WO2007077899A1 - 樹脂製プレートおよびその製造方法並びに樹脂製プレートを備える細胞培養容器 - Google Patents

樹脂製プレートおよびその製造方法並びに樹脂製プレートを備える細胞培養容器 Download PDF

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WO2007077899A1
WO2007077899A1 PCT/JP2006/326156 JP2006326156W WO2007077899A1 WO 2007077899 A1 WO2007077899 A1 WO 2007077899A1 JP 2006326156 W JP2006326156 W JP 2006326156W WO 2007077899 A1 WO2007077899 A1 WO 2007077899A1
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WO
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pattern
resist
resin
substrate
resin plate
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/326156
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English (en)
French (fr)
Inventor
Taiji Nishi
Takenori Kitani
Seiichi Kanai
Naoto Fukuhara
Go Tazaki
Motohiro Fukuda
Original Assignee
Kuraray Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Kuraray Co., Ltd. filed Critical Kuraray Co., Ltd.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B5/00—Optical elements other than lenses
    • G02B5/30—Polarising elements
    • G02B5/3083—Birefringent or phase retarding elements

Definitions

  • Resin plate method for producing the same, and cell port provided with resin plate
  • the present invention relates to a resin plate suitable for observation with a differential interference microscope used in the field of biochemistry and a method for producing the same.
  • a cell culture container provided with the resin plate.
  • Observation targets for biochemical-related applications vary in thickness, from thick ones such as nematodes to thin ones such as cultured cells.
  • thick ones such as nematodes
  • thin ones such as cultured cells.
  • the demand for polarizing microscopes and differential interference microscopes is increasing, such as looking at the details of thick specimens and looking at thin specimens with good contrast.
  • the light from the light source does not transmit and appears black.
  • the direction of light oscillation may rotate depending on the sample, so that transmitted light may be visible.
  • the one in which this is incorporated into a microscope is a polarizing microscope.
  • the differential interference microscope can observe the difference in refractive index when light passes through an unstained specimen and the optical path difference (difference in how light travels) due to the shape of the specimen surface by changing the contrast between light and dark. it can.
  • the illumination light can be divided into two light beams, and the sample can be viewed with a three-dimensional effect that raises the sample with the interference color and contrast of light and darkness caused by the interference of these lights.
  • the light from the microscope light source is aligned with the light oscillation direction by a polarizer.
  • the vibration direction is divided into two components that are orthogonal.
  • the divided light passes through different parts of the specimen.
  • a phase shift occurs between the two light beams.
  • contrast is generated in the observed image, and the microstructure of the specimen can be observed. In other words, it can be observed without staining even a living microorganism or a transparent sample, and is used in many fields related to biochemistry such as medicine and biology.
  • the differential interference microscope is an optical system using polarized light. For this reason, when a normal plastic material with large optical distortion is used as the support plate for the specimen, the polarization state of the observation light is affected by a cause different from that caused by the specimen, so that the contrast of differential interference is significantly reduced. . Therefore, the conventional plastic material has a problem that it cannot be used as a specimen support plate.
  • a glass petri dish or a commercially available glass bottom petri dish with a cover glass attached to the bottom is used.
  • the glass petri dish has a problem that the objective lens is in contact with the bottom of the petri dish when performing high magnification observation because the thickness of the bottom of the glass petri dish is as thick as 0.5 mm to Lmm, for example. It was.
  • a commercially available glass bottom petri dish is made by attaching a force bar glass of, for example, 0.1 mm to 0.5 mm on the bottom of a plastic petri dish.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-121442, paragraphs 0073-0084
  • the present inventors have determined that a phase difference between light, particularly ultraviolet light, and light having a wavelength of 633 nm due to birefringence (hereinafter, this is simply referred to as retardation).
  • retardation a phase difference between light, particularly ultraviolet light, and light having a wavelength of 633 nm due to birefringence
  • the present invention has been completed by finding that it is possible to obtain a resin plate suitable for use in the field of biochemistry for the purpose of differential interference microscope observation. .
  • the light transmittance in the wavelength region of 300 nm or more and 800 nm or less is 80% or more, and the phase difference (retardation) of the light of wavelength 633 nm due to birefringence is 30 nm or less.
  • This is a resin-made plate used for differential interference microscope observation for biochemical-related applications.
  • the thickness of the bottom, 0.02Mm ⁇ 0. 3m in the range of m Yogu area with lmm 2 or less, and the depth may have a plurality of spatial structure of 10 m or more on the surface.
  • the present invention is a method for producing the above-mentioned greasible plate used for differential interference microscope measurement in the field of biochemistry, comprising the steps of forming a resist pattern on a substrate, and forming on the substrate. Metal is attached in accordance with the resist pattern formed or the transfer pattern thereof to form a metal structure having a pattern opposite to the uneven pattern of the resin plate, and the uneven pattern of the metal structure is transferred. And a step of forming a resinous resin plate. A method of manufacturing a resinous resin plate used for fluorescence analysis in the field of biochemistry.
  • the resist layer is formed a plurality of times until the step force resist layer for forming the resist pattern is formed into a structure having a desired height or depth.
  • the step of repeating the exposure may be included.
  • the pattern position of each layer in the exposure A mask alignment step for aligning the positions of the patterns so as to be the same position may be further provided.
  • the step of forming a resist pattern on the substrate when the formation and exposure of the resist layer are repeated several times, By using a mask with a different pattern, a resist pattern having a spatial structure with at least two different depths may be formed.
  • the present invention is a cell culture container provided with the above-mentioned resin plate on the bottom surface.
  • a resin-made plate suitable for observing the microstructure of a biopolymer with a differential interference microscope in the biochemical field can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a knock ground measurement result obtained by observation with a differential interference microscope in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing a background measurement result by observation with a differential interference microscope in Comparative Example 1.
  • FIG. 3 is a view showing an uneven pattern forming a spatial structure of the surface of the resin-made plate in the example of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic view showing a step of forming a resinous resin plate in an example of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing the background of a resin-made plate of Comparative Example 3 as observed by a differential interference microscope.
  • a high value is necessary for observing fluorescence (fluorescence emission light) or measuring fluorescence intensity.
  • fluorescence emission light fluorescence emission light
  • measuring fluorescence intensity even when the observation side force of the resin plate is irradiated with excitation light, if the light transmittance of the resin plate is low, problems such as temperature increase due to light absorption are likely to occur. It is important that the light transmittance including the ultraviolet region is high.
  • the light transmittance is 80% or more in the wavelength region of 300 nm or more and 800 nm or less including the ultraviolet region.
  • the resin plate does not contain an ultraviolet absorber.
  • materials that have a benzene ring in their chemical structure such as PC (polycarbonate) and polystyrene.
  • other components include antioxidants, viscosity improvers, Among additives such as heat stabilizers and anti-sticking agents, it is necessary that no UV absorber is included.
  • Autofluorescence is a phenomenon in which polymer molecules absorb ultraviolet and visible light, then emit light and emit fluorescence themselves. While glass plates do not emit autofluorescence, many of the resin plates emit autofluorescence, which makes it impossible to identify the fluorescence generated from the sample (fluorescence emission light). The characteristic trace analysis was impossible.
  • the material does not include PC (polycarbonate), polystyrene, or the like that has a benzene ring in its chemical structure.
  • the other components should contain no UV absorbers among additives such as UV absorbers, antioxidants, viscosity improvers, heat stabilizers, and anti-sticking agents.
  • additives such as UV absorbers, antioxidants, viscosity improvers, heat stabilizers, and anti-sticking agents.
  • Birefringence means that when light passes through a material with a different refractive index depending on the vibration direction of the light, it is divided into two rays (normal and extraordinary) by the anisotropy of the refractive index of the material.
  • the differential interference microscope is a method of observing the microstructure of a specimen by using two lights with different light vibration directions, that is, polarized light, and their interference.
  • the phase of the reference light divided into two by polarization is mutually different.
  • the measurement becomes difficult because of the difference. Therefore, as a resin plate used for differential interference microscope observation, it is important that the material does not have anisotropy, the chemical structure does not have a benzene ring, and the thickness of the plate is within a certain range. This makes it possible to increase the applicability of the retardation within a small fixed range.
  • the retardation is indicated by the value of a single path in which 633 nm light is vertically incident.
  • the retardation In order to perform good differential interference microscope observation, the retardation needs to be 30 nm or less, and preferably 20 nm or less. In order to reduce the retardation value, it is effective to optimize the molding method in addition to using a material with low anisotropy. For example, when molding such as a melt extrusion method is performed, polymer molecules are oriented by extrusion and subsequent stretching. It is well known that birefringence occurs in the alignment direction when molecules are aligned. In order to reduce the influence of the orientation of polymer molecules, it is effective to reduce the thickness and the transmission distance itself. In addition, it can be produced by a cast molding method or the like that minimizes the molecular orientation during molding. In addition, as a method of relaxing the molecular orientation during extrusion, it is also possible to use relaxation reduction by reheating, and it is desirable to select the reproducibility of the engineering technology and the cost of the cost as appropriate.
  • the resin-made plate used for differential interference microscope observation in the biochemical field has a plurality of spatial structures on the surface having an area of lmm 2 or less and a depth of 10 m or more.
  • a more preferable spatial structure area is 0.5 mm 2 or less, and a more preferable spatial structure depth is 50 m or more.
  • the number of spatial structures can be selected as appropriate according to the purpose of cell culture, measurement, etc., but it is required to be as large as the constraints on the equipment and manufacturing allow, for example, 24 or more, preferably 100 The above is preferable.
  • By having a spatial structure on the surface it can be suitably used for applications such as high-throughput screening, and at the same time, the morphology and properties of cultured cells are closer to those in vivo. V, expected to be something.
  • a method for obtaining a resin-made plate used for differential interference microscope observation in the biochemical field having a plurality of spatial structures on the surface that is, a step of forming an uneven pattern on the substrate, A metal is adhered according to the uneven pattern formed on the substrate or a transfer pattern thereof to form a metal structure having a pattern opposite to the structure pattern of the resin plate, and the pattern of the metal structure is transferred.
  • a method for manufacturing a resinous resin plate comprising a step of forming a resinous resin plate will be described.
  • the resin-made plate obtained by the present invention can exhibit sufficiently high accuracy even when compared with a conventional patterned glass plate.
  • the resin-made plate is precise and can be formed at a low cost, it is particularly effective when applied to industrially used applications where the advantages of minimizing manufacturing costs can be achieved. It is.
  • a plurality of transfer patterns of the pattern formed on the substrate are produced, and a metal structure is produced by attaching a metal to the transfer pattern, thereby producing a metal structure. Costs can be further reduced.
  • Examples of a method for producing a pattern transfer pattern formed on a substrate include a method of attaching a metal, a method of pouring resin, and a method of curing with heat, light or the like.
  • the resist layer can be formed and exposed multiple times.
  • a method of cutting and fixing the pin at the same position of the substrate and the mask a method of aligning using a laser interferometer, and the position of the substrate and the mask at the same position
  • a method of producing a position mark and aligning it with an optical microscope for example, a position mark is produced on a substrate by a photolithographic method, and a position mark is drawn on a mask by a laser drawing apparatus. Even in manual operation using an optical microscope, it is effective in that accuracy within 5 m can be easily obtained.
  • the resin plate is also preferable in that various surface treatments are possible.
  • Sample adhesion Surface treatment such as hydrophilic Z hydrophobization can be applied to promote Z detachment.
  • a method using low-temperature plasma treatment, corona discharge treatment, ultraviolet irradiation, or the like, or a method of applying collagen or the like, which is a protein that promotes cell attachment can be mentioned. It is also possible to modify any part by covering a part.
  • a step of forming a pattern on a substrate, a step of attaching a metal according to the pattern formed on the substrate to form a metal structure, and a resin molding using the metal structure The method for producing a resin-made plate by the step of forming a product will be described in more detail.
  • steps (V) to (viii) are optional, and can be omitted if only one type of recess is provided, while (V) to ( v m ) Is repeated several times.
  • steps (vi) and (viii) may be omitted if the chemically amplified negative resist described later is not used as the resist.
  • a first resist layer (thickness 70 m) and a second resist layer (thickness 30 m) are formed in this order.
  • Each layer is exposed, or exposed and heat-treated.
  • a pattern with a depth of 30 / zm, which is the second resist layer is obtained first, and then a pattern with a depth of 100 ⁇ m is obtained by combining the first resist layer and the second resist layer. .
  • the solubility of each layer in the developer must be controlled in order to prevent the second resist layer, the pattern with a depth of 30 m, from being dissolved or deformed in the developer. Is required.
  • alkali resistance can be exhibited by adjusting the beta (solvent drying) time of the second resist layer.
  • One method of developing alkali resistance using a photolytic positive resist is to lengthen the beta time (solvent drying time) and cure the resist.
  • the beta time is set according to the film thickness, the concentration of solvents such as thinner, and the sensitivity. By increasing this time, alkali resistance can be provided.
  • the beta of the first resist layer advances too much, the resist is extremely hardened, and it becomes difficult to form a pattern by dissolving the portion irradiated with light in the subsequent development. It is preferable to select appropriately such as shortening the time.
  • the apparatus used for beta is not particularly limited as long as the solvent can be dried, and examples thereof include an oven, a hot plate, and a hot air dryer.
  • the resist thickness to be set is preferably within a range of 5 to 200 / ⁇ ⁇ in combination with each layer, and more preferably within a range of 10 to LOO m.
  • the crosslinking density of the negative resist can be set by the exposure amount.
  • the crosslinking density can be set by the exposure dose and the heat treatment time. By increasing the exposure amount or the heat treatment time, it becomes possible to develop alkali resistance.
  • the resist thickness to be set is preferably in the range of 10 to 300 ⁇ m, preferably in the range of 5 to 500 ⁇ m for each layer.
  • the flatness of the resin-made plate obtained in the molded product forming step is determined in the process of forming the first resist layer 2 on the substrate 1. That is, the flatness at the time when the first resist layer 2 is formed on the substrate 1 is reflected in the flatness of the metal structure, and thus the resin plate.
  • the method of forming the first resist layer 2 on the substrate 1 is not limited in any way, but generally, a spin coat method, a dating method, a roll method, bonding of a dry film resist, and the like can be given.
  • the spin coating method is a method of applying a resist on a rotating glass substrate, and has an advantage of applying a resist to a glass substrate having a diameter of more than 300 mm with a high flatness. Accordingly, the spin coating method is preferably used from the viewpoint of realizing high flatness.
  • a positive resist or a negative resist can be used as the resist used.
  • the depth of focus of the resist varies depending on the resist sensitivity and exposure conditions.
  • the type of exposure time and UV output value should be selected according to the resist thickness and sensitivity. I hope.
  • the resist to be used is a wet resist
  • a method by changing the spin coat speed set the spin coater speed appropriately.
  • the viscosity adjustment method if the resist thickness is large or the coating area increases, the flatness may decrease, so the viscosity should be adjusted according to the flatness required in actual use. Is the way to adjust
  • the thickness of the resist layer applied at one time is preferably 10 to 50 ⁇ m, more preferably 20 to 50 ⁇ m in consideration of maintaining high flatness. It is desirable to be within this range.
  • the resist layer can be formed in multiple steps.
  • the resist thickness to be set is not 100 m or more, it is preferable to select appropriately such as shortening the beta time.
  • a method of cutting and fixing the same position on the substrate and mask A a method of positioning using a laser interferometer, a position mark at the same position on the substrate and mask A, and alignment with an optical microscope The method of doing.
  • a method of aligning with an optical microscope for example, a position mark is produced on a substrate by a photolithographic method, and a position mark is drawn on a mask A by a laser drawing apparatus. Even in manual operation using an optical microscope, it is effective in that accuracy within 5 m can be easily obtained.
  • the mask A3 used in the process shown in FIG. 4 (b) is not limited in any way, but examples include an emulsion mask and a chrome mask.
  • the size and accuracy depend on the mask A3 used.
  • the dimensions and accuracy are also reflected in the resin plate. Therefore, it is necessary to define the dimensions and accuracy of mask A in order to make the dimensions and accuracy of the resin plate predetermined.
  • the method for increasing the accuracy of mask A There is no limitation on the method for increasing the accuracy of mask A.
  • the pattern of mask A The laser light source used for the formation can be changed to one with a shorter wavelength, but the equipment cost is high and the mask A production cost is high, so a resin plate is practically required. It is desirable to define appropriately according to the accuracy.
  • the material of the mask A is preferably a quartz glass that is suitable for the thermal expansion coefficient and UV transmission absorption performance, but is relatively expensive, so that the resin molded product is appropriately determined according to the accuracy required for practical use. Is desirable.
  • the masks used to expose the first and second resist layers The pattern design (transmission Z shading part) must be reliable, and simulation using CAE analysis software is one of the solutions.
  • the light beam used for the exposure is preferably ultraviolet light or laser light, which has a low equipment cost.
  • Synchrotron radiation can be used when the equipment cost is high and the price of the resin-made plate is substantially high, but it is desired to obtain a deep exposure depth.
  • exposure conditions such as exposure time and exposure intensity vary depending on the material, thickness, and the like of the resist layer 2, it is preferable to appropriately adjust according to the pattern to be obtained. In particular, it is important to adjust the exposure conditions because it affects the size and accuracy of the concavo-convex pattern.
  • the depth of focus varies depending on the type of resist, for example, when using a UV exposure system, it is desirable to select the exposure time and UV output value according to the resist thickness and sensitivity.
  • the heat treatment of the first resist layer proceeds too much, it will be difficult to dissolve uncrosslinked portions and form a pattern in subsequent development, so if the resist thickness is not 100 m or more, the heat treatment time will be shortened. To do or after It is preferable to select as appropriate, such as only heat treatment of the second resist layer.
  • alkali resistance can be expressed by setting the beta time to about 1.5 to 2.0 times the normal time. Thereby, dissolution or deformation of the resist pattern of the second resist layer 4 can be prevented when the development of the first resist layer 2 and the second resist layer 4 is completed.
  • the heat treatment of the second resist layer 4 is performed so that the pattern of the second resist layer 4 is not dissolved or deformed when the pattern of the first resist layer 2 is obtained in the subsequent development.
  • Chemical crosslinking proceeds by heat treatment, and alkali resistance is developed by increasing the crosslinking density. It is preferable that the heat treatment time for developing the alkali resistance is appropriately selected according to the thickness of the resist from the normal 1.1 to 2.0 times range.
  • the resist layer 6 having a desired pattern is obtained by developing the resist layer exposed as described above using a predetermined developer.
  • the developer may be appropriately selected from those corresponding to the resist used in the steps so far. It is preferable to adjust development conditions such as development time, development temperature, and developer concentration as appropriate according to the resist thickness and pattern shape. For example, if the development time is too long in order to obtain the required depth, it becomes larger than a predetermined dimension, so it is preferable to set conditions appropriately.
  • the width (or diameter) force S of the surface becomes wider than the width (or diameter) of the pattern bottom in the development process.
  • resists with different sensitivities are divided into stages in the formation of each resist layer. It may be preferable to form. In this case, for example, the sensitivity of the layer near the surface is made higher than the layer near the bottom. More specifically, BMR C-1000PM manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. can be used as a resist with high sensitivity, and PMER-N-CA3000PM manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. can be used as a resist with low sensitivity.
  • the sensitivity may be adjusted by changing the drying time of the resist.
  • the drying time for the first layer is 40 minutes at 110 ° C
  • the drying time for the second layer is 110 ° C. By setting it to 20 minutes, the sensitivity of the first layer can be increased.
  • Examples of a method for improving the planar accuracy of the top surface of the resin plate or the bottom of the fine pattern include a method of changing the resist type (negative type and positive type) used in resist coating, and the surface of the metal structure. And a method of polishing the surface.
  • the plurality of resist layers are exposed and developed at the same time, or after one resist layer is formed and exposed. Further, a resist layer can be formed and exposed, and the two resist layers can be developed simultaneously.
  • the metal structure forming step is a process of obtaining the metal structure 8 by depositing metal along the resist pattern 6 obtained in the resist pattern forming step and copying the uneven surface from the resist pattern 6.
  • the conductive film 7 is formed in advance along the resist pattern.
  • the method for forming the conductive film 7 is not particularly limited, but preferably vapor deposition, sputtering, or the like can be used.
  • Examples of the conductive material used for the conductive film 7 include gold, silver, white gold, copper, and aluminum.
  • a metal structure 8 is formed by depositing metal along the pattern by plating.
  • the plating method for depositing the metal is not particularly limited, and examples thereof include electrolytic plating and electroless plating.
  • the metal used is not particularly limited, nickel, nickel-cobalt alloy, copper, and gold can be exemplified, and the viewpoint of economy and durability. Nickel is preferably used.
  • the metal structure 8 may be polished according to the surface state thereof. However, since there is a concern that dirt may adhere to the molded article, it is preferable to perform ultrasonic cleaning after polishing. Further, the metal structure 8 may be surface-treated with a release agent or the like in order to improve the surface condition.
  • the inclination angle in the depth direction of the pattern copied on the metal structure 8 is preferably 50 ° to 90 °, more preferably 60 ° to 87 ° from the shape of the resin molded product. .
  • the metal structure 8 deposited by plating is separated from the resist pattern 6.
  • the metal structure 8 can also be manufactured by performing further measurements or the like on the transfer pattern of the resist pattern 6 that is simply copied directly from the resist pattern 6 and the transfer pattern.
  • the transfer pattern of the resist pattern 6 can be obtained using a plating, a thermosetting resin, an ultraviolet curable resin, or the like.
  • the transfer pattern can be produced as many times as the original resist pattern 6 can be retained, but the resulting metal structure 8 pattern is always the opposite of the structural pattern of the resin plate 9.
  • Have The transfer pattern of resist pattern 6 has sufficient strength for misalignment! In other words, a plurality of metal structures 8 can be obtained from one resist pattern 6.
  • the molded product forming step is a step of forming the resin plate 9 using the metal structure 8 as a mold.
  • the method of forming the resin molded product is not particularly limited, and examples thereof include injection molding, press molding, monomer cast molding, solvent cast molding, roll transfer method by extrusion molding, and the like, from the viewpoint of productivity and mold transferability. Injection molding is preferably used.
  • a resin plate 9 is formed by injection molding using a metal structure with a predetermined size as a mold, the shape of the metal structure 8 can be reproduced at a high transfer rate with a resin plate. .
  • an optical microscope, a scanning electron microscope (SEM), a transmission electron microscope (TEM), or the like can be used.
  • the resin structure plate 9 is formed by injection molding using the metal structure 8 as a mold, for example, 10,000 to 50,000 sheets of a single metal structure, or 200,000 sheets of resin in some cases Plates can be obtained, and the cost burden for manufacturing metal structures can be greatly eliminated. As described above, when producing multiple metal structures 8 from one resist pattern 6 The cost burden can be further reduced. Moreover, the time required for one cycle of injection molding is extremely efficient in terms of productivity, which is as short as 5 to 30 seconds. Productivity can be further improved by using a mold that can form multiple resin plates simultaneously in one cycle of injection molding. In the above molding method, the metal structure may be used as a metal mold, or the metal structure may be set in a prepared metal mold and used.
  • the minimum flatness of the resin-made plate is preferably 1 ⁇ m or more from the viewpoint of easy reproduction on an industrial scale.
  • the maximum flatness of the resin-made plate is preferably 200 m or less from the viewpoint of not causing any trouble, for example, warpage of the molded product and contact with the optical system unit.
  • the dimensional accuracy of the molded part of the resin molded product is preferably within a range of ⁇ 0.5 to 10% from the viewpoint of easy industrial reproduction.
  • the dimensional accuracy with respect to the thickness of the resin-made plate is preferably within the range of ⁇ 0.5 to 10% from the viewpoint of industrial reproducibility.
  • the thickness of the resin-made plate is not particularly specified, but it should be in the range of 0.2 to LOmm, taking into account breakage during ejection, breakage during handling, deformation, distortion, etc. preferable.
  • the size of the resin plate is not particularly limited, but when forming a resist pattern by a lithography method, for example, when the resist layer is formed by a spin coating method, it is possible to collect from the middle of a 400 mm diameter range. It is preferable to select appropriately according to the application.
  • the present invention may be a cell culture vessel provided with a resin plate used in the above-mentioned differential interference microscope observation in the field of biochemistry in the lower part.
  • a rib may be provided around the above-mentioned resin-made plate, or a petri dish having a structure in which the hole is closed with the above-mentioned resin-made plate in a petri dish having a hole at the bottom.
  • molded said resin-made plate in the bottom part may be sufficient.
  • Each plate is made of polymethylmetatalylate (PMMA) or polystyrene (PSt). Extruded sheets are used for flat plates, and extruded sheets are used for those with a spatial structure formed by the following method. What was obtained by the press method using the produced Ni structure was used. The spatial structure pattern is shown in Fig. 3.
  • PMMA polymethylmetatalylate
  • PSt polystyrene
  • the first resist application based on “000PM” was performed.
  • UV exposure equipment (Canon "PLA-501F” wavelength 365nm, exposure 300mjZcm 2
  • the first resist layer was exposed to UV light, and then the first resist layer was heat-treated using a hot plate (100 ° C. ⁇ 4 minutes).
  • Second resist coating based on “000PM” was performed.
  • UV exposure system (Canon "PLA-501F” wavelength 365nm, exposure lOOmjZcm 2 ), The second resist layer was exposed to UV light, and then the second resist layer was heat-treated using a hot plate (100 ° C. X 8 minutes).
  • the substrate having the resist layer was developed to form a resist pattern on the substrate (developer: “PMER developer P-7G” manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.).
  • vapor deposition or sputtering was performed on the surface of the substrate having the resist pattern, and a conductive film made of silver was deposited on the surface of the resist pattern.
  • platinum, gold, copper, etc. can be deposited in addition.
  • the substrate having the resist pattern is immersed in a plating solution and electroplating is performed to obtain a metal structure (hereinafter referred to as Ni structure) between the valleys of the resist pattern. It was. In this step, copper, gold, etc. can be deposited.
  • the Ni structure pattern was transferred to a PMMA sheet or PSt sheet with a thickness of 0.3 mm by press molding, and the resin plate was Obtained.
  • the retardation was measured using an ellipsometry measuring device (ELP-150ART type, manufactured by Mizojiri Optical Industry Co., Ltd.) with one pass of transmission by normal incidence.
  • ELP-150ART type manufactured by Mizojiri Optical Industry Co., Ltd.

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Abstract

　本発明は、生物化学分野の微分干渉顕微鏡観察に使用されるプレートであって、波長３００ｎｍ以上、８００ｎｍ以下の波長領域における光の透過率が８０％以上であり、かつ、複屈折による波長６３３ｎｍの光の位相差（リタデーション）が３０ｎｍ以下であることを特徴とする生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される樹脂製プレートである。また、前記樹脂製プレートは、面積が１ｍｍ２以下で、かつ、深さが１０μｍ以上の空間構造を表面に複数有することが好適である。 　また、上記の樹脂製プレートは、基板上にレジストパターンを形成するステップと、基板上に形成されたレジストパターン、又はその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂製プレートの凹凸パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体の凹凸パターンを転写して樹脂製プレートを形成するステップとを備えた製造方法によって得られる。

Description

明 細 書
樹脂製プレートおよびその製造方法並びに樹脂製プレートを備える細胞 口
技術分野
[0001] 本発明は、生物化学分野で用いられる微分干渉顕微鏡観察にお!ヽて好適な榭脂 製プレートおよびその製造方法に関するものである。また、該榭脂製プレートを備え る細胞培養容器。
背景技術
[0002] 生物化学関連用途で使用される生物顕微鏡においては、細胞へのダメージや蛍 光褪色を抑えるために、必要最小限の弱い励起光で明るくコントラストの良い蛍光観 察ができることが必要となる。微弱な蛍光シグナル (S)を観察するためには、目的以 外の光ノイズ (N)を少なくすることが重要であり、それらの比 SZNが大きいほどよりコ ントラストの良 ヽ蛍光観察が可能となる (特許文献 1参照)。
[0003] 生物化学関連用途の観察対象は、線虫などの厚いものから培養細胞などの薄いも のまで厚さはさまざまである。細胞へのダメージや蛍光褪色を抑えるため、厚い標本 の細部を見ること、薄い標本をコントラスト良く見ることなど、偏光顕微鏡、微分干渉顕 微鏡への要求が拡がって 、る。
[0004] 光源の前に 2枚の偏光板をクロス-コル (透過できる光の振動方向が 90°違う）の関 係で置くと、光源からの光は透過せず黒く見える。ここで前記 2枚の偏光板の間に標 本を置くと、標本によっては光の振動方向が回転するため、透過光が見えるようにな る場合がある。これを顕微鏡に組み込んだものが偏光顕微鏡となる。微分干渉顕微 鏡は、無染色の標本を光が通過する際の屈折率の違いや、標本表面の形状による 光路差 (光の進み方の違い)を、明暗のコントラストに変えて観察することができる。ま た、特殊なプリズムを使用し、照明光を 2つの光線に分け、これらの光の干渉によって 生ずる干渉色や明暗のコントラストで、試料を浮き出すような立体感で見ることができ る。
[0005] 微分干渉顕微鏡において顕微鏡光源からの光は、偏光子で光の振動方向が揃え られ、微分干渉素子を通る際、振動方向が直行する 2つの成分に分けられる。 2つに 分けられた光は、標本の異なる場所を通過する。その際、 2つの光束の間に位相の ずれが生じる。位相がずれた 2つの光を干渉させることで観察像にコントラストを生じ させ、標本の微細構造観察することが可能となる。すなわち、生きた微生物や透明な 試料でも染色しな 、で観察できるので、医学や生物学など生物化学関連の分野で 多く使用されている。
[0006] 微分干渉顕微鏡は、偏光を利用した光学系である。このため、標本の支持板として 光学的歪が大きい通常のプラスチック材料を使用した場合、標本によるものとは異な る原因により観察光の偏光状態が影響を受けるため、微分干渉のコントラストが著しく 低下する。したがって、従来プラスチック材料は標本の支持板としては使用できない という問題を有していた。
[0007] このため、微分干渉観察を行う場合は、ガラスシャーレまたは底部にカバーガラスを 貼り付けた市販のガラスボトムシャーレが使用されている。ガラスシャーレは、高額で あることに加え、その底面の板厚が、例えば 0. 5mm〜： Lmmと厚いため、高倍率観 察を行う際にシャーレ底面に対物レンズが接触する問題を有していた。市販のガラス ボトムシャーレは、プラスチック製シャーレの底面に、例えば 0. lmm〜0. 5mmの力 バーガラスを貼り付けたものである。
[0008] 薄い板厚のカバーガラスを使用することで高倍率観察が可能になる反面、プラスチ ックにカバーガラスを張り合わせるには、その融点が異なるため、高度な融着技術が 必要となり、その価格は高額となり実用化には適さない問題を有していた。一方、接 着剤を使用すると、プラスチックとカバーガラスの接着は容易となるが、接着剤に含ま れる溶剤が培養液に溶出し、細胞への毒性を示す場合があるため使用には適さな 、
[0009] 特許文献 1 :特開 2003— 121442公報、段落 0073〜0084
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 上記したように、スライドガラスを榭脂製プレートに置き換えようとすると、測定波長 の光が榭脂製プレートを透過しない、偏光が乱れるなどのために、生物化学分野に おける微分干渉顕微鏡観察に使用できないという課題がある。
[0011] また、微細凹凸パターンを有するガラス製プレートを、榭脂製プレートに変更しようと すると、測定波長の光が榭脂製プレートを透過しない、偏光が乱れるなどのために、 生物化学分野における微分干渉顕微鏡観察に使用できないという課題がある。 課題を解決するための手段
[0012] そこで、本発明者らは、上記の問題を解決するために鋭意検討した結果、光、特に 紫外線の透過率および複屈折による波長 633nmの光の位相差 (以下、これを単にリ タデーシヨンと称する。）を一定範囲内とすることで、微分干渉顕微鏡観察を目的とし た生物化学分野に使用される榭脂製プレートとして好適なものが得られることを見出 して本発明を完成した。
[0013] すなわち本発明は、波長 300nm以上、 800nm以下の波長領域における光の透 過率が 80%以上であり、かつ、複屈折による波長 633nmの光の位相差（リタデーシ ヨン）が 30nm以下であることを特徴とする生物化学関連用途にぉ 、て微分干渉顕微 鏡観察に使用される榭脂製プレートである。また、底面の厚みが、 0.02mm〜0. 3m mの範囲であってもよぐ面積が lmm2以下で、かつ、深さが 10 m以上の空間構造 を表面に複数有してもよい。
[0014] また本発明は、生物化学分野において微分干渉顕微鏡測定に使用される上記の 榭脂性プレートを製造する方法であって、基板上にレジストパターンを形成するステ ップと、基板上に形成されたレジストパターン、又はその転写パターンにしたがって金 属を付着させ、前記榭脂製プレートが有する凹凸パターンの反対パターンを有する 金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体の凹凸パターンを転写して榭脂 製プレートを形成するステップとを備えたことを特徴とする生物化学分野において蛍 光分析に使用される榭脂製プレートの製造方法である。そして、前記基板上にレジス トパターンを形成するステップにおいて、レジストパターンを形成するステップ力 レジ スト層が所望の高さ、又は深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層 の形成、露光を繰り返すステップを含んでいても良い。
[0015] さらに本発明は、前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複 数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、露光における各層のパターンの位置が 同じ位置になるように、パターンの位置を合わせるマスク位置合わせステップをさらに 備えていてもよいし、前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複 数回レジスト層の形成、露光を繰り返す際、異なるパターンのマスクを用いることで、 少なくとも 2以上の異なる深さの空間構造を備えるレジストパターンを形成してもよい
[0016] さらに本発明は、前記の榭脂製プレートを底面に備えた細胞培養容器である。
発明の効果
[0017] 本発明により、生物化学分野において微分干渉顕微鏡による生体高分子の微細 構造を観察する場合において好適な榭脂製プレートを提供できる。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]実施例 1において、微分干渉顕微鏡観察によるによるノ ックグラウンド測定結果 を示す図である。
[図 2]比較例 1において、微分干渉顕微鏡観察によるバックグラウンド測定結果を示 す図である。
[図 3]この発明の実施例において、榭脂製プレート表面の空間構造をなす凹凸バタ ーンを示す図である。
[図 4]この発明の実施例において、榭脂製プレートを形成する工程を示す模式図で ある。
[図 5]比較例 3の榭脂製プレートの微分干渉顕微鏡観察によるバックグラウンドを示す 図である。
符号の説明
[0019] 1 基板
2 第 1レジスト層
3 マスク A
4 第 2レジスト層
5 マスク B
6 レジストパターン
7 導電性膜 8 金属構造体
9 榭脂製プレート
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される榭脂性プレー トは、
(a)光線透過率
(b)リタデーシヨン
が一定範囲内であることを特徴とする。
[0021] (a)光線透過率
微分干渉顕微鏡観察に限らず、生物化学標本等の光学顕微鏡観察において光線 透過率の高いことが重要であるのは自明であるが、生物化学分野においては特に、 蛍光マーカーによる生体反応の観察が多用されるため、紫外線領域の光線の透過 率が特に重要である。蛍光過程によって分析する蛍光顕微鏡、マイクロアレイスキヤ ナ一等は、蛍光色素を光らせるための光 (励起光)を照射する光学系と、それにより 発生した蛍光 (蛍光放射光)を観察、又は蛍光強度測定することで解析を行う。光（ 励起光）の波長は蛍光色素の感度に応じて多様であり、励起光は、観察側の反対側 力も榭脂製プレートを通して照射されることが多いため、榭脂製プレートの光透過率 の高いことが蛍光 (蛍光放射光)を観察、又は蛍光強度測定するうえで必要となる。ま た、榭脂プレートの観察側力も励起光を照射する場合にも、榭脂プレートの光透過率 が低いと、光を吸収して温度が上がるなどの問題が生じやすいため、榭脂製プレート の紫外線領域を含む光透過率が高 、ことは重要である。
[0022] ガラス製プレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含んだ波長 300nm 以上、 800nm以下の波長領域にぉ 、て光透過率が 80%以上であることが必要であ る。上記の条件を満たすため、榭脂製プレートには紫外線吸収剤が含まれていない ことが必要である。上記の条件を満たすためには、 PC (ポリカーボネート）、ポリスチレ ン等、その化学構造にベンゼン環を有している材料は、使用しないことが必要である 。さらに上記の条件を満たすため、他の成分としては、酸化防止剤、粘度向上剤、耐 熱安定剤、膠着防止剤等の添加物のなかで、紫外線吸収剤が含まれていないことが 必要である。
[0023] また、蛍光マーカーを用いた観察においては培養プレートの自家蛍光が少ないこと も重要であるので、これついて説明する。
自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外 ·可視の光を吸収した後、光を放出して自ら蛍 光を発すると 、う現象のことを 、う。ガラス製プレートは自家蛍光を発しな 、のに対し 、榭脂製プレートの多くは自家蛍光を発するため、サンプルから発生した蛍光 (蛍光 放射光)を識別することができなくなり、これまで蛍光分析の特徴である微量分析が 不可能であった。
[0024] ガラス製プレートと同様に、自家蛍光の影響を受けないためには、波長 230nm以 上、 800nm以下の波長領域の光を照射によっては自家蛍光を発しな!/、ことが重要 である。上記の条件を満たすために、材料としては、 PC (ポリカーボネート）、ポリスチ レン等、その化学構造にベンゼン環を有するものを含まないことが必要である。上記 の条件を満たすため、他の成分としては、紫外線吸収剤、酸化防止剤、粘度向上剤 、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物のなかで、紫外線吸収剤が含まれていないこ とに加え、自家蛍光の可能性を極力排除するため、可能な限り少量、もしくは添加し ないことが好ましい。
[0025] (b)リタデーシヨン
微分干渉のコントラストを低下させることなぐ微分干渉顕微鏡観察行うためには、 材料に対する光学的歪を小さくし複屈折を小さくすることが重要である。すなわち、リ タデーシヨンを小さくすることが前提であり、ポリカーボネート（PC)、ポリスチレン (PS t)等、その化学構造にベンゼン環を有しな 、榭脂材料を選択することが必要である。
[0026] 培養プレートのリタデーシヨンについて説明する。複屈折とは、光の振動方向によつ て屈折率が異なる物質を透過したときに、その物質の屈折率の異方性によって、 2つ の光線 (通常光線と異常光線)に分けられることをいう。
微分干渉顕微鏡は、光の振動方向の異なる 2つの光、すなわち偏光を使用しそれ らの干渉により標本の微細構造を観察する方法である。ここで、光路中に光学的に 異方性の材料が存在する場合には、偏光によって 2つに分けた参照光相互に位相 差が生じるため、原理的に測定が困難となる。したがって、微分干渉顕微鏡観察に 用いる榭脂プレートとしては、その材料が異方性を持たないことが重要であり、その 化学構造にベンゼン環を有しないこと、かつ、プレートの厚みを一定範囲内とするこ とで、リタデーシヨンを小さい一定範囲内とすることで、その適用性を高めることが可 能となる。リタデーシヨンは、本明細書においては、 633nmの光を垂直入射したシン グルパスの値で示される。
[0027] 微分干渉顕微鏡観察を良好に行うためには、リタデーシヨンは 30nm以下であるこ とが必要であり、 20nm以下であることが好ましい。リタデーシヨンの値を小さくするに は、異方性の少ない材料を用いるのに加え、成形法を最適化することが効果的であ る。例えば、溶融押し出し法といった成形を行うと、押出し及びその後の延伸によって ポリマー分子が配向する。分子が配向した状態では、配向方向に複屈折が生じるこ とがよく知られている。ポリマー分子の配向の影響を小さくするには、厚さを薄くして、 透過距離自体を小さくすることが効果的である。また、成形時の分子配向が極力小さ くなるキャスト成形法などで製造することがあげられる。また、押し出し成形時の分子 配向を緩和する方法として、再加熱による緩和減少を利用することも可能であり、ェ 業技術の再現性、コストの面力 適宜選択することが望ま 、。
[0028] リタデーシヨンを小さくするには、上記したとおり、厚みを一定範囲内とすることが必 要となる。リタデーシヨンを小さくし、かつ、工業的に薄肉化が可能な範囲としては、 0. 02mn！〜 0.3mmの範囲が好ましぐ 0.05mn！〜 0. 2mmの範囲から選択することが より好まし 、。
[0029] 上記の生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される榭脂製プレート は、面積が lmm2以下で、かつ、深さが 10 m以上の空間構造を表面に複数有する ことが好ましい。より好ましい空間構造の面積は 0. 5mm2以下であり、より好ましい空 間構造の深さは、 50 m以上である。空間構造の数は、細胞培養や測定などの目 的に応じて適宜選択可能であるが、装置上および製造上の制約条件が許すかぎり 多いことが求められ、例えば 24個以上、望ましくは 100個以上であるのが好ましい。 表面に空間構造を有することにより、ハイスループットスクリーニング等の用途に好適 に用いられると同時に、培養された細胞の形態、性状もより生体内におけるものに近 V、ものとなることが期待される。
[0030] 上記の表面に複数の空間構造を有する生物化学分野において微分干渉顕微鏡 観察に使用される榭脂製プレートを得るための方法、即ち、基板上に凹凸パターンを 形成するステップと、基板上に形成された凹凸パターン、又はその転写パターンにし たがって金属を付着させ、前記榭脂製プレートの構造パターンの反対パターンを有 する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して榭脂 製プレートを形成するステップとを備えた榭脂製プレートの製造方法について説明す る。
[0031] 本発明により得られる榭脂製プレートは、従来のパターン付きガラス製プレートと対 比しても充分に高い精度を発揮することができる。また、当該榭脂製プレートは精密 であると同時に安価に形成することができるため、製造コストを極力抑えられる利点を 発揮できるような産業上大量に使用される用途に適用した場合に、特に効果的であ る。
[0032] 前記金属構造体を形成するステップにおいて、基板上に形成されたパターンの転 写パターンを複数作製し、それに金属を付着させ金属構造体を作製することで、金 属構造体を作製するコストを更に低減することが可能である。基板上に形成されたパ ターンの転写パターンを作製する方法としては、例えば、金属を付着させる方法、榭 脂を流し込み、熱、光等で硬化させる方法があげられる。
[0033] 基板上にレジストパターンを形成する方法において、レジスト層が所望の高さ、又は 深さを有する構造体に形成されるまで、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返ことも 有用である。特に粘度の低いレジストを使用した場合、 1回のレジストコートで所望の 高さ、又は深さを得ようとすると、レジストの平面性が損なわれることが懸念される。例 えば、スピンコート法でレジストを塗布する場合、複数回のレジスト塗布を行うことで、 高い平面精度を保持したうえで、所望の高さ、又は深さを有する構造体を得ることが 可能となる。また、レジスト層の形成、露光を複数回繰り返し、所望の高さ、又は深さ を得ることも可能である。特に、使用するレジストの感度に起因し、 1回の露光で所望 の高さ、又は深さを得られない場合は、レジスト層の形成、露光を複数回繰り返すこと で可能となる。 [0034] 露光における各層のパターンとマスクとの位置合わせには、基板とマスクの同位置 に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置を合わせる方法、 基板とマスクの同位置に位置マークを作製し、光学顕微鏡で位置合わせをする方法 等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法 にて基板に位置マークを作製し、マスクにはレーザー描画装置で位置マークを描画 する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、 5 m以内の精度が簡単に得られ る点で有効である。
[0035] 榭脂製プレートは、各種の表面処理が可能になる点においても好適である。サンプ ルの付着 Z離脱を促すため、親水 Z疎水化処理等の表面処理が適用できる。例え ば、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射などを用いる方法、細胞の付 着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が挙げられる。また、一部分 を被覆しておき、任意の部分を改質することも可能である。
[0036] 基板上にパターンを形成するステップと、前記基板上に形成された前記パターンに したがって金属を付着し、金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体を使用 して、榭脂成形品を形成するステップによる榭脂製プレートの製造方法について、更 に詳細に説明する。
[0037] 図 4に示すように本形態の榭脂製プレートは、
(i)基板上への第 1レジスト層の形成（図 4工程 a)
(ii)基板とマスク Aとの位置合わせ
(iii)マスク Aを用 V、た第 1レジスト層の露光
(iv)第 1レジスト層の熱処理 (省略可能）（ここまで図 4工程 b)
(V)第 1レジスト層上への第 2レジスト層の形成（図 4工程 c)
(vi)基板とマスク Bとの位置合わせ
(vii)マスク Bを用いた第 2レジスト層の露光
(viii)第 2レジスト層の熱処理 (省略可能）（ここまで図 4工程 d)
(ix)レジスト層の現像（図 4工程 e)
を行い、所望のレジストパターンを形成する。
[0038] さらに、 (x)形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンに したがって、基板上に金属構造体をメツキにより堆積させる。（図 4工程 f, g)
(xi)この金属構造体を型として、榭脂成形品を形成する（図 4工程 h)
こと〖こよって、榭脂製プレートが製造される。
(V)〜 (viii)の工程は任意であり、設ける凹部の深さが一種類のみの場合は省略が 可能である一方、 3種類以上の深さが必要なときには (V)〜 (vm)の工程を複数回繰 り返すことちでさる。
(vi)および (viii)の工程は、レジストとして後述する化学増幅系ネガレジストを用い な 、場合には省略してもよ 、。
[0039] レジストパターン形成処理について更に詳細に説明する。
基板上に、例えば、深さ 30 mと深さ 100 mの構造体を得ようとした場合、第 1レ ジスト層（厚さ 70 m)、第 2レジスト層（厚さ 30 m)順に形成し、各層に露光、また は露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第 2レジスト層である深さ 30 /z mのパ ターンが得られ、次に第 1レジスト層と第 2レジスト層を合わせた深さ 100 μ mのパタ ーンが得られる。深さ 100 mのパターンが得られた時点で、第 2レジスト層である深 さ 30 mのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液 への溶解性を制御させることが要求される。
[0040] スピンコート方式によりレジスト層を形成する場合、第 2レジスト層のベータ (溶剤の 乾燥）時間を調整することによって、耐アルカリ性を発現させることが可能である。
[0041] 光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、 ベータ時間 (溶剤の乾燥時間）を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常 、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度、および感度に応じてベータ時間を設定し ている。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることが可能となる。ま た、第 1レジスト層のベータが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像に おいて光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから 、ベータ時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベータに用いる装置は、溶 剤を乾燥できれば特に限定されるものではなぐオーブン、ホットプレート、熱風乾燥 機等があげられる。光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は 制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて 5〜200 /ζ πιの範囲内が 好ましぐ 10〜： LOO mの範囲内であることがより好ましい。
[0042] 光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベータ時 間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋 密度は、露光量によって設定することが可能である。化学増幅系ネガ型レジストの場 合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することが可能である。この 露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることが 可能となる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わ せて 5〜500 μ mの範囲内が好ましぐ 10〜300 μ mの範囲内であることがより好ま しい。
[0043] (0基板上への第 1レジスト層の形成にっ ヽて説明する。
成形品形成ステップで得られる榭脂製プレートの平面度は、基板 1上へ第 1レジスト 層 2を形成する工程にて決定づけられる。すなわち、基板 1上に第 1レジスト層 2を形 成した時点の平面度が金属構造体、ひいては榭脂製プレートの平面度に反映される
[0044] 基板 1上に第 1レジスト層 2を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピン コート方式、デイツビング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を 挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジ ストを塗布する方法で、直径 300mmを超えるガラス基板にレジストを高 ヽ平面度で 塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式 が好ましく用いられる。
[0045] 用いられるレジストはポジ型レジスト、ネガ型レジストの 、ずれもが使用可能である。
いずれも、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わるため、例え ば UV露光装置を使用した場合、露光時間、 UV出力値をレジスト厚さ、感度に応じ て種類を選択するのが望まし 、。
[0046] 用いるレジストがウエットレジストの場合、例えばスピンコート方式で所定のレジスト 厚さを得るには、スピンコート回転数の変更による方法と、粘度調整による方法とがあ る。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定す ることによって所望のレジスト厚さを得る方法である。粘度調整による方法は、レジスト 厚さが厚い場合、又は塗布面積が大きくなる場合には、平面度が低下することが懸 念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整する方法である
[0047] 例えばスピンコート方式の場合、 1回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を 保持することを考慮し、好ましくは 10〜50 μ m、さらに好ましくは、 20-50 μ mの範 囲内であることが望ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを 得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。
[0048] 第 1レジスト層 2にポジ型レジストを使用した場合、ベータ時間（溶剤の乾燥）が過度 に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成する ことが困難になることから、設定するレジスト厚さが 100 m以上でない場合、ベータ 時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。
[0049] (ii)基板とマスク Aとの位置合わせにっ 、て説明する。
第 1レジスト層 2のパターンと、第 2レジスト層 4のパターンにおける位置関係を所望 の設計通りにするためには、マスク A3を用いた露光時に、正確な位置合わせを行う ことが必要となる。位置合わせには、基板とマスク Aの同位置に切削加工を施しピン 固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板とマスク Aの同位置 に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕 微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板に位置マーク を作製し、マスク Aにはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を 用いた手動操作においても、 5 m以内の精度が簡単に得られる点で有効である。
[0050] (iii)マスク A3を用 ヽた第 1レジスト層 2の露光について説明する。
図 4 (b)に示される工程で使用するマスク A3は何ら限定されないが、ェマルジヨン マスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、使 用するマスク A3によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および 精度は、榭脂製プレートにも反映される。したがって、榭脂製プレートの各寸法、およ び精度を所定のものとするためには、マスク Aの寸法、および精度を規定する必要が ある。マスク Aの精度を高める方法は何ら限定しないが、例えば、マスク Aのパターン 形成に使用するレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができ るが、設備費用が高額であり、マスク A製作費が高額となるため、榭脂製プレートが 実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが望ましい。
[0051] マスク Aの材質は温度膨張係数、 UV透過吸収性能の面力 石英ガラスが好ましい が比較的高価であるため、榭脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規 定するのが望ましい。設計通りの所望の深さ、または高さが異なる構造体、または第 1 レジストパターンと第 2レジストパターンが異なる構造体を得るには、第 1レジスト層、 および第 2レジスト層の露光に用いるマスクのパターン設計 (透過 Z遮光部）が確実 であることが必要であり、 CAE解析ソフトを使用したシミュレーションもその解決策の 一つである。
[0052] 露光に用いられる光線は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であるこ とが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に榭脂製プレ ートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いること ができる。
[0053] 露光時間や露光強度等の露光条件はレジスト層 2の材質、厚み等により変化する ため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に凹凸パターンの 寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジス トの種類により焦点深度が変わるため、例えば UV露光装置を使用した場合、露光時 間、 UV出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが望ましい。
[0054] (iv)第 1レジスト層 2の熱処理について説明する。露光後の熱処理は、レジストパター ンの形状を補正するためにァニールといわれる熱処理が知られている。ここでは、化 学架橋を目的とし、化学増幅系ネガレジストを使用した場合のみに行う。化学増幅系 ネガレジストとは、主に、 2成分系、または 3成分系力 なり、露光時の光によって、例 えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるもの である。熱処理時間は、例えば膜厚 100 mの場合、設定温度 100°Cの条件下にお いては数分で架橋反応は進行する。第 1レジスト層の熱処理が進行しすぎると、後の 現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、 設定するレジスト厚さが 100 m以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後 の第 2レジスト層の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ま 、。
[0055] (V)第 1レジスト層 2上への第 2レジスト層 4の形成について説明する。
( について説明したことにカ卩え、以下の点を記す。
スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベータ 時間を通常の 1. 5〜2. 0倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる 。これにより、第 1レジスト層 2と第 2レジスト層 4の現像終了時、第 2レジスト層 4のレジ ストパターンの溶解、または変形を防止することができる。
[0056] (vi)基板 1とマスク B5との位置合わせについて説明する。（ii)について説明したことと 同様の要領にて、位置合わせを実施する。
[0057] (vii)マスク B5を用いた第 2レジスト層 4の露光について説明する。 (iii)について説明 したことと同様の要領にて、露光を実施する。
[0058] (vm)第 2レジスト層 4の熱処理について説明する。 (iv)について説明したことにカロえ 、以下の点を記す。
第 2レジスト層 4の熱処理は、後の現像において第 1レジスト層 2のパターンが得ら れた時点で、第 2レジスト層 4のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱 処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。 耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の 1. 1〜2. 0倍の範囲からレ ジストの厚さに応じて適宜選択することが好まし 、。
[0059] (ix)レジスト層 2, 4の現像について説明する。
上記までで露光されたレジスト層を、所定の現像液を用いて現像することで所望の パターンを有するレジストパターン 6が得られる。現像液としては、ここまでの工程で 用いたレジストに対応するものから適宜選択すればよい。現像時間、現像温度、現像 液濃度等の現像条件はレジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好 ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法より も大きくなつてしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。
[0060] レジスト層全体の厚みが増してくると、現像工程において、パターン底部の幅（また は直径)よりも表面の幅 (または直径）力 S広くなることが懸念される。レジストを複数層 形成する場合、各レジスト層の形成において、感度の異なるレジストを段階に分けて 形成することが好ましい場合がある。この場合には、例えば、表面に近い層のレジスト の感度を底部に近い層よりも高くすることなどが挙げられる。さらに具体的には、感度 の高いレジストとして東京応化工業株式会社製の BMR C— 1000PMを、そして感 度の低いレジストとして東京応化工業株式会社製の PMER— N— CA3000PMを用 いることができる。その他、レジストの乾燥時間を変えることにより感度を調整するよう にしてもよい。例えば、東京応化工業株式会社製の BMR C— 1000PMを使用した 場合、スピンコート後のレジスト乾燥時、 1層目の乾燥時間を 110°Cで 40分、 2層目 の乾燥時間を 110°Cで 20分とすることで、 1層目の感度を高めることができる。
[0061] 榭脂製プレートの上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては 、例えば、レジスト塗布で使用するレジスト種類 (ネガ型、ポジ型）を変更する方法、金 属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。
[0062] 尚、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数の レジスト層を同時に露光'現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成及び露 光処理した後、さらにレジスト層の形成及び露光処理を行い、 2つのレジスト層を同時 に現像処理することが可能である。
[0063] (X)金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパタ ーン 6に沿って金属を堆積させ、レジストパターン 6から凹凸面を写し取ることにより、 金属構造体 8を得る工程である。
[0064] 図 4に示されるように、この工程では予めレジストパターンに沿って導電性膜 7を形 成する。該導電性膜 7の形成方法は特に限定されないが、好ましくは蒸着、スパッタリ ング等を用いることができる。導電性膜 7に用いられる導電性材料としては金、銀、白 金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。
[0065] 図 4に示されるように、導電性膜 7を形成した後、パターンに沿って金属をメツキによ り堆積して金属構造体 8を形成する。金属を堆積させるメツキ方法は特に限定されな いが、例えば電解メツキ、無電解メツキ等を挙げることができる。用いられる金属は特 に限定されないが、ニッケル、ニッケル一コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経 済性 '耐久性の観点力 ニッケルが好ましく用いられる。 [0066] 金属構造体 8はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物 に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。ま た、金属構造体 8はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構 わない。なお、金属構造体 8に写し取られたパターンの深さ方向の傾斜角度は、榭脂 成形品の形状から 50° 〜90° であることが望ましぐより望ましくは 60° 〜87° で ある。
メツキにより堆積した金属構造体 8はレジストパターン 6から分離される。
[0067] 金属構造体 8は、レジストパターン 6からパターンを直接写し取るだけでなぐレジス トパターン 6の転写パターンおよびさらにその転写パターン等に対してさらにメツキ等 を行うことでも製造することができる。ここで、レジストパターン 6の転写パターンは、メ ツキ、熱硬化性榭脂、紫外線硬化性榭脂等を用いて得ることができる。この転写バタ ーンの作製は元のレジストパターン 6の形状を保持できる限り何回行っても良いが、 得られる金属構造体 8のパターンは、常に榭脂製プレート 9の構造パターンの反対形 状を有して 、る。レジストパターン 6の転写パターンの 、ずれかが充分な強度を有し て！ヽれば、一つのレジストパターン 6から複数の金属構造体 8を得ることができる。
[0068] (xi)成形品形成ステップにつ!/、て更に詳細に説明する。
成形品形成ステップは、図 4に示されるように、前記金属構造体 8を型として、榭脂 製プレート 9を形成する工程である。榭脂成形品の形成方法は特に限定されないが 、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形 によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形 が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体を型として射出成形で榭 脂製プレート 9を形成する場合、金属構造体 8の形状を高 、転写率で榭脂製プレー トに再現することが可能である。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査 電子顕微鏡 (SEM)、透過電子顕微鏡 (TEM)等を使用して行うことができる。
[0069] 金属構造体 8を型として、例えば射出成形で榭脂製プレート 9を形成する場合、 1枚 の金属構造体で 1万枚〜 5万枚、場合によっては 20万枚もの榭脂製プレートを得る ことができ、金属構造体の製作に力かる費用負担を大幅に解消することが可能であ る。前述したように一つのレジストパターン 6から複数の金属構造体 8を作製する場合 には、さらに費用負担を軽減できる。また、射出成形 1サイクルに必要な時間は 5秒 〜30秒と短ぐ生産性の面で極めて効率的である。射出成形 1サイクルで同時に複 数個の榭脂製プレートを形成可能な成形金型を使用すれば、更に生産性を向上す ることが可能となる。上記成形方法では金属構造体を金属型として用いても、金属構 造体を予め用意した金属型内部にセットして用 ヽても構わな!/、。
[0070] 榭脂製プレートの平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から 1 μ m以上で あることが好ましい。榭脂製プレートの平面度の最大値は、例えば、該成形品にソリ 等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から 200 m以下 であることが好ましい。榭脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し 易い観点から ±0. 5〜 10%の範囲内であることが好ましい。
[0071] 榭脂製プレートの厚さに対する寸法精度は、工業的な再現のし易さの観点力 ±0 . 5〜 10%の範囲内であることが好ましい。榭脂製プレートの厚さは特に規定されな いが、射出成形における取り出し時の破損、取り扱い時の破損、変形、歪みなどを考 慮し、 0. 2〜： LOmmの範囲内であることが好ましい。榭脂製プレートの寸法は特に限 定されないが、リソグラフィ一法でレジストパターンを形成する際、例えば、レジスト層 の形成をスピンコート法にて行う場合、直径 400mmの範囲の中カゝら採取できるよう 用途に応じて適宜選択することが好ま ヽ。
[0072] 本発明は、上記の生物化学分野の微分干渉顕微鏡観察に用いられる榭脂製プレ 一トを低部に備えた細胞培養容器であってもよい。例えば、上記の榭脂製プレートの 周囲にリブを設けてもよいし、底部に穴のあいたシャーレにおいて、該穴を上記の榭 脂製プレートで塞いだ構成のシャーレであってもよい。また、上記の榭脂製プレート を底部に一体に成形した榭脂製のシャーレであっても良い。
実施例
[0073] 本発明にしたがって、榭脂製プレートを形成する方法につ!、て、図を参照しながら 以下により具体的に説明する。実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本 発明はこれら実施例に限定されるものではない。
[0074] まず、本発明の生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される榭脂製 プレートについて、以下に具体的に説明する。 [0075] 表 1に示されるプレートを用いて微分干渉顕微鏡 (カールツァイス株式会社製タイプ ：ルーチン倒立顕微鏡 型式: Axiovert 40)にてバックグラウンドの観察を行い、 SZ Nを目視にて評価した。
[0076] [表 1]
Figure imgf000020_0001
[0077] 各プレートは、ポリメチルメタタリレート（PMMA)またはポリスチレン（PSt)を材料と し、平板のものは押出しシートを用い、空間構造が形成されたものは、押出しシートを 次の方法で作製した Ni構造体を用いてプレス法により得られたものを用いた。空間 構造のパターンは、図 3に示すものとした。
[0078] 空間構造を形成する凹凸パターンを表面に有する榭脂製プレートを形成する方法 について、図 4を参照しながら以下により具体的に説明する。
図 4 (a)を参照して、まず基板上に、有機材料 (東京応化工業製「PMER N-CA3
000PM」をベースとする 1回目のレジスト塗布を行った。
そして、図 4 (b)を参照して第 1レジスト層を形成した後、基板と所望のマスクパター ンにカ卩ェしたマスク Aとの位置合わせを行った。
[0079] 次に UV露光装置（キャノン製「PLA— 501F」波長 365nm、露光量 300mjZcm2
)により、第 1レジスト層を UV光により露光を行った後、ホットプレート（100°C X 4分） を用いて第 1レジスト層の熱処理を行った。
[0080] 図 4 (c)を参照して、まず基板上に、有機材料 (東京応化工業製「PMER N-CA3
000PM」をベースとする 2回目のレジスト塗布を行った。
そして、図 4 (d)を参照して第 2レジスト層を形成した後、基板と所望のマスクパター ンにカ卩ェしたマスク Bとの位置合わせを行った。
[0081] 次に UV露光装置（キャノン製「PLA— 501F」波長 365nm、露光量 lOOmjZcm2 )により、第 2レジスト層を UV光により露光を行った後、ホットプレート（100°C X 8分） を用いて第 2レジスト層の熱処理を行った。
[0082] 図 4 (e)に示すように、前記レジスト層を有する基板を現像し、基板上にレジストバタ ーンを形成した (現像液：東京応化工業製「PMER現像液 P- 7G」 )。
[0083] そして、図 4 (f)に示すように前記レジストパターンを有する基板表面に蒸着、または スパッタリングを行 ヽ、レジストパターンの表面に銀カゝらなる導電性膜を堆積させた。 この工程において、他に白金、金、銅などを堆積させることができる。
[0084] 次に、図 4 (g)に示すように前記レジストパターンを有する基板をメツキ液に浸け、電 気メツキを行い、レジストパターンの谷間に金属構造体 (以下、 Ni構造体)を得た。こ の工程において、他に銅、金などを堆積させることができる。
図 4 (h)に示すように、得られた Ni構造体を金型として、プレス成形で厚さ 0. 3mm の PMMAシートまたは PStシートに Ni構造体のパターンを転写し、榭脂製プレート を得た。
[0085] リタデーシヨンの測定は、エリプソメトリー測定装置 (株式会社溝尻光学工業所製 E LP— 150ART型）を用いて、垂直入射による透過のワンパスで行った。
[0086] 表より、リタデーシヨンが 30nm以下の実施例においては、微分干渉顕微鏡のバッ クグラウンドの SZNが良好であることがわかる。

Claims

請求の範囲
[1] 波長 300nm以上、 800nm以下の波長領域における光の透過率が 80%以上であ り、かつ、複屈折による波長 633nmの光の位相差（リタデーシヨン）が 30nm以下であ ることを特徴とする生物化学分野において微分干渉顕微鏡観察に使用される榭脂製 プレート。
[2] 厚み力 0.02mn！〜 0. 3mmの範囲であることを特徴とする生物化学分野におい て微分干渉顕微鏡観察に使用される請求項 1に記載の榭脂製プレート。
[3] 面積が lmm2以下で、かつ、深さが 10 m以上の空間構造を表面に複数有するこ とを特徴とする請求項 1または 2に記載の榭脂製プレート。
[4] 生物化学分野において微分干渉顕微鏡測定に使用される請求項 3に記載の榭脂 製プレートを製造する方法であって、
基板上にレジストパターンを形成するステップと、基板上に形成されたレジストパター ン、又はその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記榭脂製プレートが有す る凹凸パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、
前記金属構造体の凹凸パターンを転写して榭脂製プレートを形成するステップとを 備えたことを特徴とする生物化学分野において微分干渉顕微鏡測定に使用される榭 脂製プレートの製造方法。
[5] 前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、レジストパターンを形 成するステップが、レジスト層が所望の高さ、又は深さを有する構造体に形成されるま で、複数回レジスト層の形成、露光を繰り返すステップを含むことを特徴とする請求項 4記載の榭脂製プレートの製造方法。
[6] 前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の 形成、露光を繰り返す際、露光における各層のパターンの位置が同じ位置になるよう に、パターンの位置を合わせるマスク位置合わせステップをさらに備えることを特徴と する請求項 4または 5記載の榭脂製プレートの製造方法。
[7] 前記基板上にレジストパターンを形成するステップにおいて、複数回レジスト層の 形成、露光を繰り返す際、異なるパターンのマスクを用いることで、少なくとも 2以上の 異なる深さの凹部を備えるレジストパターンが形成されることを特徴とする請求項 4ま たは 5に記載の榭脂製プレートの製造方法。
請求項 1に記載の榭脂製プレートを底面に備えた細胞培養容器。
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