WO2007100083A1 - 生物活性を強化した抗体改変体 - Google Patents

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WO2007100083A1
WO2007100083A1 PCT/JP2007/054018 JP2007054018W WO2007100083A1 WO 2007100083 A1 WO2007100083 A1 WO 2007100083A1 JP 2007054018 W JP2007054018 W JP 2007054018W WO 2007100083 A1 WO2007100083 A1 WO 2007100083A1
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PCT/JP2007/054018
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Yasuhiko Masuho
Hiroaki Nagashima
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Tokyo University Of Science
Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Teijin Pharma Limited
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to a method for enhancing the effector activity of an antibody, a modified antibody having a strong effector activity, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a method for enhancing ADCC activity, which is mainly an effector activity, an antibody variant having strong ADCC activity, and a method for producing the same.
  • Non-patent Document 1 Antibodies have become available as therapeutic agents because of the development of various technologies related to antibodies.
  • a method for producing antibodies in large quantities was established by a cell fusion method developed by G. Kohler and C. Milstein [Non-patent Document 2].
  • mass production has become possible by inserting antibody genes into expression vectors and introducing them into host cells [Non-patent Document 3].
  • Non-patent document 4 a chimeric antibody having a mouse variable region and a human constant region force
  • Non-patent document 5 a humanized antibody having a mouse hypervariable region, a human framework and a human constant region force
  • an antibody drug is to exert a therapeutic effect by binding to an antigen molecule involved in a disease at its two Fab domains.
  • an antigen molecule involved in a disease For example, antibodies against tumor necrosis factor (TNF) bind to TNF and inhibit TNF activity and suppress inflammation And exerts a therapeutic effect on rheumatoid arthritis [Non-patent Document 7]. Since the therapeutic effect is exhibited by binding to the antigen molecule and inhibiting the activity of the antigen, an antibody with high antigen affinity can be expected to be highly effective in a small amount.
  • a method is widely used in which a clone having a high affinity for the same antigen is selected from many monoclonal antibodies. It is also possible to prepare a variant by genetic recombination and select a variant with high affinity from the variant.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CD C complement-dependent cytotoxicity
  • the antibody bound to the infecting microorganism has an action of binding to the Fc receptor of the effector cell and mediating phagocytosis or damage of the infecting microorganism by the effector cell.
  • This antibody activity via the Fc domain is called effector activity.
  • Fe y RIA is present on the surface of cells such as macrophages and monocytes, and exhibits high affinity for HgG.
  • Fc y RII A is present in macrophages and neutrophils and has a weak affinity for IgG.
  • FcyRII B is present in B lymphocytes, mast cells, macrophages and the like, has a weak affinity for IgG, and provides an inhibitory signal.
  • FcyRIIIA is present in natural killer (NK) cells and macrophages, has a weak affinity for IgG, and is important for exerting ADCC activity.
  • Fe y ⁇ is present on neutrophils and is bound to the cell surface by a force GPI anchor that has the same extracellular domain as Fe y RIIIA.
  • FcRn is present in the small intestine and placenta and is involved in IgG metabolism. These Fc receptors are described in a review [Non-Patent Document 8].
  • FcyRIIIA has a genetic polymorphism, and the 158th amino acid has a palin (Val) type and a phenylalanine (Phe) type.
  • ⁇ 1,6-fucose-deficient IgGl antibody had enhanced FcyllA binding activity. It has also been reported that ⁇ 1,6-fucose-deficient antibodies showed enhanced ADCC activity [Non-patent Document 11]. T. Shinka wa et al. Have published similar results [Non-patent Document 12].
  • Telford claims that an antibody having a plurality of Fc regions has improved Fc activity [Patent Document 1].
  • Telford has created an antibody variant that has an anti-chain Fab and an anti-CD19 Fab heterodivalent Fab, and two Fc regions covalently bound to each other via a chemically synthesized linker. ADCC activity is measured.
  • the increase in ADCC activity observed by Telford is due to heterobivalent Fab in addition to the effect of multiple Fc regions. This is thought to be due to the effect of the antibody variant efficiently binding to the target cells.
  • Greenwood J. Greenwood
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2907474, Japanese Patent Laid-Open No. 4-504147, WO90 / 04413
  • Non-patent literature l Brekke OH. Et al., Neiya ⁇ ⁇ ⁇ Review ⁇ ⁇ ⁇ Drug 'Discovery (Natur ure Review Drug Discovery), 2, 52 (2003)
  • Non-Patent Document 2 Kohler G. et al., Nature 256, 495 (1975)
  • Non-Patent Document 3 Carter P. et al., Nucleic Acid research
  • Non-patent document 4 Bouulianne GL et al., Nature, 312, 643 (1984)
  • Non-patent document 5 Jones PT. Et al., Nature, 321, 522 (1986)
  • Non-Patent Document 6 Reichert JM. Et al., Nature Biotechnology, 23, 1073 (2005)
  • Non-Patent Document 7 Lipsky PE. Et al., New England 'Journal' of 'Medium (New England Journal of Medicine), 343, 1594 (2000)
  • Non-Patent Literature 8 Takai T. Nature 'Review' Immunology, 2, 580 (2002)
  • Non-Patent Document 9 Shields RL. Et al., Journal of Biological Chemistry, 276, 6591 (2001)
  • Non-Patent Document 10 Idusogie EE. Et al., Journal of Immunology, 166, 2571 (2001)
  • Non-Patent Document 11 Shields RL. Et al., Journal of Biological Chemistry, 277, 26733 (2002)
  • Non-Patent Document 12 Shinkawa T. et al., Journal 'Ob' Biological 'Chemistry (Jo urnal of Biological Chemistry), 278, 3466, (2003)
  • Non-Patent Document 13 Greenwood J. et al "Therapeutic Immunology", 1, 247 (1994)
  • Non-patent literature 14 Oettgen HC. Et al., Hybridoma 2, 17 (1983)
  • Non-patent literature 15 Huhn D. et al "Blood, 98, 1326 (2001)
  • Non-Patent Document 16 Press OW. Et al., Blood, 69, 584, (1987)
  • the present invention has been made in view of the above situation, and the problem to be solved by the present invention is a method for enhancing effector activity by modifying the structure of an antibody molecule, particularly enhancing ADCC activity. Is to provide a method. At the same time, the present invention is to provide a method for producing an antibody variant with enhanced activity or an antibody variant.
  • the present inventors have made utmost efforts to solve the above problems.
  • the present inventors made a modified antibody in which Fc portions are connected in series, and examined the effector activity of the modified antibody.
  • the modified antibody in which the Fc portion was linked in tandem had a significantly enhanced ADCC activity as compared with the natural antibody.
  • the conventional knowledge it is not possible to exclude the possibility that the enhanced ADCC activity of the antibody variant to which Fc is linked horizontally is a heterobivalent Fab effect, and further, the CDC activity of the antibody variant linked to tandem is reduced. Given the weakness, the effects of the variants of the present invention are unexpected.
  • the antibody variant having three Fc regions showed further enhanced ADCC activity than the variant having two Fc regions. It is speculated that the enhanced ADCC activity of our antibody variants correlates with the number of Fc regions linked to tandem.
  • the present inventors have demonstrated that the effector activity of an antibody can be enhanced by linking an Fc domain in series with the antibody, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to a method for enhancing the effector activity of an antibody by linking Fc domains in series, and more specifically, provides the following invention.
  • a method for producing an antibody variant with enhanced effector activity comprising linking one or more structures containing an Fc domain in series to the C-terminus of an antibody heavy chain,
  • a method for producing a modified antibody with enhanced effector activity comprising the following steps (a) and (b):
  • FIG. 1-1 is a diagram showing the construction process of the expression vector pCAGGS1-neoN-L / Anti-CD20 L Chain described in Example 1.
  • FIG. 1-2 This is a continuation of FIG.
  • FIG. 2-1 is a diagram showing the process of constructing the expression vector pCAGGS1-dhfrNL / Anti-CD20 H Chain described in Example 2.
  • FIG. 2-2 This is a continuation of Fig. 2-1.
  • FIG. 3 shows the final gene structure of the H chain described in Example 2 and the corresponding primers (sequence numbers: 34 to 45).
  • the single line represents the restriction enzyme site
  • the double line represents the spacer sequence.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the antibody prepared in Example 3.
  • FIG. 5 is a gel filtration chromatogram after protein purification with protein A described in Example 4. This is a chromatogram obtained by subjecting the products of M, RTX (rituximab), D0, D1, D2, D3, T0, Tl, ⁇ 2, and ⁇ 3 to Genore filtration.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of PAGE analysis of the antibody after gel filtration described in Example 5. Shows the results of SDS-PAGE under reducing conditions and Western plotting with anti-goat anti-HgG (H + L) antibody or goat anti-human ⁇ chain antibody labeled with horseradish peracid peroxidase .
  • FIG. 7 shows the results of HPLC analysis of the antibody after gel filtration described in Example 5. Shown are HPLC (gel filtration) of purified M, RTX, D0, D1, D2, D3, T0, T1, T2, T3.
  • FIG. 8 is a view showing the results of a CD20 binding test of an antibody by flow cytometry described in Example 6.
  • FIG. 9-1 is a diagram showing the results of a receptor binding test by ELISA using recombinant 13 ⁇ 4 ⁇ R1A described in Example 7.
  • FIG. 9-2 is a view showing the results of a receptor binding test by ELISA using recombinant Fe y R2A described in Example 7.
  • FIG. 9-3 is a diagram showing the results of a receptor binding test by ELISA using recombinant Fe y R2B described in Example 7.
  • FIG. 9-4 is a diagram showing the results of a receptor binding test by ELISA using the recombinant FcyR3A (Val 158 type) described in Example 7.
  • Fig. 9-5 is a view showing the results of a receptor binding test by ELISA using recombinant FcyR3A (Phe 158 type) described in Example 7.
  • FIG. 10 shows the results of ADCC activity test described in Example 8.
  • FIG. 11 shows the results of the CDC activity test described in Example 9.
  • the present invention provides a novel method for enhancing the effector activity of an antibody, characterized in that "one or more structures containing an Fc domain are linked in series to the heavy chain C terminal of an antibody.
  • a method of enhancing the effector activity of an antibody is provided.
  • an antibody variant hereinafter also referred to as “antibody variant of the present invention” having an enhanced effector activity compared to the original antibody while maintaining the affinity of the original antibody for the antigen is obtained. It becomes possible to obtain.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited in its origin, and primates such as humans, monkeys, chimpanzees, rodents such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, horses, hidges, donkeys, dogs. Any of mammals such as shrimp, goats, dogs, cats, etc. may be used, but humans are preferred.
  • the antibody in the present invention may be a natural antibody, an antibody introduced with some artificial mutation, or a so-called chimeric antibody or a human rabbit antibody.
  • the antibody in the present invention may be any class or any subclass of immunoglobulin, but is preferably an IgG class, and more preferably an IgGl subclass.
  • the "structure containing the Fc domain” in the present invention may be the Fc domain of the antibody itself, but an appropriate chain is located on the N-terminal side of the Fc domain.
  • the oligopeptide that becomes the spacer is bound.
  • the Fc domain of an antibody is generally one of fragments obtained by digesting an immunoglobulin molecule with papain.
  • the Fc domain consists of a hinge part, CH 2 domain, and CH3 domain force from the N-terminal side of the heavy chain constant region!
  • the two heavy chains are connected by SS bonds to the hinge part.
  • the antibody can be folded at the hinge. 2 for IgGl
  • the heavy chain is linked by a non-covalent bond in the CH3 domain and a disulfide bond in the hinge region.
  • the Fc domain may have a sugar chain as long as it has the ability to enhance effector activity when linked to the C-terminus of the antibody heavy chain C-terminal.
  • an antibody from which ⁇ 1,6 fucose on the sugar chain has been removed may be used.
  • the Fc domain in the structure of the present invention may be derived from the same or different origin as the antibody to which the structure of the present invention is linked, but when used as an antibody drug, the immunogen From the viewpoint of sex, it is preferable that the same origin as the antibody to which the structure of the present invention is linked.
  • the antibody to which the structure of the present invention is linked is a human-derived antibody or a humanized antibody
  • the Fc domain in the structure of the present invention is also preferably a human Fc domain.
  • Many antibody heavy chain (H chain) sequences are registered in public databases as IgGl H chain genes including the V region. For example, GenBank Accession No. BC019337 (DNA sequence of human constant region) can be mentioned.
  • Fc domain cDNA can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • Fc domain cDNA is prepared by a known nucleic acid amplification method by designing a primer based on the sequence shown in positions 721 to 1413 in SEQ ID NO: 3 and using mRNA prepared from antibody-expressing cells as a saddle type. it can .
  • a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 may be used as a probe, and the intermediate force of a cDNA library prepared from antibody-expressing cells may be selected by selecting a sequence that hybridizes to the probe.
  • the Fc domain in the structure of the present invention may have a natural mutation or an artificial mutation as long as it has Fc receptor binding activity.
  • a polypeptide encoded by a sequence that is hybridized under stringent conditions to the complementary strand of the nucleotide sequence described in positions 721 to 1413 in SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted into the sequence from position 241 to position 471 is also a structure of the present invention as long as it has Fc receptor binding activity. Contained in the Fc domain.
  • Such Fc domain variants are also It can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • Those skilled in the art can appropriately select the stringent hybridization conditions. For example, in a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 X SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10 X Denhardt's solution, 20 g / ml denatured salmon sperm DNA After prehybridization at 42 ° C, add a labeled probe and incubate overnight at 42 ° C for hybridization.
  • the cleaning solution and temperature conditions in the subsequent cleaning are about ⁇ lxSSC, 0.1% SDS, 37 ° C '', and more severe conditions are about ⁇ 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C ''.
  • a polypeptide encoded by a polynucleotide isolated using such a hybridization technique usually has high homology in amino acid sequence with the Fc domain.
  • High homology means at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably at least 95% or more, more preferably at least 97% or more ( For example, 98 to 99%) sequence homology.
  • the identity of the amino acid sequence is determined, for example, by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1 993 by Karlin and Altschul. ) Can be determined.
  • BLASTX a program called BLASTX (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990).
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are publicly known and are fcO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
  • a technique for artificially preparing an Fc domain mutant by artificially introducing a mutation into the Fc domain is also well known to those skilled in the art.
  • the Fc domain mutant is obtained by subjecting the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 to a gene modification method such as a PCR mutation introduction method or a cassette mutation method, and introducing mutations site-specifically or randomly. Can be artificially prepared. Alternatively, it is also possible to synthesize a sequence obtained by introducing a mutation into the base sequence described in SEQ ID NO: 3 using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • the oligopeptide serving as the spacer may be omitted, but it is desirable to have it.
  • a combination of glycine and serine is often used as a spacer [Journal of Immunology, 162, 6589 (1999)].
  • a spacer of the present invention as shown in the Examples, a spacer (SEQ ID NO: 48) in which 4 glycines and 1 serine are combined, or the above sequence is repeated twice (SEQ ID NO: 49). ) Or three times (SEQ ID NO: 50) linked spacers can be used.
  • the spacer is not limited to these arrangements, and may have any structure as long as the bending of the hinge portion to which the spacer is connected is not prevented.
  • LINKER Xue F, Gu Z, Feng JA.
  • LINKER a web server to generate peptide sequences with extended conformation., Nucleic Acids Res. 2004 Jul l ; 32 (Web Server issue): W562-5.
  • the structure of the present invention enables enhancement of the effector activity of an antibody by linking to the heavy chain C-terminus of the antibody.
  • the structure of the present invention has a force capable of connecting any number, such as one, two, three, four, five, etc., preferably one or two. That is, the antibody variant to which the structure of the present invention is linked can have any number of Fc domains of 2 or more, and the number of Fc domains in the antibody variant is 2 or 3. In Examples, it was confirmed that an antibody variant in which two structures of the present invention were linked showed higher ADCC activity than an antibody variant in which one structure of the present invention was linked.
  • the antigen recognized by the antibody to which the structure of the present invention is linked may be any antigen, regardless of its type. That is, the variable region of the antibody variant of the present invention may recognize any antigen.
  • the variable region of mouse monoclonal antibody 1F5 against CD20 a human B lymphocyte antigen, was used as the variable region of the H chain and L chain of the antibody variant [Non-patent Document 14].
  • CD20 is a protein composed of 297 amino acids with a molecular weight of 33-37 kilodaltons and is strongly expressed in B lymphocytes.
  • variable region of the antibody variant of the present invention is not limited to the 1F5 variable region. Since the Fc domain is physically separated from the Fab domain and the Fc domain activity is considered to be hardly affected by the type of Fab domain, any antibody variable region other than 1F5 can be used in the antibody variant of the present invention.
  • the variable region of an antibody against any antigen other than CD20 can be used as the variable region of the antibody variant of the present invention.
  • the therapeutic effect of an antibody can be enhanced by enhancing the effector activity exhibited by the Fc domain of the antibody regardless of the antigen binding activity.
  • it is required to enhance the binding activity to the Fc receptor.
  • affinity x valence avidity.
  • Natural IgG antibody Has a single Fc and a valence of 1 regardless of the number of Fc receptors on the effector cell surface.
  • the immune complex binds to the effector cells in a multivalent manner.
  • valence is ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ depending on the structure of the immune complex.
  • cancer cells there are multiple antigens on the cell surface, and antibodies bind to them and bind to the Fc receptors of effector cells in a multivalent manner.
  • antigens on cancer cells are often less dense, and antibodies that bind to them have a lower valency with Fc receptors. For this reason, ADCC activity cannot be fully exerted, and therapeutic effects are not sufficient [Golay, J. et al., Blood, 3900, (2000)]. Therefore, multiple Fc domains can be linked in series to one antibody molecule to allow multivalent binding to Fc receptors. As a result, the binding activity, ie avidity, between the antibody and the Fc receptor is enhanced. Furthermore, effector activity will be enhanced.
  • the present invention also provides a method for producing an antibody variant with enhanced effector activity.
  • the method of the present invention allows the production of a novel chimeric antibody variant by a novel combination of a different antibody variable region and an antibody constant region derived not only by enhancing the effector activity of a naturally occurring antibody or an existing chimeric antibody. Also make it possible. Furthermore, it may be an antibody variant having a novel constant region capable of combining the CH1 domain and two or more of the above-mentioned Fc domain variants.
  • the human CH1 domain base sequence is shown from position 430 to position 720 of the heavy chain base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • variable region and constant region DNAs of heavy chain (H chain) and light chain (L chain) are prepared and linked by genetic engineering technology to express the antibody variant of the present invention. explain.
  • variable region sequence can be prepared, for example, as follows. First, the target antibody is expressed, and then a high-pridoma is prepared, and a cDNA library is also prepared for the antibody gene transfer cell force, and the target variable region DNA is cloned.
  • the DNA structures [LVH] and [LVL] in which the antibody leader sequence L is linked are constructed upstream of the variable region VH of the heavy chain and the variable region VL of the light chain.
  • the constant region of the antibody first prepares a cDNA library of human lymphoid tissue such as human myeloma cells and tonsils. Is it a partial sequence of 5 'end and 3' end of constant region of H chain and L chain? Amplification by a known nucleic acid amplification method such as polymerase chain reaction (PCR method) using the designed primers, and the H chain constant region: [CH1-Fc] cDNA fragment and L chain constant region: [CL] Obtain a cDNA fragment, insert it into a vector, and clone it.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • a DNA structure [LVL-CL] in which LVL and CL are linked is constructed.
  • the DNA structure [LVL-CL] prepared in the example (leader sequence, V region of 1F5 and C region of human L ⁇ chain) is encoded by SEQ ID NO: 1, and the DNA structure encodes The amino acid sequence to be shown is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the H chain to which the structure of the present invention is linked (H chain variant) and the H chain to which the structure of the present invention is not linked are constructed as follows.
  • the DNA structure of the H chain with one Fc (the H chain to which the structure of the present invention is not linked) is the DNA structure [LVH] and the DNA structure [C Hl-Fc domain-termination codon] Can be produced by linking.
  • the DNA sequence of the H chain DNA structure, which is one Fc prepared in the example, is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence encoded by the DNA structure is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the DNA structure of the H chain in which two Fc are connected in series (the H chain in which one structure of the present invention is connected) is the DNA structure [LVH], the DNA structure [CHI — Fc (end codon None)] and a DNA construct [spacer Fc—termination codon].
  • the DNA sequence of the H chain DNA structure in which two Fc prepared in Example are connected in series is represented by SEQ ID NO: 5 (no spacer), 7 (GGGGS (G4S is shown as a spacer. Sequence) Number: 48) Force 1), 9 (2 G4S as the spacer), 11 (3 G4S as the spacer), the amino acid sequence encoded by the DNA structure is SEQ ID NO: 6 (no spacer), 8 (1 G4S as the spacer), 10 (2 G4S as the spacer), 12 (3 G4S as the spacer).
  • the DNA structure of the H chain in which three Fc are connected in series is the DNA structure [LVH], the DNA structure [CHI- Fc (end codon None)], DNA structure [Spacer Fc— (No stop codon)], DNA structure [Spacer Fc—Stop codon].
  • the DNA sequence of the DNA structure of the H chain in which 3 Fc prepared in the example are connected in series is SEQ ID NO: 13 (no spacer), 15 (one G4S as a spacer), 17 (spacer)
  • the amino acid sequences encoded by the DNA constructs are listed in SEQ ID NOs: 14 (no spacer), 16 (spacer) and 2 (4 G4S as spacer) and 19 (3 G4S as spacer). 1 (G4S as a spacer), 18 (G4S power as a spacer), 20 (3 G4S as a spacer).
  • (Iv) 4 or more Fc connected in series In the case of the H-strand DNA construct, the number of DNA constructs [spacer Fc— (no termination codon)] should be increased in the same manner as in the case of three Fc.
  • the L-chain DNA structure and the H-chain variant DNA structure prepared as described above are cloned, and then inserted into an expression vector together with a promoter and an enzyme regulatory region. Alternatively, it may be inserted into an expression vector already provided with a control region.
  • Usable expression vectors include CAG promoter vector [Gene, Cliff, 193 (1991)], pcDNA vector [Immunology and Cell Biology, 75, 515 (1997)], etc. Any expression vector that is compatible with the host cell to be used may be used.
  • the intermediate force capable of expressing the glycoprotein can be appropriately selected.
  • the host cell can be selected from animal cells, insect cells, yeast, and the like. Specific examples include CH-DG44 cells [Cytotechnology, 9, 237 (1992)], COS-1 cells, COS-7 cells, or mouse 'myeloma cells NS0. Examples thereof include, but are not limited to, rat myeloma cells YB2 / 0 that can produce antibody molecules having a sugar chain.
  • the recombinant host cell is cultured, and the antibody variant is purified from the culture supernatant.
  • various media can be used, but a serum-free medium is preferable from the viewpoint of antibody purification.
  • ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography or high-performance liquid chromatography (HPLC) in which protein A, which has selective binding to antibodies, is immobilized.
  • the protein other than the antibody variant and fragments or aggregates of the antibody variant are removed by a known purification method such as the above, and the desired antibody variant is purified.
  • the binding activity to various Fc receptors can be measured by an enzyme antibody method using a recombinant Fc receptor extracellular domain.
  • extracellular domains of Fcy RIA, Fcy RIIA, Fcy RIIB, and Fcy RIIIA are prepared as receptors for human IgG. The sequences of these receptors are known and entered from GenBank with the following Accession No. It is possible.
  • Human Fc y RIA NM—000566, human Fc ⁇ RIIA: NM—022162, human Fc RIIB: N M — 001002273, human Fe y RIIIA: NM — 000569. These receptors are immobilized on a 96-well plate for the enzyme antibody method, and antibody variants with variable concentrations are reacted to react with anti-HgG antibodies labeled as secondary antibodies. Based on the signal, the amount of antibody variant bound to the receptor is measured.
  • FcyRIIIA has a known genetic polymorphism [Journal 'Ob' Tari-Cal 'Investigation (Journal of Clinical Investigation), 100, 1059 (1997)]. A receptor in which the 158th amino acid is palin and a receptor that is fulleranin were used.
  • the ADCC activity of the antibody variant can be measured using effector cells and target cells.
  • the effector cells for example, mononuclear cells isolated from healthy human peripheral blood can be used.
  • target cells Ramos cells or Raji cells, which are cells expressing CD20 antigen, can be used.
  • effector cells After reacting the target cells with serially diluted antibody variants, effector cells are added.
  • the ratio between the number of effector cells and the number of target cells can be within a range of 10: 1 to 100: 1, and preferably a ratio of 25: 1.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • CDC activity for example, as shown in the Examples, after reacting a serially diluted antibody variant to target cells, add Baby's rabbit fresh serum as a complement source to evaluate the cytotoxic activity. can do. Since serum containing LDH is used, cytotoxic activity is evaluated by measuring the number of viable cells with Alamar Blue.
  • the modified antibody obtained by the method of the present invention exhibits not only the above-described enhancement of the effector activity in vitro but also the enhancement of cellular immunity based on the enhancement of effector activity in vivo. It is thought to contribute to the treatment of diseases that can be improved by immunity.
  • the antibody variant of the present invention can be administered by an appropriate administration route and dosage form depending on the type of disease, patient age, symptoms and the like.
  • the antibody variant of the present invention can be formulated by a known formulation technique, and can be used as a drug together with instructions describing efficacy and effects and precautions for use.
  • additives such as pharmaceutically acceptable excipients, stabilizers, preservatives, buffering agents, suspending agents, emulsifiers, solubilizing agents, etc.
  • it is formulated with polysorbate 80, sodium chloride sodium, sodium quenate, anhydrous citrate, etc. to prepare an injection, prepared with saline or glucose injection, and administered by intravenous infusion.
  • the dose can be adjusted according to factors such as the age and weight of the patient. For example, a 10 to 10000 mg / m 2 as a single dose of intravenous infusion, preferably in the 50 to 5000 mg / m 2, more preferably at 100 to 1000 mg / m 2, these It is not limited.
  • Example 1 Construction of expression vector pCAGGSl-neon-L / ant CD20 LC (Light Chain) (1-1) Preparation of pEGFP-Nl / VL vector (Fig. 1-1-A)
  • Mouse Hyperidoma 1F5 RPMI1640 containing 10% inactivated urine fetal serum, lOOU / mL penicillin, 100 / z g / mL streptomycin (Sigma Aldrich), 37 ° C, 5% CO
  • Oligo dT primer (5, — CGAGCTCGAGCGGCCGCTTTTTTT TTTTTTTTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 21)) was added to 10 ⁇ g of total RNA, and diethylpyrocarbonate (DEPC) -treated water was added to make a total of 12. After incubating at 72 ° C for 2 minutes to destroy RNA conformation, it was quickly transferred onto ice and incubated for 3 minutes.
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • L TE (ImM EDTA, lOmM Tris—HCl (pH 8.0)) was added to prepare a 100 / zL cDNA solution.
  • 10 M forward 'primer (includes Nhel site (underlined), 5-, TCGTCTAGGCTA GCATTGTTCTCTCCCAGTCTCCA-3 (SEQ ID NO: 22)) 2 ⁇ 10 M reverse 'primer (including Xhol site (underlined), 5, -GCTTGAGACTCGAGCAGCTTGGTC CCAGCAC CGAA-3, (SEQ ID NO: 23)) 2 1F5-derived cDNA 2 ⁇ L, 5U / ⁇ L Expand High Fidelity PLUS PCR System (Roche) 0.2 ⁇ L was mixed, and PCR was performed under the following conditions.
  • the DNA fragment was treated with Nhel (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) at a final concentration of 0.8 U / L and 0.5 U / ⁇ L Xhol (manufactured by Takara Bio Inc.), and similarly treated pEGFP-Nl (manufactured by BD Biosciences) 50 ng, Ligation was performed for 30 minutes at room temperature using 1.5 U T4 DNA ligase (Promega). To the reaction solution, 100 ⁇ L of E. coli complex cell DH5a prepared by the salt-potassium potassium method was added, reacted on ice for 30 minutes, and then heat shocked at 42 ° C for 45 seconds.
  • positions 13 to 57 in SEQ ID NO: 24 are leader sequences) 2 / z L, 10 M reverse' primer (Xh 5, including -ol site (underlined), 5, -GCTTGAGACTCGAGCAGCTTGGTCCCAGCACCG AA-3 '(SEQ ID NO: 25)) 2 pEGFP-Nl / VL 100 ng prepared in (1) as a template, 5 U / ⁇ L Expand High Fidelity PLUS The PCR system was mixed with 0.2 ⁇ L, sterilized MilliQ water was added so that the total volume was 20 ⁇ L, and PCR was performed under the following conditions.
  • the DNA fragment was treated with Nhel at a final concentration of 0.8 U / ⁇ L and 0.5 hol / ⁇ L of Xhol, and 50 ng of pEGFP-Nl treated in the same manner and 1.5 U of T4 DNA ligase at room temperature. Ligation for minutes.
  • 100 L of E. coli competent cell DH5a was added, reacted on ice for 30 minutes, and then heat shocked at 42 ° C for 45 seconds. After 2 minutes on ice, lmL of SOC medium was removed, transferred to a test tube, and incubated at 37 ° C for 2 hours with shaking.
  • Human myeloma R PMI8226 is cultured in RPMI 1640 containing 10% inactivated fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, 100 g / mL streptomycin, at 37 ° C and 5% CO.
  • Both DNA fragments were purified by phenol / chloroform extraction and isopropyl alcohol precipitation. Restricted enzyme-treated pEGFP-Nl / LVL (50 ng) and the excised human CL region gene were mixed and ligated with 1.5 U T4 DNA ligase at room temperature for 30 minutes. To the reaction solution, 100 ⁇ L of E. coli competent cell DH5 a was added and reacted on ice for 30 minutes, followed by heat shock at 42 ° C. for 45 seconds. Place on ice for 2 minutes, add lmL of SOC medium, transfer to a test tube and incubate at 37 ° C for 2 hours. .
  • pCAGGSl-neoN into which the spacer was inserted was selected from the resulting mouthpiece, and this vector was designated as pCA GGS1-neoN-L.
  • pCA GGS1-neoN-L the restriction enzyme sequence was 5'-Sal ⁇ Nhe and BamHI-EcoRI-Aflll-Sail-3 '.
  • pCAGGSl-neoN-L was treated with Nhel and Aflll under the same conditions. Both DNA fragments were purified by phenol / chloroform extraction and isopropyl alcohol precipitation.
  • the restriction enzyme-treated pCAGGSl-neoN-L (50 ng) and the excised Anti-CD20 L Chain gene were mixed and ligated with 1.5 U T4 DNA ligase at room temperature for 30 minutes.
  • Escherichia coli competent cell DH5a 100 L was added to the reaction solution, reacted on ice for 30 minutes, and then heat shocked at 42 ° C for 45 seconds.
  • Example 2 Construction of expression vector pCAGGSl-dhfrN-L / anti-CD20 HC (Heavy Chain)
  • the DNA fragment was treated with Sail (Toyobo) and 1.0U / ⁇ L Hindlll (New England Biolabs) at a final concentration of 0.5 U / ⁇ L, and similarly treated pBluescriptll 50 ng and 1.5 U T4 DNA ligase Ligation was performed for 30 minutes at room temperature.
  • Escherichia coli competent cell DH5 a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to react on ice for 30 minutes, followed by heat shock at 42 ° C for 45 seconds. After placing on ice for 2 minutes, the whole amount was spread on an LB medium plate containing 100 g / mL ampicillin. After culturing at 37 ° C for 1 cm, the resulting colony force VH region gene DNA was inserted !, and one was selected, and this vector was designated as pBluescriptll / VH.
  • Escherichia coli competent cell DH5 a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes, and then subjected to heat shock at 42 ° C. for 45 seconds. After being placed on ice for 2 minutes, the whole amount was plated on an LB medium plate containing 100 g / mL ampicillin. After culturing at 37 ° C for 1 cm, the resulting colony strength was inserted with the DNA of the VH region gene to which the leader sequence was added! The vector was selected, and this vector was designated as pBluescriptll / LVH.
  • This DNA fragment was purified by phenol / chloroform extraction and isopropyl alcohol precipitation.
  • the DNA fragment was treated with Hindlll at a final concentration of 1.0 U / ⁇ L and 0.5 U / ⁇ L Notl (manufactured by New England Biolabs), and similarly treated pBluescriptll 50 ng and 1.5 U of T4 DNA primer Ligation was performed for 30 minutes at room temperature.
  • Escherichia coli competent cell DH5 a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to react on ice for 30 minutes, followed by heat shock at 42 ° C for 45 seconds. After placing on ice for 2 minutes, the whole amount was spread on an LB medium plate containing 100 g / mL ampicillin.
  • the human IgG1 C region does not include the stop codon! / ⁇ Gene from CH1 domain to CH3 domain, including hinge and stop codon CH2 to CH3 domain gene, including hinge, including stop codon
  • the following procedure was performed to clone genes from the CH2 to CH3 domains.
  • 5 x buffer provided 4 x 2.5 mM dNTP 2 L, 10 ⁇ forward 'and reverse' primers 2 ⁇ L each, pBluescriptll / CH1-CH2-CH3-T 0.1 g ⁇ 5 U / ⁇ L as template Expand High Fidelity PLUS PCR System 0.2 ⁇ L was mixed and sterilized milliQ was added to make a total volume of 20 L.
  • the primers used are: Figure 3- (1) and (7) that amplify CHI-CH2-CH3, Figure 3- (3) to (6) and (2) that amplify SP-CH2-CH3-T, or There are 13 combinations of (8) to (11) and (2), and the combination of (3) to (6) and (12) that amplifies SP-CH2-CH3.
  • a spacer a force spacer using a flexible glycine serine spacer of 0, 5, 10, and 15 amino acid residues (aa) with 4 glycine and 1 serine as a basic unit, totaling 5 amino acids.
  • One type is not particularly limited, and any type can be used as long as it is a general-purpose peptide spacer (SP).
  • a (EAAAK) nA (SEQ ID NO: 63) is known (in parentheses indicates a repeated sequence, and n indicates the number of repetitions.
  • a rai R et al. Protein Engineering 14, 529-532 (2001)).
  • PCR was carried out under the conditions that 3 steps of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 60 seconds were repeated 12 times.
  • the reaction mixture was electrophoresed using 1% agarose STANDARD 01 gel.
  • the DNA fragment from the CH1 domain to the CH3 domain was approximately 0.99 kbp, and the DNA fragment from the CH2 domain containing the peptide spacer sequence to the CH3 domain was approximately 0.74.
  • the kbp band was collected using a record chip. This is done by phenol / chloroform extraction and isopropyl alcohol precipitation. The DNA fragment was purified.
  • Both DNA fragments were purified by phenol / chloroform extraction and isopropyl alcohol precipitation.
  • the restriction enzyme-treated pBluescriptll / CH1-CH2-CH3-T (50 ng) and the excised LVH gene were mixed and ligated with 1.5 U T4 DNA ligase for 30 minutes at room temperature.
  • Escherichia coli competent cell DH5 a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes, and then subjected to heat shock at 42 ° C for 45 seconds. After 2 minutes on ice, the whole amount was spread on LB medium plates containing 100 / z g / mL ampicillin.
  • the restriction enzyme-treated pBluescriptII / CHl-CH2-CH3 (50ng) and the excised LVH gene were mixed and ligated for 30 minutes at room temperature using 1.5U T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli competent cell DH5a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to react on ice for 30 minutes, followed by heat shock at 42 ° C for 45 seconds. After 2 minutes on ice, the whole amount was spread on LB medium plates containing 100 g / mL ampicillin. Cultivate at 37 ° C for 1 mm, and select from the resulting colonies the inserted VH region gene with added leader sequence and the DNA of the HHGG 1 H chain CH1-CH2-CH3 region gene.
  • the vector was pBluescriptll / LVH—CHI—CH2—CH3.
  • Both DNA fragments were purified by phenol / chloroform extraction and isopropyl alcohol precipitation. Restricted enzyme-treated pBluescriptll / SP-CH2-CH3-T (50 ng) and the excised LVH-CH1-CH2-CH3 gene were mixed and ligated with 1.5 U T4 DNA ligase at room temperature for 30 minutes. Escherichia coli competent cell DH5a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to react on ice for 30 minutes, followed by heat shock at 42 ° C. for 45 seconds. After 2 minutes on ice, the whole amount was spread on an LB medium plate containing 100 g / mL ampicillin. Cultivate at 37 ° C for 1 mm.
  • the anti-CD20 HC Fc Monomer gene was recovered with an about 0.82 kbp insert, and the Anti-CD20 HC Fc Dimer gene was approximately 2.16 kbp. Ant and the CD20 HC Fc Trimer gene was approximately 2.90 kbp.
  • pcDNA3.1 / Zeo vector was treated with a final concentration of 0.5 U / ⁇ L Xhol and 0.5 U / ⁇ L Not. Both DNA fragments were purified by phenol / chloroform extraction and isopropyl alcohol precipitation. Restricted enzyme-treated pcDNA3.1 / Zeo (50 ng) and the excised Anti-CD20 HC gene were mixed and ligated with 1.5 U T4 DNA ligase at room temperature for 30 minutes.
  • Escherichia coli competent cell DH5a100 / zL was added to the reaction solution, reacted on ice for 30 minutes, and then subjected to heat shock at 42 ° C for 45 seconds. After being placed on ice for 2 minutes, the whole amount was spread on an LB medium plate containing 100 g / mL ampicillin.
  • sense DNA GTCGACGCTAGCAAGGATCCTTGAA TTCCTTAAGG (SEQ ID NO: 46)
  • antisense DNA GTCGACCTTAAGGAATTCAAGGATCCTTGCTAGCG (SEQ ID NO: 47)
  • sense DNA GTCGACGCTAGCAAGGATCCTTGAA TTCCTTAAGG (SEQ ID NO: 46)
  • antisense DNA GTCGACCTTAAGGAATTCAAGGATCCTTGCTAGCG (SEQ ID NO: 47)
  • Escherichia coli competent cell DH5a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to react on ice for 30 minutes, followed by heat shock at 42 ° C. for 45 seconds. After 2 minutes on ice, the whole amount was spread on an LB medium plate containing 100 g / mL ampicillin. After culturing at 37 ° C for 1 mm, pCAGGSl-dhfrN into which a spacer was inserted was selected from the resulting colonies, and this vector was designated as pCAGGSl-dhfrN-.
  • Escherichia coli competent cell DH5 a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes, and then subjected to heat shock at 42 ° C. for 45 seconds. After being placed on ice for 2 minutes, the whole amount was plated on an LB medium plate containing 100 g / mL ampicillin. Cultivate at 37 ° C for 1 mm, and select the colonies with Anti-CD20 HC gene inserted from the resulting colonies, and use these vectors as pCAGGSl-dhfrN-L / Anti-CD20 HC Fc Monome r (Fig. 2).
  • Example 3 Selection of cell clones expressing antibody variants from G418 and MTX resistant cells (3-1) Production of transformants
  • the plasmid pCAGGSl-neoN-L / Anti-CD20 LC prepared in Example 1 and the plasmid pCAGGSl-dhfrN-L / Anti-CD20 HC prepared in Example 2 were mixed with Pvul (Toyobo Co., Ltd.) at a final concentration of l.OU / L. Made into a chain.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of M: Fc monomer, D: Fc dimer, and T: Fc trimer.
  • D and T also produced variants with different spacers.
  • the sequence of Glycine-Glycine-Glycine-Glycine-Serine (GGGGS) as one unit of spacer, 0 spacer, 1 (SEQ ID NO: 48), 2 (SEQ ID NO: 49), 3 ( D and T having SEQ ID NO: 50) were prepared. They are named D0, D1, D2, D3, T0, Tl, ⁇ 2, and ⁇ 3 (hereinafter abbreviations are used for nine types of antibodies and their variants).
  • the antibody concentration in the culture supernatant was measured by enzyme antibody (ELISA) method.
  • BSA manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • the A450 was measured using a microplate reader (BIO-RAD Model 550).
  • Quantity lOO / z L / well 16 days after re-seeding the antibody concentration in the culture supernatant was measured for one colony formed in one well. 12 wells with high A450 strength were selected, trypsinized, and then seeded on a 24-well multiplate with selective medium (medium Ground volume lmL / well). After Konfuruento performs measurement of antibody concentration in the culture supernatant again, select the 6 Ueru A45 0 was high, after trypsinization and seeded in 6-well multiplate (culture volume 4mL / W ell).
  • the antibody concentration in the culture supernatant was measured again, and 3wells with high A450 were selected, trypsinized, and then seeded separately in a 10 cm dish (FALCON3 53003) (medium volume 10 mL). Of these, one clone was conditioned to serum-free and the other two clones were stored frozen.
  • Confluent cells in 10 cm dishes are trypsinized and contain 2.5 mL of CD CH 0 Medium (GIBCO), 10% urine fetal serum, 100 U / mL penicillin, 100 / zg / mL streptomycin 7.5 mL of IMDM, and suspended so as to 2Xl0 6 in a mixed medium of total 10 mL, and plated in 10cm dishes (mixing ratio 25%: 75%).
  • the cells were considered to have acclimated to the mixed medium, and thereafter, the mixing ratio of CD CHO Medium and 10% urine fetal serum 1 ⁇ ⁇ ⁇ 1 was changed to 50%: 50%, 75%: 25%, 90%: It was subcultured while changing to 10%.
  • Example 4 Mass culture of antibody-producing cells and purification of expressed antibody
  • CD CHO Medium Mixture ratio of IMDM containing 10% urinary fetal serum is 90%: 10% so that the number of antibody-expressing cells produced in Example 3 is 10 6 per 15 cm dish. A total of 7 seeds were seeded (medium amount 20 mL). After confluence, discard the medium, wash 3 times with 20 mL of PBS, add 30 mL of CD CHO Medium, and maintain at 37 ° C and 8% CO concentration for 10 days.
  • the culture supernatant of antibody-producing cells was collected in four 50 mL cocal tubes, centrifuged at 3000 g for 30 minutes, and collected in an Erlenmeyer flask so as not to remove the pellet. After equilibrating 5 mL of PBS through a column packed with 1 mL of protein A agarose (Santa Cruz), all the culture supernatant was passed through. The column was washed through 5 mL of PBS to remove non-specific adsorbate, and then 0.1 mL of 0.1 M glycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with pH 2.7 was passed through 3 mL of hydrochloric acid eluate, and 300 L was collected per fraction. .
  • the collected eluate was immediately charged with Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 'hydrochloric acid neutralized solution 30 ⁇ L at pH 9.0; ⁇ , 3 ⁇ 4 s. sodium dodecyl sulfate— polyacrylamide gel electrophore sis (SDS-PAGE), CBB staining (BIO-RAD, BIO-Safe Coomassie) was performed and quantified using the electrophoresis analysis program Image J (National Institutes of Health, USA). The difference was that 2-4 ⁇ g of antibody was obtained from 1 mL of medium.
  • the antibody was secondarily purified by an HPLC system (manufactured by JASCO Corporation) using Protein Pak 300SW (manufactured by Waters) as a column.
  • the eluent 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 containing 0.15M sodium chloride
  • RTX Reni Pharmaceutical Co., Ltd., molecular weight: 145 kDa
  • a 10% polyacrylamide gel was prepared with the following composition.
  • MilliQ water 1.9 mL, 30% acrylamide (29% acrylamide (Wako Pure Chemical Industries), 1% ⁇ , ⁇ '-methylene bisacrylamide (Wako Pure Chemical Industries)) 1.7 mL, pH 6.8 0.5 M Tris- HC1 buffer 1.3 mL, 10% SDS (Wako Pure Chemical Industries) 50 / z L, APS (Wako Pure Chemical Industries) 50 L, TEMED (Wako Pure Chemical Industries) 3 L are mixed and immediately aired on the gel plate Poured so as not to enter. MilliQ water (0.5 mL) was overlaid and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Trans-Blot SD SEMI-DRY TRANSFER CELL put two sheets of filter paper soaked in Tran sfer buffer, put PVDF membrane and gel in this order, and then soaked in Trans nsfer buffer The two were stacked, and Western blotting was performed at a constant current of 0.2A for 30 minutes. After plotting, the PVDF membrane was immersed in a PBST solution containing 5% skim milk (manufactured by Snow Brand Co., Ltd.) and blocked at 4 ° C.
  • PVDF membrane is sandwiched between bull sheets, 0.13 ⁇ g / mL HRP-labeled goat anti-hig HgG (H + L) (Chemicon) and 0.33 ⁇ g / mL HPR-labeled goat anti-human Kappa chain (Sigma Aldrich) And the mixture was shaken at room temperature for 2 hours. The operation of removing the PVDF membrane from the vinyl sheet and shaking the PBSDF for 5 minutes to wash the PVDF membrane was repeated three times. A PVDF membrane was sandwiched between bull sheets, and 1 mL of ECL Western blotting detection reaction and analysis system (manufactured by Amersham Biosciences) was covered. It was exposed to a dark room (? X film (Kodak) for 1 minute, placed in a Rendall solution (Fuji Film) until the band was confirmed, rinsed with tap water, and fixed with a force Renfix solution (Fuji Film). The result is shown in FIG.
  • Antibody molecules were analyzed by HPLC using Protein Pak 300SW.
  • the eluent 0.1 M phosphate buffer solution, pH 7.0 containing 0.15 M sodium chloride
  • the eluent 0.1 M phosphate buffer solution, pH 7.0 containing 0.15 M sodium chloride
  • Approximately 600 ng of each antibody was injected to obtain a chromatogram (FIG. 7).
  • the purified product of DO and D3 had two hinge parts and Fc domains in tandem.
  • the force that had only one tandem D1 and D2 were the main components. It was.
  • Ma had the force of three hinge parts and three Fc domains in tandem.
  • T1, T2 and T3 had three of them in tandem.
  • CD20 positive human Burkitt's lymphoma cells Ramos, using R PMI1640 containing 10% inactivated fetal bovine serum, ImM sodium pyruvate (Wako), lOUU / mL penicillin, 100 g / mL streptomycin at 37 ° C, Culturing was performed under 5% CO conditions.
  • Ramos cell culture medium at 600 g 5
  • FACS buffer PBS containing 0.1% BSA and 0.02% NaN
  • the cells were suspended in FACS Baffer 100 L containing g / mL FITC-labeled cap anti-human Kappa chain antibody (manufactured by Biosource International), and allowed to stand on ice for 30 minutes. The cells were washed as described above, suspended in 100 L FACS buffer, filtered through a mesh with a mesh size of 59 m, and transferred to a FACS tube. Fluorescence was measured using FACScan (manufactured by Becton Dickinson), and the CD 20 binding property of each antibody was analyzed (FIG. 8).
  • TACTAGGTTATTG -3 (SEQ ID NO: 51)) 1 L, 10 ⁇ reverse 'primer (including Notl site (underlined), 5, -ATTAATCAGCGGCCGCTCACGGGGATCCAACAG A T-3' (SEQ ID NO: 52)) 1 ⁇ L,
  • pGEX-2TK 100ng, 5U / ⁇ L Expand High Fidelity PLUS PCR System 0.2 ⁇ L was mixed, MilliQ water was added so that the total volume was 20 ⁇ L, and PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C for 2 minutes, the three steps of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds were repeated 10 times.
  • the reaction solution was electrophoresed using a 1% agarose ST ANDARD 01 gel, and a band of about 0.70 kbp was collected with a RECOCIP.
  • This DNA fragment was purified by phenol / chloroform extraction and isopropanol precipitation.
  • the DNA fragment was treated with a final concentration of 0.75 U / ⁇ L of Xbal and 0.5 U / ⁇ L of Notl and ligated for 30 minutes at room temperature using 50 ng of similarly treated pBluescriptll and 1.5 U of T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli competent cell DH5a 100 L was added to the reaction solution, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes, and then subjected to heat shock at 42 ° C. for 45 seconds.
  • Fcy RIA contains HindIII site (underlined), 5,-CCCCAAGCTTGCCGCCATGTGGTTCTTGACAACTC-3 , (SEQ ID NO: 53), Fc ⁇ RIIA: including Hindlll site (underlined), 5, -AACAAAAGCTTGCCGCCATGGAGACCC AAATGTCT-3, (SEQ ID NO: 54), Fc ⁇ RIIB: including Hindlll site (underlined), 5 ,-CC CCAAGCTTGCCGCCATGGGAATCCTGTCATTCT-3, (SEQ ID NO: 55), including Fc ⁇ RII IA: EcoRI site (underlined) 5, -ATATGAATTCGCCGCCATGTGGCAGCTGC TC-3, (SEQ ID NO: 56)) l / z L, 10 M Reverse 'Primer (Fe y RIA: contains HindIII site (underlined), 5,-CCCCAAGCTTGCCGCCATGTGGTTCTTGACAACTC-3 , (SEQ ID NO: 53), F
  • PCR was performed under the following conditions. That is, after the heat treatment at 95 ° C for 2 minutes, the three steps of 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds were repeated 10 times. Electrophoresis of the reaction solution using 1% agarose ST ANDARD 01 gel, Fc ⁇ RIA is about 0.88 kbp, Fc ⁇ RIIA is about 0.65 kbp, Fc ⁇ R ⁇ B is about 0.65 kbp, and Fc ⁇ RIIIA is about 0.73 kbp. The band was collected with a record chip. These DNA fragments were purified by phenol / chloroform extraction and isopropanol precipitation.
  • Fcy RIA was about 1.58 kbp
  • Fc ⁇ RIIA A band of about 1.35 kbp
  • FeyRIIB of about 1.35 kbp
  • Fc ⁇ RIIIA Fc ⁇ RIIIA of about 1.43 kbp
  • Escherichia coli competent cell DH5a100 / zL was added to the reaction mixture, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes, and then subjected to heat shock at 42 ° C for 45 seconds. After 2 minutes on ice, the whole amount was spread on LB medium plates containing 100 / z g / mL ampicillin. Cultivate at 37 ° C for 1 mm, and select colonies that have the FcyR / Gly-His-GST gene inserted from these colonies.
  • the sample was pcDNA3.1 / Zeo / FcyR / Gly—His—GST.
  • the pcDNA3.1 / Zeo / Fc ⁇ R ⁇ IA / Gly-His-GST vector prepared in m) is a V-type Fc ⁇ RIIIA
  • MilliQ water was added to and PCR was performed under the following conditions. That is, after heat treatment at 95 ° C for 2 minutes, three steps of 95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 8 minutes were repeated 14 times. After completion, 20 U // Z L of Dpnl was added to the reaction solution at 0.3 / z L and incubated at 37 ° C for 1 hour. Escherichia coli competent cell DH5a (100 ⁇ L) was added to the reaction mixture, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes, and then subjected to a heat shock at 42 ° C for 45 seconds.
  • a vector having a T sequence inserted was selected, and this vector was designated pcDNA3.1 / Zeo / Fc ⁇ R ⁇ IA (F) / Gly-His-GST.
  • Seed 293T in a 150mm cell culture dish to lxlO 7 and added at 37 ° C and CO concentration of 5%.
  • the culture supernatant was collected in a 50 mL cocal tube, centrifuged at 3000 g for 20 minutes, and collected in an Erlenmeyer flask so as not to remove the pellet.
  • a column packed with 1 mL of Ni-NTA agarose was equilibrated with 5 mL of Native Binding buffer, and then all the culture supernatant was passed through.
  • the column was washed through 5 mL of Native Wash buffer to remove non-specific adsorbate, and then passed through Native Elution buffer to collect 400 L per fraction. After SDS-PAGE, it was stained with BIO-Safe Coomassie and quantified using the migration analysis program Image J.
  • the binding strength of the variant is Tl, ⁇ 2, ⁇ 3> ⁇ 0, D3>D0> D1, D2> M.
  • Trimers is the next strongest Dimers, and M is the weakest. Trimers' Ab50 was about 100 times more open than that of M. Ab50 of D3 is about 60 times smaller than that of M.
  • T1, T2, and T3 with spacers showed stronger binding activity than TO without spacers. Dimers were stronger than D3 3 ⁇ 40. The reason why D1 and D2 are weak is that the standard contains more Monomers than Dimers.
  • the receptor binding activity of the variant was also in the order of Trimers) Dimers> M with respect to FeyRIIB. Even in this receptor, T1, T2, and T3 with spacers were stronger than TO without spacers. There was no difference between D3 and D0.
  • the Ab50 of T1, T2 and T3 was about 0.5 nM, that of D3 was about 5 nM and that of M was about 50 nM.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • the cells were resuspended by adding 20 mL of RPMI1640 medium, centrifuged again at 400 g for 10 minutes to pellet the cells, and the supernatant was discarded.
  • the cells were suspended in 30 mL of RPMI1640 medium and overlaid with 15 mL of Ficoll Pack Plus (Amersham) so that the interface was not disturbed. Centrifugation was performed at 400 g for 30 minutes, and the cloudy white layer formed between the plasma and the separated solution was transferred to another 50 mL cocal tube. Add 20mL RPMI1640 medium and centrifuge at 400g for 10 minutes did.
  • ADCC Assay buffer (RPI 1640 without phenol red, 1% urine fetal serum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES (pH 7.2), lOOU / mL penicillin, lOOmg / mL streptomycin), and centrifuging again at 400g for 10 minutes.
  • the pellet was confirmed and suspended in ADCC Assay buffer so as to be 5xl0 6 / mL, and this was used as PBMC suspension.
  • Ramos was suspended as a target cell in ADCC Assay buffer at 2xl0 5 / mL, and 50 ⁇ L was dispensed into 96-well round bottom multiplate (FALCON353077) (10 4 cells / well). Each antibody was serially diluted with ADCC Assay buffer, added to each plate in 50 L, and then incubated at 37 ° C under 5% CO for 30 minutes.
  • T1, T2, and T3 showed the strongest ADCC activity, followed by T0 and D3.
  • D1, D2 and M showed only a slight cytocidal activity at the highest antibody concentration.
  • Trastuzumab which does not bind to target cells, was completely non-cytotoxic.
  • CD20-positive human Burkitt lymphoma cells Ramos were prepared using RPMI1640 containing 10% inactivated fetal bovine serum, ImM sodium pyruvate, lOOU / mL penicillin, 100 / zg / mL streptomycin, 37 Cultivation was performed at 5 ° C under 5 ° C conditions.
  • Ra mos, RHB buffer Phenol Red free RPMI 1640 (Sigma Aldrich), 20 mM HEPES (pH 7.2) (Doujin Chemical), 2 mM L-Glutamine (Wako Pure Chemical Industries), 0.1% BSA , lOOU / mL penicillin, washed with 100 mg / mL streptomycin), and adjusted to so that such a 10 6 cells / mL, was dispensed into 96 Ueru flat bottom multiplate by 50 L min (5xl0 4 / well).
  • the RFU background is the RFU obtained from Velka et al. In which RHB buffer was added instead of the antibody in the step of adding the antibody.
  • the present invention provides a novel method for enhancing the effector activity of an antibody. By using this method, it is possible to provide a more effective antibody drug in a small amount by enhancing the effector activity, regardless of the binding activity of the antibody antigen. If an antibody having high affinity for an antigen specific to a target cell such as a cancer cell is selected and modified by this method, it can be expected that an antibody drug having a very high therapeutic effect can be obtained. In addition, existing antibody drugs that have already been treated can be modified more effectively.

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Abstract

　重鎖C末端にFcドメインが直列に複数個連結した抗体改変体、およびスペーサーを介してFcドメインが直列に連結した抗体改変体を作製し、Fc受容体に対する親和性、CDC活性、ADCC活性を測定した。Fcを複数連結してもCDC活性は増強されないとの報告があったにもかかわらず、本発明の改変体は増強されたADCC活性を示した。本発明の方法により、高い治療効果を有する抗体医薬の提供が可能になる。

Description

明 細 書
生物活性を強化した抗体改変体
技術分野
[0001] 本発明は、抗体のエフェクター活性を増強する方法、強力なエフェクター活性を有 する抗体改変体およびその製造法に関する。さらに詳しくは、主にエフェクター活性 である ADCC活性を増強する方法、強力な ADCC活性を有する抗体改変体およびそ の製造法に関する。
背景技術
[0002] 抗体は治療薬として広く利用されるようになった [非特許文献 1]。抗体が治療薬とし て利用可能になったのは、抗体に関わる多様な技術が発展したからに他ならない。 抗体を大量に作製する方法は、ケーラーとミルシュタイン（G. Kohlerと C. Milstein)が 開発した細胞融合法によって確立された [非特許文献 2]。また、遺伝子組換え技術の 進歩とともに、抗体遺伝子を発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入することによつ て大量生産することも可能になった [非特許文献 3]。
[0003] また、人間に投与した際に免疫原性を有さないように、ヒト由来の抗体分子に近づ ける工夫がなされてきた。例えば、マウス可変領域とヒト定常領域力も成るキメラ抗体 や [非特許文献 4]、マウス超可変領域とヒトフレームワークとヒト定常領域力も成るヒト 化抗体が開発されている [非特許文献 5]。これらの技術の開発により、抗体は癌、自 己免疫疾患、血栓症、炎症、感染症などの治療薬として実用化され、さらに多くの抗 体が臨床試験中である [非特許文献 6]。
[0004] 抗体医薬への期待が高まる中、抗体の活性が弱いために、がん、自己免疫疾患、 炎症、感染症などの治療効果が十分得られないケースや、あるいは、投与量が多く なることで患者のコスト負担も高くなるケースがある。そんな現状にあって、治療活性 の増強が抗体治療薬の重要な課題になって 、る。
[0005] 抗体医薬の作用として、一つには、その 2つの Fabドメインで疾患に関与している抗 原分子に結合することにより、治療効果を発揮することが挙げられる。例えば、腫瘍 壊死因子 (TNF)に対する抗体は、 TNFに結合して TNFの活性を阻害し、炎症を抑制 し、関節リウマチに治療効果を発揮する [非特許文献 7]。抗原分子に結合して、抗原 の活性を阻害することにより治療効果を発揮することから、抗原親和性が高い抗体ほ ど、少量で高い効果が期待できる。抗原結合親和性を強化するため、多くのモノクロ ーナル抗体の中から、同一抗原に対して高 、親和性を有するクローンを選択してくる 方法が広く行われている。また、遺伝子組換えによって改変体を作製し、その中から 親和性の高い改変体を選別する方法をとることもできる。
[0006] 他方、がん治療などを目的にする抗体医薬では、標的細胞であるがん細胞に対し て細胞障害作用を発揮することが重要である。標的細胞表面上の抗原に結合した抗 体は、その Fcドメインを介して、 NK細胞やマクロファージなどのエフェクター細胞表面 上に存在する Fc受容体に結合して、標的細胞を障害する。これを、抗体依存性細胞 介在性細胞障害（Antibody- dependent cellular cytotoxicity,以下、 ADCCと略す）と いう。また、抗体は、 Fcドメインを介して、補体を活性ィ匕することによって細胞を障害 する。これを補体依存性細胞障害（Complement-dependent cytotoxicity,以下、 CD Cと略す)という。細胞障害活性以外の抗体の作用として、感染微生物に結合した抗 体は、エフェクター細胞の Fc受容体に結合して、エフェクター細胞による感染微生物 の貪食や障害を仲介する作用も有する。こうした Fcドメインを介した抗体の活性を、ェ フエクタ一活性という。
[0007] ヒ HgGが結合する Fc受容体にはいくつか異なる分子種が存在する。 Fe y RIAは、マ クロファージゃ単球などの細胞表面に存在し、ヒ HgGに高い親和性を示す。 Fc y RII Aは、マクロファージゃ好中球などに存在し、 IgGに弱い親和性を示す。また、 Fc y RII Bは、 Bリンパ球、肥満細胞、マクロファージなどに存在し、 IgGに弱い親和性を有し、 抑制性シグナルをもたらす。 Fc y RIIIAは、ナチュラル 'キラー（NK)細胞やマクロファ ージなどに存在し、 IgGに弱い親和性を有し、 ADCC活性を発揮するのに重要である 。 Fe y ΠΙΒは、好中球に存在し、 Fe y RIIIAと同じ細胞外ドメインを有する力 GPIアン カーによって細胞表面に結合している。さらに、これらとは別に、 FcRnが小腸や胎盤 に存在し、 IgGの代謝に関与している。これらの Fc受容体に関しては、総説に記載さ れている [非特許文献 8]。
[0008] 抗体のがん治療活性を増強することを目的として、抗体のエフェクター機能を増強 する数々の試みがなされてきた。シールズ（R丄. Shields)らは、 Fcドメインを構成する C H2ドメインと CH3ドメインのアミノ酸を置換した多くのヒ HgGl抗体改変体を作製して、 Fc受容体への結合活性と ADCC活性を測定している [非特許文献 9]。その結果、多く の改変体は天然の IgGl抗体よりも低い結合活性を示した力 いくつかの改変体は、 A DCC活性の多少の増強が観察された。補体が結合する CH2ドメインのアミノ酸を置換 して CDC活性を増強する試みも報告されているが、補体 Clqの結合が増強されてい る力 CDC活性はむしろ減弱してしまった [非特許文献 10]。
[0009] IgGl抗体では、 Fcドメインに存在する 297番目のァスパラギンに糖鎖が結合しており 、この糖鎖の差異は、抗体のエフェクター活性に影響を与えることが知られている。シ ールズ（R丄. Shields)らは、その糖鎖の α 1,6—フコース（focose)が欠損している IgGl 抗体は、 Fc γ RI、 Fc γ RIIA、 Fc y RIIBおよび補体 Clqとの結合には大きな影響を与 えないが、 Fc y lllAとの結合活性が 50倍増強されたと報告した [非特許文献 11]。 Fc y RIIIAには遺伝子多型があり、 158番目のアミノ酸がパリン (Val)型とフエニルァラ- ン（Phe)型がある。これら多型のいずれにおいても、 α 1,6—フコース欠損 IgGl抗体 は Fc y lllAとの結合活性が増強されていた。また、 α 1,6—フコース欠損抗体は増強 された ADCC活性を示したことも報告されている [非特許文献 11]。シンカヮ (T.Shinka wa)らも同様の結果を発表している [非特許文献 12]。
[0010] テルフォード (S.G.Telford)は、複数の Fc領域を有する抗体が改善された Fc活性を 有すると主張している [特許文献 1]。テルフォードは、抗 鎖である Fabおよび抗 CD19 である Fabのへテロ 2価 Fabを有し、化学合成のリンカ一を介して 2つの Fc領域が横に 共有結合された抗体改変体を作成し、 ADCC活性の測定を行っている。しかし、ター ゲット細胞表面に CD19と 鎖の双方が発現していることを考えると、テルフォードが 観察した ADCC活性の上昇は、 Fc領域が複数あることによる効果以外に、ヘテロ 2価 Fabによって、抗体改変体が効率的にターゲット細胞に結合した効果によるものと考 えられる。テルフォードは、 ADCC活性増強の原因からヘテロ 2価 Fab効果を排除する ための検討を行って 、な 、ため、 Fc領域増加が Fc活性増強の原因であった力どうか は定かでない。そのため、 Fc領域を複数有する抗体改変体であってもテルフォード の改変体とは異なる構造である改変体を作製した場合に、その改変体が改善された Fc活性を有するかどうかは、全く予想できな 、。
[0011] 一方、グリーンウッド (J.Greenwood)は、 Fc部分がタンデムに連結した抗体改変体を 作製し、その CDC活性を比較検討している [非特許文献 13]。予想に反し、いずれの 改変体も CDC活性が減弱していた。またグリーンウッドは、各種抗体改変体の ADCC 活性につ!、て検討して!/、な!/、。
以上のように、抗体のエフェクター活性を増強する試みが続けられてきた力 いず れの試みも、満足できる結果を与えて 、るとは言えな 、。
[0012] 特許文献 1：特許第 2907474号、特表平 4-504147、 WO90/04413
非特許文献 l:Brekke OH. et al.,ネイチヤ^ ~·レビュ^ ~·ドラッグ 'ディスカバリー（Nat ure Review Drug Discovery) ,2, 52 (2003)
非特許文献 2:Kohler G. et al.,ネイチヤー（Nature) 256, 495(1975)
非特許文献 3:Carter P. et al.,ヌクレイック'アシッド'リサーチ（Nucleic Acid research
), 13, 4431(1985)
非特許文献 4:Boulianne GL et al.,ネイチヤー（Nature) , 312, 643(1984) 非特許文献 5: Jones PT. et al.,ネイチヤー（Nature) , 321, 522(1986)
非特許文献 6:Reichert JM. et al.,ネイチヤー'バイオテクノロジー（Nature Biotechno logy), 23, 1073(2005)
非特許文献 7:Lipsky PE. et al.,ニューイングランド 'ジャーナル'ォブ 'メデイシン（Ne w England Journal of Medicine), 343, 1594(2000)
非特許文献 8:Takai T.ネイチヤー 'レビュー'イミュノロジー（Nature Review Immunog logy), 2, 580(2002)
非特許文献 9: Shields RL. et al.,ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー（Jour nal of Biological Chemistry) , 276, 6591(2001)
非特許文献 10:Idusogie EE. et al.,ジャーナル'ォブ 'イミュノロジー（Journal of Immu nology) , 166、 2571(2001)
非特許文献 11: Shields RL. et al.,ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー（Jou rnal of Biological Chemistry) , 277, 26733 (2002)
非特許文献 12:Shinkawa T. et al.,ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー（Jo urnal of Biological Chemistry) , 278, 3466, (2003)
非特許文献 13 : Greenwood J. et al"セラピューティック'イミュノロジー（Therapeutic Immunology) , 1, 247 (1994)
非特許文献 14 : Oettgen HC. et al.,ハイプリドーマ（Hybridoma) 2, 17 (1983) 非特許文献 15 : Huhn D. et al"ブラッド（Blood) , 98, 1326 (2001)
非特許文献 16 : Press OW. et al.,ブラッド（Blood) , 69, 584, (1987)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しょうとする課題は 、抗体分子の構造を改変することによってエフェクター活性を増強する方法、特に AD CC活性を増強する方法を提供することである。また同時に、活性が増強された抗体 改変体の製造方法、あるいは抗体改変体を提供することである。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは上記課題を解決すベぐ鋭意努力した。上記知見にもかかわらず、本 発明者らは Fc部分を直列に連結した抗体改変体を作製し、抗体改変体のェフエクタ 一活性を検討した。驚いたことに、 Fc部分をタンデムに連結した抗体改変体は、天然 の抗体よりも、 ADCC活性が顕著に増強されていることが確認された。従来の知見に よれば、 Fcが横に連結された抗体改変体の ADCC活性増強がヘテロ 2価 Fab効果で ある可能性が排除できず、さらにタンデムに連結された抗体改変体の CDC活性が減 弱したことを考えると、本発明の改変体の効果は予想外である。また、 Fc領域を 3つ 有する抗体改変体は、 2つ有する改変体よりもさらに増強された ADCC活性を示した 。本発明者らの抗体改変体の増強された ADCC活性は、タンデムに連結された Fc領 域個数と相関関係があると推察される。本発明者らは、抗体に Fcドメインを直列に連 結することによって抗体のエフェクター活性を増強可能であることを実証し、本発明を 完成させた。
[0015] すなわち本発明は、 Fcドメインを直列に連結することにより抗体のエフェクター活性 を増強する方法に関し、より具体的には以下の発明を提供するものである。
(1) 抗体の重鎖 C末端に、 Fcドメインを含む構造物を 1個または複数個直列に連結 することを特徴とする、抗体のエフェクター活性を増強する方法、
(2) 上記構造物が、 Fcドメインの N末端側にスぺーサーポリペプチドを有する構造 物である、上記（1)記載の方法、
(3) 上記複数個が 2個である、上記（1)または（2)記載の方法、
(4) 上記エフェクター活性が抗体依存性細胞介在性細胞障害活性 (ADCC活性） である、上記（1)から（3)の 、ずれか 1項に記載の方法、
(5) 抗体の重鎖 C末端に、 Fcドメインを含む構造物を 1個または複数個直列に連結 することを特徴とする、エフェクター活性が増強された抗体改変体の製造方法、
(6) 下記工程 (a)および (b)を含む、エフェクター活性が増強された抗体改変体の 製造方法
(a)抗体重鎖 C末端に Fcドメインを含む 1または複数個の構造物が直列に連結された H鎖改変体をコードするポリヌクレオチドおよび L鎖をコードするポリヌクレオチドを発 現させる工程
(b)上記ポリヌクレオチドの発現産物を回収する工程、
(7) 上記構造物が、 Fcドメインの N末端側にスぺーサーポリペプチドを有する構造 物である、上記（5)または（6)記載の方法、
(8) 上記複数個が 2個である、上記（5)から（7)のいずれか 1項に記載の方法、
(9) 上記エフェクター活性が抗体依存性細胞介在性細胞障害活性 (ADCC活性） である、上記（5)から（8)の 、ずれか 1項に記載の方法。
(10) 上記（5)から（9)のいずれかの製造方法によって製造された、エフェクター活 性が増強された抗体改変体、
(11) 抗体の重鎖 C末端に、 Fcドメインを含む構造物が 1または複数個直列に連結 された、抗体改変体、
(12) 上記（10)または（11)に記載の抗体改変体を投与することを特徴とする、細 胞性免疫を強化する方法、
(13) 抗体が B細胞特異的分化抗原 CD20に対する抗体である、上記（1)から（9)の いずれか 1項に記載の方法、
(14) 抗体が B細胞特異的分化抗原 CD20に対する抗体である、上記（10)または（1 1)に記載の抗体改変体。
図面の簡単な説明
[図 1- 1]実施例 1で記載した発現ベクター pCAGGSl- neoN- L/Anti- CD20 L Chainの 構築過程を示す図である。
[図 1-2]図 1 1の続きを示す図である。
[図 2- 1]実施例 2で記載した発現ベクター pCAGGSl- dhfrN- L/Anti- CD20 H Chainの 構築過程を示す図である。
[図 2- 2]図 2— 1の続きを示す図である。
[図 3]実施例 2で記載した最終的な H鎖の遺伝子構造図と、対応するプライマー (配 列番号： 34〜45)を示す図である。図中の（1)から（12)において、一重線は制限酵 素サイトを、二重線はスぺーサー配列を示す。
[図 4]実施例 3で作製した抗体の模式図である。
[図 5]実施例 4で記載したプロテイン Aによるァフィユティー精製後のゲル濾過クロマト グラムである。 M、 RTX (リツキシマブ）、 D0、 Dl、 D2、 D3、 T0、 Tl、 Τ2、 Τ3の生成物を ゲノレ濾過にかけたクロマトグラムである。
[図 6]実施例 5に記載したゲル濾過後の抗体を PAGE解析した結果を示す写真である 。還元条件で SDS-PAGEを実施し、さらに西洋ヮサビ過酸ィ匕酵素で標識した抗ャギ 抗ヒ HgG(H+L)抗体あるいはャギ抗ヒト κ鎖抗体でウェスタンプロットを実施した結果 を示す。
[図 7]実施例 5に記載したゲル濾過後の抗体を HPLC解析した結果を示す図である。 精製した M、 RTX、 D0、 Dl、 D2、 D3、 T0、 Tl、 T2、 T3の HPLC (ゲル濾過）を示す。
[図 8]実施例 6に記載したフローサイトメトリーによる抗体の CD20結合性試験の結果を 示す図である。 ( 1)： Mとともに、陰性コントロールのトラスッヅマブと陽性コントロール の RTX。 (2)： D0、 Dl、 D2、 D3。（3)： T0、 Τ1、 Τ2、 Τ3。
[図 9-1]実施例 7に記載した、リコンビナント 1¾ γ R1Aを用いた ELISAによる受容体結 合性試験の結果を示す図である。
[図 9-2]実施例 7に記載した、リコンビナント Fe y R2Aを用いた ELISAによる受容体結 合性試験の結果を示す図である。 [図 9-3]実施例 7に記載した、リコンビナント Fe y R2Bを用いた ELISAによる受容体結 合性試験の結果を示す図である。
[図 9- 4]実施例 7に記載した、リコンビナント Fc y R3A(Val158型)を用いた ELISAによる 受容体結合性試験の結果を示す図である。
[図 9- 5]実施例 7に記載した、リコンビナント Fc y R3A(Phe158型)を用いた ELISAによる 受容体結合性試験の結果を示す図である。
[図 10]実施例 8に記載した ADCC活性試験の結果を示す図である。
[図 11]実施例 9に記載した CDC活性試験の結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 本発明は、抗体のエフェクター活性を増強する新規方法として、「抗体の重鎖 C末 端に、 Fcドメインを含む構造物を 1個または複数個直列に連結することを特徴とする、 抗体のエフェクター活性を増強する方法」を提供する。本発明の方法によって、元の 抗体の抗原に対する親和性を維持しつつ、元の抗体よりもエフヱクタ一活性の増強さ れた抗体改変体 (以下、「本発明の抗体改変体」ともいう）を得ることが可能になる。
[0018] 本発明における抗体は、その由来について特に制限は無ぐヒト、サル、チンパンジ 一等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげつ歯類、ゥサギ、ゥマ、ヒッジ、ロバ、 ゥシ、ャギ、ィヌ、ネコ等の哺乳類、 -ヮトリ、等のいずれでもよいが、好ましくはヒトで ある。本発明における抗体は、天然の抗体であっても、何らかの人為的変異を導入さ れた抗体であってもよぐさらには、いわゆるキメラ抗体、ヒトイ匕抗体であってもよい。 本発明における抗体は、どのクラス、あるいはどのサブクラスの免疫グロブリンでもよ いが、好ましくは、 IgGクラスであり、さらに好ましくは IgGlサブクラスである。
[0019] 本発明における「Fcドメインを含む構造物」（以下において、「本発明の構造物」とも 称す）は、抗体の Fcドメインそのものでもよいが、 Fcドメインの N末端側に、適当なスぺ ーサ一となるオリゴペプチドが結合して 、てもよ 、。
[0020] 抗体の Fcドメインは、一般的に、免疫グロブリン分子をパパインで分解して得られる フラグメントの一つである。 Fcドメインは重鎖定常領域の N末端側からヒンジ部分、 CH 2ドメインおよび CH3ドメイン力 構成されて!、て、ヒンジ部分にぉ 、て重鎖二本が S-S 結合で結ばれている。抗体はヒンジ部分で折り曲がることができる。 IgGlの場合、 2本 の重鎖は CH3ドメインにおける非共有結合とヒンジ部分のジスルフイド結合によって 結合している。 Fcドメインは糖鎖を有する力 抗体重鎖 C末端に連結した際にエフヱ クタ一活性を増強する能力がある限り、糖鎖に変異があってもよい。例えば、糖鎖上 の α 1,6フコースが除去された抗体であってもよい。
[0021] 本発明の構造物における Fcドメインは、本発明の構造物が連結する抗体と同じ由 来であっても異なる由来であってもよいが、抗体医薬として使用される場合は、免疫 原性の観点から、本発明の構造物が連結する抗体と同じ由来であることが好ましい。 例えば、本発明の構造物が連結する抗体がヒト由来の抗体またはヒト化抗体であれ ば、本発明の構造物における Fcドメインもヒト Fcドメインであることが好ましい。抗体重 鎖 (H鎖)配列は、 V領域を含めた IgGlの H鎖の遺伝子として多数公共データベース に登録されている。例えば、 GenBankの Accession No.BC019337 (ヒト定常領域の DN A配列）を挙げることができる。また実施例で使用した IgGl重鎖（リーダー配列- CD20 由来の V領域 (Accession No.AAL27650アミノ酸配列） -CHI- hinge- CH2-CH3)の塩 基配列を配列番号: 3に、アミノ酸配列を配列番号: 4に示す。ヒト Fcドメインをコードす る塩基配列は、配列番号： 3における第 721位から 1413位である。 Fcドメイン cDNAは、 当業者に周知方法によって調製することができる。例えば、配列番号: 3における第 7 21位から 1413位に記載の配列を基にプライマーを設計し、抗体を発現する細胞から 調製した mRNAを铸型として、公知核酸増幅法によって Fcドメイン cDNAを調製できる 。または、配列番号: 3に記載の配列の一部をプローブとし、抗体発現細胞から調製 した cDNAライブラリーの中力もプローブにハイブリダィズする配列を選択して調製し てもよい。
[0022] また本発明の構造物における Fcドメインは、 Fc受容体結合活性を有する限り、天然 の変異あるいは人為的な変異を有していてもよい。例えば、配列番号: 3における第 7 21位から 1413位記載の塩基配列の相補鎖にストリンジヱントな条件でノヽイブリダィズ する配列によってコードされるポリペプチドや、配列番号: 4記載のアミノ酸配列にお ける第 241位から 471位の配列に 1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および/ま たは挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチドも、 Fc受容体結合活性を有する限り 、本発明の構造物における Fcドメインに含まれる。このような Fcドメイン変異体も、当 業者に周知方法によって調製することができる。
[0023] 上記ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件は、当業者であれば、適宜選択 することができる。一例を示せば、 25%ホルムアミド、より厳しい条件では 50%ホルム アミド、 4 X SSC、 50mM Hepes pH7.0、 10 Xデンハルト溶液、 20 g/ml変性サケ精子 DNAを含むハイブリダィゼーシヨン溶液中、 42°Cで一晚プレハイブリダィゼーシヨンを 行った後、標識したプローブを添加し、 42°Cで一晩保温することによりハイブリダィゼ ーシヨンを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「lxSSC、 0.1% SD S、 37°C」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、 0.1% SDS、 42°C」程度で、さらに 厳しい条件としては「0.2xSSC、 0.1% SDS、 65°C」程度で実施することができる。このよ うにハイブリダィゼーシヨンの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性 を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記 SSC、 SDSおよび温度の条 件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジ エンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ 、ノ、イブリダィゼーシヨン反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様の ストリンジエンシーを実現することが可能である。
[0024] このようなハイブリダィゼーシヨン技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコー ドするポリペプチドは、通常、上記 Fcドメインとアミノ酸配列において高い相同性を有 する。高い相同性とは、少なくとも 40%以上、好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 8 0%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは少なくとも 95%以上、さらに好 ましくは少なくとも 97%以上 (例えば、 98から 99%)の配列の相同性を指す。アミノ酸 配列の同一性は、例えば、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl . Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1 993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、 BLASTXと呼ばれ るプログラムが開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。 BLA STXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プロ グラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知 で fcO(http://www.ncbi. nlm.nih.gov.)。 [0025] また Fcドメインに人為的に変異を導入し、 Fcドメイン変異体を人工的に調製する技 術も当業者に周知である。例えば、配列番号: 3に記載の塩基配列に、 PCRによる変 異導入法やカセット変異法などの遺伝子改変方法を施し、部位特異的にまたはラン ダムに変異を導入することによって、 Fcドメイン変異体を人工的に調製することができ る。または配列番号: 3記載の塩基配列に変異を導入した配列を、市販の核酸合成 装置によって合成することも可能である。
[0026] 本発明の構造物において、スぺーサ一となるオリゴペプチドは、無くてもよいが有つ た方が望ましい。スぺーサ一として、しばしばグリシンとセリンの組み合わせが用いら れる [ジャーナル'ォブ 'イミュノロジー（Journal of Immunology) , 162, 6589 (1999) ]。 本発明のスぺーサ一としては、実施例に示すように、グリシン 4個とセリン 1個が組み 合わせられたスぺーサー（配列番号: 48)、あるいは上記配列が 2回（配列番号: 49) または 3回（配列番号: 50)連結したスぺーサーを用いることができる。しかし、スぺー サ一はこれらの配列に限らず、スぺーサ一が連結するヒンジ部分の折れ曲がりを妨 げない限り、いかなる構造であってもよい。望ましくは、プロテアーゼあるいはぺプチ ダーゼで容易に切断されないペプチド配列である。このような配列は、例えば、リンカ 一シーケンス設計援助プログラムである LINKER (Xue F, Gu Z, Feng JA., LINKER: a web server to generate peptide sequences with extended conformation., Nucleic Aci ds Res. 2004 Jul l;32(Web Server issue):W562- 5.)に、配列の長さ等の諸条件を入 力し、所望するペプチド配列を得ることができる。 LINKERへは、 http：〃 astro.temple. edu/〜feng/Servers/BioinformaticServers.htm.でフクセス nJn である。
[0027] 遺伝子工学的技術によって複数の塩基配列をつなげるときに、例えば、制限酵素 サイトの配列などの理由によって、つなぎ目に位置するアミノ酸配列力 S1〜数個にわ たり置換、欠失、付加、および/または挿入されることがしばしばある。このような変異 は当業者に周知であり、本発明の構造物の構築の際や、本発明の構造物を抗体に 連結する際にも、このような変異がおこることがある。例えば、 V領域と C領域のつなぎ 目、 Fcの C末端と本発明の構造物の N末端 (Fcまたはスぺーサ一の N末端）とのつな ぎ目にこのような変異が起こりうる。このような変異があっても、 Fc受容体結合活性を 有する限り、本発明の構造物または本発明の抗体改変体である。 [0028] 本発明の構造物は、抗体の重鎖 C末端に連結することにより、抗体のエフェクター 活性増強を可能にする。本発明の構造物は、 1個または 2個、 3個、 4個、 5個等の、任 意の個数を連結させることができる力 好ましくは 1個または 2個である。すなわち、本 発明の構造物が連結された抗体改変体は、 2以上の任意の数の Fcドメインを有する ことができ、抗体改変体における Fcドメインの数は 2又は 3個である。実施例では、本 発明の構造物を 2つ連結した抗体改変体が、本発明の構造物を 1つ連結した抗体改 変体よりも、高い ADCC活性を示すことが確認された。
[0029] 本発明の構造物が連結される抗体が認識する抗原は、特にその種類を問わず、任 意の抗原であってよい。すなわち、本発明の抗体改変体の可変領域は、いかなる抗 原を認識するものであってもよい。下記の実施例では、抗体改変体の H鎖と L鎖の可 変領域として、ヒト Bリンパ球の分ィ匕抗原である CD20に対するマウスモノクローナル抗 体 1F5の可変領域を用いた [非特許文献 14]。 CD20は、 297アミノ酸から構成される分 子量 33〜37キロダルトンのタンパク質であり、 Bリンパ球に強く発現している。 CD20に 対するキメラ抗体であるリツキシマブ (rituximab)は、非ホジキンリンパ腫の優れた治 療薬として広く使われている [非特許文献 15]。抗 CD20抗体として、リツキシマブゃ 1F 5以外にも、マウスモノクローナル抗体 Bl、 2H7 [非特許文献 16]などが知られている 。しかし、本発明の抗体改変体の可変領域は 1F5可変領域に限定されるものではな い。 Fcドメインは Fabドメインと物理的に離れており、 Fcドメイン活性が Fabドメインの種 類によって影響を受けることは殆どないと考えられるため、 1F5以外のいかなる抗体の 可変領域でも本発明の抗体改変体の可変領域として使用してょ 、し、 CD20以外の いかなる抗原に対する抗体の可変領域も本発明の抗体改変体の可変領域として用 いることがでさる。
[0030] 本発明の方法を実施することにより、抗原結合活性に関わらずに、抗体の Fcドメイ ンが発揮するエフヱクタ一活性を増強することによって、抗体の治療効果を高めるこ とができる。抗体のエフェクター活性、特に ADCC活性を増強するためには、 Fc受容 体への結合活性を増強することが求められる。一般に、 2つの分子が結合するときの 強さは、次のように考えられる。抗体 1分子と Fc受容体 1分子の結合強度は、了フィニ ティー（affinity) x結合価数 =ァビディティー (avidity)で表わされる。天然の IgG抗体 は Fcが 1個であり、エフェクター細胞表面に多くの Fc受容体があろうと、結合価数は 1 である。ただし、抗体が抗原と複合体を形成すると、免疫複合体はエフェクター細胞 と多価で結合することになる。その結合価数は免疫複合体の構造によって 、ろ 、ろ である。がん細胞の場合には、細胞表面に複数の抗原があり、これに抗体が結合し、 エフェクター細胞の Fc受容体と多価で結合することになる。し力しながら、がん細胞 上の抗原はしばしば密度が低ぐこれに結合した抗体は、 Fc受容体との結合価数は 低くなつてしまう。そのために、 ADCC活性が十分に発揮できず、治療効果も十分で はなくなる [Golay, J. et al.，ブラッド（Blood) , 3900, (2000)]。そこで、抗体 1分子 に複数個の Fcドメインを直列に連結することによって、 Fc受容体と多価で結合するこ とを可能にする。それによつて、抗体と Fc受容体の結合活性、つまりアビディティーは 増強される。さらに、エフェクター活性が増強することになる。
[0031] また本発明は、エフェクター活性が増強された抗体改変体の製造方法も提供する。
本発明の方法は、天然に得られる抗体や既存のキメラ抗体のエフェクター活性を増 強するだけではなぐ由来の異なる抗体可変領域と抗体定常領域との新規組み合わ せによる新規キメラ抗体改変体の製造をも可能にする。さらに、 CH1ドメインと 2以上 の上述の Fcドメイン変異体との組み合わせ力 なる新規定常領域を有する抗体改変 体であってもよい。ヒト CH1ドメイン塩基配列は、配列番号： 3記載の重鎖塩基配列の 430位から 720位に示される。
[0032] 本発明の方法は、当業者に周知の手段を適宜組み合わせて行うことができる。以 下に、遺伝子工学技術により、重鎖 (H鎖）、軽鎖 (L鎖)の可変領域および定常領域 の DNAを調製して連結して本発明の抗体改変体を発現させる場合の例を説明する。
[0033] 可変領域配列は、例えば次のように調製することができる。まず目的の抗体を発現 して 、るハイプリドーマある 、は抗体遺伝子導入細胞力も cDNAライブラリーを作製し 、目的の可変領域の DNAをクローユングする。 H鎖の可変領域 VHと L鎖の可変領域 VLの上流に、抗体のリーダー配列 Lを連結した DNA構造物 [LVH]および [LVL]を構 築する。
[0034] 抗体の定常領域は、まずヒト 'ミエローマ細胞や扁桃などのヒトリンパ組織力も cDNA ライブラリーを作製する。 H鎖および L鎖の定常領域の 5'末端と 3'末端の部分配列か ら設計したプライマーを用い、ポリメラーゼ ·チェイン ·リアクション (PCR法)等の公知 核酸増幅法によって増幅し、 H鎖定常領域: [CH1— Fc]の cDNA断片および、 L鎖定 常領域: [CL]の cDNA断片を得て、これをベクターに挿入し、クローユングする。
L鎖にっ ヽては、 LVLと CLを連結した DNA構造物 [LVL-CL]を構築する。一例とし て、実施例で作製した DNA構造物 [LVL-CL] (リーダー配列と 1F5の V領域とヒト L κ 鎖の C領域）の DNA配列を配列番号： 1に、該 DNA構造物がコードするアミノ酸配列 を配列番号: 2に示す。本発明の構造物が連結した H鎖 (H鎖改変体)および本発明 の構造物が連結しない H鎖は、以下のように構築する。 （i) Fcが 1個である H鎖 (本発 明の構造物が連結しない H鎖）の DNA構造物は、 DNA構造物 [LVH]と DNA構造物 [C Hl-Fcドメイン-終始コドン]を連結することによって作製できる。実施例で作製した Fc 1個である H鎖の DNA構造物の DNA配列を配列番号： 3に、該 DNA構造物がコードす るアミノ酸配列を配列番号: 4に示す。 （ii) Fcが 2個直列に連結した H鎖 (本発明の構 造物が一つ連結した H鎖）の DNA構造物は、 DNA構造物 [LVH]、 DNA構造物 [CHI — Fc (終始コドンなし)]および DNA構造物 [スぺーサー Fc—終始コドン]を連結するこ とによって作製できる。実施例で作製した Fcが 2個直列に連結した H鎖の DNA構造物 の DNA配列を配列番号： 5 (スぺーサー無し）、 7 (スぺーサ一として GGGGS (G4Sと表 示する。配列番号: 48)力 1個）、 9 (スぺーサ一として G4Sが 2個）、 11 (スぺーサ一とし て G4Sが 3個）に、該 DNA構造物がコードするアミノ酸配列を配列番号： 6 (スぺーサー 無し）、 8 (スぺーサ一として G4Sが 1個）、 10 (スぺーサ一として G4Sが 2個）、 12 (スぺ ーサ一として G4Sが 3個）に示す。（iii) Fcが 3個直列に連結した H鎖 (本発明の構造物 が二つ連結した H鎖）の DNA構造物は、 DNA構造物 [LVH]、 DNA構造物 [CHI— Fc ( 終始コドンなし)]、 DNA構造物 [スぺーサー Fc— (終始コドンなし)]、 DNA構造物 [スぺ ーサー Fc—終始コドン]を連結することによって作製できる。実施例で作製した Fcが 3 個直列に連結した H鎖の DNA構造物の DNA配列を配列番号： 13 (スぺーサー無し） 、 15 (スぺーサ一として G4Sが 1個）、 17 (スぺーサ一として G4Sが 2個）に、および 19 ( スぺーサ一として G4Sが 3個）に、該 DNA構造物がコードするアミノ酸配列を配列番号 ： 14 (スぺーサー無し）， 16 (スぺーサ一として G4Sが 1個）， 18 (スぺーサ一として G4S 力^個）、 20 (スぺーサ一として G4Sが 3個）に示す。（iv) Fcが 4個以上直列に連結した H鎖の DNA構築物は、 Fcが 3個の場合と同様にして、 DNA構造物 [スぺーサー Fc— ( 終始コドンなし)]の数を増やせばよい。
[0036] 上記のようにして調製した L鎖 DNA構造物と H鎖改変体 DNA構造物は、クローニン グされた後、プロモーターやェンノヽンサ一等制御領域とともに発現ベクターに挿入さ れる。あるいは、既に制御領域を備えた発現ベクターに挿入してもよい。使用可能な 発現ベクターとしては、 CAGプロモーターを有するベクター [ジーン（Gene) ,崖， 193 (1991)]、 pcDNAベクター [イミュノロジ^ ~ ·アンド 'セル'バイオロジー（Immunology and Cell Biology) , 75, 515 (1997)]などが挙げられる力 使用する宿主細胞に適合する 発現ベクターであれば、いずれを用いてもよい。
[0037] 宿主細胞としては、糖タンパク質発現可能なものの中力も適宜選択することができ、 例えば、動物細胞、昆虫細胞、酵母、等の中から選択することができる。具体例を挙 げるとするならば、 CH-DG44細胞 [サイトテクノロジー（Cytotechnology) , 9, 237 (1992 )]、 COS- 1細胞、 COS- 7細胞、あるいはマウス'ミエローマ細胞 NS0ゃフコースが欠損 した糖鎖を有する抗体分子を産生しうるラット ·ミエローマ細胞 YB2/0などを例示する ことができるが、これらに限定するものではない。
[0038] 組換え宿主細胞を培養し、その培養上清から抗体改変体を精製する。培養に当た つては、各種培地を使用可能であるが、抗体精製上の点からは無血清培地が好都 合である。培養上清から、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲ ルろ過クロマトグラフィー、抗体に選択的な結合性を有するプロテイン Aなどを固相化 したァフィユティー 'クロマトグラフィーあるいは高速液体クロマトグラフィー（HPLC)等 の公知精製方法によって、抗体改変体以外のタンパク質および抗体改変体の断片 あるいは凝集体を除去し、目的の抗体改変体を精製する。
[0039] 上記のようにして得られた抗体改変体力 増強されたエフヱクタ一活性を有するか どうかについては、当業者に公知の手段によって確認可能である。例えば、各種 Fc 受容体との結合活性につ 1、て、リコンビナント Fc受容体細胞外ドメインを使った酵素 抗体法によって測定することができる。一つの具体例を説明すると、まず、ヒト IgGの 受容体として、 Fc y RIA、 Fc y RIIA、 Fc y RIIB、 Fc y RIIIAの細胞外ドメインを作製す る。これら受容体の配列は公知であり、 GenBankから下記の Accession No.によって入 手可能である。ヒト Fc y RIA:NM— 000566、ヒト Fc γ RIIA:NM— 021642、ヒト Fc y RIIB :N M_001002273、ヒト Fe y RIIIA:NM_000569。これらの受容体を酵素抗体法用の 96穴プ レートに固相化し、濃度を変量した抗体改変体を反応させて、 2次抗体として標識し た抗ヒ HgG抗体などを反応させ、標識力ものシグナルに基づいて、受容体に結合し た抗体改変体量を測定する。なお、 Fc y RIIIAは遺伝子多型が知られており [ジャー ナル 'ォブ 'タリ-カル 'インべスティゲーシヨン（Journal of Clinical Investigation) , 100 ,1059 (1997)],本実施例では、 158番目のアミノ酸がパリンである受容体とフ -ルァ ラニンである受容体を用いた。
[0040] 抗体改変体の ADCC活性は、エフェクター細胞とターゲット細胞を用いて測定する ことができる。エフェクター細胞としては、例えば、健常人末梢血から分離した単核球 を用いることができる。ターゲット細胞としては、 CD20抗原を発現している細胞である Ramos細胞や Raji細胞などを用いることができる。ターゲット細胞と段階希釈した抗体 改変体とを反応させた後、エフェクター細胞を添加する。エフェクター細胞数とターゲ ット細胞数の比率は 10 : 1〜100： 1の範囲内で行なうことができ、好ましくは 25 : 1の比 率で行う。抗体改変体の ADCC活性によりターゲット細胞が障害を受けると、細胞内 の乳酸脱水素酵素 (LDH)が培養上清中に放出されるので、放出された LDHを回収 して、酵素活性を測定すれば、 ADCC活性を知ることができる。
[0041] CDC活性については、例えば実施例に示すように、ターゲット細胞に段階希釈した 抗体改変体を反応させた後、ベイビ一'ラビット新鮮血清を補体原として加えて、細胞 障害活性を評価することができる。 LDHが含まれる血清を用いるので、細胞障害活性 はアラマ一 ·ブルーによる生細胞数の測定などによって評価する。
[0042] 本発明の方法によって得られた抗体改変体は、上記の in vitroにおけるェフエクタ 一活性増強のみならず、 in vivoにおいてもエフェクター活性増強に基づく細胞性免 疫増強効果を発揮し、細胞性免疫によって改善が期待できる疾患の治療に寄与する ものと考えられる。本発明の抗体改変体は、疾病の種類、患者の年齢、症状等に応 じた、適切な投与経路および剤形によって投与することができる。また本発明の抗体 改変体は、公知製剤技術によって製剤化し、効能'効果や使用上の注意などが記載 された説明書とともに、薬剤とすることができる。製剤化にあたっては、性状および品 質を確保する等の目的に応じ、薬学的に許容されうる賦形剤、安定剤、保存剤、緩 衝剤、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、等の適当な添加剤を適宜加えることができ る。例えば、ポリソルベート 80、塩ィ匕ナトリウム、クェン酸ナトリウム、無水クェン酸など と配合して注射剤として製剤化し、生理食塩水またはブドウ糖液注射液によって用時 調製し、点滴静注などの方法で投与可能である。投与量は、患者の年齢、体重等の 要素に応じて調整することができる。例えば、点滴静注の 1回投与量として 10〜10000 mg/m2であり、好ましくは、 50〜5000 mg/m2であり、より好ましくは 100〜1000 mg/m2で あるが、これらに限られるものではない。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
(実施例 1)：発現ベクター pCAGGSl- neoN- L/antト CD20 LC (Light Chain)の構築 (1 - 1) pEGFP- Nl/VLベクター（図 1-1- A)の調製
マウス抗 CD20 IgG2a VL領域遺伝子のクローユングのため、以下の操作を行った。 マウスハイプリドーマ 1F5を、 10%非働化ゥシ胎児血清、 lOOU/mLペニシリン、 100 /z g/ mLストレプトマイシン（Sigma Aldrich社製）を含む RPMI1640を用いて、 37°C、 5%CO
2 条件下で培養し、 ISOGEN (二ツボンジーン社製)をもちいて total RNAを抽出した。 10 μ gの total RNAに、オリゴ dTプライマー（5，— CGAGCTCGAGCGGCCGCTTTTTTT TTTTTTTTTTT- 3' (配列番号： 21) )を lOpmolカ卩え、 diethylpyrocarbonate (DEPC) 処理水をカ卩えて全量を 12 しとした。 72°Cで 2分インキュベートして RNAの高次構造を 破壊した後、氷上に素早く移して 3分インキュベートした。添付の lOxReaction緩衝液 (和光純薬工業社製）2 L、 lOOmM DTT (和光純薬工業） 1 μ L、 20mM dNTP (和光 純薬工業） 1 μ L、 20U/ μ L RNase阻害剤（和光純薬工業） 1 μ Lを加え、 DEPC処理 水で全量を 19 μしとした。 42°Cまでカ卩温した後、 200U/ μ L Reverscriptll (和光純薬ェ 業） 1 μ Lを加え、そのまま 42°Cで 50分インキュベートした。反応終了後、 Lの TE ( ImM EDTA、 lOmM Tris— HCl(pH 8.0))をカ卩えて 100 /z Lの cDNA液とした。 [0044] 氷上で滅菌 MilliQ水 7.8 μ L、添付された 5 X緩衝液 4 L、 2.5 mM dNTP 2 L、 10 Mフォワード 'プライマー（Nhelサイト（下線部）を含む、 5，- TCGTCTAGGCTA GCATTGTTCTCTCCCAGTCTCCA-3， (配列番号： 22) ) 2 μ 10 Mリバース' プライマー（Xholサイト（下線部）を含む、 5， -GCTTGAGACTCGAGCAGCTTGGTC CCAGCAC CGAA-3， （配列番号： 23) ) 2 レテンプレートとして 1F5由来 cDNA 2 μ L、 5U/ μ L Expand High FidelityPLUS PCRシステム (Roche) 0.2 μ Lを混合し、次の 条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 10分間の加熱処理後、 95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒 、 72°Cで 60秒の 3工程を 30回繰り返した。反応液を 1%ァガロース STANDARD 01 (Sol ana社製）ゲルを用いて電気泳動し、約 0.31kbpのバンドをレコチップ（タカラバイオ社 製）を用いて回収した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を 行うことで、この DNA断片を精製した。 DNA断片を終濃度 0.8U/ Lの Nhel (東洋紡社 製)及び 0.5U/ μ Lの Xhol (タカラバイオ社製)で処理し、同様に処理した pEGFP-Nl ( BD Biosciences社製） 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガーゼ（Promega社製）を用いて室温 で 30分ライゲーシヨンした。反応液に、塩ィ匕カリウム法により作製した大腸菌コンビテ ントセル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを 与えた。 2分間氷上においた後、 lmLの SOC培地（2% Bacto tryptone (BD Bioscience s社製）、 0.5% Bacto yeast extract (BD Biosciences社製）、 1%塩化ナトリウム（和光純 薬工業社製)）を加え、試験管に移して 37°Cで 2時間振盪培養した。振盪後、菌液 10 0 μ Lを 100 μ g/mLのカナマイシン（和光）を含む LB培地プレートに撒いた。 37°Cで 1 晚培養し、生じたコロニー力 VL領域遺伝子の DNAが挿入されて 、るものを選択し、 このベクターを pEGFP-Nl/VLとした。
[0045] ( 1 - 2) pEGFP- N1/LVLベクター（図 1- 1- B)の調製
VL遺伝子にリーダーシークェンスを付加するために、以下の操作を行った。氷上で 、添付された 5 X緩衝液 4 Lゝ 2.5 mM dNTP 2 L、 10 μ Μフォワード 'プライマー (Nhelサイト（下線部）を含む、 5，- GAGTTT GCTAGCGCCGCCATGGATTTTCAAG
ACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCA-3 ' (配列番号： 24)、配列番号： 24に おける 13位から 57位はリーダーシークェンス）2 /z L、 10 Mリバース 'プライマー（Xh olサイト（下線部）を含む、 5， -GCTTGAGACTCGAGCAGCTTGGTCCCAGCACCG AA-3 ' (配列番号： 25) ) 2 レテンプレートとして（1)で作製した pEGFP-Nl/VL 100 ng、 5U/ μ L Expand High FidelityPLUS PCRシステムを 0.2 μ Lを混合し、全量が 20 μ L となるように滅菌 MilliQ水を加え、以下の条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 10分間 の加熱処理後、 95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒の 3工程を 30回繰り返した。 反応液を 1%ァガロース STANDARD 01ゲルを用いて電気泳動し、約 0.38kbpのバン ドをレコチップを用いて回収した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコ ール沈殿を行うことで、この DNA断片を精製した。
[0046] DNA断片を終濃度 0.8U/ μ Lの Nhel及び 0.5U/ μ Lの Xholで処理し、同様に処理し た pEGFP- Nl 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンし た。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 aを 100 Lカ卩え、氷上で 30分間反応させ た後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 lmLの SOC培地をカロ え、試験管に移して 37°Cで 2時間振盪培養した。振盪後、菌液 100 Lを 100 g/mL のカナマイシンを含む LB培地プレートに撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニー 力もリーダーシークェンスが付加された VL領域遺伝子の DNAが挿入されているもの を選択し、このベクターを pEGFP- N1/LVLとした。
[0047] ( 1 - 3) pEGFP- N1/CLベクター（図 1- 1- C)の調製
ヒト κ鎖 C領域遺伝子のクローユングのため、以下の操作を行った。ヒトミエローマ R PMI8226を、 10%非働化ゥシ胎児血清、 100U/mLペニシリン、 100 g/mLストレプトマ イシンを含む RPMI 1640を用いて、 37°C、 5%CO条件下で培養し、 ISOGENをもちいて
2
トータル RNAを抽出した。 10 gのトータル RNAに、オリゴ dTプライマーを lOpmolカロえ 、 DEPC処理水をカ卩えて全量を 12 μ Lとし、 72°Cで 2分インキュベートした後、氷上に 素早く移して 3分インキュベートした。添付の lOxReaction緩衝液 2 μ lOOmM DTT 1 μ L、 20mM dNTP 1 μ L、 20U/ μ L RNase阻害剤 1 μ Lを加え、 DEPC処理水で全 量を 19 μしとした。 42°Cまでカ卩温した後、 200U/ μ L Reverscriptll 1 μ Lを加え、その まま 42°Cで 50分インキュベートした。反応終了後、 80 μ Lの ΤΕをカ卩えて 100 μ Lの cDN A液とした。氷上で、添付された 5 X緩衝液 4 レ 2.5 mM dNTP 2 L、 10 ju Mフ ォワード'プライマー（Xholサイト（下線部）を含む、 5，- ACCTCTAACTCGAGACTGT GGCTGCACC ATCTGT- 3， （配列番号： 26) ) 2 /z L、10 Mリバース 'プライマー（ EcoRIサイト（下線部）を含む、 5， - ACTTGAATTCCTAACACTCT CCCCTGTTGA —3， （配列番号： 27) ) 2 L、テンプレートとして RPMI8226由来 cDNA 2 レ511/ し Expand High FidelityPLUS PCRシステム 0.2 μ Lを混合し、滅菌 MilliQ水をカ卩えて全 量を 20 Lとした後、次の条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 10分間の加熱処理後、 95°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒の 3工程を 30回繰り返した。反応液を 1%ァガ ロース STANDARD 01ゲルを用いて電気泳動し、約 0.32kbpのバンドをレコチップを 用いて回収した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うこ とで、この DNA断片を精製した。 DNA断片を終濃度 0.5U/ /Z Lの Xhol及び 0.5U/ /Z L の EcoRI (東洋紡社製）で処理し、同様に処理した pEGFP-Nl 50ngと、 1.5Uの T4 DN Aリガーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセ ル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与え た。 2分間氷上においた後、 lmLの SOC培地をカ卩え、試験管に移して 37°Cで 2時間振 盪培養した。振盪後、菌液 100 Lを 100 g/mLのカナマイシンを含む LB培地プレー トに撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、 CL領域遺伝子が挿入されてい るものを選択し、このベクターを pEGFP-Nl/CLとした。
( 1 -4) pEGFP- Nl/Anti- CD20 LCベクター（図 1- 1- D)の調製
マウスヒトキメラ型抗 CD20 L鎖遺伝子 (DNA配列を配列番号： 1、アミノ酸配列を配 列番号： 2に示す。）を構築するため、以下の操作を行った。 0.7 μ gの pEGFP-Nl/C Lに対して終濃度 0.5U/ μ Lの Xhol及び 0.5U/ μ Lの EcoRIで処理し、 1%ァガロース S TANDARD 01ゲルで全量を電気泳動した後、ベクター断片を拾わないように約 0.32k bpのインサート DNA断片をレコチップで回収した。これとは別に、 pEGFP-Nl/LVLベ クタ一を同じ条件で XhoI、 EcoRI処理した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピ ルアルコール沈殿を行うことで、両 DNA断片を精製した。制限酵素処理済み pEGFP- Nl/LVL 50ngと、切り出したヒト CL領域遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを 用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷 上においた後、 lmLの SOC培地をカ卩え、試験管に移して 37°Cで 2時間振盪培養した 。振盪後、菌液 100 Lを 100 g/mLのカナマイシンを含む LB培地プレートに撒いた 。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、リーダーシークェンスが付加された VL領域 遺伝子、及びヒト CL領域遺伝子の DNAが挿入されているものを選択し、このベクター を pEGFP— Nl/ Anti-CD20 LCとした。
[0049] ( 1 - 5) pcDNA3.1/Zeo/Anti- CD20 LCベクター（図 1- 2- E)の調製
マウスヒトキメラ型抗 CD20 L鎖遺伝子を pEGFP- N1ベクターから pcDNA3.1/Zeoに 移し変えるため、以下の操作を行った。 0.5 μ gの pEGFP- Nl/ Antト CD20 L Chainに 対して終濃度 0.8U/ μ Lの Nhel及び 0.5U/ μ Lの EcoRIで処理し、 1%ァガロース STA NDARD 01ゲルで全量を電気泳動した後、ベクター断片を拾わないように約 0.70kbp のインサート DNA断片をレコチップで回収した。これとは別に、 pcDNA3.1/Zeoベクタ 一（Invitrogen社製）を同じ条件で Nhel、 EcoRI処理した。フエノール/クロ口ホルム抽 出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、両 DNA断片を精製した。制限酵素処 理済み pcDNA3.1/Zeo 50ngと、切り出した Anti-CD20 LC遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテント セル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与 えた。 2分間氷上においた後、 100 iu g/mLのァンピシリン（Sigma Aldrich社製）を含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニー力も Antト CD20 LC遺伝子の DNAが挿入されているものを選択し、このベクターを pcDNA3.1/Zeo /A nti— CD20 LCとした。
[0050] ( 1 - 6) pCAGGSl- neoN- L (図 1- 2- F)の調製
CAGプロモーターと、ネオマイシン而性遺伝子を持つ発現ベクター pCAGGSl- neo Nにスぺーサーを挿入するため、以下の操作を行った。 pCAGGSl-neoNを終濃度 0.5 U/mLの Sailで処理し、フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を 行うことで、この DNA断片を精製した。これとは別に、 2本の DNA鎖（センス DNA : GTC GACGCTAGCAAGGATCCTTGAATTCCTTAAGG (配列番号： 28)、アンチセンス DNA： GTCGACCTTAAGGAATTCAAGGATCCTTGCTAGCG (配列番号： 29) )を 合成し、これらを終濃度 1 μ Μとなるように混ぜ、 \1皿(3水で全量を10 しとした。 75°C で 5分加熱し、室温に静置して徐々に温度を下げた。この溶液 1 μ Lと、 Sailで処理し た pCAGGSl- neoN 50ngを混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライ ゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 /z Lを加え、氷上で 30分 間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 100 /z g/m Lのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコ 口-一から、スぺーサ一が挿入された pCAGGSl- neoNを選択し、このベクターを pCA GGS1- neoN- Lとした。スぺーサーを挿入したことで、 pCAGGSl- neoNに 2箇所の Sail サイトが生じ、制限酵素切断部位配列は 5 ' - Sal卜 Nheト BamHI- EcoRI- Aflll- Sail- 3 'と なった。
[0051] (1 - 7) pCAGGSl- neoN-L/Anti-CD20 LCベクターの調製（図 1-2- G)
マウスヒトキメラ型抗 CD20 L鎖遺伝子を pcDNA3.1/Zeoベクターから pCAGGSl- neo N-Lベクターに移し変えるため、以下の操作を行った。 0.5 gの pcDNA3.1/Zeo/Ant i-CD20 LCに対して終濃度 0.8U/ μ Lの Nhel及び 1.0U/ μ Lの AflII (New England Biol abs社製）で処理し、 1%ァガロース STANDARD 01ゲルで全量を電気泳動した後、ベタ ター断片を拾わないように約 0.70kbpのインサート DNA断片をレコチップで回収した。 これとは別に、 pCAGGSl-neoN-Lを同じ条件で Nhel、 Aflll処理した。フエノール/クロ 口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、両 DNA断片を精製した。制 限酵素処理済み pCAGGSl-neoN-L 50ngと、切り出した Anti-CD20 L Chain遺伝子 を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液 に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lをカ卩え、氷上で 30分間反応させた後、 42°C で 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニー力も Antト CD20 LC遺伝子の DNAが挿入されて!、るものを選択し、このベクターを pCAGGSl- neoN-L /Anti— CD20 LCとした。
[0052] (実施例 2)：発現ベクター pCAGGSl- dhfrN-L/anti-CD20 HC (Heavy Chain)の構 築
(2- 1) pBluescriptll/VHベクターの調製（図 2- 1- A)
マウス抗 CD20 IgG2a VH領域遺伝子のクローユングのため、以下の操作を行った。 氷上で滅菌 milliQ 7.8 μ L、添付された 5 X緩衝液 4 レ 2.5 mM dNTP 2 L、 10 μ Mフォワード 'プライマー（Salサイト（下線部）を含む、 5，- CACGCGTCGACGCCG CCATGGCCCAGGTGCAACTG— 3， （配列番号： 30) ) 2 μ 10 Mリバース'プ ライマー（Hindlllサイト（下線部）を含む、 5，- GCGGCCAAGCTTAGAGGAGACTGT GAGAGTGGTGC -3， （配列番号： 31) ) 2 L、テンプレートとして 1F5由来 cDNA 2 μ L、 5U/ μ L Expand High FidelityPLUS PCRシステム 0.2 μ Lを混合し、次の条件で P CRを行った。即ち、 95°Cで 10分間の加熱処理後、 95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒の 3工程を 30回繰り返した。反応液を 1%ァガロース STANDARD 01ゲルを用いて 電気泳動し、約 0.36kbpのバンドをレコチップを用いて回収した。フエノール/クロロホ ルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、この DNA断片を精製した。 DNA 断片を終濃度 0.5U/ μ Lの Sail (東洋紡社製）及び 1.0U/ μ Lの Hindlll (New England Biolabs社製）で処理し、同様に処理した pBluescriptll 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガ一 ゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 1 00 Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間 氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニー力 VH領域遺伝子の DNAが挿入されて!、るもの を選択し、このベクターを pBluescriptll/VHとした。
(2 - 2) pBluescriptll/LVHベクターの調製（図 2- 1- B)
VH遺伝子にリーダーシークェンスを付加するために、以下の操作を行った。氷上 で、添付された 5 X緩衝液 4 レ 2.5 mM dNTP 2 L、 10 μ Μフォワード 'プライマ 一（Sailサイト（下線部）を含む、 5，- CACGCGTCGAC GCCGCCATGGGATGGAGC TGTATCATCTTCTTTTT GGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTG CAACTGCGGCAGCCTGGG- 3， （配列番号： 32) ) 2 L、 10 μ Μリバース ·プライマ 一（Hindlllサイト（下線部）を含む、 5，- GCGGCCAAGCTTAGAGGAGACTGTGAG AGTGGTGC- 3， （配列番号： 33) ) 2 L、テンプレートとして pBluescriptll /VH 100η g、 5U/ μ L Expand High FidelityPLUS PCRシステム 0.2 μ Lを混合し、全量が 20 μしと なるように滅菌 milliQを加え、以下の条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 10分間の加 熱処理後、 95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒の 3工程を 12回繰り返した。反応 液を 1%ァガロース STANDARD 01ゲルを用いて電気泳動し、約 0.43kbpのバンドを、レ コチップを用いて回収した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈 殿を行うことで、この DNA断片を精製した。 DNA断片を終濃度 0.511/ Lの Sail及び 1. 0U/ Lの Hindlllで処理し、同様に処理した pBluescriptll 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガ ーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分 間氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒い た。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニー力もリーダーシークェンスが付加された VH領 域遺伝子の DNAが挿入されて!、るものを選択し、このベクターを pBluescriptll/LVHと した。
(2- 3) pBluescriptn/CHl- CH2- CH3- Tベクターの調製（図 2- 1- C)
ヒト IgGlの C領域、即ち、終止コドン（-T)を含む CH1ドメインから CH3ドメインまでの 遺伝子をクローユングするため、以下の操作を行った。健常人扁桃細胞から、 ISOGE Nをもちいてトータル RNAを抽出した。 5 μ gのトータル RNAにオリゴ dTプライマーを 10 pmolを加え、 DEPC処理水をカ卩えて全量を 12 μ Lとし、 72°Cで 2分インキュベートした 後、氷上に素早く移して 3分インキュベートした。添付の lOxReaction緩衝液 2 μ l OOmM DTT 1 μ Lゝ 20mM dNTP 1 μ Lゝ 20U/ μ L RNase阻害剤 1 μ Lを加え、 DEPC 処理水で全量を 19 μしとした。 42°Cまでカ卩温した後、 200U/ μ L Reverscriptll 1 μ Lを 加え、そのまま 42°Cで 50分インキュベートした。反応終了後、 30 Lの TEを加えて 50 μ Lの cDNA液とした。氷上で、添付された 5 X緩衝液 4 μ 2.5 mM dNTP 2 L、 1 0 Μフォワード 'プライマー（図 3- (1)) 2 レ 10 Μリバース 'プライマー（図 3- (2) ) 2 L、テンプレートとしてヒト扁桃細胞由来 cDNA 2 μ 5υ/ μ L Expand High Fide lityPLUS PCRシステム 0.2 μ Lを混合し、滅菌 milliQを加えて全量を 20 μ Lとした後、次 の条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 10分間の加熱処理後、 95°Cで 30秒、 55°Cで 30 秒、 72°Cで 60秒の 3工程を 30回繰り返した。反応液を 1%ァガロース STANDARD 01ゲ ルを用いて電気泳動し、約 0.99kbpのバンドを、レコチップを用いて回収した。フエノ ール /クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、この DNA断片を 精製した。 DNA断片を終濃度 1.0U/ μ Lの Hindlll及び 0.5U/ μ Lの Notl (New England Biolabs社製）で処理し、同様に処理した pBluescriptll 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガ一 ゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 1 00 Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間 氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、ヒト IgGl C領域遺伝子が挿入されているもの を選択し、このベクターを pBluescriptII/CHl—CH2—CH3—Tとした。
(2 -4) pBluescriptn/CHl— CH2— CH3ベクター（図 2— 1— D)ゝ pBluescriptll/SP— CH2 — CH3— Tベクター（図 2— 1— E、図 2— 1— F)、 pBluescriptll/ SP— CH2— CH3ベクター（図 2— 1-G)の調製
ヒト IgG 1の C領域のうち、終止コドンを含まな!/ヽ CH 1ドメインから CH3ドメインまでの遺 伝子、ヒンジ及び終止コドンを含む CH2から CH3ドメインまでの遺伝子、ヒンジを含み 終止コドンを含まない CH2から CH3ドメインまでの遺伝子をクローユングするため、以 下の操作を行った。氷上で、添付された 5 X緩衝液 4 レ 2.5 mM dNTP 2 L、 10 μ Μフォワード '及びリバース 'プライマー 2 μ Lずつ、テンプレートとして pBluescriptll /CH1-CH2-CH3-T 0.1 gゝ 5U/ μ L Expand High FidelityPLUS PCRシステム 0.2 μ L を混合し、滅菌 milliQをカ卩えて全量を 20 Lとした。用いたプライマーは、 CHI- CH2- CH3を増幅する図 3-(1)と (7)、 SP-CH2-CH3-Tを増幅する図 3-(3)から (6)と (2)、または (8)から (11)と (2)、 SP- CH2- CH3を増幅する (3)から (6)と (12)の組み合わせの、全 13通り である。今回、スぺーサ一としてグリシン 4つとセリン 1つの計 5アミノ酸を基本単位とし た 0、 5、 10、 15アミノ酸残基（a.a.)のフレキシブルなグリシンセリンスぺーサ一を用い た力 スぺーサ一の種類は特に限定されるものではなぐ汎用されるペプチドスぺー サー（SP)なら種類を問わない。汎用される SPとして、例えば、 A(EAAAK)nA (配列番 号： 63)が知られて 、る（括弧の中は繰り返される配列を、 nは繰り返しの数を示す。 A rai R et al.， Protein Engineering 14, 529-532 (2001))。 95°Cで 10分間の加熱処理後 、 95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒の 3工程を 12回繰り返す条件で PCRを行つ た。反応液を 1%ァガロース STANDARD 01ゲルを用いて電気泳動し、 CH1ドメインか ら CH3ドメインまでの DNA断片は約 0.99kbp、ペプチドスぺーサー配列を含む CH2ドメ インから CH3ドメインまでの DNA断片は約 0.74kbpのバンドを、レコチップを用いて回 収した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、この DNA断片を精製した。 DNA断片を対応する制限酵素で処理 (最終濃度: Hindlll 1.0U / L、 BamHI (タカラバイオ社製） 0.75U/ μ L、 Xbal (タカラバイオ社製） 0.75U/ μ L、 Notl 0.5U/ /Z L)し、同様に処理した pBluescriptll 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを 用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷 上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37 °Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、 目的の C領域遺伝子が挿入されているものを 選択し、このベクターを pBluescriptn/CHl- CH2- CH3、 pBluescriptll/ SP- CH2- CH3 — T、 pBluescriptll/ SP— CH2— CH3とした。
[0056] (2 - 5) pBluescriptII/Anti-CD20 HC Fc Monomerベクターの調製（図 2-1- H)
マウスヒトキメラ型抗 CD20 Fc単量体 H鎖遺伝子（DNA配列を配列番号： 3、アミノ酸 配列を配列番号: 4に示す。）を構築するため、以下の操作を行った。 0.5 gの pBlue scriptll/LVH (図 2- 1- B)に対して終濃度 0.5U/ μ Lの Sail及び 1.0U/ μ Lの Hindlllで処 理し、 1%ァガロース STANDARD 01ゲルで全量を電気泳動した後、ベクター断片を拾 わないように約 0.43kbpのインサート DNA断片をレコチップで回収した。これとは別に 、 pBluescriptll/CHl- CH2- CH3- Tベクター（図 2- 1- C)を同じ条件で Sall、 Hindlll処 理した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、両 D NA断片を精製した。制限酵素処理済み pBluescriptll /CH1-CH2-CH3-T 50ngと、 切り出した LVH遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲ ーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lを加え、氷上で 30分間 反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 100 /z g/mL のアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロ ニーから、リーダーシークェンスが付加された VH領域遺伝子、及びヒト IgGl H鎖 CHI - CH2-CH3-T領域遺伝子の DNAが挿入されて!、るものを選択し、このベクターを pBl uescriptll/Anti— CD20 HC Fc Monomerとした。
[0057] (2 - 6) pBluescriptll/LVH- CHI- CH2- CH3ベクターの調製（図 2- 1- 1)
0.5 μ gの pBluescriptll/LVH (図 2- 1- B)に対して終濃度 0.5U/ μ Lの Sail及び 1.0U/ μ Lの Hindlllで処理し、 1%ァガロース STANDARD 01ゲルで全量を電気泳動した後、 ベクター断片を拾わな 、ように約 0.43kbpのインサート DNA断片をレコチップで回収し た。これとは別に、 pBluescriptll /CH1-CH2-CH3 (図 2-1-D)ベクターを同じ条件で S all, Hindlllで処理した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を 行うことで、両 DNA断片を精製した。制限酵素処理済み pBluescriptII/CHl-CH2-CH 3 50ngと、切り出した LVH遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 3 0分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lを加え、氷上 で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 10 0 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、 生じたコロニーから、リーダーシークェンスが付加された VH領域遺伝子、及びヒ HgG 1 H鎖 CH1-CH2-CH3領域遺伝子の DNAが挿入されているものを選択し、このべクタ 一を pBluescriptll/ LVH— CHI— CH2— CH3とした。
(2- 7) pBluescriptll/Anti- CD20 HC Fc Dimerベクターの調製（図 2- 2- J)
0.5 μ gの pBluescriptll/ LVH- CHI- CH2- CH3 (図 2-1- 1)に対して終濃度 0.5U/ μ Lの Sail及び 0.75U/ μ Lの BamHIで処理し、 1%ァガロース STANDARD 01ゲルで全量 を電気泳動した後、ベクター断片を拾わないように約 1.42kbpのインサート DNA断片 をレコチップで回収した。これとは別に、グリシンセリンスぺーサ一の長さが異なる 4種 の pBluescriptll/SP- CH2- CH3- T (図 2- 1- E)ベクターを同じ条件で Sall、 BamHI処理 した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、両 DN A断片を精製した。制限酵素処理済み pBluescriptll/ SP- CH2- CH3- T 50ngと、切り 出した LVH- CH1-CH2-CH3遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室 温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lを加え 、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた 後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培 養し、生じたコロニーから、リーダーシークェンスが付加された VL領域遺伝子、ヒ Hg Gl H鎖 CHI- CH2- CH3領域、ペプチドスぺーサーを含んだ CH2- CH3- T領域全て の遺伝子が挿入されているものを選択し、このベクターを pBluescriptII/Anti-CD20 H C Fc Dimerとした。そのヒト IgGl H鎖 CHI- CH2- CH3領域に CH2- CH3- T領域が連 結した DNA配列を、配列番号： 5 (スぺーサー 0個）、 7 (スぺーサー 1個）、 9 (スぺー サー 2個）、 11 (スぺーサー 3個）に示す。また、それぞれに対応するアミノ酸配列を 配列番号： 6、 8、 10、 12に示す。
[0059] (2 - 8) pBluescriptll/ SP- CH2- CH3- SP- CH2- CH3- Tベクターの調製（図 2- 1- K) グリシンセリンスぺーサ一の長さが異なる 4種の pBluescriptll/SP- CH2- CH3- T (図 2 -1-F) 0.5 μ gに対して終濃度 0.75U/ μ Lの Xbal及び 0.5U/ μ Lの Notlで処理し、 1%ァ ガロース STANDARD 01ゲルで全量を電気泳動した後、ベクター断片を拾わないよう に約 0.74kbpのインサート DNA断片をレコチップで回収した。これとは別に、グリシン セリンスぺーサ一の長さが異なる 4種の pBluescriptll/SP- CH2- CH3 (図 2- 1- G)ベクタ 一を同じ条件で Xbal、 Notl処理した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアル コール沈殿を行うことで、両 DNA断片を精製した。制限酵素処理済み pBluescriptll/S P-CH2-CH3 50ngと、切り出した同じ長さのペプチドスぺーサーを持つ SP-CH2-CH 3遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。 反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lをカ卩え、氷上で 30分間反応させた後 、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 100 /z g/mLのアンピシリン を含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、ぺ プチドスぺーサ一を含む CH2-CH3遺伝子が 2つ挿入されて!、るものを選択し、この ベクターを pBluescriptll/SP— CH2— CH3— SP— CH2— CH3— Tとした。
[0060] (2 - 9) pBluescriptll/Anti- CD20 H Chain Fc Trimerベクターの調製（図 2- 2- L)
0.5 μ gの pBluescriptll/LVH- CHI- CH2- CH3 (図 2-1- 1)に対して終濃度 0.5U/ μ L の Sail及び 0.75U/ /Z Lの BamHIで処理し、 1%ァガロース STANDARD 01ゲルで全量 を電気泳動した後、ベクター断片を拾わないように約 1.42kbpのインサート DNA断片 をレコチップで回収した。これとは別に、グリシンセリンスぺーサ一の長さが異なる 4種 の pBluescriptll/SP- CH2- CH3- SP- CH2- CH3- T (図 2- 1- K)ベクターを同じ条件で Sa II、 BamHI処理した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行 うことで、両 DNA断片を精製した。制限酵素処理済み pBluescriptll/SP- CH2- CH3- S P-CH2-CH3-T 50ngと、切り出した LVH- CHI- CH2 - CH3遺伝子を混合し、 1.5Uの T 4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテン トセル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与 えた。 2分間氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全 量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、リーダーシークェンスが付加さ れた VH領域遺伝子、ヒト IgGl H鎖 CHI- CH2- CH3領域、ペプチドスぺーサーを含ん だ CH2-CH3領域遺伝子が 2つ挿入されて!、るものを選択し、このベクターを pBluescr iptll/ Anti-CD20 HC Fc Trimerとした。そのヒト IgGl H鎖の CHI— CH2— CH3領域に C H2- CH3- T領域が 2つ連結した DNA配列を、配列番号： 13 (スぺーサー 0個）、 15 (ス ぺーサ一 1個）、 17 (スぺーサー 2個）、 19 (スぺーサー 3個）に示す。また、それぞれ に対応するアミノ酸配列を配列番号： 14、 16、 18、 20に示す。
(2 - 10) pcDNA3.1/Anti-CD20 HCベクター（図 2-2-M、図 2-2-N、図 2-2-0)の調 製
マウスヒトキメラ型抗 CD20 H鎖遺伝子を pBluescriptllベクターから pcDNA3.1/Zeoベ クタ一に移し変えるため、以下の操作を行った。 0.5 μ gの pBluescriptII/Anti-CD20 H C Fc Monomer (図 2— 1— H)ゝ pBluescriptll/Antト CD20 HC Fc Dimer (図 2— 2— J) 、 pBl uescriptll/Anti- CD20 HC Fc Trimer (図 2-2- L)に対して、終濃度 0.5U/ μ Lの Sail及 び 0.5U/ μ Lの Notで処理し、 1%ァガロース STANDARD 01ゲルで全量を電気泳動し た後、ベクター断片を拾わないように Anti- CD20 HC Fc Monomer遺伝子は約 1.42kb p、 Anti-CD20 HC Fc Dimer遺伝子は約 2.16kbpゝ Antト CD20 HC Fc Trimer遺伝子 は約 2.90kbpのインサート DNA断片をレコチップで回収した。これとは別に、 pcDNA3. 1/Zeoベクターを、終濃度 0.5U/ μ Lの Xhol及び 0.5U/ μ Lの Notで処理した。フエノー ル /クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコール沈殿を行うことで、両 DNA断片を精製 した。制限酵素処理済み pcDNA3.1/Zeo 50ngと、切り出した Anti-CD20 HC遺伝子を 混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に 大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 /z Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 4 5秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB 培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、 Anti-CD20 H C遺伝子が挿入されているものを選択し、これらのベクターを、 pcDNA3.1/Zeo/Anti- CD20 HC Fc Monomer, pcDNA3.1/Zeo/Anti- CD20 HC Fc Dimerゝ pcDNA3.1/Zeo /Anti— CD20 HC Fc Trimerとした。 [0062] (2 - 1 1) pCAGGSl- dhfrN- Lベクター（図 2- 2- P)の調製
CAGプロモーターと、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子を持つ発現ベクター pCA GGS1- dhfrNにスぺーサーを挿入するため、以下の操作を行った。 pCAGGSl- dhfrN を終濃度 0.5U/mLの Sailで処理し、フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピルアルコ ール沈殿を行うことで、この DNA断片を精製した。これとは別に、 2本の DNA鎖 (セン ス DNA： GTCGACGCTAGCAAGGATCCTTGAA TTCCTTAAGG (配列番号： 46)、 アンチセンス DNA : GTCGACCTTAAGGAATTCAAGGATCCTTGCTAGCG (配列番 号: 47) )を合成し、これらを終濃度 1 μ Μとなるように混ぜ、 MilliQ水で全量を 10 Lと した。 75°Cで 5分加熱し、室温に静置して、徐々に温度を下げた。この溶液 1 μ Lと、 S allで処理した pCAGGSl-dhfrN 50ngを混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室 温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lを加え 、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた 後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培 養し、生じたコロニーから、スぺーサ一が挿入された pCAGGSl- dhfrNを選択し、この ベクターを pCAGGSl- dhfrN-しとした。スぺーサーを挿入したことで、 pCAGGSl- dhfr Nに 2箇所の Sailサイトが生じ、制限酵素切断部位配列は 5 ' -SalI-NheI-BamHI-EcoRI — Aflll— Sail— 3 'となった。
[0063] (2 - 12) pCAGGSl- dhfrN- L/Anti- CD20 HCベクター（図 2- 2- Q、図 2- 2- R、図 2- 2 -S)の調製
マウスヒトキメラ型抗 CD20 H鎖遺伝子を pcDNA3.1/Zeoベクターから pCAGGSl- dhf rN-Lベクターに移し変えるため、以下の操作を行った。 0.5 μ gの pcDNA3.1/Zeo/Ant i-CD20 HC Fc Monomer, pcDNA3.1/Zeo/Anti- CD20 HC Fc Dimerゝ pcDNA3.1/Ze o/Anti- CD20 HC Fc Trimerに対して、終濃度 0.8U/ μ Lの Nhel及び 0.5U/ μ Lの Eco RIで処理し、 1%ァガロース STANDARD 01ゲルで全量を電気泳動した後、ベクター 断片を拾わないように、 Anti- CD20 HC Fc Monomer遺伝子は約 1.42kbp、 Anti- CD2 0 HC Fc Dimer遺伝子は約 2.16kbp、 Anti- CD20 HC Fc Trimer遺伝子は約 2.90kbp のインサート DNA断片をレコチップで回収した。これとは別に、 pCAGGSl-dhfrN-Lベ クタ一を、同じ条件で Nhel、 EcoRI処理した。フエノール/クロ口ホルム抽出、イソプロピ ルアルコール沈殿を行うことで、両 DNA断片を精製した。制限酵素処理済み pCAGG SI- dhfrN- L 50ngと、切り出した Anti- CD20 HC遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガ ーゼを用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lを加え、氷上で 30分間反応させた後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分 間氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒い た。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから、 Anti-CD20 HC遺伝子が挿入されている ものを選択し、これらのベクターを、 pCAGGSl- dhfrN- L/Anti-CD20 HC Fc Monome r (図 2- 2- Q)、 pCAGGSl- dhfrN- L /Anti- CD20 HC Fc Dimer (図 2-2- R)、 pCAGGSl -dhfrN- L/Anti-CD20 HC Fc Trimer (図 2- 2- S)とした。
(実施例 3)： G418及び MTX耐性細胞からの抗体改変体発現細胞クローンの選択 (3 - 1) 形質転換体の製造
実施例 1で作製したプラスミド pCAGGSl-neoN-L/Anti-CD20 LC及び実施例 2で作 製したプラスミド pCAGGSl- dhfrN- L/Anti-CD20 HCを、最終濃度 l .OU/ Lの Pvul ( 東洋紡社製)を用いて鎖状化した。 10%ゥシ胎児血清、 O. lmMヒポキサンチン (和光） 、 0.016mMチミジン（和光）、 lOOU/mLペニシリン、 100 g/mLストレプトマイシンを含 む IMDM (Sigma Aldrich社製）培地を用いて、 CHO DG44株を 3xl05/wellとなるように 、 6ウェルマルチプレート（FALCON353046)に播種し 37°C、 CO濃度 5%で 24時間培
2
養した。 Trans Fast Transfection Reagent (Promega社製)を用いて、 L鎖発現ベクター 1.35 μ gと 9種類の Η鎖発現ベクター 1.35 μ gを、 9群の CHO DG44株にトランスフエク シヨンし、 37°C、 CO濃度 5%で 48時間培養した。これらのプラスミドが導入された結果
2
産生されるであろう 9種類の抗体とその改変体の模式図を図 4に示した。図 4において 、 M:Fcモノマー、 D : Fcダイマー、 T : Fcトリマーの模式図を示す。 Dと Tでは、さらに、ス ぺーサ一の異なる改変体を作製した。グリシン-グリシン-グリシン-グリシン-セリンの 配列（GGGGS)をスぺーサー 1つの単位として、スぺーサー 0個、 1個（配列番号： 48) 、 2個（配列番号 : 49)、 3個（配列番号 : 50)を有する Dと Tを作製した。それぞれ、 D0 、 Dl、 D2、 D3、 T0、 Tl、 Τ2、 Τ3と命名する（以後、 9種類の抗体とその改変体につい ては略称を用いることにする）。形質転換された細胞の培養上清を破棄し、 PBSで洗 浄後、 Trypsin- EDTA Solution (Sigma Aldrich社製）を lmLカ卩えて、 37°Cで 3分インキ ュペートした。細胞がプレートからはがれて丸くなつたことを確認して、 10%ゥシ胎児血 清、 0.8mg/mL G418、 500nMメトトレキサート、 100U/mLペニシリン、 100 μ g/mLストレ プトマイシンを含む IMDM選択培地で懸濁し、 1つの形質転換体につき 2枚の 96ゥェ ル平底マルチプレート（FALCON353072)に 3xl03/wellで播種し、培養を続けた（培 地量 lOO /z L/well
[0065] (3 - 2) Anti-CD20と濃度の測定
培養上清中の抗体濃度を酵素抗体 (ELISA)法により測定した。ャギ抗ヒト γ鎖抗体 (Biosource社製）を 0.5 μ g/mLとなるように PBSで希釈した固相化抗体 50 μ Lを 96ゥェ ルプレー HFALCON353912)に分注し、 4°Cでー晚インキュベートした。抗体溶液を 破棄し、 0.1% BSA (和光純薬工業社製)を含む PBS溶液 150 Lをカ卩えて 37°Cで 2時 間インキュベートすることで、ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を破棄し、細胞 の培養上清を PBSで 10倍希釈した液 100 Lを対応するゥエルに分注した後、 37°Cで 2時間インキュベートした。希釈培地を破棄し、 0.05% Tween20 (MP Biomedicals社製） を含む PBS溶液（PBST) 100 Lでゥエルを 3回洗浄した。ペルォキシダーゼ標識ャギ 抗ヒト γ鎖抗体（Sigma Aldrich社製）を 0.5 μ g/mLとなるように 0.1% BSAを含む PBSで 希釈し、各ゥエルに 50 Lずつ分注し、 37°Cで 1時間インキュベートした。溶液を破棄 し、 PBSTでゥエルを 3回洗浄した後、基質溶液（0.4% 0—フエ-レンジァミン 2塩酸塩（ Sigma Aldrich)、 0.003% H O (和光）を含む、 pH 5.0クェン酸ナトリウム緩衝液） 50 μ L
2 2
を分注し、マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Model 550)で A450の測定を行った。
[0066] (3 - 3) 細胞のクローニング
形質転換体を 96ゥエルプレートに播種後 4日目に選択培地 100 μ Lを供給した。培 地を供給した 1週間後に、実施例 3 (2)による培養上清中の抗体濃度の測定を行い、 1種の形質転換体 192ゥヱルのうち Α450が高かった 12ゥヱルを選び、これらをトリプシ ン処理後、選択培地で混合した。 3cells/wellとなるように 1枚、 lcell/wellとなるように 2 枚、計 3枚の 96ウェルマルチプレートに再播種し、 37°C、 CO濃度 5%で培養した (培地
2
量 lOO /z L/well 再播種した 16日後に、 1つのゥエルに 1つのコロニーが形成されて いるものについて、培養上清中の抗体濃度の測定を行った。 A450が高力つた 12ゥェ ルを選び、トリプシン処理した後、 24ウェルマルチプレートに選択培地で播種した (培 地量 lmL/well)。コンフルェント後、再度培養上清中の抗体濃度の測定を行い、 A45 0が高かった 6ゥエルを選び、トリプシン処理した後、 6ウェルマルチプレートに播種し た (培地量 4mL/Well)。コンフルェント後、再度培養上清中の抗体濃度の測定を行い 、 A450が高かった 3ゥエルを選び、トリプシン処理した後、 10cmディッシュ（FALCON3 53003)に別々に播種した（培地量 10mL)。これらのうち、 1クローンを無血清馴化する ことにし、他の 2クローンについては凍結保存した。
[0067] (3-4) 無血清培地への馴化
10cmディッシュにコンフルェントになった細胞をトリプシン処理し、 2.5mLの CD CH 0 Medium (GIBCO社製）と、 10%ゥシ胎児血清、 100U/mLペニシリン、 100 /z g/mLスト レプトマイシンを含む 7.5mLの IMDM、計 10mLの混合培地で 2xl06となるように懸濁し 、 10cmディッシュに播種した（混合比 25%： 75%)。コンフルェントになったところで細胞 が混合培地に馴化したとみなし、以後、 CD CHO Mediumと 10%ゥシ胎児血清を含む 1\©\1の混合比を50%: 50%、 75% : 25%, 90%: 10%と変えていきながら、継代していった。
[0068] (実施例 4)：抗体産生細胞の大量培養と発現させた抗体の精製
(4- 1) 抗体産生細胞の大量培養
CD CHO Medium : 10%ゥシ胎児血清を含む IMDMの混合比が 90% : 10%の混合培地 を用い、実施例 3により製造した抗体発現細胞を 15cmディッシュ 1枚につき 106個とな るように、計 7枚に播種した（培地量 20mL)。コンフルェント後、培地を破棄し、 20mLの PBSで 3回洗浄後、 30mLの CD CHO Mediumを添カ卩し、 37°C、 CO濃度 8%で 10日間
2
口 しプ 。
[0069] (4- 2) プロテイン Aァガロースを用いた、培養上清力もの抗体精製
抗体産生細胞の培養上清を 50mLコ-カルチューブ 4本に集め、 3000gで 30分遠心 し、ペレットを取らないように三角フラスコに集めた。 lmLのプロテイン Aァガロース（Sa nta Cruz)を詰めたカラムに 5mLの PBSを通して平衡化してから培養上清全てを通し た。 5mLの PBSを通してカラムを洗浄し、非特異的な吸着物を除去した後、 pH 2.7の 0 .1Mグリシン (和光純薬工業社製） '塩酸溶出液 3mLを通し、 1フラクションあたり 300 L回収した。回収した溶出液には即座に pH 9.0の Tris (和光純薬工業） '塩酸中和液 3 0 μ Lをカロ;^、 ¾s倒 |&禾口した。 sodium dodecyl sulfate— polyacrylamide gel electrophore sis (SDS- PAGE)、 CBB染色（BIO- RAD社製、 BIO- Safe Coomassie)を行い、泳動解 析プログラム Image J (National Institutes of Health, USA)を用いて定量したところ、 9 種の抗体 、ずれも培地 lmLから 2〜4 μ gの抗体が得られた結果となった。
[0070] (4- 3)ゲル濾過クロマトグラフィーによる二次精製
カラムとして Protein Pak 300SW (Waters社製）を用いた HPLCシステム（日本分光社 製)で抗体の二次精製を行った。 1分に lmLの速さで溶離液 (0.15M塩ィ匕ナトリウムを 含む pH 7.0の 0.1Mリン酸緩衝液)を送液した。 RTX (リツキサン、中外製薬社製、分子 量 145kDa)を定性したところ、保持時間は 7.5分であった。この結果を受けて、 100 /z g /mLの 9種類の抗体 100 μ Lを 4回ずつインジヱクシヨンし、 M (154kDa)は 7.8分、 D0 (2 08kDa)は 7.0分、 Dl (154kDa)は 7.7分、 D2 (154kDa)は 7.5分、 D3 (208kDa)は 6.7分、 TO (262kDa)は 6.5分、 Tl (262kDa)は 6.3分、 T2 (262kDa)は 6.2分、 T3 (262kDa)は 6. 2分、のピークを回収した。回収量は各抗体、いずれも約 4mLであった。この時のクロ マトグラムを図 5に示す。
[0071] (4-4) 限外濾過による濃縮
分画分子量 50kDaの Amicon Ultra- 4 (Millipore社製）のフィルターユニットに、 lmL の 5% Tween20を注ぎ、室温で 1時間静置した。 Tween20水溶液を破棄し、 lmLの Milli Q水でフィルターユニットを 3回洗浄した。ゲル濾過で回収した二次精製後の溶液 4m Lをフィルターユニットに加え、 25°C、 3000gで 25分遠心した。約 100 Lに濃縮された 溶液を回収した。標準物質として RTXを用い、 HPLCで定量を行い、濃度決定を行つ た。
[0072] (実施例 5) :抗体の構造解析
(5- 1) SDS- PAGE解析
10%ポリアクリルアミドゲルを以下の組成で作製した。分離ゲルとして、 MilliQ水 1.9 mL、 30%アクリルアミド（29%アクリルアミド（和光純薬工業社製）、 1% Ν,Ν'ーメチレン ビスアクリルアミド（和光純薬工業）） 1.7 mL、 pH6.8の 0.5 M Tris- HC1緩衝液 1.3 mL、 10% SDS (和光純薬工業） 50 /z L、 APS (和光純薬工業） 50 L、 TEMED (和光純薬 工業） 3 Lを混合し、直ちにゲル板に空気が入らないように流し込んだ。 MilliQ水 0 .5 mLを上カゝら重層し、室温で 30分静置した。ゲル化した後、重層した MilliQ水を破 棄し、濃縮ゲルとして、 MilliQ水 1.4 mL、 30%アクリルアミド 0.25 mL、 pH 8.8の 1.5 M T ris- HC1緩衝液 0.33 mL、 10% SDS 20 μ L、 APS 20 μ L、 TEMED 2 μ Lを混合し、ゲ ル板に流しこんだ。コームを差して室温で 30分静置し、ゲルを固めた。各抗体 300ng を HPLCで用いた溶離液で 10 Lとし、 10% 2—メルカプトエタノール（和光純薬工業） を含む Laemmli Sample緩衝液（BIO- RAD社製）をカ卩えて 20 μしとした。ボルテックス した後、 95°Cで 5分熱処理を行った。このサンプルを 10%アクリルアミドゲルのゥエルに 注ぎ、 0.02Aの定電流で Laemmli法による SDS- PAGEを行った。メタノールに PVDF膜（ Pall Corporation)を完全に浸しておき、メタノール含量力 ¾0%となるように Transfer緩 衝液（0.78% Tris、 3.6%グリシン）を加えた。泳動終了後のゲルを上力 乗せ、室温で 1 5分振盪した。 Trans-Blot SD SEMI-DRY TRANSFER CELL (BIO- RAD社製)に Tran sfer緩衝液で浸した濾紙を 2枚のせ、その上に PVDF膜、ゲルの順にのせ、さらに Tra nsfer緩衝液で浸した濾紙を 2枚重ね、 0.2A定電流で 30分間ウェスタンブロットを行つ た。プロット終了後、 PVDF膜を 5%スキムミルク（雪印社製)入り PBST溶液に浸し、 4°C でー晚ブロッキングを行った。 PVDF膜をビュルシートにはさみ、 0.13 μ g/mL HRP標 識ャギ抗ヒ HgG(H+L) (Chemicon社製）と 0.33 μ g/mL HPR標識ャギ抗ヒト Kappa鎖（S igma Aldrich社製）を含むブロッキング液 lmLに浸し、室温で 2時間振盪した。 PVDF 膜をビニルシートから取り出し、 PBSTで 5分間振盪させて PVDF膜を洗浄する操作を 3 回繰り返した。 PVDF膜をビュルシートにはさみ、 ECL Westernblotting detection reag ents and analysis system (Amersham Biosciences社製) lmLをカ卩 た。暗室（?X フィ ルム（Kodak)に 1分感光させ、バンドが確認できるまでレンドール液（富士フィルム社 製）につけ、水道水ですすいで力 レンフィックス液（富士フィルム社製)で固定した。 この結果を図 6に示す。
(5- 2) HPLC解析
Protein Pak 300SWを用いた HPLCで抗体分子の解析を行った。 1分に lmLの速さ で溶離液 (0.15M塩ィ匕ナトリウムを含む pH 7.0の 0.1Mリン酸緩衝液）を送液した。約 6 00ngの各抗体をインジェクションし、クロマトグラムを得た（図 7)。 SDS-PAGEおよび HP LCによる解析結果から、 DOと D3の精製物はヒンジ部分と Fcドメインをタンデムに 2個 タンデムに有していた力 D1と D2は 1個しか持っていない分子が主要成分だった。ま た、 TOはヒンジ部分と Fcドメインを 3個タンデムに有していた力 T1と T2と T3はそれら を 3個タンデムに有して 、る分子とともに 2個しか有して ヽな 、分子が混じって 、た。
[0074] (実施例 6)：フローサイトメトリーによる抗体の CD20結合性試験
CD20陽性ヒトバーキットリンパ腫細胞 Ramosを、 10%非働化ゥシ胎児血清、 ImMピル ビン酸ナトリウム（和光）、 lOOU/mLペニシリン、 100 g/mLストレプトマイシンを含む R PMI1640を用いて、 37°C、 5%CO条件下で培養した。 Ramos細胞培養液を 600gで 5
2
分間遠心して培地を除いた後、適当量の培地で縣濁した。再度 600gで 5分間遠心し 、培地を除いた。細胞に FACS緩衝液（0.1% BSA、 0.02% NaNを含む PBS) 5mLをカロ
3
えて懸濁し、このまま氷上で 30分間ブロッキングした。 600gで 5分遠心して上清を除 き、 5xl06cells/mLになるように FACS緩衝液に縣濁し、 100 /z Lずつ 1.5mLチューブ に分注した。作製した抗 CD20抗体、及び RTXを最終濃度が 50nMとなるようにカロえ、 また、 HER (ハーセプチン（トラスッズマブ trastuzumab)、中外製薬、 148kDa)を最終 濃度 30nMになるように加え、氷上で 30分間静置し、抗体を細胞と反応させた。 600g で 5分間遠心して上清を除き、 500 Lの FACS緩衝液を加えて細胞を洗浄した。こ の操作を 2回繰り返し、未反応の抗体を完全に除去した。 g/mLの FITC標識ャ ギ抗ヒト Kappa鎖抗体（Biosource International社製）を含む FACS Baffer 100 Lで細 胞を懸濁し、氷上で 30分間遮光して静置した。細胞を前述の方法で洗浄し、 100 L の FACS緩衝液に懸濁した後、目開き 59 mのメッシュで濾過して FACSチューブに 移しかえた。 FACScan (Becton Dickinson社製）を用いて蛍光を測定し、各抗体の CD 20結合性を解析した (図 8)。
[0075] 抗 CD20抗体であるマウスモノクローナル抗体 1F5の可変領域とヒト定常領域を有す るこれらの抗体はいずれも Ramos細胞に結合した。 T0、 Tl、 T2、 T3、 Dl、 D2、 D3は D 0よりも若干多く結合していた。 Mは DOよりも結合量が若干少な力つた。
[0076] (実施例 7)：リコンビナント Fc γ Rを用いた、 ELISAによる受容体結合性試験
(7- 1) リコンビナント Fe y Rの作製
0 pBluescriptll/Gly-His -GSTベクターの構築
6
GST遺伝子配列を pBluescriptllに挿入するため、以下の操作を行った。氷上で添 付された 5x緩衝液 4 レ 2.5 mM dNTP 1.6 レ GST配列を増幅する 10 Mフォ ワード'プライマー (Xbalサイト（下線部）、 Gly-His配列（配列番号: 51における 12-32
6
TACTAGGTTATTG -3， （配列番号： 51) ) 1 L、 10 μ Μリバース 'プライマー (Notl サイト（下線部）を含む、 5， -ATTAATCAGCGGCCGCTCACGGGGATCCAACAG A T-3' (配列番号： 52) ) 1 μ L、テンプレートとして pGEX-2TK 100ng、 5U/ μ L Expand High FidelityPLUS PCRシステム 0.2 μ Lを混合し、全量が 20 μ Lとなるように MilliQ水 を加え、以下の条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 2分間の加熱処理後、 95°Cで 30 秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒の 3工程を 10回繰り返した。反応液を 1%ァガロース ST ANDARD 01ゲルを用いて電気泳動し、約 0.70kbpのバンドをレコチップで回収した。 フエノール'クロロフォルム抽出、イソプロパノール沈殿を行うことで、この DNA断片を 精製した。 DNA断片を終濃度 0.75U/ μ Lの Xbal及び 0.5U/ μ Lの Notlで処理し、同様 に処理した pBluescriptll 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライゲ ーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 Lを加え、氷上で 30分間 静置した後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 100 /z g/mLの アンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニ 一力 Gly-His -GST配列が挿入されているものを選択し、このベクターを pBluescript
6
II/Gly-His -GSTとした。
6
ii) pBluescriptll/Fc γ R/Gly— His—GSTベクターの構築
6
4種類の Fc y R、即ち Fc y RIA、 Fc y RIIA、 Fc y RIIB、 Fc y RIIIAの細胞外ドメイン遺 伝子配列を pBluescriptll/Gly-His -GSTに挿入するため、以下の操作を行った。氷
6
上で添付された 5x緩衝液 4 レ 2.5mM dNTP 1.6 レ Fc γ R細胞外ドメイン配列を 増幅する 10 Mフォワード'プライマー (Fc y RIA : HindIIIサイト（下線部）を含む、 5，- CCCCAAGCTTGCCGCCATGTGGTTCTTGACAACTC-3， （配列番号： 53)、 Fc γ RIIA： Hindlllサイト（下線部）を含む、 5， -AACAAAAGCTTGCCGCCATGGAGACCC AAATGTCT-3， （配列番号： 54)、 Fc γ RIIB： Hindlllサイト（下線部）を含む、 5， - CC CCAAGCTTGCCGCCATGGGAATCCTGTCATTCT-3， （配列番号： 55)、 Fc γ RII IA : EcoRIサイト（下線部）を含む、 5， -ATATGAATTCGCCGCCATGTGGCAGCTGC TC- 3， （配列番号： 56) ) l /z L、 10 Mリバース 'プライマー (Fe y RIA : Xbalサイト（下 線部）を含む、 5， -GCGAATCTAGAATGAAACCAGACAGGAG-3' (配列番号： 57) 、 Fc γ RIIA： Xbalサイト（下線部）を含む、 5， - ACGATTCTAGACA TTGGTGAAGAG CTGCC-3' (配列番号： 58)、 Fc γ RIIB： Xbalサイト（下線部）を含む 5， - ACGATTCT AGACATCGGTGAAGAGCTGGG-3 ' (配列番号： 59)、 Fc γ RIIIA : Xbalサイト（下線 部）を含む 5， -CGGCATCTAGATTGGTACCCAGGTGGAAAG-3' (配列番号： 60) ) 1 μ L、テンプレートとして全長 Fe y R遺伝子挿入済みベクター 100ng、 5U/ μ L Expan d High FidelityPLUS PCRシステム 0.2 μ Lを混合し、全量が 20 μ Lとなるように MilliQ水 を加え、以下の条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 2分間の加熱処理後、 95°Cで 30 秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒の 3工程を 10回繰り返した。反応液を 1%ァガロース ST ANDARD 01ゲルを用いて電気泳動し、 Fc γ RIAは約 0.88kbp、 Fc γ RIIAは約 0.65kb p、 Fc γ RΠBは約0.65kbp、 Fc γ RIIIAは約 0.73kbpのバンドをレコチップで回収した。 フエノール'クロロフォルム抽出、イソプロパノール沈殿を行うことで、これらの DNA断 片を精製した。 Fc y RIA、 Fc y RIIA, Fc y RIIB DNA断片を終濃度 1.0U/ μ Lの Hindlll 及び 0.75U/ μ Lの Xbalで、 Fc y RIIIAを 0.5U/ μ Lの EcoRI及び 0.75U/ μ Lの Xbalで処 理し、同様に処理した pBluescriptll /Gly-His -GST 50ngと、 1.5Uの T4 DNAリガーゼ
6
を用いて室温で 30分ライゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間静置した後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上 においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°C で 1晚培養し、生じたコロニー力も Fe y Rの細胞外ドメイン遺伝子が挿入されているも のを選択し、このベクターを pBluescriptll/Fc γ R/Gly- His -GSTとした。
6
iii) pcDNA3.1/Zeo/Fc y R/Gly- His -GSTベクターの構築
6
Fc y R/Gly-His -GST配列を pBluescriptll/ベクターから pcDNA3.1/Zeoベクターに
6
移し変えるため、以下の操作を行った。 0.5 μ gの pBluescriptll/Fc y R/Gly- His -GST
6 に対して、終濃度 0.5U/mLの Apal及び 0.5U/mLの Notlで処理し、 1%ァガロース STA NDARD 01ゲルを用いて電気泳動した後、 Fc y RIAは約 1.58kbp、 Fc γ RIIAは約 1.35 kbp、 Fe y RIIBは約 1.35kbp、 Fc γ RIIIAは約 1.43kbpのバンドをレコチップで回収した 。これとは別に、 pcDNA3.1/Zeoベクターを終濃度 0.5U/ μ Lの Apal及び 0.5U/ μしの Notで処理した。フエノール'クロロフォルム抽出、イソプロパノール沈殿を行うことで、 両 DNA断片を精製した。制限酵素処理済み pcDNA3.1/Zeo 50ngと、切り出した 1¾ γ R/Gly-His -GST遺伝子を混合し、 1.5Uの T4 DNAリガーゼを用いて室温で 30分ライ
6
ゲーシヨンした。反応液に大腸菌コンビテントセル DH5 a 100 /z Lを加え、氷上で 30分 間静置した後、 42°Cで 45秒熱ショックを与えた。 2分間氷上においた後、 100 /z g/mL のアンピシリンを含む LB培地プレートに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロ ニーから、 Fc y R/Gly-His -GST遺伝子が挿入されているものを選択し、これらのベタ
6
ターを、 pcDNA3.1/Zeo/Fc y R/Gly— His—GSTとした。
6
[0079] iv) pcDNA3.1/Zeo/Fc y RIIIA(F)/Gly- His -GSTベクターの構築
6
m)で作成したpcDNA3.1/Zeo/Fc γ RΠIA/Gly-His - GSTベクターは V型 Fc γ RIIIA
6
であった。 Site-Directed Mutagenesisによる変異導入を行って pcDNA3.1/Zeo/Fc γ R IIIA(F)/Gly-His -GSTベクターを作成するため、以下の操作を行った。氷上で添付さ
6
れた 10x緩衝液 2 レ 2.5mM dNTP 1.6 レ変異導入のための 10 μ M senseプライ マー (5，- TCTGCAGGGGGCTTTTTGGGAGTAAAAAT- 3 ' (配列番号： 61) ) 0.5 Lゝ ΙΟ Μ antisenseプライマー (5 '— ATTTTTACTCCCAAAAAGCCCCCTGCAGA— 3 ' (配列番号： 62) ) 0.5 μ L、テンプレートとして pcDNA3.1/Zeo/Fc γ RIIIA(157V)/Gly- His -GST lOngゝ 2.5U/ ^ L Plu Polymerase 0.4 μ Lを混合し、全量が 20 μ Lとなるよう
6
に MilliQ水を加え、以下の条件で PCRを行った。即ち、 95°Cで 2分間の加熱処理後、 95°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 68°Cで 8分の 3工程を 14回繰り返した。終了後、反応液に 20U/ /Z Lの Dpnlを 0.3 /z Lカ卩えて 37°Cで 1時間インキュベートした。反応液に大腸菌コ ンピテントセル DH5 a 100 μ Lを加え、氷上で 30分間静置した後、 42°Cで 45秒熱ショッ クを与えた。 2分間氷上においた後、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB培地プレー トに全量を撒いた。 37°Cで 1晚培養し、生じたコロニーから Fe y RinA(F)/Gly- His - GS
6
T配列が挿入されているものを選択し、このべクターをpcDNA3.1/Zeo/Fc γ RΠIA(F)/ Gly-His -GSTとした。
6
[0080] v) 293Tへの遺伝子導入と培養
293Tを lxlO7となるよう 150mm細胞培養ディッシュに播種し、 37°C、 CO濃度 5%で 24
2
時間培養した。 TransFast Transfection Reagentを用いて 48 gの pcDNA3.1/Zeo/Fc y R/Gly-His -GSTをトランスフエクシヨンし、 37°C、 CO濃度 5%で 24時間培養した。 培地を破棄し、トリプシン処理した細胞を、 10%ゥシ胎児血清、 g/mLゼォシン、 1 00U/mLペニシリン、 100 μ g/mL streptomycinを含む DMDM選択培地 120mLに懸濁 し、 4枚の 150mm細胞培養ディッシュに再播種した後、 37°C、 CO濃度 5%で 7日間培
2
し 7こ。
[0081] vO Fc y受容体の精製
培養上清を 50mLコ-カルチューブに集め、 3000gで 20分遠心し、ペレットを取らな いように三角フラスコに集めた。 lmLの Ni-NTAァガロースを詰めたカラムに 5mLの Na tive Binding緩衝液を通して平衡化してから培養上清全てを通した。 5mLの Native W ash緩衝液を通してカラムを洗浄し、非特異的な吸着物を除去した後、 Native Elutio n緩衝液を通し、 1フラクション当たり 400 L回収した。 SDS-PAGEを行った後、 BIO- Safe Coomassieで染色し、泳動解析プログラム Image Jを用いて定量した。
[0082] (7- 2) Fc受容体結合性測定
用意した Fc γ R (Fc γ RIA、 Fc y RIIA、 Fc y RIIB、 Fc y RIIIAVal、 Fc y RIIIAPhe)を PBS で 4 μ g/mLに調整し、 96ゥエルプレートに 50 μ Lずつ分注した。 4°Cでー晚静置した 後、溶液を破棄し、 ELISA Assay緩衝液（0.5% BSA、 2mM EDTA、 0.05% Tween20、 2 5mM TBS (pH 7.4))を各ウエノレに 180 Lずつカロえ、 37°Cで 2時間静置してプレート をブロッキングした。溶液を廃棄し、 ELISA Assay緩衝液で段階希釈した抗体溶液を 50 Lずつゥエルにカ卩え、 37°Cで 2時間反応させた。抗体溶液を廃棄し、 150 Lの E LISA Assay緩衝液でゥエルを 3回洗浄した。 0.33 μ g/mLの HRP標識ャギ抗ヒト Kapp a鎖抗体を含む ELISA Assay緩衝液を各ゥエルに 50 μ Lずつ分注し、 37°Cで 1時間 静置した。抗体溶液を除いた後、 150 Lの ELISA Assay緩衝液でゥエルを 3回洗浄 し、基質溶液（0.4% 0—フエ-レンジァミン 2塩酸塩、 0.003% H 0を含む、 pH 5.0タエ
2 2
ン酸ナトリウム緩衝液 ) 50 Lを分注した。遮光して室温で 10分間静置した後、マイク 口プレートリーダーで A450の測定を行った（図 9)。
[0083] 図 9-1に示すように、 Fc y RIAにつ 、ては、 、ずれの抗体も親和性に大きな差がな かった。抗体結合最大値の 50%を示す抗体濃度 Ab50は、どの抗体改変体について も 0.1〜0.3 nMの範囲にあった。
[0084] 図 9-2に示すように、 Fe y RIIAに関しては、改変体の結合強度は、 Tl、 Τ2、 Τ3〉Τ0、 D3〉D0〉D1、 D2〉Mの順であった。 Trimersがもっとも強ぐ次に Dimersであり、 Mがもつ とも弱い。 Trimersの Ab50は Mのそれに比べて約 100倍も開きがあった。 D3の Ab50も Mのそれと比べて 60倍前後小さい。 Trimersの間で比較すると、スぺーサ一がある T1 と T2と T3がスぺーサ一がない TOよりも強い結合活性を示した。 Dimersでも、 D3の方 力 ¾0よりも強かった。 D1と D2が弱いのは、その標品中に Dimersよりも Monomerが多く 含まれて 、たせ 、であろう。
[0085] 図 9-3に示すように、 Fe y RIIBに関しても、改変体の受容体結合活性は、 Trimers) Dimers〉Mの順だった。この受容体においても、スぺーサ一がある T1と T2と T3がスぺ ーサ一のない TOよりも強かった。 D3と D0の差は見られなかった。 T1と T2と T3の Ab50 が約 0.5 nMで、 D3のそれは約 5 nM、 Mのそれは約 50 nMであった。
[0086] Fc y RIIIAには遺伝子多型があり、 158番目のアミノ酸がパリン型とフエ-ルァラニン 型が存在する。図 9- 4に示すように、 Fe y RIIIAValに関しても、 Tl、 T2、 T3〉T0、 D3、 DO 〉D2、 Dl、 Mという結合強度を示した（図 9- 4)。 T1と T2と T3の Ab50は約 0.5 nM、 TOと D 3と DOの Ab50は約 2 nM、 Dlと D2と Mの Ab50は約 30 nMであった。もう 1つの Fe y RIIIA Phe型は Fc γ RIIIAVal型よりも親和性が弱いが、 Trimers〉Dimers〉Mの順は同じであった (図 9-5)。
[0087] (実施例 8)： ADCC活性試験
(8- 1) PBMCエフェクター細胞の調製
エフェクター細胞として末梢血単核細胞 (PBMC)懸濁液を調製するため、以下の 操作を行った。健康成人から lOOmLの血液を採取した。 lOOmLの血液に 80mLの 3.5% Dextran200000 (和光純薬工業社製）、 0.9%塩化ナトリウム水溶液を加え、転倒混和 した。室温で 20分静置し、大部分の赤血球を沈殿させた。上清 25mLを 50mLコ-カル チューブに移し、 25mLの RPMI1640培地をカ卩えた。 400gで 10分遠心し、細胞をペレツ トとした後、上清を破棄した。 20mLの RPMI1640培地をカ卩えて細胞を再懸濁し、再び 4 00gで 10分遠心し、細胞をペレットとした後、上清を破棄した。 30mLの RPMI1640培地 に細胞を懸濁させ、 15mLのフイコールパックプラス (Amersham社製）に界面が乱れな いように重層した。 400gで 30分遠心し、血漿と分離液の間に帯状となった白濁層を別 の 50mLコ-カルチューブに移した。 20mLの RPMI1640培地を加えて 400gで 10分遠心 した。ペレットを確認し、上清を捨て、 15mLの ADCC Assay緩衝液（フエノールレッド を含まない RPMI 1640、 1%ゥシ胎児血清、 2mM L—グルタミン、 10mM HEPES(pH7.2) 、 lOOU/mLペニシリン、 lOOmg/mLストレプトマイシン）をカ卩えて、再び 400gで 10分遠 心した。ペレットを確認し、 5xl06/mLとなるように ADCC Assay緩衝液に懸濁させ、こ れを PBMC懸濁液とした。
[0088] (8- 2) ADCC活性測定
2xl05/mLとなるように、 ADCC Assay緩衝液にターゲット細胞として Ramosを懸濁さ せ、 96ゥエル丸底マルチプレート（FALCON353077)に 50 μ Lずつ分注した (104cells/ well)。 ADCC Assay緩衝液で各抗体を段階希釈し、 50 Lずつプレートに添カ卩した 後、 37°C、 5%CO条件下で 30分インキュベートした。（1)で調製した PBMC懸濁液 50
2
μ Lを各ゥエルに添カ卩し、 37°C、 5%CO条件下で 4時間インキュベートした（2.5xl05/w
2
ell、エフェクター：ターゲット = 25 : 1となる）。プレートを 300gで 10分遠心し、上清 50 Lを 96ゥエルプレートに移した。 Cytotoxic Detection kit(Roche社製)反応液を調製し、 50 Lを 96ゥエルプレートに分注した。室温で 30分反応させ、 450nmの吸光度を測定 した。得られた A450を元に、「細胞毒性（％) = 100 x (被検体—ターゲット 'コントロー ルーエフェクター 'コントロール）/ (2% Tweenコントロール ターゲット 'コントロール） 」の式を用いてを算出した。ターゲット 'コントロールは、エフェクター細胞を添加する 段階で、代わり〖こ ADCC Assay緩衝液をカ卩えたものである。ェフエクタ一'コントロー ルは、ターゲット細胞を添加する段階で、代わり〖こ ADCC Assay緩衝液を加えたもの である。
[0089] 図 10に示すように、 T1と T2と T3がもっとも強力な ADCC活性を示し、次いで T0と D3 であった。 D1と D2と Mでは、もっとも高い抗体濃度でもわずかな殺細胞活性しか見出 されなかった。ターゲット細胞に結合しないトラスッズマブ trastuzumabはまったく細胞 毒性を示さな力つた。
[0090] (実施例 9) : CDC活性試験
ターゲット細胞として使用するため、 CD20陽性ヒトバーキットリンパ腫細胞 Ramosを、 10%非働化ゥシ胎児血清、 ImMピルビン酸ナトリウム、 lOOU/mLペニシリン、 100 /z g/ mLストレプトマイシンを含む RPMI1640を用いて、 37°C、 5%CO条件下で培養した。 Ra mosを RHB緩衝液（フエノールレッドを含まない RPMI 1640 (Sigma Aldrich社製）、 20m M HEPES(pH7.2) (同人化学社製）、 2mM L グルタミン（和光純薬工業社製）、 0.1% BSA、 lOOU/mLペニシリン、 100mg/mLストレプトマイシン）で洗浄後、 106cells/mLとな るように調整し、 50 Lずつ 96ゥエル平底マルチプレートに分注した (5xl04/well)。 RH B緩衝液で段階希釈した 50 Lの抗体と、同じく RHB緩衝液で 12倍希釈した 50 L のべイビ■ _·ラビット新鮮血清（Cedarlane Laboratories社製）をカ卩え、 37°C、 5%CO条
2 件下で 2時間インキュベートした。 50 μ Lの Alamar Blue (AccuMed International社製） を各ゥエルに添カ卩し、 37°C、 5%CO条件下でー晚インキュベートした。翌日、プレート
2
のフタをはずし、蛍光プレートリーダー（PerSeptive Biosystems社製， CYTOFLUOR S eries 4000)を用いて、 530nmの励起光を照射し、 590nmの蛍光を測定した。 RFU(Rela tive Fluorescent Unit)として得られたデータから、細胞毒性（％) = 100 x (RFUバッ クグランド一 RFU被検体） I RFUバックグランド」の式によって算出した。 RFUバックグ ランドは、抗体を添加する段階で、抗体の代わりに RHB緩衝液を加えたゥェルカゝら得 られた RFUである。
[0091] 図 11に示すように、改変によって CDC活性の変化は見られなかった。また、コント口 ールとしてのトラスッズマブではまったく細胞毒性を示さなカゝつた。
産業上の利用可能性
[0092] 本発明によって、抗体のエフェクター活性を増強する新規方法が提供された。本方 法を用いれば、抗体 抗原の結合活性にはこだわらず、エフェクター活性増強により 、少量でより効果的な抗体医薬を提供することが可能になる。癌細胞等の標的細胞 に特異的な抗原に親和性の高い抗体を選別し、本方法により改変すれば、きわめて 治療効果の高い抗体医薬を得られると期待できる。また、既に治療実績のある既存 の抗体医薬をより効果的に改変することも可能になると考えられる。

Claims

請求の範囲
[I] 抗体の重鎖 C末端に、 Fcドメインを含む構造物を 1個または複数個直列に連結するこ とを特徴とする、抗体のエフェクター活性を増強する方法。
[2] 上記構造物が、 Fcドメインの N末端側にスぺーサーポリペプチドを有する構造物であ る、請求項 1記載の方法。
[3] 上記複数個が 2個である、請求項 1または 2記載の方法。
[4] 上記エフェクター活性が抗体依存性細胞介在性細胞障害活性 (ADCC活性)である
、請求項 1から 3のいずれ力 1項に記載の方法。
[5] 抗体の重鎖 C末端に、 Fcドメインを含む構造物を 1個または複数個直列に連結するこ とを特徴とする、エフェクター活性が増強された抗体改変体の製造方法。
[6] 下記工程 (a)および (b)を含む、エフェクター活性が増強された抗体改変体の製造方 法。
(a)抗体重鎖 C末端に Fcドメインを含む 1または複数個の構造物が直列に連結された H鎖改変体をコードするポリヌクレオチドおよび L鎖をコードするポリヌクレオチドを発 現させる工程
(b)上記ポリヌクレオチドの発現産物を回収する工程
[7] 上記構造物が、 Fcドメインの N末端側にスぺーサーポリペプチドを有する構造物であ る、請求項 5または 6記載の方法。
[8] 上記複数個が 2個である、請求項 5から 7のいずれか 1項に記載の方法。
[9] 上記エフェクター活性が抗体依存性細胞介在性細胞障害活性 (ADCC活性)である
、請求項 5から 8のいずれ力 1項に記載の方法。
[10] 請求項 5から 9のいずれかの製造方法によって製造された、エフェクター活性が増強 された抗体改変体。
[II] 抗体の重鎖 C末端に、 Fcドメインを含む構造物が 1または複数個直列に連結された、 抗体改変体。
[12] 請求項 10または 11に記載の抗体改変体を投与することを特徴とする、細胞性免疫 を強化する方法。
[13] 抗体が B細胞特異的分化抗原 CD20に対する抗体である、請求項 1から 9のいずれか 1項に記載の方法。
抗体が B細胞特異的分ィ匕抗原 CD20に対する抗体である、請求項 10または 11【 載の抗体改変体。
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