WO2007088857A1 - 遺伝子改変動物およびその用途 - Google Patents

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WO2007088857A1
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mice
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Yoshihiko Kaisho
Shigehisa Taketomi
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a GPR40 gene-introduced non-human mammal and a non-human mammal deficient in gene expression, and screening for insulin secretion and Z or glucose tolerance regulators, anti-obesity drugs, insulin sensitivity regulators and the like using them. For methods.
  • GPR40 was reported in 1997 as an orphan G protein-coupled receptor with unknown ligand (Non-patent Document 1, Patent Document 1), and then the receptor is expressed in the spleen, and its ligand is a free fatty acid. (Patent Document 2). Furthermore, it has been shown that free fatty acids promote insulin secretion from spleen ⁇ 8 cell-derived cell lines via the receptor (Non-patent Documents 2 and 3).
  • Spleen ⁇ -cell disorder is also the basis of diabetes, and improvement of insulin secretion disorder is also effective from a therapeutic aspect. Therefore, clarifying the role of the GPR40 gene in vivo is important not only for basic research but also for viewpoints in drug discovery research.
  • GPR40 transgenic mice and gene-deficient mice have also been reported (Non-patent Document 3, Patent Document 4). According to it, GPR40 gene-deficient mice are resistant to glucose intolerance due to high-fat diet load, while GPR40 transgenic mice develop diabetes with insulin secretion failure.
  • Patent Document 1 International Application Publication No. 2000/22129 Pamphlet
  • Patent Document 2 International Application Publication No. 02/057783 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Application Publication No. 03/068959 Pamphlet
  • Patent Document 4 International Publication No. 2005/015990 Pamphlet
  • Non-Patent Document 2 Nature, 2003, 422 (6928): 173-6
  • Non-Patent Document 3 Cell MetaboL, 2005, 1: 245-58
  • the purpose of the present invention is to create and analyze GPR40 gene-introduced and gene-deficient animals to elucidate the functions of the GPR40 gene in vivo, and use the obtained genetically modified animals. It is to provide a screening and drug efficacy evaluation system for diabetes prevention and treatment drugs.
  • mice prepared by Edlund and Walker et al. overexpressed GPR40 with the IPF1 promoter.
  • the present inventors introduced a human GPR40 gene under the control of the insulin promoter to produce a transgenic (Tg) mouse.
  • Tg mice were found to have an increased insulin secretory capacity and an accompanying improvement in glucose tolerance compared to the corresponding non-transgenic mice.
  • the phenotype of the transgenic mouse according to the present invention became clear in vitro, supporting the results of promoting insulin secretion by V and GPR40, and supporting the concept of diabetes prevention and treatment by enhancing GPR40 activity. To do.
  • the present inventors also succeeded in producing a GPR40 gene knockout (KO) animal in which the GPR40 gene was disrupted using homologous recombination.
  • KO GPR40 gene knockout
  • the present invention provides:
  • a mouse or a part of its living body characterized by
  • a test compound is applied to the mouse according to [1] above or a part of its living body, and (1) insulin secretion and Z or (2) glucose tolerance is measured, (1) insulin Secretion and Z or (2) glucose tolerance regulator screening method,
  • a mouse or a part of the living body thereof according to [7], which is derived from a heterologous GPR40 force human, [9] a test compound applied to the mouse or the living body part according to [7] above, and the GPR40 agonist A method of screening for a heterologous GPR40 antagonist or a heterologous GPR40 antagonist, characterized by assaying for activity or GPR40 antagonist activity;
  • a heterologous mammal characterized by applying a test compound to the mouse according to [7] above or a part of its living body, and measuring (1) insulin secretion and Z or (2) glucose tolerance (1) Insulin secretion and / or (2) Glucose tolerance regulator screening method,
  • the GPR40 gene-modified animal of the present invention has an effect of exhibiting a phenotype that more reflects normal GPR40 function, and can be used as a screening method for GPR40 action regulators in vivo.
  • FIG. 1 shows the structure of a human GPR40 gene expression unit.
  • the human GPR40 gene containing pol y (A) + addition signal is linked downstream of the mouse insulin II gene promoter.
  • NonTg Control mouse.
  • FIG. 2 is a graph showing human (A) and mouse (B) GPR40 gene expression in isolated Lanai in Transgenic Mouse 47M and 23F systems.
  • the animals were on a low fat diet or high fat diet from 8 weeks of age to 8 weeks.
  • LF low fat diet load group
  • HF high fat diet load group
  • N control mouse
  • T transgenic mouse.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a glucose tolerance test of a transgenic mouse.
  • Glucose tolerance tests were performed on 16-week-old 47M strains (A, C) and 18-week-old 23F strains (B, D) mice that had been fed on a normal diet for 16 hours after fasting.
  • A, B) indicates plasma glucose level
  • C, D indicates plasma insulin level
  • NonTg Control mouse
  • Tg Transgenic mouse.
  • NonTg Control mouse
  • Tg Transgenic mouse 47M strain.
  • FIG. 5 is a diagram showing insulin secretion during glucose stimulation in a transgenic mouse.
  • A Insulin secretion in the presence of 3 mM glucose or 16 mM glucose in the transgenic mouse 47M system.
  • NonTg Control mouse
  • Tg Transgenic mouse 47M strain.
  • FIG. 6 is a diagram showing mouse GPR40 gene expression in GPR40 gene homo-deficient mice.
  • FIG. 7 shows general properties of GPR40 gene homo-deficient mice.
  • GPR40 gene homo-deficient mice from 8 weeks of age to 8 weeks, 10 kcal% fat low fat diet load (A, B, C, D) or 60 kcal% fat high fat diet load (E, F, G, H) was performed.
  • WT control mouse
  • KO GPR40 gene homo-deficient mouse
  • LF low-fat diet load group
  • HF high-fat diet load group.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of a glucose tolerance test in GPR40 gene homo-deficient mice in a fat diet loaded group.
  • GPR40 gene homo-deficient mice are fasted for 16 hours after 8 weeks of age to 11 weeks after a low-fat diet load (A, C) of 10 kcal% fat or a high-fat diet load of 60 kcal% fat (B, D) The glucose tolerance test was conducted.
  • A, B is plasma glucose level
  • WT control mouse
  • KO GPR40 gene homo-deficient mouse
  • LF low-fat diet load group
  • HF high-fat diet load group.
  • Transgenic non-human mammals that retain exogenous GPR40-encoding DNA in an expressible state are DNA encoding exogenous GPR40. Is stably maintained in a state where it can be expressed. “Stablely held” means that the DNA encoding the exogenous GPR40 is permanently present in the cells of the animal even if the DNA is integrated on the host chromosome. Alternatively, it may exist stably as extrachromosomal DNA, but preferably the DNA is retained in an integrated state on the host chromosome.
  • the Tg animal of the present invention is a fertilized egg of a non-human mammal, an unfertilized egg, a sperm and a progenitor cell thereof (primordial germ cell, oocyte, oocyte, egg cell, spermatogonia, spermatocyte) , Sperm cells, etc.), preferably in the early stage of embryo development of fertilized eggs (more preferably before the 8-cell stage), calcium phosphate coprecipitation method, electroporation (elect mouth position) method, lipofusion method, aggregation method, It is prepared by introducing DNA encoding the desired exogenous GP R40 by gene transfer methods such as microinjection, gene gun (particle gun), and DEAE-dextran.
  • the target DNA can be introduced into somatic cells, tissues, organs, etc. of non-human mammals and used for cell culture, tissue culture, etc. Tg animals can also be produced by fusing embryo (or reproductive) cells with known cell fusion methods.
  • the target DNA is introduced into embryonic stem cells (ES cells) of a non-human mammal using the above-described gene transfer method, and the DNA is stabilized in advance.
  • ES cells embryonic stem cells
  • the ES cell After selecting the integrated clone, the ES cell is injected into the blastocyst, or the ES cell mass and the 8-cell stage embryo are aggregated to create a chimeric mouse, and the introduced DNA is transmitted to the germ line It is also possible to obtain Tg animals by selecting those that have been made.
  • Tg animal organisms thus produced for example, (1) cells, tissues, organs, etc. that stably hold DNA encoding exogenous GPR40, (2) derived from these Cell or tissue cultured and passaged as necessary
  • ⁇ of the living body of a non-human mammal that holds exogenous GPR40-encoding DNA in an expressible state '' As ⁇ part '' It can be used for the same purpose as the “non-human mammal that retains exogenous GPR40-encoding DNA in an expressible state” of the invention.
  • Examples of the living body of the Tg animal of the present invention include organs such as spleen, liver, adipose tissue, skeletal muscle, kidney, adrenal gland, blood vessel, heart, gastrointestinal tract, and brain, and tissue pieces and cells derived from the organ. Is preferably exemplified.
  • non-human mammal that can be the subject of the present invention is not particularly limited as long as it is a non-human mammal for which a transgene system has been established.
  • Preferred are mice, magpies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, etc., among others, the ability to produce disease model animals
  • Mice that have relatively low ontogeny and relatively short biological cycles for example, as pure strains) C57BL / 6 system, DBA2 system, etc., B6C3F system, BDF system,
  • B6D2F BALB / c, ICR, etc. are preferred.
  • birds such as chicks can be used for the same purpose as the “non-human mammal” targeted in the present invention.
  • DNA encoding exogenous GPR40 is not restricted if it is not endogenous GPR40 DNA originally possessed by the non-human mammal that is the target of gene transfer but is introduced from the outside. It may be GPR40 DNA derived from a non-human mammal to be introduced (for example, mouse), or a heterologous mammal (for example, human, rabbit, monkey, pig, hidge, goat, usagi, inu, It may be GPR40 derived from cats, guinea pigs, hamsters, rats, etc.) or a DNA encoding a protein having substantially the same amino acid sequence.
  • the DNA encoding the exogenous GPR40 of the present invention is DNA encoding a heterologous GPR40 or a protein having substantially the same amino acid sequence as that of the non-human mammal to be introduced, more preferably human.
  • Examples of the DNA encoding human GPR40 include a DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 90% or more, preferably 95% or more, more preferably about 98% or more.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • the “protein having substantially the same amino acid sequence” includes an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a protein having substantially the same quality of activity as a potent protein is preferred.
  • “Substantially the same quality of activity” includes, for example, ligand [that is, free fatty acid and the like (including agonists and antagonists)] binding activity, intracellular Ca ++ concentration increasing activity, cAMP formation inhibitory activity, Insulin secretion promoting effect of spleen
  • the ligand binding activity, intracellular Ca ++ concentration increasing action, cAMP production inhibitory action, and insulin secretion promoting action are equivalent, but the extent of these activities (eg, about 0.01 to 100 times) , Preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times) and quantitative factors such as the molecular weight of the protein may be different.
  • the ability to measure activities such as ligand binding activity, intracellular Ca ++ concentration increasing action, cAMP production inhibitory action, and insulin secretion promoting action can be performed according to a method known per se. For example, described in Patent Document 3 above It can be measured according to the screening method and the like.
  • Examples of DNA encoding GPR40 derived from mammals other than humans include mouse, rat and hamster DNA described in Patent Document 3 above.
  • the DNA encoding exogenous GPR40 is preferably in an intron-free form (ie, complementary DNA), such as DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, but the intron 5 ′ and Since the 3 ′ end sequence is common to most eukaryotic genes, in another embodiment, forms containing introns (i.e. genomic DNA) can also be used preferably [provided that the ORF (sequence of human GPR40 No .: 1) is the human chromosome 19 (GenBank accession No. NC—000019 (VERSION: NC— 000019.8 GI: 42406306)) 40534295 to 4053, 5197, and the mouse GPR40 ORF (GenBank accession No.
  • NM— 194057.1 Is mouse chromosome 7 (GenBank accession No. NC— 000073 (VERSION: NC— 000073.3 GI: 83280982) ) At positions 113965103 to 113966005 (reverse strands), at least there are no introns in the human and mouse GPR40 genes].
  • DNA encoding exogenous GPR40 can be obtained from various non-human mammals (usi, monkeys, pigs, hedges, goats, usagis, inu, cats, guinea pigs, mice, mice, rats, mice). ) Spleen, liver, adipose tissue, skeletal muscle, kidney, adrenal gland, blood vessel, heart, gastrointestinal tract, brain, etc. and all or part of genomic DNA from various genomic DNA libraries sold by the company RNA power used as a raw material or derived from spleen, liver, adipose tissue, skeletal muscle, kidney, adrenal gland, blood vessel, heart, gastrointestinal tract, brain, etc. of various non-human mammals cDNA prepared by known methods It can be isolated as a raw material using the oligonucleotide prepared based on the known GPR40 gene sequence as a probe or primer, by the hybridization, PCR method or the like.
  • the Tg animal of the present invention retains DNA encoding exogenous GPR40 "in an expressible state". Therefore, when introducing the DNA into the target animal, it is generally used in a form (for example, an expression vector) comprising an expression cassette linked downstream of a promoter that can function in the cells of the target animal. It is advantageous.
  • Examples of vectors carrying DNA encoding exogenous GPR40 include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, butterophage such as lambda phage, and retro such as Moro-one leukemia virus. Animal or insect viruses such as viruses, lentiviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses or baculoviruses are used. Of these, plasmids (preferably E. coli-derived, Bacillus subtilis-derived or yeast-derived plasmids, particularly E. coli-derived plasmids) and animal viruses (preferably retroviruses, lentiviruses) are preferable.
  • promoters that regulate gene expression of exogenous GPR40 include promoters of genes derived from viruses (such as cytomegalovirus, Moro-1 leukemia virus, JC virus, and breast cancer virus), and various mammals (humans).
  • albumin, endothelin, osteocalcin eg, Muscle creatine
  • a promoter capable of specifically or highly expressing exogenous GPR40 in the target tissue eg, insulin I and II promoters that can be expressed specifically in the spleen (hereinafter collectively referred to as insulin) Promoter
  • GPR40 original promoter Serum amyloid ⁇ component (SAP), albumin, transferrin, fibrinogen, antithrombin III, a 1-antitrypsin and other gene promoters that can be highly expressed in the liver
  • adipose tissue Adiponectin-powered in-gene promoters such as adiponectin that can be expressed specifically in the gene
  • gene promoters such as muskrin that can be expressed specifically in skeletal muscle
  • gene promoters such as the PTH / PTHrP receptor that can be highly expressed in the kidney
  • Inheritance of highly expressed ACTH receptor Gene promoters such as preproendothelin-1 that can be expressed specifically in blood vessels; gene promoters such as a and
  • downstream of the DNA encoding exogenous GPR40 has a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in Tg animals (also referred to as polyadenylation (polyA) signal, terminator).
  • the expression of the transgene can be achieved efficiently by using a terminator sequence derived from a viral gene or from various mammalian or avian genes.
  • a terminator sequence derived from a viral gene or from various mammalian or avian genes.
  • simian virus SV40 terminator and the like are used.
  • splicing signals for each gene, enhancer region, and introns of eukaryotic genes are used for the purpose of further expressing the target gene. It is also possible depending on the purpose to link a part 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ downstream of the translation region.
  • the above vector can be used as a selectable marker gene (eg, neomycin resistance gene) for selecting a clone in which the introduced DNA is stably integrated.
  • a drug resistance gene such as a hygromycin resistance gene.
  • the above vector should be used to eliminate random insertions.
  • HSV-tk herpes simplex virus-derived thymidine kinase
  • diphtheria toxin gene is further included as a negative selection marker gene outside the DNA sequence homologous to the target site.
  • exogenous GPR40-encoding DNA, terminator, etc. are corrected and arranged in the above vector by a conventional genetic engineering technique using an appropriate restriction enzyme and DNA ligase. That is, it can be inserted in a Tg animal in an arrangement that allows expression of exogenous GPR40.
  • the expression vector containing DNA encoding exogenous GPR40 obtained as described above is introduced into an early embryo of a target non-human mammal by a microinjection method.
  • in vivo fertilized eggs obtained by mating male and female of the same non-human mammal were collected, or the male and female strength of the same non-human mammal were also collected. It can be obtained by in vitro fertilization of eggs and sperm.
  • mice preferably inbred mice such as C57BL / 6J (B6), F6 between B6 and other inbred strains
  • B6 inbred mice
  • F6 F6 between B6 and other inbred strains
  • females are preferably about 4 to about 6 weeks old, males are about 2 to about 8 months of age, and about 12 hours light condition (for example, 7: 00-19: 00) ) Is preferably raised for about 1 week.
  • In vivo fertilization may be by natural mating, but in order to control the sexual cycle and obtain a large number of individual embryos, after inducing superovulation by administering gonadotropin to female non-human mammals, A method of mating with a non-human mammal is preferred.
  • Excretion of female non-human mammals For example, follicle stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin)
  • luteinizing hormone human chorionic gonadotropin, generally abbreviated as hCG
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the non-human mammal is a mouse (preferably an inbred mouse such as C57BL / 6J (B6), F of B 6 and other inbred line, etc.), usually after administration of follicle stimulating hormone, 48 hours later
  • the preferred method of obtaining fertilized eggs by administering luteinizing hormone to male mice and immediately mating with male mice is about 20 to about 50 IU / individual, preferably about 30 IU / individual, luteinizing
  • the dosage of the hormone is about 0 to about 10 IU / individual, preferably about 5 IU / individual.
  • the abdominal cavity of a female non-human mammal whose mating has been confirmed by inspection of the vaginal plug, etc. remove the fertilized egg from the oviduct, and culture medium for embryo culture (e.g., M16 medium, modified Whitten medium, BWW medium, Wash in M2 medium, WM-HEPES medium, BWW-HEPES medium, etc.), remove cumulus cells, and incubate until 5% carbon dioxide / 95% air injection to DNA microinjection by the microdrop culture method. If microinjection is not performed immediately, the collected fertilized eggs can be stored frozen by the slow method or the ultra rapid method.
  • culture medium for embryo culture e.g., M16 medium, modified Whitten medium, BWW medium, Wash in M2 medium, WM-HEPES medium, BWW-HEPES medium, etc.
  • female fostering hormone and luteinizing hormone are administered to female non-human mammals for egg collection (similar to those used in in vivo fertilization) in the same manner as described above. After incubating the ovum, the egg is collected and cultured in a fertilization medium (eg, TYH medium) in the atmosphere of 5% carbon dioxide / 95% by microdrop culture until in vitro fertilization.
  • a fertilization medium eg, TYH medium
  • male non-human mammals of the same species are preferably used).
  • Sperm after completion of pre-culture is added to fertilization medium containing eggs and cultured under 5% carbon dioxide / 95% atmosphere using a microdrop culture method, etc., then fertilized eggs with two pronuclei are examined under a microscope. Select with. If DNA microinjection is not performed immediately! / ⁇ , the resulting fertilized egg can be stored frozen by the slow or ultra rapid method.
  • the microinjection of DNA into a fertilized egg can be performed according to a conventional method using a known apparatus such as a micromanipulator. Simply put, in a microdrop of embryo culture medium The fertilized egg is aspirated and fixed with a holding pipette, and the DNA solution is injected directly into the male or female pronucleus, preferably into the male pronucleus, using an injection pipette.
  • the introduced DNA is preferably one that has been highly purified using a CsCl density gradient ultracentrifugation or an anion exchange resin column.
  • the introduced DNA is preferably linearized by cleaving the vector portion using a restriction enzyme.
  • the fertilized egg after DNA introduction is cultured from the 1 cell stage to the blastocyst stage in 5% carbon dioxide gas / 95% air in the embryo culture medium by the microdrop culture method etc. Transplanted into oviduct or uterus of female non-human mammal for embryo.
  • the recipient non-human mammal should be of the same species as the animal from which the early embryo to be transplanted is derived. For example, when transplanting an early mouse embryo, an ICR female mouse (preferably about 8 to about 10 weeks old) is preferably used.
  • Embryonic female Non-human mammals can be put into a pseudopregnant state by, for example, homologous vasectomy (ligation) male non-human mammals (for example, in the case of mice, ICR male mice (preferably about 2 It is known how to select those that have been confirmed to be vaginal plugs by mating with those older than months))).
  • Embryonic females should be naturally ovulated, or luteinizing hormone-releasing hormone (generally abbreviated as LHRH) or its analog prior to mating with a vasectomized (ligated) male. It is also possible to use those that have been administered to induce fertility.
  • LHRH luteinizing hormone-releasing hormone
  • LHRH analogs include [3,5- Dil- Tyr 5 ]-LH- RH, [Gin 8 ]-LH- RH, [D- Ala 6 ]-LH- RH, [des- Gly 10 ]- LH-RH, [D-His (Bzl) 6 ] -LH-RH and their ethylamides.
  • the dose of LHRH or its analog, and the time of mating with a male non-human mammal after the administration differ depending on the type of non-human mammal.
  • the non-human mammal is a mouse (preferably an ICR mouse, etc.)
  • the dose of the analog is usually about 10-60 / zg / individual, preferably about 40 g / individual.
  • the embryo is transplanted into the fallopian tube.
  • Embryo recipient females are used appropriately after a certain number of days with pseudopregnancy depending on the stage of embryo transfer. For example, in the case of mice, female mice about 0.5 days after pseudopregnancy are preferable for transplanting 2-cell stage embryos, and female mice about 2.5 days after pseudopregnancy are preferable for transplanting blastocyst stage embryos.
  • Anesthetize female for embryo transfer (preferred Or Avertiiu Nembutal, etc.), then incision is made to draw out the ovary, and early embryos (about 5 to about 10) suspended in the culture medium for embryo culture are placed in the abdominal cavity of the fallopian tube using an embryo transfer pipette. Alternatively, inject near the fallopian tube junction.
  • a non-human mammal can be obtained by natural delivery or caesarean section. If a naturally delivered embryo is born by cesarean section, the offspring should be kept separately.
  • a female mouse that is normally mated and delivered (preferably Can be fed to ICR female mice))).
  • progeny (F) animals are exogenous to all germline and somatic cells.
  • F animals are obtained as heterozygotes with the introduced DNA only in one of the homologous chromosomes.
  • an expression vector containing a DNA encoding exogenous GPR40 is introduced into ES cells of a target non-human mammal by a known gene transfer method such as an electopore position method.
  • ES cells are cells derived from the inner cell mass (ICM) of fertilized eggs at the blastocyst stage, and can be cultured and maintained in an undifferentiated state in vitro. ICM cells are the cells that will form the embryo body in the future. The stem cell that is the basis of all tissues, including germ cells. As ES cells, already established cell lines can be used, or those newly established according to the method of Evans and Kauftnan (Nature 292, 154, 1981). Good. For example, in the case of mouse ES cells, ES cells derived from 129 mice are generally used. However, since the immunological background is unclear, an alternative and purely immunologically genetic gene is used. For the purpose of obtaining ES cells with a clear background, for example, B57 mice (C57BL / 6 and DBA / 2 and
  • ES cells established from F can be used well.
  • C57BL / 6 mouse Since the C57BL / 6 mouse is used as a background in view of the advantage of being large and eggs are strong, ES cells derived from this can be backcrossed with the C57BL / 6 mouse when a disease model mouse is prepared.
  • the genetic background can be advantageously used in that it can be replaced with C57BL / 6 mice.
  • ES cells can be prepared, for example, as follows.
  • mice preferably inbred mice such as C57BL / 6J (B6), F of B6 and other inbred strains, etc.
  • mice preferably inbred mice such as C57BL / 6J (B6), F of B6 and other inbred strains, etc.
  • mice preferably inbred mice such as C57BL / 6J (B6), F of B6 and other inbred strains, etc.
  • the uterine force of female mice (about 3.5 days of gestation is preferably used) is also collected in the embryo culture medium after collecting the blastocyst stage embryo (or after collecting the oviduct force of the early embryo before the morula stage) And may be cultured to the blastocyst stage in the same manner as described above), an appropriate feeder cell (for example, in the case of a mouse, a primary fibroblast prepared from a mouse fetus, a known STO fibroblast cell line, etc.) When cultured on a layer, some cells of the blastocyst gather to form an ICM that differentiates into an embryo in the future. This inner cell mass is treated with trypsin to dissociate single cells, maintain appropriate cell density, and repeat the dissociation and subculture while changing the medium to obtain ES cells.
  • an appropriate feeder cell for example, in the case of a mouse, a primary fibroblast prepared from a mouse fetus, a known STO fibroblast cell line, etc.
  • ES cells may be male or female, a normal ES cell is more convenient for producing a germline chimera. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.
  • One example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. Using this method, the number of ES cells (about 50) is only about 1 colony, compared to about 10 6 cells previously required for karyotype analysis. Thus, primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by male / female discrimination, and male cells can be selected at an early stage, which can greatly reduce labor in the early stage of culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the ES cell line obtained in this way must be carefully subcultured to maintain the properties of undifferentiated stem cells.
  • an appropriate feeder cell such as STO fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbonic acid
  • LIF 1 to 10,000 U / ml
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5 % Trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA (preferably about 0.1% trypsin / ImM EDTA) treatment, and then seeded on a newly prepared feeder cell.
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5 % Trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA (preferably about 0.1% trypsin / ImM EDTA) treatment, and then seeded on a newly prepared feeder cell.
  • Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this
  • ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by suspension culture until the ability to monolayer culture to a high density or to form a cell clump.
  • MJ Evans and MH Kau & ian Nature 292, 154, 1981
  • GR Martin Proceedings' Ob 'National' Academia ⁇ ⁇ Ob 'Sciences' USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal 'Ob' Embryology, ⁇ and.Experimental. Morphology, 87, 27.
  • exogenous GPR40-expressing non-human mammalian cells obtained by separating ES cells into which the DNA encoding the exogenous GPR40 of the present invention has been introduced are cell biology of exogenous GPR40 in the in vitro mouth. This is useful in the study.
  • calcium phosphate coprecipitation method, electroporation method, lipofuxion method, retrovirus infection method, aggregation method, microinjection method, gene gun (particle gun) ) Method and DEAE-dextran method can be used.
  • the point-elect-position method is generally selected because it can easily process a large number of cells.
  • ES cells into which the introduced DNA has been incorporated are screened for colony strength separated and extracted by culturing single cells on a single feeder cell, by Southern blot hybridization or PCR.
  • the greatest advantage of a transgenic system using ES cells is that transformants can be selected at the cell stage using the expression of drug resistance genes and reporter genes as indicators. Therefore, the transduction vector used here contains a drug resistance gene (eg, neomycin phosphotransferase II (nptll) gene, no, igromycin phosphotransferase (in addition to an expression cassette containing DNA encoding exogenous GPR40)).
  • a drug resistance gene eg, neomycin phosphotransferase II (nptll) gene, no, igromycin phosphotransferase (in addition to an expression cassette containing DNA encoding exogenous GPR40).
  • hpt gene
  • a reporter gene eg, j8-galactosidase (lacZ) gene, chloramphie-coal acetyltransferase (cat) gene, etc.
  • the selection marker gene eg, j8-galactosidase (lacZ) gene, chloramphie-coal acetyltransferase (cat) gene, etc.
  • the ES cells after gene transfer treatment are cultured in a medium containing a neomycin antibiotic such as G418, and the emerged resistant colonies are respectively placed on a culture plate. After transfer, repeat trypsinization and medium exchange, leave a part for culture, and apply the rest to PCR or Southern hybridization to confirm the presence of the introduced DNA.
  • ES cells in which the integration of the introduced DNA has been confirmed are returned into the embryo derived from a non-human mammal of the same species, they are incorporated into the ICM of the host embryo to form a chimeric embryo.
  • a chimeric transgenic animal can be obtained by transplanting this to a foster parent (female for embryo transfer) and continuing the development.
  • ES cells contribute to the formation of primordial germ cells that will be separated into eggs and sperm in the chimeric animal, germline chimeras will be obtained. Tg animals fixed in can be prepared.
  • Chimera embryos can be produced by adhering and collecting early embryos up to the morula stage (aggregate chimera method) and by microinjecting cells into the blastocyst split cavity (injection chimera method) There is.
  • the power of the latter has been widely used in the production of chimeric embryos using ES cells.
  • an assembled chimera is produced by co-culturing and aggregating an ES cell mass and an 8-cell embryo from which the zona pellucida has been removed.
  • the host embryo can be collected in the same manner from a non-human mammal that can be used as an egg-collecting female in gene transfer to a fertilized egg.
  • ES cells for the formation of a chimeric mouse are used. It is preferable to collect mouse power host embryos of a line with a different color from the line from which the ES cells are derived so that the contribution rate of the cell can be determined by coat color.
  • ES cells are derived from a 129 mouse (hair color: agouti)
  • C57BL / 6 mice hair color: black
  • ICR mice hair color: albino
  • ES cells are C57BL / 6.
  • DBF mice hair color: black
  • TT2 cells C57BL / 6 and CBA F
  • ICR mice and BALB / c mice can be used as females for egg collection.
  • the germline chimera-forming ability largely depends on the combination of ES cells and host embryos, it is more preferable to select a combination having a high germline chimera-forming ability.
  • a host embryo derived from the C57BL / 6 strain for ES cells derived from 129 strains, and a host embryo derived from the BALB / c strain for ES cells derived from C57BL / 6 strains. Etc. are preferred.
  • Female mice for egg collection are preferably about 4 to about 6 weeks of age, and males for mating are preferably of the same strain of about 2 to about 8 months of age.
  • the mating may be natural mating, but preferably after gonadotropin (follicle stimulating hormone, next luteinizing hormone) is administered to induce superovulation.
  • a blastocyst stage embryo (for example, in the case of a mouse, about 3.5 days after mating) is collected from the uterus of an egg-collecting female (or an early embryo before the morula stage) And then may be cultured to the blastocyst stage in the above-described embryo culture medium), and DNA encoding exogenous GPR40 was introduced into the blastocyst split space using a micromanipulator After injecting ES cells (about 10 to about 15 cells), the cells are transplanted into the uterus of a female non-human mammal for embryo transfer that is pseudopregnant.
  • a non-human mammal for embryos a non-human mammal that can be used as a female for embryos in gene transfer into a fertilized egg can be used as well.
  • 8-cell embryos and morulas are collected from the oviduct and uterus of the female egg collection (or early embryos before the 8-cell stage).
  • the embryo After collecting the fallopian tube force, it can be cultured in the above-mentioned embryo culture medium until the 8-cell stage or the morula stage.) After dissolving the zona pellucida in acidic tyrode solution, the embryo layered with mineral oil Place the ES cell mass (about 10 to about 15 cells) into which DNA encoding exogenous GPR40 has been introduced into the microdroplet of the culture medium, and then add the above 8-cell embryo or morula (preferably 2) ) And co-culture overnight. The obtained morula or blastocyst is transplanted into the uterus of a female non-human mammal for embryo reception in the same manner as described above.
  • a chimeric non-human mammal can be obtained by natural delivery or caesarean section. If a baby is delivered by cesarean section, it is sufficient to continue suckling in the naturally delivered embryo. If the baby is born separately, the baby is a separately prepared nursing female (usually mated and delivered non-human mammal). Can be made.
  • the sexes of ES cells are first discriminated in advance.
  • a chimeric mouse having the same sex as the ES cells is selected (usually male ES cells are used, so male chimeric mice are selected.
  • a chimeric mouse (for example, 50% or more) having a high contribution rate of ES cells is selected.
  • D3 cells which are male ES cells derived from 129 mice, and host embryos derived from C57BL / 6 mice
  • the proportion of the flag hair color is high.
  • Confirmation of whether the selected non-human mammal is a germline chimera can be performed based on the phenotype of the F animal obtained by crossing with a homologous animal of an appropriate strain. For example, the above
  • Germline chimeric non-human mammals (founders) into which DNA encoding exogenous GPR40 obtained as described above is introduced are usually heterozygotes having the introduced DNA only in one of the homologous chromosomes. As obtained. Individual founders are randomly inserted on different chromosomes unless homologous recombination is used. In order to obtain a homozygote having DNA encoding exogenous GPR40 in both homologous chromosomes, the F-activity obtained as described above is used.
  • Heterozygous siblings with heterozygous DNA introduced into only one of the homologous chromosomes in one product may be crossed.
  • Select heterozygotes, for example! 7 Stains isolated and extracted from the tail of animals
  • Body DNA can be assayed by screening by Southern hybridization or PCR. If the introduced DNA is integrated only at one locus, 1/4 of the F animals obtained will be homozygous.
  • Another preferred embodiment when using a virus as an expression vector is a method of infecting an early embryo or ES cell of a non-human mammal with a virus containing DNA encoding exogenous GPR40.
  • a virus containing DNA encoding exogenous GPR40 For example, Proceedings 'Ov'National' Power Demi ⁇ ⁇ Ov 'Sciences' USA 99th, No. 4, pp. 2140-2145, See 2002.
  • retroviruses or lentiviruses seed cells (preferably remove the zona pellucida for fertilized eggs! / ⁇ ) in an appropriate incubator such as a dish, and add the viral vector to the culture medium. (Polyprene may coexist if desired).
  • a selective agent such as G418 and idaromomycin is added and the culture is continued to select cells into which the vector has been incorporated.
  • Tg animals of the present invention have the following characteristics compared to the corresponding non-transgenic animals:
  • Non-Patent Document 3 and Patent Document 4 Conventionally known GPR40 Tg mice (see Non-Patent Document 3 and Patent Document 4) developed diabetes with insulin secretion deficiency.
  • the above phenotype of the Tg animal of the present invention supports the concept that a GPR40 agonist promotes the secretion of spleen cell insulin and is useful as a prophylactic or therapeutic agent for diabetes. is there. That is, in the Tg animal of the present invention, it is considered that the exogenous GPR40-encoding DNA is under the control of the insulin promoter, and the original enhancement of ⁇ -cell function has been achieved.
  • the phenotype of the Tg animal of the present invention was observed in two strains as described in the Examples, it is an effect based on the transgene, and it is supported that it reflects normal GPR40 function.
  • the known GPR40 Tg mouse is an expression mouse with the Ipf-1 promoter, the promoter used was different, and the phenotype was different due to differences in expression site, expression time, expression level, insertion location in the chromosome, or for some reason. It is thought that there was a difference in
  • the Tg animal of the present invention is used in an evaluation system for GPR40 modulators (including agonists and antagonists) that merely demonstrates the concept of 'preventing and treating diabetes with GPR40 agonists.' be able to.
  • the present invention also provides a GPR40 agonist or GPR40 antagonist, characterized by applying a test substance to the Tg animal of the present invention or a part of its living body and assaying for GPR40 agonist activity or GPR40 antagonist activity.
  • a test substance to the Tg animal of the present invention or a part of its living body and assaying for GPR40 agonist activity or GPR40 antagonist activity.
  • a human-type gene is expressed, it is useful for evaluating a compound that acts only on the human-type gene.
  • the “agonist activity” refers to a property of specifically binding to GPR40 and shifting the equilibrium state between the active and inactive forms of GPR40 to the active side, and the degree thereof is not particularly limited. Therefore, the “substance having agonist activity (agonist)” includes not only so-called fluagonist but also partial ghost.
  • antagost activity refers to GPR40 Riga GPR40 active and inactive forms that bind to any binding site of GPR40, or bind to any site of GPR40. The property which shifts the equilibrium state of to a more inactive side. Therefore, in this document, “antagonist active substance (antagonist)” is defined as a concept encompassing both the so-called neutral antagonist and the inverse agonist. To do.
  • test substance is administered to the Tg animal of the present invention.
  • test substances in addition to known synthetic compounds, peptides, proteins, DNA libraries, etc., for example, tissue extracts of mammals (for example, mice, rats, pigs, ushi, hidge, monkeys, humans, etc.) Cell culture supernatant is used.
  • Test substance GPR40 agonist Z antagonist activity is an indicator of ligand (i.e., free fatty acid, etc.) binding activity, intracellular Ca ++ concentration-increasing effect, cAMP production inhibitory activity, and insulin secretion promoting effect from splenocytes. Can be tested. These can be measured according to a method known per se.
  • GPR40 agonists selected in this way are effective against diseases such as safe and low-toxic glycouria (types I and II), impaired glucose tolerance, hyperlipidemia, and metabolic syndrome in mammals. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent, spleen function regulator (eg, spleen function improving agent), insulin secretagogue, glucose lowering agent, spleen) 8-cell protective agent. Others, ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, arteriosclerosis, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, thrombotic disease, dyspepsia, memory learning disorder It can also be used as a preventive or therapeutic agent for diseases such as
  • the GPR40 agonist is, for example, orally as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like with sugar coating as necessary, or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution or suspension.
  • the agonist is mixed with the physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., in a unit dosage form generally required for the practice of the approved formulation. It can be formulated. The amount of the active ingredient in these preparations is appropriately selected in consideration of the dose described later.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • a swelling agent such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry, etc.
  • a liquid carrier such as fats and oils.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil etc. .
  • aqueous solutions for injection include isotonic solutions (eg, D -sorbitol, D-manntol, sodium chloride sodium salt, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants.
  • Suitable solubilizers such as alcohol (eg ethanol), polyalcohol (eg propylene glycol, polyethylene glycol etc.), nonionic surfactants (eg polysorbate 80 TM, HCO-50 etc.) ) Etc.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, salted benzalcoum, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene) Glycol, etc.
  • preservatives eg benzyl alcohol, phenol, etc.
  • anti-oxidation agents eg., anti-oxidation agents and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, mammals (for example, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, Hedges, pigs, rabbits, horses, cats, Inu, monkeys, etc.), preferably administered to an animal (preferably human) from which exogenous GPR40 is derived.
  • mammals for example, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, Hedges, pigs, rabbits, horses, cats, Inu, monkeys, etc.
  • the dose of GPR40 agonist varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.For example, when administered orally for the purpose of treating diabetes, it is generally clear for adults (body weight 60 kg) a day. About O.lmg to about 100 mg, preferably about 1.0 to about 50 mg, more preferably about 1.0 to about 20 mg.
  • the dose of the agonist is the subject of administration and the target disease. For example, when administered to an adult (body weight 60 kg) as an injection for the treatment of diabetes, it is about 0.01 to about 30 mg, preferably about 0.1 to about 20 mg, more preferably. Is about 0.1 to about 10 mg. Even if the subject of administration is an animal other than a human, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the GPR40 antagonist selected by the screening method of the present invention is safe and low-toxic obesity and hyperlipidemia in mammals (preferably, animals derived from exogenous GPR40, more preferably humans). It is useful as a preventive-therapeutic agent for diseases such as type II diabetes and insulin resistance syndrome, a spleen function regulator (eg, a spleen function improving agent), an insulin secretion inhibitor, and a blood sugar increasing agent.
  • a spleen function regulator eg, a spleen function improving agent
  • an insulin secretion inhibitor e.g, a spleen function improving agent
  • a blood sugar increasing agent e.g., a blood sugar increasing agent.
  • GPR40 antagonists are formulated in the same manner as the above GPR40 agonists, and are orally or parenterally administered to mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, ushi, Horses, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the GPR40 antagonist varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • adults when administered orally for the treatment of obesity, generally, adults (body weight 60 kg) should be administered daily.
  • the dosage of the antagonist varies depending on the subject of administration, target disease, etc.For example, when administered to an adult (60 kg body weight) as an injection for the treatment of obesity, about 0.01 to About 30 mg, preferably about 0.1 to about 20 mg, more preferably about 0.1 to about 10 mg. Even if the subject of administration is an animal other than a human, an amount converted per 60 kg of body weight can be administered.
  • the Tg animals of the present invention are compared to corresponding non-transgenic animals,
  • the animal is particularly useful for screening (1) insulin secretion and Z or (2) glucose tolerance modulators.
  • the present invention also provides a test substance to the Tg animal of the present invention or a part of its living body.
  • a test substance to the Tg animal of the present invention or a part of its living body.
  • a test substance is administered to the Tg animal of the present invention.
  • test substances in addition to known synthetic compounds, peptides, proteins, DNA libraries, etc., for example, mammalian extracts (eg, mouse, rat, pig, ushi, hidge, monkey, human etc.), cell extracts A culture supernatant or the like is used.
  • mammalian extracts eg, mouse, rat, pig, ushi, hidge, monkey, human etc.
  • cell extracts A culture supernatant or the like is used.
  • the insulin secretion regulating action and the glucose tolerance regulating action of the test substance can be measured according to a method known per se, for example, the method used in the examples described later.
  • the insulin secretion Z glucose tolerance modulator selected by the screening method is used for improving insulin secretion and Z or glucose tolerance in mammals (preferably animals derived from exogenous GPR40, more preferably humans). can do.
  • the modulator is formulated in the same manner as the above GPR40 agonist and is orally or parenterally used in mammals (for example,
  • the dose of the insulin secretion Z glucose tolerance regulator varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the dosage of the modulator varies depending on the subject of administration, target disease, etc.
  • the subject of administration is an animal other than a human, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • a non-human mammal deficient in GPR40 gene expression means a non-human mammal in which the expression of endogenous GPR40 is inactivated, and from the ES cell in which the GPR40 gene is knocked out (KO), according to the above method
  • knockdown (KD) animals in which GPR40 gene expression is inactivated by antisense or RNAi technology are also included.
  • knockout (KO) means complete destruction by destroying or removing endogenous genes.
  • knockdown means inactivating the expression of endogenous genes by inhibiting the translation of mRNA into protein. Means.
  • the "non-human mammal” that can be targeted is established as a transgene system.
  • non-human mammals such as mice, rats, rabbits, monkeys, pigs, hidges, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters and the like.
  • mice, rats, magpies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, etc. among which rodents that have relatively short ontogeny and biological cycle are easy to reproduce from the viewpoint of disease model animal production. More preferred among others (e.g. C57BL / 6 strain, DBA2 strain as pure strain, B6C3F strain, BDF strain, B6D2F strain, BALB / c strain, I
  • CR strain etc. CR strain etc.
  • rats eg Wistar, SD etc.
  • a GPR40 gene (genomic DNA) derived from the target non-human mammal is isolated according to a conventional method, for example, (1) other DNA in its exon part or promoter region.
  • the homologous recombinant can be used instead of the DNA encoding exogenous GPR40 in the introduction of DNA encoding exogenous GPR40 into ES cells, which is one of the methods for producing a Tg animal of the present invention.
  • Targeting vector strength When the drug resistance or reporter gene is inserted into the exon or promoter part of the GPR40 gene, Gene-transferred ES cells can be selected using reporter activity as an index.
  • the drug resistance or reporter gene is preferably in the form of an expression cassette containing any promoter that can function in mammalian cells, but the reporter gene is under the control of the endogenous promoter of the GPR40 gene. When inserted into the GPR40 gene as is, the reporter gene vector does not require a promoter.
  • gene recombination in mammals is largely non-homologous, and the introduced DNA is randomly inserted at any position on the chromosome. Therefore, depending on the selection such as drug resistance and detection of reporter gene expression, it is not possible to efficiently select only the clones targeted to the endogenous GPR40 gene targeted by homologous recombination. For all clones, it is necessary to confirm the integration site by Southern hybridization or PCR. Therefore, if, for example, a simple herpesvirus-derived thymidine kinase (HSV-tk) gene conferring ganciclovir sensitivity is ligated outside the region homologous to the target sequence of the targeting vector, the vector becomes random.
  • HSV-tk simple herpesvirus-derived thymidine kinase
  • the inserted cell Since the inserted cell has the HSV-tk gene, it cannot grow in a medium containing ganciclovir, but the cell targeted to the endogenous GPR40 locus by homologous recombination does not have the HSV-tk gene and becomes resistant to ganciclovir. Is done.
  • a diphtheria toxin gene is linked instead of the HSV-tk gene, cells into which the vector is randomly inserted will be killed by the toxin produced by the vector, and thus homologous in the absence of a drug. Recombinants can also be selected. Each of the emerged resistant colonies is transferred to a culture plate, and after trypsinization and medium exchange are repeated, a part is left for culture, and the rest is subjected to PCR or Southern hybridization to confirm the presence of the introduced DNA. .
  • Preparation of a chimeric embryo, establishment of a founder, preparation of a homozygote, etc. can be performed using the same method as described above in the method for producing a Tg animal of the present invention using ES cells.
  • DNA encoding GPR40 antisense RNA or siRNA is introduced using any of the above-described techniques for constructing a transgene. And a method for expression in the target non-human mammalian cells. Can be mentioned.
  • DNA containing a base sequence complementary to the target region of the target polynucleotide that is, DNA that can hybridize with the target polynucleotide is "antisense" to the target polynucleotide. !/,I can.
  • An antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding GPR40 or a part thereof is complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding GPR40.
  • Any antisense DNA may be used as long as it contains a complementary base sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the polynucleotide.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the polynucleotide encoding GPR40 is, for example, about 70% or more, preferably about 80, with respect to the region overlapping with the nucleotide sequence of the complementary strand of the polynucleotide. % Or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of the nucleotide sequence.
  • the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of GPR40 protein for example, An antisense DNA having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a complementary strand of a base sequence in the vicinity of the start codon
  • antisense DNA directed to RNA degradation by RNaseH it is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90%, with the complementary strand of the entire nucleotide sequence of the polynucleotide encoding GPR40 including intron.
  • Antisense DNA having a homology of at least%, most preferably at least about 95% is preferred.
  • the target non-human mammal when the target non-human mammal is a mouse, it is complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence registered as GenBank accession No. NM_194 057 (VERSION: NM_194057.1 GI: 34610212)
  • An antisense DNA containing a simple nucleotide sequence or a part thereof Preferred examples include antisense DNA containing a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof.
  • an antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding GPR40 or a part thereof is a clone. It is possible to design and synthesize based on the base sequence information of DNA encoding GPR40 that has been converted or determined. Such antisense DNA can inhibit GPR40 gene replication or expression. That is, the antisense DNA of the present invention can hybridize with RNA (mRNA or initial transcription product) transcribed from the GPR40 gene, and inhibits mRNA synthesis (processing) or function (translation into protein). it can.
  • RNA mRNA or initial transcription product
  • the target region of the antisense DNA of the present invention encodes the protein that is not particularly limited in length as long as the antisense DNA is hybridized and as a result, translation into the GPR40 protein is inhibited.
  • the entire mRNA sequence or partial sequence may be as short as about 10 bases and as long as the entire sequence of mRNA or initial transcript.
  • the 3′-end palindromic region or the 3′-end hairpin loop can be selected as an anti-sense DNA preference / target region. Any region within the GPR40 gene can be selected as a target. For example, the intron part of the gene is used as the target region.
  • the antisense DNA of the present invention binds to the GPR40 gene, which is a double-stranded DNA that only hybridizes with GPR40 mRNA or initial transcripts and inhibits translation into proteins. ) And can inhibit RNA transcription. Alternatively, it may be one that induces degradation by RNaseH by forming a DNA: RNA nobled.
  • a DNA encoding a ribozyme capable of specifically cleaving mRNA or an initial transcript encoding GPR40 within the coding region is also an anti-antibody of the present invention. It can be included in the sense DNA.
  • Most versatile as a ribozyme As V there are self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroid and virusoid, and hammerhead type and hairpin type are known.
  • the hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and several bases at both ends (about 10 bases in total) adjacent to the part having the hammerhead structure are arranged complementary to the desired cleavage site of mRNA.
  • ribozyme By arranging in a row, it is possible to specifically cleave only the target mRNA. This type of ribozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • the target sequence should be made single-stranded by using a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to RNA helicase. [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5577 (2001)].
  • the ribozyme can be further linked to a modified tRNA sequence [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780- 2788 (2001)].
  • RNAi RNA interference
  • siRNA can be designed as appropriate using commercially available software (eg, RNAi Designer; Invitrogen) based on the base sequence information of the target mRNA.
  • the antisense oligo DNA and ribozyme of the present invention determine the target sequence of mRNA or initial transcript based on the GPR40 cDNA sequence or genomic DNA sequence, and sell the DNA / RNA automatic synthesizer (Applied Biosystems, Beckman, etc.) can be prepared by synthesizing a complementary sequence thereto.
  • the synthesized antisense oligo DNA or ribozyme is inserted downstream of the expression vector promoter via an appropriate linker (adapter) sequence, if necessary, to express DNA encoding the antisense oligo RNA or ribozyme.
  • Vectors can be prepared.
  • the expression vectors that can be used in the above are preferably exemplified by those described above for the Tg animal of the present invention.
  • a DNA expression vector encoding a longer antisense RNA expresses GPR40 cDNA cloned by conventional methods via an appropriate linker (adapter) sequence as necessary. It can be prepared by inserting in the reverse direction downstream of the vector promoter.
  • DNA encoding siRNA can be prepared by separately synthesizing as DNA encoding sense strand or antisense strand, and inserting each into a suitable expression vector.
  • siRNA expression vector one having a Pol III promoter such as U6 or HI can be used.
  • siRNA is formed by transcription and annealing of the sense strand and the antisense strand in the animal cell introduced with the vector.
  • An shRNA can be prepared by inserting a unit in which a sense strand and an antisense strand are inserted in a length that can form an appropriate loop structure (for example, 15 forces of about 25 bases) into an appropriate expression vector. .
  • shRNA expression vector one having a Pol III promoter such as U6 or HI can be used.
  • the shRNA transcribed in the animal cell into which the expression vector has been introduced forms a loop by itself, and then is processed by an endogenous enzyme dicer or the like to form a mature siRNA.
  • knockdown can be achieved by RNAi by expressing a microRNA (miRNA) containing a target siRNA sequence with a Pol II promoter.
  • miRNA microRNA
  • tissue-specific knockdown is also possible with a promoter exhibiting tissue-specific expression.
  • any of the methods described above in the Tg animal of the present invention is appropriately used depending on the target cell.
  • a microinjection method is used for introduction into an early embryo such as a fertilized egg.
  • ES cells calcium phosphate coprecipitation method, electopore position method, lipofusion method, retrovirus infection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method and the like can be used.
  • gene transfer can be easily achieved by adding the virus to ES cells in early embryos and culturing for 1-2 days and infecting the cells with the virus. You may get.
  • KO mouse of the present invention produced based on ES cells derived from 129 / sv / Ev mouse
  • Congenic mice obtained by mating back to C57BL / 6J mice showed a remarkable phenotype compared to wild-type mice.
  • the KO animal of the present invention is produced by destroying the gene by inserting a reporter gene into the GPR40 gene, and the reporter gene is in a position under the control of the endogenous promoter of the GPR40 gene.
  • a test substance is applied to the animal or a part of its living body, and the expression of the reporter gene is detected, so that a regulator of the promoter activity for the GPR40 gene can be screened.
  • the reporter gene include, but are not limited to, DNA encoding luciferase, peroxidase, green fluorescent protein (GFP), alkaline phosphatase, 13-galatatosidase, and the like.
  • the reporter activity can be measured by a method known per se depending on the reporter gene used.
  • test substances in addition to known synthetic compounds, peptides, proteins, DNA libraries, etc., for example, mammalian extracts (eg, mouse, rat, pig, ushi, hidge, monkey, human etc.), cell extracts A culture supernatant or the like is used.
  • mammalian extracts eg, mouse, rat, pig, ushi, hidge, monkey, human etc.
  • cell extracts A culture supernatant or the like is used.
  • the test substance may be selected as a substance that regulates the promoter activity of the GPR40 gene. it can.
  • the GPR40 promoter activity enhancer selected by the screening method can bring about the same effect as the above GPR40 agonist, diabetes (type I and type II), glucose intolerance, hyperlipidemia, metabolism It is useful as a preventive / therapeutic agent for diseases such as sex syndrome, a spleen function regulator (eg, spleen function improving agent), an insulin secretagogue, a hypoglycemic agent, and a spleen ⁇ -cell protective agent.
  • a spleen function regulator eg, spleen function improving agent
  • an insulin secretagogue e.g, a hypoglycemic agent
  • hypoglycemic agent e.g., hypoglycemic agent
  • a spleen ⁇ -cell protective agent e.g, spleen ⁇ -cell protective agent.
  • ketosis, acidosis, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetes can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as retinopathy, arteriosclerosis, sexual dysfunction, skin diseases, arthropathy, osteopenia, thrombotic diseases, poor extinction, and memory learning disorders.
  • the activity-enhancing drug is formulated in the same manner as the GPR40 agonist, and is orally or parenterally administered to a mammal (eg, human, rat, mouse, guinea pig, usagi, hidge, pig, ushi, horse, Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the GPR40 promoter activity enhancer varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the dose of the GPR40 promoter activity enhancer varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the dosage of the modulator varies depending on the subject of administration, target disease, etc.For example, when administered to an adult (body weight 60 kg) as an injection for the treatment of diabetes, about 0.01 to About 30 mg, preferably about 0.1 to about 20 mg, more preferably about 0.1 to about 10 mg. Even if the subject of administration is an animal other than a human, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the GPR40 promoter activity inhibitor selected by the screening method can bring about the same effect as the above GPR40 antagonist, it can be used for diseases such as obesity, hyperlipidemia, type II diabetes, and insulin resistance syndrome. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent, a spleen function regulator (eg, a spleen function improver), an insulin secretion inhibitor, and a blood sugar increasing agent. Others, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, unstable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, thrombotic disease, lipotoxicity It can also be used as a preventive / therapeutic agent for diseases such as cancer.
  • a spleen function regulator eg, a spleen function improver
  • Others hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, unstable diabetes, fat atrophy, insulin
  • the activity inhibitor is formulated in the same manner as the GPR40 agonist, and is orally or parenterally used for mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, rabbits, horses, etc.). , Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the GPR40 promoter activity inhibitor varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the dosage of the modulator varies depending on the subject of administration, target disease, etc.
  • it is about 0.01 to about 30 mg, preferably about 0.1 to about 20 mg, more preferably about 0.1 to about 10 mg per day.
  • the subject of administration is a non-human animal, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the Tg animal of the present invention is not particularly limited in terms of endogenous GPR40 expression as long as the expression level of the exogenous GPR40 is ensured to such an extent that the effect of the test substance on the exogenous GPR40 can be quantitatively measured.
  • exogenous GPR40 is heterologous to endogenous GPR40
  • the Tg animal of the present invention is used to evaluate a drug that can act not only on the heterologous GPR40 but also on endogenous GPR40. It is desirable to inactivate the expression of endogenous GPR40.
  • the Tg animal of the present invention in which the expression of endogenous GPR40 is inactive is selected from the GPR40 gene selected by a known method (for example, see Non-patent Document 3 above) or the method described above in the present specification. Obtained by introducing a DNA encoding a heterologous GPR40 into an ES cell knocked out from the ES cell, or an early embryo or ES cell derived from the ES cell derived from the GPR40 KO animal according to the method described above. be able to.
  • the Tg animal of the present invention in which the expression of endogenous GPR40 is inactivated is an early embryo derived from a KD animal in which the expression of GPR40 gene is inactivated by antisense or RNAi technology as described above.
  • ES cells can be obtained by introducing a DNA encoding a heterologous GPR40 according to the method described above.
  • Tg animals in which endogenous GPR40 expression is inactive and only heterologous GPR40 is expressed include animals that have been knocked out (or knocked down) endogenous GPR40 and the above-mentioned exogenous (heterologous) GPR40. It can also be obtained by crossing the KO (or KD) animal introduced with the same species with the same species.
  • an offspring obtained by crossing an endogenous GPR40 homo-deficient (-/-) mouse with a human GPR40Tg (+/-) mouse are further mated to select human GPR40 Tg (+/-) and mouse GP R40-deficient mice, so that endogenous GPR40 (-/ _) ' Human GPR40 Tg (+/-) mice can be generated.
  • a Tg animal in which endogenous GPR40 expression is inactivated is a knock-in (KI) animal in which the endogenous GPR40 gene is replaced with a DNA encoding a heterologous GPR40 by gene targeting using homologous recombination.
  • KI animals can be produced according to basically the same procedure as KO animals. For example, a targeting vector containing DNA obtained by excising the region containing the ORF of the GPR40 gene derived from the target non-human mammal using an appropriate restriction enzyme and inserting the corresponding region of the heterologous GPR40 gene instead.
  • a marker gene for positive selection such as a neomycin resistance gene into the GPR40 gene 3, untranslated region of the targeting vector, and further target If a marker gene for negative selection such as HSV-tk gene or diphtheria toxin gene is inserted outside the region homologous to the sequence, homologous recombinants can be selected using drug resistance as an index.
  • a targeting vector with ⁇ or frt sequences at both ends of the positive selection marker gene since it may interfere with the expression of heterologous GPR40 into which a positive selection marker gene has been introduced, use a targeting vector with ⁇ or frt sequences at both ends of the positive selection marker gene. It is preferable to excise the marker gene for positive selection by allowing Cre or Flp recombinase or the recombinase expression vector (eg, adenovirus vector) to act at an appropriate time. Alternatively, instead of using the Cre-loxP system or Flp-frt system, sequences that are homologous to the target sequence are repeatedly arranged in the same direction at both ends of the positive selection marker gene, and intragenic recombination between the sequences is used. Then, the marker gene for positive selection may be excised.
  • Cre or Flp recombinase or the recombinase expression vector eg, adenovirus vector
  • the Tg animal of the present invention and the KO / KD animal of the present invention are DNAs encoding exogenous GPR40.
  • Tg animals in which the expression of endogenous GPR40 gene is inactive (KO / KD animals)
  • diseases involving GPR40 activity regulation It may have one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathological condition.
  • ⁇ Diseases involving regulation of GPR40 activity '' are not only diseases caused by abnormal GPR40 activity or resulting in abnormal GPR40 activity but also preventive and Z or therapeutic effects by regulating GPR40 activity It should be understood as a concept that includes diseases that can be obtained.
  • diabetes types I and II
  • impaired glucose tolerance hyperlipidemia, metabolic syndrome, others, ketosis, acidosis, diabetic Neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, arteriosclerosis, sexual dysfunction, skin disease, arthropathy, osteopenia, thrombotic disease, dyspepsia, memory learning disorder, etc.
  • Diseases that can be prevented and treated include obesity, hyperlipidemia, type II diabetes, insulin resistance syndrome, others, hypoglycemia, hypertension, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, edema, non Examples include stable diabetes, fat atrophy, insulin allergy, insulinoma, arteriosclerosis, thrombotic disease, lipotoxicity, and cancer.
  • “Other genetic modifications” include spontaneous disease model animals having abnormalities in endogenous genes due to spontaneous mutations, Tg animals further introduced with other genes, and endogenous genes other than GPR40 gene.
  • Inactivated KO / KD animals In addition to gene disruption due to insertion mutation, etc., Tg animals whose gene expression has been reduced to an undetectable or negligible level by introduction of antisense DNA or DNA encoding a neutralizing antibody. And dominant negative mutant Tg animals into which the mutant endogenous gene has been introduced.
  • Disease models having one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathologies as those involving the regulation of GPR40 activity include, for example, NO D mice (Makino S. et al., Experimental 'Animal (Exp. Anim.), 29th, 1st page, 1 980), BB rat (Crisa L. et al., Diabetes Metabolism' review (Diabetes Meta b. Rev.), 8th, 4th, 1992), ob / ob mouse, db / db mouse (Hummel L. et al., Science, 153rd, 1127, 1966), KK mouse, KKA y Mouse, GK rat (Go to Y.
  • WHHL Usagi with a change in low density lipoprotein receptor (LDLR) as a model for hyperlipidemia or arteriosclerosis; Watanabe Y., Atherosclerosis, pp. 36, 261 , 1980), SHLM (a spontaneous mouse with apoE deletion mutation; Matsushima Y. et al., Mammian Ge nome), 10th pp. 352, 1999), LDLR KO mice (Ishibashi S. et al., Journal 'Ov' Tari-Cal 'In Vestigation (J. Clin.
  • mice interleukin 1 Tg mice (Groves RW et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92nd page, 11874, 1995) etc. have been used as dermatitis models as mutant amyloid precursor protein.
  • Transgenic mice, etc. are models of anemia hypoxia such as beta SAD (beta S-Antilles-D Punjab) Tg mice (Trudel M. et al., EMBO J, Vol. 10, page 3157, 1991), etc.
  • Steroidogenic factor 1 KO mice Zhao L. et al., Development, No. 128) Pp. 147, 2001
  • p53 KO mice Kemp CJ Molecular Carcinogenesis, p. 132, p.
  • liver cancer models and c-neu Tg mice (Rao GN et al., Breast) Cancer Res Treat, pp. 48, 265, 1998), etc.
  • pericinitis endocarditis model perforin 'Fas-ligand double KO mice (Seeman J. et al., J Immunol., Pp. 161, 7003, 1998) is known.
  • the method of introducing one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathological condition to the disease involving the regulation of GPR40 activity in the Tg animal of the present invention or the KO / KD animal of the present invention is not particularly limited.
  • Tg animal of the present invention or KO / KD animal of the present invention, and the same type of non-human having one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathological condition as a disease involving regulation of GPR40 activity (2) Early embryos of non-human mammals having one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathological conditions as those involved in the regulation of GPR40 activity.
  • a method for obtaining a Tg animal by introducing exogenous GPR40-encoding DNA by the method described above Non-human mammals with one or more other genetic modifications that cause the same or similar pathological conditions as those involving GPR40 activity regulation
  • the early embryo of the animal (3) A method for obtaining an KO / KD animal by inactivating the expression of the endogenous GPR40 gene by the above-described method); (3) An early embryo of a non-human mammal introduced with a DNA encoding exogenous GPR40.
  • a method of introducing one or more other gene modifications into ES cells that cause the same or similar pathological conditions as those involving regulation of GPR40 activity by the above-mentioned method (non-inactivated GPR40 gene)
  • a method of introducing one or more other gene modifications that cause the same or similar pathology to a disease involving the regulation of GPR40 activity is introduced into ES cells by the method described above. It is done.
  • the targeting vector those exemplified for the production of the above KI animal can be preferably used except that the endogenous GPR40 gene is replaced with the endogenous gene to be disrupted.
  • the Tg animal of the present invention or the KO / KD animal of the present invention and a disease model of the same species having one or more other gene modifications that cause the same or similar pathological condition as a disease involving regulation of GPR40 activity When crossing with human mammals, it is desirable to cross homozygotes. For example, F obtained by crossing a homozygous mouse in which DNA encoding exogenous GPR40 is integrated at one locus with a db / db mouse (diabetes and obesity model) is inherited by both genes.
  • Non-genetic treatment means treatment that does not cause genetic modification in the target non-human mammal.
  • Such treatment includes, for example, drug-induced treatment such as STZ, dietary stress load such as high fat diet load, sugar load, fasting, external stress such as UV, active oxygen, heat, vascular ligation Z reperfusion, etc. Examples include, but are not limited to, a load.
  • a disease state model animal obtained by subjecting the Tg animal of the present invention or the KO / KD animal of the present invention to other genetic modification or non-genetic treatment has a pathological condition expressed by the animal.
  • Prevention of diseases with the same or similar pathological conditions' Can be used for screening for substances that show therapeutic effects. That is, by applying a test substance to the disease model animal or a part of its living body and examining the improvement of the disease state, it is possible to select a 'prophylaxis of treatment with a disease state identical or similar to the disease state' therapeutic substance. it can.
  • the specific pathology is preferably a symptom observed in metabolic syndrome, such as diabetes, insulin resistance, glucose intolerance, obesity, hypertension, arteriosclerosis, hyperTGemia, high LDL- Examples include C blood and low HDL-C blood.
  • test substance is administered to the disease state model animal.
  • test substances in addition to known synthetic compounds, peptides, proteins, DNA libraries, and the like, for example, tissue extracts, cells of mammals (eg, mice, rats, pigs, ushi, hidge, monkeys, humans, etc.) A culture supernatant or the like is used.
  • the test substance can be selected as a substance having a preventive or therapeutic activity for a disease associated with the pathological condition.
  • the disease preventive / therapeutic drug selected by the screening method is formulated by the same method as the above GPR40 agonist and is orally or parenterally administered to a mammal (eg, human, rat, mouse, guinea pig). , Usagi, Hidge, Pig, Ussi, Horse, Cat, Inu, Monkey, etc.).
  • the dose of the prophylactic / therapeutic agent varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • oral administration for the purpose of treating diabetes generally in adults (body weight 60 kg) From about O.lmg to about 100 mg, preferably from about 1.0 to about 50 mg, more preferably from about 1.0 to about 20 mg per day.
  • the dose of the prophylactic / therapeutic drug varies depending on the subject of administration and target disease.For example, when administered to an adult (body weight 60 kg) as an injection for the treatment of diabetes, about 0.01 per day To about 30 mg, preferably about 0.1 to about 20 mg, more preferably about 0.1 to about 10 mg. Even if the subject of administration is an animal other than a human, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • SEQ ID Nos in the sequence listing of the present invention indicate the following sequences.
  • Self-sequence number 1] Shows the base sequence of DNA (CDS) encoding human GPR40.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • cDNA complementary deoxyribonucleic acid A: Adenine
  • RNA Ribonucleic acid
  • RNA Messenger ribonucleic acid
  • dATP Deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP Deoxythymidine triphosphate
  • dGTP Deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP Deoxycytidine triphosphate
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • a plasmid pISLM / GPR40 in which a human GPR40 gene containing a 3 ′ untranslated region was introduced downstream of the mouse insulin II promoter was prepared as follows.
  • the plasmid in which the mouse insulin II promoter was subcloned was double-digested with Hindlll and Sail, and the resulting 673 bp mouse insulin II promoter fragment was introduced into the Hindlll and Sail sites of pCAN618 (described in WO 00/14226).
  • a 2256 bp DNA fragment obtained by double digestion of Sail and Spel from a plasmid obtained by subcloning the human GPR40 gene coding region and 3 'untranslated region at the site of double digestion of this plasmid with Sail and Spel. This was inserted to prepare a human GPR40 gene expression plasmid pi SLII4 / GPR40 under the control of the mouse insulin II promoter.
  • E. coli DH5a This was introduced into E. coli DH5a to obtain a transformant Escherichia coli DH5a / pISLII4 / GPR40.
  • the strain was deposited at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as Deposit No. FERM BP-10462 on December 1, 2005.
  • the above PISLII4 / GPR40 was triple digested with Mlul, Kpnl, and Spel, and then subjected to low melting point agarose gel (Takara Shuzo) electrophoresis to excise a 2928 bp DNA fragment.
  • the DNA fragment containing the human GPR40 gene expression unit was obtained by purifying the DNA fragment with Nucleotrap (manufactured by Nippon Genetics) (FIG. 1A).
  • Transgenic mice were prepared by microinjection according to the method of Hogan et al. (Manipulating the mouse emoryo, Cold bpnng Haroor Laboratory Press. 1994).
  • the DNA fragment containing the human GPR40 gene expression unit prepared in Example 1 was adjusted to a concentration of 1 to 3.3 ⁇ g / ml with 1/10 TE solution (ImM Tris-HCl, O. lmM EDTA, pH 8.0). did .
  • PCR was performed on the obtained DNA using a primer set having sequences of 5′-GGAGTGTGGTGCTTAATCCGCTGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and 5′-AGACTGCCTCCTCCTTCCCGTAAGTACAA-3 ′ (SEQ ID NO: 8).
  • cDNA corresponding to 25 ng of RNA was used as a template for TaqMan analysis.
  • a primer for detection of the human GPR40 gene, Forward primer (5 and GCCCGCTTCAGCCTCTCT—3 ′; SEQ ID NO: 9), Reverse primer (5′-GAG GCAGCCCACGTAGCA-3 ′; SEQ ID NO: 10), and FAM-labeled TaqMan Taq Man analysis (TaqMan 7700 and 7700 SDS software, manufactured by Applied Biosystems) was performed using a set of primer probes (5, -TCTGCCCTTGGCCATCACAGCCT-3 '; SEQ ID NO: 11).
  • Calibration curve used in the copy number calculation made from C values measured Te by Unishi as a logarithmic six points Ueru per 10 1 copies from 10 6 copies per Ueru known concentration of human GPR40 cDNA fragment containing the amplified region full length did.
  • FIG. 1B shows the expression of the human GPR40 gene in the spleen at 8 weeks of age of each line of human GPR40 gene transgenic mice. Expression of the human GPR40 gene was observed in almost all strains examined. Compared to multiple lines including 14M, 41M, and 23F, 47M and 81M showed higher expression levels.
  • Genomic DNA was analyzed by the Southern blot hybridization method for the above-mentioned 14M, 41M, 47M, 81M and 23F transgenic mice. That is, 5 ⁇ g of DNA was cleaved with EcoRI and Bglll, electrophoresed with 1.0% agarose gel, and then transferred to a nylon filter. This filter is a DIG RNA Labeling Kit (Roche Diag And hybridize with a probe of a human GPR40 gene-containing DNA fragment labeled with Nostics, wash twice with 2xSSC, 0.1% SDS at room temperature, and then with 0.1xSSC, 0.1% SDS Washed twice at 68 ° C.
  • DIG RNA Labeling Kit Roche Diag And hybridize with a probe of a human GPR40 gene-containing DNA fragment labeled with Nostics, wash twice with 2xSSC, 0.1% SDS at room temperature, and then with 0.1xSSC, 0.1% SDS Washed twice at 68 ° C.
  • a DIG fluorescence detection kit manufactured by Roche Diagnostics
  • a band of approximately 2.9 kbp was confirmed for these five strains, and the introduction of the human GPR40 gene was confirmed.
  • the transgene integrated into the chromosome with high copy was 14M, 47M and 81M, and the low copy with integrated into the chromosome was 23F and 41M.
  • the results of human GPR40 gene expression level and the results of the number of copies incorporated into the chromosome are generally correlated, and the 47M system was selected as the high expression system and the 23F system was selected as the standard expression system. Went.
  • the mice were bred and maintained by crossing with C57BL / 6J strain mice.
  • Transgenic Mouse 47M and 23F strains are available for 8 weeks on low-fat diet (D1 2450B, 10 kcal% fat, research diet) or high-fat diet (D12492, 60 kcal% fat, research) Breeding on a diet).
  • D1 2450B 10 kcal% fat, research diet
  • high-fat diet D12492, 60 kcal% fat, research
  • the duodenum side was ligated, force-ureation on the common bile duct was performed, and an lmg / ml collagenase solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was injected into the mouse spleen.
  • the filled spleen was cut out, placed in a tube in the same collagenase solution, and shaken at 37 ° C. for 20 minutes.
  • the mixture was vigorously mixed for 30 seconds, and made up to 20 ml with a Quenching buffer solution (0.001% DNaseI, Hanks Balanced Salt Solution containing 25 mM HEPES) containing 10% FBS.
  • a Quenching buffer solution 0.001% DNaseI, Hanks Balanced Salt Solution containing 25 mM HEPES
  • the solution was transferred to a petri dish, washed twice with a Quenching buffer solution, and then Lashima was collected with a pipette under a microscope and used as a sample for use as a specimen. About 100 islands were isolated from each individual.
  • the isolated La Island was homogenized in ISOGEN with an 18 gauge needle to extract total RNA. Next, it was further purified using RNeasy Micro kit (Qiagen), and finally the contaminating DNA was removed by DNase treatment. For 1 ⁇ g or less of total RNA, cDNA synthesis was performed according to the protocol using First strand cDNA synthesis kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and used as a template for TaqMan analysis. For detection of the human GPR40 gene, TaqMan analysis was performed using the primer set described in Example 3.
  • Mouse GPR40 Assay on demand (Applied Systems) was used for gene detection, and Taqman Ribosomal RNA Control Reagents VIC Probe set (Applied Systems) was used to detect the internal standard 18S ribosomal RNA gene. .
  • the standard curve used to calculate the copy number is a DNA fragment encoding human GPR40 cDNA, mouse GPR40 cDNA, or mouse 18S ribosomal RNA gene with a known concentration including the entire length of the amplified region, from 10 6 copies per well to 10 3 per well. It was created from the C value measured so that the logarithm of the copy was 4 points.
  • the isolated human GPR40 gene is expressed only in transgenic mice in both the 47M and 23F strains on isolated islands, and the expression level is high in the spleen at 47M. (See Figure 1B). In both the 47M and 23F systems, there was no significant difference between the human GPR40 gene expression level in the low fat diet load group and that in the high fat diet load group. On the other hand, the expression level of endogenous GPR40 gene in mice is not significantly different between control mice and transgenic mice in both 47M and 23F strains. It was almost the same level in the group ( Figure 2B). In addition, the amount of human GPR40 gene expressed on Lah Island is 70-fold increase in the 47M strain and 30-fold increase in the 23F strain compared to that of the mouse endogenous GPR40 gene. It was expected to have a sufficient effect.
  • Example 5 General properties and glucose tolerance test of human GPR40 gene transgenic mice
  • Transgenic mice 47M and 23F strains were bred on a normal diet (CE-2, 12 kcal% fat, manufactured by CLEA Japan).
  • a normal diet CE-2, 12 kcal% fat, manufactured by CLEA Japan.
  • blood was collected from the fundus of the liver treated with Kyabinari (manufactured by Drummond Scientific Company, Inc.), and plasma was obtained by centrifugation.
  • the glucose level was measured with Fuji Dry Chem (Fuji Film Medical), and the insulin level was measured with the Morinaga Insulin ELISA kit (Morinaga Bioscience Laboratories).
  • the glucose tolerance test was conducted as follows. That is, blood was collected from a mouse-treated pill with a mouse fundus force 16 hours after the start of fasting to obtain a sample at the 0th minute. Next, a 10% glucose solution was orally administered to give lg per kg of body weight. After 7.5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes, the ocular fundus force-treated liver Picked at Blood samples were taken at each time. These samples were centrifuged to isolate plasma components, and glucose and insulin levels were measured as described above.
  • the body weight values at the time of 16-week-old at the time of satiety and fasting did not differ significantly from the control mice in both the 47M and 23F strains (Table 1). Plasma glucose levels at the time of fasting were much lower in transgenic mice (Table 1). A glucose tolerance test was conducted on 47M mice at 16 weeks of age and 23F mice at the age of 18 weeks, and both the 47M and 23F strains had lower plasma glucose levels in transgenic mice than in control mice. In contrast, plasma insulin levels in Transgenic mice were high (Fig. 3). These results are considered to indicate that glucose tolerance improved in transgenic mice with increased insulin secretion. Since similar results were obtained with two strains of transgenic mice, the 47M strain was mainly used for further analysis.
  • Transgenic Mouse 47M strain is also low-fat diet at 8 weeks of age for 9 weeks (D12450B 10 kcal% fat, manufactured by Research Diet), 45 k cal% fat containing fat (D12451, manufactured by Research Diet) and 60 kcal% fat After feeding on a high fat diet (D12492, manufactured by Research Diet), a glucose tolerance test was performed on mice at 17 weeks of age.
  • Example 7 Insulin secretion during glucose stimulation in isolated islets of human GPR40 gene derived from transgenic mice
  • the GPR40 gene targeting vector has been described in Example 21 of Patent Document 3.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ / pGT-GPR40 transformed with the vector has been deposited as Deposit Number FERM BP-8259 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on December 11, 2002. ing.
  • the GPR40 gene targeting vector g linearized with the restriction enzyme Notl was introduced into ES cells (AB2.2 prime, manufactured by Lexicon) by electroporation. Homologous recombinant candidate strains were selected by PCR for the selected 384 clones of G4 18 resistant strain.
  • Primer # 1 and # 2 are sequences in Neo r in the targeting vector, # 2 5 -GCAGGTCCGAAATGGT CAGGTTTAGCA-3' (SEQ ID NO: 13 ) Is the targeting vector 3, sequence on the outer side of the side arm), and LA Taq polymerase (Takara Shuzo) 94 ° C 1 min ⁇ (98 ° C 10 sec ⁇ 70 ° C 5 min 30 sec) X 35 times ⁇ PCR was performed at 72 ° C for 10 min.
  • Southern hybridization was performed. That is, ES cell DNA was digested with EcoRI using the 1.2 kbp SacI-EcoRI fragment existing outside the 3 side arm of the targeting vector as a probe, and then Southern hybridization was performed. This gives a band of 9.7Kbp from wild allele and 4.6kbp from tar geted allele. In addition, using a 0.9 kbp SacI-BamHI fragment located outside the 5th arm of the targeting vector as a probe,
  • Southern hybridization was performed on 9 clones including 7 clones that were positive in the previous PCR. 3.
  • the side arm was operated as follows. Each clone DNA and mouse genomic DNA 2 ⁇ were digested with EcoRI, electrophoresed on 0.4% TAE agarose gel, and blotted on a nylon filter. 3 'outside the EcoR preparative Sad 1.2 kbp DNA fragment of the arm [ ⁇ - 32 P] dCTP ( NEG513Z, manufactured by DuPont) random prime method using (Multiprime DNA labeling system RPN.1601Y, Amasha Muhu Alma shear Biotech To obtain a probe. Hybridization was performed at 65 ° C.
  • Homologous recombination ES cell line No.231 was injected into C57BL / 6J strain mouse-derived blastocysts. The injected blastocysts were transplanted into pseudopregnant mouse oviducts to obtain 31 chimeric mice. Mating was performed on mice exhibiting a high chimera ratio of males with an ES cell contribution rate of 50% or more, and 106 ES cell-derived mice were obtained, confirming germline migration. When these mouse tail genomic DNAs were purified and genotyped by PCR using primers # 1 and # 2 described in Example 8, 48 individuals were found to be hetero-deficient mice. Next, the heterozygous mice were mated with each other, and the resulting litter was genotyped as follows.
  • primer # 3 (5'-GCCCGCCCTGCCCGTCTCA-3 '(SEQ ID NO: 14) is the sequence in the deleted part of the mouse GPR40 gene) and primer ⁇ (S'- AACGTTCGATGCTCACCGCCGTCA-3' (SEQ ID NO: 15) is Targeting vector PCR was performed under the conditions of 94 ° C 1 min ⁇ (98 ° C 10 sec ⁇ 70 ° C 5 min30 sec) X 30 times ⁇ 72 ° C 10 min. No band was detected in the specimens of homo-deficient mice, and a band of approximately 5.4 kbp was detected in the specimens of wild mice and hetero-deficient mice. Wild mice, hetero-deficient mice, and homo-deficient mice were obtained as described above. Thereafter, maintenance and breeding were carried out by mating homozygous mice, and control mice were maintained and breeding by mating between wild mice and used for the experiment.
  • RNA was extracted from the spleens at 8 weeks of age using ISOGEN according to the attached protocol.
  • First strand cDNA was synthesized from 1 ⁇ g of the obtained total RNA using random primers and Superscript II reverse transcriptase according to the attached protocol, precipitated with ethanol, and dissolved in 40 1 TE.
  • TaqMan analysis was performed using cDNA corresponding to 25 ng of RNA as a template.
  • Forwar d primer (5, -TTTGCGCTGGGCTTTCC-3 '; SEQ ID NO: 16), Reverse primer (5'-G CTGGGAGTGAGTCGCAGTT-3'; SEQ ID NO: 17), and FAM-labeled TaqMan prime r
  • the primer set of probe (5 CCATCCGAGGCGCAGTGTCCC-3 '; SEQ ID NO: 18) was used for detection of the actin gene.
  • Reverse primer (5' -CGTGAAAAGATGACC CAGATCA-3 '; SEQ ID NO: 19), Reverse primer (5 The primer set of '-CACAGCCTGGATGGCTACG T-3'; SEQ ID NO: 20) and FAM-labeled TaqMan primer probe ( ⁇ '-TGAGACCTTCA ACACCCCAGCCATG-3 '; SEQ ID NO: 21) was used.
  • the calibration curve used to calculate the copy number is a plasmid DNA containing mouse GPR40 gene with a known concentration including the entire length of the amplified region, or a synthetic DNA fragment of a part of the mouse actin gene (Sigma Dienosi).
  • the expression level of the mouse GPR40 gene was expressed as a ratio to the expression level of the actin gene.
  • heterozygous mice were obtained by crossing the heterozygous or homozygous mice with C57BL / 6J mice (first generation).
  • Hetero-deficient mice (fifth generation) obtained by repeating this mating five times were mated to obtain control mice and homo-deficient mice. Thereafter, maintenance breeding was carried out by crossing heterozygous mice, or control mice or homozygous mice.
  • mice For GPR40 gene homo-deficient mice, from 8 weeks of age, 8 weeks low fat diet (D12450B, 10 kcal% fat, Research Diet) or high fat diet (D12492, 60 kcal% fat, Lisaichi Diet) Reared in Body weight measurements were performed weekly from the start of the fat diet load, and blood parameters were measured in some cases. That is, blood was collected from the fundus using a heparin-treated liver, the plasma component was obtained by centrifugation, and the plasma glucose level and the plasma insulin level were measured by the method described in Example 5. The caloric intake per day was measured as follows.
  • the weight of the food on the feeding wire mesh is measured, and the weight of the food ingested by measuring the weight of the food on the wire mesh and the weight of the food scattered in the cage the next day.
  • the caloric intake per day was calculated by multiplying the calorie content.
  • GPR40 gene homo-deficient mice were bred on the low fat diet (D12450B, 10 kcal% fat, Research Diet) or the high fat diet (D12492, 60 kcal% fat, Research Diet) for 8 weeks to 11 weeks. .
  • a glucose tolerance test was performed on mice at 19 weeks of age in the same manner as in Example 5.
  • the human GPR40 gene transgenic mouse 47M system obtained in Example 3 and the GPR40 gene homozygous mouse obtained in Example 9 were crossed to retain the human GPR40 gene, and the mouse GPR40 gene Individuals with deficient heterozygotes were obtained.
  • the male GPR40 gene homo-deficient mouse was crossed with the male transgenic mouse obtained above, and the male GPR40 gene homo-deficient mouse was crossed with the female GPR40 gene homo-deficient mouse.
  • a crossbred mouse (47M TgxKO) that retained the gene and was homozygous for the mouse GPR40 gene deficiency was obtained.
  • mice were obtained at the same time, which was homozygous for the GPR40 gene deficiency and did not have the human GPR40 gene.
  • 47M TgxKO and NonTgxKO were selected by determining the presence of the human GPR40 gene in mice obtained by crossing 47M TgxKO and NonTgxKO.
  • the human GPR40 gene transgenic mouse 23F strain is a hybrid mouse (23F TgxKO) that retains the human GPR40 gene and is homozygous for the mouse GPR40 gene deletion and its control mouse (NonTgxKO). ) was produced.
  • 47M TgxKO and 23F TgxKO mice are considered to be mice that have lost the mouse GPR40 gene expression and express only the human GPR40 gene.
  • Example 13 Human GPR40 Gene Transgenic Mouse with Genetic Background of KKA y mice.
  • human GPR40 gene transgenic mice with the genetic background of KKA y mice were prepared. That is, by crossing the human GPR40 gene transgenic mouse 47 M strain obtained in Example 3 with a KKA y mouse, a mouse that retains the human GPR40 gene and has an A y gene from the coat color (47M Tg / KKA y ). At this time, mice that retain the human GPR40 gene but do not have the Ay gene (47M Tg / KK) were also obtained. Similarly, 23F Tg / KKA y and 23F Tg / KK were also produced. In each case, NonTg / KKA y and NonTg / KK were used as control mice.
  • Tg and KO / KD animals of the present invention exhibit a phenotype more reflecting normal GPR40 function, and thus are useful as screening systems for GPR40 action modulators in vivo.

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Description

明 細 書
遺伝子改変動物およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、 GPR40遺伝子導入非ヒト哺乳動物および該遺伝子発現不全非ヒト哺乳 動物、並びにそれらを用いたインスリン分泌および Zまたは耐糖能調節薬、抗肥満 薬およびインスリン感受性調節薬等のスクリーニング方法などに関する。
発明の背景
[0002] GPR40はリガンド未知のォーファン Gタンパク質共役受容体として 1997年に報告さ れ (非特許文献 1、特許文献 1)、その後、同受容体が脾臓に発現し、そのリガンドが 遊離脂肪酸であることが報告された (特許文献 2)。さらに、遊離脂肪酸が同受容体を 介して脾臓 ι8細胞由来細胞株からのインスリン分泌を促進することが示されている（ 非特許文献 2、特許文献 3)。
これらの知見から、 GPR40に特異的に作用する化合物は、血中インスリン濃度をコ ントロールできる可能性が考えられ、 GPR40作動薬は糖尿病に対する新規の作用メ 力-ズムを有する予防.治療薬として期待されている。し力しながら、 GPR40の生体で の機能にっ 、ては、まだ十分に解明されて 、な 、点も多 、。
[0003] 脾 β細胞障害が糖尿病の基盤でもあり、インスリン分泌障害の改善は治療面からも 有効である。したがって、 GPR40遺伝子の生体での役割を明らかにすることは、基礎 研究のみならず、創薬研究の観点力 も重要である。
遺伝子の機能解析にぉ 、ては、トランスジエニックマウスやノックアウトマウス等の遺 伝子改変動物が大いに威力を発揮する。 GPR40の遺伝子導入マウスおよび遺伝子 欠損マウスも報告されている (非特許文献 3、特許文献 4)。それによると、 GPR40遺伝 子欠損マウスは高脂肪食負荷による耐糖能悪ィ匕に対して抵抗性であるのに対し、 GP R40遺伝子導入マウスはインスリン分泌不全を伴う糖尿病を発症する。
特許文献 1：国際出願公開第 2000/22129号パンフレット
特許文献 2：国際出願公開第 02/057783号パンフレット
特許文献 3：国際出願公開第 03/068959号パンフレット 特許文献 4:国際出願公開第 2005/015990号パンフレット
非特許文献 l : Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 239(2): 543-7
非特許文献 2 : Nature, 2003, 422(6928): 173-6
非特許文献 3 : Cell MetaboL, 2005, 1: 245-58
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、 GPR40遺伝子の生体内での機能を解明すベぐ GPR40遺伝子 導入および遺伝子発現不全動物を作製し、解析することであり、さらに得られた遺伝 子改変動物を用いて、糖尿病予防 ·治療薬のスクリーニングおよび薬効評価系を提 供することである。
課題を解決するための手段
[0005] Edlundと Walkerら（上記非特許文献 3、特許文献 4)の作製した GPR40遺伝子導入 マウスは IPF1プロモーターにより GPR40を過剰発現させていた。これに対し、本発明 者らは、インスリンプロモーターの制御下にヒト GPR40遺伝子を導入して、トランスジェ ニック (Tg)マウスを作製した。その結果、該 Tgマウスでは、対応する非トランスジェ- ックマウスに比べて、インスリン分泌能の増大とそれに伴う耐糖能の改善が認められ た。即ち、本発明によるトランスジエニックマウスの表現型は、 in vitroで明ら力となって V、た GPR40のインスリン分泌促進の成績を支持し、 GPR40の活性増強による糖尿病 予防 ·治療というコンセプトを支持するものである。
他方、本発明者らは、相同組換えを用いて GPR40遺伝子を破壊した GPR40遺伝子 ノックアウト (KO)動物を作出することにも成功した。該 KOマウスを C57BL/6J系統に 戻し交配した結果得られたコンジエニック系統においては、野生型マウスと比較して 顕著な表現型は認められな力つた。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成 するに至った。
[0006] すなわち、本発明は、
[ 1 ]外来性 GPR40をコードする DNAを発現可能な状態で保持するトランスジェ-ッ クマウスであって、対応する非トランスジエニックマウスと比較して (1)インスリン分泌能が増大している、および Zまたは
(2)耐糖能が改善されている
ことを特徴とするマウスまたはその生体の一部、
[2]外来性 GPR40をコードする DNAがインスリンプロモーターの制御下にある上記
[I]記載のマウスまたはその生体の一部、
[3]外来性 GPR40が配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を有する上記 [ 1]記載のマウスまたはその生体の一部、
[4]上記 [ 1 ]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、 GPR40ァ ゴニスト活性または GPR40アンタゴ-スト活性を検定することを特徴とする GPR40ァ ゴ-ストまたは GPR40アンタゴ-ストのスクリーニング方法、
[5]上記 [ 1 ]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、（ 1)インス リン分泌および Zまたは（2)耐糖能を測定することを特徴とする、（1)インスリン分泌 および Zまたは（2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法、
[6]インスリンプロモーターの制御下にある外来性 GPR40をコードする DNAを保持 するマウスの受精卵、
[7]外来性 GPR40がマウスにとって異種であり、かつ内在性 GPR40遺伝子発現不 全である上記 [ 1]記載のマウスまたはその生体の一部、
[8]異種 GPR40力ヒト由来である上記 [7]記載のマウスまたはその生体の一部、 [9]上記 [7]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、 GPR40ァ ゴニスト活性または GPR40アンタゴ-スト活性を検定することを特徴とする異種 GPR 40ァゴ-ストまたは異種 GPR40アンタゴ-ストのスクリーニング方法、
[10]上記 [7]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、（1)イン スリン分泌および Zまたは (2)耐糖能を測定することを特徴とする、異種哺乳動物に おける（1)インスリン分泌および/または（2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法、
[ I I ]上記 [ 1 ]記載のマウスと他の病態モデルマウスとの交配によって生じる病態モ デルマウスまたはその生体の一部、
[ 12]上記 [ 1 ]記載のマウスに対する薬剤誘発またはストレス負荷によって生じる病態 モデルマウスまたはその生体の一部、 [ 13]上記 [ 11 ]または [ 12]記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適 用し、病態の改善を検定することを特徴とする該病態を伴う疾患の予防'治療物質の スクリーニング方法、
[ 14]病態もしくは疾患が、代謝性症候群またはその 1以上の症候である上記 [13] 記載の方法、などを提供するものである。
発明の効果
[0007] 本発明の GPR40遺伝子改変動物は、正常な GPR40機能をより反映した表現型を示 すという効果を奏し、インビボでの GPR40作用調節薬のスクリーニング '薬効評価系と なり得る。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1] (A)ヒト GPR40遺伝子発現ユニットの構造を示す図である。マウスインスリン II遺 伝子プロモーターの下流に poly(A)+付加シグナルを含むヒト GPR40遺伝子が連結さ れた構造である。 (B)ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウスの脾臓における発現 を示す図である。各系統の 8週齢マウス脾臓におけるヒト GPR40遺伝子発現量を示す 。バーおよびエラーバーはそれぞれ、平均および標準偏差を示す (Mean士 SE, n=3 〜6)。但し、 47M系、 54M系、 23F系、および、 61F系のエラーバーは平均からの乖離 を示す（Mean士 SE, n=2)。 NonTg:対照マウス。
[図 2]トランスジエニックマウス 47M系および 23F系における単離ラ氏島でのヒト（A)お よびマウス (B) GPR40遺伝子発現を示す図である。動物は 8週齢から 8週間低脂肪食 負荷または高脂肪食負荷を行った。ヒトまたはマウス GPR40遺伝子発現量は 18Sリボ ソーム RNA遺伝子発現量に対する比で表した。バーおよびエラーバーはそれぞれ、 平均および標準偏差を示す (Mean士 SE, n=3〜4)。 LF:低脂肪食負荷群、 HF:高脂 肪食負荷群、 N:対照マウス、 T:トランスジェニックマウス。
[図 3]トランスジエニックマウスの耐糖能試験の結果を示す図である。通常食で飼育し た 16週齢の 47M系（A, C)マウス、および 18週齢の 23F系 (B, D)マウスに対して 16時間 絶食後に耐糖能試験を行った。 (A, B)は血漿グルコース値を、 (C, D)は血漿インスリ ン値を示す（Mean士 SE, 47M n=8; 23F n=12)。 NonTg:対照マウス、 Tg:トランスジェ ニックマウス。 圆 4]トランスジヱニックマウスの脂肪食負荷群における耐糖能試験の結果を示す図 である。トランスジエニックマウス 47M系について、 8週齢から 9週間、 10 kcal% fatの低 脂肪食負荷 (A, D)、 45 kcal% fatの高脂肪食負荷（B, E)、および、 60 kcal% fatの高 脂肪食負荷 (C, F)後に、 16時間絶食を行い、耐糖能試験を実施した。 (A, B, C)は 血漿グルコース値を、（D, E, F)は血漿インスリン値を示す（Mean士 SE, n=10)。 NonTg ：対照マウス、 Tg:トランスジエニックマウス 47M系。
[図 5]トランスジエニックマウスのグルコース刺激時のインスリン分泌を示す図である。 ( A)トランスジエニックマウス 47M系における、 3 mMグルコースまたは 16 mMグルコース 存在下でのインスリン分泌を示す。 （B)トランスジエニックマウス 47M系における、 11 m Mグルコース存在下での 0.5 mMパルミチン酸添カ卩時または無添カ卩時のインスリン分 泌を示す。縦軸は分泌されたインスリン量を示し、バーおよびエラーバーはそれぞれ 、平均および標準偏差を示す (Mean士 SE, n=3)。 NonTg:対照マウス、 Tg:トランスジ エニックマウス 47M系。
[図 6]GPR40遺伝子ホモ欠損マウスにおけるマウス GPR40遺伝子発現を示す図である o 8週齢脾臓におけるマウス GPR40遺伝子発現を示す。マウス GPR40遺伝子発現量 はァクチン遺伝子発現量に対する比で表した。バーおよびエラーバーはそれぞれ、 平均および標準偏差を示す（Mean士 SE, n=3)。 Wild:対照マウス、 Hetero： GPR40遺 伝子へテロ欠損マウス、 Homo： GPR40遺伝子ホモ欠損マウス。
[図 7]GPR40遺伝子ホモ欠損マウスにおける一般性状を示す図である。 GPR40遺伝 子ホモ欠損マウスについて、 8週齢から 8週間、 10 kcal% fatの低脂肪食負荷 (A, B, C , D)または 60 kcal% fatの高脂肪食負荷（E, F, G, H)を行った。 (A, E)、（B, F)、 (C, G)、および (D, H)はそれぞれ体重、カロリー摂取量、血漿グルコース値、および血 漿インスリン値を示す（Mean士 SE, n=10)。 WT :対照マウス、 KO： GPR40遺伝子ホモ 欠損マウス、 LF:低脂肪食負荷群、 HF:高脂肪食負荷群。
[図 8]GPR40遺伝子ホモ欠損マウスの脂肪食負荷群における耐糖能試験の結果を示 す図である。 GPR40遺伝子ホモ欠損マウスについて、 8週齢から 11週間、 10 kcal% fat の低脂肪食負荷 (A, C)、または、 60 kcal% fatの高脂肪食負荷 (B, D)後に、 16時間 絶食を行い、耐糖能試験を実施した。 (A, B)は血漿グルコース値を、 (C, D)は血漿ィ ンスリン値を示す（Mean士 SE, n=8)。 WT:対照マウス、 KO: GPR40遺伝子ホモ欠損 マウス、 LF:低脂肪食負荷群、 HF:高脂肪食負荷群。
[0009] 外来性 GPR40をコードする DNAを発現可能な状態で保持するトランスジヱニック非 ヒト哺乳動物（以下、「本発明の Tg動物」という場合もある）は、外来性 GPR40をコード する DNAを発現可能な状態で安定に保持する。「安定に保持」するとは、該動物の細 胞内に外来性 GPR40をコードする DNAが発現可能な状態で永続的に存在することを 意味し、該 DNAが宿主染色体上に組み込まれていても、あるいは染色体外 DNAとし て安定に存在していてもよいが、好ましくは、該 DNAは宿主染色体上に組み込まれ た状態で保持される。
[0010] 本発明の Tg動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子およびその前駆 細胞 (始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞 等)などに、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階 (さらに好ましくは 8細胞期以前） において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクト口ポレーシヨン）法、リポフエ クシヨン法、凝集法、顕微注入 (マイクロインジェクション)法、遺伝子銃 (パーティクル ガン)法、 DEAE-デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とする外来性 GP R40をコードする DNAを導入することにより作製される。また、該遺伝子導入法により、 非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とする DNAを導入し、細胞培養、組 織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚 (もしくは生殖)細胞と 公知の細胞融合法を用いて融合させることにより Tg動物を作製することもできる。ある いは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞 (ES細 胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とする DNAを導入し、予め該 DNAが安定に 組み込まれたクローンを選択した後に、該 ES細胞を胚盤胞に注入するかある 、は ES 細胞塊と 8細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入 DNAが伝 達されたものを選択することによつても Tg動物を得ることが可能である。
[0011] また、このようにして作製された Tg動物の生体の一部（例えば、（1)外来性 GPR40を コードする DNAを安定に保持する細胞、組織、臓器など、（2)これらに由来する細胞ま たは組織を培養し、必要に応じて継代したものなど)も、本発明の「外来性 GPR40をコ ードする DNAを発現可能な状態で保持する非ヒト哺乳動物の生体の一部」として、本 発明の「外来性 GPR40をコードする DNAを発現可能な状態で保持する非ヒト哺乳動 物」と同様な目的に用いることができる。
本発明の Tg動物の生体の一部としては、脾臓、肝臓、脂肪組織、骨格筋、腎臓、副 腎、血管、心臓、消化管、脳などの臓器や、当該臓器由来の組織片および細胞など が好ましく例示される。
[0012] 本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジヱニック系が確立されたヒト以 外の哺乳動物であれば特に制限はなぐ例えば、マウス、ゥシ、サル、ブタ、ヒッジ、 ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。好ましくは、マウ ス、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも疾患モデル動物作 製の面力 個体発生および生物サイクルが比較的短ぐ繁殖が容易なマウス (例えば 、純系として C57BL/6系統、 DBA2系統など、交雑系として B6C3F系統、 BDF系統、
1 1
B6D2F系統、 BALB/c系統、 ICR系統など）が好ましい。
1
また、哺乳動物以外にも-ヮトリなどの鳥類が本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物 」と同様の目的に用いることができる。
[0013] 「外来性 GPR40をコードする DNA」は、遺伝子導入の対象となる非ヒト哺乳動物が本 来有している内在性 GPR40 DNAではなく、外部より導入されたものであれば特に制 限はなぐ導入対象の非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）由来の GPR40 DNAであって もよいし、異種哺乳動物（例えば、ヒト、ゥシ、サル、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、 ネコ、モルモット、ハムスター、ラットなど）由来の GPR40もしくはそれと実質的に同一 のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAであってもよい。好ましくは、本発明 の外来性 GPR40をコードする DNAは、導入対象の非ヒト哺乳動物にとって異種の GP R40もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAで あり、より好ましくはヒト GPR40もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋 白質をコードする DNAである。ヒト GPR40をコードする DNAとしては、配列番号： 2で表 わされるアミノ酸配列をコードする DNA、好ましくは配列番号： 1で表わされる塩基配 列を含む DNAが挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、例えばヒト GP R40の場合、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と約 90%以上、好ましくは 95%以上 、より好ましくは約 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸 配列の同一性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotec hnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件 (期待 値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フィルタリング =OFF)にて計算するこ とがでさる。
「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、例えばヒト GPR40の場合 、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列 番号： 2で表わされるアミノ酸配列力 なる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋 白質が好ましい。「実質的に同質の活性」としては、例えば、リガンド [即ち、遊離脂肪 酸など (ァゴ二スト、アンタゴニストを含む）]結合活性、細胞内 Ca++濃度上昇作用、 cA MP生成抑制作用、脾 |8細胞力 のインスリン分泌促進作用などが挙げられる。実質 的に同質とは、それらの活性が定性的に同等であることを示す。したがって、リガンド 結合活性、細胞内 Ca++濃度上昇作用、 cAMP生成抑制作用、インスリン分泌促進作 用などの活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度 (例、約 0.01〜100 倍、好ましくは約 0.5〜20倍、より好ましくは約 0.5〜2倍)や蛋白質の分子量などの量 的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性、細胞内 Ca++濃度上昇作用、 cAMP 生成抑制作用、インスリン分泌促進作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準 じて行なうことができる力 例えば、上記特許文献 3に記載されるスクリーニング方法 等に従って測定することができる。
ヒト以外の哺乳動物由来の GPR40をコードする DNAとしては、上記特許文献 3に記 載されるマウス、ラット、ハムスター由来 DNA等が挙げられる。
外来性 GPR40をコードする DNAは、例えば配列番号： 1で表わされる塩基配列を含 む DNAのように、イントロンを含まない形態（即ち、相補 DNA)であることが好ましいが 、イントロンの 5'および 3'末端配列はほとんどの真核生物遺伝子で共通であるので、 別の実施態様においてはイントロンを含む形態 (即ち、ゲノム DNA)もまた、好ましく用 いられ得る [但し、ヒト GPR40の ORF (配列番号： 1)はヒト 19番染色体（GenBank acces sion No. NC— 000019 (VERSION: NC— 000019.8 GI:42406306))の 40534295位〜 4053 5197位と、マウス GPR40の ORF (GenBank accession No. NM— 194057.1)はマウス 7番 染色体（GenBank accession No. NC— 000073 (VERSION: NC— 000073.3 GI:83280982) )の 113965103位〜 113966005位（逆鎖）とそれぞれ一致するので、少なくともヒトおよ びマウス GPR40遺伝子にはイントロンは存在しない]。
[0015] 外来性 GPR40をコードする DNAは、ヒトゃ各種非ヒト哺乳動物（ゥシ、サル、ブタ、ヒ ッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ノ、ムスター、ラット、マウスなど）の脾臓、 肝臓、脂肪組織、骨格筋、腎臓、副腎、血管、心臓、消化管、脳などに由来する DNA および巿販の各種ゲノム DNAライブラリーに由来するゲノム DNAの全てあるいは一部 を原料として用い、あるいはヒトゃ各種非ヒト哺乳動物の脾臓、肝臓、脂肪組織、骨格 筋、腎臓、副腎、血管、心臓、消化管、脳などに由来する RNA力 公知の方法により 調製された cDNAを原料として用い、公知の GPR40遺伝子配列をもとに作製したオリ ゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして、ノ、イブリダィゼーシヨン法もしくは PCR法などにより単離することができる。
[0016] 本発明の Tg動物は、外来性 GPR40をコードする DNAを「発現可能な状態で」保持し ている。したがって、当該 DNAを対象動物に導入するにあたっては、当該 DNAを対 象動物の細胞内で機能し得るプロモーターの下流に連結した発現カセットを含む形 態 (例、発現ベクターなど)で用いるのが一般に有利である。
[0017] 外来性 GPR40をコードする DNAを担持するベクターとしては、大腸菌由来のプラス ミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバタテリオファ ージ、モロ-一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、レンチウィルス、アデノ随伴ウイ ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物もしくは昆虫ウィルスなど が用いられる。なかでも、プラスミド (好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母 由来、特に大腸菌由来のプラスミド)や、動物ウィルス (好ましくはレトロウイルス、レン チウィルス）が好ましい。
[0018] 外来性 GPR40の遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、例えばウィルス (サイ トメガロウィルス、モロ-一白血病ウィルス、 JCウィルス、乳癌ウィルスなど）に由来す る遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ゥシ、サル、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ 、ィヌ、ネコ、モルモット、ノ、ムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（-ヮトリなど）に 由来する遺伝子 [例えば、アルブミン、エンドセリン、ォステオカルシン、筋クレアチン キナーゼ、 I型および II型コラーゲン、サイクリック AMP依存蛋白キナーゼ j8 Iサブュ- ット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーノ ミン |8 -水酸ィ匕酵素、ニューロフィラメント軽鎖 、メタ口チォネイン Iおよび ΠΑ、メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、平滑筋 αァク チン、ポリペプチド鎖伸長因子 1 a (EF1- α ) , βァクチン、 αおよび βミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイド Ρコンポーネント、レニンな ど]のプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、 目的とする疾患モデルに応じて、 標的組織で外来性 GPR40を特異的もしくは高発現させ得るプロモーター [例：脾臓で 特異的に発現可能なインスリン Iおよび IIプロモーター（以下、包括してインスリンプロ モーターともいう）、あるいは GPR40本来のプロモーター；肝臓で高発現可能な血清 アミロイド ρコンポーネント（SAP)、アルブミン、トランスフェリン、フイブリノ一ゲン、アン チトロンビン III、 a 1-アンチトリプシンなどの遺伝子プロモーター;脂肪組織で特異的 に発現可能なアディポネクチンなどのアディポサイト力イン遺伝子プロモーター；骨格 筋で特異的に発現可能なマスクリンなどの遺伝子プロモーター；腎臓で高発現可能 な PTH/PTHrP受容体などの遺伝子プロモーター；副腎で高発現可能な ACTH受容 体などの遺伝子プロモーター；血管で特異的に発現可能なプレプロエンドセリン- 1な どの遺伝子プロモーター；心臓で高発現可能な aおよび j8ミオシン重鎖、ミオシン軽 鎖 1および 2などの遺伝子プロモーター；消化管で高発現可能な脂肪酸結合蛋白質 などの遺伝子プロモーター;脳で高発現可能なミエリン塩基性蛋白、グリア線維性酸 性蛋白などの遺伝子プロモーター等]を適宜選択することができる力 好ましくは、内 在の GPR40遺伝子の生理的条件下での発現と類似した時間的 ·空間的発現プロファ ィルを付与し得るプロモーター、例えば、インスリンプロモーター、 GPR40プロモータ 一など、より好ましくはインスリン IIプロモーターが用いられる。
外来性 GPR40をコードする DNAの下流には、 Tg動物において目的とするメッセンジ ヤー RNAの転写を終結させる配列（ポリアデ-レーシヨン (polyA)シグナル、ターミネ一 ターとも呼ばれる）を有していることが好ましぐ例えば、ウィルス遺伝子由来、あるい は各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネータ一配列を用 、て、効率よ ヽ 導入遺伝子の発現を達成することができる。好ましくは、シミアンウィルスの SV40ター ミネ一ターなどが用いられる。その他、 目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、 各遺伝子のスプライシングシグナル、ェンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの 一部を、プロモーター領域の 5'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳 領域の 3'下流に連結することも目的により可能である。
[0020] また、胚性幹細胞 (ES細胞）を用いて Tg動物を作製する場合、上記のベクターは、 導入 DNAが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子 (例 ：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）を さらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導 入 DNAを組み込むこと (即ち、ノックイン動物の作製)を意図する場合には、上記のベ クタ一は、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同な DNA配列の外側に 単純へルぺスウィルス由来チミジンキナーゼ（HSV-tk)遺伝子やジフテリア毒素遺伝 子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ま 、。これらの実施態 様につ!、ては後で詳述する。
[0021] 上記のプロモーター、外来性 GPR40をコードする DNA、ターミネータ一などは、適当 な制限酵素および DNAリガーゼ等を用いた通常の遺伝子工学的手法により、上記の ベクター中に正し 、配置で、即ち Tg動物にお 、て外来性 GPR40を発現可能な配置 で、挿入することができる。
[0022] 好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られる外来性 GPR40をコード する DNAを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺 乳動物の初期胚に導入される。
[0023] 対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られ る体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄力もそれぞれ採 取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例 えばマウス（好ましくは C57BL/6J (B6)などの近交系マウス、 B6と他の近交系との Fな
1 ど）を用いる場合は、雌が約 4〜約 6週齢、雄が約 2〜約 8ヶ月齢程度のものが好ましく 、また、約 12時間明期条件 (例えば 7:00-19:00)で約 1週間飼育したものが好ましい。 体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と 1個体力 多数の初期胚を 得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を 誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排 卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン (妊馬血清性性腺刺激ホルモン
、一般に PMSGと略する）、次いで黄体形成ホルモン (ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、 一般に hCGと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、 好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる 。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス (好ましくは C57BL/6J (B6)などの近交系マウス、 B 6と他の近交系との Fなど）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約 48時間後
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に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る 方法が好ましぐ卵胞刺激ホルモンの投与量は約 20〜約 50IU/個体、好ましくは約 30 IU/個体、黄体形成ホルモンの投与量は約 0〜約 10IU/個体、好ましくは約 5IU/個体 である。
一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を 開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地 (例: M16培地、修正 Whitten培地、 BWW培地、 M2培地、 WM- HEPES培地、 BWW-HEPES培地等）中で洗って卵丘細胞 を除き、微小滴培養法等により 5%炭酸ガス/ 95%大気下で DNA顕微注入まで培養する 。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で 凍結保存することも可能である。
[0024] 一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物 (体内受精の場合と同様のも のが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモン を投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地 (例: TYH培地）中で体 外受精時まで微小滴培養法等により 5%炭酸ガス/ 95%大気下で培養する。他方、同種 の雄非ヒト哺乳動物 (体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる)力 精巣上 体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の 精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により 5%炭酸ガス/ 95%大 気下で培養した後、 2個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちに DNA の顕微注入を行わな!/ヽ場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結 保存することも可能である。
[0025] 受精卵への DNAの顕微注入は、マイクロマニピュレータ一等の公知の装置を用い て常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に 入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを 用いて DNA溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。 導入 DNAは CsCl密度勾配超遠心または陰イオン交換榭脂カラム等で高度に精製し たものを用いることが好ましい。また、導入 DNAは制限酵素を用いてベクター部分を 切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
[0026] DNA導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により 5%炭酸ガス/ 95% 大気下で 1細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動 物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚 が由来する動物と同種のものであればよぐ例えば、マウス初期胚を移植する場合は 、 ICR系の雌マウス (好ましくは約 8〜約 10週齢)などが好ましく用いられる。受胚用雌 非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除 (結紮） 雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、 ICR系の雄マウス (好ましくは約 2ヶ月齢以 上)）と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られて ヽる。 受胚用雌は自然排卵のものを用いてもょ 、し、あるいは精管切除 (結紮)雄との交 配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン (一般に LHRHと略する)もしくはその 類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。 LHRH類縁体としては、 例えば、 [3,5- Dil- Tyr5]- LH- RH、 [Gin8]- LH- RH、 [D- Ala6]- LH- RH、 [des- Gly10]- LH - RH、 [D-His(Bzl)6]-LH-RHおよびそれらの Ethylamideなどが挙げられる。 LHRHもし くはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時 期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス (好ましくは ICR系のマウスなど）の場合には、通常、 LHRHもしくはその類縁体を投与 した後、約 4日目に雄マウスと交配させることが好ましぐ LHRHあるいはその類縁体の 投与量は、通常、約 10〜60 /z g/個体、好ましくは約 40 g/個体である。
[0027] 通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前
(例えば、 1細胞期〜 8細胞期胚)であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植 胚の発生段階に応じて偽妊娠力もある日数が経過したものが適宜使用される。例え ばマウスの場合、 2細胞期胚を移植するには偽妊娠後約 0.5日の雌マウスが、胚盤胞 期胚を移植するには偽妊娠後約 2.5日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔 (好ま しくは Avertiiuネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養 用培地に懸濁した初期胚 (約 5〜約 10個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口 もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
[0028] 移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔 非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよ ぐ帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌 (例えばマウスの 場合、通常に交配'分娩した雌マウス (好ましくは ICR系の雌マウス等)）に哺乳させる ことができる。
[0029] 受精卵細胞段階における外来性 GPR40をコードする DNAの導入は、導入 DNAが対 象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保され る。導入 DNAが染色体 DNAに組み込まれている力否かは、例えば、産仔の尾部より 分離抽出した染色体 DNAをサザンノヽイブリダィゼーシヨンまたは PCR法によりスクリー ニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動 物（F )の生殖系列細胞において外来性 GPR40をコードする DNAが存在することは、
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その後代 (F )の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに外来性 GP
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R40をコードする DNAが存在することを意味する。
通常、 F動物は相同染色体の一方にのみ導入 DNAを有するヘテロ接合体として得
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られる。また、個々の F個体は相同糸且換えによらない限り異なる染色体上にランダム
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に挿入される。相同染色体の両方に外来性 GPR40をコードする DNAを有するホモ接 合体を得るためには、 F動物と非トランスジヱニック動物とを交雑して F動物を作製し
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、相同染色体の一方にのみ導入 DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すれ ばよい。 1遺伝子座にのみ導入 DNAが組み込まれていれば、得られる!7動物の 1/4が
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ホモ接合体となる。
[0030] 別の一実施態様においては、外来性 GPR40をコードする DNAを含む発現ベクター は、エレクト口ポレーシヨン法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動 物の ES細胞に導入される。
[0031] ES細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊 (ICM)に由来し、インビトロで未分化状 態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。 ICMの細胞は将来、胚本体を形成する細 胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。 ES細胞としては、 既に榭立された細胞株を用いてもよぐまた、 Evansと Kauftnanの方法（ネイチヤー（Na ture)第 292卷、 154頁、 1981年）に準じて新しく榭立したものでもよい。例えば、マウス ES細胞の場合、現在、一般的には 129系マウス由来の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背 景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で、例えば、 C57BL/6マウスや C57BL/6 の採卵数の少なさを DBA/2との交雑により改善した BDFマウス（C57BL/6と DBA/2と
1
の F )から樹立される ES細胞なども良好に用いることができる。 BDFマウスは、採卵数
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が多ぐかつ卵が丈夫であるという利点にカ卩えて、 C57BL/6マウスを背景に持つので 、これ由来の ES細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、 C57BL/6マウスと戻し交雑 することでその遺伝的背景を C57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用 い得る。
[0032] ES細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳 動物 [例えばマウス（好ましくは C57BL/6J (B6)などの近交系マウス、 B6と他の近交系 との Fなど）を用いる場合は、約 2ヶ月齢以上の雄マウスと交配させた約 8〜約 10週齢
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程度の雌マウス (妊娠約 3.5日）が好ましく用いられる]の子宮力も胚盤胞期胚を採取 して (あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管力も採取した後、胚培養用培地中で上 記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダ一細胞 (例えばマウス の場合、マウス胎仔から調製される初代繊維芽細胞や公知の STO繊維芽細胞株等） 層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化する ICMを形成 する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保 ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことにより ES細胞が得られる。
[0033] ES細胞は雌雄 、ずれを用いてもょ 、が、通常雄の ES細胞の方が生殖系列キメラを 作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ 早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば 、 PCR法により Y染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その 1例 としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約 106 個の細胞数を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 (約 50個）で済むの で、培養初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能 であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、第二次セレクションとして、例えば、 G-バンデイング法による染色体数の確認 等により行うことができる。得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが 、細胞株榭立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞への遺伝子導 入の後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が 2n=40である細胞）に再びクロー ユングすることが望ましい。
このようにして得られる ES細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意 深く継代培養することが必要である。例えば、 STO繊維芽細胞のような適当なフィー ダー細胞上で、分ィ匕抑制因子として知られる LIF (l〜10,000U/ml)存在下に炭酸ガ ス培養器内（好ましくは、 5%炭酸ガス/ 95%空気または 5%酸素 /5%炭酸ガス/ 90%空気） で約 37°Cで培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/ EDTA溶 液（通常 0.001〜0.5%トリプシン /0.1〜5mM EDTA,好ましくは約 0.1%トリプシン/ ImM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法な ど力とられる。このような継代は、通常 1〜3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行 い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望ま れる。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養する力 または細胞集塊 を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプ の細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及び M. H. Kau&ian,ネイチヤー（ Nature)第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin,プロシーディングズ 'ォブ 'ナショナ ル 'アカデミ^ ~·ォブ 'サイエンシーズ 'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschmanら，ジャーナル'ォブ'ェンブリオロジ^ ~· アンド.ェクスペリメンタル.モルフォロジ一、第 87卷、 27頁、 1985年〕、本発明の外来 性 GPR40をコードする DNAを導入された ES細胞を分ィ匕させて得られる外来性 GPR40 発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビト口における外来性 GPR40の細胞生物学的検討 において有用である。 [0035] ES細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔 (エレクトロボ レーシヨン)法、リポフエクシヨン法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入 (マイクロ インジェクション)法、遺伝子銃 (パーティクルガン）法、 DEAE-デキストラン法などのい ずれも用いることができる力 簡便に多数の細胞を処理できること等の点力 エレクト 口ポレーシヨン法が一般的に選択されている。エレクト口ポレーシヨンには通常の動物 細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよぐ例えば、対数 増殖期にある ES細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、 106〜108細胞/ mlとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、外来性 GPR40をコードする DNAを含 むベクターを 10〜100 /z g添カ卩し、 200〜600V/cmの電気パルスを印加することにより 行なうことができる。
[0036] 導入 DNAが組み込まれた ES細胞は、単一細胞をフィーダ一細胞上で培養して得ら れるコロニー力 分離抽出した染色体 DNAをサザンノヽイブリダィゼーシヨンまたは PC R法によりスクリーニングすることによつても検定することができる力 ES細胞を用いるト ランスジェニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の発現を 指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用さ れる導入べクタ一は、外来性 GPR40をコードする DNAを含む発現カセットに加えて、 薬剤耐性遺伝子（例：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ II (nptll)遺伝子、ノ、ィグロ マイシンホスホトランスフェラーゼ (hpt)遺伝子など)やレポーター遺伝子 (例： j8 -ガラ クトシダーゼ（lacZ)遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ（cat)遺 伝子など)等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マー カー遺伝子として nptll遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後の E S細胞を G418などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した 耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した 後、一部を培養用として残し、残りを PCRもしくはサザンハイブリダィゼーシヨンにかけ て導入 DNAの存在を確認する。
[0037] 導入 DNAの組込みが確認された ES細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻 すと、宿主胚の ICMに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親 (受胚用雌）に 移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジエニック動物が得られる。 キメラ動物の中で ES細胞が将来卵や精子に分ィ匕する始原生殖細胞の形成に寄与し た場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入 DNA が遺伝的に固定された Tg動物を作製することができる。
キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる 方法 (集合キメラ法)と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法 (注入キメラ法） とがある。 ES細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれてい る力 最近では、 8細胞期胚の透明帯内への ES細胞の注入により集合キメラを作る方 法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、 ES細胞塊と透明 帯を除去した 8細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する 方法も行われている。
いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用さ れ得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、 キメラマウス形成への ES細胞の寄与率を毛色 (コートカラー）で判定し得るように、 ES 細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウス力 宿主胚を採取することが好 ましい。例えば、 ES細胞が 129系マウス（毛色:ァグーチ）由来であれば、採卵用雌と して C57BL/6マウス（毛色：ブラック）や ICRマウス（毛色：アルビノ）を用い、 ES細胞が C57BL/6もしくは DBFマウス（毛色：ブラック）由来や TT2細胞（C57BL/6と CBAとの F
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(毛色：ァグーチ）由来）であれば、採卵用雌として ICRマウスや BALB/cマウス（毛色： アルビノ）を用いることができる。
また、生殖系列キメラ形成能は ES細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するの で、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えば マウスの場合、 129系統由来の ES細胞に対しては C57BL/6系統由来の宿主胚等を 用いることが好ましく、 C57BL/6系統由来の ES細胞に対しては BALB/c系統由来の 宿主胚等が好ましい。
採卵用雌マウスは約 4〜約 6週齢程度が好ましぐ交配用の雄マウスとしては約 2〜 約 8ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ま しくは性腺刺激ホルモン (卵胞刺激ホルモン、次 ヽで黄体形成ホルモン)を投与して 過剰排卵を誘起した後に行なわれる。 [0039] 胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚 (例えばマウスの場合、交配後約 3.5日）を 採卵用雌の子宮から採取し (あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後 、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレータ 一を用いて胚盤胞の割腔内に外来性 GPR40をコードする DNAが導入された ES細胞（ 約 10〜約 15個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移 植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として 使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
共培養法による場合は、 8細胞期胚および桑実胚 (例えばマウスの場合、交配後約 2.5日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して (あるいは 8細胞期以前の初期胚 を卵管力 採取した後、上述の胚培養用培地中で 8細胞期または桑実胚期まで培養 してもょ 、)酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚 培養用培地の微小滴中に外来性 GPR40をコードする DNAが導入された ES細胞塊（ 細胞数約 10〜約 15個）を入れ、さらに上記 8細胞期胚または桑実胚 (好ましくは 2個） を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用 雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
[0040] 移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキ メラ非ヒト哺乳動物が得られる。 自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させれ ばよぐ帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌 (通常に交配 •分娩した雌非ヒト哺乳動物）〖こ哺乳させることができる。
生殖系列キメラの選択は、まず ES細胞の雌雄が予め判別されて 、る場合は ES細胞 と同じ性別のキメラマウスを選択し (通常は雄性 ES細胞が使用されるので、雄キメラマ ウスが選択される）、次いで毛色等の表現型力 ES細胞の寄与率が高いキメラマウス (例えば、 50%以上）を選択する。例えば、 129系マウス由来の雄性 ES細胞である D3細 胞と C57BL/6マウス由来の宿主胚とのキメラ胚カも得られるキメラマウスの場合、ァグ ーチの毛色の占める割合の高 、雄マウスを選択するのが好ま 、。選択されたキメラ 非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物と の交雑により得られる F動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記
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キメラマウスの場合、ァグーチはブラックに対して優性であるので、雌 C57BL/6マウス と交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られる Fの毛色はァ
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グーチとなる。
[0041] 上記のようにして得られる外来性 GPR40をコードする DNAが導入された生殖系列キ メラ非ヒト哺乳動物（フアウンダー）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入 DNAを有 するヘテロ接合体として得られる。また、個々のフアウンダ一は相同組換えによらない 限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に外来性 GPR40を コードする DNAを有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られる F動
1 物のうち相同染色体の一方にのみ導入 DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交 雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えば!7動物の尾部より分離抽出した染色
1
体 DNAをサザンハイブリダィゼーシヨンまたは PCR法によりスクリーニングすることによ り検定することができる。 1遺伝子座にのみ導入 DNAが組み込まれていれば、得られ る F動物の 1/4がホモ接合体となる。
2
[0042] 発現ベクターとしてウィルスを用いる場合の別の好ま 、一実施態様として、外来 性 GPR40をコードする DNAを含むウィルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくは ES細 胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、プロシーディングズ'ォヴ'ナショナル'ァ 力デミ^ ~·ォヴ 'サイエンシーズ 'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA)第 99卷， 第 4号，第 2140-2145頁， 2002年参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウィルスを用 いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞 (受精卵は透明帯を除いておくこと が好まし!/ヽ）を播き、培養液にウィルスベクターを加えて (所望によりポリプレンを共存 させてもよい）、 1〜2日間培養後、初期胚であれば、上述のように偽妊娠させた受胚 用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宫内に移植し、 ES細胞であれば、上述のように G 418ゃノ、イダロマイシンなどの選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込ま れた細胞を選択する。
さらに、プロシーディングズ ·ォヴ ·ナショナノレ 'ァカデミ一'ォヴ ·サイエンシーズ ·ュ 一エスエー（proc. Natl. Acad. Sci. USA)第 98卷，第 13090- 13095頁， 2001年に記載 されるように、雄非ヒト哺乳動物力も採取した精原細胞を STOフィーダ一細胞と共培 養する間にウィルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に 注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よく外来性 GPR40ヘテロ Tg (+ /-)産仔を得ることができる。
[0043] 本発明の Tg動物は、対応する非トランスジエニック動物と比較して、以下の特性：
(1)インスリン分泌能が増大している、および Zまたは
(2)耐糖能が改善されている
を有することを特徴とする。
従来公知の GPR40 Tgマウス (非特許文献 3、特許文献 4を参照）はインスリン分泌 不全を伴う糖尿病を発症した。し力しながら、上記の本発明の Tg動物の表現型は、 G PR40作動薬が脾 細胞力 のインスリン分泌を促進し、糖尿病の予防'治療薬として 有用であるとのコンセプトを支持するものである。即ち、本発明の Tg動物では、外来 性 GPR40をコードする DNAはインスリンプロモーターの制御下であり、本来の β細胞 の機能亢進が達成されたと考えられる。また、本発明の Tg動物の表現型は、実施例 に記載するように 2系統において認められたことから、導入遺伝子に基づく効果であり 、正常な GPR40機能を反映していることが支持される。これに対し、公知の GPR40 Tg マウスは Ipf-1プロモーターによる発現マウスであり、用いたプロモーターが異なり、発 現部位、発現時期、発現レベル、染色体への挿入場所の違い、または何らかの理由 で表現型に相違がみられたと考えられる。
[0044] 本発明の Tg動物は、上述のように、 GPR40作動薬による糖尿病の予防 '治療という コンセプトを実証するだけでなぐ GPR40調節薬 (作動薬、拮抗薬を含む)の評価系 などに用いることができる。
したがって、本発明はまた、本発明の Tg動物またはその生体の一部に被験物質を 適用し、 GPR40ァゴニスト活性または GPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴 とする、 GPR40ァゴ-ストまたは GPR40アンタゴ-ストのスクリーニング方法を提供する 。また、ヒト型遺伝子を発現させた場合は、ヒト型遺伝子のみに作用する化合物の評 価に有用となる。
ここで「ァゴ二スト活性」とは、 GPR40に特異的に結合し、 GPR40の活性型と不活性 型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいい、その程度は特に限定されない 。従って、「ァゴ二スト活性を有する物質 (作動薬)」には、いわゆるフルァゴニストの他 、パーシャルァゴ-ストも包含される。一方、「アンタゴ-スト活性」とは、 GPR40のリガ ンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は 全く影響を及ぼさない性質、あるいは GPR40の任意の部位に結合して、 GPR40の活 性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。従って、本明 細書にお 1、て「アンタゴ-スト活性を有する物質 (拮抗薬)」とは、 、わゆる-ユートラ ルアンタゴ-ストとインバースァゴ-ストの両方を包含する概念として定義されるものと する。
[0045] 具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の Tg動物に被験物質を投 与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、 DNAライブラリー などの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ゥシ、ヒッジ、サル、ヒトな ど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。被験物質の GPR40ァゴニスト Z アンタゴニスト活性は、例えば、リガンド (即ち、遊離脂肪酸など)結合活性、細胞内 C a++濃度上昇作用、 cAMP生成抑制作用、脾 細胞からのインスリン分泌促進作用な どを指標として検定することができる。これらは自体公知の方法に準じて測定すること ができる。
[0046] このようにして選択された GPR40作動薬は、哺乳動物における安全で低毒性な糖 尿病 (I型および II型)、耐糖能障害、高脂血症、代謝性症候群などの疾患に対する 予防'治療剤、脾臓機能調節剤 (例、脾臓機能改善剤)、インスリン分泌促進剤、血 糖低下剤、脾 )8細胞保護剤として有用である。その他、ケトーシス、アシドーシス、糖 尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、動脈硬化、性機能障害、皮膚 疾患、関節症、骨減少症、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などの疾患に対 する予防'治療剤としても使用することができる。
[0047] GPR40作動薬は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシ ル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的 に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に 使用できる。該作動薬は、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、 防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位 用量形態で混和することによって製剤化することができる。これら製剤における有効 成分量は後述する投与量を考慮して適宜選択される。 [0048] 錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、 コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような 賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ ネシゥムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセ ルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有すること ができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡 麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常 の製剤実施に従って処方することができる。
[0049] 注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液 (例えば、 D-ソルビトール、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウムなど）などが挙げ られ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール (例えば、エタノールなど）、ポリアルコ ール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面 活性剤（例えば、ポリソルベート 80™、 HCO- 50など）などと併用してもよい。油性液と しては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝 液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩ィ匕ベンザルコ-ゥム、塩酸プ ロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保 存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸ィ匕防止剤などと配合しても よい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
[0050] このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例え ば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サル など）、好ましくは外来性 GPR40の由来する動物 (好ましくはヒト）に対して投与するこ とがでさる。
GPR40作動薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、 例えば、糖尿病の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人 (体重 60kg)にお 、 ては、一日にっき約 O.lmg〜約 100mg、好ましくは約 1.0〜約 50mg、より好ましくは約 1. 0〜約 20mgである。非経口投与の場合、当該作動薬の投与量は投与対象、対象疾 患などによっても異なるが、例えば、糖尿病の治療目的で注射剤として成人 (体重 60 kg)に投与する場合、一日にっき約 0.01〜約 30mg程度、好ましくは約 0.1〜約 20mg程 度、より好ましくは約 0.1〜約 10mg程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
[0051] また、本発明のスクリーニング法により選択された GPR40拮抗薬は、哺乳動物 (好ま しくは外来性 GPR40の由来する動物、さらに好ましくはヒト）における安全で低毒性な 肥満、高脂血症、 II型糖尿病、インスリン抵抗性症候群などの疾患に対する予防 -治 療剤、脾臓機能調節剤 (例、脾臓機能改善剤)、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤 として有用である。その他、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、浮腫、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノ 一マ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などの疾患に対する予防'治療剤として も使用することができる。 GPR40拮抗薬は、上記 GPR40作動薬と同様の方法により製 剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモ ット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど）に投与することができる。
[0052] GPR40拮抗薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、 例えば、肥満の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人 (体重 60kg)において は、一日にっき約 O.lmg〜約 100mg、好ましくは約 1.0〜約 50mg、より好ましくは約 1.0 〜約 20mgである。非経口投与の場合、当該拮抗薬の投与量は投与対象、対象疾患 などによっても異なるが、例えば、肥満の治療目的で注射剤として成人 (体重 60kg) に投与する場合、一日にっき約 0.01〜約 30mg程度、好ましくは約 0.1〜約 20mg程度 、より好ましくは約 0.1〜約 10mg程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体 重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
[0053] 上述のように、本発明の Tg動物は、対応する非トランスジヱニック動物と比較して、
(1)インスリン分泌能が増大している、および Zまたは
(2)耐糖能が改善されている
ことを特徴とすることから、該動物は、（1)インスリン分泌および Zまたは（2)耐糖能調 節薬のスクリ一ユングに特に有用である。
したがって、本発明はまた、本発明の Tg動物またはその生体の一部に被験物質を 適用し、（1)インスリン分泌および Zまたは（2)耐糖能を測定することを特徴とする、 ( 1)インスリン分泌および Zまたは（2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法を提供する
[0054] 具体的には、該スクリーニング方法では、本発明の Tg動物に被験物質を投与する。
被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、 DNAライブラリーなどの 他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ゥシ、ヒッジ、サル、ヒトなど）の 組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。被験物質のインスリン分泌調節作用 および耐糖能調節作用は、それぞれ自体公知の方法、例えば、後記実施例におい て用いられる方法などに準じて測定することができる。
[0055] 該スクリーニング法により選択されたインスリン分泌 Z耐糖能調節薬は、哺乳動物（ 好ましくは外来性 GPR40の由来する動物、さらに好ましくはヒト）におけるインスリン分 泌および Zまたは耐糖能の改善に使用することができる。該調節薬は、上記 GPR40 作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物 (例えば
、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルな ど）に投与することができる。
[0056] 該インスリン分泌 Z耐糖能調節薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート などにより異なる力 例えば、糖尿病の治療目的で経口投与する場合、一般的に成 人（体重 60kg)においては、一日にっき約 O.lmg〜約 100mg、好ましくは約 1.0〜約 50 mg、より好ましくは約 1.0〜約 20mgである。非経口投与の場合、当該調節薬の投与量 は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病の治療目的で注射 剤として成人 (体重 60kg)に投与する場合、一日にっき約 0.01〜約 30mg程度、好まし くは約 0.1〜約 20mg程度、より好ましくは約 0.1〜約 10mg程度である。投与対象がヒト 以外の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
[0057] GPR40遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物とは、内在性 GPR40の発現が不活性ィ匕され た非ヒト哺乳動物を意味し、 GPR40遺伝子がノックアウト (KO)された ES細胞から上記 の方法に従って作製される GPR40 KO動物の他、アンチセンスもしくは RNAi技術によ り GPR40遺伝子の発現が不活性ィ匕されたノックダウン (KD)動物なども含まれる。ここ で「ノックアウト (KO)」とは、内在性遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全 な mRNAを産生不能にすることを意味し、他方、「ノックダウン (KD)」とは、 mRNAから 蛋白質への翻訳を阻害することにより、結果的に内在性遺伝子の発現を不活性化す ることを意味する。
[0058] 本発明の GPR40遺伝子 KO/KD動物（以下、単に「本発明の KO/KD動物」という場 合がある）において、対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジエニック系が確立さ れたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなぐ例えば、マウス、ラット、ゥシ、サル 、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。好 ましくは、マウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも 疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短ぐ繁殖が 容易な齧歯動物がより好ましぐとりわけマウス (例えば、純系として C57BL/6系統、 D BA2系統など、交雑系として B6C3F系統、 BDF系統、 B6D2F系統、 BALB/c系統、 I
1 1 1
CR系統など）およびラット（例えば、 Wistar、 SDなど）が好ましい。
[0059] GPR40遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来の GPR40遺伝子 (ゲノム DNA)を常法に従って単離し、例えば、（1)そのェキソン部分や プロモーター領域に他の DNA断片（例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子 等）を挿入することによりェキソンもしくはプロモーターの機能を破壊する力、 (2)Cre-l oxP系や Flp-frt系を用いて GPR40遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を 欠失させるか、（3)蛋白質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳 を不能にする力 あるいは (4)転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させる DNA配列（ 例えば、 polyA付加シグナルなど）を挿入して、完全な mRNAの合成を不能にすること によって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 (以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動 物の GPR40遺伝子座に組み込ませる方法などが好ましく用いられ得る。
[0060] 該相同組換え体は、例えば、本発明の Tg動物の作製方法の 1つである、 ES細胞へ の外来性 GPR40をコードする DNAの導入において、外来性 GPR40をコードする DNA の代わりに上記ターゲッティングベクターを用いることにより取得することができる。タ ーゲッティングベクター力 GPR40遺伝子のェキソンもしくはプロモーター部分に薬剤 耐性もしくはレポーター遺伝子が挿入されたものである場合、当該薬剤耐性もしくは レポーター活性を指標として遺伝子導入 ES細胞を選択することができる。薬剤耐性も しくはレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞内で機能し得る任意のプロモーターを含 む発現カセットの形態であることが好まし 、が、レポーター遺伝子が GPR40遺伝子の 内在性プロモーターの制御下におかれるように GPR40遺伝子内に挿入される場合、 該レポーター遺伝子のベクターにはプロモーターを必要としない。
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入された DN Aは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポータ 一遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内在 性 GPR40遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができ ず、選択されたすベてのクローンにつ 、てサザンハイブリダィゼーシヨン法もしくは PC R法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的 配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純へルぺ スウィルス由来チミジンキナーゼ (HSV-tk)遺伝子を連結しておけば、該ベクターがラ ンダムに挿入された細胞は HSV-tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地で は生育できないが、相同組換えにより内在性 GPR40遺伝子座にターゲッティングされ た細胞は HSV-tk遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。ある いは、 HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該べ クタ一がランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので 、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。出現した耐性コロニーをそ れぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養 用として残し、残りを PCRもしくはサザンハイブリダィゼーシヨンにかけて導入 DNAの 存在を確認する。
[0061] キメラ胚の作製、フアウンダ一の樹立、ホモ接合体の作製等は、 ES細胞を用いた本 発明の Tg動物の作製方法において上記したと同様の方法を用いて行うことができる
[0062] GPR40遺伝子をノックダウンする具体的な手段としては、 GPR40のアンチセンス RNA もしくは siRNA(shRNAを含む）をコードする DNAを、上記のいずれかのトランスジェ- ック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物細胞内で発現させる方法などが 挙げられる。
[0063] 目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含む DNA、即ち、目的の ポリヌクレオチドとハイブリダィズすることができる DNAは、該目的のポリヌクレオチドに 対して「アンチセンス」であると!/、うことができる。
GPR40をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的 な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス DNAとしては、 GPR40をコードする ポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば 、いずれのアンチセンス DNAであってもよい。
[0064] GPR40をコードするポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該 ポリヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約 70%以 上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相 同性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相 同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値 =10 ;ギャップを許 す；フィルタリング =ON ;マッチスコア =1；ミスマッチスコア =-3)にて計算することができ る。
特に、 GPR40をコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、（a)翻訳 阻害を指向したアンチセンス DNAの場合は、 GPR40蛋白質の N末端部位をコードす る部分の塩基配列 (例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約 70%以上 、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同 性を有するアンチセンス DNAが、（b) RNaseHによる RNA分解を指向するアンチセンス DNAの場合は、イントロンを含む GPR40をコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の 相補鎖と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましく は約 95%以上の相同性を有するアンチセンス DNAがそれぞれ好適である。
[0065] 具体的には、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、 GenBank accession No. NM_194 057 (VERSION: NM_194057.1 GI:34610212)として登録されている塩基配列に相補 的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンス DNA、 好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンス DN Aなどが挙げられる。
[0066] GPR40をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的 な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス DNA (以下、「本発明のアンチセン ス DNA」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定された GPR40をコードする DNAの 塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。カゝかるアンチセンス DNAは、 GPR40遺伝 子の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンス DNAは、 GPR40遺伝子から転写される RNA (mRNAまたは初期転写産物）とハイブリダィズする ことができ、 mRNAの合成 (プロセッシング)または機能（蛋白質への翻訳）を阻害する ことができる。
[0067] 本発明のアンチセンス DNAの標的領域は、アンチセンス DNAがハイブリダィズする ことにより、結果として GPR40蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに 特に制限はなぐ該蛋白質をコードする mRNAの全配列であっても部分配列であって もよぐ短いもので約 10塩基程度、長いもので mRNAまたは初期転写産物の全配列が 挙げられる。具体的には、 GPR40遺伝子の 5'端ヘアピンループ、 5'端 6-ベースペア ピート、 5'端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、 ORF翻訳終止コド ン、 3'端非翻訳領域、 3'端パリンドローム領域または 3'端ヘアピンループなどが、ァ ンチセンス DNAの好まし!/、標的領域として選択しうる力 GPR40遺伝子内の如何なる 領域も対象として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とするこ とちでさる。
さらに、本発明のアンチセンス DNAは、 GPR40の mRNAもしくは初期転写産物とハイ ブリダィズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなぐ二本鎖 DNAである GPR40遺伝 子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、 RNAの転写を阻害し得るものであって もよい。あるいは DNA:RNAノヽイブリツドを形成して RNaseHによる分解を誘導するもの であってもよい。
[0068] GPR40をコードする mRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産 物の場合はイントロン部分を含む)で特異的に切断し得るリボザィムをコードする DNA もまた、本発明のアンチセンス DNAに包含され得る。リボザィムとして最も汎用性の高 V、ものとしては、ウイロイドやウィルソイド等の感染性 RNAに見られるセルフスプライシ ング RNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型 は約 40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両 端の数塩基ずつ (合わせて約 10塩基程度)を mRNAの所望の切断部位と相補的な配 列にすることにより、標的 mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイ プのリボザィムは、 RNAのみを基質とするので、ゲノム DNAを攻撃することがないとい うさらなる利点を有する。 GPR40 mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、 RNAへ リカーゼと特異的に結合し得るウィルス核酸由来の RNAモチーフを連結したハイプリ ッドリボザィムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)]。さらに、転写産物の細胞質への移行を 促進するために、 tRNAを改変した配列をさらに連結したノ、イブリツドリボザィムとする こともできる [Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)]。
[0069] 本明細書においては、 GPR40の mRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部 分配列 (初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なオリゴ RNAとその相 補鎖と力 なる二本鎖 RNA、いわゆる単鎖干渉 RNA(siRNA)もまた、本発明の KD動 物作製のために用いることができる。 siRNAを細胞内に導入するとその RNAに相同な mRNAが分解される、いわゆる RNA干渉（RNAi)と呼ばれる現象は、以前から線虫、 昆虫、植物等で知られていた力 この現象が動物細胞でも広く起こることが確認され て以来 [Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザィムの代替技術として汎用され ている。 siRNAは標的となる mRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（ 例： RNAi Designer; Invitrogen)を用いて適宜設計することができる。
[0070] 本発明のアンチセンスオリゴ DNA及びリボザィムは、 GPR40の cDNA配列もしくはゲ ノミック DNA配列に基づいて mRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、巿販 の DNA/RNA自動合成機（アプライド ·バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて 、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。合成されたアンチ センスオリゴ DNAまたはリボザィムは、必要に応じて適当なリンカ一（アダプター）配列 を介して発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、アンチセンスオリ ゴ RNAまたはリボザィムをコードする DNA発現ベクターを調製することができる。ここ で用いられ得る発現ベクターとしては、本発明の Tg動物において上記した通りのもの が同様に好ましく例示される。
より長いアンチセンス RNA (例えば、 GPR40 mRNAの相補鎖全長など）をコードする DNA発現ベクターは、常法によりクローユングした GPR40 cDNAを、必要に応じて適 当なリンカ一（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に逆方 向に挿入することにより調製することができる。
一方、 siRNAをコードする DNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードする DNA として別個に合成し、それぞれを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製す ることができる。 siRNAの発現ベクターとしては、 U6や HIなどの Pol III系プロモーター を有するものが用いられ得る。この場合、該ベクターが導入された動物細胞内で、セ ンス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ転写されてアニーリングすることにより、 siRNAが 形成される。 shRNAはセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しう る長さ（例えば 15力 25塩基程度）を間に挿入したユニットを適当な発現ベクター中 に挿入することにより調製することができる。 shRNAの発現ベクターとしては U6や HIな どの Pol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを 導入された動物細胞内で転写された shRNAは、自身でループを形成した後に、内在 の酵素ダイサー（dicer)などによってプロセシングされることにより成熟 siRNAが形成さ れる。あるいは、 Pol II系プロモーターで、ターゲットの siRNA配列を含むマイクロ RNA (miRNA)を発現させて RNAiによりノックダウンを達成することも可能である。この場合 には組織特異的発現を示すプロモーターにより、組織特異的ノックダウンも可能とな る。
GPR40のアンチセンス RNA、 siRNA、 shRNA、もしくは miRNAをコードする DNAを含 む発現ベクターを細胞に導入する方法としては、本発明の Tg動物において上記した いずれかの方法が、標的細胞に応じて適宜用いられる。例えば、受精卵などの初期 胚への導入については、マイクロインジェクション法が用いられる。また、 ES細胞への 導入については、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクト口ポレーシヨン法、リポフエクシ ヨン法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン 法、 DEAE-デキストラン法などが用いられ得る。あるいは、ベクターとしてレトロウィル スゃレンチウィルスなどを用いる場合には、初期胚ゃ ES細胞にウィルスを添カ卩して 1 〜2日培養し、該細胞を該ウィルスに感染させることにより、簡便に遺伝子導入を達 成し得る場合がある。
[0072] 初期胚、 ES細胞からの個体再生 (フアウンダ一の樹立）、継代 (ホモ接合体の作製） 等は、本発明の Tg動物において上記したと同様の方法により行うことができる。
[0073] 129/sv/Evマウス由来の ES細胞をもとに作製された本発明の KOマウス
を C57BL/6Jマウスに戻し交配して得られたコンジエニック系のマウスでは、野生型マ ウスと比較して顕著な表現型を認めな力つた。
[0074] 本発明の KO動物が、 GPR40遺伝子内にレポーター遺伝子を挿入することにより該 遺伝子を破壊して作製され、該レポーター遺伝子が GPR40遺伝子の内在性のプロモ 一ターの制御下にある位置に挿入されている場合、該動物またはその生体の一部に 被験物質を適用し、レポーター遺伝子の発現を検出することにより、 GPR40遺伝子に 対するプロモーター活性の調節薬をスクリーニングすることができる。レポーター遺伝 子としては、例えば、ルシフェラーゼ、ペルォキシダーゼ、緑色蛍光蛋白質（GFP)、 アルカリフォスファターゼ、 13 -ガラタトシダーゼ等をコードする DNAが挙げられるが、 これらに限定されない。レポーター活性は、用いられるレポーター遺伝子に応じて、 それぞれ自体公知の方法により測定することができる。
被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、 DNAライブラリーなどの 他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ゥシ、ヒッジ、サル、ヒトなど）の 組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
被験物質を適用していない動物またはその生体の一部と比較して、レポーター活 性に有意な差が認められた場合、該被験物質を GPR40遺伝子のプロモーター活性 を調節する物質として選択することができる。
[0075] 該スクリーニング法により選択された GPR40プロモーター活性増強薬は、上記 GPR4 0作動薬と同様の効果をもたらし得るので、糖尿病 (I型および II型)、耐糖能障害、高 脂血症、代謝性症候群などの疾患に対する予防'治療剤、脾臓機能調節剤 (例、脾 臓機能改善剤)、インスリン分泌促進剤、血糖低下剤、脾 β細胞保護剤として有用で ある。その他、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病 性網膜症、動脈硬化、性機能障害、皮膚疾患、関節症、骨減少症、血栓性疾患、消 化不良、記憶学習障害などの疾患に対する予防'治療剤としても使用することができ る。該活性増強薬は、 GPR40作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは 非経口的に哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、 ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど）に投与することができる。
[0076] 該 GPR40プロモーター活性増強薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート などにより異なる力 例えば、糖尿病の治療目的で経口投与する場合、一般的に成 人（体重 60kg)においては、一日にっき約 O.lmg〜約 100mg、好ましくは約 1.0〜約 50 mg、より好ましくは約 1.0〜約 20mgである。非経口投与の場合、当該調節薬の投与量 は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病の治療目的で注射 剤として成人 (体重 60kg)に投与する場合、一日にっき約 0.01〜約 30mg程度、好まし くは約 0.1〜約 20mg程度、より好ましくは約 0.1〜約 10mg程度である。投与対象がヒト 以外の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
[0077] 該スクリーニング法により選択された GPR40プロモーター活性抑制薬は、上記 GPR4 0拮抗薬と同様の効果をもたらし得るので、肥満、高脂血症、 II型糖尿病、インスリン 抵抗性症候群などの疾患に対する予防'治療剤、脾臓機能調節剤 (例、脾臓機能改 善剤）、インスリン分泌抑制剤、血糖上昇剤として有用である。その他、低血糖症、高 血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、不安定糖尿病 、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、インスリノ一マ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒 性、癌などの疾患に対する予防'治療剤としても使用することができる。該活性抑制 薬は、 GPR40作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺 乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネ コ、ィヌ、サルなど）に投与することができる。
[0078] 該 GPR40プロモーター活性抑制薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート などにより異なるが、例えば、肥満の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（ 体重 60kg)においては、一日にっき約 O.lmg〜約 100mg、好ましくは約 1.0〜約 50mg、 より好ましくは約 1.0〜約 20mgである。非経口投与の場合、当該調節薬の投与量は投 与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満の治療目的で注射剤として 成人 (体重 60kg)に投与する場合、一日にっき約 0.01〜約 30mg程度、好ましくは約 0. 1〜約 20mg程度、より好ましくは約 0.1〜約 10mg程度である。投与対象がヒト以外の動 物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
[0079] 本発明の Tg動物は、外来性 GPR40に対する被験物質の作用を定量的に測定可能 な程度に外来性 GPR40の発現量が確保される限り、内在性 GPR40の発現について は特に制限はない。し力しながら、例えば、外来性 GPR40が内在性 GPR40に対して 異種であり、本発明の Tg動物を該異種 GPR40だけでなく内在性 GPR40にも作用し得 る薬剤の評価に使用する場合は、内在性 GPR40の発現を不活性ィ匕することが望まし い。内在性 GPR40の発現が不活性ィ匕された本発明の Tg動物は、公知の方法 (例え ば、上記非特許文献 3参照)または本明細書にぉ 、て上述した方法により選択される GPR40遺伝子がノックアウトされた ES細胞、あるいは該 ES細胞から上記の方法に従つ て作製される GPR40 KO動物由来の初期胚もしくは ES細胞に、上記の方法に従って 異種 GPR40をコードする DNAを導入することによって得ることができる。あるいはまた 、内在性 GPR40の発現が不活性ィ匕された本発明の Tg動物は、上述のように、アンチ センスもしくは RNAi技術により GPR40遺伝子の発現が不活性ィ匕された KD動物由来 の初期胚もしくは ES細胞に、上記の方法に従って異種 GPR40をコードする DNAを導 人すること〖こよっても得ることができる。
[0080] また、内在性 GPR40の発現が不活性ィ匕し、異種 GPR40のみを発現する Tg動物は、 内在性 GPR40をノックアウト (もしくはノックダウン)された動物と、上述の外来性 (異種 ) GPR40を導入された、該 KO (もしくは KD)動物と同種の動物とを交配することによつ ても得ることができる。例えば、内在性 GPR40ホモ欠損（- /- )マウスと、ヒト GPR40Tg (+ /-)マウスとを交配して得られる産仔（内在性 GPR40ヘテロ欠損 (+/-) ·ヒト GPR40へテ 口 Tg (+/-)マウス）の雌雄同士をさらに交配して、ヒト GPR40 Tg (+/- )およびマウス GP R40の欠損が確認されたマウスを選択することにより、内在性 GPR40 (-/_) 'ヒト GPR40 Tg (+/-)マウスを作製することができる。
[0081] あるいは、内在性 GPR40の発現が不活性ィ匕された Tg動物は、相同組換えを用いた 遺伝子ターゲッティングにより異種 GPR40をコードする DNAで内在性 GPR40遺伝子を 置換したノックイン（KI)動物であってもよ 、。 [0082] KI動物は KO動物と基本的に同様の手法に従って作製することができる。例えば、 対象非ヒト哺乳動物由来の GPR40遺伝子の ORFを含む領域を適当な制限酵素を用 いて切除し、代わりに異種 GPR40遺伝子の対応する領域を挿入することにより得られ る DNAを含むターゲッティングベクターを、上記の方法に従って対象非ヒト哺乳動物 由来の ES細胞に導入し、相同組換えにより該動物の内在性 GPR40遺伝子座に異種 GPR40をコードする DNAが組み込まれた ES細胞クローンを選択すればよ!、。クローン 選択は PCR法やサザン法を用いて行なうこともできる力 例えば、ターゲッティングべ クタ一の GPR40遺伝子の 3，非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子等のポジティ ブ選択用マーカー遺伝子を挿入し、さらに標的配列と相同な領域の外側に HSV-tk 遺伝子やジフテリア毒素遺伝子等のネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入すれ ば、薬剤耐性を指標にして相同組換え体を選択することができる。
また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された異種 GPR40の発現を妨げる 場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端に ΙοχΡ配列もしくは frt配 列を配したターゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期に C reもしくは Flpリコンビナーゼまたは該リコンビナーゼ発現ベクター（例：アデノウイルス ベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出す ことが好ましい。あるいは、 Cre-loxP系や Flp-frt系を用いる代わりに、ポジティブ選択 用マーカー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該 配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出し てもよい。
[0083] 上記のようにして得られる、内在性 GPR40 KO/KD X異種 GPR40 Tg動物または KI 動物を用いて、上記の外来性 GPR40 Tg動物と同様に、 GPR40作動薬および拮抗薬 、あるいはインスリン分泌/耐糖能調節薬のスクリーニングを行うことができる。かかる KO/KD X Tg動物または KI動物は、内在性 GPR40を発現しな 、か無視し得る程度に 発現が低下して 、るので、異種 GPR40だけでなく内在性 GPR40に対しても作用する 薬剤についても、異種 GPR40に対する作用を定量的に評価することができる点で有 用である。
[0084] 本発明の Tg動物および本発明の KO/KD動物は、外来性 GPR40をコードする DNA を発現可能な状態で安定に保持すること (Tg動物）、内在性 GPR40遺伝子の発現が 不活性ィ匕されていること（KO/KD動物）に加えて、 GPR40の活性調節が関与する疾 患と同一もしくは類似の病態を生じさせるような、 1以上の他の遺伝子改変を有してい てもよい。
「GPR40の活性調節が関与する疾患」とは、 GPR40活性の異常に起因する力もしく は結果的に GPR40活性の異常を生じる疾患だけでなく、 GPR40活性を調節すること により予防および Zまたは治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握され るべさである。
例えば、 GPR40を活性ィ匕することにより予防 '治療可能な疾患として、糖尿病（I型お よび II型）、耐糖能障害、高脂血症、代謝性症候群、その他、ケトーシス、ァシドーシ ス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、動脈硬化、性機能障害、 皮膚疾患、関節症、骨減少症、血栓性疾患、消化不良、記憶学習障害などが、 GPR 40を阻害することにより予防，治療可能な疾患として、肥満、高脂血症、 II型糖尿病、 インスリン抵抗性症候群、その他、低血糖症、高血圧、糖尿病性神経障害、糖尿病 性腎症、糖尿病性網膜症、浮腫、不安定糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、 インスリノ一マ、動脈硬化、血栓性疾患、脂肪毒性、癌などがそれぞれ挙げられる。
[0085] 「他の遺伝子改変」としては、自然突然変異により内在性遺伝子に異常を有する自 然発症疾患モデル動物、他の遺伝子をさらに導入された Tg動物、 GPR40遺伝子以 外の内在性遺伝子を不活化された KO/KD動物 (挿入突然変異等による遺伝子破壊 のほか、アンチセンス DNAや中和抗体をコードする DNAの導入により遺伝子発現が 検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下した Tg動物を含む）、変異内在性遺 伝子が導入されたドミナントネガティブ変異 Tg動物などが含まれる。
[0086] 「GPR40の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上 の他の遺伝子改変を有する疾患モデル」としては、例えば、糖尿病モデルとして NO Dマウス（Makino S.ら、ェクスペリメンタル'アニマル（Exp. Anim.)、第 29卷、第 1頁、 1 980年）、 BBラット（Crisa L.ら、ダイアビーテイス'メタボリズム 'レヴュー（Diabetes Meta b. Rev.)、第 8卷、第 4頁、 1992年）、 ob/obマウス、 db/dbマウス（Hummel L.ら、サイエ ンス（Science)、第 153卷、第 1127頁、 1966年）、 KKマウス、 KKAyマウス、 GKラット（Go to Y.ら、トウホク 'ジャーナル'ォヴ'ェクスペリメンタル'メディシン（Tohoku J. Exp. Me d.)、第 119卷、第 85頁、 1976年）、 Zucker fattyラッ HZucker L.M.ら、ァ-ュアル'ォ ヴ'-ユーヨーク'ァカデミ一'ォヴ 'サイエンス（Ann. NY Acad. Sci.)、第 131卷、第 44 7頁、 1965年）、 ZDFラット、 OLETFラット（Kawano K.ら、ダイアビーテイス（Diabetes)ゝ 第 41卷、第 1422頁、 1992年）等が、肥満モデルとして ob/obマウス、 db/dbマウス、 KK マウス、 KKAyマウス、 Zucker fattyラット、 ZDFラット、 OLETFラット等力 高脂血症もし くは動脈硬化症モデルとして WHHLゥサギ (低比重リポ蛋白レセプター (LDLR)に変 異を有する； Watanabe Y.、ァテロースクレローシス（Atherosclerosis)、第 36卷、第 261 頁、 1980年）、 SHLM (apoE欠損変異を有する自然発症マウス； Matsushima Y.ら、マ ンマリアン.ゲノム（Mamm. Genome)、第 10卷、第 352頁、 1999年）、 LDLR KOマウス（ Ishibashi S.ら、ジャーナル'ォヴ'タリ-カル 'インヴエスティゲーシヨン（J. Clin. Invest. )、第 92卷、第 883頁、 1993年）、 apoE KOマウス（Piedrahita J.A.ら、プロシーデイング ズ'ォヴ'ナショナル'アカデミ^ ~ ·ォヴ 'サイエンシーズ 'ユーエスエー（Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA)、第 89卷、第 4471頁、 1992年）、ヒト apo Α·ヒト apoBダブル Tgマウス（Ca How M.J.ら、プロシーディングズ'ォヴ'ナショナル'ァカデミ一'ォヴ 'サイエンシーズ' ユーエスエー（proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第 91卷、第 2130頁、 1994年）等力 低血 糖モデルとして SPC2 KOマウス（Furuta M.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USAゝ第 94卷、 6646頁、 1997年）等が、脂肪肝モデルとして ob/obマウス（Herberg L.及び Coleman D 丄.、メタボリズム（Metabolism)、第 26卷、第 59頁、 1977年）、 KKマウス（Nakamura M. 及び Yamada K.、ダイアベトロジァ（Diabetologia)、第 3卷、第 212頁、 1967頁）、 FLSマ ウス（Soga M.ら、ラボラトリ一'ォヴ'アニマル'サイエンス（Lab. Anim. Sci.)、第 49卷、 第 269頁、 1999年）、虚血性心疾患モデルとして CD55. CD59ダブル Tgマウス（Cowan P.J.ら、 Xenotransplantation第 5卷、第 184-90頁、 1998年）等が、皮膚炎モデルとし てインターロイキン 1 Tgマウス（Groves R.W.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,第 92卷 、 11874頁、 1995年）等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体蛋白 質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとして beta SAD (beta S-Antilles- D Punjab) Tgマウス（Trudel M.ら、 EMBO J、第 10卷、 3157頁、 1991年）等が、性腺障 害モデルとして Steroidogenic factor 1 KOマウス（Zhao L.ら、 Development,第 128卷 、 147頁、 2001年）等力 肝臓癌モデルとして p53 KOマウス（Kemp C.J. Molecular Ca rcinogenesis,第 12卷、 132頁、 1995年）等が、乳癌モデルとして c- neu Tgマウス（Rao G.N.ら、 Breast Cancer Res Treat,第 48卷、 265頁、 1998年）等が、子宫内膜炎モデ ルとして perforin 'Fas— ligandダブル KOマウス（Spielman J.ら、 J Immunol. ,第 161卷、 7 063頁、 1998年）等が、知られている。
これらの「他の遺伝子改変を有する疾患モデル」は、例えば、米国の Jackson研究 所などから購入可能であるか、あるいは周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作製 することができる。
本発明の Tg動物または本発明の KO/KD動物に、 GPR40の活性調節が関与する疾 患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変を導入する方法 は特に制限はなぐ例えば、（1)本発明の Tg動物または本発明の KO/KD動物と、 GP R40の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の 遺伝子改変を有する同種の非ヒト哺乳動物とを交雑する方法； (2)GPR40の活性調節 が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変を 有する非ヒト哺乳動物の初期胚ゃ ES細胞に、上述の方法により外来性 GPR40をコー ドする DNAを導入して Tg動物を得る方法 (GPR40の活性調節が関与する疾患と同一 もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物の 初期胚ゃ ES細胞を上述の方法により処理し、内在性 GPR40遺伝子の発現を不活性 化して KO/KD動物を得る方法）； (3)外来性 GPR40をコードする DNAを導入された非ヒ ト哺乳動物の初期胚ゃ ES細胞に、上述の方法により、 GPR40の活性調節が関与する 疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変を導入する方 法（内在性 GPR40遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物の初期胚ゃ ES細胞に、上 述の方法により、 GPR40の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生 じさせる 1以上の他の遺伝子改変を導入する方法)等が挙げられる。また、 GPR40の 活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝 子改変が、外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳 動物の初期胚ゃ ES細胞に、該外来遺伝子等と外来性 GPR40をコードする DNA (また はターゲッティングベクター Zアンチセンス RNAもしくは siRNAをコードする DNA)とを 同時にもしくは順次導入して Tg (または KO/KD)動物を得てもよい。さらに、 GPR40の 活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝 子改変が内在性遺伝子の破壊による場合は、外来性 GPR40をコードする DNAを破壊 すべき内在性遺伝子にターゲッティングされ得るようにデザインして野生型非ヒト哺乳 動物の ES細胞に導入してもよい。この場合、ターゲッティングベクターは、内在性 GP R40遺伝子を破壊されるべき内在性遺伝子に置き換える以外は、上記の KI動物の作 製に関して例示したものが好ましく使用され得る。
[0088] 本発明の Tg動物または本発明の KO/KD動物と、 GPR40の活性調節が関与する疾 患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変を有する同種の 疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ま しい。例えば、外来性 GPR40をコードする DNAが 1遺伝子座に組み込まれたホモ接 合体マウスと、 db/dbマウス (糖尿病'肥満モデル）とを交雑して得られる Fは両遺伝
1 子についてヘテロである。この F同士を兄妹交配して得られる F個体の 1/16は外来
1 2
性 GPR40 (+/+) X db/dbとなる。
[0089] 本発明の Tg動物または本発明の KO/KD動物は、 GPR40の活性調節が関与する疾 患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の非遺伝的処理を施されていてもよ い。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処 理を意味する。このような処理としては、例えば、 STZなどの薬剤誘発処理、高脂肪食 負荷、糖負荷、絶食等の食餌的ストレス負荷、 UV、活性酸素、熱、血管結紮 Z再灌 流等の外的ストレス負荷などが挙げられるが、これらに限定されない。
[0090] 上記のように、本発明の Tg動物または本発明の KO/KD動物に他の遺伝子改変も しくは非遺伝的処理を施して得られる病態モデル動物は、該動物が発現する病態と 同一もしくは類似の病態を伴う疾患の予防 '治療効果を示す物質のスクリーニングに 用いることができる。即ち、該病態モデル動物またはその生体の一部に被験物質を 適用し、病態の改善を検定することにより、該病態と同一もしくは類似の病態を伴う疾 患の予防'治療物質を選択することができる。
具体的な病態としては、好ましくは、代謝性症候群にみられる症候、例えば、糖尿 病、インスリン抵抗性、耐糖能異常、肥満、高血圧、動脈硬化、高 TG血症、高 LDL- C血症、低 HDL-C血症等が挙げられる。
[0091] 具体的には、該スクリーニング方法では、上記病態モデル動物に被験物質を投与 する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、 DNAライブラリーな どの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ゥシ、ヒッジ、サル、ヒトなど )の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
被験物質を投与していない動物と比較して有意な病態の改善が認められた場合、 該被験物質を該病態を伴う疾患の予防，治療活性を有する物質として選択すること ができる。
[0092] 該スクリーニング法により選択された疾患予防 ·治療薬は、上記 GPR40作動薬と同 様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物 (例えば、ヒト、ラット 、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど）に投与 することができる。
[0093] 該予防'治療薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが 、例えば、糖尿病の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人 (体重 60kg)にお いては、一日にっき約 O.lmg〜約 100mg、好ましくは約 1.0〜約 50mg、より好ましくは 約 1.0〜約 20mgである。非経口投与の場合、当該予防'治療薬の投与量は投与対象 、対象疾患などによっても異なる力 例えば、糖尿病の治療目的で注射剤として成人 (体重 60kg)に投与する場合、一日にっき約 0.01〜約 30mg程度、好ましくは約 0.1〜 約 20mg程度、より好ましくは約 0.1〜約 10mg程度である。投与対象がヒト以外の動物 の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
[0094] 本発明の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
ほ己列番号： 1〕ヒト GPR40をコードする DNA(CDS)の塩基配列を示す。
ほ己列番号： 2〕ヒト GPR40のアミノ酸配列を示す。
[0095] 本願明細書にぉ 、て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Co mmission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用 略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。
DNA ：デォキシリボ核酸
cDNA ：相補的デォキシリボ核酸 A ：ァデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シトシン
RNA ：リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸 dATP ：デォキシアデノシン三リン酸 dTTP ：デォキシチミジン三リン酸 dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸 dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ：ドデシル硫酸ナトリウム
Gly ：グリシン
Ala ：ァラニン
Val ：パリン
Leu ：ロイシン
He ：ィソロイシン
Ser ：セリン
Thr ：スレ才ニン
Cys ：システィン
Met ：メチォニン
Glu ：グルタミン酸
Asp ：ァスパラギン酸
Lys ：リジン
Arg ：ァノレギニン
His ：ヒスチジン
Phe ：フエ二ルァラニン Tyr ：チロシン
Trp ：トリブトファン
Pro ：プロリン
Asn ：ァスノ ラギン
Gin ：グルタミン
pGlu ：ピログルタミン酸
Me ：メチル基
Et ：ェチル基
Bu ：ブチル基
Ph ：フエニル基
TC ：チアゾリジン— 4 (R)—カルボキサミド基
実施例
[0096] 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する力 本発明がこれらに限定 されな!/、ことは言うまでもな！/、。
[0097] 実施例 1 ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウス作出用発現ベクターの構築
ヒト GPR40遺伝子をマウス脾臓で高発現させるために、マウスインスリン IIプロモータ 一の下流に 3'非翻訳領域を含むヒト GPR40遺伝子を導入したプラスミド pISLM/GPR 40を以下のようにして作製した。
マウスゲノム DNA (クロンテック社製)から、 5，端に Hindlllおよび Mlul制限酵素部位 を含むプライマー (5， -ATTAGAAAGCTTACGCGTGAGAGATAGAGGAGGAGGG ACCATTAAGTG-3'；配列番号： 3)、 5'端に Sail制限酵素部位を含むプライマー（5 列番号： 4)、および、 KOD polymerase (東洋紡社製)を用いて 94°C 2 min→(94°C 15s ec→68°C 45sec) X 25回の条件にて PCRを行い、マウスインスリン IIプロモーターを 含む断片を pCR4- TOPO Blunt (インビトロジェン社製)にサブクローユングした。同様 に、ヒトゲノム DNA (クロンテック社製)から、 5'端に Sal淛限酵素部位を含むプライマ
TCTATGTGG- 3'；配列番号： 5)、 5， -TATGCACGCAAACACAAACTCTAT- 3，（配 列番号： 6)の配列を有するプライマー、および、 KOD polymerase (東洋紡社製)を用 いて 94°C 2 min→(94°C 15sec→68°C 3min) X 25回の条件にて PCRを行い、ヒト GP R40遺伝子コーディング領域および 3 '非翻訳領域を含む DNA断片を pCR4- TOPO Β lunt (インビトロジェン社製)にサブクローユングした。
マウスインスリン IIプロモーターをサブクローユングしたプラスミドを Hindlllと Sailで二 重消化し、得られた 673bpのマウスインスリン IIプロモーター断片を pCAN618 (WO 00/ 14226に記載）の Hindlllおよび Sail部位に導入した。次に、このプラスミドを Sailと Spel で二重消化した部位に、ヒト GPR40遺伝子コーディング領域と 3 '非翻訳領域をサブク ローニングしたプラスミドから Sailと Spelの二重消化で得られた 2256bpの DNA断片を 挿入し、マウスインスリン IIプロモーター制御下でのヒト GPR40遺伝子発現プラスミド pi SLII4/GPR40を作製した。これを大腸菌 DH5 aに導入して、形質転換体 Escherichia coli DH5 a /pISLII4/GPR40を得た。該菌株は 2005年 12月 1日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-10462として寄 託されている。
上記の PISLII4/GPR40を Mlul、 Kpnl、および、 Spelで三重消化した後、低融点ァガ ロースゲル（宝酒造社製）電気泳動にかけ、 2928bpの DNA断片を切り出した。 DNA断 片を Nucleotrap(日本ジェネティックス社製)で精製することにより、ヒト GPR40遺伝子発 現ユニットを含む DNA断片を取得した（図 1A)。
実施例 2 ヒト GPR40遺伝子トランスジヱニックマウスの作製
マイクロインジェクションによるトランスジエニックマウス作製は Hoganらの方法（Manip ulating the mouse emoryo, Cold bpnng Haroor Laboratory Press. 1994)に従って行 つた。実施例 1にて作製したヒト GPR40遺伝子発現ユニットを含む DNA断片は 1/10 T E溶液（ImM Tris-HCl, O. lmM EDTA, pH8.0)にて 1〜3.3 μ g/mlの濃度に調整した 。 C57BL/6J系統由来受精卵をミネラルオイルで覆われた M2培地のドロップ中に入れ てホールディングピペットで吸引固定し、上記の DNA溶液をインジェクションピペット に吸引し、マイクロマニピュレーター（ナリシゲ社製)を用いて受精卵の雄性前核に注 入した。インジェクションした受精卵を偽妊娠雌マウスに移植し、飼育した。得られた 産仔のうち、離乳した 154匹のマウスについて、 4週齢に達した時点で、尾力も DNAを 採取した。取得した DNAに対して、 5'- GGAGTGTGGTGCTTAATCCGCTGGT- 3' ( 配列番号： 7)および 5'- AGACTGCCTCCTCCTTCCCGTAAGTACAA- 3' (配列番 号： 8)の配列を有するプライマーセットを用いて PCRを行い、 27匹のトランスジェ-ッ クマウスを取得した。
実施例 3 ヒト GPR40遺伝子トランスジヱニックマウスの発現とゲノム解析
取得されたヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウスが 8週齢以降に達した段階で C 57BL/6J系統マウスと交配を行い、産仔を得て、実施例 2と同様の PCR法にてトランス ジェニックマウス個体を選別した。トランスジェニックマウス産仔について、 8週齢の脾 臓から ISOGEN (二ツボンジーン社製）を用いて、添付のプロトコールに従って total R NAを抽出した。得られた total RNA 1 μ gを、ランダムプライマーおよび Superscript II 逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて、 first strand cDNAを合成し、エタノール 沈殿後、 40 1の TEに溶解した。そのうち、 RNAで 25 ngに相当する cDNAを TaqMan 解析のテンプレートとした。プライマーとして、ヒト GPR40遺伝子の検出には、 Forward primer (5し GCCCGCTTCAGCCTCTCT— 3'；配列番号： 9)、 Reverse primer (5 '-GAG GCAGCCCACGTAGCA- 3'；配列番号： 10)、および、 FAM標識 TaqMan primer pro be (5，- TCTGCCCTTGGCCATCACAGCCT- 3'；配列番号： 11)のセットを用い、 Taq Man解析（TaqMan7700および 7700SDSソフトウェア、アプライドバイオシステムズ社製 )を実施した。コピー数算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のヒト GPR40 cDNA断片をゥエル当り 106コピーからゥエル当り 101コピーの対数 6点となるよ うにして測定した C値から作成した。
T
ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウス各系統の 8週齢での脾臓におけるヒト GPR 40遺伝子の発現を図 1Bに示す。調べたほぼすベての系統でヒト GPR40遺伝子の発 現が認められた。 14M系、 41M系、および 23F系を含む複数の系統に比べて、 47M系 および 81M系は高い発現レベルを示した。
上記 14M系、 41M系、 47M系、 81M系、および、 23F系のトランスジエニックマウス 5系 統について、ゲノム DNAをサザンノヽイブリダィゼーシヨン法により解析した。すなわち 、 5 μ gの DNAを EcoRIおよび Bglllで切断し、 1.0%ァガロースゲル電気泳動後、ナイ口 ンフィルターへ移した。このフィルターを、 DIG RNAラベリングキット（ロッシュ 'ダイァグ ノスティックス社製)で標識したヒト GPR40遺伝子含有 DNA断片のプローブと一晚ノ、ィ ブリダィズし、 2xSSC、 0.1%SDSにて室温で 2回洗浄し、次に 0.1xSSC、 0.1%SDSにて 68 °Cで 2回洗浄した。検出には DIG蛍光検出キット（ロッシュ 'ダイァグノスティックス社製 )を用いた。その結果、これら 5系統力も約 2.9 kbpのバンドが確認され、ヒト GPR40遺 伝子の導入が確認された。また、導入遺伝子が高コピーで染色体に組み込まれた系 統は 14M系、 47M系および 81M系であり、低コピーで染色体に組み込まれた系統は 2 3F系と 41M系であることもわ力つた。ヒト GPR40遺伝子発現量の成績と染色体に組み 込まれたコピー数の成績とはおおむね相関しており、高発現系統として 47M系を、標 準的な発現系として 23F系を選択し、以後の解析を行った。上記マウスは、 C57BL/6J 系統のマウスと交雑することにより、繁殖および維持を行った。
実施例 4 ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウスラ氏島における GPR40の遺伝子 発現
8週齢時から、トランスジエニックマウス 47M系、および、 23F系を 8週間低脂肪食（D1 2450B、 10 kcal% fat、リサーチダイエット社製）または高脂肪食（D12492、 60 kcal% fat 、リサーチダイエット社製）にて飼育した。 16週齢マウスに対して、十二指腸側を結紮 し、総胆管への力-ユレーシヨンを行い、 lmg/mlコラゲナーゼ溶液 (和光純薬社製） をマウス脾臓に注入した。充填された脾臓を切り出して、同コラゲナーゼ溶液中のチ ユーブに入れて 37°C 20分間振とうした。その後、 30秒間激しく混和し、 10%FBSを含 む Quenching buffer溶液 (0.001% DNaseI、 25mM HEPESを含む Hanks Balanced Salt Solution)で 20mlにメスアップした。溶液をシャーレに移し、 Quenching buffer溶液で 2 回洗浄後、ラ氏島を顕微鏡下でピペットにより回収し、検体に供する試料とした。各 個体から 100個程度のラ氏島を単離した。
単離したラ氏島を 18ゲージ針にて ISOGEN中でホモジナイズし、 total RNAを抽出し た。次に、 RNeasy Micro kit (キアゲン社製)を用いてさらに精製し、最後に DNase処理 により混在する DNAを除去した。 1 μ g以下の total RNAに対して、 First strand cDNA synthesis kit (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）を用いてプロトコールに従って cDNA合成を行い、 TaqMan解析のテンプレートとした。ヒト GPR40遺伝子の検出には 、実施例 3に記載したプライマーセットを用いて TaqMan解析を行った。マウス GPR40 遺伝子の検出には Assay on demand (アプライドバイォシステムズ社製)を、内部標準 である 18Sリボソーム RNA遺伝子の検出には Taqman Ribosomal RNA Control Reagen ts VIC Probeセット (アプライドバイォシステムズ社製)を用いた。コピー数算出に用い た検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のヒト GPR40 cDNA、マウス GPR40 cDN A、またはマウス 18Sリボソーム RNA遺伝子をコードする DNA断片をゥエル当り 106コピ 一からゥエル当り 103コピーの対数 4点となるようにして測定した C値から作成した。
T
図 2Aに示されるように、単離ラ氏島において、導入したヒト GPR40遺伝子は 47M系 および 23F系共に、トランスジ ニックマウスにのみ発現しており、その発現量は 47M において高ぐ脾臓における発現レベルと相関していた（図 1B参照)。また、 47M系お よび 23F系共に、低脂肪食負荷群のヒト GPR40遺伝子発現量と高脂肪食負荷群のそ れとの間に有意な差はなかった。一方、マウス内在性 GPR40遺伝子発現量について も、 47M系および 23F系共に対照マウスとトランスジエニックマウスとの間に有意な差は なぐ低脂肪食負荷群におけるマウス GPR40遺伝子発現量と高脂肪食負荷群におけ るそれもほぼ同じレベルであった（図 2B)。また、ラ氏島におけるヒト GPR40遺伝子発 現量はマウス内在性 GPR40遺伝子のそれに比べて 47M系で 70倍、 23F系で 30倍程 度の増大であり、作製されたトランスジエニックマウスが生理的にも十分な作用を有す ることが期待された。
実施例 5 ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウスの一般性状と耐糖能試験 トランスジエニックマウス 47M系と 23F系を、通常食（CE- 2、 12 kcal% fat、 日本クレア 社製）にて飼育した。体重測定後、眼底よりへノ リン処理済みキヤビラリ一（ドラモンド サイエンティフィックカンパ-一社製）にて採血し、遠心分離により血漿を取得した。 血漿成分にっ 、てグルコース値は富士ドライケム（富士フィルムメディカル社製）によ り測定し、インスリン値はモリナガインスリン ELISAキット (森永生科学研究所製）により 測定した。
耐糖能試験は以下のようにして実施した。即ち、絶食を開始してから 16時間後のマ ウス眼底力もへノ リン処理済みキヤビラリ一にて採血を行い、 0分目の試料とした。次 に、 10%グルコース溶液を体重 lkg当り lgとなるよう経口投与し、その 7.5分後、 15分後 、 30分後、 60分後、および、 120分後に眼底力 へノ リン処理済みキヤビラリ一にて採 血し、それぞれの時間の試料とした。これらの試料を遠心分離により、血漿成分を単 離し、グルコースおよびインスリン値を上記と同様にして測定した。
16週齢時の飽食時および絶食時の体重値は 47M系および 23F系共に、それぞれの 対照マウスとの間に差はな力つた (表 1)。絶食時の血漿グルコース値はトランスジェ ニックマウスにぉ 、て低 、傾向を示した（表 1 )。 16週齢時の 47M系および 18週齢時 の 23F系マウスについて耐糖能試験を実施したところ、 47M系および 23F系共に、トラ ンスジエニックマウスの血漿グルコース値は対照マウスのそれよりも低い値を示したの に対し、トランスジエニックマウスの血漿インスリン値は高い値を示した（図 3)。以上の 成績は、トランスジエニックマウスにおいては、インスリン分泌亢進に伴い、耐糖能が 良好になったことを示していると考えられる。 2系統のトランスジエニックマウスで同様 な成績が得られたことから、以後の解析には主に 47M系を用いた。
[表 1]
蒙
葡
Figure imgf000049_0001
実施例 6 ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウスの脂肪食負荷条件下での耐糖能 試験
高脂肪食条件下での影響を調べるため、トランスジエニックマウス 47M系につ 、て、 8週齢時力も 9週間低脂肪食（D12450B 10 kcal% fat,リサーチダイエット社製）、 45 k cal% fat含有の高脂肪食 (D12451、リサーチダイエット社製）、および、 60 kcal% fat含 有の高脂肪食 (D12492、リサーチダイエット社製）にて飼育後、 17週齢時マウスに対 して耐糖能試験を実施した。
図 4に示されるように、対照マウスにおける耐糖能は、低脂肪食負荷群よりも 45 kcal % fat含有の高脂肪食負荷群、および、 60 kcal% fat含有の高脂肪食負荷群において 悪化しており、高脂肪食効果が明確に現れていた。このとき、対照マウスとトランスジ エニックマウス 47M系とを比較すると、低脂肪食負荷群、 45 kcal% fat含有の高脂肪食 負荷群、および、 60 kcal% fat含有高脂肪食負荷群共に、トランスジエニックマウスの 耐糖能は対照マウスのそれよりも良好であることが判明した。いずれの場合もインスリ ン分泌はトランスジエニックマウスにおいて亢進傾向にあり、高脂肪食負荷群におい て顕著であった。このとき、インスリン感受性は対照マウスおよびトランスジエニックマ ウス間で大きな差はなかった。以上の成績は、トランスジエニックマウスではインスリン 分泌亢進を伴って耐糖能が良好になったことを示していると考えられる。また、高脂 肪食負荷群ではインスリン分泌亢進が顕著であることから、 GPR40遺伝子に基づく結 果であることが示唆された。
実施例 7 ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウス由来単離ラ氏島のグルコース刺 激時のインスリン分泌
トランスジェニックマウス 47M系由来単離ラ氏島のグルコース刺激に対するインスリ ン分泌を調べた。通常食で飼育した 10から 13週齢のマウスから、実施例 4で示した方 法によりラ氏島を単離した。 llmMグルコース、 ImM HEPES、および、 10%FBSを含む RPMI1640培地（インビトロジェン社製)で 16時間培養後、 1 mMグルコースおよび 0.2% BSAを含む Krebs Ringer bicarbonate buffer (116 mM NaCl、 4.7 mM KC1、 1.17 mM KH PO、 1.17 mM MgSO - 7H 0、 25 mM NaHCO、 2.52 mM CaCl、 24 mM HEPES
2 4 4 2 3 2
、 0.2% BSA)で 30分間培養した。次に、 3 mMグルコースまたは 16 mMグルコースを 含む Krebs Ringer bicarbonate bufferに置換して、 1時間培養した。パルミチン酸添 加実験の場合には、 1 ImMグルコースを含む Krebs Ringer bicarbonate bufferにパル ミチン酸を 0.5 mMとなるよう添加して 1時間培養した。培養後の培養上清について、 モリナガインスリン ELISAキット (森永生科学研究所製）によりインスリン量を測定した。 一方、培養後のラ氏島はソ-ケ一ター (ェムエス機器社製）により超音波破砕を行い 、 Quant- iT Picogreen ds DNA Assay kit (モレキュラープローブズ社製)により DNA 量を測定して、インスリン分泌量を補正した。
3 mMグルコース存在下でのインスリン分泌量は対照マウスと 47M系にお!/、て差は 認められなかった（図 5A)。それに対して、 16 mMグルコース存在下においては、 47 M系のインスリン分泌量は、対照マウスのそれよりも高かった（図 5A)。また、 GPR40の リガンドのひとつであるパルミチン酸の添加実験において、対照マウスのパルミチン 酸添加群のインスリン分泌量は、無添加群のそれよりも 1.5倍程度の上昇であつたの に対し、トランスジエニックマウスにおいては 6倍程度の上昇を示した（図 5B)。以上の 成績から、トランスジエニックマウス由来ラ氏島における高濃度グルコース刺激時のィ ンスリン分泌量は、対照マウスのそれよりも亢進していること、および、パルミチン酸に 対する反応性も対照マウスに比べて高いことが判明した。いずれも、 GPR40遺伝子高 発現に起因して ヽることが示唆される。
実施例 8 GPR40遺伝子欠損マウス作製のための相同組換え ES細胞体の取得
GPR40遺伝子ターゲッティングベクターは特許文献 3の実施例 21に記載済みであ る。また、該ベクターで形質転換した大腸菌、 Escherichia coli DH5 α /pGT- GPR40 は、 2002年 12月 11日から独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一に寄託番号 FERM BP-8259として寄託されている。
制限酵素 Notlで線状化した GPR40遺伝子ターゲッティングベクター gを ES細 胞（AB2.2 prime,レキシコン社製）に electroporationにより導入した。選択された G4 18耐性株 384クローンについて、 PCRにより相同組換え体候補株を選別した。即ち、 Primer #1、および、 #2 (#1 5し CAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCA- 3' (配列番号： 12 )はターゲッティングベクター中の Neor内の配列、 #2 5 -GCAGGTCCGAAATGGT CAGGTTTAGCA-3' (配列番号： 13)はターゲッティングベクターの 3，側アームの外 側の配列)、および、 LA Taq polymerase (宝酒造社製)を用いて、 94°C 1 min→(98°C 10sec→70°C 5min30sec) X 35回→ 72°C 10 minの PCRを行った。その結果、陽性 7 クローンおよび擬陽性 12クローンの計 19クローンについて、約 5.1kbpのバンドを 得た。このうち、陽性 7クローンを含む 10クローンについて、再度、同条件で PCRを 行ったところ、 No.85, 231, 247, 325, 373, 374、および 391の 7クローンが陽性であ つた o
次に、 GPR40遺伝子座への相同組換えの有無を調べるため、サザンノヽイブリダィゼ ーシヨンを行った。即ち、ターゲッティングベクターの 3，側アームの外側に存在する 1 .2kbpの SacI-EcoRI断片をプローブとして、 ES細胞の DNAを EcoRI消化した後、 サザンハイブリダィゼーシヨンを行った。これにより、 wild alleleからは 9.7Kbpの、 tar geted alleleからは 4.6kbpのバンドが得られる。また、ターゲッティングベクターの 5， 側アームの外側に存在する 0.9kbpの SacI-BamHI断片をプローブとして、 ES細胞の
DNAを Sad消化した後、サザンハイブリダィゼーシヨンを行った。これにより、 wild al leleからは 14.2Kbpのバンドが得られ、 targeted alleleからは 17.4kbpのバンドが得 られる。
先の PCR判定で陽性であった 7クローンを含む 9クローンについてサザンハイブ リダィゼーシヨンを実施した。 3，側アームについては以下のように行った。それぞれの クローンの DNAとマウスゲノム DNA 2 μ ξを EcoRIで消化した後、 0.4% TAEァガロ ースゲルにて電気泳動を行い、ナイロンフィルターにブロッテイングした。 3 '側アーム の外側の EcoRト Sad 1.2kbp DNA断片を [ α - 32P] dCTP(NEG513Z,デュポン社製） を用いてランダムプライム法 (Multiprime DNA labeling system RPN.1601Y,アマシャ ムフアルマシアバイオテク社製)によりラベルして、プローブとした。ハイブリダィゼーシ ヨンは hybridization buffer (0.5M Na+— phosphatebuffer pH.7.2, 7% SDS, 1%BSA, lm M EDTA)中で 65°C、ー晚行った。洗浄は最終的に 0.1 X SSC, 0.1% SDSで 20min X 2回洗浄し、 BAS2000(富士フィルム社製)を用いてオートラジオグラムをとつた。 5， 側アームについては、それぞれのクローンの DNAとマウスゲノム DNA 2 μ ξを Sacl で消化し、 5，側アームの外側の SacI-BamHI 0.9kbp DNA断片をプローブとして、先 と同様にサザンノヽイブリダィゼーシヨンを行った。その結果、 3 '側アーム領域で相同 組換えが起こった際に観察される 4.6kbpのバンド、および、 5 '側アーム領域で相同 組換えが起こった際に観察される 17.4kbpのバンドの両方が得られた No.85,231 ,247 ,325,373,および、 374の 6クローンが相同組換え体の候補株となった。しかしながら、 17.4kbpのバンドが各クローンによってへテロであったため、この領域についてさらに 解析した。 ターゲッティングベクターが相同組換え領域以外の染色体上に挿入されて ヽな ヽ 力 また相同組換え部位にタンデムに挿入されていないか、などを確認するために、 5，側アームの外側領域のサザンノヽイブリダィゼーシヨン解析に用いたメンブレンフィ ルターをリプローブした後、ターゲッティングベクター内の Neo1"領域に相当する 1.9k bpの BamHI-EcoRI断片をプローブとしてサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。こ のとき、相同組換え体が正しく 1コピー挿入された場合には、 17.4kbpのバンドが検 出される。 No.247, 373,および、 374クローンについては複数のバンドが観察された ことから、ターゲッティングベクターが非相同組換えによりゲノム上に挿入されている 可能性が考えられた。また、 No. 85クローンについては、バンドは 1本のみ得られた 力 他のクローンと比較してバンドが濃いことから、相同組換え領域にタンデムに組み 込まれた可能性が示唆された。最終的に、 17.4kbpのバンド 1本のみが得られた No. 231および 325の 2クローンを相同糸且換え体と判定した。
実施例 9 GPR40遺伝子ホモ欠損マウスの作製とホモ欠損マウスにおける GPR40遺 伝子発現
相同組換え ES細胞株 No.231を C57BL/6J系統マウス由来胚盤胞に注入した。注入 された胚盤胞を偽妊娠マウス卵管に移植して、キメラマウス 31匹を得た。 ES細胞寄与 率 50%以上の雄の高キメラ率を示すマウスについて交配を実施し、 106匹の ES細胞 由来マウスを取得することにより、生殖系列移行を確認した。これらのマウス尾力 ゲ ノム DNAを精製し、実施例 8に記載したプライマー #1および #2を用いた PCRによる 遺伝子型判定を行ったところ、 48個体がヘテロ欠損マウスであることが判明した。次 に、ヘテロ欠損マウス同士を交配することにより、得られた産仔の遺伝子型判定を以 下のようにして行った。尾力も調製した DNAを铸型として、実施例 8に記載したプライ マー #1およびプライマー #2を用いて、 94°C 1 min→(98°C 10sec→70°C5min30sec) X 25回→ 72°C 10 minの条件にて PCRを行った。ワイルドマウスの検体からはバンドが 検出されず、ヘテロ欠損マウスおよびホモ欠損マウスの検体からは約 5.1 kbpのバン ドが検出される。同様に、プライマー #3 (5'- GCCCGCCCTGCCCGTCTCA- 3' (配列 番号： 14)はマウス GPR40遺伝子の欠損した部分内の配列）およびプライマー ^ (S'- AACGTTCGATGCTCACCGCCGTCA- 3' (配列番号： 15)はターゲッティングベクタ 一の 3，側アームの外側の配列）を用いて、 94°C 1 min→ (98°C lOsec→ 70°C5min3 0sec) X 30回→ 72°C 10 minの条件にて PCRを行った。ホモ欠損マウスの検体からは バンドが検出されず、ワイルドマウスおよびへテロ欠損マウスの検体からは約 5.4 kbp のバンドが検出される。上記のようにしてワイルドマウス、ヘテロ欠損マウス、および、 ホモ欠損マウスを取得した。以後はホモ欠損マウス同士の交配により維持および繁 殖を行い、対照マウスはワイルドマウス同士の交配により維持および繁殖を行い、実 験に供した。
GPR40遺伝子ホモ欠損マウス、 GPR40遺伝子へテロ欠損マウス、および、対照マウ スについて、 8週齢の脾臓から ISOGENを用いて、添付のプロトコールに従って total R NAを抽出した。得られた total RNA 1 μ gを、ランダムプライマーおよび Superscript II 逆転写酵素を用いて、添付のプロトコールに従って first strand cDNAを合成し、エタ ノール沈殿後、 40 1の TEに溶解した。そのうち、 RNAで 25 ngに相当する cDNAをテ ンプレートとして、 TaqMan解析を実施した。マウス GPR40遺伝子の検出には、 Forwar d primer (5，-TTTGCGCTGGGCTTTCC - 3'；配列番号： 16)、 Reverse primer (5'-G CTGGGAGTGAGTCGCAGTT - 3'；配列番号： 17)、および FAM標識 TaqMan prime r probe (5し CCATCCGAGGCGCAGTGTCCC - 3'；配列番号： 18)のプライマーセッ トを用い、ァクチン遺伝子の検出には、 Forward primer (5 '-CGTGAAAAGATGACC CAGATCA - 3'；配列番号： 19)、 Reverse primer (5'- CACAGCCTGGATGGCTACG T - 3'；配列番号： 20)、および FAM標識 TaqMan primer probe (δ'-TGAGACCTTCA ACACCCCAGCCATG - 3'；配列番号： 21)のプライマーセットを用いた。コピー数の 算出に用いた検量線は、増幅領域全長を含む濃度既知のマウス GPR40遺伝子含有 プラスミド DNA、またはマウスァクチン遺伝子の一部の合成 DNA断片（シグマジエノシ
ゥエル当り 106コピーからゥエル当り 101コピーの対数 6点となるようにして測定した C値
T
から作成した。マウス GPR40遺伝子の発現レベルは、ァクチン遺伝子の発現レベル に対する比で表した。
図 6に示されるように対照マウスの脾臓においては、マウス GPR40遺伝子発現レべ ルが明確であつたのに対し、 GPR40遺伝子へテロ欠損マウス脾臓の発現レベルは対 照マウスのそれの約半分に低下しており、さらに、 GPR40遺伝子ホモ欠損マウス脾臓 での発現は消失していた。上記の成績から、これらマウスの発現レベルは、マウス GP R40遺伝子量と相関して 、ることが判明し、取得された GPR40遺伝子ホモ欠損マウス は、 GPR40遺伝子欠損に伴う表現型が観察されることが期待された。
次に、上記のへテロ欠損マウスまたはホモ欠損マウスを C57BL/6Jマウスと交配する ことにより、ヘテロ欠損マウスを取得した (第一世代目）。この交配を 5回繰り返して得 たへテロ欠損マウス (第五世代目）同士を交配して、対照マウスおよびホモ欠損マウ スを取得した。以後はへテロ欠損マウス同士の交配、または、対照マウス同士または ホモ欠損マウス同士の交配により、維持繁殖を行ない、実験に供した。
実施例 10 GPR40遺伝子ホモ欠損マウスの一般性状
GPR40遺伝子ホモ欠損マウスについて、 8週齢時から、 8週間低脂肪食（D12450B、 10 kcal% fat、リサーチダイエット社製）または高脂肪食（D12492、 60 kcal% fat、リサ一 チダイエット社製）にて飼育した。脂肪食負荷開始後から、体重測定を毎週実施し、 場合により血液パラメーターを測定した。即ち、眼底よりへノリン処理済みキヤビラリ 一にて採血を行い、遠心分離により血漿成分を取得し、実施例 5に記載した方法に より、血漿グルコース値および血漿インスリン値を測定した。 1日当りのカロリー摂取量 は以下のようにして測定した。測定開始前日に給餌金網上の餌の重量を測定し、次 の日に再度金網上の餌の重量とケージ中に散在した餌の重量を測定することにより 摂取した餌の重量を求め、各餌のカロリー量を乗じることにより、 1日当りのカロリー摂 取量を算出した。
低脂肪食負荷群および高脂肪食負荷群共に、 GPR40遺伝子ホモ欠損マウスの体 重値は、対照マウスのそれと同等であり（図 7Aと E)、カロリー摂取量も、対照マウスの それと差はなかった（図 7Bと F)。血漿グルコース値および血漿インスリン値は共に、 低脂肪食負荷群においても高脂肪食負荷群においても対照マウスとホモ欠損マウス との間に有意な差は認められなかった（図 7Cと Dと Gと!■[)。以上のこと力も GPR40遺 伝子ホモ欠損マウスの体重、カロリー摂取量、血漿グルコース値、および、血漿イン スリン値は対照マウスと大きな差がないと考えられた。 [0108] 実施例 11 GPR40遺伝子ホモ欠損マウスの耐糖能
GPR40遺伝子ホモ欠損マウスについて、 8週齢から 11週間低脂肪食（D12450B、 10 kcal% fat、リサーチダイエット社製）または高脂肪食（D12492、 60 kcal% fat、リサーチ ダイエット社製）にて飼育した。 19週齢時マウスに対して実施例 5と同様に、耐糖能試 験を実施した。
低脂肪食群および高脂肪食群共に、耐糖能は対照マウスとホモ欠損マウスとの間 で大きな差はなカゝつた。上記の成績から、 GPR40遺伝子欠損は耐糖能に影響を及ぼ さないと考えられた。
[0109] 実施例 12 ヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウスと GPR40遺伝子ホモ欠損マウス との交雑マウス
ヒト GPR40遺伝子のみを発現するマウスを作製するため以下のことを行った。即ち、 実施例 3で取得されたヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウス 47M系と実施例 9で 取得された GPR40遺伝子ホモ欠損マウスとを交雑することにより、ヒト GPR40遺伝子を 保持し、かつ、マウス GPR40遺伝子欠損がヘテロ接合体を示す個体を取得した。上 記で得られた雄のトランスジエニックマウスに対しては、雌の GPR40遺伝子ホモ欠損 マウスを、雌のトランスジエニックマウスに対しては雄の GPR40遺伝子ホモ欠損マウス を交雑して、ヒト GPR40遺伝子を保持し、かつ、マウス GPR40遺伝子欠損がホモ接合 体である交雑マウス（47M TgxKO)を取得した。このとき、 GPR40遺伝子欠損がホモ 接合体でヒト GPR40遺伝子を持たな ヽ対照マウス (NonTgxKO)も同時に取得された。 以後は、 47M TgxKOと NonTgxKOとを交雑して得たマウスに対してヒト GPR40遺伝子 の有無を判定することにより、 47M TgxKOおよび NonTgxKOを選別した。ヒト GPR40遺 伝子トランスジエニックマウス 23F系についても、上記と同様にして、ヒト GPR40遺伝子 を保持し、かつマウス GPR40遺伝子欠損がホモ接合体となる交雑マウス（23F TgxKO )とその対照マウス（NonTgxKO)を作製した。 47M TgxKOと 23F TgxKOマウスはマウ ス GPR40遺伝子発現が消失し、ヒト GPR40遺伝子のみを発現して ヽる性質を有する マウスであると考えられる。
[0110] 実施例 13 KKAyマウスの遺伝背景を有するヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウ ス GPR40遺伝子高発現が高血糖および肥満を呈する KKAyマウスに及ぼす影響を調 ベるため、 KKAyマウスの遺伝背景を有するヒト GPR40遺伝子トランスジエニックマウス を作製した。即ち、実施例 3で取得されたヒト GPR40遺伝子トランスジヱニックマウス 47 M系と KKAyマウスとを交雑することにより、ヒト GPR40遺伝子を保持し、かつ、毛色から Ay遺伝子を有するマウス (47M Tg/KKAy)を取得した。このとき、ヒト GPR40遺伝子を 保持するが、 Ay遺伝子を有さないマウス (47M Tg/KK)の取得も行った。同様にして、 23F Tg/KKAy、および 23F Tg/KKも作製した。いずれの場合も NonTg/KKAyおよび N onTg/KKをそれぞれの対照マウスとした。
産業上の利用可能性
[0111] 本発明の Tgおよび KO/KD動物は、正常な GPR40機能をより反映した表現型を示 すので、インビボでの GPR40作用調節薬のスクリーニング '薬効評価系として有用で ある。
[0112] 本発明を好ま U、態様を強調して説明してきたが、好ま 、態様が変更され得るこ とは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載され た以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の 範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願 2006-022913を基礎としており、そこに開示さ れる内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許お よび特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたこ とによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
Figure imgf000058_0001
下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物村料に関連している
段落番号 0105
寄託の表示
寄託機閉の名称 I P0D (独)産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 ( I P0D)
寄？操関のあて名 曰本国 〒305- 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6
寄託の日付 2002年 12月 11曰 (1 1. 12. 2002)
受託番号 I POD FERM ΒΡ-8259
この表示を行うための指定国 すべての指定国
下記の表示は発明の詳細な説明中に記 ¾
された微生物又は生物材料に閣連している
段落番号 0097
寄託の表示
寄託機関の名称 I P0D (独)産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 ( I P0D)
寄託機関のあて名 曰本国 〒305- 8566茨城県つくぱ市東 1丁目 1番地 1 中央第 6
寄託の日付 2005年 12月 01日 (01. 12. 2005)
受託番号 I POD FERM BP- 10462
この表示を行うための指定国 すべての指定国
受理官庁記入欄
この用紙は国際出願とともに受理した
(はい/いいえ）
権限のある職員 国際事務局記入攔
この用紙が国際 務局に受理された曰
】 権限のある職負
達替 え撥鈹（規則 26)

Claims

請求の範囲 [I] 外来性 GPR40をコードする DNAを発現可能な状態で保持するトランスジエニック マウスであって、対応する非トランスジエニックマウスと比較して
(1)インスリン分泌能が増大している、および/または
(2)耐糖能が改善されている
ことを特徴とするマウスまたはその生体の一部。
[2] 外来性 GPR40をコードする DNAがインスリンプロモーターの制御下にある請求項
1記載のマウスまたはその生体の一部。
[3] 外来性 GPR40が配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を有する請求項 1記載のマウスまたはその生体の一部。
[4] 請求項 1記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、 GPR40ァゴ 二スト活性または GPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴とする GPR40ァゴ 二ストまたは GPR40アンタゴ-ストのスクリーニング方法。
[5] 請求項 1記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、（1)インスリ ン分泌および/または（2)耐糖能を測定することを特徴とする、（1)インスリン分泌お よび Zまたは (2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法。 _
[6] インスリンプロモーターの制御下にある外来性 GPR40をコードする DNAを保持す るマウスの受精卵。
[7] 外来性 GPR40がマウスにとって異種であり、かつ内在性 GPR40遺伝子発現不全 である請求項 1記載のマウスまたはその生体の一部。
[8] 異種 GPR40がヒト由来である請求項 7記載のマウスまたはその生体の一部。
[9] 請求項 7記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、 GPR40ァゴ 二スト活性または GPR40アンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種 GPR4 0ァゴニストまたは異種 GPR40アンタゴニストのスクリーニング方法。
[10] 請求項 7記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、 (1)インスリ ン分泌および/または (2)耐糖能を測定することを特徴とする、異種哺乳動物におけ る（1)インスリン分泌および Zまたは（2)耐糖能調節薬のスクリーニング方法。
[II] 請求項 1記載のマウスと他の病態モデルマウスとの交配によって生じる病態モデル
蘧簪ぇ爾弒（親節 マウスまたはその生体の一部。
[12] . 請求項 1記載のマウスに対する薬剤誘発またはストレス負荷によって生じる病態モ デルマウスまたはその生体の一部。
[13] 請求項 11または 12記載のマウスまたはその生体の一部に試験化合物を適用し、 病態の改善を検定することを特徴とする該病態を伴う疾患の予防'治療物質のスクリ 一ユング方法。
[14] 病態もしくは疾患が、代謝性症候群またはその 1以上の症候である請求項 13記載 の方法。 .
鎏簪え爾弒 (ΜΙ82β)
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