WO2007094330A1 - ボンベシン様ペプチド受容体を活性化するペプチド、およびその利用 - Google Patents

ボンベシン様ペプチド受容体を活性化するペプチド、およびその利用 Download PDF

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WO2007094330A1
WO2007094330A1 PCT/JP2007/052552 JP2007052552W WO2007094330A1 WO 2007094330 A1 WO2007094330 A1 WO 2007094330A1 JP 2007052552 W JP2007052552 W JP 2007052552W WO 2007094330 A1 WO2007094330 A1 WO 2007094330A1
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WO
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peptide
seq
amino acid
bombesin
present
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PCT/JP2007/052552
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Inventor
Makiko Suwa
Takatsugu Hirokawa
Hidehito Mukai
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a peptide that activates a bombesin-like peptide receptor and use thereof.
  • Bombesin is a 14-residue bioactive polypeptide isolated and identified from rat uterine smooth muscle contractile activity and chicken small intestine smooth muscle contractile activity from European skin L skin.
  • Bactesin primary sequence pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-TYp-Ala-Va ⁇ Gly-His-Leu-Met-NH, SEQ ID NO: 4, Non-Patent Document 1).
  • the forces identified by Lanatensin and Aaleticin were also identified by the skin.
  • These peptides have a homologous sequence at the C-terminal part of the peptide.
  • Non-Patent Document 2 GRP-10—Next Sequence: Gly-Asn-His-TYp-Ala-Va Gly-His-Leu-Met-NH, SEQ ID NO: 8, Non-Patent Document 3, NMB—Next Sequence ⁇ lj: Gly_Asn-Leu-T ⁇ -Ala- Thr-Glv
  • Non-Patent Document 4 it was revealed that bombesin-like peptides exist in mammals. Furthermore, studies using antibodies against GRP and NMB revealed that bombesin-like peptides are bioactive peptides that are widely distributed in both the brain and intestinal tract in mammals, so-called brain-gut p-marked tides. It became clear that it was a family peptide which comprises. It has also been clarified that NMB has its amino terminal extensions, big neuromedins B-30 and B-32, also present in mammals.
  • GRP and NMB regulate body temperature, increase blood sugar, regulate hypothalamic and pituitary hormone secretion, and modify digestion and absorption in the center.
  • many gastrointestinal hormone secretion stimulating actions including gastrin, insulin, cholecystokinin, gastric acid secretion regulating action, vaginal secretion stimulating action, gastrointestinal motility regulating action. It has been clarified that it has a wide variety of biological activities such as blood pressure increasing action, antidiuretic action, smooth muscle contraction stimulating action, cell proliferation stimulating action (Non-patent Document 5).
  • NBBR or BBS-I
  • GRP bombesin receptor subtypes 1 that are selective for NMB and its analogs
  • GRPR or BBS-2
  • BRS-3 bombesin receptor subtype 3
  • BRS-3 has a low binding activity to GRP and NMB, which are known bombesin-like peptides derived from mammals. It came to be thought that a peptide ligand might exist.
  • Patent ⁇ ffl ⁇ l Anastasi, A., Erspamer, V., and Bucci, M. Arcnives of Biochemistry and Biochemistry, 148, 443-446, 1972
  • Non-Patent Document 2 McDonald, TJ, Joernvall, H "Nillson, G., Vagne, M., Ghatei, M., Bl oom, SR, and Mutt, V. Biochemical and Biophysical Research communications, 90, 227-233, 1979
  • Non-Patent Document 3 Reeve, J.R.Jr., Walsh, J.H., Chew, P., Clark, B "Hawke, D., and Shi very, J.E. Journal of Biological Chemistry, 258, 5582-5588, 1983
  • Non-Patent Document 4 Minamino, N., Kangawa, K., and matsuo, H. Biochemical and Biophysical Research communications, 114, 541-548. 1983
  • Non-Patent Document 5 Hidehito Mukai, Eisuke Munakata, Chemistry and Biology, Academic Publishing Center, 28, 152-161, 1 990
  • Non-Patent Document 6 Corjay, MH, Dobazanski, DJ, Way, JM, Viallet, J "Shapira, H” Worland, P., Sausville, EA, and Battey, JF Journal of Biological Chemistry, 266, 18771-18779, 1991
  • Non-Patent Document 7 Fathi, Z., Corjay, MH, Shapira, H., Wada, E., Benya, R., Jensen, R., Viallet, J., Sausville, EA, and Battey, JF Journal of Biological Chemistry, 268, 5 979-5984, 1993
  • Non-Patent Literature 8 Ohk, Hamazaki, H., Watase, K., Yamamoto, K., Ogura, H., Yamano, M., Yamada, K., Maeno, H., Imaki, J., Kikuyama, S ., Wada, E., and Wada, K. Natur e, 390, 165-169, 1997
  • endogenous peptide ligands are translated into proteins and then cleaved to become active matures. Therefore, expression cloning methods often used for protein function discovery cannot be applied. At present, the only way to identify endogenous peptide ligands is to extract peptides from living tissues and chemically determine their structure.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a peptide that activates a bombesin-like peptide receptor (for example, a bombesin receptor subtype).
  • a bombesin-like peptide receptor for example, a bombesin receptor subtype
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating obesity, which comprises the step of administering the peptide to a subject. More Another object is to provide a drug for preventing or treating obesity comprising the peptide as an active ingredient.
  • the present inventors have determined that the minimum activity unit T> p_Ala_X_Gly- (His / Ser) -X-Met structure of bombesin-like peptide from the human genome sequence (X is an arbitrary A plurality of sequences including (amino acid residue) (SEQ ID NO: 71) are extracted, and further, docking simulation with BRS-3 is performed, whereby the minimum activity unit of the peptide ligand that binds to and activates BRS-3 is obtained. A prediction was made.
  • the present inventors have discovered a peptidic ligand that selectively activates BRS-3, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following (1) to (22).
  • XI, X2, X3, and X4 are amino acid residues or amino acid sequences that may optionally be included.
  • X2 is Ala or Leu.
  • X1 is Lys-Lys-Arg-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 1), Tyr, pGlu (pyroglutamic acid), Ile-Ile-Asn-Leu-Glu (SEQ ID NO: 2), or Leu-Glu
  • X1 is Lys-Lys-Arg-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 1), Tyr, pGlu (pyroglutamic acid), Ile-Ile-Asn-Leu-Glu (SEQ ID NO: 2), or Leu-Glu
  • a peptide comprising the amino acid sequence of 7 or 58,
  • the amino acid sequence according to 7 or 58 is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and acts as an agonist of Bombesin receptor subtype 3. Peptide.
  • a method of activating Bombesin receptor subtype 3 in a subject comprising a step of administering the peptide according to any one of (1) to (8) to the subject.
  • the method comprises administering to the subject the DNA of (9), the vector of (10), or the transformant of (11).
  • a method for treating or preventing obesity in a subject comprising a step of administering to the subject the peptide according to any one of (1) to (8).
  • the DNA according to (9), the vector according to (10), or the transformant according to (11) A method of treating or preventing obesity in a subject, comprising the step of administering any of the above forces to the subject.
  • a drug for preventing or treating obesity comprising the peptide according to any one of (1) to (8) as an active ingredient.
  • a drug for preventing or treating obesity comprising as an active ingredient any one of the DNA according to (9), the vector according to (10), or the transformant according to (11).
  • a marker for detecting the growth of tumor cells comprising the peptide according to any one of (1) to (8) or the antibody according to (19) or (20).
  • a marker for detecting a metabolic disease comprising the peptide according to any one of (1) to (8) or the antibody according to (19) or (20).
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure and minimum activity unit of a known mammalian bombesin-like peptide.
  • A Primary sequence of known bombesin-like peptide and its minimal activity unit.
  • GRP-10 Gastrin-releasing peptide C-terminal decapeptide
  • NMB Neuromedin B.
  • B Minimal activity unit of bombesin-like peptide predicted from human genome sequence.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method for evaluating peptide ligand activity (details are described in the Examples).
  • Enzo 3-A shows a novel bombesin-like peptide sequence (1) predicted from the human genome sequence.
  • Enzo 3-B shows a novel bombesin-like peptide sequence (2) predicted from the human genome sequence.
  • FIG. 3-C is a diagram showing a novel bombesin-like peptide sequence and a pyrrolitrin-related peptide sequence predicted from the human genome sequence.
  • the ferrolithrin-related peptide is a third subfamily bombesin-like peptide (BN3-022-01-06) that exists in Riki and has not yet been confirmed in mammals.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of increasing intracellular free calcium concentration in HEK293 cells stably expressing BRS-3 of bombesin-like peptide predicted from the human genome sequence.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of increasing intracellular free calcium concentration in HEK293 cells stably expressing BRS-3 of bombesin-like peptide and pyrrolitorin-related peptide predicted from the human genome sequence.
  • the ferrolithin-related peptide is a third subfamily bombesin-like peptide (BN3_022_01-06) that exists in Rikiru and has not yet been confirmed in mammals.
  • FIG. 6 is a graph showing the stimulating peptide concentration-dependent effect of increasing intracellular free calcium concentration in HEK293 cells stably expressing BRS-3 of bombesin-like peptide and pyrrolitorin-related peptide predicted from the human genome sequence.
  • the ferrolithrin-related peptide is a third subfamily bombesin-like peptide (BN3_022_02,04) that has been found to exist in mammals.
  • FIG. 7 A graph showing the dependence of intracellular free calcium concentration on stimulating peptide concentration in NMBR, GRPR and BRS-3-overexpressing HEK293 Itoda cells of known bombesin-like peptides.
  • FIG. 8 A graph showing the dependence of the intracellular free calcium concentration on stimulating peptide concentration in HEK293 cells overexpressing bombesin-like peptides NMBR, GRPR and BRS-3, predicted from the human genome sequence.
  • FIG. 9 Dependence of stimulating peptide concentration on intracellular free calcium concentration in NMBR, GRPR and BRS-3-overexpressing HEK293 cells of bombesin-like peptide, pyrrolitorin-related peptide and bombesin predicted from human genome sequence
  • FIG. The phyllolithrin-related peptide is a third subfamily bombesin-like peptide (BN3-022-02, 04) that exists in Rikiru and has not yet been confirmed in mammals.
  • the present invention relates to a peptide comprising a minimal activity unit of a bombesin-like peptide.
  • XI, X2, X3, and X4 are amino acid residues or amino acid sequences that may be optionally included, and as long as they are functionally equivalent to the peptide of the present invention, the amino acid sequence structure Is not particularly limited. “Optionally included” includes cases where there is no amino acid corresponding to that position.
  • “functionally equivalent” means that the target peptide retains the function of activating the bombesin-like peptide receptor, that is, the function as an agonist.
  • bombesin-like peptide receptors include bombesin receptor subtype 3 (BRS-3), bombesin receptor subtype 1 neuromedin B receptor (NMBR, BBS-1), Alternatively, gastrin releasing peptide receptors (GRPR, BBS-2) which are bombesin receptor subtype 2 can be mentioned.
  • the function of the peptide of the present invention includes, but is not particularly limited to, a function of selectively activating bombesin receptor subtype 3.
  • “acting as a selective agonist of bombesin receptor subtype 3” means a concentration of 1/10 or less, preferably compared to bombesin receptor subtype 1 and / or 2. It means that subtype 3 is activated at a concentration of 1/100 or less, more preferably 1/1000 or less. It also includes acting as a bombesin receptor subtype 3 agonist and not as a bombesin receptor subtype 1 and Z or subtype 2 agonist.
  • the peptide When the peptide is administered to the subject, the subject also loses weight, suppresses appetite, promotes cell proliferation, promotes gastrointestinal hormone secretion, promotes smooth muscle contraction, or regulates blood pressure. It can be regarded as functionally equivalent to the peptide of the present invention.
  • the amino acid residue corresponding to the above formula X3 is not limited to Cys, Val, or Phe.
  • amino acid sequence corresponding to the above formula X4 examples include Ser-Phe_Met and His_Phe_Met, but are not particularly limited thereto.
  • amino acid residue corresponding to the above formula X2 is not particularly limited to the force capable of mentioning Ala or Leu.
  • amino acid residue or amino acid sequence corresponding to the above formula XI includes Lys-Lys-Arg.
  • the peptides of the present invention may be chemically modified as long as they are functionally equivalent.
  • Chemical modifications of peptides include acetylation, amidation (carboxynole terminus), anilide (force carboxyl terminus), benzyloxycarbonylation, biotinylation, dansylation, DNPNP, fatty acid addition, formylation, nitro Powers that can include, but are not limited to, phosphorylation, serine phosphorylation, threonine phosphorylation, tyrosine phosphorylation, succinylation, sulphonylation, and the like.
  • chemical modification may be performed using an enzyme. The above chemical modification can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • Preferable examples of the chemical modification of the peptide of the present invention include carboxyl-terminal amidides.
  • the side chain when gnoletamine is present at the amino terminal, the side chain may be closed to form pyrologrenomic acid (pGlu).
  • pGlu pyrologrenomic acid
  • this glycine was converted to an amino group by a C-terminal amidation enzyme such as peptidyldaricin-amidated monooxygenase. It can be a thing.
  • Preferred examples of the peptide of the present invention include a peptide represented by the amino acid sequence ljTYp_Ala-Phe-Gly-His-Phe-Met-NH (SEQ ID NO: 21), an amino acid sequence Tyr-Ile-Ile-Asn -Leu-Gl
  • a peptide represented by u-Ala-T ⁇ -Ala-Phe-Gly-His-Phe-Met-NH (SEQ ID NO: 27),
  • peptide of the present invention a peptide represented by the amino acid sequence Leu-T--Ala-Cys-Gly-Ser-Phe-Met (SEQ ID NO: 3) can be mentioned. .
  • the peptide of the present invention is a peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the specific amino acid sequence described above, Peptides that are functionally equivalent to peptides having the above amino acid sequences are also included.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but preferably within 5 amino acids (eg, within 1, 2, 3, 4, 5 amino acids) ).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chains are: hydrophobic 'amino acids (A, I, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic permanent amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atoms Amino acids with side chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with base-containing side chains (R, K, ⁇ ), aromatics Amino acids having side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (the parentheses indicate single letter amino acids).
  • One or more of a certain amino acid sequence It is already known that polypeptides having amino acid sequences modified by deletion, addition and / or substitution by other amino acids of several amino acid residues retain their biological activity.
  • the peptide of the present invention can be produced by organic chemical synthesis or by decomposing a precursor protein containing the peptide of the present invention (the above-mentioned amino acid sequence IJ).
  • organic chemical synthesis include automated peptide synthesis methods (Boc solid phase method, Fmoc solid phase method, etc.) known to those skilled in the art or classical organic chemical synthesis methods, and are not particularly limited. Absent.
  • a protease known to those skilled in the art can be used under appropriate conditions.
  • Proteases include serine proteases (eg, trypsin, chymotrypsin, subtilisin), aspartic proteases (eg, pepsin, cathebsin D, HIV protease), metalloproteases (eg, thermolysin), cysteine proteases (eg, papine, caspase), N- The ability to list terminal threonine protease, glutamate protease, etc.
  • serine proteases eg, trypsin, chymotrypsin, subtilisin
  • aspartic proteases eg, pepsin, cathebsin D, HIV protease
  • metalloproteases eg, thermolysin
  • cysteine proteases eg, papine, caspase
  • the present invention relates to DNA encoding the peptide of the present invention.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention includes genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA.
  • Genomic DNA and cDNA can be prepared using methods known to those skilled in the art.
  • genomic DNA for example, genomic DNA is extracted from cells expressing bombesin-like peptide receptors, and a genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as a vector) is created. This can be expanded and prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on DNA encoding the peptide of the present invention. .
  • a primer specific to the DNA encoding the peptide of the present invention It is also possible to prepare a primer specific to the DNA encoding the peptide of the present invention and perform PCR using this primer.
  • cDNA is synthesized based on mRNA extracted from cells expressing a bombesin-like peptide receptor, and inserted into a vector such as ⁇ ZAP to prepare a cDNA library. It can be prepared by developing and performing colony hybridization or plaque hybridization in the same manner as described above, or by performing PCR.
  • the DNA of the present invention can be used for mass expression of the peptide of the present invention or mass production of a recombinant peptide.
  • the present invention relates to a vector containing the DNA, and a transformant (host cell) into which the vector has been introduced. Furthermore, the present invention relates to a method for producing the peptide, comprising a step of culturing or breeding the transformant and recovering a recombinant protein from the transformant cell or a culture supernatant thereof.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention in a host cell or for expressing the peptide of the present invention.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in Escherichia coli in order to amplify it in large quantities using Escherichia coli (for example, JM109, DH5, HB101, XLlBlue). If you have a selected gene of E. coli that has been transformed (for example, a drug resistance gene that can be discriminated by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol), etc.) Absent.
  • Escherichia coli for example, JM109, DH5, HB101, XLlBlue.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • M13 vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • pUC vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the host is E. coli such as JM109, DH5 ct, HB101, XLl-Blue.
  • a promoter that can be expressed efficiently in E. coli, such as the lacZ promoter, araB promoter, or T7 promoter.
  • pGEX-5X_l manufactured by Pharmacia
  • QIAexpress system Qiagen
  • pEGFP pEGFP
  • pET the host expresses T7 RNA polymerase
  • the vector may include a signal sequence for protein secretion.
  • the pelB signal sequence may be used when the periplasm of E. coli is used for production.
  • the introduction of the vector into the host cell For example, it can be carried out by using the calcium chloride method or the electopore position method.
  • vectors for producing the protein of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BO S, pEF, pCDM8).
  • mammalian-derived expression vectors for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BO S, pEF, pCDM8.
  • Insect cell-derived expression vectors eg, “Bac_to_BAC baculovirus expression system” (Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV PAdexL cw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit J (manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01), derived from Bacillus subtilis Expression vectors (for example, pPL608, pKTH50) can be mentioned.
  • Bacillus subtilis Expression vectors for example, pPL608, pKTH50
  • promoters necessary for expression in cells such as SV40 promoter, MML V-LTR promoter, EF1 promoter It is indispensable to have a CMV promoter, etc., and it is even better if you have a gene to select for transformation into cells.
  • Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway has a DHFR gene complementary thereto.
  • examples include a method of introducing a vector (for example, pCHOI) and amplifying with methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • a gene expressing SV40T antigen is chromosomally expressed.
  • An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using the above COS cells.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reduction Can contain enzyme (dhfr) gene, etc.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reduction
  • the DNA of the present invention is used as a method for expressing the DNA of the present invention in an animal body.
  • the method include integration into an appropriate vector, and introduction into a living body by, for example, the retrovirus method, ribosome method, cationic liposome method, adenovirus method, and the like.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for production and expression of the peptide of the present invention.
  • Production systems for peptide production include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as a host.
  • Animal cells include mammalian cells, e.g. CHO, COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, e.g. African megal oocytes, or insect cells, e.g. Sf9, Sf21 Tn5 is known.
  • CHO cells dhfr-CHO and CHO K-1, which are CHO cells deficient in the DHFR gene, can be preferably used.
  • CHO cells are particularly preferred for mass expression.
  • Vectors can be introduced into host cells by methods such as the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the cationic ribosome DOTAP (Boehringer Mannheim), the electroporation method, the lipofusion, etc. Is possible.
  • a plant cell for example, it is known as a cell force S protein production system derived from Nicotiana tabacum, which may be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger. )It has been known.
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • bacterial cells include E. coli, such as JM109, DH5 and HB101, and Bacillus subtilis is also known.
  • the peptide is obtained by transforming these cells with the target DNA and culturing the transformed cells in vitro.
  • the culture can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM is used as a culture medium for animal cells. Power to use S
  • serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culture is preferably about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30-40 ° C for about 15-200 hours, with medium exchange, aeration, and agitation as necessary.
  • examples of a system for producing a protein in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the target DNA is introduced into these animals or plants to produce and recover proteins in the animals or plants.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice and sushi When animals are used, there are production systems that use mammals and insects. As mammals, goats, pigs, hidges, mice and sushi can be used. In addition, when a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat j3 casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is then injected into a goat embryo and the embryo is transferred to a female goat.
  • the protein of interest can be obtained from the milk produced by the transgene goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • hormones may be used in the transgeneic goat as appropriate.
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which DNA encoding the target protein is inserted.
  • tobacco when using plants, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the peptide of interest is inserted into a plant expression vector, such as pM0N 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefa ciens. Introduce.
  • the bacteria can be infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired peptide can be obtained from the leaves of this tobacco.
  • the peptide of the present invention can be used after chemical synthesis or in a host cell or extracellularly (such as a medium). Can be purified as a substantially pure and homogeneous peptide. Separation and purification of peptides is not limited in any way by using the separation and purification methods used in normal protein purification. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected and assembled. When combined, proteins can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography. These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the present invention encompasses peptides that are highly purified using these purification methods.
  • the present invention relates to a bombesin receptor subtype in a subject comprising the step of administering to the subject any one of the above peptide, DNA encoding the peptide, vector carrying the DNA, or transformant.
  • the invention relates to a method of activating 3 or a method of treating or preventing obesity in a subject.
  • subject refers to an organism to which the bombesin receptor subtype 3 activator or obesity therapeutic agent of the present invention is administered, and a part of the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals)
  • the "part in the body of the organism” is not particularly limited, but preferred examples include a site where the function of bombesin receptor subtype 3 is expressed or its peripheral site.
  • administering includes oral or parenteral administration.
  • Oral administration can include administration in the form of oral agents, and as oral agents, the dosage form such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions is selected. That power S.
  • the present invention which may be orally ingested or administered in the form of health foods, functional foods, foods for specified health use, dietary supplements, enteral nutritional foods, or oral forms, is limited to these foods. Is Absent.
  • Parenteral administration can include administration in the form of injections, and as injections, intravenous injection such as infusion, subcutaneous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.
  • the power S can be raised.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing DNA to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the agent of the present invention can be locally administered to a region where treatment is desired. For example, it can be administered by local injection during surgery, use of a catheter, or targeted gene delivery of DNA encoding a peptide of the invention.
  • activating bombesin receptor subtype 3 means initiating or activating a signal transduction cascade involving bombesin receptor subtype 3.
  • signal transduction activity may include changes in Ca 2+ levels, phospholipase C activation, changes in inositol triphosphate (IP) levels, diacylglycerol levels.
  • the peptide of the present invention is administered to a subject, when the signal transduction cascade is initiated or activated in the subject, for example, in the above-mentioned Atsy system, Ca 2+ level, inositol triphosphate (IP ) Level, diacylglycerol level, adenylate
  • the peptide can be regarded as activating bombesin receptor subtype 3 when the level of lyase or adenosine cyclic 3′5′-phosphate (cAMP) is increased.
  • cAMP adenosine cyclic 3′5′-phosphate
  • the peptide of the present invention when administration of the peptide of the present invention to a subject causes weight loss, appetite suppression, cell growth promotion, gastrointestinal hormone secretion promotion, smooth muscle contraction promotion, or blood pressure regulation in the subject causes weight loss, appetite suppression, cell growth promotion, gastrointestinal hormone secretion promotion, smooth muscle contraction promotion, or blood pressure regulation in the subject Furthermore, it can be considered that the peptide activated bombesin receptor subtype 3. That is, the peptide of the present invention can also be used as a drug for causing the above-described biological phenomenon.
  • the peptide of the present invention is used as a therapeutic agent for a symptomatic disease such as diabetes by regulating gastrointestinal hormone secretion. I can do it.
  • treating or preventing obesity means improving or preventing obesity symptoms (weight gain, body fat percentage increase), or suppressing complications associated with obesity.
  • complications associated with obesity include diseases based on insulin resistance, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, promotion of arteriosclerosis, or coronary artery disease.
  • BMI body mass index
  • body weight kg
  • m height
  • m height
  • m body weight
  • BMI body mass index
  • BMI ⁇ 25 is determined and one of the following conditions is met, the patient is diagnosed with obesity requiring weight loss treatment.
  • a health disorder related to obesity that requires or can be improved by weight loss.
  • Lesions with health problems, Easiness, High-risk obesity Visceral fat-type obesity suspected of upper body obesity by screening physical measurements and confirmed by abdominal CT examination.
  • the obesity symptom is improved in the subject, for example, when the body weight decreases (BMI value decreases) or the body fat percentage decreases.
  • a peptide can be regarded as treating or preventing obesity.
  • the present invention provides an agent for preventing or treating obesity, which contains any one of the above peptide, DNA encoding the peptide, vector that holds the DNA, or transformant as an active ingredient.
  • the agent of the present invention can be paraphrased as a therapeutic agent for obesity and a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity.
  • a pharmaceutical acceptable carrier such as a preservative or a stabilizer may be added to the drug for preventing or treating obesity.
  • “Pharmaceutically acceptable” means that the material itself may be a material having an effect of treating or preventing obesity as described above, or a material having no such effect of preventing or treating. That can be administered with other drugs It means an acceptable material. Moreover, even a material that does not have an effect of preventing or treating obesity may be a material that has a synergistic or additive stabilizing effect when used in combination with the compound of the present invention.
  • Examples of the materials acceptable for pharmaceutical use include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like. be able to
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants, such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, Glycerin fatty acid esters such as glyceryl monomylate and glycerin monostearate; Polyglyceryl fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate and decaglyceryl monolinoleate; Polyoxyethylene sorbitan monolaurate , Polyoxyethylene sonolebitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxyethylene Polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester such as ethylene sorbitan tristearate; Polyoxyethylene sorbite fatty acid ester such as polyoxyethylene
  • the surfactant examples include an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as cetyl sodium sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate and the like.
  • an anionic surfactant for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as cetyl sodium sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate and the like.
  • Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average addition molar power of ethylene oxide of ⁇ 4 and an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate; sodium laurylsulfosuccinate ester Alkylsulfosuccinic acid ester salts having an alkyl group with a carbon atom number of up to 18; natural surfactants such as lecithin, glyceport phospholipids; fingophospholipids such as sphingomyelin; and having 12 to 18 carbon atoms
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20.40,60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred. Also preferred are polyoxyethylene polyoxypropylene glycols such as poloxamers (such as Pull Knick F-68 (registered trademark)).
  • the amount of surfactant to be added varies depending on the type of surfactant to be used, but in the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mg / mL, preferably 0.003 to 50 mg / mL. Yes, more preferably 0.005 to 2 mg / mL.
  • the buffering agent phosphoric acid, citrate buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, dalconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicylic acid, triglyceride
  • organic acids such as ethanolamine, fumaric acid, etc., or carbonate buffer, tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer and the like can be mentioned.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • amino acid may be a basic amino acid such as arginine, lysine, histidine, ornithine or the like, or an inorganic salt of these amino acids (preferably in the form of hydrochloride or phosphate salt, that is, phosphate. Amino acid).
  • the preferred pH value is determined by appropriate physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted.
  • physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted.
  • phosphate is particularly advantageous in that a stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • the preferred amino acid is arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as gnoretamic acid and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine,
  • aromatic amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyl tryptophan can be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, gnolecose, fructose, ratatoose, xylose, mannose, manolethose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol, and the like.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, such as D-sonolebitonore, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride. It may also be used in combination with an appropriate solubilizing agent such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant polysorbate 80, HCO-50) and the like.
  • solubilizing agent such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant polysorbate 80, HCO-50) and the like.
  • it may further contain a diluent, a solubilizer, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine and N-acetate.
  • Sulfhydryl groups such as tilhomocistine, thiotate, thiodiglycol, thiodiethanol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, sodium thiosulfate, glutathione, and thioalkanoic acids having 1 to 7 carbon atoms
  • antioxidant in the present invention for example, erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butinorehydroxyanisonore, hitocoferonole, tocopherolole acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L -Ascorbyl palmitate, L-ascorbyl stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediammine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate, etc.
  • EDTA disodium ethylenediammine tetraacetate
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, Nanoparticles and nanoforces can also be used (see Remingtons Pharmaceutical Science 1 edition, Oslo Ed., 1980, etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; US Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 5 47 — 556 ; EP 1 33 , 988 ).
  • EP European Patent Application Publication
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is selected as appropriate or in combination according to the dosage form, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to an antibody that binds to the peptide of the present invention.
  • the activity of the peptide of the present invention in the subject can be controlled.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the peptide of the present invention.
  • Examples of the antibody of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody variants, and fragments thereof.
  • a polyclonal antibody can be obtained as follows. Juvenile hormone acid methyltransferase from silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera litura Alternatively, a recombinant protein expressed in a microorganism such as E. coli or a partial peptide thereof as a fusion protein with GST is immunized to a small animal such as a rabbit and serum is obtained.
  • ammonium sulfate precipitation for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, silkworm, Drosophila, mosquito, Spodoptera, or tobacco tobacco juvenile hormone acid methyltransferase or synthetic peptide coupled
  • a monoclonal antibody for example, a young animal such as a silkworm, a fruit fly, a mosquito, a moth, or a tobacco moth is immunized to a small animal such as a mouse, or a partial peptide thereof.
  • the spleen is removed and ground to separate cells, and the cells and mouse myeloma cells are fused using a reagent such as polyethylene glycol, and from the fused cells (hybridomas) formed thereby, silkworms are used.
  • a reagent such as polyethylene glycol
  • silkworms are used.
  • the obtained hyperidoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was obtained by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, silkworm, It can be prepared by purifying it with an affinity column coupled with juvenile hormone acid methyltransferase or synthetic peptide of Drosophila, mosquito, Spodoptera or Tobacco.
  • antibody variant refers to an amino acid sequence variant of an antibody in which one or more amino acid residues are modified. Any modified amino acid variant having the same binding specificity as the original antibody is included in the “antibody variant” of the present invention.
  • Such variants have at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and most preferably the amino acid sequence of the variable domain of the antibody heavy or light chain. Preferably at least 95. / 0 of amino acid sequence homology or similarity amino acid sequence and small sequence homology than 100% with or having similar properties.
  • the present invention relates to a biomarker for detecting the growth of tumor cells, comprising the peptide of the present invention or the antibody of the present invention.
  • the biomarker of the present invention is a tumor cell It can be used to detect proliferation or to detect metabolic diseases.
  • the detection can be performed by a method known to those skilled in the art by binding a labeling substance to the peptide or antibody.
  • the labeling substance is not particularly limited. Specifically, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, radioactive substances, metal chelates and the like can be used.
  • Preferred labeling enzymes include, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, j3-D-galactosidase, malate dehydrogenase, staphylococcal nuclease, delta 5-steroid isomerase, ⁇ -glycol phosphate phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, horseradish Examples include peroxidase, asparaginase, glucose oxidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, gnorecoamylase, and acetylcholinesterase.
  • Preferable fluorescent materials include, for example, fluorescein isothiocyanate, phycopyroprotein, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, aloficocyanin, and orthophthalaldehyde.
  • Preferable luminescent materials include isoluminol, lucigenin, luminol, aromatic acyl ester, imidazole, ataridinium salt and its modified ester, noreciferin, luciferase, and equorin.
  • Preferred examples of the radioactive substance include 125 I, 127 I, m I, M C, 3 H, 32 P, and 35 S.
  • reaction of these cross-linking agents with enzymes and peptides or antibodies may be performed according to known methods depending on the properties of the respective cross-linking agents.
  • a low molecular hapten such as biotin, dinitrophenyl, pyridoxal, or fluoresamine may be bound to the peptide or antibody and indirectly labeled with a binding component that recognizes the peptide or antibody.
  • a binding component that recognizes the peptide or antibody.
  • avidin and streptavidin are used as recognition ligands.
  • dinitrophenyl, pyridoxal or fluoresamine peptides or antibodies that recognize these haptens are labeled. This enzyme is advantageous because it can react with many substrates and can be easily bound to antibodies by the periodate method.
  • fragments thereof such as Fab ′, Fa b, and F (ab ′) are used as antibodies.
  • an enzyme-labeled product can be obtained by the same treatment regardless of whether it is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. If the enzyme label obtained using the cross-linking agent is purified by a known method such as affinity chromatography, a more sensitive immunoassay system becomes possible.
  • the purified enzyme-labeled antibody should be stored with Thimerosal as a preservative and glycerin as a stabilizer.
  • the labeled peptide or labeled antibody can be stored for a longer period of time by lyophilization and storage in a cool and dark place.
  • the marker of the present invention may contain an appropriate one of the carriers described above according to the use.
  • peptide ligands that selectively activate bombesin-like peptide receptors among GPCRs were identified by the above-described steps. The details of each process are described below.
  • the DBs used are listed below.
  • Homo_sapiens.N BI35.may.pep.fa the super-set or all translations resulting from Ensembl known or novel gene predictions
  • the length is about several to tens of residues, and a cleavage motif (Gly_Lys-Lys, Gly-Arg-) by trypsin-like enzyme is placed on the C-terminal side.
  • peptide ligand candidate sequences listed in (2) above mapping to human genome sequences and searching for known protein sequences were performed again.
  • a bombesin-like peptide minimal activity unit was used as a motif.
  • T ⁇ -Ala- X-Gly (SEQ ID NO: 65) was used. Moreover, the following sequences were used as detailed motifs.
  • Trp-Ala-X-Gly- [Ser / His]-[Leu I Phe] _Met (SEQ ID NO: 66)
  • Trp-Ala-X-Gly- [Ser I His]-[Leu I Phe]-[Met I Asp I Glu] (SEQ ID NO: 67) Trp-Ala-X-Gly- [Ser I His]-[Leu I lie I Phe]-[Met I Asp I Glu] (SEQ ID NO: 68) [Leu I lie I Asp I Glu] -T ⁇ -Ala- X_Gly- Ser- [Leu I lie I Phe]-Met (SEQ ID NO: 69) [Leu I lie I Asp I Glu]-T ⁇ — Ala— [Val I Thr] -Gly- [Ser I His I Thr]-[Leu / lie / P he I Val]-[Met I Asp I Glu ] (SEQ ID NO: 70)
  • the length is several residues, a few dozen residues, and a cleavage motif by trypsin-like enzyme (Gly-Lys-Lys, Gly-Arg-Arg) on the C-terminal side.
  • Gly-Lys-Ar g Gly-Arg-Lys, Giy-Lys, Gly-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys, Lys, Arg
  • all sequences ending with a stop codon were excised and restored.
  • Trp-Ala-Leu-Gly-Ser-Leu-Met (SEQ ID NO: 10)
  • Trp-Ala-Pro-Gly-Ser-Leu-Met SEQ ID NO: 11
  • Trp-Ala-Gln-Gly-Ser-Leu-Met SEQ ID NO: 12
  • Trp-Ala-Thr-Gly-Ser-Leu-Met SEQ ID NO: 13
  • Trp-Ala-Cys-Gly-Ser-Phe-Met SEQ ID NO: 14
  • Trp-Ala-Lys-Gly-Ser-Leu-Met SEQ ID NO: 15
  • Trp-Ala-Pro-Gly-Ser-Phe-Met SEQ ID NO: 16
  • Trp-Ala-Val-Gly-Ser-Phe-Met-NH SEQ ID NO: 17
  • Trp-Ala-Ser-Gly-Ser-Leu-Met SEQ ID NO: 18
  • Trp-Ala-Gly-Gly-His-Phe-Met SEQ ID NO: 19
  • Trp-Ala-Met-Gly-Ser-Leu-Met SEQ ID NO: 20
  • Trp-Ala-Phe-Gly-His-Phe-Met-NH SEQ ID NO: 21
  • Example 1 containing the minimal activity unit predicted by Example 1 was extracted from the human genome sequence, and the extracted sequence and its derivatives with different chain lengths were chemically synthesized.
  • the amino acid sequences of the designed peptides are shown in SEQ ID NOs: 21-33 (Fig. 3-A), SEQ ID NOs: 34-53 (Fig. 3-B), and SEQ ID NOs: 3, 38, 54-64 (Fig. 3-). ⁇ )
  • the peptide of the present invention was solid-phase synthesized in a simple polypropylene reaction vessel using the following Boc method or Fmoc method, and then purified.
  • Ars has a tosyl group, Asp has a cyclohexyl group, Cys has a 4-methylbenzyl group, G1 ui this f benzyl ester, Fiisi this P; 2,4-dimtrophenyl (Dnp) , Lys (this f 2-chlorobenzylox ycarbonyl group, Ser and Thr (this f benzyl group, Tyr (this f 2-bromobenzyloxycarbonyl group Was used.
  • Boc-X-resin (X is the C-terminal amino acid of the peptide to be synthesized) with 50% TFA, cleave the N-terminal Boc group, and then add 2.5 equivalents of Boc-X to the amount of Boc-X introduced.
  • Amino acids were condensed by the DCC-HOBt method. A few hours later, Kaisar's ninhydrin test confirmed that the reaction was complete. If the reaction was not sufficient, the condensation reaction was repeated. Thus, the cleavage of the Boc group and the condensation reaction of the protected amino acid were repeated to extend the peptide chain sequentially from the C-terminus, thereby obtaining a protected peptide resin.
  • Fmoc-amino acid-resin was treated in 25% piperidine-DMF for about 30 minutes to remove the Fmo c group, then 2.5 equivalents of Fmoc-amino acid to the introduced C-terminal amino acid, HOB t, DCC and 0.5 equivalents of ⁇ , ⁇ ', ⁇ ''-diisopropylethylamine (DIEA) or 2.5 equivalents of Fmoc-amino acid, HOBt, 2.25 equivalents of HBTU and 4.5 equivalents of DIEA for 30 minutes It was carried out by repeating the operation of condensation for several hours.
  • DIEA diisopropylethylamine
  • the synthetic peptide was purified by RP-HPLC using a reverse phase ODS column (20 X 250 mm). For purification, a linear gradient of acetonitrile is applied in the presence of 0.1% TFA, and elution is performed at a flow rate of 5 ml / min. The main peak is separated using the absorption at 214 nm as an indicator, and this is freeze-dried. A purified peptide was obtained. The purity of the purified peptide was confirmed by analytical RP-HPLC using an ODS (4.5 ⁇ 150 mm) column.
  • the purified peptide is hydrolyzed in 6 N hydrochloric acid containing 2% phenol and 2% thioglycolic acid at 110 ° C for 24 hours, and the hydrolyzate is analyzed with an amino acid analyzer to determine the amino acid composition of the peptide. With confirmation, the content was quantified.
  • HEK293 cells expressing NMB receptor (NMBR), GRP receptor (GRPR) and BRS-3 were prepared by the following steps.
  • HEK293 cells or BRS-3 stably expressing HEK293 cells (BRS3 / HEK293 stable, described later) is 10. /.
  • the test was performed in a DMEM medium (10% FBS-DMEM) containing heat inactivated fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C and a CO concentration of 5%. 10 cm diameter c for cell culture
  • the cells were passaged each time they became confluent. That is, the medium of the dish in which the cells were grown to the confluent was aspirated and washed, and then washed with PBS. Subsequently, 0.025% Trypsin-EDTA was reacted at room temperature for 1 minute to recover the adhered cells (trypsin-EDTA treatment).
  • NMB receptor NMB receptor
  • GRPR GRP receptor
  • BRS-3 overexpressing HEK293 cells
  • the cells were washed with 5 ml of PBS per dish and reacted with 0.025% Trypsin-EDTA at room temperature for 1 minute to deattach the cells (trypsin-EDTA processing).
  • Trypsin-EDTA processing Add 1 ml trypsin inhibitor to inactivate trypsin, transfer this cell suspension to a 15 ml centrifuge tube, fill the cell suspension to 15 ml with PBS, and centrifuge (800 rpm). 4 minutes), the supernatant was aspirated off, suspended in 10 ml of PBS, and the number of cells was counted.
  • This cell suspension is centrifuged again, the supernatant is aspirated, and suspended in 10% FBS-DMEM to obtain 6.0-7.0 X 10 6 cells / 10 ml per dish, calculated from the number of cells counted. -Seeded in a -coated dish and cultured at 37 ° C and 5% CO. After 24 hours
  • the NMBR gene (cDNA is shown in SEQ ID NO: 72, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 73), and the GRPR gene (cDNA is shown in SEQ ID NO: 73).
  • -Cells were recovered by EDTA treatment, and cells recovered from 1 dish were replated in 2 dishes and used for activity evaluation after 24 hours (described later).
  • the equivalent of 12 ⁇ g of pcDNA3.1 cell expression vector containing the gene for resistance to the dieneticin incorporating the BRS-3 gene was added to 900 / i 1 OPTI-MEM.
  • BRS-3 stable expression cell BRS3 / HEK293 stable
  • ligand peptides that activate the bombesin-like peptide receptors NMBR, GRPR and BRS-3 expressed in HEK293 cells is assessed by the activity of increasing intracellular calcium concentration. I was worth it.
  • Example 2 The peptides and derivatives chemically synthesized in Example 2 were evaluated for bombesin-like peptide receptor activation ability by the following steps. Each cell prepared in Example 3 was used in this evaluation method.
  • Figure 2 shows a conceptual diagram of this evaluation method.
  • the receptor-expressing HEK293 cells were collected by trypsin-EDTA treatment, washed 3 times with PBS, and then washed with 1 ml of Fluo_3 loading buffer (a calcium ion sensitive fluorescent substance, Flu ⁇ -3- ⁇ 4.4 ⁇ M , Pulonic F127 0.02%, HEPES 20 mM, Probenecid 2.5 mM and BSA 0.1% in HBSS solution), and incubate at 37 ° C for 1 hour while rotating on a rotary stirrer to incorporate Fluo_3 into the cells
  • Fluo_3 loading buffer a calcium ion sensitive fluorescent substance, Flu ⁇ -3- ⁇ 4.4 ⁇ M , Pulonic F127 0.02%, HEPES 20 mM, Probenecid 2.5 mM and BSA 0.1% in HBSS solution
  • Fluo_3 loading buffer a calcium ion sensitive fluorescent substance, Flu ⁇ -3- ⁇ 4.4 ⁇ M , Pulonic F127 0.02%, HEPES 20 mM, Probenecid 2.5 m
  • BN3-001-03 SEQ ID NO: 24
  • BN3-001-04 SEQ ID NO: 25
  • BN3-001-05 SEQ ID NO: 26
  • BN3-001-06 SEQ ID NO: 27
  • BN3-001-07 SEQ ID NO: 28
  • BN 3-001-08 SEQ ID NO: 29
  • BN3-001-09 SEQ ID NO: 30
  • BN3-00 to 10 SEQ ID NO: 31)
  • BN3- 001-11 SEQ ID NO: 32
  • BN3-001-12 SEQ ID NO: 33
  • BN3- 001-13 SEQ ID NO: 21
  • BN3-006-01 SEQ ID NO: 38
  • BN3-006-02 SEQ ID NO: 54
  • BN3-00 6-03 SEQ ID NO: 55
  • BN3-006-05 SEQ ID NO: 57
  • BN3-006-06 SEQ ID NO: 3
  • BN3_006_07 SEQ ID NO: 58
  • BN3_001_07 SEQ ID NO: 28
  • BN3-001-10 SEQ ID NO: 31
  • BN3_001_12 SEQ ID NO: 33
  • BN3-006-01 SEQ ID NO: 38
  • BN 3-006-05 SEQ ID NO: 57
  • BN3-006-06 SEQ ID NO: 3
  • NMB GRP-10
  • bombesin which are natural bombesin-like peptides.
  • the ability to activate the vesin-like peptide receptors N MBR, GRPR, or BRS-3 was evaluated.
  • NMB and GRP-10 which are natural bombesin-like peptides, show little selectivity for their receptors.
  • BRS-3 is hardly activated, and bombesin is NMBR, The force showing almost the same activity against GRPR It was revealed that the activity against BRS-3 is very weak compared to the above two receptors. ( Figure 7)
  • BN3-006-06 SEQ ID NO: 3
  • BN3-001-07 sequence
  • BN3-001-10 SEQ ID NO: 31
  • BN3-001-12 SEQ ID NO: 33
  • BN3-006-01 SEQ ID NO: 38
  • BN3-006-05 SEQ ID NO: 57
  • the - ⁇ H structure (SEQ ID NO: 3) was shown to be important for the selective activation of BRS-3, an orphan GPCR.
  • the peptides identified by the present invention include three types of bombesin-like peptide receptors. Among NMBR (BBS-l), GRPR (BBS_2) and bombesin receptor subtype 3 (BRS-3), it has a function of selectively activating BRS-3. Therefore, the peptide of the present invention can be used for the purpose of selectively activating bombesin receptor subtype 3 in vivo, and binds to other receptors by its selectivity. It is very effective because it reduces the side effects caused by.
  • the peptide of the present invention exhibits an effective effect for the treatment or prevention of obesity.
  • it is expected to be applied to diabetes drugs by stimulating the secretion of knee hormones including insulin, which is predicted to be involved in BRS-3, and useful as a tumor marker.

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Abstract

　本発明者らは、まず、ヒトゲノム配列からBRS-3を活性化すると考えられる最小活性単位を含む、複数のペプチド性リガンドの構造を予測した。次に、予測したペプチドの構造を基に、最小活性単位を含むいくつかのペプチドを化学合成し、これらのペプチドのBRS-3活性化能について検討を行った。その結果、アミノ酸配列Leu-Trp-Ala-Cys-Gly-Ser-Phe-Met（配列番号：３）で示されるペプチドが、BRS-3を選択的に活性化することを見出した。

Description

明 細 書
ボンべシン様ペプチド受容体を活性化するペプチド、およびその利用 技術分野
[0001] 本発明は、ボンべシン様ペプチド受容体を活性化するペプチド、およびその利用 に関する。
背景技術
[0002] ボンべシンは、ヨーロッパ産力エル皮膚よりラット子宮平滑筋収縮活性ならびにニヮ トリ小腸平滑筋収縮活性を指標に単離 ·同定された 14残基からなる生理活性ポリべ プチドである（ボンべシン一次配列： pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-TYp-Ala-Va卜 Gly-His-Leu-Met-NH、配列番号： 4、非特許文献 1)。ボンべシンの同定とほぼ同 時期、ラナテンシン、ァリテシンもやはり力エル皮膚より同定された力 これらペプチド はその C末端部分に相同配列を持つことから、ボンべシン様ペプチドあるいはボンべ シン群へゾテト (り ombesin— like peptides or Dombesm family peptides)と総称 θれるよ うになった（ラナテンシン一次配列： pGlu-Va卜 Pro-Gln-TYp-Ala-Va Gly-His-Phe- Met-NH、配列番号： 5、ァリテシン一次配列： pGlu-Gly- Arg-Leu- Gly-Thr- Gln-TYp
-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH、配列番号： 6)。
[0003] ボンべシンに対する抗体による検討により、哺乳動物におけるボンべシン様ぺプチ ドの存在が予測されていた力 その後ガストリン放出ペプチド（GRP)およびその C末 端デカペプチド GRP_10、ならびにニューロメディン B (NMB)がブタより単離'同定さ れ（ブタ GRP—次配列： Ala-Pro_Val- Ser_Val- Gly-Gly_Gly-Thr_Val- Leu-Ala-Lys- Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Met-NH、配列番号：
7、非特許文献 2、 GRP-10—次配列： Gly- Asn-His-TYp-Ala- Va卜 Gly-His-Leu-Met -NH、配列番号： 8、非特許文献 3、 NMB—次配歹 lj : Gly_Asn-Leu-T卬- Ala- Thr-Glv
-His-Phe-Met-NH、配列番号： 9、非特許文献 4)、哺乳動物においてもボンべシン 様ペプチドが存在することが明らかとなった。さらに GRPならびに NMBに対する抗体 を用いた検討により、哺乳動物においてボンべシン様ペプチドは脳および腸管両者 に広く分布する生理活性ペプチド、いわゆる脳-腸管ペプチド（brain-gut p印 tides)を 構成するファミリーペプチドであることが明らかとなった。カロえて NMBにはそのアミノ末 端延長体であるビッグニューロメディン B-30ならびに B-32も哺乳動物生体内に存在 することも明らかとなった。
[0004] その後の哺乳動物におけるボンべシン様ペプチドの機能解析の結果、 GRPならび に NMBは中枢においては体温調節、血糖上昇作用、視床下部並びに脳下垂体ホル モン分泌調節作用、消化'吸収修飾作用、摂食行動の修飾等、末梢においてはガス トリン、インスリン、コレシストキニンをはじめとした多くの消化管ホルモン分泌刺激作 用、胃酸分泌調節作用、陴外分泌刺激作用、消化管運動調節作用、血圧上昇作用 、抗利尿作用、平滑筋収縮刺激作用、細胞増殖刺激作用等、多岐にわたる生物活 性を有することが明らかとなった (非特許文献 5)。
[0005] これらペプチドに対する受容体としては NMBおよびその類縁体に選択性を示すボ ンべシン受容体サブタイプ 1である NMBR (あるいは BBS-I)、 GRPおよび GRP-10に選 択性を示すボンべシン受容体サブタイプ 2である GRPR (あるいは BBS-2)の 2種の存 在が知られていた力 1993年にこれら 2種の受容体とアミノ酸配列上で相同性を有す る受容体、ボンべシン受容体サブタイプ 3 (以下、 BRS-3と標記することもある）が存在 することが明らかとなった (非特許文献 6、 7)。
[0006] これら受容体のうち、 BRS-3については、既知の哺乳動物由来ボンべシン様ぺプ チドである GRPおよび NMBが低い結合活性しか持たなかったことから、 BRS-3特異 的内因性ペプチドリガンドが存在するのではなレ、かと考えられるようになった。
[0007] このような背景から BRS-3の存在意義を検討するためマウス BRS-3遺伝子をノックァ ゥトした結果、そのマウスは肥満になったことより、 BRS-3活性化薬は抗肥満活性を持 つことが期待されるようになった（非特許文献 8)。このため BRS-3の内因性リガンド探 索が精力的に行われているにも拘らず、未だ内因性リガンドは不明である。また、 BR S-3のみを活性化させるァゴニストもまだ見出されていない。
[0008] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
^^特許乂 ffl^l： Anastasi, A., Erspamer, V., and Bucci, M. Arcnives of Biochemistry a nd Biophysics, 148, 443-446, 1972
非特許文献 2 : McDonald, T.J., Joernvall, H" Nillson, G.， Vagne, M., Ghatei, M.， Bl oom, S.R., and Mutt, V. Biochemical and Biophysical Research communications, 90, 227-233， 1979
非特許文献 3 : Reeve, J.R. Jr., Walsh, J.H. , Chew, P., Clark, B" Hawke, D.， and Shi very, J.E. Journal of Biological Chemistry, 258, 5582-5588, 1983
非特許文献 4 : Minamino, N., Kangawa, K., and matsuo, H. Biochemical and Biophys ical Research communications, 114, 541-548. 1983
非特許文献 5 :向井秀仁，宗像英輔，化学と生物，学会出版センター， 28, 152-161, 1 990
非特許文献 6： Corjay, M.H., Dobazanski, D.J., Way, J.M., Viallet, J" Shapira, H" Worland, P., Sausville, E.A., and Battey, J.F. Journal of Biological Chemistry, 266, 18771-18779， 1991
非特許文献 7 : Fathi, Z.， Corjay, M.H., Shapira, H.， Wada, E.， Benya, R.， Jensen, R. ， Viallet, J., Sausville, E.A., and Battey, J.F. Journal of Biological Chemistry, 268, 5 979-5984, 1993
非特許文献 8 : Ohkト hamazaki, H.， Watase, K.， Yamamoto, K., Ogura, H., Yamano, M.， Yamada, K., Maeno, H.， Imaki, J. , Kikuyama, S.， Wada, E., and Wada, K. Natur e, 390， 165-169, 1997
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 一般的に内因性ペプチド性リガンドは、タンパク質として翻訳された後切断されて 初めて活性を持つ成熟体となるため、タンパク質の機能発見にしばしば用いられる発 現クローニング法を適用できず、したがって現在でも内因性ペプチドリガンドを同定 するには、生体組織よりペプチドを抽出し、化学的に構造を決定するしか方法がない のが現状である。
[0010] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ボンべシン様 ペプチド受容体を活性化するペプチド（一つの例としてボンべシン受容体サブタイプ
3を選択的に活性化するペプチド）を提供することにある。また、該ペプチドを対象に 投与する工程を含む、肥満症を予防または治療する方法の提供を課題とする。さら に、該ペプチドを有効成分とする、肥満症を予防または治療する薬剤の提供につい ても課題とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、ヒトゲノム配列からボンべシン様ぺ プチドの最小活性単位 T>p_Ala_X_Gly-(His/Ser)-X-Met構造（Xは任意のアミノ酸残 基）（配列番号： 71 )を含む複数の配列を抽出し、さらに BRS-3とのドッキングシミュレ ーシヨンを行うことにより、 BRS-3に結合'活性化するペプチド性リガンドの最小活性 単位の予測を行った。
[0012] 次に、予測したペプチドの構造を基に、最小活性単位を含むいくつかのペプチドを 設計および化学合成し、これらのペプチドの BRS-3活性化能にっレ、て検討を行った 。具体的には、ボンべシン様ペプチド受容体である BRS-3を安定発現、あるレ、は BRS -3、 NMBR,および GRPRを一過発現した HEK293細胞に対し上記ペプチドを添加し、 細胞内遊離カルシウム濃度上昇活性をカルシウムイオン感受性蛍光試薬である Fluo -3を用いて測定することで、ペプチドの受容体活性化能を判定した。
[0013] その結果、アミノ酸配列 Leu-T卬 -Ala-Cys-Gly-Ser-Phe-Met (配列番号： 3)で示さ れるペプチドが、 BRS-3を選択的に活性化することを見出した。
即ち、本発明者らは、 BRS-3を選択的に活性化するペプチド性リガンドを発見し、こ れにより本発明を完成するに至った。
[0014] 本発明は、より具体的には以下の（1 )〜（22)を提供するものである。
( 1 )下記式で表され、かつボンべシン受容体サブタイプ 3のァゴニストとして作用する ことを特徴とするペプチド：
Xl -X2 - Trp -Ala -X3 - Gly -X4
(式中、 XI、 X2、 X3、および X4は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、または アミノ酸配列である。 )
( 2) X3が、 Cys、 Val、または Pheのいずれかである、（1 )に記載のペプチド。
( 3) X4が、 Ser-Phe-Met,または His-Phe-Metである、 （1 )または（2)に記載のぺプ チド。
(4) X2が、 Alaまたは Leuである、 （1 )〜（3)のいずれかに記載のペプチド。 (5) X1が、 Lys-Lys-Arg-Lys-Tyr (配列番号： 1)、 Tyr、 pGlu (ピログルタミン酸）、 Ile- Ile-Asn-Leu-Glu (配列番号： 2)、または Leu-Gluのいずれかである、（1)〜（4)のい ずれかに記載のペプチド。
(6)以下の（a)または（b)のペプチド：
(a)配歹幡号： 3、 21、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 38、 54、 55、 5
7または 58に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配歹' J番号： 3、 21、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 38、 54、 55、 5
7または 58に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷 入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつボンべシン受容体サブタイ プ 3のァゴニストとして作用することを特徴とするペプチド。
(7)カルボキシル末端がアミド化されたことを特徴とする、（1)〜（6)のいずれかに記 載のペプチド。
(8)ボンべシン受容体サブタイプ 3の選択的ァゴニストとして作用することを特徴とす る、（1)〜（7)のいずれかに記載のペプチド。
(9) (1)〜（7)のレ、ずれかに記載のペプチドをコードしている DNA。
(10) (9)に記載の DNAを含むベクター。
(11) (10)に記載のベクターが導入された形質転換体。
(12) (11)に記載の形質転換体を培養または育種し、該形質転換体細胞またはその 培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、（1)〜（7)のいずれかに記 載のペプチドの製造方法。
(13) (1)〜（8)のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象に おいてボンべシン受容体サブタイプ 3を活性化させる方法。
(14) (9)に記載の DNA、（10)に記載のベクター、または（11)に記載の形質転換体 のレ、ずれかを対象に投与する工程を含む、対象にぉレ、てボンべシン受容体サブタイ プ 3を活性化させる方法。
(15) (1)〜（8)のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象に おける肥満症を治療または予防する方法。
(16) (9)に記載の DNA、（10)に記載のベクター、または（11)に記載の形質転換体 のいずれ力を対象に投与する工程を含む、対象における肥満症を治療または予防 する方法。
(17) (1)〜（8)のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有する、肥満症を 予防または治療するための薬剤。
(18) (9)に記載の DNA、（10)に記載のベクター、または（11)に記載の形質転換体 のいずれかを有効成分として含有する、肥満症を予防または治療するための薬剤。
(19) (1)〜（8)のレ、ずれかに記載のペプチドに結合する抗体。
(20)モノクローナル抗体である（19)に記載の抗体。
(21) (1)〜（8)のいずれかに記載のペプチド、または、 (19)もしくは（20)に記載の 抗体を含有する、腫瘍細胞の増殖を検出するためのマーカー。
(22) (1)〜（8)のいずれかに記載のペプチド、または、 (19)もしくは（20)に記載の 抗体を含有する、代謝病を検出するためのマーカー。
図面の簡単な説明
園 1]既知哺乳動物由来ボンべシン様ペプチドの構造と最小活性単位を示す図であ る。 A：既知ボンべシン様ペプチドの一次配列とその最小活性単位。 GRP-10 :ガストリ ン放出ペプチド C末端デカペプチド、 NMB :ニューロメディン B。 B :ヒトゲノム配列より 予測したボンべシン様ペプチド最小活性単位。
園 2]ペプチドリガンド活性評価方法 (詳細は実施例に記述）を示す図である。
園 3-A]ヒトゲノム配列より予測した新規ボンべシン様ペプチド配列（1)を示す図であ る。
園 3- B]ヒトゲノム配列より予測した新規ボンべシン様ペプチド配列（2)を示す図であ る。
[図 3-C]ヒトゲノム配列より予測した新規ボンべシン様ペプチド配列およびフイロリトリ ン関連ペプチド配列を示す図である。なおフイロリトリン関連ペプチドとは、力エルに おいて存在する第 3のサブファミリーのボンべシン様ペプチド（BN3-022-01〜06)で 哺乳動物における存在は未だ確認されていないものである。
[図 4]ヒトゲノム配列より予測したボンべシン様ペプチドの BRS-3安定発現 HEK293細 胞における細胞内遊離カルシウム濃度上昇効果を示す図である。 [図 5]ヒトゲノム配列より予測したボンべシン様ペプチドおよびフイロリトリン関連べプチ ドの BRS-3安定発現 HEK293細胞における細胞内遊離カルシウム濃度上昇効果を示 す図である。なおフイロリトリン関連ペプチドとは、力エルにおいて存在する第 3のサブ ファミリーのボンべシン様ペプチド（BN3_022_01〜06)で哺乳動物における存在は未 だ確認されていなレ、ものである。
[図 6]ヒトゲノム配列より予測したボンべシン様ペプチドおよびフイロリトリン関連ぺプチ ドの BRS-3安定発現 HEK293細胞における細胞内遊離カルシウム濃度上昇効果の刺 激ペプチド濃度依存性を示す図である。なおフイロリトリン関連ペプチドとは、力エル におレ、て存在する第 3のサブファミリーのボンべシン様ペプチド（BN3_022_02,04)で 哺乳動物における存在は未だ確認されていないものである。
[図 7]既知ボンべシン様ペプチドの NMBR、 GRPRおよび BRS-3—過発現 HEK293糸田 胞における細胞内遊離カルシウム濃度上昇効果の刺激ペプチド濃度依存性を示す 図である。
[図 8]ヒトゲノム配列より予測したボンべシン様ペプチドの NMBR、 GRPRおよび BRS-3 一過発現 HEK293細胞における細胞内遊離カルシウム濃度上昇効果の刺激べプチ ド濃度依存性を示す図である。
[図 9]ヒトゲノム配列より予測したボンべシン様ペプチド、フイロリトリン関連ペプチドお よびボンべシンの NMBR、 GRPRおよび BRS-3—過発現 HEK293細胞における細胞内 遊離カルシウム濃度上昇効果の刺激ペプチド濃度依存性を示す図である。なおフィ ロリトリン関連ペプチドとは、力エルにおいて存在する第 3のサブファミリーのボンべシ ン様ペプチド（BN3-022-02, 04)で哺乳動物における存在は未だ確認されていないも のである。
[図 10]ヒトゲノム配列より予測したボンべシン様ペプチドおよびその中で BRS-3選択 的活性化能を持つペプチド BN3-006-06の NMBR、 GRPRおよび BRS-3—過発現 HE K293細胞における細胞内遊離カルシウム濃度上昇効果の刺激ペプチド濃度依存性 を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 BRS-3を活性化すると考えられる最小活性単位を含むペプチドをヒ トゲノム配列から予測'ィ匕学合成し、該ペプチドがボンべシン受容体サブタイプ 3を選 択的に活性化させることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
[0017] 本発明は、ボンべシン様ペプチドの最小活性単位を含むペプチドに関する。
本発明のペプチドの一つの態様として、好ましくは下記式で表されるペプチドを挙 げ'ること力 S出来る。
Xl -X2-Trp-Ala-X3-Gly-X4
式中、 XI、 X2、 X3、および X4は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、または アミノ酸配列であり、本発明のペプチドと機能的に同等である限り、アミノ酸の配列構 成については特に限定をされない。「任意に含まれていてもよい」とは、その位置に 相当するアミノ酸が何も存在しなレ、場合も含まれる。
[0018] 本発明において「機能的に同等」とは、対象となるペプチドが、ボンべシン様ぺプチ ド受容体を活性化する機能、すなわちァゴニストとしての機能を保持することをいう。 本発明において、ボンべシン様ペプチド受容体としては、ボンべシン受容体サブタイ プ 3 (BRS-3)、ボンべシン受容体サブタイプ 1であるニューロメジン B受容体（NMBR、 BBS-1)、またはボンべシン受容体サブタイプ 2であるガストリン放出ペプチド受容体（ GRPR, BBS-2)を挙げることが出来る。
[0019] 本発明のペプチドの機能としては、ボンべシン受容体サブタイプ 3を選択的に活性 化させる機能を挙げることが出来るが、特に限定されるものではない。本発明におい て、「ボンべシン受容体サブタイプ 3の選択的ァゴニストとして作用する」とは、ボンべ シン受容体サブタイプ 1および/または 2に比較して 1/10以下の濃度、好ましくは 1/ 100以下の濃度、より好ましくは 1/1000以下の濃度でサブタイプ 3を活性化することを 意味する。また、ボンべシン受容体サブタイプ 3のァゴニストとして作用し、ボンべシン 受容体サブタイプ 1および Zまたはサブタイプ 2のァゴニストとして作用しないことも含 む。
[0020] ペプチドを対象に投与することによって、対象において体重減少、食欲抑制、細胞 増殖促進、消化管ホルモン分泌促進、平滑筋収縮促進、または血圧調節が引き起こ された場合にも、該ペプチドが本発明のペプチドと機能的に同等であるとみなすこと が出来る。 [0021] 上記式 X3に相当するアミノ酸残基としては、 Cys、 Val、または Pheを挙げることが出 来る力 特にこれらに限定されるものではない。
[0022] また、上記式 X4に相当するアミノ酸配列としては、 Ser-Phe_Met、または His_Phe_M etを挙げることが出来るが、特にこれらに限定されるものではない。
[0023] また、上記式 X2に相当するアミノ酸残基としては、 Alaまたは Leuを挙げることが出 来る力 特にこれらに限定されるものではない。
[0024] また、上記式 XIに相当するアミノ酸残基またはアミノ酸配列としては、 Lys-Lys-Arg
-Lys- Tyr (配列番号： 1 )、 Tyr、 pGlu (ピログルタミン酸）、 Ile-Ile- Asn-Leu-Glu (配列 番号： 2)、または Leu-Gluを挙げることが出来る力 特にこれらに限定されるものでは ない。
[0025] 本発明のペプチドは、機能的に同等である限り、化学修飾を受けていてもよい。ぺ プチドの化学修飾としては、ァセチル化、アミド化（カルボキシノレ末端）、ァニリド化（力 ルボキシル末端）、ベンジルォキシカルボニル化、ビォチン化、ダンシル化、 DNPィ匕、 脂肪酸付加、ホルミル化、ニトロ化、セリンリン酸化、スレオニンリン酸化、チロシンリン 酸化、サクシ二ル化、スルフォンィ匕等を挙げることができる力 これらに限定されるも のではない。本発明において、化学修飾は酵素を用いて行われてもよい。上記の化 学修飾は当業者に公知の方法によって行うことが出来る。
[0026] 本発明のペプチドの化学修飾の好ましい例としては、カルボキシル末端のアミドィ匕 を挙げることができる。
[0027] また、本発明のペプチドは、ァミノ末端にグノレタミンが存在する場合には、側鎖が閉 環されピログノレタミン酸 (pGlu)になっていてもよい。また、カルボキシル末端のアミド 化は、カルボキシノレ末端にグリシンが存在する場合に、このグリシンがぺプチジルダリ シンひ -アミド化モノォキシゲナーゼ等の C末端アミド化酵素によって、ァミノ基に変換 されたものであってもよレ、。
[0028] 本発明のペプチドの好ましい例としては、アミノ酸配歹 ljTYp_Ala- Phe- Gly- His- Phe- Met-NH (配列番号： 21 )で表されるペプチド、アミノ酸配列 Tyr-Ile-Ile-Asn-Leu-Gl
2
u-Ala-T卬- Ala- Phe-Gly- His- Phe-Met-NH (配列番号： 27)で表されるペプチド、ァ
2
ミノ酸配列 lie- lie- Asn_Leu- Glu-Ala-T卬- Ala- Phe-Glv- His- Phe-Met-NH (配列番 号： 28)で表されるペプチド、アミノ酸配歹 Ijlle-Asn-Leu-Glu-Ala-T卬 -Ala-Phe-Gly- His-Phe-Met-NH (配列番号： 29)で表されるペプチド、アミノ酸配列 Leu-Glu-Ala-T rp-Ala-Phe-Gly-His-Phe-Met-NH (配列番号： 31 )で表されるペプチド、アミノ酸配 列 Glu- Ala- TYp-Ala-Phe- Gly-His-Phe- Met-NH (配列番号： 32)で表されるぺプチ ド、アミノ酸配列 Ala-TYp-Ala-Phe-Gly-His-Phe-Met-NH (配列番号： 33)で表され るペプチド、アミノ酸配列 Lys-Lys-Arg-Lys- Tyr-Leu-T卬- Ala- Cys-Gly- Ser- Phe-M et (配列番号： 38)で表されるペプチド、アミノ酸配列 Lys-Arg- Lys-Tyr_Leu- TYp-Ala -Cys-Gly-Ser-Phe-Met (配列番号： 54)で表されるペプチド、アミノ酸配歹 IjTyr-Leu- Trp-Ala-Cys-Gly-Ser-Phe-Met (配列番号： 57)で表されるペプチド、アミノ酸配列 p Glu-Leu-Trp-Ala-Val-Gly-Ser-Phe-Met-NH (配列番号： 60)で表されるペプチド、 アミノ酸配列 Leu- TYp-Ala-Val-Glv- Ser- Phe- Met- NH (配列番号： 62)で表されるぺ プチドを挙げることが出来る。また、本発明のペプチドのより好ましい例としては、アミ ノ酸配列 Leu-T卬 -Ala-Cys-Gly-Ser-Phe-Met (配列番号： 3)で表されるペプチドを 挙げること力 Sできる。
[0029] また、本発明のペプチドには、上記の具体的なアミノ酸配列において 1若しくは複 数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなるぺプ チドであって、上記のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドも含ま れる。
[0030] 本発明において、変異 (置換、欠失、挿入、および/または付カロ）するアミノ酸数は 特に制限されないが、好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 1、 2、 3、 4、 5アミノ酸以内) であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存さ れている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質として は、疎水'性アミノ酸（A、 I、し、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水十生アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q 、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側 鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、 M)、カルボン 酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するァミノ 酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（ 括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複 数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾され たアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知 られている。
[0031] 本発明のペプチドは、有機化学合成、または本発明のペプチド（上記のアミノ酸配 歹 IJ)を含む前駆体タンパク質を分解することにより生成することが可能である。有機化 学合成としては、当業者には公知の自動ペプチド合成方法 (Boc固相法、 Fmoc固相 法等）または、古典的な有機化学合成方法を挙げることができ、特に限定されるもの ではない。前駆体タンパク質を分解することにより、本発明のペプチドを合成する場 合には、当業者に公知のプロテアーゼを適切な条件下で使用することができる。プロ テアーゼとしては、セリンプロテアーゼ（例えばトリプシン、キモトリブシン、スブチリシ ン）、ァスパラギン酸プロテアーゼ（例えばペプシン、カテブシン D、 HIVプロテアーゼ )、金属プロテアーゼ（例えばサーモリシン）、システィンプロテアーゼ（例えばパパイ ン、カスパーゼ）、 N-末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等を挙 げること力 S出来る。
[0032] 本発明は、上記の本発明のペプチドをコードしている DNAに関する。本発明のぺプ チドをコードする DNAには、ゲノム DNA、 cDNA、および化学合成 DNAが含まれる。ゲ ノム DNAおよび cDNAの調製は、当業者にとって公知の方法を利用して行うことが可 能である。ゲノム DNAは、例えば、ボンべシン様ペプチド受容体を発現する細胞から ゲノム DNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コ スミド、 BAC、 PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明のペプチドを コードする DNAを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンある いはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより調製することが可能である。また、 本発明のペプチドをコードする DNAに特異的なプライマーを作成し、これを利用した PCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、 cDNAは、例えば、ボン ベシン様ペプチド受容体を発現する細胞から抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、 これを λ ZAP等のベクターに揷入して cDNAライブラリーを作成し、これを展開して、 上記と同様にコロニーハイブリダィゼーシヨンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨン を行うことにより、また、 PCRを行うことにより調製することが可能である。 [0033] 本発明の DNAは、本発明のペプチドの大量発現、または組み換えペプチドの大量 調製などに利用することが可能である。
[0034] 本発明は、該 DNAを含むベクター、および該ベクターが導入された形質転換体 (宿 主細胞）に関する。さらに、該形質転換体を培養もしくは育種し、該形質転換体細胞 またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、該ペプチドの製 造方法に関する。
[0035] 本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明の DNAを保持させたり、本発明 のペプチドを発現させるために有用である。
[0036] ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例え ば、 JM109、 DH5ひ、 HB101、 XLlBlue)などで大量に増幅させ大量調製するために、 大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエ 二コール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。
[0037] ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript, pC R-Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場 合、上記ベクターの他に、例えば、 GEM-T, pDIRECT, pT7などが挙げられる。
[0038] 本発明のペプチドを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、 発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的 とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を J M109、 DH5 ct、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効 率よく発現できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター、 araBプロモーター、 または T7プロモーターなどを持ってレ、ることが不可欠である。このようなベクターとし ては、上記ベクターの他に pGEX-5X_l (フアルマシア社製）、「QIAexpress system] ( キアゲン社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現し ている BL21が好ましい)などが挙げられる。
[0039] また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよレ、。
タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる 場合、例えば pelBシグナル配列を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は 、例えば塩化カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法を用いて行うことができる。
[0040] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、 哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、 pEGF-BO S、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac_to_BAC baculovirus expression system」（ギブコ BRL社製）、 pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例え ば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexL cw)、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現べクタ 一（例えば、 「Pichia Expression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVl l、 SP-Q01)、枯草 菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pKTH50)が挙げられる。
[0041] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター、 MML V-LTRプロモーター、 EF1ひプロモーター、 CMVプロモーターなどを持っていること が不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子を有すればさらに好ま しレ、。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK-CMV, pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0042] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅 を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR 遺伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX)によ り増幅させる方法が挙げられ、 また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には 、 SV40T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製開 始点を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点とし ては、また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の 由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子 、チミジンキナーゼ（TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフ エラーゼ（Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる
[0043] 一方、動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、本発明の DNAを 適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リボソーム法、カチォニックリ ポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。
[0044] 本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌 や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、 本発明のペプチドの製造や発現のための産生系として使用することができる。ぺプチ ド製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系と しては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
[0045] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用い ること力 Sできる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH〇、 COS, 3T3、ミエロー マ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、両生類細胞、例えばアフリカッメガエ ル卵母細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5が知られている。 CHO細胞 としては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞である dhfr-CHOや CHO K-1を 好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には 特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシゥ ム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム 社製）を用いた方法、エレクト口ポーレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うこ とが可能である。
[0046] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タバカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞 力 Sタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞とし ては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス'セレ ビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、例えば、尸スへノレヤノレス (Aspergillus) 属、例えば、ァスペルギルス'二ガー（Aspergillus niger)が知られている。
[0047] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌 (E. coli)、例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知 られている。
[0048] これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、形質転換された細胞を in vitroで 培養することによりペプチドが得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる 。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを使 用すること力 Sできる。その際、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもでき るし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8であるのが好ましい。培養は、 通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を 加える。
[0049] 一方、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする DNA を導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における 「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0050] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用レ、る産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる。また、哺乳類動物を用いる 場合、トランスジヱニック動物を用いることができる。
[0051] 例えば、 目的とする DNAを、ャギ j3カゼインのような乳汁中に固有に産生されるタ ンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝 子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容し たャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、 目的の タンパク質を得ることができる。トランスジエニックャギから産生されるタンパク質を含 む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよ レ、。
[0052] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、 目的 のタンパク質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させること により、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる。
[0053] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、 目的とするペプチドをコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pM〇N 530 に揷入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファシエンス（Agrobacterium tumefa ciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ 'タ バカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望のペプチドを得ること ができる。
[0054] 本発明のペプチドは、化学合成後、または宿主細胞内または細胞外 (培地など）に おいて生産させた後に、実質的に純粋で均一なペプチドとして精製することができる 。ペプチドの分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方 法を使用すればよぐ何ら限定されるものではなレ、。例えば、クロマトグラフィーカラム 、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアク リルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合 わせればタンパク質を分離、精製することができる。
[0055] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィ 一、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発 明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたペプチドも包含する。
[0056] 本発明は、上記ペプチド、該ペプチドをコードする DNA、該 DNAを保持するべクタ 一、または形質転換体のいずれかを対象に投与する工程を含む、対象においてボン ベシン受容体サブタイプ 3を活性化させる方法、または対象における肥満症を治療ま たは予防する方法に関する。
[0057] 本発明において、「対象」とは、本発明のボンべシン受容体サブタイプ 3活性化剤ま たは肥満症治療剤を投与する生物体、該生物体の体内の一部分をいう。生物体は、 特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む
[0058] また、「生物体の体内の一部分」については特に限定されないが、好ましくはボンべ シン受容体サブタイプ 3の機能が発現している部位またはその周辺部位を挙げること が出来る。
[0059] 本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含 まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤 としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型 を選択すること力 Sできる。
[0060] 又は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、経腸栄養食品と レ、う形態で経口的に摂取または投与されてもよぐ本発明はこれらの食品に限定され ない。
[0061] 非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤とし ては、点滴などの静脈注射、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を 挙げること力 Sできる。患者の年齢、症状により適宜投与方法'投与量を選択することが できる。また、投与すべき DNAを含む遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導 入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。また、本発明の薬剤 を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注 入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコードする DNAの標的化遺伝子 送達により投与することも可能である。
[0062] 本発明において「ボンべシン受容体サブタイプ 3を活性化」とは、ボンべシン受容体 サブタイプ 3の関与するシグナル伝達カスケードを開始させるまたは活性化させること を意味する。 GPCRの性質に応じてシグナル伝達活性は、 Ca2+レベルの変化、ホスホ リパーゼ C活性化、イノシトール三リン酸（IP )レベルの変ィ匕、ジァシルグリセロールレ
3
ベルの変化、 pH値の変化、アデ二ル酸シクラーゼレベルの変化、またはアデノシン 環状 3'5'—リン酸（cAMP)レベルの変化を細胞内において測定することによって測定 できる。上記の値の変化は、当業者に公知の方法により測定を行うことが出来る。
[0063] 本発明のペプチドを対象に投与した際に、対象においてシグナル伝達カスケード を開始させた、または活性化させた場合、例えば上記アツセィ系において Ca2+レべ ノレ、イノシトール三リン酸（IP )レベル、ジァシルグリセロールレベル、アデニル酸シク
3
ラーゼレベル、またはアデノシン環状 3'5'—リン酸（cAMP)レベルを上昇させた場合 に、該ペプチドはボンべシン受容体サブタイプ 3を活性化させたものとみなすことが 出来る。
[0064] また、本発明のペプチド等を対象に投与することによって、対象において体重減少 、食欲抑制、細胞増殖促進、消化管ホルモン分泌促進、平滑筋収縮促進、または血 圧調節が引き起こされた場合にも、該ペプチドがボンべシン受容体サブタイプ 3を活 性化させたものとみなすことが出来る。すなわち、本発明のペプチドは上記の生体現 象を引き起こすための薬剤としても使用することが可能である。例えば、消化管ホル モン分泌調節による糖尿病等の代簡す病の治療剤として、本発明のペプチドを用いる ことが出来る。
[0065] 本発明において、「肥満症を治療または予防する」とは、肥満症状 (体重増加、体 脂肪率増加）の改善または予防、または肥満に伴う合併症などを抑制することを意味 する。肥満に伴う合併症としては、インシュリン抵抗性に基づく疾患、高血圧症、糖尿 病、高脂血症、動脈硬化の促進、または冠動脈疾患等を挙げることが出来る。
[0066] 本発明において、肥満症状（体重増加、体脂肪率増加）が改善されたか否かの確 認は、各種公知の検查方法により行うことが出来る。
[0067] 肥満であるかどうかは、ヒトの場合、身長あたりの体格指数（BMI (body mass index )：体重 (kg)—身長 (m)—身長 (m) )をもとに判定することが出来る。 BMI< 18.5の場 合は「低体重」、 18.5≤BMI< 25の場合は「普通体重」、 25≤BMI< 30の場合は「肥満 (1度）」、 30≤BMI< 35の場合は「肥満（2度）」、 35≤BMI< 40の場合は「月巴満（3度）」 、 40≤BMIの場合は「肥満 (4度）」と判定される。肥満（BMI≥25)と判定され、さらに 以下の条件のいずれかを満たす場合は、医学的にみて減量治療の必要な肥満と診 断される。 （1)肥満に関連し、減量が必要、または減量により改善が可能な健康障害 を有する場合。 (2)健康障害を伴レ、やすレ、ハイリスク肥満：身体計測のスクリーニング により上半身肥満を疑われ、腹部 CT検査によって確定診断された内臓脂肪型肥満 の場合。
[0068] 本発明のペプチドを対象に投与した際に、対象において肥満症状が改善された場 合、例えば、体重が減少（BMI値の低下）、または体脂肪率が低下した場合に、該ぺ プチドは肥満症を治療または予防したものとみなすことが出来る。
[0069] 本発明は、上記ペプチド、該ペプチドをコードする DNA、該 DNAを保持するべクタ 一、または形質転換体のいずれかを有効成分として含有する、肥満症を予防または 治療するための薬剤に関する。本発明の薬剤は、肥満症治療剤、肥満症を予防また は治療するための医薬組成物と言い換えることが可能である。
[0070] 本発明において肥満症を予防または治療するための薬剤には、保存剤や安定剤 等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自 体は上記の肥満症の治療または予防効果を有する材料であってもよレ、し、当該予防 または治療効果を有さない材料であってもよぐ上記の薬剤とともに投与可能な製剤 上許容される材料を意味する。また、肥満症の予防または治療効果を有さない材料 であっても、本発明の化合物と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化 効果を有する材料であってもよレ、。
[0071] 製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、 緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることができる
[0072] 本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例 えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート 等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、 グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレ ート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂 肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソノレ ビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシェチ レンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキ シエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ ノレ；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテト ラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレング リセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレ ングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシェ チレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェチレ ンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピル エーテノレ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチノレエーテノレ等のポリオキシェ チレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシェチェレンノユルフェニル エーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマ シ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオ キシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシェチ レンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体 ；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の HLB 6〜 18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
[0073] また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル 硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレィル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜1 8のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等 の、エチレンォキシドの平均付加モル数力 ¾〜4でアルキル基の炭素原子数が 10〜1 8であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステ ノレナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数力 〜 18のアルキルスルホコハク酸エス テル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質;スフインゴミエリン 等のフィンゴリン脂質;炭素原子数 12〜18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典 型白勺 ί列として挙げ'ること力 Sできる。
[0074] 本発明おいては、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添カロ すること力 Sできる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート 2 0,40,60又は 80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソル ペート 20及び 80が特に好ましい。また、ポロキサマー（プル口ニック F— 68 (登録商標） など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましレ、。
[0075] 界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート 20又はポリソルベート 80の場合では、一般には 0.001〜100 mg/mLであり、好ましくは 0.003〜50 mg/mLであり、さらに好ましくは 0.005〜2 mg/mLである。
[0076] 本発明において緩衝剤としては、リン酸、クェン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸 、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸、サリチ ル酸、トリエタノールァミン、フマル酸等 他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリ ス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
[0077] また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製 してもよレ、。緩衝液の濃度は一般には 1〜500 mMであり、好ましくは 5〜100 mMであ り、さらに好ましくは 10〜20 mMである。
[0078] また、本発明おいては、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチ ンゃ免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖ァ ルコールを含んでレ、てもよレ、。 [0079] 本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒス チジン、オル二チン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩 (好ましくは、塩酸塩、リン酸 塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場 合、好ましい pH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩 酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添カ卩により調整される。この場合、リン 酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が 有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クェン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有し ない場合あるいは対応する陰イオン (リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クェン酸イオン、 コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましレヽ アミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオル二チンである。さらに、酸性アミ ノ酸、例えばグノレタミン酸及びァスパラギン酸、及びその塩の形 (好ましくはナトリウム 塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン 、バリン、メチォニン、システィン、またはァラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフ ェニルァラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体の N-ァセチルトリプトファンを 使用することちできる。
[0080] 本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン 、グノレコース、フラクトース、ラタトース、キシロース、マンノース、マノレトース、スクロー ス， トレハロース、ラフイノース等を挙げること力 sできる。
[0081] 本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシ トール等を挙げることができる。
[0082] 注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液、例えば、 D-ソノレビトーノレ、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナトリ ゥムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等)、ポリアルコ ール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面活性斉 ポリソルベート 80、 HCO -50)等と併用してもよい。
[0083] 所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、 pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化 防止剤等を含有してもよい。
[0084] 本発明において、含硫還元剤としては、例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセ チルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリ セロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グ ルタチオン、並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等を挙げること力 Sできる。
[0085] また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒド ロキシトルエン、ブチノレヒドロキシァニソーノレ、 ひ一トコフェローノレ、酢酸トコフェローノレ 、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン 酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食 子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリ ゥム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
[0086] また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ [メ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プでノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition , Osl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981， 15: 167-277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547_556;EP第 133，988号)。
[0087] 使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中力 適宜あるいは組合 せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
[0088] 本発明は、本発明のペプチドに結合する抗体に関する。本発明の抗体を対象に投 与することによって、対象における本発明のペプチドの活性制御を行うことが出来る。
[0089] また、本発明は、本発明のペプチドと結合する抗体を提供する。本発明の抗体とし ては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体、これらの断片等が例 示できる。
[0090] これらの抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクロー ナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。カイコ、ショウジョ ゥバエ、蚊、ハスモンョトウ、またはォォタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素 、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコ ンビナントタンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を 得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換 クロマトグラフィー、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊、ハスモンョトウ、またはォォタバコガ の幼若ホルモン酸メチル基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたァフィ二ティ 一力ラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例 えば、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊、ハスモンョトウ、またはォォタバコガの幼若ホルモ ン酸メチル基転移酵素またはその部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、 同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエ口 一マ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融 合細胞（ハイブリドーマ）の中から、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊、ハスモンョトウ、また はォォタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素に結合する抗体を産生するクロ ーンを選択する。次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウス より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、カイコ、ショウジヨウバエ、蚊 、ハスモンョトウ、またはォォタバコガの幼若ホルモン酸メチル基転移酵素や合成べ プチドをカップリングしたァフィ二ティーカラム等により精製することで、調製することが 可能である。
[0091] また、本発明において、「抗体変異体」とは、 1またそれ以上のアミノ酸残基が改変 された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアント であれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異 体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのァミノ 酸配列と少なくとも 75%、より好ましくは少なくとも 80%、さらに好ましくは少なくとも 85 ヽさらにより好ましくは少なくとも 90%、そして、最も好ましくは少なくとも 95。/0のアミ ノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と 100%よりも少ない配列相同性 、または類似性を有する。
[0092] 本発明は本発明のペプチド、または本発明の抗体を含有する、腫瘍細胞の増殖を 検出するためのバイオマーカーに関する。本発明のバイオマーカーは、腫瘍細胞の 増殖を検出するため、または代謝病を検出するために使用することが出来る。
[0093] 本発明のペプチドを対象に投与することによって、対象におけるボンべシン受容体 サブタイプ 3の発現、または該受容体によって引き起こされる生体現象の検出を行う ことが出来る。
[0094] 本発明の抗体を対象に投与することによって、対象における本発明のペプチドと同 様の効果を示す化合物（ペプチドを含む）の検出、または対象における本発明のぺ プチドおよびボンべシン様受容体を発現している細胞の検出が可能である。
上記の検出は、該ペプチドまたは抗体に標識物質を結合させ、当業者に公知の方 法で行うことが可能である。
[0095] 標識物質は、特に限定されない。具体的には、酵素、蛍光物質、発光物質、放射 性物質、金属キレート等を使用することができる。好ましい標識酵素としては、例えば ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、 j3 -D-ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒド ロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ 5 -ステロイドイソメラーゼ、 α -グリ セロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさ びパーォキシダーゼ、ァスパラギナーゼ、グルコースォキシダーゼ、リボヌクレアーゼ 、ゥレアーゼ、カタラーゼ、グルコース 6—ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グノレコアミ ラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。好ましい蛍光物質として は、例えばフルォレセインイソチアネート、フィコピリプロテイン、ローダミン、フィコエリ トリン、フィコシァニン、ァロフィコシァニン、およびオルトフタルアルデヒド等が挙げら れる。好ましい発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族ァク リジニゥムエステル、イミダゾール、アタリジニゥム塩及びその修飾エステル、ノレシフェ リン、ルシフェラーゼ、およびェクオリン等が挙げられる。そして好ましい放射性物質と しては、 125I、 127I、 mI、 MC、 3H、 32P、あるいは35 S等が挙げられる。
[0096] 前記標識物質をペプチドまたは抗体に結合する手法は公知である。具体的には、 直接標識と間接標識が利用できる。直接標識としては、架橋剤によってペプチドまた は抗体、あるいはペプチドまたは抗体断片と標識とを化学的に共有結合する方法が 一般的である。架橋剤としては、 N, Nしオルトフヱ二レンジマレイミド、 4_ (N -マレイミド メチル）シクロへキサン酸 . N-スクシンイミドエステル、 6-マレイミドへキサン酸 . N-スク シンイミドエステル、 4，4'-ジチォピリジン、その他公知の架橋剤を利用することができ る。これらの架橋剤と酵素およびペプチドまたは抗体との反応は、それぞれの架橋剤 の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。この他、ペプチドまたは抗体にビォ チン、ジニトロフエニル、ピリドキサール又はフルォレサミンのような低分子ハプテンを 結合させておき、これを認識する結合成分によって間接的に標識する方法を採用す ることもできる。ピオチンに対してはアビジンやストレプトアビジンが認識リガンドとして 利用される。一方、ジニトロフエニル、ピリドキサール又はフルォレサミンについては、 これらのハプテンを認識するペプチドまたは抗体が標識される。本酵素は多くの基質 と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができるの で有利である。また、抗体としては場合によっては、そのフラグメント、例えば Fab'、 Fa b、 F (ab')を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同 様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標 識体はァフィ二ティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば更に感度の 高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、防腐剤としてチメロサ ール (Thimerosal)等を、そして安定剤としてグリセリン等をカ卩えて保存する。標識ぺプ チドまたは標識抗体は、凍結乾燥して冷暗所に保存することにより、より長期にわた つて保存することができる。
[0097] 本発明のマーカーは、用途に併せて上記に記載の担体の中から適切なものを含有 していてもよい。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0098] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0099] 〔実施例 1〕 ゲノム配列からの新規ペプチド性リガンドの同定
ペプチド性 GPCRリガンドは、前駆体から特異的切断ならびに修飾を受けて初めて 活性を持つ成熟体となることから、これを発見し同定するためには、以下の三つのェ 程が必要になる。 (1)ヒトゲノム配列〈以下に一覧としてリストアップ〉から GPCRのペプチド性リガンドを 有する前駆体配列を予測すること。
(2)前駆体から生成されるペプチド成熟体を予測すること。
(3)予測したペプチド成熟体配列をモチーフとして、ゲノム配列へのマッピングおよ び、既知蛋白質配列の検索により、ペプチド成熟体候補を増加させること。
[0100] 本発明においては上記の工程により、 GPCRの中でもボンべシン様ペプチド受容体 を選択的に活性化するペプチド性リガンドの同定を行った。以下に、それぞれ工程の 作業の詳細について述べる。
[0101] (1)ヒトゲノム配列からの GPCRのペプチド性リガンドを有する前駆体配列の予測 最初にヒトゲノム配列上で、 low-complexity領域や、リピート領域をマスクするため の前処理を行った。次に SWISSPROTより、既知ペプチド性 GPCRリガンドを有する前 駆体配列（以下、既知ペプチド性リガンド前駆体配歹 IJ)を検索して抽出した。そして次 の独立した 3つのステップく 1〉，く 2〉，く 3>により前駆体候補を予測した。
[0102] く 1〉配列相同性を基にして、ヒトゲノム配列上に、既知ペプチド性リガンド前駆体配列 をマップした。完全一致でない場合も許すので、既知ペプチド性リガンド前駆体配列 とは若干異なる配列候補をさらに抽出できる可能性がある。
[0103] く 2〉既知のタンパク質配列を全て収めてある DB (データベース）に対し、既知べプチ ド性リガンド前駆体配歹 1Jを検索した。
使用した DBを以下に一覧として記載する。
(A) nr 2005/05/29バージョン。 Homo sapiensのみを対象。
(B) NCBIヒトゲノムァノテーシヨン（BUILD35.1)
a)protein.fa (annotated proteins)
(b)Gnomon_prot.fsa ab initio protein predictions)
(C) Ensemblヒトゲノムァノテーシヨン（BUILD35.1)
a)Homo_sapiens.Nし BI35.may.pep.fa (the super-set or all translations resulting from Ensembl known or novel gene predictions)
(D) UCSCヒトゲノムァノテーシヨン（BUILD35.1)
a)known enePep.txt (Protein coding genes based on proteins from SWISS - PROT, TrEMBL, and TrEMBL-NEW
and their corresponding mRNAs from GenBank)
(b) twinscanPep.txt (Translations of Twinscan gene predictions into
corresponding amino acid sequences)
(c) genscanPep.txt (Translations of Genscan gene predictions into corresponding amino acid sequences)
(E) DIGITized Genes (BUILD34)
(a)chrN.pep (N: 1— 22,X,Y，）
(F) H-invDB release 1.8
(a)orf_all.fa
[0104] く 3〉ヒトゲノムとマウスやラットゲノムのシンテュー領域を見出し、その領域で相同性の 高い部分をェクソン領域として同定する。開始コドンで始まるェクソン、終止コドンで 終わるェクソン、およびそれらに挟まれたェクソン候補間で可能な組み合わせを全て 網羅的に数え上げ、遺伝子を組み上げた。
[0105] (2)前駆体から生成されるペプチド成熟体を予測
上記の（1)で同定した前駆体配列の中から、長さが数残基から十数残基程度であ つて、 C末端側にトリプシン様酵素による切断モチーフ（Gly_Lys-Lys, Gly-Arg-Arg, ly-Lys-Arg, Gly_Arg_Lys, Gly-Lys, ly-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg, Lys_Arg, Arg-L ys, Lys, Argのいずれ力 を持つ配歹 lj、あるいは終止コドンで終わる配列を全て切り 出してリストアップした。
[0106] (3)モチーフ検索によるペプチド性リガンド候補予測
上記 (2)でリストアップ済みのペプチドリガンド候補配列をモチーフとして、再びヒト ゲノム配列へのマッピングと既知蛋白質配列への検索を行った。本発明においては 、モチーフとしてボンべシン様ペプチド最小活性単位を使用した。
[0107] まずく 1>緩いモチーフで候補をスクリーニングし、次に、く 2>より詳細なモチーフで候 補を絞り込む、作業を行った。
[0108] 本発明においては、緩いモチーフとして、
T卬- Ala- X-Gly (配列番号： 65) を用いた。また詳細なモチーフとしては、以下に記載の配列を使用した。
Trp-Ala-X-Gly-[Ser / His]-[Leu I Phe]_Met (配列番号： 66)
Trp-Ala-X-Gly-[Ser I His]-[Leu I Phe]-[Met I Asp I Glu] (配列番号： 67) Trp-Ala-X-Gly-[Ser I His]-[Leu I lie I Phe]-[Met I Asp I Glu] (配列番号： 68) [Leu I lie I Asp I Glu]-T卬- Ala- X_Gly- Ser- [Leu I lie I Phe]- Met (配列番号： 69) [Leu I lie I Asp I Glu]- T卬— Ala— [Val I Thr]-Gly-[Ser I His I Thr]- [Leu / lie / P he I Val]-[Met I Asp I Glu] (配列番号： 70)
[0109] モチーフの一致度の算出は以下の様に行った。
例えば [Leu I lie I Asp I Glu]- TYp-Ala- [Val I Thr]-Gly - [ Ser I His I Thr]-[ Le u / lie / Phe I Val]-[ Met I Asp I Glu] (配列番号： 70)の 8残基のモチーフを想定 し、各ヒットで何残基一致するかを調べ、一致度 =一致残基数とした。 (Trp, Ala, Gly は全てのヒットで一致するので加点から除外)。
[0110] モチーフがゲノム配列上アミノ酸に翻訳した領域に、検索ごとに設定した特定の一 致度以上のしきい値でヒットした場合は、その領域および前後の領域を伸ばし、蛋白 質候補配列を組み上げた。一方、既知蛋白質 DBにモチーフがヒットした場合は、ヒッ トした先の蛋白質配列を抽出した。
[0111] 以上の 2つの過程で得られた蛋白質候補配列に対し、ソフトウェア SignalP 3.0を禾 lj 用してシグナルペプチドの有無の判定を行った。シグナルペプチドを持つ場合、ぺ プチドリガンドの前駆体配列である可能性は高まる。
[0112] 同定した前駆体配列の中から、長さが数残基力 十数残基程度であって、 C末端 側にトリプシン様酵素による切断モチーフ（Gly-Lys-Lys, Gly-Arg-Arg, Gly-Lys-Ar g, Gly-Arg-Lys, Giy-Lys, Gly-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys, Lys, Ar gのいずれ力、）を持つ配列、あるいは終止コドンで終わる配列を全て切り出してリストア ップした。
[0113] 上記の方法により、ヒトゲノム配列からボンべシン様ペプチドの最小活性単位 T卬 -A la_X_Gly-[His/Ser]-X-Met構造 (Xは任意のアミノ酸残基）（配列番号： 71)を含む複 数の配列を抽出し、さらに BRS-3とのドッキングシュミレーシヨンを行うことにより、 BRS- 3に結合 '活性化するペプチドリガンドの最小活性単位の予測を行った。 [0114] その結果、下記配列
Trp-Ala-Leu-Gly-Ser-Leu-Met (配列番号： 10)
Trp-Ala-Pro-Gly-Ser-Leu-Met (配列番号： 11)
Trp-Ala-Gln-Gly-Ser-Leu-Met (配列番号： 12)
Trp-Ala-Thr-Gly-Ser-Leu-Met (配列番号： 13)
Trp-Ala-Cys-Gly-Ser-Phe-Met (配列番号： 14)
Trp-Ala-Lys-Gly-Ser-Leu-Met (配列番号： 15)
Trp-Ala-Pro-Gly-Ser-Phe-Met (配列番号： 16)
Trp-Ala-Val-Gly-Ser-Phe-Met-NH (配列番号： 17)
Trp-Ala-Ser-Gly-Ser-Leu-Met (配列番号： 18)
Trp-Ala-Gly-Gly-His-Phe-Met (配列番号： 19)
Trp-Ala-Met-Gly-Ser-Leu-Met (配列番号： 20)
Trp-Ala-Phe-Gly-His-Phe-Met-NH (配列番号： 21)
が最小活性単位の候補として予測された（図 1)。
[0115] 〔実施例 2〕 最小活性単位を含むペプチドの設計および化学合成
実施例 1により予測された最小活性単位を含む配歹 1Jをヒトゲノム配列から抽出し、抽 出した配列およびその鎖長をかえた誘導体の化学合成を行った。設計したペプチド のアミノ酸配列を、配列番号： 21〜33 (図 3— A)、配列番号： 34〜53 (図 3— B)、お よび配列番号： 3、 38、 54〜64 (図3—〇）に示す。
[0116] 本発明のペプチドは、以下の Boc法あるいは Fmoc法を用いて簡易型ポリプロピレ ン反応容器中で固相合成し、その後精製を行った。
[0117] (1) Boc法による合成
Boc法によるペプチド合成において、カルボキシル末端が遊離のカルボン酸の場合 固相担体には PAM樹脂を、アミド体の場合は p_methy卜 benzhydrylamine樹脂を用 レヽ、 a -amino基の保護基に Boc基を用い固相合成した。また Boc-アミノ酸の側鎖保 護基として Argには tosyl基、 Aspには cyclohexyl基、 Cysには 4- methylbenzyl基、 G1 uiこ f benzyl ester 、 Fiisiこ P;2，4-dimtrophenyl (Dnp) 、 Lys(こ f 2-chlorobenzylox ycarbonyl基、 Serおよび Thr (こ f benzyl基、 Tyr(こ fま 2-bromobenzyloxycarbonyl基 を用いた。最初に Boc-X-樹脂 (Xは合成したいペプチドの C末端アミノ酸）を 50 % TFAで処理し、 N末端の Boc基を切断、続いて Boc-Xの導入量に対し 2.5当 量の Boc-アミノ酸を DCC-HOBt法で縮合させた。数時間後、 Kaisarのニンヒドリン テストによって反応が完了しているかどうかを確認し、反応が充分でない場合は再度 縮合反応を行なった。このように Boc基の切断と保護アミノ酸の縮合反応を繰り返し て C末端より順次ペプチド鎖を延長し、保護ペプチド樹脂を得た。ただし、 Trpのィ ンドール環を保護するために、 Trp残基導入後の Boc基の切断には 2 % エタンジ チオールを含む 50% TFAを使用した。得られた保護ペプチド樹脂の脱保護および 樹脂からの脱離は、無水フッ化水素処理により行なった。すなわち、保護ペプチド樹 脂 lgあたりァニソール（0.5 ml)、チオアニソール、エタンジチオール、硫化メチル（各 1 ml )存在下、 10 mlの無水フッ化水素で氷冷下 1時間処理してペプチドを樹脂か ら脱離し、同時に保護基を除去した。反応後直ちに HFを真空下で除去し、ぺプチ ドおよび樹脂混合物をジェチルエーテルで洗浄した後、 60%ァセトニトリルによりべ プチドを抽出し、減圧濃縮後凍結乾燥して粗ペプチドを得た。ただし、保護ペプチド 樹脂に Hisが含まれている場合は、 Dnp基をチォフエノール（20 mmol/mmol Dnp 基）で 1時間反応させて除去した後、 N末端の Boc基を切断、無水フッ化水素処理 を行った。
(2) Fmoc法による合成
Fmoc法によるペプチド合成においては、固相担体にカルボキシル末端が遊離の カルボン酸の場合は Wang樹脂を、アミド体の場合は Rink amide樹脂を用いて固相 合成した。アミノ酸の保護基として α -ァミノ基には Fmoc基を、側鎖の保護には Asn 、 Cys、 Ginおよび Hisに triphenylmethyl ( Trt )基、 Ser、 Thrおよび Tyrに tert_butyl( t -Bu )基、 Gluおよび Asp (こ tert-butyl ester¾、 Arg(こ 4— methoxy-2，j，6-trimethylben zenesulfonyl ( Mtr )¾¾>5l 、fi2,2，4，6,7—pentamethyldihydrobenzofuran—5—sulfonyl ( Pbf)基、 Lysおよび T卬には tert- butyloxycalbonyl ( Boc )基を用いた。まず Wang樹 脂あるいは Rink amide樹脂を dichloromethane (DCM)中で膨潤させた後、これと 2当 量の DCC、 0.2当量の dimethylaminopyridine ( DMAP )、 Fmocアミノ酸を N，Nし dimeth ylformamide ( DMF )中において 1時間反応させ Fmocアミノ酸 -樹脂を得た。ぺプチ ド鎖の伸長は Fmoc-アミノ酸-樹脂を 25 %ピぺリジン- DMF中で約 30分処理して Fmo c基を除去した後、導入された C末端アミノ酸に対して 2.5当量の Fmoc-アミノ酸、 HOB t、 DCCならびに、 0.5当量の Ν,Ν',Ν''-diisopropylethylamine ( DIEA )、あるいは 2.5当 量の Fmoc-アミノ酸、 HOBt、 2.25等量の HBTUならびに、 4.5当量の DIEAを加えて 30 分〜数時間縮合する操作を繰り返すことで行なった。 Fmoc基の脱離および縮合反 応の進行は、微量の樹脂を反応容器より取り出してニンヒドリンテストを行なって確認 した。得られた保護ペプチド-樹脂の脱保護および樹脂からの脱離はスカベンジャー としてフエノール、チオアニソール、エタンジチオールを含む TFA溶液（ TFA： フエ ノール：チオアニソール：エタンジチオール：水 = 82.5 : 5 : 5 : 2.5 : 5 )で 3時間処理す ることにより行なった。反応終了後に反応混合液を濃縮除去し、 1 M酢酸を用いてぺ プチドの抽出を行ない樹脂を濾別した。その後ジェチルエーテルによる洗浄を 5回行 なレ、スカベンジャーを除去し減圧濃縮した後、凍結乾燥することで粗ペプチドを得た
(3)合成ペプチドの精製
合成ペプチドの精製は逆相 ODSカラム（ 20 X 250 mm )を用いた RP-HPLC によ つて行った。精製は、 0.1% TFA存在下でァセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて 流速 5 ml /minで溶出を行い、 214 nmの吸収を指標に主なピークを分取し、これ を凍結乾燥することで精製ペプチドを得た。精製ペプチドの純度は、 ODS (4.5 X 15 0 mm)カラムを使用した分析 RP-HPLCにより確認した。ペプチドの精製同様に、 0.1 % TFA存在下でァセトニトリルの直線的濃度勾配をかけて流速 1 ml /minで溶出 を行い、 214 nmの吸収で検出した。また MALDI-TOF MS装置を用いて質量分析し 、 目的の質量数であることを確認した。次に、精製したペプチドを 2% フエノール、 2 % チォグリコール酸を含む 6 N塩酸中で 110 °C、 24時間加水分解し、加水分解 物をアミノ酸分析計によって分析することでペプチドのアミノ酸組成を確認するととも に、その含有量を定量した。定量したペプチドは 100 nmol/tubeで分注し、凍結乾 燥後測定時まで冷凍保存した。またこれらは水に難溶性であるため、ジメチルスルホ キシド（DMSO)に溶解し DMSOの終濃度が 0.1%となるようにした。その際この濃度 で、それぞれの反応に影響がみられなレ、ことを確認した。 [0120] 〔実施例 3〕 NMB受容体（NMBR)、 GRP受容体（GRPR)ならびに BRS-3発現 HEK293 細胞の作製
NMB受容体（NMBR)、 GRP受容体（GRPR)ならびに BRS-3を発現する HEK293細胞 の作製を下記の工程により行った。
[0121] (1)細胞培養
HEK293細胞あるいは BRS-3安定発現 HEK293細胞（BRS3/HEK293 stable,後述） の培養は、 10。 /。熱非働化ゥシ胎児血清（FBS)含む DMEM培地（10% FBS-DMEM) 中で 37 °C、 CO 濃度 5 %の条件下静置して行った。細胞培養には直径 10 cmの c
2
ollagen-coated dishを用い、細胞がコンフルェントになるたびに継代した。すなわち、 コンフルェントに細胞が増殖した dishの培地を吸引し除いた後 PBSで洗浄し、つづい て 0.025% Trypsin- EDTAを室温で 1分反応させ接着した細胞を回収した（trypsin- ED TA処理）。これに 1 mlの trypsin inhibitorを加えて trypsinを不活性化した後、細胞懸 濁液を 15 mlの遠心管に移し、 PBSで細胞懸濁液を 15 mlにフィルアップして遠心（800 rpm, 4 min)、上清を吸引して除いた後、 PBS 10 ml中に懸濁し細胞数を計測した。こ の細胞懸濁液をふたたび遠心、上清を吸引し、最後に 1.0 X 106細胞 /10 mlとなるよう 10% FBS—DMEM【こ懸獨し、 dishiこ播禾重した。
[0122] (2) NMB受容体（NMBR)、 GRP受容体（GRPR)ならびに BRS-3—過発現 HEK293細 胞の作製
コンフルェントに増殖した HEK293細胞 dishの培地を吸引し除いた後、 dish 1枚あた り 5 mlの PBSで洗浄、 0.025% Trypsin-EDTAを室温で 1分反応させ細胞を脱接着した (trypsin-EDTA処理）。これに 1 mlの trypsin inhibitorを加えて trypsinを不活性化した 後、この細胞懸濁液を 15 mlの遠心管に移し、 PBSで細胞懸濁液を 15 mlにフィルアツ プして遠心（800 rpm, 4分）、上清を吸引して除いた後、 PBS 10 ml中に懸濁し細胞 数を計測した。この細胞懸濁液をふたたび遠心、上清を吸引し、計測した細胞数より 計算して dishl枚あたり 6.0 - 7.0 X 106細胞/ 10 mlとなるよう 10% FBS-DMEMに懸濁 し、 collagen-coated dishに播種、 37 °C、 5%COでー晚培養した。 24時間後検鏡によ
2
り培養密度がサブコンフルェントになったことを確認の上、 NMBR遺伝子（cDNAを配 列番号： 72に、アミノ酸配列を配列番号： 73に示す）、 GRPR遺伝子（cDNAを配列番 号： 74に、アミノ酸配列を配列番号： 75に示す）、または BRS-3遺伝子（cDNAを配列 番号： 76に、アミノ酸配列を配列番号： 77に示す）を組み込んだ細胞発現ベクター pc DNA3.1 (pcDNA/NMBR、 pcDNA/GRPRならびに pcDNA/BRS—3) 12 /i g相当量を 90 0 μ 1の OPTI- MEM培地で希釈した溶液に 45 μ 1の Lipofectamine 2000を 900 μ 1の〇Ρ ΤΙ_ΜΕΜ培地で希釈したものを静かに加え、室温で 20分インキュベートし、これを HE K293細胞の dishに加え 37 °C、 5%COでー晚培養した。この後上述したように trypsin
2
-EDTA処理により細胞を回収し、 1 dishから回収した細胞を 2 dishに再播種し、 24時 間後活性評価に使用した (後述)。
[0123] (3) BRS-3安定発現 HEK293細胞の作製
コンフルェントに増殖した HEK293細胞 dishの培地を吸引し除いた後、 dish 1枚あた り 5 mlの PBSで洗浄、上記の場合と同様に trypsin-EDTA処理により細胞を回収し、細 胞数を計測した。この細胞懸濁液をふたたび遠心、上清を吸引し、計測した細胞数 より計算して dishl枚あたり 6.0 - 7.0 X 106細胞/ 10mlとなるよう 10% FBS- DMEMに懸 濁し、 collagen-coated dishに播種、 37。C、 5%COでー晚培養した。 24時間後検鏡に
2
より培養密度がサブコンフルェントになったことを確認の上、 BRS-3遺伝子を組み込 んだジエネティシン耐性遺伝子を持つ pcDNA3.1細胞発現ベクター 12 μ g相当量を 900 /i 1の OPTI-MEM培地で希釈した溶液に 45 μ 1の Lipofectamine 2000を 900 μ \ の OPT -MEM培地で希釈したものを静かに加え、室温で 20分インキュベートし、これ を ΗΕΚ293細胞の dishに加え 37 °C、 5%COでー晚培養した。この後 dishの培地を吸
2
引して除き、ジエネティシンを含む 10% FBS-DMEM培地で 2週間培養し、再び trypsin -EDTA処理により生育した細胞コロニーを回収し、これを 96ゥエルプレートに 1ゥエル 1細胞になるように播種し、 RT-PCRで BRS-3遺伝子の発現を確認するとともに NMB によって細胞内カルシウム濃度が上昇する細胞を選択 (評価法は後述）、これを BRS- 3安定発現細胞（BRS3/HEK293 stable)とした。
[0124] 〔実施例 4〕 HEK293細胞に発現したボンべシン様ペプチド受容体 NMBR、 GRPRな らびに BRS-3を活性化するリガンドペプチドの評価
HEK293細胞に発現したボンべシン様ペプチド受容体 NMBR、 GRPRならびに BRS- 3を活性化するリガンドペプチドの活性は、細胞内カルシウム濃度上昇活性により評 価した。
[0125] ( 1 )評価方法
実施例 2において化学合成したペプチドおよび誘導体について以下の工程により 、ボンべシン様ペプチド受容体活性化能の評価を行った。実施例 3において作製し た各細胞を本評価方法に用いた。本評価方法の概念図を図 2に示す。
[0126] すなわち、受容体発現 HEK293細胞を trypsin-EDTA処理により回収し PBSで 3回洗 浄した後、 1 mlの Fluo_3 loading buffer (カルシウムイオン感受性蛍光物質である Flu ο-3-ΑΜ 4.4 μ M、 Pulonic F127 0.02%、 HEPES 20 mM、 Probenecid 2.5 mMならび に BSA 0.1%を含む HBSS溶液）中に懸濁、回転撹拌装置で回転させながら 37 °Cで 1 時間インキュベートすることで Fluo_3を細胞に取り込ませた。これを 800卬 mで 4分間 遠心し上清を吸引して除いた後、細胞を 5 mlの FDSS用アツセィ buffer (HEPES 20 m M、 Probenecid 2.5 mMならびに BSA 0.1%を含む HBSS溶液）中に懸濁し細胞を洗浄 する操作を 3回繰り返した後、細胞密度が 1 X 105細胞/ mlとなるように FDSS用アツセィ bufferに懸濁し、これを 96ゥエル optical plateに 40 μ 1/ゥエルずつ分注した。これにリ ガンドペプチド溶液を 10 μ ΐずつ添加し、蛍光測定装置（FDSS 6000、浜松ホトニタス 社製）にて 480 nmで励起したときの 530 nmにおける蛍光変化を経時的に測定した。
[0127] (2) BRS-3を安定発現した HEK293細胞に対するペプチドの活性
まず始めに、 BRS-3を安定発現した HEK293細胞に対する各合成ペプチドの BRS-3 活性化能の評価を行った。
[0128] その結果、 BN3-001-03 (配列番号： 24)、 BN3-001-04 (配列番号： 25)、 BN3-001- 05 (配列番号 26)、 BN3-001-06 (配列番号： 27)、 BN3-001-07 (配列番号： 28)、 BN 3-001-08 (配列番号 : 29) , BN3-001-09 (配列番号： 30)、 BN3-00ト 10 (配列番号： 31)、 BN3- 001- 11 (配列番号： 32)、 BN3-001-12 (配列番号： 33)、 BN3- 001- 13 (配 列番号： 21 )、 BN3-006-01 (配列番号： 38)、 BN3-006-02 (配列番号： 54)、 BN3-00 6-03 (配列番号： 55)、 BN3-006-05 (配列番号： 57)、 BN3-006-06 (配列番号： 3)、 および BN3_006_07 (配列番号： 58)において、ペプチド濃度 20 の刺激により有 意な細胞内遊離カルシウム濃度上昇が認められた（図 4、 5)。またこれらのうち ΒΝ3-0 01-06 (配列番号 : 27) , BN3-001-07 (配列番号： 28)、 BN3-001-08 (配列番号： 29) 、 BN3-001-11 (配列番号： 32)、 BN3-001-12 (配列番号： 33)、 BN3-001-13 (配列番 号： 21)および BN3-006-01 (配列番号： 38)、 BN3-006-02 (配列番号： 54)、 BN3-00 6-03 (配列番号 : 55) , BN3-006-05 (配列番号 : 57) , BN3-006-06 (配列番号： 3)に おいては、ペプチド濃度 2 においても有意な活性が確認された（図 4〜6)。
[0129] (3) NMBR、 GRPRならびに BRS-3を一過発現した HEK293細胞に対するペプチドの 活性
上記活性の確認されたペプチドのうち、 BN3_001_07 (配列番号： 28)、 BN3-001-1 0 (配列番号： 31)、 BN3_001_12 (配列番号： 33)、 BN3-006-01 (配列番号： 38)、 BN 3-006-05 (配列番号： 57)、 BN3-006-06 (配列番号： 3)、天然のボンべシン様ぺプチ ドである NMB、 GRP-10,およびボンべシンについて、ボンべシン様ペプチド受容体 N MBR、 GRPR、または BRS-3の活性化能を評価した。
[0130] 具体的には、ボンべシン様ペプチド受容体 NMBR、 GRPR、または BRS-3を一過的 に発現した HEK293細胞に対する、これらのペプチドの細胞内遊離カルシウム濃度 上昇活性およびその濃度依存性を検討した。
[0131] その結果、天然のボンべシン様ペプチドである NMBおよび GRP-10はそれぞれの受 容体に選択性を示す力 BRS-3についてはほとんど活性化しないこと、また、ボンべ シンは NMBR、 GRPRに対してほぼ同等の活性を示す力 BRS-3に対しては前記二つ の受容体の場合に比較して非常に活性が弱いことが明らかとなった。 （図 7)
[0132] さらに、活性予測ペプチドのうち BN3-006-06 (配列番号： 3)のみ BRS-3に選択性を 示し、 NMBRおよび GRPRをほとんど活性化しないのに対し、 BN3-001-07 (配列番号： 28)、 BN3-001-10 (配列番号： 31)、 BN3-001-12 (配列番号： 33)、および BN3-006- 01 (配列番号： 38)、 BN3-006-05 (配列番号： 57)は NMBRに選択性を示すが、すべ ての受容体を濃度依存的に刺激することが明らかとなった（図 8〜： 10)。
[0133] 以上の結果より BN3-006-06が持つ構造 NH -Leu-TYp-Ala- Cys-Gly- Ser- Phe- Met
2
-〇H構造（配列番号： 3)が、 orphan GPCRである BRS-3の選択的活性化に重要であ ることが示された。
産業上の利用可能性
[0134] 本発明により同定されたペプチドは、 3種類存在するボンべシン様ペプチド受容体 NMBR (BBS-l)、 GRPR (BBS_2)およびボンべシン受容体サブタイプ 3 (BRS-3)のうち 、 BRS-3を選択的に活性化させる機能を有する。このことから、本発明のペプチドは、 生体内においてボンべシン受容体サブタイプ 3を選択的に活性化させる用途に用い ることが可能であり、その選択性により他の受容体に結合することにより引き起こされ る副作用が軽減されるため、非常に有効性がある。
ボンべシン受容体サブタイプ 3遺伝子を欠損させたノックアウトマウスの研究報告よ り、ボンべシン受容体サブタイプ 3の活性化は抗肥満活性に繋がるものと考えられて いる。このことから、本発明のペプチドは肥満症の治療または予防に有効な効果を示 すものと考えられる。また BRS-3の関与が予測されているインスリンをはじめとした膝 ホルモン分泌刺激による糖尿病薬剤への応用、また腫瘍マーカーとしての有用性も 期待される。

Claims

請求の範囲
下記式で表され、かつボンべシン受容体サブタイプ 3のァゴニストとして作用すること を特徴とするペプチド：
Xl -X2 - Trp -Ala-X3 - Gly-X4
(式中、 XI、 X2、 X3、および X4は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、または アミノ酸配列である。 )
X3が、 Cys、 Val、または Pheのいずれかである、請求項 1に記載のペプチド。
X4が、 Ser-Phe_Met、または His-Phe-Metである、請求項 1または 2に記載のぺプチ ド。
X2が、 Alaまたは Leuである、請求項 1〜3のいずれかに記載のペプチド。
XIが、 Lys-Lys-Arg-Lys-Tyr (配列番号： 1 )、 Tyr、 pGlu (ピログルタミン酸）、 Ile-Ile-
Asn-Leu-Glu (配列番号： 2)、または Leu-Gluのいずれかである、請求項:!〜 4のいず れかに記載のペプチド。
以下の（a)または（b)のペプチド：
(a)配歹幡号： 3、 21、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 38、 54、 55、 5
7または 58に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
(b)配歹' J番号： 3、 21、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 38、 54、 55、 5
7または 58に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷 入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつボンべシン受容体サブタイ プ 3のァゴニストとして作用することを特徴とするペプチド。
カルボキシノレ末端がアミド化されたことを特徴とする、請求項:!〜 6のいずれかに記載 のペプチド。
ボンべシン受容体サブタイプ 3の選択的ァゴニストとして作用することを特徴とする、 請求項:!〜 7のいずれかに記載のペプチド。
請求項 1〜7のいずれかに記載のペプチドをコードしている DNA。
請求項 9に記載の DNAを含むベクター。
請求項 10に記載のベクターが導入された形質転換体。
請求項 1 1に記載の形質転換体を培養または育種し、該形質転換体細胞またはその 培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項 1〜7のいずれかに 記載のペプチドの製造方法。
[13] 請求項 1〜8のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象にお いてボンべシン受容体サブタイプ 3を活性化させる方法。
[14] 請求項 9に記載の DNA、請求項 10に記載のベクター、または請求項 11に記載の形 質転換体のレ、ずれかを対象に投与する工程を含む、対象にぉレ、てボンべシン受容 体サブタイプ 3を活性化させる方法。
[15] 請求項 1〜8のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象にお ける肥満症を治療または予防する方法。
[16] 請求項 9に記載の DNA、請求項 10に記載のベクター、または請求項 11に記載の形 質転換体のいずれかを対象に投与する工程を含む、対象における肥満症を治療ま たは予防する方法。
[17] 請求項:!〜 8のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有する、肥満症を予 防または治療するための薬剤。
[18] 請求項 9に記載の DNA、請求項 10に記載のベクター、または請求項 11に記載の形 質転換体のいずれ力を有効成分として含有する、肥満症を予防または治療するため の薬剤。
[19] 請求項 1〜8のいずれかに記載のペプチドに結合する抗体。
[20] モノクローナル抗体である請求項 19に記載の抗体。
[21] 請求項 1〜8のいずれかに記載のペプチド、または、請求項 19もしくは 20に記載の 抗体を含有する、腫瘍細胞の増殖を検出するためのマーカー。
[22] 請求項 1〜8のいずれかに記載のペプチド、または、請求項 19もしくは 20に記載の 抗体を含有する、代謝病を検出するためのマーカー。
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