by SEQ ID NO: 51, one or several bases are deleted, substituted, inserted and Z or added, and the base sequence is also introduced into the cell. RNA that suppresses the expression of sialidase.
  • a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and Z or added is:
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22, 34, 45 or 51 is the nucleotide sequence in which the 5 ′ end and one or several bases at the Z or 3 ′ end are deleted, substituted, inserted and Z or added.
  • the length of the base sequence is preferably 1 to 50, more preferably 10 to 40, still more preferably 10 to 30, and most preferably 15 to 30 continuous RNA.
  • siRNA As a method for introducing siRNA, any method can be used as long as siRNA can be introduced into cells, but a genetic engineering technique is preferred.
  • siRNA, precursor RNA, or a DNA molecule that is a cocoon of these can be transiently introduced into a cell, or a siRNA or precursor RNA cocoon of a DNA molecule can be stably integrated into the host genomic DNA. Methods.
  • siRNA, precursor RNA, or their DNA molecules are expressed in cells.
  • a recombinant vector by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector, and the recombinant vector is transformed into a host suitable for the recombinant vector. Examples include a method of introducing into a cell and a method of directly introducing into a cell a double-stranded RNA designed based on the base sequence of sialidase without using an expression vector.
  • the designed siRNA, precursor RNA, or a DNA molecule of these types can be transcribed.
  • examples thereof include a method of preparing an expression vector containing a promoter at a position where it can be introduced, introducing the expression vector into a host cell suitable for the expression vector, and integrating it into a host chromosome.
  • the sialidase includes a protein encoded by the following DNA (a), (b), (c), (d), (e), (1), (g) or (h), or (0 , (J), (k), (1), (m), (n), (o), (p), (q), (r), (s) or (t) proteins It is done.
  • (0) a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having a sialidase activity;
  • (P) a protein having amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and has a sialidase activity;
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions is, for example, DNA such as DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4, or a part thereof DNA obtained by using the Koguchi-one 'hybridization method or the Southern blot hybridization method, etc., using the above fragment as a probe, specifically, DNA derived from colonies or plaques Using a fixed filter, 0.7 to 1M sodium chloride was present, and after carrying out noise hybridization at 65 ° C, 0.1 to 2 times concentrated SSC solution (composition of 1 times concentrated SSC solution) Can be obtained by washing the filter under 65 ° C conditions using 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate).
  • Hybridization is molecular cloning (A Molecular manual, A Laboratory manual, second edition, Cold Spring Haroor Laboratory Press, 1989). 'Molekiyura 1 ⁇ ' Neolon 1 ⁇ (Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons, 1987-1997 (hereinafter 'Protocol's In'Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology), Dneue Claw -DNA Cloning 1: Can be performed according to the method described in Core Techniques, A Practica 1 Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. Specific examples of DNA that can be hybridized include sequencing. DNA having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence represented by No. 1, 2, 3 or 4, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% Furthermore, particularly preferably 95% or more, most preferably be mentioned a DNA having a homology of 98% or more.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7 or 8 has an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has a sialidase activity.
  • Proteins are molecular 'Crowung 2nd edition, current' profile Conoréles 'in' molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology, Nucleic 'acid' research (Nuclei c Acids Research), 10, 6487 (1982), Proceedings' National 'Academic' Science USA (p roc . Natl. Acad.
  • site-directed mutagenesis is introduced into DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7 or 8. It means a protein that can be obtained by doing.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited. However, deletion, substitution, or The number is such that it can be added, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • the protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7 or 8 and having sialidase activity is SEQ ID NO: 5, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, most at least 80% or more of the protein having the amino acid sequence described in 6, 7 or 8
  • a protein having a homology of 99% or more and having a sialidase activity is preferable.
  • homology values described in the present invention are values calculated using a homology search program known to those skilled in the art. Examples include numerical values calculated using default parameters in 'Ob' Molecular Biology (J. Mol. Biol), 215, 403 (1990)].
  • BLAST2 Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1 997)]; Genome Res., 7, 649 (1997); http: // www. ncbi.nlm.nih.gOv/Education/BLASTinfo/infomation3.html] and numerical values calculated using default parameters.
  • Default parameter 1 is 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, 1 if it is an amino acid sequence , -Q (penalty for nucleotide mismatch) force 3, r (reward for nucleotide match) force 1, e (expect value) force 10, one W (wordsize) force base 11 3 residues for amino acid residues, 20 if y (Dropoff (X) for blast extemsions in bits) is blastn, 25 for programs other than blastn (http: ⁇ www.ncbi. nlm.nih.gov/blastcgihelp.html) 0 Another example of amino acid sequence analysis software is FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)].
  • the cells of the present invention include yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like, but animal cells are preferred.
  • yeast examples include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluybe mouth mouth, Genus Trichospolon, Schumi-omyces, etc. That power S.
  • Animal cells include human cells, such as Namalwa cells, monkey cells, COS cells, Chinese cells, CHO cells, which are Muster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299). Rat myeloma cells, mouse myeloma cells, Syrian omster kidney-derived cells, embryonic stem cells, fertilized egg cells, and the like.
  • Insect cells include Spodoptera frugiperda ovarian cells S19, Sf21 (Current 'protocol ⁇ Norez in'more ⁇ ' Neolon ⁇ Baculovirus Expression Vectors, A Laooratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusiani's ovary cells, High 5 (Invitrogen), and the like.
  • Plant cells include tobacco, potatoes, tomatoes, carrots, soybeans, rape, alfalfa, rice, wheat, barley, green moss, duckweed, and the like.
  • animal cells include Chinese, mustar ovarian tissue-derived cells (CH 2 O cells), rat myeloma cell line YB2Z0 cell, mouse myeloma cell line NS0 cell, mouse myeloma cell line SP2Z0—Agl4 cell, and Syrian nomus muster.
  • Kidney tissue-derived B HK cells (ATCC CCL-10), MDCK (ATCC CCL-34), PER-C6 TM, human NM-F9 cells, human HEK293 cells, Hypridoma cells, human leukemia cell line Namalva cells, embryonic Examples thereof include stem cells and fertilized egg cells.
  • CHO cells include CHO-K1 strain (ATCC CCL-61), CHO / dhfr- strain (ATCCCRL-9096), Pro5 strain (ATCC CR L-1781), and commercially available CHO-S strain (Cat # manufactured by Invitrigen). 11619), or substrains obtained by acclimating these strains to serum-free medium.
  • Rat myeloma cells For example, mouse cells such as Y3 Agl.2.3. (ATCC CRL-1631), YO (ECACC No: 85110501), YB2 / 0 (ATCC CRL 1662), NSO (ATCC CR L-1827), Sp2 / 0 (ATCC CRL—1581) and the like, myeloma cells or hybrid cells of the myeloma cell line, or substrains (ATC C CRL—1581.1) in which these strains are conditioned to a serum-free medium or the like.
  • human cells include PER. C6 (ECACC 9602 2940), or sub-strains obtained by acclimating these strains to a serum-free medium.
  • cells having the same properties as these cells obtained by subjecting these cells to mutation treatment or cell fusion with B cells obtained by immunizing mammals other than humans with antigens are also available. It is contained in the animal cell in this invention.
  • the cell in the present invention includes a lectin that recognizes a sugar chain structure in which N-glycosidic complex type sugar chain reducing terminal N-acetylyldarcosamine 6-position and fucose 1-position are a-linked.
  • a composition comprising a resistant cell, for example, a glycoprotein molecule having an N-glycoside-bonded complex sugar chain, of all N-glycoside-bonded complex sugar chains contained in the composition, Examples thereof include cells having the ability to produce a glycoprotein composition in which the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyl darcosamine at the sugar chain reducing end is 20% or more. Examples of such cells include cells in which the activity of at least one protein listed below has been reduced or inactivated.
  • N-glycoside-linked complex sugar chain reducing terminal N-acetylcylcosamine is located at the 6-position of fucose (cells with reduced or inactivated activity of enzyme protein involved in X-linked sugar chain modification) Examples thereof include cells in which a gene encoding intracellular a 1,6-fucosyltransferase has been knocked out (WO02 / 31140, WO03 / 85107, WO03 / 85102).
  • Enzyme proteins involved in the synthesis include any enzyme involved in the synthesis of sugar nucleotide GDP-fucose, which is the source of fucose to sugar chains in the cell.
  • Fucose Enzymes involved in the synthesis include enzymes that affect the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose.
  • the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose is supplied by the de novo synthesis pathway or the Salvage synthesis pathway. Therefore, all enzymes involved in these synthetic pathways are included in enzymes involved in the synthesis of intracellular GDP-fucose.
  • Enzymes involved in the de novo synthesis pathway of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose include GDP-mannose 4,6-dehydratase (GDP-mannose 4,6-dehydratase; hereinafter referred to as GM D), (JDP — Keto—ri— deoxymannose 3,5— epimerase, 4,6— reductase (LJDP—keto-deoxymannose 3,5-epimerase, 4,6-reductase; hereinafter referred to as Fx) .
  • GDP-beta-L-fucose-pyrophosphorylase As an enzyme involved in the Salvage synthesis pathway of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, GDP-beta-L-focose pyrophosphorylase (GDP-beta-L-fucose-pyrophosphorylase; hereinafter referred to as GFPP) , Fucokinase and the like.
  • Examples of the enzyme that affects the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include the above-mentioned substances that affect the activity of enzymes involved in the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose synthesis pathway, and substances that serve as substrates for the enzyme. Enzymes that affect structure are also included.
  • N-glycoside bond complex type N-glycoside bond complex type N-glycoside bond complex type N-glycosyl bond complex type Any enzyme involved in the reaction in which the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the sugar chain reducing end and the 1-position of fucose are a-linked is included.
  • N-glycosidic complex type N-acetylyldarcosamine 6-position of the sugar chain reducing end and the enzyme involved in ⁇ -bonding of fucose 1-position are: Any enzyme that affects the reaction in which the 6th position of acetyltilcosamine and the 1st position of fucose bind to a is included. Specifically, ⁇ -1, 6-fucosyltransferase is a-L-fucosidase.
  • Proteins involved in transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus include intracellular sugar nucleotide GDP-protein involved in transport of fucose to the Golgi apparatus, or intracellular sugar nucleotide GDP- Any protein that affects the reaction of transporting fucose into the Golgi is included.
  • proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus include the GDP-fucose transporter.
  • proteins that affect expression As a protein that affects the reaction of transporting intracellular sugar nucleotide GDP-fucose into the Golgi apparatus, it affects the activity of the above-mentioned proteins involved in transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus. Also included are proteins that affect expression.
  • V or a deviation method may be used as long as it can reduce or eliminate the target enzyme activity. it can.
  • N-glycoside-linked sugar chain N-acetylyldarcosamine 6-position and fucose 1-position of fucose are selected for strains that are resistant to lectins that recognize sugar-linked glycan structures. It is done.
  • a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-glycidyl darcosamine at the reducing end of N-glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are a-linked is any lectin that can recognize the sugar chain structure.
  • Any lectin can be used. Specific examples include Lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin derived from Lens Culinaris), Endumen lectin PS A (Peasum sativum-derived Pea Lectin), Broad bean lectin VFA (Agglutin in derived from Vicia faba), Hiratiyawantake Lectin AAL (Lectin from Aleuria aurantia) etc. it can.
  • a cell resistant to lectin refers to a cell whose growth is not inhibited even when an effective concentration of lectin is given.
  • the effective concentration is not less than the concentration at which cells before the genome gene modification (hereinafter referred to as parent strain) cannot grow normally, and preferably the same concentration at which cells before the genome gene modification cannot grow.
  • the concentration is more preferably 2 to 5 times, still more preferably 10 times, and most preferably 20 times or more.
  • the effective concentration of a lectin whose growth is not inhibited may be appropriately determined according to the cell line.
  • the effective concentration of a normal lectin is 10 / zg / mL to 10 mg / mL, preferably 0.5 mg / mL to 2.0. mg / mL.
  • a method for producing a glycoprotein composition using the cells of the present invention specifically, a method for producing using a host cell into which a gene encoding a glycoprotein has been introduced, a gene encoding a glycoprotein was introduced.
  • a method of producing non-human embryonic stem cells or fertilized egg cells into early embryos of non-human animals and then using the generated transgenic non-human animals, or introducing a gene encoding a glycoprotein And a method of producing using a transgenic plant produced from a plant callus cell.
  • the present invention also relates to a method for producing a glycoprotein composition in which the glycoprotein composition has an increased amount of sialic acid per molecule as compared to the glycoprotein composition produced by the parent cell line.
  • the amount of sialic acid added per molecule of glycoprotein of the glycoprotein composition produced by introducing the siRNA that suppresses sialidase activity of the present invention was produced from the cells before the siRNA was introduced. Increased compared to the amount of sialic acid added per molecule of glycoprotein in the glycoprotein composition.
  • a glycoprotein composition having an increased amount of sialic acid per molecule of glycoprotein is 80 to 90% or more, preferably 95% or more of the number of molecules to which sialic acid is added per molecule of glycoprotein. More preferably, it refers to a glycoprotein composition in which sialic acid is bound to 100%.
  • the method for measuring sialidase activity is not particularly limited, but is a method using a fluorescent substrate such as 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-alpha-D-neuraminic acid ammonium (4MU-Ne5AC) (Molecular Biotechnology). vol.15, 69 (2000)), Proceedings of the society for experimental biology and medicine vol.169, 50 1-505 (1982)) and a method using a lectin (Biol Pharm. Bull, vol. 17, 29-33 (1994)).
  • a fluorescent substrate such as 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-alpha-D-neuraminic acid ammonium (4MU-Ne5AC) (Molecular Biotechnology). vol.15, 69 (2000)), Proceedings of the society for experimental biology and medicine vol.169, 50 1-505 (1982)) and a method using a lectin (Biol Pharm. Bull, vol. 17, 29-33 (1994)).
  • the parent cell line refers to a cell before introduction of siRNA that suppresses sialidase activity.
  • the glycoprotein composition refers to a composition containing a glycoprotein molecule having a sugar chain in which a sialic acid addition site is present at the non-reducing end.
  • sugar chains of glycoproteins are divided into two chains: sugar chains that bind to asparagine (N-glycoside-linked sugar chains) and sugar chains that bind to serine, threonine, etc. (0-glycoside-linked sugar chains). Broadly divided into types. These are collectively referred to as glycoside-linked sugar chains.
  • N-glycoside-linked sugar chains have a variety of structures. [Biochemical Experimental Methods 23-Glycoprotein Sugar Chain Research Methods (Academic Publication Center) Atsuko Takahashi (1989)], V Even in the case of misalignment, it has a common core structure shown in the following structural formula (I).
  • the end of the sugar chain that binds to asparagine is referred to as the reducing end, and the opposite side is referred to as the non-reducing end.
  • the N-glycoside-linked sugar chain is a high mannose type in which only mannose binds to the non-reducing end of the core structure, and a galactose-N-acetylcylcosamine (hereinafter referred to as Ga ⁇ GlcNAc) branch to the non-reducing end of the core structure.
  • a complex type (hereinafter also referred to as a complex type) having a structure such as sialic acid or bisecting N-acetylcylcosamine on the non-reducing end side of Ga to GlcNAc. Examples include a hybrid type having both a high mannose type and a complex type branch on the non-reducing terminal side of the structure.
  • the reducing end of N-acetylylgalatatosamine is bonded to the hydroxyl group of serine or threonine, and further, galactose, N-acetylyldarcosamine, N-acetylgalato Samine, sialic acid, or a sugar chain to which sialic acid is bonded, xylose is a sugar chain having j8 bond to the hydroxyl group of serine, galactose is bonded to the hydroxyl group of hydroxylysine and j8 bond Sugar chain and the like.
  • a sugar chain in which xylose is bonded to the hydroxyl group of serine by / 3 usually has a plurality of sugars bonded to the 4-position of the xylose, and a linear polysaccharide composed of two sugars is bonded to the end of the bonded sugar. is doing.
  • Examples of the substance having such a sugar chain structure include cartilage proteodalycan.
  • Examples of the substance having a sugar chain structure in which galactose is ⁇ -bonded to the hydroxyl group of hydroxylysine include collagen.
  • sugar constituting the sugar chain examples include ⁇ -acetylyl darcosamine, ⁇ -acetyl galatatosamine, mannose, galactose, fucose, sialic acid, xylose, and arabinose. May be combined in order.
  • the glycoprotein composition refers to a composition having a glycoprotein molecular force having a ⁇ -glycoside-linked sugar chain or a 0-glycoside-linked sugar chain. Since there are many sugar chains that bind to glycoproteins and their sugar chain structures are diverse, there are many combinations of sugar chains in the sugar chains of glycoproteins. Accordingly, the glycoprotein composition of the present invention includes a composition composed of glycoprotein molecules combined with a single sugar chain structure, and a glycoprotein molecule combined with a plurality of different sugar chain structures. The number of sugar chains can be one or more! /.
  • the amount of sialic acid added per molecule of glycoprotein of a glycoprotein composition produced from a cell into which siRNA that suppresses sialidase activity of the present invention has been introduced is the amount of sugar produced from the cell prior to the introduction of siRNA. Increased compared to the amount of sialic acid added per molecule of glycoprotein in the protein composition.
  • a glycoprotein composition having an increased amount of sialic acid per molecule of glycoprotein exhibits improved physiological activity when administered in vivo as compared to the glycoprotein composition produced by the parent cell.
  • Physiological activity includes affinity between glycoprotein and receptor, half-life time of glycoprotein in the body, changes in tissue distribution after administration in blood, interaction with proteins necessary for expression of pharmacological activity, etc. Can be given.
  • the composition comprises glycoprotein molecules having N-glycoside-bonded complex-type sugar chains, and all N-glycosides contained in the composition Of the combined complex-type glycans, fucosyl is linked to the N-acetylyldarcosamine at the sugar chain reducing end.
  • a glycoprotein composition in which the proportion of sugar chains to which no sugar is bound is 20% or more has further excellent physiological activity.
  • an antibody composition comprising an antibody molecule having an N-glycoside-bonded complex sugar chain in the Fc region, wherein the N-glycoside-bonded complex sugar chain is an N-acetylyldarco at the reducing end of the sugar chain.
  • An antibody composition having a sugar chain, in which fucose is bound to samine has a higher ADCC activity.
  • fucose is bound, and as a sugar chain, fucose is not bound to N-acetylcylcosamine on the reducing end side in the chemical formula shown above. Also, the structure of the sugar chain at the non-reducing end can be quite good!
  • the fact that fucose is not bound to N-acetylyldarcosamine at the sugar chain reducing end means that fucose is not substantially bound.
  • the glycoprotein composition to which fucose is not substantially bound specifically refers to a case where the glycoprotein composition is such that fucose is not substantially detectable in the sugar chain analysis described in 3 below. . To the extent that it cannot be detected substantially means that it is below the detection limit of measurement.
  • glycoproteins produced by the cells of the present invention include glycoproteins described below, glycoprotein fragments thereof, fusion proteins obtained by fusing two or more glycoproteins or glycoprotein fragments, and the like.
  • Glycoproteins include antibodies, erythropoietin (EPO) [J. Biol. Chem., 252, 5558 (19 77)], thrombopoietin (TPO) [Nature, 369, 533 (1994)] tissue-type plasminose Genactivator, prokinase, thrombomodulin, antithrombin III, a1 antitrypsin, C1 inhibitor, haptoglobin, activated protein C, blood coagulation factor VII, blood coagulation factor VIII, blood coagulation factor IX, blood coagulation factor X, blood coagulation Factor XI, blood coagulation factor XII, blood coagulation factor XIII, prothrombin complex, fibrinogen, albumin, gonadal stimulating hormone, thyroid stimulating hormone, epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, Activin, bone morphogenetic factor, granulocyte colony stimulating factor (G—C SF
  • soluble interleukin 4 examples include receptors, tumor necrosis factor at, DnaseU galactosidase, oc darcosidase, darcocelle brosidase, hemoglobin, transferrin and the like.
  • V may be an antibody having an antigen binding property! /, But an antibody that binds to a tumor-related antigen, an antibody that binds to an antigen associated with allergy or inflammation, or a cardiovascular disease An antibody that binds to an antigen, an antibody that binds to an antigen associated with an autoimmune disease, or an antibody that binds to an antigen associated with a virus or bacterial infection is preferred, and the antibody class is preferably IgG.
  • Anti-GD2 antibodies Anticancer Res., 13, 331-33 6, 1993
  • anti-GD3 antibodies Anticancer Immunol. Immunother., 36, 260-266, 1993
  • Anti-GM2 antibody Anti-GM2 antibody
  • Anti-HER2 antibody Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992
  • anti-CD52 antibody Nature, 332, 323) -327, 1988
  • anti-MAGE antibody British J.
  • anti-insulin-like growth factor receptor antibody J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995
  • anti-PMSA antibody J Urology, 160, 2396-24 01, 1998)
  • anti-vascular endothelial growth factor antibody Cancer Res., 57, 4593-4599, 1997)
  • anti-vascular endothelial growth factor receptor antibody Oncogene, 19, 2138- 2146, 2000
  • anti-CA125 antibody anti-17-1A antibody, anti-integrin ⁇ 3 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD22 antibody, anti-HLA antibody, anti-HLA-DR antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD19 antibody
  • Examples thereof include an anti-EGF receptor antibody (Immunology Today 21 (8), 403-410 (2000)), an anti-CD10 antibody (American Journal of Clinical Pathology, 113, 374-382, 2000) and the like.
  • Anti-interleukin 6 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), anti-interleukin 6 receptor antibody (Mole) are antibodies that bind to antigens related to allergy or inflammation. cular Immunol, 31, 371-381, 1994), anti-interleukin 5 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), anti-interleukin 5 receptor antibody, anti-interleukin 4 antibody (Cytokine, 3, 562-567, 1991), anti-interleukin 4 receptor antibody (J. Immunol.
  • anti-tumor necrosis factor antibody Hybridoma, 13, 183-190, 1994
  • anti-tumor Necrosis factor receptor antibody Molecular Pharmacol, 58, 237-245, 2000
  • anti-CCR4 antibody Nature, 400, 776-780, 1999
  • anti-chemokine antibody J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994
  • anti-chemokine receptor antibody J. Exp. Med., 186, 1373-1381, 1997)
  • anti-IgE antibody anti-CD23 antibody
  • anti-CD11a antibody Immunology Today, 21 (8), 403-410) (2000)
  • anti-CRTH2 antibody J
  • antiplatelet-derived growth factor receptor antibody J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 1997) or anticoagulant factor antibody (Circulation, 101, 1158-1164, 2000) .
  • antibodies that bind to antigens associated with autoimmune diseases include anti-self DNA antibodies (Immunol. Letters, 72, 61-68, 2000).
  • antibodies that bind to antigens associated with viral or bacterial infection include anti-gpl20 antibodies
  • anti-CD4 antibody J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998), anti-CCR4 antibody, anti-verotoxin antibody (J. Clin. Microbiol, 37, 396-399, 1999), autoimmune disease (psoriasis, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, etc.), anti-CDlla antibody, anti-ICAM3 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD3 Examples thereof include antibodies, anti-CD4 antibodies, anti-integrin ⁇ 4 j87 antibodies, anti-CD40L antibodies, anti-IL-2 receptor antibodies (Immunology Today, 21 (8), 403-410 (2000)).
  • An antibody is a protein produced in a living body by an immune reaction as a result of stimulation with a foreign antigen, and has an activity that specifically binds to an antigen, as long as it is a molecule containing the Fc region of an antibody. , Such molecules are also included.
  • Specific examples include antibodies, antibody fragments, and fusion proteins containing the Fc region.
  • antibodies examples include antibodies produced by gene recombination techniques, ie, antibody expression vectors into which antibody genes have been inserted, in addition to antibodies secreted by hybridoma cells prepared from spleen cells of immunized animals after immunizing animals with antigens. And the like, which are obtained by introducing the protein into a host cell.
  • Specific examples include antibodies produced by Hypridoma, human chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and the like.
  • a hyperidoma is obtained by cell fusion of a B cell obtained by immunizing a mammal other than a human with an antigen and a myeloma cell derived from a rat or mouse. It means a cell producing a monoclonal antibody having a desired antigen specificity.
  • the human chimeric antibody is a non-human animal antibody heavy chain variable region (hereinafter, heavy chain is referred to as H chain, variable region is referred to as HV or VH as V region) and antibody light chain variable region (hereinafter referred to as light chain).
  • CL the light chain constant region of the human antibody
  • animals other than humans any mouse, rat, mouse, muster, rabbit, etc. can be used as long as it is possible to produce a hyperidoma.
  • a human chimeric antibody For a human chimeric antibody, cDNAs encoding VH and VL are obtained from a hybridoma producing a monoclonal antibody, and inserted into expression vectors for host cells having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed and introduced into a host cell for expression and production.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any of those belonging to human immunoglobulin (hereinafter referred to as “hlg”), but is preferably of the hlgG class, and more preferably of hlgG1, hIgG2, hIgG3, Any of the subclasses such as hIgG4 can be used.
  • hlg human immunoglobulin
  • any ⁇ class or ⁇ class can be used as long as it belongs to hlg.
  • the humanized antibody is also referred to as a complementarity determining region (hereinafter referred to as CDR) grafted antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • a humanized antibody means an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of a non-human animal antibody into appropriate positions of the VH and VL of a human antibody.
  • the human ⁇ antibody constructs a cDNA encoding the V region obtained by grafting the VH and VL CDR sequences of the non-human animal antibody to the VH and VL CDR sequences of any human antibody.
  • a humanized antibody expression vector is constructed by inserting each into a host cell expression vector having a gene encoding the antibody CL, and the humanized antibody is expressed and produced by introducing the expression vector into the host cell. it can.
  • CH of the human rabbit antibody if belonging to hlg! /, It may be something! /, But those of hlgG class are preferred, and hIgGl, hIgG2, hIgG3 belonging to hlgG class, Any subclass such as hIgG4 can be used.
  • CL of human rabbit antibody may be any as long as it belongs to hlg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • a cell into which siRNA that suppresses sialidase activity of the present invention is introduced (hereinafter abbreviated as “the cell of the present invention”) can be prepared, for example, as follows.
  • RNAi RNA interferance gene construct having an appropriate length including a portion encoding a sialidase or a portion of an untranslated region is designed.
  • a thread recombination vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the cell of the present invention can be obtained by selecting a transformant using as an index the mRNA amount and activity of the introduced sialidase, or the glycoprotein molecule on the produced glycoprotein molecule or the glycoprotein on the cell surface. .
  • any yeast cell, animal cell, insect cell, plant cell or the like having a target sialidase gene can be used. Specifically after Examples of the host cell described in 2. above.
  • the above host cell can be autonomously replicated! /, Or can be integrated into a chromosome, and contains a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed. Used. Specifically, an expression vector that is transcribed by RNA polymerase III or a recombinant vector suitable for various host cells described in 2. below can be used.
  • sialidase cDNA and genomic DNA examples include the methods described below.
  • Total RNA or mRNA is prepared from the tissues or cell strength of various host cells.
  • a cDNA library is prepared from the prepared total RNA or mRNA.
  • a degenerative primer is prepared, and a gene fragment encoding sialidase is obtained by PCR using the prepared cDNA library as a template.
  • a cDNA library can be screened to obtain DNA encoding sialidase.
  • Human or non-human animal tissue or cell mRNA may be commercially available (for example, manufactured by Clontech), or human or non-human animal tissue or cell force may be prepared as follows. .
  • mRNA is prepared by using a commercially available kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia). Togashi.
  • a cDNA library is prepared from the prepared human or non-human animal tissue or cell mRNA.
  • the cDNA library can be prepared by the method described in Molecular 'Crowing 2nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), etc., or a commercially available kit. Examples thereof include a method using Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies: ⁇ ), ZAP-cDNA by nthesis Kit (STRATAGENE).
  • any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can autonomously replicate in Escherichia coli K12.
  • ZAP Express [STRATAGENE, Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ ZAP II manufactured by STRATAGENE
  • gtl0, gtl l [DNA cloning, A Practical A pproach], 1, 49 (1985)]
  • TriplEx (Clontech )
  • pT7 T318U Pharmacia
  • pcD2 [Mole. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]
  • pUC18 Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli is preferably used as a host microorganism for preparing a cDNA library. Specifically, Escherichia coli XL1—Blue MRF '[STRATAGENE, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia E. coli YlO 88 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Yl 090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 [Jananore 'Ob' Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology 0. Mol.
  • this cDNA library can be used as it is for the subsequent analysis, it was developed by Kanno and others to reduce the percentage of incomplete-length cDNA and to obtain full-length cDNA as efficiently as possible.
  • Oligo cap method [Gene, 138, 171 (1994); Gene, 200, 149 (1997); protein nucleic acid enzyme, 41, 603 (1996); experimental medicine, 11, 2491 (1993); It may be prepared by using cDNA cloning (Yodo Co., Ltd.) (1996); Gene library preparation method (Yodo Co., Ltd. (1994)).
  • a degenerative primer specific to the 5'-end and 3'-end base sequences predicted to encode the amino acid sequence is prepared, Obtaining a gene fragment encoding sialidase by amplifying DNA using the prepared cDNA library as a saddle and using the PCR method [PCR Protocols, Academic Press (1990)] Can do.
  • the obtained gene fragment is a DNA encoding sialidase.
  • Sanger et al.'S dideoxy method [Procedidas • Ob The National Academia ⁇ ⁇
  • a base sequence analyzer such as ABI PRISM377 DNA Sequencer (Applied Biosystems), or the like, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 4, 5463 (1977)] Can be confirmed.
  • colony hybridization or plaque hybridization (molecular clones) from cDNA or cDNA library synthesized from mRNA contained in tissues or cells of human or non-human animals. -2nd edition) can be used to obtain the salidase DNA.
  • cDNA synthesized from mRNA contained in tissues or cells of human or non-human animals can be obtained using a cDNA library as a template and PCR. By using this amplification, it is possible to obtain cDNAs of various enzymes related to the addition of sialic acid.
  • the base sequence of the obtained DNA encoding the sialidase can be determined by a commonly used base sequence analysis method such as Sanger et al.'S dideoxy method [Procedidas' Ob 'The' National * By analyzing using a base sequence analyzer such as Obci Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1 977)] or ABI PRISM377 DNA Sequencer (Applied Biosystems) The base sequence of the DNA can be determined. [0077] Based on the determined base sequence of cDNA, a homology search program such as BLAST is used to search base sequence databases such as Genbank, EMBL, and DDBJ. It can be confirmed that the gene encodes sialidase.
  • a homology search program such as BLAST is used to search base sequence databases such as Genbank, EMBL, and DDBJ. It can be confirmed that the gene encodes sialidase.
  • Examples of the base sequence of the gene encoding sialidase obtained by the above method include the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, 3 or 4.
  • Lidase cDNA Based on the determined DNA base sequence! / And by chemically synthesizing with a DNA synthesizer such as a DNA synthesizer model 392 (manufactured by Perkin Elmer) using the phosphoramidite method, Lidase cDNA can also be obtained.
  • a DNA synthesizer such as a DNA synthesizer model 392 (manufactured by Perkin Elmer) using the phosphoramidite method
  • Examples of the method for preparing the genomic DNA of sialidase include the methods described below.
  • genomic DNA of sialidase can be obtained by using a genomic DNA library screening system (Genome Systems) or Universal GenomeWalker TM Kits (CLONTECH).
  • Examples of methods for selecting transformants using sialidase activity as an index include the following methods.
  • cells can be selected using as an index the change in traits resulting from the suppression of sialidase activity.
  • a method of selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced glycoprotein as an index can be mentioned. Specifically, the method described in 3. below can be mentioned.
  • RNA gene for suppressing the amount of mRNA of the sialidase gene can be prepared by a conventional method or using a DNA synthesizer.
  • RNA gene construct is [Nature, 391, 806 (1998); Procedurals of the National Academia Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 95, 15502 (1998); Nature, 395, 854 (1998); Proceedings 'Ob' The National 'A Power Demi-Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 5049 (1999); Cell, 95, 1017 (1998); Procedures' Ob The National Academia ⁇ ⁇ Ob Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA ), 96, 1451 (1999); Procedurals of the National Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998); ⁇ ⁇ It can be designed according to the description of Cell's Biology (Nature Cell Biol), 2, 70 (2000).
  • the cell of the present invention can be obtained by directly introducing into a cell a double-stranded RNA designed based on the base sequence of sialidase without using an expression vector.
  • Double-stranded RNA can be prepared by a conventional method or using an RNA synthesizer. Specifically, among the complementary RNA base sequences of sialidase cDNA and genomic DNA, it corresponds to 1 to 50 bases, preferably 10 to 40 bases, more preferably 10 to 30 bases, and even more preferably 15 to 30 bases. Based on the sequence information of the oligonucleotide having a sequence, it can be prepared by synthesizing an oligonucleotide (antisense oligonucleotide) corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide. The oligonucleotide and antisense oligonucleotide may be synthesized independently, or connected with a spacer nucleotide that does not interfere with double-stranded RNA formation! /! /.
  • oligonucleotide derivatives examples include oligo RNA and derivatives of the oligonucleotide (hereinafter referred to as oligonucleotide derivatives).
  • Oligonucleotide derivatives include phosphodiester bonds in oligonucleotides. Oligonucleotide derivative converted to phosphothioate bond, phosphodiester bond in oligonucleotide converted to N3, -P5, phosphoramidate derivative converted to phosphoramidate bond, substituted with uracilca SC-5 propynyluracil in oligonucleotide Oligonucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives substituted with uracilca C-5 thiazoleuracil in the oligonucleotide, oligonucleotide derivatives substituted with cytosine in the oligonucleotide with C-5 propylcytosine, in the oligonucleotide Oligonucleotide derivatives in which the cytosine is replaced with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives in which the ribose in
  • the glycoprotein composition was obtained from Molecular 'Crowning 2nd Edition, Current' Protocols 'In' Molecular 1 ⁇ Nylon 1 ⁇ , Antibodies, A Laboratory manual, old Spring Harbor Laboratory, 1988 (hereinafter referred to as Antibodies).
  • Monoclonal Antibodies principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (hereinafter abbreviated as Monoclonal Nanoreantibodies), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (hereinafter, For example, the cell of the present invention can be used as a host cell and expressed in the host cell as described below.
  • a cDNA encoding a glycoprotein is prepared, and a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the molecule is prepared.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing a glycoprotein molecule can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • any yeast cell, animal cell, insect cell, plant cell, etc. can be used as long as it can express the target gene.
  • the follicle is raised.
  • An expression vector that can replicate autonomously in the above host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where DNA encoding the target glycoprotein molecule can be transcribed is used. It is done.
  • the cDNA can be prepared from a tissue or cell of a human or non-human animal using a probe or primer specific for the target glycoprotein according to the cDNA preparation method described in 1. above. it can.
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATC C 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.
  • promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MF al promoter, CUP 1 promoter and the like.
  • any method for introducing DNA into yeast can be used.
  • the Elect Mouth Position Method [Methods. Enzymol., 194, , 182 (1990)]
  • Spheroplast method Proceedings' Ob The National de force of science ( proc . Natl. Acad. Sci. USA), 84, 1 929 (1978 )]
  • Lithium Acetate Method Lithium Acetate Method [Journal ⁇ Ob 'Battereriology 0. Bacteriology), 15 3, 163 (1983)], Proceedings' Ob The 'National' Academia 1 'Ob' Science (Proc. Natl Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978)].
  • examples of expression vectors include pcDNAU pcD M8 (sold by Funakoshi), pAGE107 [Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979; Cytotechno logy, 3, 133, ( 1990)], pAS3-3 [JP-A-2-227075], pCDM8 [Nature, 32 9, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGElO 3 [Journal 'Ob' Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE21 0 etc. can be raised.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrowinores examples thereof include promoters, meta-mouthone promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electoral position method [Cytote chnology, 3, 133 (1990) , Calcium phosphate method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075], lipofussion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 84, 7413 (1987) ], Injection method [Murpurating 'The' Mouse Embryo Laboratories Manual], method using particle gun (Patent No. 2606856, Patent No.
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into insect cells to express the protein. it can.
  • Examples of gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVLl, and the like.
  • baculoviruses include the ability to use autora, californica nuclear polyhedrosis virus and the like, which are viruses that infect night stealing insects.
  • baculoviruses include the ability to use autora, californica nuclear polyhedrosis virus and the like, which are viruses that infect night stealing insects.
  • a method for co-introducing the above recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofusion method [Proceedings] 'Ob The National'Academia's Ob Science ( proc . Natl. Acad. Sci. USA), 84, 7413 (1987)].
  • expression vectors include Ti plasmids and tobacco mosaic virus vectors.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the rice 1 promoter.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140 885, Kaisho 60-70080, WO94 / 00977
  • Elect Mouth Position Method Japanese Patent Laid-Open No. 60-251887
  • a method using a particle gun Japanese Patent No. 25 17813
  • Japanese Patent No. 25 17813 Japanese Patent No. 25 17813
  • secretory production can be carried out according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition, etc. in addition to direct expression.
  • the transformant obtained as described above is cultured in a medium, and the desired glycoprotein composition is produced and accumulated in the culture, and the glycoprotein composition is collected from the culture.
  • a composition can be produced.
  • the method of culturing the transformant in the medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • the medium As a medium for culturing a transformant obtained using a eukaryote such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the organism, and the culture of the transformant is performed. If the medium can be efficiently used, the difference between natural and synthetic media can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphates, and other ammonium or organic acid salts. Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts use is made of monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, mangan sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like. be able to.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH during the culture is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • antibiotics such as ampicillin or tetracycline to the medium during culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the culture medium.
  • RPMI 1640 medium commonly used as a medium for culturing transformants obtained using animal cells as a host [The Journal of the American American Medical Association (The Journal of the American Medical Association), 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959) ], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], Whitten medium [Genetic engineering experiment] Manual-Transgeneic • How to make a mouse (Kodansha) Motoya Katsuki (1987) An added medium or the like can be used.
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and the presence of 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Common media for culturing transformants obtained using insect cells as hosts include the commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, and ExCell405. (Both manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 6-7, 25-30 ° C, etc. for 1-5 days.
  • antibiotics such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Transformants obtained using plant cells as hosts are cultured as cells or differentiated into plant cells and organs. can do.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige 'and' Stag (MS) medium, White medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin is added to these mediums. It is possible to use the prepared medium.
  • Cultivation is usually carried out for 3 to 60 days under conditions of pH 5 to 9 and 20 to 40 ° C.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a yeast, animal cell, or plant cell-derived transformant having a recombinant vector incorporating a DNA encoding a glycoprotein molecule is cultured according to a normal culture method to produce a glycoprotein composition.
  • the glycoprotein composition can be produced by accumulating and collecting the glycoprotein composition from the culture.
  • the glycoprotein composition can be produced in a host cell, secreted outside the host cell, or produced on the outer membrane of the host cell.
  • the method can be selected by changing the structure of the glycoprotein molecule to be produced.
  • the glycoprotein composition When the glycoprotein composition is produced in the host cell or on the host cell outer membrane, Luson et al. [Journal ⁇ Ob ⁇ Biological ⁇ Chemistry (J. Biol. Chem.), 264, 17619 (1989)], Roe et al. [Proceedings 'Ob The National'' Ob . Science ( proc . Natl. Acad. Sci. USA), 86, 8227 (1989); Gene' Development (Genes Develop.), 4, 1288 (1990)], or JP 05-336963, By applying the method described in WO94 / 23021 etc., the glycoprotein composition can be actively secreted out of the host cell.
  • a DNA encoding a glycoprotein molecule and a DNA encoding a signal peptide appropriate for the expression of the glycoprotein molecule are inserted into an expression vector, and the expression vector is used as a host.
  • the target glycoprotein molecule can be actively secreted outside the host cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • an animal individual transgenic non-human animal or plant individual (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created.
  • a glycoprotein composition can be produced using these individuals.
  • the transformant is an animal or plant individual, it is bred or cultivated according to a usual method to produce and accumulate the glycoprotein composition, and the glycoprotein composition is collected from the animal individual or plant individual.
  • the glycoprotein composition can be produced.
  • -A non-human animal ⁇ ! Can be produced by producing and accumulating a glycoprotein composition in the animal and collecting the glycoprotein composition from the animal.
  • the Examples of the production 'accumulation site in the animal include milk of the animal (Japanese Patent Laid-Open No. 63-309192). ), And eggs.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animals.
  • a mammary cell specific promoter a chick casein promoter, an e casein promoter, an e lactoglobulin promoter, whey acidity.
  • a protein promoter or the like is preferably used.
  • glycoprotein composition As a method for producing a glycoprotein composition using an individual plant, for example, a known method for a transgenic plant introduced with DNA encoding a glycoprotein molecule [tissue culture, 20 (199 4); tissue culture]. , 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], and the glycoprotein composition is produced and accumulated in the plant. A method for producing a glycoprotein composition by collecting the glycoprotein composition can be mentioned.
  • a glycoprotein composition produced by a transformant into which a gene encoding a glycoprotein molecule has been introduced for example, when the glycoprotein composition is expressed in a dissolved state in a cell
  • the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, and then disrupted with an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as tilaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), and cation using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method using resins such as butyl sepharose and ferrule sepharose, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, isoelectric point
  • a purified preparation of the glycoprotein composition can be obtained by using a method such as electrophoresis such as electrophoresis alone or in combination.
  • the glycoprotein composition when expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is similarly collected, disrupted, and centrifuged to insoluble the glycoprotein composition as a precipitate fraction. Collect body. The recovered insoluble material of the glycoprotein composition is dissolved with a protein denaturant. The solubilized solution is diluted or dialyzed to return the glycoprotein composition to a normal three-dimensional structure, and then a purified preparation of the glycoprotein composition can be obtained by the same isolation and purification method as described above. Togashi.
  • the glycoprotein composition or a derivative thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, the culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation similar to the above, and glycoproteins are obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. A purified preparation of the composition can be obtained. If the host cell already has the ability to express the glycoprotein composition, the cell has the ability to express the glycoprotein composition using the method described in 1. above. After the preparation, the cells are cultured, and the desired glycoprotein composition is collected from the culture and purified, whereby the glycoprotein composition can be produced.
  • the sugar chain structure of a glycoprotein molecule expressed in various cells can be performed according to the analysis of the sugar chain structure of a normal glycoprotein.
  • neutral sugars such as galactose, mannose, and fucose
  • amino sugars such as N-acetyldarcosamine
  • acidic sugars such as sialic acid
  • neutral sugar or amino sugar can be liberated by acid hydrolysis of the sugar chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • composition ratio can also be analyzed by a fluorescent labeling method using 2-aminoviridine. Specifically, a sample subjected to acid-branching decomposition according to a known method [Agricultural 'and' Biological Chemistry (Agric. Biol. Chem.), 55 (1), 283-284 (1991)] Fluorescent labeling can be performed by 2-aminoviridylation, and HPLC analysis can calculate the composition ratio.
  • Acid sugar composition analysis As a method for analyzing the composition of the sugar chain added to the glycoprotein, acid sugar is liberated by acid hydrolysis of the sugar chain with hydrochloric acid or sulfuric acid, and the released acid sugar is labeled. Thus, the sugar composition ratio can be analyzed.
  • monosaccharides that constitute sugar chains added to glycoproteins include sialic acid, neutral sugars, and amino sugars.
  • the stability of monosaccharides released to acids is limited to amino sugars, neutral sugars, and sialic sugars. The order is acid. Therefore, since sialic acid is completely decomposed under the conditions for cleaving the glycosidic bond of amino sugar and neutral sugar, analysis of sialic acid and analysis of amino acid and neutral sugar are usually performed separately.
  • the glycoprotein composition is hydrolyzed to release sugar chains from glycoprotein molecules, and the fluorescent labeling of sugar chains with 2-aminoviridine (hereinafter abbreviated as “ ⁇ ”) [Journal After 'Ob' biochemistry (J. Biochem.), 95, 197 (1984)], the glycan is separated from excess PA reagent by gel filtration and reverse phase chromatography is performed. Next, normal phase chromatography is performed for each peak of the separated sugar chain. Based on these results, a 2D glycan map was plotted and the glycan standard (TaKaRa), literature [Analytical's Biochem., 171, 73 (1988)] The sugar chain structure can be estimated by comparing the spots with. [0122] Furthermore, mass analysis such as MALDI-TOF-MS of each sugar chain can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain map method.
  • ⁇ 2-aminoviridine
  • a purified glycoprotein composition is labeled with a compound such as a radioisotope, and the binding reaction with the receptor or interacting protein of the labeled glycoprotein composition is strong.
  • a method for quantitatively measuring the thickness It is also possible to measure protein-protein interactions using various devices such as Biacore's BIAcore series (J. Immnunol. Methods, 145, 229 (1991)). Intermolecular interaction experiment method, Yodosha (1996)).
  • the pharmaceutical containing the glycoprotein composition of the present invention can be administered alone as a prophylactic or therapeutic agent. Usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers. However, it is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the technical field of pharmaceutics.
  • the route of administration includes oral administration where it is desirable to use the most effective treatment, or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous. In the case of a glycoprotein preparation, intravenous administration is desirable.
  • the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol, and fructose, Daricols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, P- It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoates and the like, flavors such as stove belly flavors and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc. It can be produced using a binder such as an agent, polybulal alcohol, hydroxypropylcellulose, gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin, and the like as additives.
  • a binder such as an agent, polybulal alcohol, hydroxypropylcellulose, gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin, and the like as additives.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • the injection is prepared using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a powder injection can be prepared by freeze-drying a glycoprotein composition according to a conventional method and adding sodium chloride thereto.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using a carrier that does not irritate the glycoprotein composition itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa and disperses the glycoprotein composition as fine particles to facilitate absorption. Is done.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral agents can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, weight, etc.
  • the amount of active ingredient is usually 1 ⁇ / 13 ⁇ 4 to 200 g / kg per day for an adult. is there.
  • methods for measuring the biological activity of glycoprotein compositions include in vitro experiments, glycoprotein receptor binding activity measurement methods, glycoprotein composition enzyme activity measurement methods, glycoprotein receptor expression methods.
  • examples include in vitro tests such as methods for measuring proliferation / differentiation promoting activity using cell lines, or in vivo tests using human disease model animals.
  • plasmid pBluescriptll KS (+) was dissolved in 30 L of NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs), and 10 units of restriction enzymes EcoRI and XhoI (New England Biolabs) were added. Digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours. After the reaction, add 13 w L of sterile water, 5 ⁇ L of 10 X Alkaline Phosphatase Buffer and 1 unit of Alkaline Phosphatase E. coli 75 to the reaction solution, and remove at 37 ° C for 1 hour.
  • reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and an EcoRI-Xhol fragment derived from about 2.9 Kb of plasmid pBluescriptll KS (+) was collected using RECOCHIP (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • DNA EcoRI-Xhol fragment obtained above (approx. 250 bp) 8 ⁇ plasmid pBluescriptll KS (+) derived EcoR to Xhol fragment (approx. 2.9 Kb) 2 les Ligation High (Toyobo) 10 ⁇ L mixed And reacted at 16 ° C for 2 hours.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain (manufactured by Invitrogen) was transformed using the reaction solution, and plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin meta clone using QIAprep spin Mini prep Kit (manufactured by Qiagen).
  • the obtained plasmid is hereinafter referred to as FT81ib3 / pBS (Fig. 1).
  • plasmid pAGE249 was dissolved in 30 ⁇ l of NEBuffer 1 (New England Biolabs), and 10 units of restriction enzymes Nael and XhoI (New England Biolabs) were added at 37 ° C. The digestion reaction was performed for 6 hours. After the digestion reaction, sterilized water 22 L, 10 X Alkaline Phosphatase Buffer 6 ⁇ L and Alkaline Phosphatase E.coli C75 (manufactured by Takara Bio) 1 Units were added and dephosphorylation was performed at 37 ° C for 1 hour.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a Nael-Xhol fragment derived from about 4.4 Kb of plasmid pAGE249 was recovered using RECOCHIP (Takara Bio Inc.).
  • PAGE249 is a derivative of pAGE248 [Journal 'Ob' Biological. Chemistry (J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994))].
  • dhfr dihydrofolate reductase gene
  • PAGE249_seq FW SEQ ID NO: 8
  • pAGE249-seq RV SEQ ID NO: 9
  • the inserted DNA sequence is included in plasmid FUT8shRNA / lib2B / pP UR or plasmid FUT8shRNA / lib3 / pPUR
  • the RNA-val promoter ⁇ Short hairpin RNA expression unit V was consistent with the sequence corresponding to the EcoR and Xhol fragment.
  • the resulting plasmid is hereinafter referred to as FT81ib3 / pAGE ( Figure 2).
  • a synthetic oligo DNA was prepared that forms a double-stranded DNA cassette containing the target sequence of siRNA against the Chinese nomstar NEU2 sialidase gene.
  • NEU2 sialidase cDNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 (GeneBank, U06143), and Reynolds et al. (Nature Biotechnology, 22, 326 (2004))
  • SEQ ID NO: 1 GeneBank, U06143
  • Reynolds et al. London Biotechnology, 22, 326 (2004)
  • Condition 1 GC content is 30% to 50%. Add 1 point if satisfied.
  • At least 3 bases A or U are added to the 15th to 19th 5 bases of the sense strand. included. If satisfied, add 1 point for every 1 base of A or U.
  • Condition 4 19th force A of the sense strand. Add 1 point if satisfied.
  • a double-stranded DNA cassette was designed for the selected target sequence by the following procedure. Double-stranded DNA cassettes are also generated in the order of 5 'end force by cleavage of the restriction enzyme Sad, the 3' overhanging end, the antisense coding DNA complementary to the DNA sequence corresponding to SEQ ID NOs: 11-55 and the restriction enzyme Kpnl 3 'Has a protruding end.
  • the 5 ′ end of the double-stranded DNA was phosphorylated and the target sequence shown in SEQ ID NO: 11 was used, and the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as SiAl) of the synthetic oligo DNA designed was SEQ ID NO: 56, the antisense strand.
  • the base sequence of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 12 (hereinafter referred to as SiaBl) is shown in SEQ ID NO: 57 as the base sequence of SIAA2 (hereinafter referred to as SiaA2).
  • the base sequence is SEQ ID NO: 59
  • the base sequence of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 13 (hereinafter SiaCl) is the base sequence of SEQ ID NO: 60
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter SiaC2) is SEQ ID NO:
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as SiaD1) of the synthetic oligo-DNA designed by the target sequence shown in SEQ ID NO: 14 is represented by SEQ ID NO: 62
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as SiaD2) is represented by SEQ ID NO: 63.
  • Synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 65 the base sequence of the sense strand of the oligo DNA (hereinafter SiaEl) is SEQ ID NO: 64
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter SiaE2) is SEQ ID NO: 65
  • the nucleotide sequence of the sense strand (hereinafter referred to as SiaFl) is SEQ ID NO: 66, antisense.
  • the base sequence of the strand (hereinafter referred to as SiaG2) is the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as SiaGl) of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 67.
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as SialFW) of the synthetic oligo DNA designed as shown in SEQ ID NO: 69 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 18 is the base sequence of SEQ ID NO: 70 and the antisense strand (hereinafter referred to as SialRV).
  • Sia2FW the nucleotide sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia2FW) of the synthetic oligo DNA designed in accordance with the target sequence shown in SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 19, and the nucleotide sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia2RV).
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia3FW) of the synthetic oligo DNA designed in accordance with the target sequence shown in SEQ ID NO: 20 is represented by SEQ ID NO: 74, and the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia3RV). No.
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia4 FW) of the designed synthetic oligo DNA is represented by SEQ ID NO: 76
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia4RV) is represented by SEQ ID NO: 77
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 22
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia5FW) of the designed synthetic oligo DNA is represented by SEQ ID NO: 78
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia5RV) is represented by SEQ ID NO: 79
  • the target sequence represented by SEQ ID NO: 23 the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia4RV) of the designed synthetic oligo DNA is represented by SEQ ID NO: 78
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia5RV) is represented by SEQ ID NO: 79
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter Sia7FW) is SEQ ID NO: 82
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia7RV) is SEQ ID NO: 83
  • the sense strand of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 25 (Sia8FW)
  • Sia9FW The base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia9FW) of the synthetic oligo DNA designed for column No.
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia8RV) is shown in SEQ ID NO: 85 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 26 as SEQ ID NO: 86.
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as SialOFW) of the synthetic oligo DNA designed by connecting the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia9RV) to the target sequence shown in SEQ ID NO: 87 and SEQ ID NO: 27 is shown in SEQ ID NO: 88.
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as SialORV) is shown in SEQ ID NO: 89, and the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sial 1 FW) of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 28 is shown in SEQ ID NO: 90.
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sial2FW) of the synthetic oligo DNA designed according to the target sequence shown in SEQ ID NO: 91 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 29 as the base sequence of the strand (hereinafter referred to as SiallRV) is represented by SEQ ID NO: 92 Sial2RV)
  • the base sequence is SEQ ID NO: 93
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter Sial3FW) of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 30 is SEQ ID NO: 94
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Si al3RV) is SEQ ID NO: 95
  • the base sequence of the antisense strand here
  • the base sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter referred to as Sial6FW) designed for the target sequence shown in number 33 is shown in SEQ ID NO: 100
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sial6RV) is shown in SEQ ID NO: 101
  • the target shown in SEQ ID NO: 34 In the array
  • the synthesized oligo DNA sense strand (hereinafter referred to as Sial7FW) has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 102
  • the antisense strand hereinafter referred to as Sial7RV
  • the synthetic oligo designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 35 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 103
  • the base sequence of the DNA sense strand (hereinafter referred to as Sial8FW) is SEQ ID NO: 104
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sial8RV) is SEQ ID NO: 105
  • the sense strand of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 36 ( The base sequence of Sial9FW) is SEQ ID NO: 106
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sial9RV) is SEQ ID NO: 107
  • the target sequence shown in SEQ ID NO: 37 is the base of the sense strand (hereinafter Sia20FW) of the synthetic oligo DNA designed.
  • the base sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter referred to as Sia21FW) designed by SEQ ID NO: 108, the nucleotide sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia20RV) as SEQ ID NO: 109, and the target sequence shown as SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 110, the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia21RV) in SEQ ID NO: 111, and the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia22FW) of the synthetic oligo DNA designed using the target sequence shown in SEQ ID NO: 39 as SEQ ID NO: 112, the nucleotide sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia22RV) is shown in SEQ ID NO: 113, and the nucleotide sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter referred to as Sia23FW) designed according to the target sequence shown in S
  • the base sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter Sia25FW) designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 117 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 42 (hereinafter Sia24RV) is shown in SEQ ID NO: 1. 18.
  • the nucleotide sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia26FW) of the synthetic oligo DNA designed according to the target sequence shown in SEQ ID NO: 119 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 43 as the nucleotide sequence of the antisense strand (hereinafter Sia25RV) is SEQ ID NO: 120.
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as SiA27FW) of the synthetic oligo DNA designed with the target sequence shown in SEQ ID NO: 121 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 44 as the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia26RV) is SEQ ID NO: 122 as the antisense strand.
  • the base sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter referred to as Sia28FW) designed according to the target sequence shown in SEQ ID NO: 123 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 45 is referred to as SEQ ID NO: 124 and the antisense strand (hereinafter referred to as Sia28RV).
  • Sia29FW Is the nucleotide sequence of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 46 (hereinafter referred to as Sia29FW), the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 126, and the nucleotide sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia29RV).
  • SEQ ID NO: 1 In 27, the base sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter Sia30FW) designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 47 is SEQ ID NO: 128, and the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia30RV) is SEQ ID NO: 129.
  • the base sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter referred to as Sia31FW) designed according to the target sequence shown in SEQ ID NO: 48 is shown in SEQ ID NO: 130
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia31RV) is shown in SEQ ID NO: 131
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter Sia32FW) of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in 49 is shown in SEQ ID NO: 132
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia32RV) is shown in SEQ ID NO: 133
  • the target sequence shown in SEQ ID NO: 50 The base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as Sia33FW) of the synthetic oligo DNA designed for SEQ ID NO: 134
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia33RV) is shown in SEQ ID NO: 135, and
  • the sense sequence of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 136 is shown in SEQ ID NO: 136 for the base sequence of the sense strand (hereinafter Sia34FW) of the Rigo DNA, SEQ ID NO: 137 in the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia34RV).
  • the base sequence of the strand (hereinafter referred to as Sia35FW) is SEQ ID NO: 138, the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as Sia35RV) is shown in SEQ ID NO: 139, and the synthetic oligo DNA sense strand designed by the target sequence shown in SEQ ID NO: 53 (
  • the base sequence of Sia36FW) is represented by SEQ ID NO: 140
  • the base sequence of the antisense strand hereinafter Sia36RV
  • the sense strand of the synthetic oligo DNA (hereinafter referred to as the target sequence shown by SEQ ID NO: 54).
  • Sia37FW is the base sequence of SEQ ID NO: 142
  • the antisense strand (hereinafter Sia37RV) is the base sequence of SEQ ID NO: 143
  • the sense strand of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 55 ( The base sequence of Sia38FW) is shown in SEQ ID NO: 144
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter Sia38RV) is shown in SEQ ID NO: 145.
  • the designed synthetic oligo DNA was synthesized according to a conventional method (Molequila I. Cloning 2nd edition).
  • the synthetic oligo DNA synthesized in this section (2) was inserted into the siRNA-type DNA insertion region of FT81ib3 / pAGE obtained in this section 1 (1).
  • the synthetic oligo DNA was annealed according to the following procedure (Fig. 3). 200 pmol each of the synthetic oligo DNA sense strand and antisense strand was dissolved in 10 ⁇ L of annealing buffer [10 mM Tris (pH 7.5) -50 mM NaCl-lmM EDTA] and incubated at 98 ° C. for 2 minutes. Then, it was cooled down and cooled to room temperature over about 3 hours. Thereafter, the annealed synthetic oligo DNA was diluted 100 times with sterile water.
  • annealing buffer 10 mM Tris (pH 7.5) -50 mM NaCl-lmM EDTA
  • each plasmid DNA obtained by cleaving the short DNA fragment of the short hairpin RNA loop by digestion with BamHI was used as a primer.
  • PAGE249-seq FW (SEQ ID NO: 9) and pAGE249- Using seq RV (SEQ ID NO: 10) it was confirmed that there was no mistake in the sequence of the inserted synthetic oligo DNA and the ligation part.
  • the plasmid inserted with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNAs siaAl and siaA2 is pSiaA
  • the plasmid inserted with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNAs siaBl and siaB2 is composed of pSiaB
  • PSiaC is the plasmid with the double-stranded DNA inserted
  • pSiaD is the plasmid with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNAs siaDl and siaD2
  • a plasmid with a synthetic oligo DNA siaFl and siaF2 also has a double-stranded DNA inserted into pSiaF
  • a synthetic oligo DNA sialFW and pSial is a plasmid in which double-stranded DNA consisting of sialRV is inserted
  • pSia2 a plasmid inserted with double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNAs sia3FW and sia3RV
  • pSia3 a plasmid inserted with double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNAs sia4FW and sia4RV
  • synthetic oligo DNA sia5FW and sia5RV PSia5 is the plasmid with the double-stranded DNA inserted
  • pSia6 is the plasmid with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNAs sia6FW and sia6RV
  • the plasmid is the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNA sia7FW and sia7RV PSia7
  • pSia8 a plasmid inserted with a double-
  • the plasmid is pSiall, the plasmid inserted with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNA sial2FW and sial2RV is pSial2, the plasmid with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNA sial3FW and sial3RV is pSial3, and the synthetic oligo DNA pSial4 is a plasmid in which double-stranded DNA consisting of sial 4FW and sial4RV is inserted, pSial5 is a plasmid in which double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNA sial5FW and sial5RV is inserted, and double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNA sial6FW and sial6RV PSial6 is the plasmid with the inserted DNA, pSial7 is the plasmid with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNA sial7FW and sial
  • PSia29 is the inserted plasmid
  • pSia30 is the plasmid with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNAs sia30FW and sia30 RV
  • pSia31 is the plasmid with the double-stranded DNA composed of the synthetic oligo DNA sia31FW and sia31RV.
  • PSia32 is a plasmid in which double-stranded DNA consisting of oligo DNA si32FW and sia32RV is inserted
  • pSia33 is a plasmid in which double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNAs sia33FW and sia33RV is inserted
  • two plasmids are composed of synthetic oligo DNA sia34FW and sia34RV.
  • a plasmid with a double-stranded DNA consisting of pSia34 and a synthetic oligo DNA sia35FW and sia35RV is inserted into the plasmid with the double-stranded DNA inserted.
  • pSia35 a plasmid inserted with a double-stranded DNA composed of synthetic oligo DNAs sia36FW and sia36RV
  • pSia36 a plasmid inserted with a double-stranded DNA composed of synthetic oligo DNAs sia37FW and sia37RV
  • pSia37 a synthetic oligo DNA composed of sia38FW and sia38RV
  • the plasmids with double-stranded DNA inserted are called pSia38 (Fig. 3).
  • Sia! 2 is a sequence complementary to nucleotides 177 to 196 of the Chinese hamster NEU2 sialidase gene sequence shown in SEQ ID NO: 1, and siarv2 is a sequence complementary to nucleotides 1311 to 1333.
  • the PCR reaction was 25 ⁇ L of 5 ⁇ L CHO / DG44 cell-derived single-stranded cDNA [1 X EX Taq Buffer (Takara Shuzo), 0.2 mM dNTP, s, 0.5 units of EX Prepare Taq polymerase (Takara Shuzo), 0.5 ⁇ of the above primers (SEQ ID NO: 146 and SEQ ID NO: 147)], and use GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elma) for 5 minutes at 94 ° C. After heating, 30 cycles of 94 ° C for 20 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds were performed.
  • a PCR amplified fragment of about 1 .1 Kbp was recovered using Qiaex II gel extraction kit (Qiagen).
  • the DNA fragment was ligated to the pT7 blue vector (Novagen) using Ligation high (Toyobo), and the resulting recombinant plasmid DNA was used to transform E. coli DH5a strain (Toyobo).
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from the resulting ampicillin metacolonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
  • the base sequence of the PCR fragment contained in the plasmid was determined using DNA Sequencer ABI PRISM 377 (manufactured by PerkinElmer Co., Ltd.) according to a conventional method, and it was confirmed that there was no base mutation associated with PCR.
  • the resulting plasmid containing the NEU2 sialidase cDNA derived from Chinese hamster ovary cells (CHO) is called pT7 blue sialidase ( Figure 4).
  • firefly luciferase gene 1 ⁇ g of the reporter plasmid pG5Luc (Clontech) that encodes lysate is dissolved in 30 ⁇ L of Kashiwa Buffer 1 (Takara Shuzo), 10 units of HindllKNew England BioLab) and 10 units of XbaI (New England BioLab)
  • the reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment encoding about 1.7 Kbp of firefly luciferase was recovered using RECOCHIP (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • plasmid pAGE249 is dissolved in 30 ⁇ L of koji buffer (Takara Shuzo), and 10 units of Hindlll (Takara Shuzo) and 10 units of BamHI (New England BioLab) are added at 37 ° C. And digested for 2 hours.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 6.4 Kbp derived from pAGE249 was recovered using RECOCHIP (Takara Bio Inc.).
  • pAGE Lucia is a plasmid that expresses a chimeric reporter gene that also has firefly luciferase and Chinese nomstar NEU2 sialidase activity under the control of the mouse Moro-1 LTR promoter.
  • siRNA expression plasmids and chimeric reporter expression plasmids were co-introduced into CHO / DG44 cells, effective siRNA expression plasmids were identified by measuring luciferase activity.
  • What is expressed from the plasmid pKANTEX Lucia prepared in this Example 3 is a chimeric reporter gene that also has the power of a firefly luciferase gene in which a Chinese nomstar NEU2 sialidase gene is placed in the untranslated region.
  • the NEU2 sialidase region on the chimeric reporter gene is cleaved by siRNA, the intracellular luciferase activity decreases with the disappearance of the chimeric reporter.
  • the DNA-lipid mixture was prepared by the following procedure. 40 ng chimeric reporter expression plasmid pKANTEX Lucia per well, 160 ng siRNA expression plasmid and 20 ng internal standard plasmid pRL-TK were dissolved in 25 ⁇ L OPTI-MEM medium, and 0.8 ⁇ L Lipofectamin2000 The DNA solution was added to a lipid mixture mixed with 25 ⁇ L of ⁇ -MEM medium and allowed to stand at room temperature for 20 minutes to prepare a DNA-lipid mixture.
  • PRL-TK is a Renilla luciferase expression plasmid added to correct the gene transfer efficiency for each well. Add 50 L of the DNA-lipid mixture and add it to the well containing the transfected cells replaced with 0 PTI-MEM medium, and incubate for 6 hours at 37 ° C and 5% CO. It was. After culturing for 6 hours, add 100% basic medium containing 20% serum.
  • the amount of firefly luciferase luminescence from each well was corrected using the amount of luminescence from renilla luciferase, and for each siRNA expression plasmid, the relative value of the firefly luciferase activity observed when co-introduced with the chimeric reporter plasmid was calculated. Indicated.
  • psiFLuc manufactured by GeneScript
  • psiFLuc as a positive control is a plasmid that expresses siRNA targeting a part of the firefly luciferase gene. By co-introducing this plasmid, the amount of firefly luciferase luminescence from the chimeric reporter is It was suppressed by 80% (Fig. 7).
  • siRNA expression plasmids targeting the sialidase gene 4 molecules of pSi5, pSil7, pSi28, and pSi34 clearly have the ability to suppress the activity of the co-introduced reporter by 80% or more, as in the positive control. became.
  • sialidase target siRNA expression plasmids pSi5, pSil7, pSi28, and pSi34 obtained in this section 2 into MS705 pKAN- ⁇ 27 strain described in WO2005 / 035563 (Department No. 13 ⁇ 41? ⁇ 1 BP-0 8472) Then, a cell line in which the cellular sialidase activity was stably suppressed was obtained. This strain is a CHO / MS705-derived strain that stably produces antithrombin.
  • the plasmid was introduced into the cell line by the following method.
  • puromycin was replaced with 10 mL of basic medium containing 12 ⁇ g / mL, and further cultured for 7 days to obtain puromycin-resistant clones.
  • 96 pure-mouthymycin resistant clones were isolated and cultured in 96-well plates for cell culture (Grainer). A replicated plate was prepared immediately before the cell density of each well reached confluence. That is, after each well was washed with 100 L PBS (Invitrogen), 25 ⁇ L of 0.05% Tripsin (Invitrogen) 25 ⁇ L was added and placed in a 5% CO incubator.
  • each basic well is supplemented with a basic medium containing 125 L of puromycin (SIGMA) at a concentration of 12 ⁇ g / mL, and the cells are suspended. Inoculate three 96-well plates containing basal medium containing 12 ⁇ g / mL of puromycin at a concentration of 12 ⁇ g / mL and leave at 37 ° C for 3 days in a 5% CO incubator.
  • SIGMA puromycin
  • sialidase activity was measured by dispensing 5 ⁇ L / wenore of the sialidase fluorescent substrate 4-methylumbellifery ⁇ a-a-D-acetyln euraminic acid ammonium salt (manufactured by Nacalai Tesque) prepared at a concentration of 4 mM, and capping the plate. And allowed to react at 37 ° C for 2 hours in a carbon dioxide incubator (smoked).
  • Serum-free batch culture is performed under conditions of a temperature of 35 ° C and a stirring speed of 85 rpm, and supplements the consumption of amino acids, etc. on the 3rd, 5th, 7th, 9th, and 11th days after the start of the culture.
  • Antithrombin was quantified by first using ⁇ ELISA Capture Antibody (Antibody Set, Affinity Biologocs C / N ⁇ -EIA) with 50 mM Carbonate (1.59 g Na CO and 2.93 g NaHC).
  • Dissolve O in an appropriate amount of distilled water adjust to pH 9.6 with 5N NaOH aqueous solution, and then add distilled water.
  • the solution was diluted 100 times with 1 L of the solution, and dispensed at 100 L / well into a 96-well plate (Nunc). After standing at room temperature for 1-2 hours, the inside of the well was washed with 0.005% Tween20-PBS, and 1% BSA-PBS was dispensed at 100 ⁇ L / well and stored frozen.
  • Samples and standards with known concentrations are diluted to an appropriate concentration with 1% BSA-PBS, dissolved at room temperature, and BSA-PBS in the wells removed, 50 ⁇ L / well And dispensed at room temperature for 1 hour. After washing the well with 0.05% Tween20-PBS, the sputum detection antibody solution was dispensed at 100 / z L / well and allowed to stand at room temperature for about 1 hour. After each well was washed with 350 L of 0.05% Tween20-PBS, ABTS solution containing 0.1% H0 was added.
  • the color development was stopped by adding 5% SDS solution with L / well. Using a microplate reader, the absorbance was measured at a wavelength of excitation 415 nm / absorption 490 nm, and the soot content was calculated.
  • the 28-17 strain suppressed the sialidase activity in the culture supernatant throughout the 14-day culture period.
  • the sialic acid number can maintain a high value.
  • the production method of the present invention can provide a glycoprotein composition in which the amount of sialic acid added is increased as compared with conventional glycoprotein compositions.

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Abstract

　糖蛋白質組成物中のシアル酸付加量を高めることにより、高い生理活性を有する糖蛋白質組成物を提供することが求められている。本発明により、シアリダーゼ活性を抑制するsiRNAを導入または発現させた細胞、該細胞を用いた糖蛋白質分子の製造方法、および該製造方法により得られた糖蛋白質組成物を提供する。

Description

明 細 書
糖蛋白質組成物の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、シァリダーゼ活性を抑制する低分子干渉 RNA (small interfering RNA;以 下、 siRNAと略記する。）を導入させた細胞、該細胞を用いる糖蛋白質分子の製造方 法、および該製造方法により得られる糖蛋白質組成物に関する。本発明は、また、 si RNAを用いた、シァリダーゼ活性を抑制する方法に関する。
背景技術
[0002] シァリダ一ゼは糖蛋白質に付加した糖鎖の非還元末端力 シアル酸を除去するこ とによって糖鎖分解の初発反応を触媒するェキソ型 aーグリコシダーゼの一種であ る。シァリダーゼによって糖蛋白質に付加した糖鎖の非還元末端カもシアル酸残基 が除去されると多くの糖蛋白質分子の機能が変化する。これまで、シァリダ一ゼの機 能を解明するには、細菌やウィルス由来のシァリダーゼが用いられてきたため、哺乳 動物の生体内でシアル酸がどのように脱離されるのかにっ ヽては詳 、解析がなさ れていな力つた。し力しながら、近年、哺乳動物の内在性シァリダーゼ力 糖鎖分解 の最初の反応をつ力さどることによって、糖鎖修飾されている生体分子の異化分解を 調節し、立体構造や受容体による認識機構、細胞接着や免疫機構などに影響を与 えるなどの、多くの重要な細胞機能を制御することが明らかとなった (非特許文献 1)。
[0003] 哺乳動物には、細菌やウィルスのシァリダ一ゼとは異なる、少なくとも 4種のシァリダ ーゼが存在する (非特許文献 2、 3)。哺乳動物の内在性シァリダーゼは、細胞質 (非 特許文献 4)、リソソーム内腔 (非特許文献 5)、リソソーム膜 (非特許文献 6)および形 質膜 (非特許文献 6)に局在し、互いに基質特異性などの酵素学的な性状が異なつ ている。
最初の哺乳動物シァリダーゼとして細胞質シァリダーゼ遺伝子 (NEU2シァリダーゼ )の構造が明らかになり（非特許文献 7)、次いでリソソ一ムシァリダ一ゼ (NEU1) (非 特許文献 8)と形質膜シァリダーゼ (NEU3) (非特許文献 9)の遺伝子がクローユング された。微生物が起源であるシァリダーゼ含め、各種シァリダーゼのアミノ酸配列の 相同性はそれほど高くな 、が、複数のァスパラギン酸ボックス（Ser-X-Asp-X- Gly-X - Thr-Trp)配列の存在や、 N末端付近の Phe-Arg-Ile-Pro配列、および 2つのァスパ ラギン酸ボックス配列の間に位置する Va卜 Gly-X- Gly配列など、共通に見出されるァ ミノ酸配列が保存されている。さらに、シァリダーゼ活性に関与するアミノ酸残基が高 度に保存されており、アミノ酸立体構造に高い類似性がある。例えば、サルモネラ LT 2由来シァリダーゼの結晶構造 (非特許文献 10)は、ヒト NEU2シァリダーゼの結晶構 造 (非特許文献 11)と類似して ヽる。
[0004] NEU2シァリダーゼ遺伝子は、 1679塩基長からなり 379アミノ酸残基力 なる一本鎖 ポリペプチドをコードしている。 NEU2シァリダーゼには、 2個のァスパラギン酸ボックス 配列が存在し、システィン残基や j8シート構造に富み、微生物由来シァリダ一ゼと類 似した立体構造をとることが知られている。本酵素は細胞質に存在し、中性 pH付近 で働き、オリゴ糖、ガンダリオシド、糖蛋白質を基質としている。特に、精巣や骨格筋 に高発現し、骨格筋細胞の分化に重要な役割を果たすことが報告されている (非特 許文献 12)。 NEU2シァリダーゼについては、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細 胞 (非特許文献 13)、ヒト骨格筋 (非特許文献 14)、マウス脳 (非特許文献 15)および マウス胸腺 (非特許文献 16)から遺伝子が単離されて!/ヽる。
[0005] 一般に、医薬への応用が考えられている糖蛋白質の多くは、遺伝子組換え技術を 用いて作製され、哺乳動物由来の細胞、例えばチャイニーズノヽムスター卵巣組織由 来の CHO細胞やマウスミエローマ細胞などを宿主細胞として用い製造されて 、る。し 力しながら、発現させた糖蛋白質の糖鎖構造は宿主細胞や培養方法によって異なる ため、現状では、必ずしも最適な薬理活性が発揮できるような糖鎖が付加されている とは限らない。特に、糖鎖の非還元末端シアル酸の付加は、投与した糖蛋白質の薬 理活性に大きな影響を与える場合があるため、シアル酸修飾を制御した糖蛋白医薬 品を製造し提供することが重要である。
[0006] シアル酸付加が薬理活性の発現に重要な糖蛋白医薬品としては、具体的には、ェ リスロボイエチン（EPO)や組織型プラスミノーゲンァクチベータ (t- PA)などがあげら れる。
これら糖蛋白医薬品は、患者の静脈あるいは皮下に注射あるいは点滴によって投 与されるが、糖鎖の非還元末端に付加されたシアル酸が糖蛋白質の血中半減期の 維持に重要な役割を果たしており、シアル酸の脱離により血中半減期が大きく損なわ れることが知られている (非特許文献 17〜 19)。この理由は、シアル酸を脱離させると 非還元末端側にガラクトース残基が露出し、肝臓などに局在するァシァ口糖蛋白質 受容体 (ガラタトース受容体）に捕捉され速やかに分解されるためである (非特許文献 20)。
[0007] 糖蛋白質は、宿主細胞にそれら糖蛋白質をコードする cDNAを安定的に組込んで 榭立した形質転換体を、適当な培養条件で適当な期間培養することにより分泌生産 させる。生産細胞力も培養液中に分泌された糖蛋白質には、細胞が固有に有する糖 鎖修飾機構に基づいて多様な糖鎖が付加され、多くの場合、成熟した糖鎖の非還元 末端側は負電荷を有するシアル酸残基で修飾されている。しかしながら、その付カロ 率は、生産株や培養方法によって幅が生じてしまい、全ての糖鎖の非還元末端をシ アル酸で保護すること難しい。この糖蛋白質の製造において、シアル酸付加率を低 下させる大きな原因の一つに生産細胞が有するシァリダーゼの関与があげられる。
[0008] シァリダーゼ、特に、 NEU2シァリダーゼは、糖蛋白質の製造において、生産細胞の 細胞質より培養液中に漏出蓄積し (非特許文献 21)、培養液中に蓄積した糖蛋白質 の糖鎖カもシアル酸を脱離させて 、ることが分力つてきた (非特許文献 22)。このこと は、 CHO細胞を宿主とした複数種類の遺伝子組換え糖蛋白質の生産研究によって 検証されている (非特許文献 23、 24)。
[0009] これまでに開発されたシアル酸付加率の低下を防止するための培養工学的な手法 としては、各種培養パラメーターの最適化 (非特許文献 25、特許文献 1)や、シァリダ ーゼ阻害活性を有する物質を培地成分に添加する手法 (非特許文献 24、特許文献 2)などが挙げられる。培養パラメーターの最適化は、シァリダーゼの細胞質力 の漏 出が細胞の生存率低下に伴っておこるため、培養工程において生産細胞の生存率 をできるだけ高いレベルで長期間維持することを目的に行われる。しかしながら、この 方法では、糖蛋白質へのシアル酸付加率の向上が若干観察されるものの十分な量 ではない上、糖蛋白質のシアル酸付加率が高める培養パラメーターと糖蛋白質の生 産性を高める培養パラメーターとがー致しないため、糖蛋白質へのシアル酸付加率 を優先させた場合には生産性を犠牲にしなくてはならないという問題が生じる。また、 シァリダーゼ阻害剤を培地成分として添加する手法にっ 、ては、 N-ァセチル -2,3-デ ヒドロ- 2-デォキシノイラミン酸 (Neu5Ac2en)などの特異的阻害剤を添加する方法や、 比較的高濃度の銅イオンを添加する方法などが開発されているが、いずれの方法も 糖蛋白質の製造に用いるには培地の調製や廃液処理に関する経済的負担が大きい ことが問題とされている。さらに、 Neu5Ac2enのような天然には存在しない化合物を医 薬品製造に用いる場合には、このような物質自身やこの物質が培養中に変化して生 じる誘導体の、生体に対する安全性も考慮しなくてはならない。
[0010] 糖蛋白質を生産する細胞力 漏出するシァリダーゼを制御する細胞工学的な手法 としては、アンチセンスによって NEU2シァリダーゼ mRNAのスプライシングゃ mRNA の翻訳を阻害する方法、相同組換えによってゲノム上 NEU2遺伝子座を破壊すること が知られている（特許文献 3)。アンチセンスによって NEU2シァリダーゼ mRNAのスプ ライシングゃ翻訳を阻害する方法にっ 、ては、クローユングされた CHO細胞の NEU2 シァリダーゼ cDNA配列 (非特許文献 13)をもとに、 NEU2シァリダーゼ mRNAと特異 的にハイブリダィズするアンチセンス RNAを設計し、このアンチセンス RNAを安定発 現させるための DNAコンストラクトを糖蛋白質生産細胞に導入し、 NEU2シァリダーゼ の発現を抑制することができる方法が開発されている (非特許文献 26)。具体的には 、 NEU2シァリダーゼアンチセンス RNA発現ベクターを、糸且換え DNaseを生産する CH 0細胞に安定的に導入することにより、細胞質シァリダーゼ活性を 40%まで抑制し、 生産物 DNaseのシアル酸付加率を最大で 37%上昇させた力 細胞質シァリダーゼ活 性の抑制率が不充分である。
[0011] このように、実際にはゲノム上に存在する NEU2遺伝子座を破壊した細胞株の榭立 に関する報告は未だ知られて ヽな 、。
非特許文献 l :Trends Biochem. Sci" 10, 357-360 (1985); Glycobiology, 3, 201-217 (1993)
非特許文献 2 : J. Biochem., 107, 794-798 (1990)
非特許文献 3 : Glycoconjugate Journal vol.17,301- 306 (2000)
非特許文献 4 Journal of Biological Chemistry vol.260,6710- 6716 (1985) 非特許文献 5 : European Journal of Biochemistry vol.141, 75- 81 (1984) 非特許文献 6 Journal of Biochemistry vol.107,787- 793 (1990)
非特許文献 7 Journal of Biological Chemistry vol.268,26435- 26440 (1993) 非特許文献 8 : Genes and Development vol.10,3156- 3169 (1996)
非特許文献 9 Journal of Biological Chemistry vol.274,5004-5011 (1999) 非特許文献 10 : Pro^Natl.Acad.Sci.USA vol.90,9852- 9856 (1993)
非特許文献 11 Journal of Biological Chemistry vol.280, 469-475 (2005) 非特許文献 12 : Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.221, 826-830 (1996) 非特許文献 13 : Glycobiology vol.4, 367-373 (1994)
非特許文献 14 : Genomics vol.57, 137-143 (1999)
非特許文献 15 : Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.258, 727-731 (1999) 非特許文献 16 : Biochem.Biophys.Res.Commun.vol.286, 250-258 (2001) 非特許文献 17 Journal of Biological Chemistry 264, 35 (1989)
非特許文献 18 : European Journal of Biochemistry 194, 457 (1990)
非特許文献 19 Journal of Biological Chemistry 265, 12127 (1990)
非特許文献 20 : Blood 73, 84 (1989)
非特許文献 21 : Glycobiology vol.3, 455-463 (1993)
非特許文献 22 : BIO/TECHNOLOGY vol.13, 692 (1995)
非特許文献 23 : Biotechnology Progress vol.12, 559-563 (1996)
非特許文献 24 : Biotechnology Progress vol.20, 864-871 (2004)
非特許文献 25 : Cytotechnology vol.15, 217-221 (1994)
非特許文献 26 : Biotechnology and Bioengineering vol.60, 589-595 (1998) 特許文献 1：米国特許第 5705364号
特許文献 2：米国特許第 6528286号
特許文献 3：特表平 8-510133号
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明の目的は、シァリダーゼの発現を抑制する siRNA、糖蛋白質組成物に結合 する糖鎖に含まれるシアル酸付加量が該 siRNAを導入させた細胞、および該細胞を 用いた糖蛋白質組成物の製造方法およびその利用を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明は以下の（1)〜（20)に関する。
(1) シァリダーゼの発現を抑制する低分子干渉 RNA(small interfering RNA)が導入 された細胞。
(2) 低分子干渉 RNA(small interfering RNA)が以下の (a)〜（d)からなる群から選ば れる RNAおよびその相補 RNAからなる低分子干渉 RNA(small interfering RNA)である 、上記（1)記載の細胞。
(a)配列番号 1で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA。
(3) 低分子干渉 RNA(small interfering RNA)が以下の (a)〜(h)からなる群から選ば れる RNAおよびその相補 RNAからなる低分子干渉 RNA(small interfering RNA)である 、上記（1)記載の細胞。
(a)配列番号 22で表される塩基配列力もなる RNA；
(b)配列番号 22で表される塩基配列において、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(c)配列番号 34で表される塩基配列力もなる RNA；
(d)配列番号 34で表される塩基配列にお 、て、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA; (e)配列番号 45で表される塩基配列からなる RNA;
(f)配列番号 45で表される塩基配列において、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(g)配列番号 51で表される塩基配列力もなる RNA；
(h)配列番号 51で表される塩基配列において、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA。
(4) シァリダーゼが、以下の (a)〜(h)力もなる群力も選ばれる DNAがコードする蛋白 質である、上記（3)に記載の細胞。
(a)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNA;
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(f)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(5) シァリダーゼが、以下の （a)〜(1)力もなる群力も選ばれる蛋白質である、上記（ 3)に記載の細胞。
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 8で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質； (e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(f)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(h)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(i)配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質。
(6) 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細 胞である、上記（1)〜（5)の 、ずれか 1項に記載の細胞。
(7) 細胞が、下記の（a)〜 (k)力もなる群力も選ばれる細胞である、上記（1)〜（6) の!、ずれか 1項に記載の方法。
(a)チャイニーズノヽムスター卵巣組織由来 CHO細胞；
(b)ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；
(c)マウスミエローマ細胞株 NS0細胞；
(d)マウスミエローマ細胞株 SP2/0- Agl4細胞； (e)シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(f)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(g)ヒト PER.C6細胞；
(h)ヒト NM- F9細胞；
(0胚性幹細胞；
(j)受精卵細胞；
(k)ヒト HEK293細胞。
(8) 細胞が、糖蛋白質分子をコードする遺伝子が導入された細胞である、上記（1) 〜（7)の!、ずれ力 1項に記載の細胞。
(9) 上記 (8)記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積 させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質組成 物の製造方法。
(10) 糖蛋白質組成物が、親株細胞が生産する糖蛋白質組成物より、糖蛋白質 1 分子あたりのシアル酸付加量が増加した糖蛋白質組成物であることを特徴とする、上 記（9)に記載の方法。
(11) 糖蛋白質組成物が、親株細胞が生産する糖蛋白質組成物より血中半減期が 延長された糖蛋白質組成物である、上記（9)または（10)に記載の方法。
(12) 上記（9)〜（11)のいずれかに記載の製造方法により得られた糖蛋白質組成 物。
(13) 以下の (a)〜（d)力もなる群力も選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成され る 2本鎖 RNA。
(a)配列番号 1で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA。
(14) 以下の (a)〜(h)力もなる群力も選ばれる RNA及びその相補 RNAで構成される 2 本鎖 RNA。
(a)配列番号 22で表される塩基配列力もなる RNA；
(b)配列番号 22で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(c)配列番号 34で表される塩基配列力もなる RNA；
(d)配列番号 34で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(e)配列番号 45で表される塩基配列からなる RNA;
(f)配列番号 45で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Ζまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(g)配列番号 51で表される塩基配列力もなる RNA；
(h)配列番号 51で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA。
(15) 上記（13)または（14)に記載の RNAに対応する DNA及びその相補 DNA。
(16) 上記（13)または（14)に記載の RNAに対応する DNA及びその相補 DNAをべ クタ一に組み込んで得られる組換え体 DNA。
(17) 上記（16)に記載の組換え体 DNAを細胞に導入して得られる形質転換体。
(18) 上記（17)記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物 を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖 蛋白質組成物の製造方法。
( 19)上記（ 18)記載の方法で得られる糖蛋白質組成物。
(20)上記（13)または（14)に記載された低分子干渉 RNA(small interfering RNA)を 用いることを特徴とする、シァリダーゼ活性を抑制する方法。
発明の効果
[0014] 本発明によると、シァリダーゼ活性を抑制する siRNAを導入させた細胞、該細胞を 用いる糖蛋白質分子の製造方法、および該製造方法により得られる糖蛋白質組成 物に関する。本発明は、また、 siRNAを用いた、シァリダーゼ活性を抑制する方法を 提供する。本発明の製造方法により、従来の糖蛋白質組成物よりもシアル酸付加量 が増加された糖蛋白質組成物を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]は、プラスミド FT81ib3/pBSの製造について表した図である。
[図 2]は、プラスミド FT81ib3/pAGEの製造について表した図である。
[図 3]は、プラスミド pSiA〜pSi38の製造について表した図である。
[図 4]は、プラスミド pT7 Blue Sialidaseの製造について表した図である。
[図 5]は、プラスミド pAGELuciaの製造について表した図である。
[図 6]は、プラスミド pKANTEXLuciaの製造につ!、て表した図である。
[図 7]は、 CHO/DG44細胞にキメラレポーター遺伝子とシァリダーゼ siRNA発現べクタ 一を共導入した際のレポーター活性を表した図である。
[図 8]は、 CHO/DG44細胞にシァリダーゼ siRNA発現ベクターを導入した際の細胞溶 解液のシァリダーゼ活性を表した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明のシァリダーゼ活性を抑制する siRNAを導入させた細胞（以下、「本発明の 細胞」と表記する）とは、細胞内のシァリダーゼの酵素活性を抑制させるように siRNA を導入させた細胞であれば、 、かなる細胞も包含される。
シァリダーゼとは、糖蛋白質に付加された糖鎖の非還元末端カもシアル酸を除去 する反応を触媒する酵素である。シァリダーゼ活性とは、糖蛋白質に付加された糖鎖 の非還元末端力 シアル酸を除去する反応を触媒する活性をいう。
[0017] 本発明にお!/、て、シァリダーゼ活性を抑制する siRNAとしては、 RNAおよびその相 補 RNA力 構成され、かつ細胞内のシァリダーゼの mRNA量を減少させることができ る 2本鎖 RNAであれば!/、かなるものでもよ!/、。 RNAの長さとしては、好ましくは 1〜50、より好ましくは 10〜40、さらに好ましくは 10〜 30、最も好ましくは 15〜30である。具体的な RNAとしては、
(a)配列番号 1で表される塩基配列中の連続した 10〜40塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中の連続した 10〜40塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中の連続した 10〜40塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中の連続した 10〜40塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(e)配列番号 22で表される塩基配列からなる RNA;
(D配列番号 22で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該細 胞のシァリダーゼの発現量が抑制される RNA;
(g)配列番号 34で表される塩基配列からなる RNA；
(h)配列番号 34で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現量が抑制される RNA;
(0配列番号 45で表される塩基配列力 なる RNA；
(j)配列番号 45で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該細 胞のシァリダーゼの発現量が抑制される RNA;
(k)配列番号 51で表される塩基配列からなる RNA；
(1)配列番号 51で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該細 胞のシァリダーゼの発現量が抑制される RNA。
があげられる。
1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列とは、 配列番号 22、 34、 45または 51の塩基配列の 5'末端および Zまたは 3'末端の 1また は数個の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列をいう。塩基 配列の長さとしては、好ましくは 1〜50、より好ましくは 10〜40、さらに好ましくは 10 〜30、最も好ましくは 15〜30の連続した RNAがあげられる。
[0019] siRNAを導入させる方法としては、 siRNAを細胞に導入させることができればいかな る方法でもよいが遺伝子工学的手法が好ましい。例えば siRNA、前駆体 RNA、あるい はこれらの铸型となる DNA分子を一過性に細胞内に導入する、または、 siRNA,前駆 体 RNAの铸型 DNA分子を宿主のゲノム DNAに安定に組み込む方法などがあげられ る。
siRNA,前駆体 RNA、あるいはこれらの铸型となる DNA分子を一過性に細胞内に導 入する方法としては、 siRNA、前駆体 RNA、あるいはこれらの铸型となる DNA分子を 細胞内で発現させるために、調製した DNAの断片、または全長を適当な発現べクタ 一のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製し、該組換え ベクターを、該組換えベクターに適した宿主細胞に導入する方法、発現ベクターを用 いずに、シァリダーゼの塩基配列に基づいて設計した 2本鎖 RNAを、直接細胞に導 入する方法などがあげられる。
[0020] siRNA,前駆体 RNA、あるいはこれらの铸型となる DNA分子を宿主のゲノム DNAに 安定に組み込む方法としては、設計した siRNA、前駆体 RNA、あるいはこれらの铸型 となる DNA分子を転写できる位置にプロモーターを含有した発現ベクターを作製し、 該発現ベクターを、該発現べクタ一に適した宿主細胞に導入して、宿主の染色体へ の組み込む方法などがあげられる。
[0021] シァリダーゼとしては、下記 (a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（1)、（g)あるいは (h)の DNAがコード する蛋白質、または下記 (0、（j)、（k)、（1)、（m)、（n)、（o)、（p)、（q)、（r)、（s)あるいは (t)の蛋 白質などがあげられる。
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA;
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA； (e)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(D配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(g)配列番号 3で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(h)配列番号 4で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
または、
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(1)配列番号 8で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(m)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(n)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(0)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(P)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(q)配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(r)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列力もな り、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(s)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からな り、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(t)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 な り、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質。
[0022] 本発明にお!/、て、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、例えば、 配列番号 1、 2、 3または 4で表される塩基配列を有する DNAなどの DNAまたはその一 部の断片をプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロッ トハイブリダィゼーシヨン法などを用いることにより得られる DNAを意味し、具体的には 、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0.7〜1Mの 塩化ナトリウム存在化、 65°Cでノヽイブリダィゼーシヨンを行った後、 0.1〜2倍濃度の SS C溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウ ムよりなる）を用い、 65°C条件化でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあ げることができる。ハイブリダィゼーシヨンはモレキユラ一'クロー-ング（Molecular Clo ningノ ,A Laboratory manual, second edition, Cold Spring Haroor Laboratory Press, 1989 (以下モレキュラー 'クローユング第 2版と略す）、カレント 'プロトコールズ'イン' モレキユラ1 ~~ 'ノィォロン1 ~~ (Current Protocols in Molecular Biology) , John Wiley & Sons, 1987-1997 (以下、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと 略す）、ディーェヌエー'クロー-ング（DNA Cloning 1)： Core Techniques, A Practica 1 Approach, Second Edition, Oxford University (1995)などに記載されている方法に 準じて行うことができる。ハイブリダィズ可能な DNAとしては具体的に、配列番号 1、 2 、 3または 4で表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する DNA、好まし くは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 9 5%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAをあげることができる。
[0023] 本発明において、配列番号 5、 6、 7または 8で表されるアミノ酸配列において 1以上 のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ シァリダーゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント'プ 口トコーノレズ 'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、ヌクレイック 'アシッド 'リサーチ（Nuclei c Acids Research) , 10, 6487 (1982)、プロシーディングス'ナショナル'アカデミック' サイエンス.ユーエスエー (proc. Natl. Acad. Sci.) USA, 79, 6409 (1982)、ジーン（Ge ne) , 34, 315 (1985)、などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番 号 5、 6、 7または 8で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAに部位 特異的変異を導入することにより取得できる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入お よび/または付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定されないが、 上記部位特的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換、もしくは付加できる 程度の数であり、例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さ らに好ましくは 1〜5個である。
[0024] また本発明にお 、て、配列番号 5、 6、 7または 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上 の相同性を有し、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質とは、配列番号 5、 6、 7また は 8に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくともと 80%以上、、好ましくは 85% 以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97%以上 、最も好ましくは 99%以上の相同性を有し、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質で ある。
[0025] 本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の 相同性検索プログラムを用いて算出される数値であって、塩基配列については BLAS T [ジャーナル'ォブ 'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 215,403 (1990)]にお いてデフォルトパラメーターを用いて算出される数値などがあげられる。アミノ酸配列 については、 BLAST2 [ヌクレイック 'アシッド'リサーチ (Nucleic Acid Res.), 25, 3389 (1 997)] ;ゲノム'リサーチ (Genome Res.), 7, 649 (1997) ; http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/E ducation/BLASTinfo/infomation3. html]においてデフォルトパラメータを用いて算出さ れる数値などがあげられる。デフォルトパラメータ一としては、 G(Cost to open gap)が 塩基配列の場合は 5、アミノ酸配列の場合は 11、 -E(Cost to extend gap)が塩基配列 の場合は 2、アミノ酸配列の場合は 1、 -q(penalty for nucleotide mismatch)カ 3、— r(r eward for nucleotide match)力 1、一 e(expect value)力 10、一 W (wordsize)力塩基酉己歹 lj の場合は 11残基、アミノ酸残基の場合は 3残基、 - y(Dropoff (X) for blast extemsions i n bits)が blastnの場合は 20、 blastn以外のプログラムでは 25である（http：〃 www.ncbi. nlm.nih.gov /blastcgihelp.html) 0また、アミノ酸配列の解析ソフトとしては FASTA [^ソ ッズ'イン'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymology) , 183, 63 (1990)]などもあげら れる。
[0026] 本発明の細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられるが 、動物細胞が好ましい。
酵母としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイべ口ミセス属、トリコス ポロン属、シュヮ-ォミセス属等に属する微生物、例えば、 Saccharomyces cerevisiae 、 Schizosaccharomyces pombe、 Kluyveromyces lactis、 fnchosporon pullulans、 ¾chw anniomyces alluvius等 あげること力 Sできる。
[0027] 動物細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 29 9)、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンノヽムスター腎臓由来細胞、 胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である S19、 Sf21 [カレント 'プロ トコ ~~ノレズ ·イン'モレ = ュフ ~~ 'ノィォロン ~~ Baculovirus Expression Vectors, A Laoo ratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)]、 Trichoplusianiの 卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製)等をあげることができる。
植物細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギ、ヒメッリガネゴケ、ゥキクサ等をあげることができる。 動物細胞の具体的な例としては、チャイニーズノ、ムスター卵巣組織由来細胞 (CH O細胞）、ラットミエローマ細胞株 YB2Z0細胞、マウスミエローマ細胞株 NS0細胞、 マウスミエローマ細胞株 SP2Z0— Agl4細胞、シリアンノヽムスター腎臓組織由来 B HK細胞（ATCC CCL— 10)、 MDCK (ATCC CCL— 34)、 PER— C6™、ヒト N M-F9細胞、ヒト HEK293細胞、ハイプリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、 胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。 CHO細胞としては、 CHO— K1株 (AT CC CCL— 61)、 CHO/dhfr—株（ATCCCRL— 9096)、 Pro5株（ATCC CR L— 1781)や市販の CHO— S株（Invitrigen社製 Cat # 11619)、あるいはこれら の株を無血清培地などに馴化させた亜株などが上げられる。ラットミエローマ細胞とし ては、例えば Y3 Agl.2.3. (ATCC CRL - 1631) , YO (ECACC No : 85110501) 、 YB2/0 (ATCC CRL 1662)等、マウス細胞としては、例えば NSO (ATCC CR L- 1827) , Sp2/0 (ATCC CRL— 1581)等、ミエローマ細胞またはミエローマ 細胞系の雑種細胞、あるいはこれらの株を無血清培地などに馴化させた亜株 (ATC C CRL— 1581.1)などが上げられる。ヒト細胞としては PER. C6 (ECACC 9602 2940)、あるいはこれらの株を無血清培地などに馴化させた亜株などが上げられる。 また、これらの細胞に変異処理を施したり、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取 得された B細胞と細胞融合することによって得られる、これらの細胞と同等の性質を 有する細胞も、本発明における動物細胞に含まれる。
[0028] また、本発明における細胞としては、 N—グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N ーァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を認識するレ クチンに耐性を有する細胞、例えば、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する糖蛋白 質分子カゝらなる組成物であって、該組成物中に含まれる全 N-グリコシド結合複合型 糖鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が 20%以上である糖蛋白質組成物を生産する能力を有する細胞があげら れる。当該細胞としては、以下に挙げる少なくとも 1つの蛋白質の活性が低下または 失活した細胞などがあげられる。
(a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が (X結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
[0029] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコース の 1位が (X結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質の活性が低下または失活した 細胞としては、細胞内の a 1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノック アウトされた細胞などがあげられる。（WO02/31140、 WO03/85107, WO03/85102)。 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質としては、細胞 内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与す る酵素であればいかなる酵素も包含される。細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの 合成に係わる酵素としては、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に影響を与 える酵素などがあげられる。
[0030] 細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースは、 de novoの合成経路あるいは Salvage合 成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素はすべて 細胞内 GDP-フコースの合成に係わる酵素に包含される。
細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースの de novoの合成経路に関与する酵素として は、 GDP- mannose 4,6- dehydratase (GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ；以下、 GM Dと表 する)、（JDP— keto—り— deoxymannose 3,5— epimerase, 4,6— reductase (LJDP—ケ ト-デォキシマンノース 3,5-ェピメラーゼ， 4,6-リダクターゼ；以下、 Fxと表記する）など があげられる。
[0031] 細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースの Salvage合成経路に関与する酵素としては 、 GDP- beta- L- focose pyrophosphorylase (GDP-ベータ- L-フコース-ピロホスフォリラ ーゼ；以下、 GFPPと表記する）、 Fucokinase (フコキナーゼ）などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の 細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を 与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
[0032] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコース の 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質としては、 N-グリコシド結合複 合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合する 反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。 N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に 関与する酵素としては、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコ サミンの 6位とフコースの 1位が a結合する反応に影響を与える酵素であればいかな る酵素も包含される。具体的には、 α— 1 , 6—フコシルトランスフェラーゼゃ a—L— フコシダーゼなどがあげられる。
[0033] また、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフ コースの 1位が a結合する反応に影響を与える酵素としては、上述の N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合 する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造 に影響を与える酵素も包含される。
[0034] 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質として は、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質、ま たは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与え る蛋白質であればいかなる蛋白質も包含される。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質として は、具体的には、 GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。
また、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を 与える蛋白質としては、上述の細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への 輸送に関与する蛋白質の活性に影響を与えたり、発現に影響を与える蛋白質も包含 される。
[0035] 上述の酵素活性が低下または欠失した細胞を取得する方法としては、 目的とする 酵素活性を低下または欠失させることができる手法であれば、 V、ずれの手法でも用 いることができる。具体的には、
(a)酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
(b)酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
(c)酵素につ 、ての突然変異を導入する手法；
(d)酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
(e) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位 が OC結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあ げられる。
[0036] N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチン であれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レン ズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin)、エンドゥマメレクチン PS A (Pisum sativum由来の Pea Lectin)、ソラマメレクチン VFA (Vicia faba由来の Agglutin in)、ヒイロチヤワンタケレクチン AAL (Aleuria aurantia由来の Lectin)等を挙げることが できる。
[0037] レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されな い細胞を言う。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、親株と も称す)が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子が改変され る以前の細胞が成育できない濃度と同濃度、より好ましくは 2〜5倍、さらに好ましくは 10倍、最も好ましくは 20倍以上である。
[0038] 生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよぐ通 常のレクチンの有効濃度は 10 /z g/mL〜10mg/mL、好ましくは 0.5mg/mL〜2.0mg/mL である。
本発明の細胞を用いて糖蛋白質組成物を製造する方法としては、具体的には、糖 蛋白質をコードする遺伝子を導入した宿主細胞を用いて生産する方法、糖蛋白質を コードする遺伝子を導入したヒト以外の動物の胚性幹細胞または受精卵細胞をヒト以 外の動物の初期胚へ移植後、発生させたトランスジエニック非ヒト動物を用いて生産 する方法、あるいは、糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した植物カルス細胞より作 製したトランスジエニック植物用いて生産する方法などを包含する。
[0039] また、本発明は、糖蛋白質組成物が、親株細胞が生産する糖蛋白質組成物より、 1 分子あたりのシアル酸付加量が増加した糖蛋白質組成物を生産する方法に関する。 本発明の、シァリダーゼ活性を抑制する siRNAを導入した細胞カゝら生産された糖蛋 白質組成物の糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量は、 siRNAを導入する前の細 胞から生産された糖蛋白質組成物の糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量に比 ベて増加する。
[0040] 糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量が増加した糖蛋白質組成物とは、糖蛋白 質 1分子あたりのシアル酸が付加される分子数の 80〜90%以上、好ましくは 95%以上 、より好ましくは 100%にシアル酸が結合された糖蛋白質組成物をいう。
シァリダーゼ活性を測定する方法としては、特に限定はないが、 4-メチルゥンベリフ ェリル- N-ァセチル-アルファ- D-ノィラミン酸アンモ-ゥム（4MU- Neu5AC)などの蛍 光基質を用いる方法（Molecular Biotechnology vol.15, 69 (2000))、発光基質を用い る方法 (Proceedings of the society for experimental biology and medicine vol.169, 50 1-505 (1982))およびレクチンを用いる方法（Biol Pharm. Bull, vol.17, 29-33 (1994)) などがあげられる。
[0041] 親株細胞とは、シァリダーゼ活性を抑制する siRNAを導入する前の細胞をいう。
本発明において、糖蛋白質組成物とは、非還元末端にシアル酸付加部位が存在 する糖鎖を有する糖蛋白質分子を含有する組成物をいう。
糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、ァスパラギンと結合する糖 鎖 (N-グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（0-グリコシド結 合糖鎖)の 2種類に大別される。これらを総称してグリコシド結合糖鎖という。
[0042] N-グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有して 、るが [生物化学実験法 23—糖蛋 白質糖鎖研究法 (学会出版センター)高橋禮子編 (1989年) ]、 Vヽずれの場合も以下 の構造式 (I)に示す共通のコア構造を有する。
[0043] [化 1]
Man 1→6
Man β l→4GlcNAc β l→4GlcNAc (I)
Man a 1→3
[0044] 構造式 (I)にお ヽて、ァスパラギンと結合する糖鎖の末端が還元末端、反対側が 非還元末端という。
N-グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合 するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトースー N-ァセチルダルコ サミン（以下、 Ga卜 GlcNAcと表記する）の枝を並行して 1ないしは複数本有し、更に Ga ト GlcNAcの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングの N-ァセチルダルコサミンな どの構造を有するコンプレックス型 (以下、複合型とも称す)、コア構造の非還元末端 側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげ られる。
[0045] 0-グリコシド結合糖鎖としては、 N-ァセチルガラタトサミンの還元末端がセリンまた はスレオニンの水酸基とひ結合し、更にガラクトース、 N-ァセチルダルコサミン、 N-ァ セチルガラタトサミン、シアル酸、あるいはシアル酸が結合した糖鎖、キシロースがセ リンの水酸基と j8結合した糖鎖、ガラクトースがハイドロキシリジンの水酸基と j8結合 した糖鎖などがあげられる。
[0046] キシロースがセリンの水酸基と /3結合した糖鎖は、通常、当該キシロースの 4位に複 数の糖が結合し、結合した糖の先に 2糖からなる直鎖状の多糖が結合している。この ような糖鎖構造を有する物質としては軟骨プロテオダリカン等があげられる。ガラタト ースがハイドロキシリジンの水酸基と β結合した糖鎖構造を有する物質としては、コラ 一ゲン等があげられる。
[0047] 糖鎖を構成する糖としては、 Ν—ァセチルダルコサミン、 Ν—ァセチルガラタトサミ ン、マンノース、ガラクトース、フコース、シアル酸、キシロース、ァラビノースが含まれ 、これらの糖は 、かなる順序で結合しても良 、。
糖蛋白質組成物とは、 Ν—グリコシド結合糖鎖または 0-グリコシド結合糖鎖を有す る糖蛋白質分子力もなる組成物をいう。糖蛋白質に結合する糖鎖は多数存在し、そ の糖鎖構造は多様性があるために、糖蛋白質の糖鎖には多数の糖鎖の組合せが存 在することになる。したがって、本発明における糖蛋白質組成物としては、単一の糖 鎖構造が結合された糖蛋白質分子から構成される組成物、複数の異なる糖鎖構造 が結合された糖蛋白質分子カゝら構成される組成物などがあげられ、糖鎖の本数は 1 本であってもそれ以上であってもよ！/、。
[0048] 本発明の、シァリダーゼ活性を抑制する siRNAを導入した細胞から生産された糖 蛋白質組成物の糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量は、 siRNAを導入する前の 細胞から生産された糖蛋白質組成物の糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量に 比べて増加する。このように糖蛋白質 1分子あたりのシアル酸付加量が増加した糖蛋 白質組成物は、親株細胞が生産する糖蛋白質組成物に比べて生体内に投与した場 合において生理活性の向上を示す。
[0049] 生理活性としては、糖蛋白質と受容体との親和性、体内における糖蛋白質の血中 半減期間、血中投与後の組織分布の変化、薬理活性発現に必要な蛋白質との相互 作用などがあげられる。
さらに、本発明の製造方法で得られる糖蛋白質組成物のうち、 N-グリコシド結合複 合型糖鎖を有する糖蛋白質分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれる全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコ ースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である糖蛋白質組成物は、さらに優れ た生理活性を有する。例えば、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体 分子カゝらなる抗体組成物であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末 端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合して ヽな 、糖鎖を有する抗体組成物 はさらに高 、ADCC活性を有する。
[0050] 本発明にお 、て、フコースが結合して 、な 、糖鎖としては、上記で示された化学式 中、還元末端側の N-ァセチルダルコサミンにはフコースが結合されておらず、また非 還元末端の糖鎖の構造は!、かなるものであってもよ 、。
本発明にお 、て、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合して いないとは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合 していない糖蛋白質組成物とは、具体的には、後述の 3に記載の糖鎖分析において 、フコースが実質的に検出できない程度の糖蛋白質組成物である場合をいう。実質 的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることを意味する。
[0051] 本発明の細胞により生産される糖蛋白質としては、後述する糖蛋白質、それらの糖 蛋白質断片、二つ以上の糖蛋白質または糖蛋白質断片とを融合させた融合蛋白質 などがあげられる。
糖蛋白質としては、抗体、エリスロポイエチン（EPO) [J. Biol. Chem., 252, 5558 (19 77)]、トロンボポイエチン (TPO) [Nature, 369, 533 (1994)]組織型プラスミノーゲンァ クチベータ、プロゥロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビン III、 a 1アンチトリ プシン、 C1インヒビター、ハプトグロビン、活性化プロテイン C、血液凝固因子 VII、血 液凝固因子 VIII、血液凝固因子 IX、血液凝固因子 X、血液凝固因子 XI、血液凝固因 子 XII、血液凝固因子 XIII、プロトロンビン複合体、フイブリノゲン、アルブミン、性腺刺 激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子 (EGF)、肝細胞増殖因子 (HGF)、 ケラチノサイト増殖因子、ァクチビン、骨形成因子、顆粒球コロニー刺激因子 (G— C SF) [J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983)]、マクロファージコロニー刺激因子（M— CS F) [J. Exp. Med., 173, 269 (1992)]、幹細胞因子（SCF)、顆粒球-マクロファージコロ ニー刺激因子（GM— CSF) [J. Biol. Chem., 252, 1998 (1977)]、インターフェロン α 、インターフェロン j8、インターフェロン γ、インターロイキン一 2 (IL— 2) [Science, 19 3, 1007 (1976)]、インターロイキン 6、インターロイキン 10、インターロイキン 1 1、インタ 一ロイキン一 12 (IL— 12) [J. Leuc. Biol , 55, 280 (1994)]、可溶性インターロイキン 4受容体、腫瘍壊死因子 at、 DnaseUガラクトシダーゼ、 ocダルコシダーゼ、ダルコセ レブロシダーゼ、ヘモグロビン、トランスフェリンなどがあげられる。
[0052] 抗体としては、 V、かなる抗原結合性を有する抗体でもよ!/、が、腫瘍関連抗原に結合 する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原に結合する抗体、循環器疾患に 関連する抗原に結合する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原に結合する抗体、ま たはウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原に結合する抗体であることが好ましく 、抗体のクラスは IgGが好ましい。
[0053] 腫瘍関連抗原に結合する抗体としては、抗 GD2抗体 (Anticancer Res. , 13, 331-33 6, 1993)、抗 GD3抗体（Cancer Immunol. Immunother. , 36, 260-266, 1993)、抗 GM 2抗体（Cancer Res. , 54, 1511-1516, 1994)、抗 HER2抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992)、抗 CD52抗体（Nature, 332, 323-327, 1988)、抗 MAGE 抗体（British J. Cancer, 83, 493-497, 2000)、抗 HM1. 24抗体（Molecular Immunol , 36, 387-395, 1999)、抗副甲状腺ホルモン関連タンパク（PTHrP)抗体（Cancer, 88, 2909-2911 , 2000)、抗 FGF8抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989 )抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗 FGF8受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 265, 16 455-16463, 1990)、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖 因子抗体 (J. Neurosci. Res. , 40, 647-659, 1995)、抗インスリン様増殖因子受容体抗 体（J. Neurosci. Res. , 40, 647-659, 1995)、抗 PMSA抗体（J. Urology, 160, 2396-24 01 , 1998)、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Cancer Res. , 57, 4593-4599, 1997)、抗 血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Oncogene, 19, 2138-2146, 2000)、抗 CA125 抗体、抗 17-1A抗体、抗インテグリン α ν 3抗体、抗 CD33抗体、抗 CD22抗体、抗 HL A抗体、抗 HLA-DR抗体、抗 CD20抗体、抗 CD 19抗体、抗 EGF受容体抗体（Immuno logy Todayゝ 21(8)、 403- 410 (2000) )、抗 CD 10抗体（American Journal of Clinical Pat hology, 113, 374-382, 2000)などがあげられる。
[0054] アレルギーあるいは炎症に関連する抗原に結合する抗体としては、抗インターロイ キン 6抗体（Immunol. Rev. , 127, 5-24, 1992)、抗インターロイキン 6受容体抗体（Mole cular Immunol, 31, 371-381, 1994)、抗インターロイキン 5抗体（Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992)、抗インターロイキン 5受容体抗体、抗インターロイキン 4抗体（Cytokine, 3, 562-567, 1991)、抗インターロイキン 4受容体抗体（J. Immunol. Meth., 217, 41-50 , 1998)、抗腫瘍壊死因子抗体（Hybridoma, 13, 183-190, 1994)、抗腫瘍壊死因子 受容体抗体（Molecular Pharmacol, 58, 237-245, 2000)、抗 CCR4抗体（Nature, 400 , 776-780, 1999)、抗ケモカイン抗体（J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994)、抗 ケモカイン受容体抗体 (J. Exp. Med., 186, 1373-1381, 1997)、抗 IgE抗体、抗 CD23 抗体、抗 CD 11 a抗体（Immunology Today, 21(8)、 403- 410 (2000) )、抗 CRTH2抗体 (J
Immunol., 162, 1278-1286 (1999))、抗 CCR8抗体 (W099/25734)、抗 CCR3抗体（U S6207155)などがあげられる。
[0055] 循環器疾患に関連する抗原に結合する抗体としては、抗 GpIIb/IIIa抗体 (J. Immuno 1., 152, 2968-2976, 1994)、抗血小板由来増殖因子抗体（Science, 253, 1129-1132,
1991)、抗血小板由来増殖因子受容体抗体 (J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 19 97)または抗血液凝固因子抗体（Circulation, 101, 1158-1164, 2000)などが挙げら れる。
自己免疫疾患に関連する抗原に結合する抗体としては、抗自己 DNA抗体 (Immun ol. Letters, 72, 61-68, 2000)などが挙げられる。
[0056] ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原に結合する抗体としては、抗 gpl20抗体
(Structure, 8, 385-395, 2000)、抗 CD4抗体（J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998 )、抗 CCR4抗体、抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol, 37, 396-399, 1999)、自己免 疫疾患 (乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、 多発性硬化症など）、抗 CDlla抗体、抗 ICAM3抗体、抗 CD80抗体、抗 CD2抗体、抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗インテグリン α 4 j8 7抗体、抗 CD40L抗体、抗 IL-2受容体 抗体（Immunology Today, 21(8)、 403- 410 (2000) )などが挙げられる。
[0057] 抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で 、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいい、抗体の Fc領域を含む分子であ れば 、かなる分子も包含される。
具体的には、抗体のほか、抗体の断片、 Fc領域を含む融合蛋白質などがあげられ る。
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリド 一マ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち 、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得さ れた抗体などがあげられる。具体的には、ハイプリドーマが生産する抗体、ヒト型キメ ラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
[0058] 本発明において、ハイプリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得さ れた B細胞と、ラット、またはマウスに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得ら れる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。 ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域 (以下、重鎖は H鎖として 、可変領域は V領域として HVまたは VHとも ヽぅ）および抗体軽鎖可変領域 (以下、 軽鎖は L鎖として LVまたは VLともいう）とヒト抗体の重鎖定常領域 (以下、定常領域 は C領域として CHとも 、う）およびヒト抗体の軽鎖定常領域 (以下、 CLとも 、う）とから なる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ノ、ムスター、ラビット等、 ハイプリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
[0059] ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより VHおよび VL をコードする cDNAを取得し、ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 CLをコードする遺伝子を有 する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構 築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン (以下、 hlgという）に属すればい かなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hlgG 1、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト 型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよぐ κクラスあるいは λ クラスのちのを用いることがでさる。
[0060] ヒト化抗体は、相同性決定領域 (complementarity determining region：以下、 CDR という）移植抗体ともいう。
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列をヒト 抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体を意味する。 ヒトイ匕抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列を任意のヒト抗体 の VHおよび VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒト抗 体の CHおよびヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクター にそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ 導入することによりヒト化抗体を発現させ、製造することができる。
[0061] ヒトイ匕抗体の CHとしては、 hlgに属すれば!/、かなるものでもよ!/、が、 hlgGクラスのも のが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブ クラスのいずれも用いることができる。また、ヒトイ匕抗体の CLとしては、 hlgに属すれば いかなるものでもよく、 κクラスまたは λクラスのものを用いることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
[0062] 1.本発明の細胞の作製
本発明の、シァリダーゼ活性を抑制する siRNAを導入させた細胞（以下、「本発明の 細胞）と略記する）は、例えば、以下のように作製することができる。
シァリダーゼの cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
[0063] 決定した DNAの配列に基づき、シァリダーゼをコードする部分あるいは非翻訳領域 の部分を含む適当な長さの RNAi(RNA interferance)遺伝子のコンストラクトを設計す る。
該 RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、調製した DNAの断片、または全長を 適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、糸且換えベクターを 作製する。
該組換えベクターを、該発現べクタ一に適した宿主細胞に導入することにより形質 転換体を得る。
[0064] 導入したシァリダーゼの mRNA量、活性、あるいは産生糖蛋白質分子または細胞表 面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞 を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするシァリダ ーゼの遺伝子を有して 、るものであれば 、ずれも用いることができる。具体的には後 述の 2.に記載の宿主細胞があげられる。
[0065] 発現ベクターとしては上記宿主細胞にお!、て、自立複製可能な!/、しは染色体への 組み込みが可能で、設計した RNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有し ているものが用いられる。具体的には RNAポリメラーゼ IIIにより転写が行われるタイプ の発現ベクターあるいは後述の 2.に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターを 用!/、ることができる。
シァリダーゼの cDNAおよびゲノム DNAを取得する方法としては、例えば、以下に記 載の方法があげられる。
[0066] cDNAの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞力ゝら全 RNA又は mRNAを調製する。
調製した全 RNA又は mRNAから cDNAライブラリーを作製する。
シァリダーゼのアミノ酸配列に基づ 、て、デジエネレイティブプライマーを作製し、 作製した cDNAライブラリーを铸型として PCR法でシァリダーゼをコードする遺伝子断 片を取得する。
[0067] 取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 cDNAライブラリーをスクリーニングし、 シァリダーゼをコードする DNAを取得することができる。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞の mRNAは市販のもの (例えば Clontech社製)を 用いてもよ!、し、以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞力も調製しても よい。
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞力も全 RNAを調製する方法としては、チォシアン 酸グァ-ジン-トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一 (Methods i n Enzymology), 154, 3 (1987)]、酸性チォシアン酸グァ-ジン'フエノール'クロ口ホル ム（AGPC)法 [アナリティカル 'バイオケミストリー (Analytical Biochemistry), 162, 156 (1987);実験医学、 9, 1937 (1991)]などがあげられる。
[0068] また、全 RNA力 poly(A)+ RNAとして mRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT)固 定ィ匕セルロースカラム法 (モレキュラー 'クローユング第 2版)等があげられる。
さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製）、 Quick Prep mRNA Purifi cation Kit (Pharmacia社製）などの市販のキットを用いることにより mRNAを調製するこ とがでさる。
[0069] 次に、調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞 mRNAから cDNAライブラリーを作 製する。 cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレン ト.プロトコールズ.イン.モレキュラー.バイオロジー、 A Laboratory Manual, 2 nd Ed.( 1989)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えば Superscript Plasmid Syste m for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies社:^)、 ZAP-cDNA by nthesis Kit (STRATAGENE社製）を用いる方法などがあげられる。
[0070] cDNAライブラリーを作製するためのクローユングベクターとしては、大腸菌 K12株中 で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも 使用できる。具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社、ストラテジーズ (Strategies ), 5, 58 (1992)]、 pBluescript II SK(+) [ヌクレイツク'アシッド'リサーチ (Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)]、 λ ZAP II (STRATAGENE社製）、 gtl0、 gtl l [ディ ーェヌエー.クロー-ング.ァ.プラクティカル.アプローチ (DNA cloning, A Practical A pproach), 1, 49 (1985)]、 λ TriplEx (Clontech社製）、 λ ExCell (Pharmacia社製）、 pT7 T318U (Pharmacia社製）、 pcD2 [モレキュラ^ ~ ·セルラ^ ~ ·バイオロジー (Mol. Cell. Biol .), 3, 280 (1983)]および pUC18 [ジーン (Gene), 33, 103 (1985)]等をあげることができ る。
[0071] cDNAライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれ でも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、 Escherichia coli XL1— Blue MRF' [STRATAGENE社、ストラテジーズ (Strategies), 5, 81 (1992)]、 E scherichia coli C600 [ジ ネテイクス (Genetics), 39, 440 (1954)]、 Escherichia coliYlO 88 [サイエンス (Science), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coliYl 090 [サイエンス (Scienc e), 222, 778 (1983)]、 Escherichia coliNM522 [ジャーナノレ'ォブ'モレキュラ^ ~ ·バイオ ロジー 0. Mol. Biol), 166, 1 (1983)]、 Escherichiacoli K802 [ジャーナル'ォブ 'モレ キユラ ~ ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 16, 118 (1966)]および Escherichiacoli JM105 [ ジーン (Gene), 38, 275 (1985)]等が用いられる。
[0072] この cDNAライブラリ一は、そのまま以降の解析に用いてもょ 、が、不完全長 cDNA の割合を下げ、なるべく完全長 cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発した オリゴキャップ法 [ジーン (Gene), 138, 171 (1994);ジーン (Gene), 200, 149 (1997);蛋 白質核酸酵素， 41, 603 (1996);実験医学， 11, 2491 (1993); cDNAクローユング (羊土 社) (1996);遺伝子ライブラリーの作製法 (羊土社）（1994)]を用いて調製して以下の解 祈に用いてもよい。
[0073] シァリダーゼのアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測さ れる塩基配列の 5'末端および 3'末端の塩基配列に特異的なデジエネレイティブブラ イマ一を作製し、作製した cDNAライブラリーを铸型として PCR法 [ピーシーア一ル'プ ロトコールズ (PCR Protocols), Academic Press (1990)]を用いて DNAの増幅を行うこと により、シァリダーゼをコードする遺伝子断片を取得することができる。
[0074] 取得した遺伝子断片がシァリダーゼをコードする DNAであることは、通常用いられる 塩基配列解析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 [プロシーディンダス •ォブ ·ザ'ナショナル ·アカデミ^ ~ ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 7 4, 5463 (1977)]あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一（Applied Biosystems社 製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
[0075] 該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mR NAから合成した cDNAあるいは cDNAライブラリーからコロニーハイブリダィゼーシヨン やプラークハイブリダィゼーシヨン (モレキュラー ·クロー-ング第 2版)等を用いて、シ ァリダーゼの DNAを取得することができる。
また、シァリダーゼをコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを 用い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれる mRNAから合成した cDNAある ヽ は cDNAライブラリーを铸型として、 PCR法を用いて増幅することにより、シアル酸の付 加に関連する諸酵素の cDNAを取得することもできる。
[0076] 取得したシァリダーゼをコードする DNAの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解 析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 [プロシーディンダス 'ォブ 'ザ' ナショナル *ァ力デミ一 ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1 977)]あるいは ABI PRISM377DNAシークェンサ一（Applied Biosystems社製）等の塩 基配列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決定することがで きる。 [0077] 決定した cDNAの塩基配列をもとに、 BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、 Genbank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、取 得した DNAがデータベース中の遺伝子の中でシァリダーゼをコードしている遺伝子 であることを確認することちできる。
上記の方法で得られるシァリダーゼをコードする遺伝子の塩基配列としては、例え ば、配列番号 1、 2、 3または 4に記載の塩基配列があげられる。
[0078] 決定された DNAの塩基配列に基づ!/、て、フォスフォアミダイト法を利用した DNA合 成機 model 392 (Perkin Elmer社製）等の DNA合成機で化学合成することにより、シァ リダーゼの cDNAを取得することもできる。
シァリダーゼのゲノム DNAを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法が あげられる。
[0079] ゲノム DNAの調製方法
ゲノム DNAを調製する方法としては、モレキュラー ·クローユング第 2版やカレント · プロトコールズ ·イン.モレキュラー.バイオロジー等に記載された公知の方法があげら れる。また、ゲノム DNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems社製）や Universal GenomeWalkerTM Kits (CLONTECH社製）などを用いることにより、シァリ ダーゼのゲノム DNAを取得することもできる。
[0080] シァリダーゼの活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以 下の方法があげられる。
形皙転椽株を選択する方法
シァリダーゼ活性を抑制した細胞を選択する方法としては、文献ほ if生化学実験講 座 3-糖質 I,糖蛋白質 (東京化学同人）日本生化学会編 (1998)]、文献 [細胞工学,別 冊,実験プロトコールシリーズ,グライコバイオロジー実験プロトコール,糖蛋白質'糖脂 質'プロテオダリカン (秀潤社)谷日直之'鈴木明美 ·古川清 .菅原一幸監修 (1996)]、 モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 2版、カレント 'プロトコ一ルズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオ ロジ一などに記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な手法などがあげら れる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を測 定する方法があげられる。遺伝子工学的な手法としては。例えば、シァリダ一ゼの遺 伝子の mRNA量を測定するノーザン解析や RT-PCR法などがあげられる。
[0081] また、シァリダーゼ活性が抑制した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する こともできる。例えば、産生糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する 方法があげられる。具体的には、後述の 3.に記載の方法があげられる。
シァリダーゼの遺伝子の mRNA量を抑制するするための RNA遺伝子は、常法または DNA合成機を用いることにより調製することができる。
[0082] RNA遺伝子のコンストラクトは [ネイチヤー (Nature), 391, 806 (1998);プロシーディ ングス ·ォブ ·ザ'ナショナル ·アカデミ^ ~ ·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA ), 95, 15502 (1998);ネイチヤー (Nature), 395, 854 (1998);プロシーディングス 'ォブ' ザ ·ナショナル 'ァ力デミ一 ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049 ( 1999);セル (Cell), 95, 1017 (1998);プロシーデイングス'ォブ ·ザ'ナショナル ·ァカデ ミ^ ~ ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451 (1999);プロシーディン グス ·ォブ ·ザ'ナショナル 'ァ力デミ一 ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998);ネイチヤ^ ~ ·セル'バイオロジー (Nature Cell Biol), 2, 70 (2000)] 等の記載に従って設計することができる。
[0083] また、発現ベクターを用いず、シァリダーゼの塩基配列に基づ 、て設計した 2本鎖 R NAを、直接細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
2本鎖 RNAは常法または RNA合成機を用いることにより調製することができる。具体 的にはシァリダーゼの cDNAおよびゲノム DNAの相補 RNA塩基配列のうち、連続した 1〜50塩基、好ましくは 10〜40塩基、より好ましくは 10〜30塩基、さらに好ましくは 15 〜30塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴ ヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド (アンチセンスオリゴヌタレ ォチド)を合成することで調製することができる。該オリゴヌクレオチドとアンチセンスォ リゴヌクレオチドは、それぞれ独立に合成してもよいし、 2本鎖 RNA形成に支障のない ようなスぺーサーヌクレオチドでつながれて!/、てもよ！/、。
[0084] オリゴヌクレオチドとしては、オリゴ RNAおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体 (以下、 オリゴヌクレオチド誘導体と ヽぅ）などがあげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が ホスホチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中 のリン酸ジエステル結合が N3， -P5，ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌタレ ォチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のゥラシルカ SC-5プロピニルゥラシルで置換され たオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のゥラシルカ C-5チアゾールゥラシ ルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンが C-5プロ ピ-ルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシ ンがフエノキサジン修飾シトシン (phenoxazine-modified cytosine)で置換されたオリゴ ヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが 2，- 0-プロピルリボースで置換 されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，-メトキ シエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などがあげられる [細胞ェ 学， 16, 1463 (1997)]。
[0085] 2.糖蛋白質組成物の製造方法
糖蛋白質組成物は、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント 'プロトコールズ 'ィ ン'モレキュフ1 ~~ノィォロン1 ~~、 Antibodies, A Laboratory manual, し old Spring Harbor Laboratory, 1988 (以下、アンチボディズと略す）、 Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (以下、モノクロ一ナノレアンチボディズ と略す)、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford Universi ty Press, 1996 (以下、アンチボディエンジニアリングと略す)等に記載された方法を用 い、例えば、以下のように本発明の細胞を宿主細胞として用い、該宿主細胞中で発 現させて取得することがでさる。
[0086] 糖蛋白質をコードする cDNAを調製し、該分子をコードする部分を含む適当な長さ の DNA断片を調製する。
該 DNA断片、または全長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、 糖蛋白質分子を生産する形質転換体を得ることができる。
[0087] 宿主細胞としては、前述の酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、 目的とする遺 伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる力 より好ましくは動物細 胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、 目的とする糖蛋白質分子をコードする DNAを転写できる位置にプ 口モーターを含有して 、るものが用いられる。
[0088] cDNAは、前記 1.に記載の cDNAの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又 は細胞より、 目的とする糖蛋白質に特異的なプローブやプライマー等を用いて調製 することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEP13 (ATC C 37115)、 YEp24 (ATCC 37051)、 YCp50 (ATCC 37419)等をあげることができる
[0089] プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用い てもよく、例えば、へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05 プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gal 1プロ モーター、 gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、 MF a lプロモー ター、 CUP 1プロモーター等をあげることができる。
[0090] 組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [メソッズ'イン'ェンザィモロジ 一 (Methods. Enzymol.),194, 182 (1990)]、スフエロプラスト法 [プロシーディングス 'ォ ブ ·ザ.ナショナル .ァ力デミ一 ·ォブ.サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1 929 (1978)]、酢酸リチウム法 [ジャーナル ·ォブ 'バタテリォロジ一 0. Bacteriology), 15 3, 163 (1983)]、プロシーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデミ一'ォブ 'サイェン ス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929 (1978)]に記載の方法等をあげることがで きる。
[0091] 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 [特開平 3- 22979 ;サイトテクノロジー (Cytotechno logy), 3, 133, (1990)]、 pAS3- 3 [特開平 2- 227075]、 pCDM8 [ネイチヤー (Nature), 32 9, 840, (1987)]、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGElO 3 [ジャーナル'ォブ'バイオケミストリー (J. Biochemistry), 101, 1307 (1987)]、 pAGE21 0等をあげることができる。
[0092] プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロモ 一ター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることができる。また、 ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ!、。
[0093] 組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytote chnology), 3, 133 (1990)]、リン酸カルシウム法 [特開平 2-227075]、リポフエクシヨン 法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンス (Proc. Natl . Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)]、インジェクション法 [マ-ピュレイティング'ザ' マウス .ェンブリオ.ァ ·ラボラトリー ·マニュアル]、パーティクルガン (遺伝子銃）を用い る方法 [特許第 2606856、特許第 2517813]、 DEAE-デキストラン法 [バイオマ-ユア ルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 ·解析法 (羊土社)横田崇 ·新井賢一編 (1994)]、ゥ ィルスべクタ一法 [マ-ピュレーティング ·マウス ·ェンブリオ第 2版]等をあげることがで きる。
[0094] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント 'プロトコールズ'イン'モレ
=Τュフ ヽィォロン ~~ Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H.
Freeman and Company, New York (1992 ィォ /ァクノロン ~~ (Bio/ Technology) ,
6, 47 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
[0095] 該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、例えば、 pVL1392、 pVLl
393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製）等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトラ ファ 'カリフオノレニ力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウイノレス (Autographa californica nucle ar polyhedrosis virus)等を用 ヽること力でさる。 [0096] 組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法 [プロシーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデミ一' ォブ ·サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)]等をあげることがで きる。
[0097] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用い てもよく、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、イネァク チン 1プロモーター等をあげることができる。
[0098] 組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、ァグロバタテリゥム (Agrobacterium) [特開昭 59- 140 885、特開昭 60-70080、 WO94/00977] ,エレクト口ポレーシヨン法 [特開昭 60-251887 ]、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 [日本特許第 2606856、 日本特許第 25 17813]等をあげることができる。
[0099] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー ·クロー-ング第 2版に 記載されている方法等に準じて、分泌生産を行うことができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に目的とする糖蛋 白質組成物を生成、蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取することにより、 糖蛋白質組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿 主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
[0100] 酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該 生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率 的に行える培地であれば天然培地、合成培地の ヽずれを用いてもょ ヽ。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水 化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール 類等を用いることができる。 [0101] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物 等を用いることができる。
[0102] 無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫 酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間である。培養中の pHは 3. 0〜9. 0に保持する。 pHの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、 炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
[0103] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル- β -D-チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた組 換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培 地に添カ卩してもよい。
[0104] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れて 、る RPMI 1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン'メディカル ·ァソシエイ シヨン (The Journal of the American Medical Association), 199, 519 (1967)]、 Eagleの MEM培地 [サイエンス (Science), 122, 501 (1952)]、ダルベッコ改変 MEM培地 [ヴユウ ロロジー (Virology), 8, 396 (1959)]、 199培地 [プロシーデイング'ォブ 'ザ 'ソサイエテ ィ'フォア'ザ 'バイオロジカノレ'メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 (1950)]、 Whitten培地 [発生工学実験マニュアル-トランスジエニック •マウスの作り方 (講談社)勝木元也編（1987)ほたはこれら培地に牛胎児血清等を 添加した培地等を用いることができる。
[0105] 培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
2
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カロ してちよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地（Pharmingen社製）、 Sf- 900 II SFM培地（Life Technologies社 製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製）、 Grace's Insect Medium [ネイチヤー (Nature), 195, 788 (1962)]等を用いることができる。
[0106] 培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いるこ とがでさる。
[0107] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
上記のとおり、糖蛋白質分子をコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保 有する酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法 に従って培養し、糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物より糖蛋白質組成物を 採取することにより、糖蛋白質組成物を製造することができる。
[0108] 糖蛋白質組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外 に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿 主細胞や、生産させる糖蛋白質分子の構造を変えることにより、該方法を選択するこ とがでさる。
糖蛋白質組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポー ルソンらの方法 [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリー (J. Biol. Chem.), 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [プロシーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル 'ァ力デミ一' ォブ.サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227 (1989);ジーン'デベロップ メント (Genes Develop.), 4, 1288 (1990) ]、または特開平 05-336963、 WO94/23021等 に記載の方法を準用することにより、糖蛋白質組成物を宿主細胞外に積極的に分泌 させることがでさる。
[0109] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、糖蛋白質分子をコード する DNA、および糖蛋白質分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードする DNA を挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に糖蛋白質分子を発現させること により、目的とする糖蛋白質分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0110] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて糖蛋白質組成物を製造することもできる。 形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育また は栽培し、糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該糖蛋 白質組成物を採取することにより、該糖蛋白質組成物を製造することができる。
[0111] 動物個体を用いて糖蛋白質組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法 [ アメリカン 'ジャーナル'ォブ 'クリニカル'二ユートリシヨン (American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S (1996);アメリカン ·ジャーナル ·ォブ 'タリ-カル ·二ユートリシヨン (American Journal of Clinical Nutrition), 63, 627S (1996);バイオ/テクノロジー (Bio/ Technology), 9, 830 (1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とす る糖蛋白質組成物を生産させる方法があげられる。
[0112] 動物個体の場合は、例えば、糖蛋白質分子をコードする DNAを導入したトランスジ
-ック非ヒト動物^!司育し、糖蛋白質組成物を該動物中に生成 ·蓄積させ、該動物 中より糖蛋白質組成物を採取することにより、糖蛋白質組成物を製造することができ る。該動物中の生成'蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク (特開昭 63-309192 )、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現 できるものであればいずれも用いることができる力 例えば、乳腺細胞特異的なプロ モーターであるひカゼインプロモーター、 eカゼインプロモーター、 eラクトグロブリン プロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
[0113] 植物個体を用いて糖蛋白質組成物を製造する方法としては、例えば糖蛋白質分子 をコードする DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， 20 (199 4);組織培養， 21 (1995);トレンド'イン'バイオテクノロジー (Trends in Biotechnology), 15, 45 (1997)]に準じて栽培し、糖蛋白質組成物を該植物中に生成.蓄積させ、該 植物中より該糖蛋白質組成物を採取することにより、糖蛋白質組成物を生産する方 法があげられる。
[0114] 糖蛋白質分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された糖蛋白 質組成物は、例えば糖蛋白質組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機 、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、 通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機 溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE) -セファロース、 DIAION HPA-75 ( 三菱化学 (株)製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセ ファロース、フエ-ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分 子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシン グ法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い 、糖蛋白質組成物の精製標品を得ることができる。
[0115] また、糖蛋白質組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞 を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として糖蛋白質組成物の不溶 体を回収する。回収した糖蛋白質組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。 該可溶化液を希釈または透析することにより、該糖蛋白質組成物を正常な立体構造 に戻した後、上記と同様の単離精製法により該糖蛋白質組成物の精製標品を得るこ とがでさる。
[0116] 糖蛋白質組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該糖蛋白質組成物 あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分 離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同 様の単離精製法を用いることにより、糖蛋白質組成物の精製標品を得ることができる すでに宿主細胞が糖蛋白質組成物を発現する能力を有する場合には、上記 1.に 記載した方法を用いて糖蛋白質組成物を発現する能力を有する細胞を調製した後 に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする糖蛋白質組成物を採取し、精製するこ とにより、糖蛋白質組成物を製造することができる。
[0117] 3.糖蛋白質組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた糖蛋白質分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造 の解析に準じて行うことができる。例えば、ガラクトース、マンノース、フコースなどの 中性糖、 N-ァセチルダルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖は、糖組成 分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うこ とがでさる。
[0118] (1)中性糖'アミノ糖組成分析
糖蛋白質の糖鎖の組成分析は、トリフルォロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うこ とにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。 Bio LCま HPAEC— PAD (hign performance anion— exchange chromatography— pulsed ampe rometric detection)法 [ジャーナノレ ·ォブ ·リキッド ·クロマトグラフィー (J丄 iq.Chromato gr.) , 6, 1577 (1983)]によって糖組成を分析する装置である。
[0119] また、 2-アミノビリジンによる蛍光標識ィ匕法でも組成比を分析することができる。具体 的には、公知の方法 [ァグリカルチュラル 'アンド'バイオロジカル ·ケミストリー (Agric.B iol.Chem.), 55(1), 283-284 (1991)]に従って酸カ卩水分解した試料を 2-アミノビリジル 化で蛍光ラベルイ匕し、 HPLC分析して組成比を算出することができる。
(2)酸性糖組成分析 糖蛋白質に付加された糖鎖の組成を分析する方法としては、塩酸または硫酸等で 、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、酸性糖を遊離し、遊離された酸性糖を標識す ることにより、糖の組成比を分析することができる。糖蛋白質に付加された糖鎖を構成 する単糖としては、シアル酸、中性糖、ァミノ糖があげられるが、酸に対する遊離され た単糖の安定性は、アミノ糖、中性糖、シアル酸の順である。したがって、アミノ糖ゃ 中性糖のグリコシド結合を切断する条件ではシアル酸は完全に分解されてしまうため 、通常、シアル酸の分析と、アミノ酸および中性糖の分析とは別々に行われる。
[0120] 具体的な方法としては、公知の方法 [Chem. Pharm. Bull. 35, 687 (1987); Anal. Bio chem. 179, 162-166 (1989)]に従って加水分解した試料を、例えば市販のシアル酸 蛍光標識用試薬キット（宝酒造株式会社)などを用い l,2-diamino-4,5-methylenediox ybenzene (DMB)蛍光標識し、 HPLCにて分析することで組成比を算出することができ る。
(3)糖鎖構造解析
糖蛋白質分子の糖鎖の構造解析は、 2次元糖鎖マップ法 [アナリティカル 'バイオケ ミストリー (Anal. Biochem.) , 171, 73 (1988)、生物化学実験法 23-糖蛋白質糖鎖研究 法 (学会出版センター)高橋禮子編（1989年) ]により行うことができる。 2次元糖鎖マツ プ法は、例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出 位置を、 Υ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、そ れぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定す る方法である。
[0121] 具体的には、糖蛋白質組成物をヒドラジン分解して、糖蛋白質分子から糖鎖を遊離 し、 2-アミノビリジン (以下、「ΡΑ」と略記する）による糖鎖の蛍光標識 [ジャーナル'ォ ブ 'バイオケミストリー（J. Biochem.) , 95, 197 (1984)]を行った後、ゲルろ過により糖 鎖を過剰の PAィ匕試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した 糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、 2次元 糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード (TaKaRa社製）、文献 [アナリティカル'バ ィォケミストリー（Anal. Biochem.) , 171, 73 (1988)]とのスポットの比較より糖鎖構造を 推定することができる。 [0122] さらに各糖鎖の MALDI-TOF-MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マップ法によ り推定される構造を確認することができる。
4.糖蛋白質組成物の活性評価
精製した糖蛋白質組成物の蛋白量、受容体との親和性、血液中での半減期、血液 投与後の組織への分布、あるいは薬理活性発現に必要な蛋白質相互作用の変化を !j疋する方法としては、 Current Protocols In Protein Science, John Wiley & Sons Inc ., (1995)、日本生化学会編新生化学実験講座 19動物実験法，東京化学同人（199 1)、日本生化学会編新生化学実験講座 8細胞内情報と細胞応答，東京化学同人（ 1990)、日本生化学会編新生化学実験講座 9ホルモン Iペプチドホルモン，東京化学 同人（1991)、実験生物学講座 3アイソトープ実験法，丸善株式会社（1982)、 Monocl onal Antibodies: Principles and Applications, Wiley— Liss, Inc., (1995)、酵素免疫 1 J 定法第 3版，医学書院（1987)、改訂版酵素抗体法，学際企画（1985)等に記載の公 知の方法を用いることができる。
[0123] その具体的な例としては、精製した糖蛋白質組成物をラジオアイソトープなどの化 合物で標識し、標識した糖蛋白質組成物の受容体あるいは相互作用をする蛋白質と の結合反応の強さを定量的に測定する方法があげられる。また、 Biacore社の BIAcor eシリーズなどの各種装置を用いて、蛋白質蛋白質相互作用を測定することもできる（ J. Immnunol. Methods, 145, 229 (1991)、実験医学別冊バイオマニュアル UPシリー ズ蛋白質の分子間相互作用実験法，羊土社（1996))。
[0124] 標識した糖蛋白質組成物を体内に投与することで、血液中での半減期あるいは血 液投与後の組織への分布を知ることができるが、標識体の検出には、標識物質を検 出する方法と検出の対象となる糖蛋白質特異的な抗体抗原反応とを組み合わせた 検出方法が好ましい。
5.本発明の糖蛋白質組成物の利用
本発明の糖蛋白質組成物を含有する医薬は、予防薬あるいは治療薬として単独で 投与することも可能ではある力 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以 上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野にお!、てよく知られる任意の方法によ り製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 [0125] 投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげ ることができ、糖蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。 投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、 注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
[0126] 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の 糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のダリコール類、ごま油、オリ ーブ油、大豆油等の油類、 P-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、スト口ベリ 一フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
[0127] カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マン-トール等の 賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タル ク等の滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の 結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として 用いて製造できる。
[0128] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物カゝらなる担体等を用いて 調製される。または、糖蛋白質組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリ ゥムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
[0129] また、噴霧剤は糖蛋白質組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜 を刺激せず、かつ糖蛋白質組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。糖蛋白質組成物および用 いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、こ れらの非経口剤にぉ 、ても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもでき る。 [0130] 投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体 重等により異なる力 有効成分の量として、通常成人 1日当たり 1 §/1¾〜200 g/kg である。
また、糖蛋白質組成物の生物活性を測定する方法は、インビトロ (in vitro)実験とし ては、糖蛋白質受容体結合活性測定法、糖蛋白質組成物の酵素活性測定法、糖蛋 白質受容体発現細胞株を用いた増殖分化促進活性の測定法などの in vitro試験、あ るいはヒト病態モデル動物を用いた in vivo試験等があげられる。
[0131] 糖蛋白質受容体結合活性測定法、糖蛋白質組成物の酵素活性測定法、糖蛋白質 受容体発現細胞株を用いた増殖分化促進活性の測定法、ヒト病態モデル動物を用 いた in vivo試験は、文献 [基礎と臨床， 22(15), 5531 (1988)、 J. Pharm. Pharmacol, 42 ,758(1990)、 J. Urology, 146,1645(1991)、基礎と臨床， 22(15), 5547 (1988)、基礎と臨 沐, 22(1D , 5811(1988)、 The second Series of Pharmaceutical Research and Develop ment Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, T okyo, Japan, 1992;医学のあゆみ， 120, 1147, 1982;薬理と治療 17, 5843, 1989;臨 床と研究 62, 3573, 1985;臨床と研究 62, 3688, 1985;応用薬理 30, 589, 1985]等 記載の公知の方法に従って行うことができる。
[0132] 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる 例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものでない。
実施例 1
[0133] シァリダーゼを標的とした siRNA発現プラスミド導入による細胞質性シァリダーゼ抑制 CHO/DG44細胞の作製
1. NEU2シァリダーゼを標的とした siRNA発現ベクターの構築
(1)ハイグロマイシン而性 tRNA- valプロモーター型 siRNA発現ベクター FT81ib3/pA GEの作製
WO2005/035778実施例 3第 1項（1)に記載されているプラスミド FUT8shRNA/lib3/ pPUR 1.0 μ gを NEBuffer for EcoRI(New England Biolabs社製） 30 μ Lに溶解し、 10単 位の制限酵素 EcoRIおよび XhoI(New England Biolabs社製）を加えて 37°Cで 3時間消 化反応を行った後、該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラ バイオ社製）を用いて約 250bpのヒト tRNA-valプロモータ一-ショートヘアピン型 RNA- ターミネータ一配列発現カセットを含む DNA断片を回収した。
[0134] 一方、プラスミド pBluescriptll KS (+) 1.0 μ gを NEBuffer for EcoRI(New England Biola bs社製） 30 Lに溶解し、 10単位の制限酵素 EcoRIおよび XhoI(New England Biolabs 社製)を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。反応後、該反応液に滅菌水 13 w L、 10 X Alkaline Phosphatase Buffer 5 μ Lおよび Alkaline Phosphatase E.coliし 75(タ yフ バイオ社製） 1単位を添加し、 37°Cで 1時間脱リン酸化反応を行った後、該反応液をァ ガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて約 2.9Kbのプ ラスミド pBluescriptll KS (+)由来の EcoRI- Xhol断片を回収した。
[0135] 上記で得た DNA EcoRI- Xhol断片 (約 250bp) 8 μ プラスミド pBluescriptll KS (+)由 来の EcoRト Xhol断片 (約 2.9Kb) 2 レ Ligation High (東洋紡社製） 10 μ Lを混合し、 1 6°Cで 2時間反応した。該反応液を用いて大腸菌 DH5 α株 (インビトロジェン社製)を形 質転換し、得られたアンピシリン而性クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲ ン社製)を用いてプラスミド DNAを単離した。得られたプラスミドを以下 FT81ib3/pBSと 称す (図 1)。
[0136] 次に、プラスミド FT81ib3/pBS 1 μ gを NEBuffer4(New England Biolabs社製） 20 μ L に溶解し、 10単位の制限酵素 SmaI(New England Biolabs社製）をカ卩えて 25°Cで 5時間 消化反応を行った後、 65°C、 20分間の加熱による制限酵素 Smalの不活化処理を行 なった。該反応液に滅菌水 14.6 L、 10 X NEBuffer2(New England Biolabs社製） 4 μ L、 100 X BSA(New England Biolabs社製） 0.4 L、 10単位の制限酵素 XhoI(New Engl and Biolabs社製)をそれぞれ加えて 37°Cで一晩消化反応を行った後、該反応液をァ ガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて約 250bpのヒ ト tRNA-valプロモータ一-ショートヘアピン型 RNA-ターミネータ一配列発現カセットを 含む DNA断片を回収した。
[0137] 一方、プラスミド pAGE249 1.0 μ gを NEBuffer 1 (New England Biolabs社製） 30 μしに 溶解し、 10単位の制限酵素 Naelおよび XhoI(New England Biolabs社製)をカ卩えて 37°C で 6時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液に滅菌水 22 L、 10 X Alkaline P hosphatase Buffer 6 μ Lおよび Alkaline Phosphatase E.coli C75(タカラバィォ社製) 1 単位を添加し、 37°Cで 1時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電 気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製)を用いて約 4.4Kbのプラスミド pAGE24 9由来の Nael- Xhol断片を回収した。尚、 pAGE249は、 pAGE248 [ジャーナル 'ォブ' バイオロジカル.ケミストリー（J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994))の誘導体であり、 pA GE248よりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr)発現ユニットを含む 2.7Kb Sphl-Sphl断 片を除去したベクターである。
[0138] 上記で得た約 250bpの DNA Smal- Xhol断片 10 μ L、プラスミド pAGE249由来の約 4.
4Kbの Nae卜 Xhol断片 5 μ Lおよび Ligation High (東洋紡社製） 15 μ Lを混合し、 16°C で一晩反応した。該反応液を用いて大腸菌 DH5 α株 (インビトロジ ン社製)を形質転 換し、得られたアンピシリン而性クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲン社 製)を用いてプラスミド DNAを単離した。各プラスミドに挿入された DNAの塩基配列を 、 DNAシークェンサ一 377 (Parkin Elmer社製）および BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems社製）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。 シークェンス解析のプライマーには、 pAGE249_seq FW (配列番号 8)および pAGE249 - seq RV (配列番号 9)を用い、挿入 DNAの配列が、プラスミド FUT8shRNA/lib2B/pP URあるいはプラスミド FUT8shRNA/lib3/pPURに含まれるヒ RNA-valプロモータ^ ショートヘアピン RNA発現ユニットである EcoRト Xhol断片に相当する配列と矛盾しな V、ことを確認した。得られたプラスミドを以下 FT81ib3/pAGEと称す（図 2)。
[0139] (2)標的配列の選定および合成オリゴ DNAの設計
チャイニーズノヽムスター NEU2シァリダーゼ遺伝子に対する siRNAの標的配列を含 む二本鎖 DNAカセットを形成する合成オリゴ DNAを作製した。まず、配列番号 1で表 されるチャイニーズノヽムスター由来 NEU2シァリダーゼ cDNA配列（GeneBank, U0614 3)力ら、 Reynoldsらの報告（ネイチヤー'バイオテクノロジー (Nature Biotechnology),22 ,326(2004))に記載のアルゴリズムに基づき、標的配列を 7箇所同定した。選定した標 的配列を配列番号 11〜17に示した。尚、標的配列は連続した 19塩基のうち、以下 に示す条件によって与えられるポイントが高い順に選択した。
[0140] 条件 1 GC含量が 30%〜50%である。満たしていれば 1ポイント加算。
条件 2 センス鎖の 15番目から 19番目の 5塩基に少なくとも 3塩基の Aあるいは Uが 含まれる。満たした場合、 Aまたは Uが 1塩基含まれる毎に 1ポイント加算。
条件 3 配列内部に繰り返し配列もしくはヘアピン構造を含まない (Tmく 20°Cで測定 ) o満たしていれば 1ポイント加算。
[0141] 条件 4 センス鎖の 19番目力 Aである。満たしていれば 1ポイント加算。
条件 5 センス鎖の 3番目が Aである。満たして ヽれば 1ポイント加算。
条件 6 センス鎖の 10番目力 ¾である。満たして!/、れば 1ポイント加算。
条件 7 センス鎖の 19番目が Gまたは Cでな 、。満たして 、なければ 1ポイント減算 条件 8 センス鎖の 13番目が Gでな 、。満たして 、なければ 1ポイント減算 一方、チャイニーズノヽムスター由来 NEU2シァリダーゼの cDNA配列のアミノ酸コード 全領域を標的とするため、該遺伝子配列を機械的に 30bp毎に分断した配列を標的と した siRNAの設計を行つた。これら標的配列を配列番号 18〜 55に示す。
[0142] 選定した標的配列について以下の手順で二本鎖 DNAカセットを設計した。二本鎖 DNAカセットは 5'末端力も順に、制限酵素 Sad切断により生じる 3'突出末端、配列番 号 11〜55に対応する DNA配列に相補的なアンチセンスコード DNAおよび制限酵素 Kpnl切断により生じる 3'突出末端を有する。該ニ本鎖 DNAの 5'末端はリン酸ィ匕した 配列番号 11に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Si aAl)の塩基配列を配列番号 56、アンチセンス鎖（以下 SiaA2)の塩基配列を配列番 号 57に、配列番号 12に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖 (以下 SiaBl)の塩基配列を配列番号 58、アンチセンス鎖（以下 SiaB2)の塩基配列を 配列番号 59に、配列番号 13に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセ ンス鎖（以下 SiaCl)の塩基配列を配列番号 60、アンチセンス鎖（以下 SiaC2)の塩基 配列を配列番号 61に、配列番号 14に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ D NAのセンス鎖（以下 SiaDl)の塩基配列を配列番号 62、アンチセンス鎖（以下 SiaD2) の塩基配列を配列番号 63に、配列番号 15に示す標的配列について設計した合成 オリゴ DNAのセンス鎖（以下 SiaEl)の塩基配列を配列番号 64、アンチセンス鎖（以下 SiaE2)の塩基配列を配列番号 65に、配列番号 16に示す標的配列について設計し た合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 SiaFl)の塩基配列を配列番号 66、アンチセンス 鎖（以下 SiaF2)の塩基配列を配列番号 67に、配列番号 17に示す標的配列について 設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 SiaGl)の塩基配列を配列番号 68、アンチ センス鎖（以下 SiaG2)の塩基配列を配列番号 69に、配列番号 18に示す標的配列に つ!、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 SialFW)の塩基配列を配列番号 70 、アンチセンス鎖（以下 SialRV)の塩基配列を配列番号 71に、配列番号 19に示す標 的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia2FW)の塩基配列を配 列番号 72、アンチセンス鎖（以下 Sia2RV)の塩基配列を配列番号 73に、配列番号 2 0に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia3FW)の塩 基配列を配列番号 74、アンチセンス鎖（以下 Sia3RV)の塩基配列を配列番号 75に、 配列番号 21に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia4 FW)の塩基配列を配列番号 76、アンチセンス鎖（以下 Sia4RV)の塩基配列を配列番 号 77に、配列番号 22に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖 (以下 Sia5FW)の塩基配列を配列番号 78、アンチセンス鎖（以下 Sia5RV)の塩基配 列を配列番号 79に、配列番号 23に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNA のセンス鎖（以下 Sia6FW)の塩基配列を配列番号 80、アンチセンス鎖（以下 Sia6RV) の塩基配列を配列番号 81に、配列番号 24に示す標的配列について設計した合成 オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia7FW)の塩基配列を配列番号 82、アンチセンス鎖（以 下 Sia7RV)の塩基配列を配列番号 83に、配列番号 25に示す標的配列について設 計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia8FW)の塩基配列を配列番号 84、アンチ センス鎖（以下 Sia8RV)の塩基配列を配列番号 85に、配列番号 26に示す標的配列 につ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia9FW)の塩基配列を配列番号 86、アンチセンス鎖（以下 Sia9RV)の塩基配列を配列番号 87に、配列番号 27に示 す標的配列につ!、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 SialOFW)の塩基配 列を配列番号 88、アンチセンス鎖（以下 SialORV)の塩基配列を配列番号 89に、配 列番号 28に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sial 1 FW)の塩基配列を配列番号 90、アンチセンス鎖（以下 SiallRV)の塩基配列を配列 番号 91に、配列番号 29に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス 鎖（以下 Sial2FW)の塩基配列を配列番号 92、アンチセンス鎖（以下 Sial2RV)の塩 基配列を配列番号 93に、配列番号 30に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sial3FW)の塩基配列を配列番号 94、アンチセンス鎖（以下 Si al3RV)の塩基配列を配列番号 95に、配列番号 31に示す標的配列について設計し た合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sial4FW)の塩基配列を配列番号配列番号 96、 アンチセンス鎖（以下 Sial4RV)の塩基配列を配列番号 97に、配列番号 32に示す標 的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sial5FW)の塩基配列を配 列番号 98、アンチセンス鎖（以下 Sial5RV)の塩基配列を配列番号 99に、配列番号 33に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sial6FW)の 塩基配列を配列番号 100、アンチセンス鎖（以下 Sial6RV)の塩基配列を配列番号 1 01に、配列番号 34に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（ 以下 Sial7FW)の塩基配列を配列番号 102、アンチセンス鎖（以下 Sial7RV)の塩基 配列を配列番号 103に、配列番号 35に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sial8FW)の塩基配列を配列番号 104、アンチセンス鎖（以下 S ial8RV)の塩基配列を配列番号 105に、配列番号 36に示す標的配列について設計 した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sial9FW)の塩基配列を配列番号 106、アンチ センス鎖（以下 Sial9RV)の塩基配列を配列番号 107に、配列番号 37に示す標的配 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia20FW)の塩基配列を配列番 号 108、アンチセンス鎖（以下 Sia20RV)の塩基配列を配列番号 109に、配列番号 38 に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia21FW)の塩 基配列を配列番号 110、アンチセンス鎖（以下 Sia21RV)の塩基配列を配列番号 111 に、配列番号 39に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia22FW)の塩基配列を配列番号 112、アンチセンス鎖（以下 Sia22RV)の塩基配列 を配列番号 113に、配列番号 40に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNA のセンス鎖（以下 Sia23FW)の塩基配列を配列番号 114、アンチセンス鎖（以下 Sia23 RV)の塩基配列を配列番号 115に、配列番号 41に示す標的配列にっ 、て設計した 合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia24FW)の塩基配列を配列番号 116、アンチセン ス鎖（以下 Sia24RV)の塩基配列を配列番号 117に、配列番号 42に示す標的配列に つ!、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia25FW)の塩基配列を配列番号 1 18、アンチセンス鎖（以下 Sia25RV)の塩基配列を配列番号 119に、配列番号 43に 示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia26FW)の塩基 配列を配列番号 120、アンチセンス鎖（以下 Sia26RV)の塩基配列を配列番号 121に 、配列番号 44に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Si a27FW)の塩基配列を配列番号 122、アンチセンス鎖（以下 Sia27RV)の塩基配列を 配列番号 123に、配列番号 45に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAの センス鎖（以下 Sia28FW)の塩基配列を配列番号 124、アンチセンス鎖（以下 Sia28RV )の塩基配列を配列番号 125に、配列番号 46に示す標的配列について設計した合 成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia29FW)の塩基配列を配列番号 126、アンチセンス 鎖（以下 Sia29RV)の塩基配列を配列番号 127に、配列番号 47に示す標的配列につ V、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia30FW)の塩基配列を配列番号 128 、アンチセンス鎖（以下 Sia30RV)の塩基配列を配列番号 129に、配列番号 48に示す 標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia31FW)の塩基配列を 配列番号 130、アンチセンス鎖（以下 Sia31RV)の塩基配列を配列番号 131に、配列 番号 49に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia32FW )の塩基配列を配列番号 132、アンチセンス鎖（以下 Sia32RV)の塩基配列を配列番 号 133に、配列番号 50に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス 鎖（以下 Sia33FW)の塩基配列を配列番号 134、アンチセンス鎖（以下 Sia33RV)の塩 基配列を配列番号 135に、配列番号 51に示す標的配列について設計した合成オリ ゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia34FW)の塩基配列を配列番号 136、アンチセンス鎖（以 下 Sia34RV)の塩基配列を配列番号 137に、配列番号 52に示す標的配列について 設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia35FW)の塩基配列を配列番号 138、ァ ンチセンス鎖（以下 Sia35RV)の塩基配列を配列番号 139に、配列番号 53に示す標 的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia36FW)の塩基配列を配 列番号 140、アンチセンス鎖（以下 Sia36RV)の塩基配列を配列番号 141に、配列番 号 54に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（以下 Sia37FW) の塩基配列を配列番号 142、アンチセンス鎖（以下 Sia37RV)の塩基配列を配列番号 143に、配列番号 55に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖（ 以下 Sia38FW)の塩基配列を配列番号 144、アンチセンス鎖（以下 Sia38RV)の塩基 配列を配列番号 145にそれぞれ示した。設計した合成オリゴ DNAの合成は定法 (モ レキユラ一.クロー-ング第 2版）に従って行った。
[0143] (3)合成オリゴ DNAのハイグロマイシン而性 tRNA-valプロモーター型 siRNA発現べ クタ一への挿入
本項 1 (1)にて取得した FT81ib3/pAGEの siRNA铸型 DNA挿入領域に本項（2)にて 合成した合成オリゴ DNAの挿入を行った。
まず、合成オリゴ DNAのアニーリングを以下の手順で行った（図 3)。合成オリゴ DNA センス鎖およびアンチセンス鎖各 200pmolをアニーリングバッファー〔10mM Tris(pH7. 5)-50mM NaCl-lmM EDTA] 10 μ Lに溶解し、 2分間 98°Cで保温した。その後、除冷 し約 3時間かけて室温まで冷却した。その後、アニーリングした合成オリゴ DNAを滅菌 水で 100倍希釈した。
[0144] 一方、プラスミド FT81ib3/pAGE 3 μ gを 100 μ g/mL BSA(New England Biolabs社製） を含む NEBufferl(New England Biolabs社製) 40 μ L〖こ溶解し、 20単位の制限酵素 Kpn Iおよび SacI(New England Biolabs社製)をカ卩えて 37°Cで 4時間消化反応を行った。消 化反応後、該反応液に滅菌水 12 μ Lゝ 10 X Shrimp Alkaline Phosphatase Buffer (宝 酒造社製） 6 μ Lおよび Shrimp Alkaline Phosphatase (宝酒造社製） 1単位を添カ卩し、 3 7°Cで 30分間、脱リン酸化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し 、 RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて約 4.6!¾のプラスミド1^81¾3 〇5由来の Kpnl-Sad断片を回収した。
[0145] 上記で得た二本鎖合成オリゴ DNA溶液 luL、プラスミド FT81ib3/pAGE由来の Kpnl- Sacl断片 1 μ L、および滅菌水 8 /z L、 Ligation High (東洋紡績社製） 10 Lを混合し、 1 6°Cでー晚反応させた。該反応液を用いて QIAprep spin Mini Kit (キアゲン社製）を 用いてプラスミド DNAを単離した。
各プラスミドに挿入された DNAの塩基配列を、 DNAシークェンサ一 ABI PRISM 377 ( パーキンエルマ一社製)を用いて、常法に従って決定した。シークェンス解析の铸型 には BamHI消化により、ショートヘアピン型 RNAのループ部分の铸型 DNAを切断した 各プラスミド DNAを、プライマーには PAGE249- seq FW (配列番号 9)および pAGE249- seq RV (配列番号 10)を用い、挿入された合成オリゴ DNAの配列および連結部分に 間違いが無いことを確認した。以下合成オリゴ DNA siaAlおよび siaA2からなる二本 鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiaA、合成オリゴ DNA siaBlおよび siaB2からなる二 本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiaB、合成オリゴ DNA siaClおよび siaC2からなる 二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiaC、合成オリゴ DNA siaDlおよび siaD2から なる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiaD、合成オリゴ DNA siaElおよび siaE2か らなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiaE、合成オリゴ DNA siaFlおよび siaF2 力もなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiaF、合成オリゴ DNA siaGlおよび sia G2からなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiaG、合成オリゴ DNA sialFWおよ び sialRVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSial、合成オリゴ DNA sia2F Wおよび sia2RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia2、合成オリゴ DNA sia3FWおよび sia3RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia3、合成オリゴ DNA sia4FWおよび sia4RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia4、合成 オリゴ DNA sia5FWおよび sia5RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia5 、合成オリゴ DNA sia6FWおよび sia6RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia6、合成オリゴ DNA sia7FWおよび sia7RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラス ミドを pSia7、合成オリゴ DNA sia8FWおよび sia8RVからなる二本鎖 DNAが挿入された プラスミドを pSia8、合成オリゴ DNA sia9FWおよび sia9RVからなる二本鎖 DNAが挿入 されたプラスミドを pSia9、合成オリゴ DNA sialOFWおよび sialORVからなる二本鎖 DN Aが挿入されたプラスミドを pSialO、合成オリゴ DNA siallFWおよび siallRVからなる 二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSiall、合成オリゴ DNA sial2FWおよび sial2R Vからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSial2、合成オリゴ DNA sial3FWおよ び sial3RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSial3、合成オリゴ DNA sial 4FWおよび sial4RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSial4、合成オリゴ DNA sial5FWおよび sial5RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSial5、 合成オリゴ DNA sial6FWおよび sial6RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミド を pSial6、合成オリゴ DNA sial7FWおよび sial7RVからなる二本鎖 DNAが挿入された プラスミドを pSial7、合成オリゴ DNA sial8FWおよび sial8RVからなる二本鎖 DNAが揷 入されたプラスミドを pSial8、合成オリゴ DNA sial9FWおよび sial9RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSial9、合成オリゴ DNA sia20FWおよび sia20RVからな る二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia20、合成オリゴ DNA sia21FWおよび sia21 RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSial、合成オリゴ DNA sia22FWおよ び sia22RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia22、合成オリゴ DNA sia2 3FWおよび sia23RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia23、合成オリゴ DNA sia24FWおよび sia24RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia24、 合成オリゴ DNA sia25FWおよび sia25RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミド を pSia25、合成オリゴ DNA sia26FWおよび sia26RVからなる二本鎖 DNAが挿入された プラスミドを pSia26、合成オリゴ DNA sia27FWおよび sia27RVからなる二本鎖 DNAが揷 入されたプラスミドを pSia27、合成オリゴ DNA sia28FWおよび sia28RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia28、合成オリゴ DNA sia29FWおよび sia29RVからな る二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia29、合成オリゴ DNA sia30FWおよび sia30 RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia30、合成オリゴ DNA sia31FWお よび sia31RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia31、合成オリゴ DNA si a32FWおよび sia32RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia32、合成オリ ゴ DNA sia33FWおよび sia33RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia33 、合成オリゴ DNA sia34FWおよび sia34RVからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミ ドを pSia34、合成オリゴ DNA sia35FWおよび sia35RVからなる二本鎖 DNAが挿入され たプラスミドを pSia35、合成オリゴ DNA sia36FWおよび sia36RVからなる二本鎖 DNAが 挿入されたプラスミドを pSia36、合成オリゴ DNA sia37FWおよび sia37RVからなる二本 鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia37、合成オリゴ DNA sia38FWおよび sia38RVから なる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pSia38とそれぞれ称す（図 3)。
2.チャイニーズノヽムスターシァリダーゼを標的とする有効 siRNA発現プラスミドの同 定
(1)チャイニーズノヽムスター NEU2シァリダーゼをコードする配列をホタルルシフェラ ーゼ遺伝子の下流に有するレポーター遺伝子を発現するプラスミド pKANTEX Lucia の構築 まず、配列番号 1で表されるチャイニーズノ、ムスター卵巣細胞（CHO)由来 NEU2シ ァリダーゼの cDNA塩基配列（GeneBank, U06143)に基づき、 NEU2シァリダーゼの 5， 側非翻訳領域に特異的なプライマー sial 2 (配列番号 146)および 3 '側非翻訳領域 に特異的なプライマー siarv2 (配列番号 147)を用いてポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を 行ない、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO)由来 NEU2シァリダーゼ cDNAを増 幅した。尚、 sia! 2は配列番号 1に示したチャイニーズハムスター NEU2シァリダーゼ 遺伝子配列の 177番目から 196番目の塩基、 siarv2は 1311番目から 1333番目の塩基 に相補的な配列である。
[0147] PCR反応は CHO/DG44細胞由来一本鎖 cDNAを 5 μ L分含む 25 μ Lの反応液 [1 X EX Taq Buffer (宝酒造社製）、 0.2mMの dNTP， s、 0.5単位の EX Taq polymerase (宝 酒造社製)、 0.5 μ Μの上記プライマー (配列番号 146および配列番号 147) ]を調製 し、 GeneAmp PCR system 9700 (パーキンエルマ一社製）を用いて 94°Cにて 5分間加 熱した後、 94°Cにて 20秒間、 65°Cにて 30秒間、 72°Cにて 30秒間のサイクルを 30サイ クル行なった。この PCR反応液をァガロースゲル電気泳動により分離後、約 l . lKbpの PCR増幅断片を QiaexII gel extraction kit (キアゲン）を用い回収した。該 DNA断片を pT7 blueベクター（Novagen)に Ligation high (東洋紡社製）を用いて連結し、得られ た組換えプラスミド DNAを用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換した。 得られた複数のアンピシリン而性コロニーより、 QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン 社製)を用いて組換えプラスミド DNAを単離した。プラスミドに含まれる PCR断片の塩 基配列を DNAシークェンサ一 ABI PRISM 377 (パーキンエルマ一社製）を用い、常法 に従って決定し、 PCRに伴う塩基の変異をないことを確認した。得られたチャイニーズ ハムスター卵巣細胞（CHO)由来 NEU2シァリダーゼ cDNAを含むプラスミドを pT7 blu e sialidaseと称す（図 4)。
[0148] 上記で構築した pT7 blue sialidase 1 μ gを 30 μ Lの Ηバッファー（宝酒造社製）に溶 解し、 10単位の Xbal (宝酒造社製）および 10単位の BamHI (New England BioLab社製 )を加え、 37°Cで 2時間消化を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 約 l . lKbpからなるチャイニーズハムスター NEU2シァリダーゼをコードする DNA断片を RECOCHIP (タカラバイオ社製)を用い回収した。一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子 をコードするレポータープラスミド pG5Luc (Clontech社製） 1 μ gを 30 μ Lの Μバッファ 一（宝酒造社製）に溶解し、 10単位の HindllKNew England BioLab社製)および 10単 位の XbaI (New England BioLab社製)をカ卩え、 37°Cで 2時間反応を行った。該反応液 をァガロースゲル電気泳動に供し、約 1.7Kbpのホタルルシフェラーゼをコードする DN A断片を RECOCHIP (タカラバイオ社製)を用いて回収した。次にプラスミド pAGE249 1 μ gを 30 μ Lの Μバッファー（宝酒造社製）に溶解し、 10単位の Hindlll (宝酒造社製） および 10単位の BamHI (New England BioLab社製)を加え、 37°Cで 2時間消化を行つ た。該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 pAGE249由来の約 6.4Kbpの DNA 断片を RECOCHIP (タカラバイオ社製)を用い回収した。該 DNA断片 1 μ L、上記で取 得したチャイニーズハムスター NEU2シァリダーゼをコードする DNA断片 1 μ Lおよび ホタルルシフェラーゼをコードする DNA断片 1 μ Lを混合し、 7 μ Lの滅菌蒸留水およ び 10 Lの Ligation High (東洋紡績社製)を添加し、 16°Cで一晩反応させた。該反応 液を用いて QIAprep spin Mini Kit (キアゲン社製）を用いてプラスミド DNAを単離した 。得られたプラスミドを pAGE Luciaと称する（図 5)。 pAGE Luciaはマウスモロ-一 LTR プロモーター制御によりホタルルシフェラーゼとチャイニーズノヽムスター NEU2シァリ ダーゼ力もなるキメラレポーター遺伝子を発現するプラスミドである。
上記で構築した pAGE Lucia 1 μ gを 30 μ Lの Ηバッファー（タカラバイオ社製）に溶 解し 10単位の XhoI (New England BioLab社製）および BamHI (New England BioLab社 製)を加え、 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に 供し、マウスモロニ一 LTRプロモーター、ホタルルシフェラーゼおよびチャイニーズノヽ ムスター NEU2シァリダーゼからなるキメラレポーター遺伝子を含有する 3.5Kbpの DN A断片を RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて回収した。一方、 WO97/10354に記 載のプラスミド PKANTEX93 1 μ gを 30 μ Lの Ηバッファー（タカラバイオ社製）に溶解し 、 10単位の Xhol (New England BioLab社製）および BamHI (New England BioLab社 製)を加え、 37°Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に 供し、約 8.2Kbpの pKANTEX93由来 DNA断片を単離した。上記で取得した pAGE Luc ia由来 3.5Kbpの DNA断片 5 μ L、 pKANTEX93由来 8.2Kbpの DNA断片 5 μ Lおよび 10 μ Lの Ligation High (東洋紡績社製)を添加し、 16°Cで一晩反応させ連結反応を行つ た。該反応液を用いて QIAprep spin Mini Kit (キアゲン社製）を用いてプラスミド DNA を単離した。得られたプラスミドを pKANTEX Luciaと称する（図 6)。
(2)レポーターシステムを用いたチャイニーズノヽムスター NEU2シァリダーゼを標的と した有効 siRNA発現プラスミドのスクリーニング
CHO/DG44細胞に siRNA発現プラスミドおよびキメラレポーター発現プラスミドを共 導入した後、ルシフェラーゼ活性を測定することにより有効な siRNA発現プラスミドの 同定を実施した。本実施例で作製したプラスミド pKANTEX Luciaから発現するのは 3 ，非翻訳領域にチャイニーズノヽムスター NEU2シァリダーゼ遺伝子を配置したホタル ルシフェラーゼ遺伝子力もなるキメラレポーター遺伝子である。 siRNAによってキメラ レポーター遺伝子上の NEU2シァリダーゼ領域が切断されるとキメラレポーターの消 失に伴い、細胞内のルシフェラーゼ活性が低下する。 pKANTEX Luciaおよび siRNA 発現プラスミドの CHO/DG44細胞への遺伝子導入は以下に示す手順でリポフエクシ ヨン法にて実施した。 CHO/DG44を 4 X 105個/ mlの密度で基本培地（10% ゥシ胎児 透析血清 (Life Technologies社)および 50 μ g/ml Gentamicin (ナカライテスタ社製）を 添加しァこ Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium(Life Technologies社))に懸 し、糸且 織培養用白色 96ゥエルプレート (スミロン社製） 1ゥエルあたり 100 Lずつ播種した。 3 7°C、 5% CO条件下で一晩培養を行った後、各ゥエルより培養液を除去し、 1ゥエルあ
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たり 50 /z Lの ΟΡΉ-ΜΕΜ培地（インビトロジェン社製）を添カロした。一方、以下の手順 で該 DNA—脂質混合液を調製した。 1ゥエルあたり 40ngのキメラレポーター発現ブラ スミド pKANTEX Lucia 、 160ngの siRNA発現プラスミドおよび、 20ngの内部標準プラス ミド pRL- TKを 25 μ Lの OPTI- MEM培地に溶解した後、 0.8 μ Lの Lipofectamin2000 (ィ ンビトロジェン社製）および 25 μ Lの ΟΡΉ- MEM培地を混合した脂質混合液に該 DNA 溶液を添加し、室温にて 20分間放置することにより DNA—脂質混合液を調製した。 尚、 pRL-TKは各ゥエル毎の遺伝子導入効率を補正するために添加したゥミシィタケ 由来ルシフェラーゼ発現プラスミドである。該 DNA—脂質混合液 50 Lをあら力じめ 0 PTI-MEM培地に置き換えた被遺伝子導入細胞の入ったゥエルに添カ卩し、 37°C、 5% CO条件下で 6時間培養を行った。 6時間培養後、 20%血清を含む基本培地を 100
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L/ゥエルで添加し、さらに 48時間培養を行った。 48時間後、各ゥエルより 150 Lの培 地を除去した後、 1ゥエルあたり 50 Lの Dua卜 Glo Luciferase Reagent (プロメガ社製） を添加した。ピペッティングにてゥエル内を混合後、室温にて 10分間放置し、各ゥェ ルからのホタルルシフェラーゼ発光量を ARVO MX 1420 Reader(Wallac社製)を用い て測定した。測定後、各ゥエルに 50 μ Lの Dua卜 Glostop & Glo Reagentを添加し、 10 分間室温にて放置した。 10分後、 ARVO MX 1420 Readerを用いて各ゥエルからのゥ ミシィタケ由来ルシフェラーゼ発光量を測定した。各ゥエルのホタルルシフェラーゼ発 光量はゥミシィタケルシフェラーゼ発光量を用いて補正し、各 siRNA発現プラスミドに っ 、て、キメラレポータープラスミドと共導入した際に観察されるホタルルシフェラー ゼ活性の相対値を示した。本系にお 、て陽性コントロールとした psiFLuc (GeneScript 社製）はホタルルシフェラーゼ遺伝子の一部を標的とする siRNAを発現するプラスミド である力 該プラスミドの共導入によりキメラレポーター由来のホタルルシフェラーゼ 発光量は 80%抑制された（図 7)。シァリダーゼ遺伝子を標的とした siRNA発現プラス ミド 36分子のうち、 pSi5、 pSil7、 pSi28、 pSi34の 4分子は、陽性コントロールと同様、共 導入したレポーターの活性を 80%以上抑制することが明ら力となった。
3.組み換え蛋白質生産 CHO/DG44細胞へのシァリダーゼ標的 siRNA発現プラスミ ドの安定導入
WO2005/035563に記載の MS705 pKAN- ΑΤΠΙ 27株（ェ技院寄託番号1¾1?\1 BP- 0 8472)に本項 2.で取得したシァリダーゼ標的 siRNA発現プラスミド pSi5、 pSil7、 pSi28 、 pSi34をそれぞれ導入し、安定に細胞のシァリダーゼ活性の抑制された細胞株を取 得した。本株はアンチトロンビンを安定に生産する CHO/MS705由来株である。細胞 株へのプラスミドの導入は下記の方法で行った。
上記の各 siRNA発現プラスミド 10 gを、制限酵素 FspI (New England Biolabs社）で 消化して線状化し、線状化した 10 gの各 siRNA発現プラスミドを 1.6 X 106個の pKAN -ATIII 27株へエレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 ( 1990)]により導入した後、基本培地 [10%、ゥシ胎児透析血清 (Invitrogen社)、 50 g/ mLゲンタマイシン（ナカライテスタ社）、および 500nmol/L MTX (Sigma社）を含む IMD M (Invitrogen社)]に懸濁し。接着細胞用 10cmディッシュ（Falcon社） 10枚に 10 mLず つ播種した。 5%COインキュベーター内で 37°C、 24時間培養した後、ピューロマイシ ン（SIGMA)を 12 μ g/mLの濃度で含む基本培地 10 mLに交換し、さらに 7日間の培 養を行い、ピューロマイシン耐性クローンを取得した。各プラスミドにっき 96個のピュ 一口マイシン耐性クローンを単離し、それぞれ細胞培養用 96ゥエルプレート（グライナ 一社製)で培養を行った。各ゥエルの細胞密度がコンフレントに達する直前にレプリ 力プレートの作製を行った。すなわち各ゥエルを 100 Lの PBS (Invitrogen)で洗浄し た後、 25 μ Lの 0.05%Tripsin (Invitrogen) 25 μ Lを加え、 5%COインキュベーター内で
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37°C、 5分間静置した。静置後各ゥエルに 125 Lのピューロマイシン（SIGMA)を 12 μ g/mLの濃度で含む基本培地をカ卩え、細胞を懸濁した後、該細胞懸濁液を 50 L ずつ、あらかじめ 50 μ Lのピューロマイシンを 12 μ g/mLの濃度で含む基本培地を入 れた 96ゥエルプレート 3枚に播種し、 5%COインキュベーター内で 37°C、 3日間静置
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した。 3日後、下記の方法で、各ゥエルの細胞内のシァリダーゼ活性を測定した。
3枚の 96ゥエルプレートより一枚を選択し、各ゥエルより培養液を除去し、 PBSlOO /z Lで洗浄した後、 150 /z Lの PBSをカ卩え、 -20°Cで 24時間以上凍結させた。凍結後、室 温にプレートを取り出し、細胞を融解した後、 8連マイクロピペットで 10回ピぺッティン グを行った後、該細胞溶解液を U字底 96ゥエルプレート (NUNC)に移した。冷却遠心 機（日立社製)を用いスイング型ローターにて 1000回転 10分の遠心を行った後、上清 である細胞溶解液を新しい U字底 96ゥエルプレート（NUNC)に移した。
上記で得た細胞溶解液 50 μ Lを蛍光測定用黒色 96ゥエルプレート (スミロン）に分 取し、資料中に含まれるシァリダーゼ活性の測定を行った。シァリダーゼ活性の測定 は濃度 4 mMで調製したシァリダーゼ蛍光基質 4- methylumbellifery卜 Ν- a - D- acetyln euraminic acid ammonium salt (ナカライテスク社製)を 5 μ L/ウエノレで分注し、プレー トに蓋を載せて炭酸ガスインキュベーター (ΤΑΒΑΙ製）にて 37°Cで 2時間反応させた。 反応後、 0.2 Mグリシン- NaOH (pH 10)を 140 L/ゥエルで添カ卩して反応を停止し蛍 光を増強させた。反応停止後、蛍光プレートリーダー ARVO (Perkin Elmer社製)を用 いて、各ゥエルの、 340nmの励起波長による 460nm蛍光波長の強度、すなわち各ゥェ ルの細胞質シァリダーゼ活性を 0.1秒間測定した。ゥエル間での細胞数の違いは、各 サンプルに含まれる乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)比活性により補正した。 LDH活性の 測定はラタテートデヒドロゲナーゼ CIIテストヮコー（和光純薬)を用いて添付の説明書 に従って行い、各細胞溶解液 50 Lを測定に供した。図 8に示す通り、各試料につい てシァリダーゼ活性 (蛍光強度； RU値)を LDH活性 (nmol/hr/mL)で除した値を比較 した結果、 pSi28を導入した形質転換株より、シァリダーゼ活性が親株である MS705 p KAN-ATIII 27株の 10%以下まで抑制された 28-17株を単離した。
4. siRNA発現プラスミドを安定に導入した CHO株による糖蛋白質の生産 本項 3.で榭立した、シァリダーゼ siRNA発現プラスミドを安定に導入することにより シァリダーゼ活性が抑制されたアンチトロンビン生産細胞である 28-17株を用い、以 下の手順で無血清フヱドバッチ培養を行うことができる。
無血清培地 EX-cell 302 (JRH)に馴化した 28_17株を、生細胞密度が 2.5 X 105cells /mLとなるように無血清フエドバッチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液を 1Lスピナ一 バイオリアクターに播種した。無血清フエドバッチ培養は、温度 35°C、攪拌速度 85rpm の条件で行い、培養開始後 3日目、 5日目、 7日目、 9日目、 11日目に、アミノ酸等の 消費量を補う目的でフィード培地 [L-ァラニン 0.177g/L、 L-アルギニン一塩酸 0.593g/ L、 L-ァスパラギン一水和物 0.177g/L、 L-ァスパラギン酸 0.212g/L、 L-シスチン二塩 酸 0.646g/L、 L-グルタミン酸 0.530g/L、 L-グルタミン 5.84g/L、グリシン 0.212g/L、 L- ヒスチジン一塩酸二水和物 0.297g/L、 L-イソロイシン 0.742g/L、 L-ロイシン 0.742g/L 、 L-リジン一塩酸 1.031g/L、 L-メチォニン 0.212g/L、 L-フエ-ルァラニン 0.466g/L、 L -プロリン 0.283g/L、 L-セリン 0.297g/L、 L-スレオ-ン 0.671g/L、 L-トリプトファン 0.113 g/L、 L-チロシンニナトリウム二水和物 0.735g/L、 L-パリン 0.664g/L)、ビタミン（d-ビ ォチン 0.0918mg/L、 D-パントテン酸カルシウム 0.0283g/L、塩化コリン 0.0283g/L、葉 酸 0.0283g/L、 myo-イノシトール 0.0509g/L、ナイァシンアミド 0.0283g/L、ピリドキサ一 ル塩酸 0.0283g/L、リボフラビン 0.00283g/L、チアミン塩酸 0.0283g/L、シァノコバラミ ン 0.0918mg/L、インシュリン 0.314g/L) ]を 50 mL添加し、グルコース濃度を制御する 目的で 50% (w/v)グルコース溶液を終濃度 5000mg/Lとなるように添加した。培養開 始後 2曰目、 3曰目、 5曰目、 7曰目、 9曰目、 11曰目、 13曰目、 14曰目に培養液を 10 mLずつ採取し、生細胞密度 (cells/mL)、生存率 (%)、アンチトロンビン濃度 (mg/L)、 培養上清中のシァリダーゼ活性および、生産されたアンチトロンビンに結合した糖鎖 末端のシアル酸数を測定した。アンチトロンビンの濃度は下記に示した方法で行 、、 シアル酸含有数は陰イオン交換 HPLC (島津製作所)を用いて測定した。
アンチトロンビンの定量は、まず ΑΤΙΠ ELISA Capture Antibody (Antibody Set, Affi nity Biologocs C/N ΑΤΠΙ- EIA)を 50 mM Carbonate (1.59gの Na COと 2.93gの NaHC
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Oを適当量の蒸留水に溶解し、 5Nの NaOH水溶液で pH9.6に調製した後、蒸留水で
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1Lにメスアップした溶液）で 100倍に希釈し、 100 L/ゥエルで 96well plate (Nunc社 製）に分注した。室温にて 1〜2時間静置し、 0.005%Tween20-PBSを用いてゥエル内 を洗浄した後 1%BSA-PBSを 100 μ L/ゥエルで分注して凍結保存した。
試料と濃度既知の標準品を、 1%BSA-PBSを用いて適当な濃度に希釈し、室温で 溶解しゥエル内の BSA-PBSを除去した抗 ΑΤΠΙ抗体固相化プレートに 50 μ L/ゥエル で分注し、室温にて 1時間静置した。 0.05%Tween20-PBSを用いてゥエル内を洗浄し た後、 ΑΤΠΙ検出抗体溶液を 100 /z L/ゥエルで分注し、室温にて約 1時間静置した。 各ゥエルを 350 Lの 0.05%Tween20- PBSで洗浄した後、 0.1%H 0をカ卩えた ABTS溶
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液を 50 L/ゥエルでカ卩え、発色を確認した後、 5%SDS溶液を L/ゥエルで添カロし て発色を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて励起 415nm/吸収 490nmの波 長で吸光度を測定し ΑΤΠΙ含有量を算出した。
28-17株は、シァリダーゼ siRNA導入細胞未導入株である MS705 pKAN-ATIII 27株 に比べ、 14日間の培養期間を通して培養上清中のシァリダーゼ活性が抑制され、そ の結果、生産された ΑΤΠΙのシアル酸数は高い値を維持することができる。以上のこと は、シァリダーゼ siRNA導入細胞力 実際の工業的製造法を模倣したスピナ一リアク ターを用いた培養においても、シァリダーゼ活性を抑制することにより、糖蛋白質から のシアル酸の脱離を抑制する効果があることを示している。
産業上の利用可能性
シァリダーゼ活性を抑制する siRNAを導入させた細胞、該細胞を用いる糖蛋白質分 子の製造方法、および該製造方法により得られる糖蛋白質組成物、 siRNAを用いた、 シァリダーゼ活性を抑制する方法が提供される。本発明の製造方法により、従来の 糖蛋白質組成物よりもシアル酸付加量が増加された糖蛋白質組成物を提供すること ができる。
配列表フリーテキスト [0154] 配列番号 9 147 人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[1] シァリダーゼの発現を抑制する低分子干渉 RNA(small interfering RNA)が導入された 細胞。
[2] 低分子干渉 RNA(small interfering RNA)が以下の (a)〜（d)力もなる群から選ばれる R NAおよびその相補 RNAからなる低分子干渉 RNA(small interfering RNA)である、請 求項 1記載の細胞。
(a)配列番号 1で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA。
[3] 低分子干渉 RNA(small interfering RNA)が以下の (a)〜(h)からなる群から選ばれる RN Aおよびその相補 RNAからなる低分子干渉 RNA(small interfering RNA)である、請求 項 1記載の細胞。
(a)配列番号 22で表される塩基配列力もなる RNA；
(b)配列番号 22で表される塩基配列において、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(c)配列番号 34で表される塩基配列力もなる RNA；
(d)配列番号 34で表される塩基配列にお 、て、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(e)配列番号 45で表される塩基配列からなる RNA;
(f)配列番号 45で表される塩基配列において、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(g)配列番号 51で表される塩基配列力もなる RNA；
(h)配列番号 51で表される塩基配列において、その塩基配列の両端の 1または数個 の塩基が欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞 に導入することにより該細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA。
[4] シァリダーゼが、以下の (a)〜(h)力 なる群力 選ばれる DNAがコードする蛋白質で ある、請求項 3に記載の細胞。
(a)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNA;
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(f)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
[5] シァリダーゼが、以下の （a)〜 (1)力もなる群力も選ばれる蛋白質である、請求項 3に 記載の細胞。
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 8で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質； (f)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(h)配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつシァリダーゼ活性を有する 蛋白質；
(i)配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 8で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつシァリダーゼ活性を有する蛋白質。
[6] 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞力 なる群力 選ばれる細胞で ある、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の細胞。
[7] 細胞が、下記の（a)〜(k)からなる群力も選ばれる細胞である、請求項 1〜6のいずれ 力 1項に記載の方法。
(a)チャイニーズノヽムスター卵巣組織由来 CHO細胞；
(b)ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；
(c)マウスミエローマ細胞株 NS0細胞；
(d)マウスミエローマ細胞株 SP2/0- Agl4細胞；
(e)シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(f)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(g)ヒト PER.C6細胞； (h)ヒト NM- F9細胞；
(i)胚性幹細胞；
(j)受精卵細胞；
(k)ヒト HEK293細胞。
[8] 細胞が、糖蛋白質分子をコードする遺伝子が導入された細胞である、請求項 1〜7の いずれか 1項に記載の細胞。
[9] 請求項 8記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ
、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質組成物の 製造方法。
[10] 糖蛋白質組成物が、親株細胞が生産する糖蛋白質組成物より、糖蛋白質 1分子あた りのシアル酸付加量が増加した糖蛋白質組成物であることを特徴とする、請求項 9に 記載の方法。
[11] 糖蛋白質組成物が、親株細胞が生産する糖蛋白質組成物より血中半減期が延長さ れた糖蛋白質組成物である、請求項 9または 10に記載の方法。
[12] 請求項 9〜11のいずれかに記載の製造方法により得られた糖蛋白質組成物。
[13] 以下の (a)〜（d)力もなる群力も選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本 鎖 RNA。
(a)配列番号 1で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA。
[14] 以下の (a)〜(h)力もなる群力も選ばれる RNA及びその相補 RNAで構成される 2本鎖 R NA。
(a)配列番号 22で表される塩基配列力もなる RNA； (b)配列番号 22で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(c)配列番号 34で表される塩基配列力もなる RNA；
(d)配列番号 34で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(e)配列番号 45で表される塩基配列からなる RNA;
(f)配列番号 45で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Ζまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA;
(g)配列番号 51で表される塩基配列力もなる RNA；
(h)配列番号 51で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および Zまたは付加された塩基配列力もなり、かつ細胞に導入することにより該 細胞のシァリダーゼの発現が抑制される RNA。
[15] 請求項 13または 14に記載の RNAに対応する DNA及びその相補 DNA。
[16] 請求項 13または 14に記載の RNAに対応する DNA及びその相補 DNAをベクターに 組み込んで得られる組換え体 DNA。
[17] 請求項 16に記載の組換え体 DNAを細胞に導入して得られる形質転換体。
[18] 請求項 17記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成 蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質 組成物の製造方法。
[19] 請求項 18記載の方法で得られる糖蛋白質組成物。
[20] 請求項 13または 14に記載された低分子干渉 RNA(small interfering RNA)を用いるこ とを特徴とする、シァリダーゼ活性を抑制する方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009049284A3 (en) * 2007-10-12 2009-12-30 Sigma-Aldrich Co. Compositions and methods for improved glycoprotein sialylation
JP2012524747A (ja) * 2009-04-23 2012-10-18 クルセル ホランド ベー ヴェー 組換えヒトアルファ１−アンチトリプシン
JPWO2013002330A1 (ja) * 2011-06-29 2015-02-23 協和発酵キリン株式会社 たん白質の精製方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERRARI J. ET AL.: "Chinese hamster ovary cells with constitutively expressed sialidase antisense RNA produce recombinant DNase in batch culture with increased sialic acid", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 60, no. 5, 1998, pages 589 - 595, XP002981240 *
FERRARI J. ET AL.: "Cloning and expression of a soluble sialidase from Chinese hamster ovary cells: sequence alignment similarities to bacterial sialidases", GLYCOBIOLOGY, vol. 4, no. 3, 1994, pages 367 - 373, XP002070047 *
MIYAGI T. ET AL.: "A crucial role of plasma membrane-associated sialidase (NEU3) in the survival of human cancer cells", GLYCOBIOLOGY, vol. 14, no. 11, 2004, pages 1176, XP002995283 *
PILATTE Y. ET AL.: "Sialic acids as important molecules in the regulation of the immune system: pathophysiological implications of sialidases in immunity", GLYCOBIOLOGY, vol. 3, 1993, pages 201 - 218, XP003017643 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009049284A3 (en) * 2007-10-12 2009-12-30 Sigma-Aldrich Co. Compositions and methods for improved glycoprotein sialylation
JP2011500032A (ja) * 2007-10-12 2011-01-06 シグマ−アルドリッチ・カンパニー 糖タンパク質のシアリル化を改善するための組成物および方法
US8273723B2 (en) 2007-10-12 2012-09-25 Sigma-Aldrich Co. Llc Compositions and methods for improved glycoprotein sialylation
JP2015057059A (ja) * 2007-10-12 2015-03-26 シグマ−アルドリッチ・カンパニー、エルエルシー 糖タンパク質のシアリル化を改善するための組成物および方法
EP2930245A1 (en) * 2007-10-12 2015-10-14 Sigma Aldrich Co. LLC Cell line and methods for improved glycoprotein sialylation
JP2012524747A (ja) * 2009-04-23 2012-10-18 クルセル ホランド ベー ヴェー 組換えヒトアルファ１−アンチトリプシン
JPWO2013002330A1 (ja) * 2011-06-29 2015-02-23 協和発酵キリン株式会社 たん白質の精製方法

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