WO2007074756A1

WO2007074756A1 - 免疫分析マイクロチップ、免疫分析用キット及び免疫分析方法

Info

Publication number: WO2007074756A1
Application number: PCT/JP2006/325730
Authority: WO
Inventors: Masaya Kakuta; Manabu Tokeshi; Hitoshi Izumida; Takahide Takadera; Kenji Miyagawa
Original assignee: Institute Of Microchemical Technology; Kansai Paint Co., Ltd.
Priority date: 2005-12-26
Filing date: 2006-12-25
Publication date: 2007-07-05
Also published as: CN101389961A; US20100261205A1; TWI324685B; KR20080084844A; US8802449B2; CN101389961B; KR101160345B1; JP4717081B2; TW200734641A; JPWO2007074756A1

Abstract

　マイクロチャネル内部に、流路抵抗を抑えつつ十分な反応面積を有するビーズの微小構造物を作製した免疫分析マイクロチップ及び微量試料に対する簡便・高感度な免疫分析方法の提供を課題とし、一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが光硬化した親水性樹脂中に均質分散保持された微小構造物を少なくとも一部に配置したマイクロチャネルを備えた、免疫分析マイクロチップ及びそのマイクロチップを用いた免疫分析方法により、該課題を解決した。

Description

明細書

免疫分析マイクロチップ、免疫分析用キット及び免疫分析方法

技術分野

[0001] 本発明は、免疫分析マイクロチップ及びそのマイクロチップを用いた免疫分析方法に関する。詳しくは、微細ビーズが均質に分散保持された親水性光硬化性榭脂溶液に露光処理を施すことにより、免疫分析用微小構造を微小流路中に形成した免疫分析マイクロチップ又は免疫分析キット、さらにはそのマイクロチップを用いた免疫分析方法に関する。

背景技術

[0002] 基板上に形成されたマイクロチャネル中に、抗体を表面に固定したビーズ体を導入し、該導入されたビーズ体をせき止め部によりせき止め、免疫分析用カラムとして用 V、、せき止め部を越えて流れる酵素反応生成物を熱レンズ顕微鏡等の分析ユニットにより分析する酵素免疫分析チップと酵素免疫分析方法が記載されて、る。（特許文献 1参照のこと。 )

[0003] これにより、従来のマイクロタイタープレートを用いての免疫分析法に比べ、検体量を大幅に低減でき、取り扱いが簡便で検出に要する時間も短縮できるようになった。

[0004] 一方、親水性硬化性榭脂、光重合開始剤、及びアルカリ金属または多価金属ィォンとの接触によりゲルィ匕する能力のある水溶性高分子多糖類を含んでなる液状組成物を、アルカリ金属または多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下して該組成物を粒状にゲル化し、活性光線を照射して硬化せしめてなる微生物の付着に適した表面を有する微生物菌体固定ィ匕用粒状担体が知られて、る。（特許文献 2参照のこと。）

[0005] また、マイクロチャネル内の細胞を含む溶液中に光架橋レジン滴を分散し、顕微鏡を用いて所望の細胞を選択し、その周囲にレーザ光を照射することによって、周囲の光架橋レジンを局所的に光重合し、該選ばれた細胞のみをマイクロチップ中に固定化する、単一細胞レベル実験用の局所的光重合を適用したマイクロチップ内単一細胞固定ィ匕技術が知られ、さらに照射時間と硬化レジンの径の関係についても知見が得られている。（非特許文献 1参照のこと。）

特許文献 1：国際公開第 2003Z062823号パンフレット

特許文献 2 :国際公開第 97Z19978号パンフレット

非特干文献 1 : Maruyama,H.,外 d名, Immobilisation of individual cells by local photo -polymerisation on a chip , The Analyst , The Royal Society of Chemistry, 2005年 1月 31日, (2005),130,p.304-310

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 特許文献 1のようにマイクロチャネルを用いることで、検体量を大幅に低減できるようになったものの、その反面、検体量が小さくなつたが故に反応生成物量も極端に少なくなり、その分析には熱レンズ顕微鏡といった特殊な分析機器を必要とするよう〖こなり、適用できる環境には自ずと限界があった。

[0007] 力かる技術的課題を解決する一つの方向性としては、反応効率を向上させて、少な、検体量であっても十分な量の反応生成物を生成させることであるが、反応効率を向上させるためには、反応面積を大きくすることが要請され、ビーズ径を更に小さくする必要がある。

[0008] ところが、さらにビーズ径を小さくした場合、ビーズ自体の取り扱!/、 (例えば、堰部までビーズを導入しカラムを形成すること）がー層困難になることはもちろんのこと、かかる小径のビーズが多数詰まったマイクロチャネル中に、検体等の液体を流すことは、ビーズ間の隙間長力もみて明らかなように、流路抵抗は非常に大きぐ処理液を流下させることができなくなると予想された。

[0009] 一方、特許文献 2や非特許文献 1のように、微生物や細胞を個別にビーズ状の親水性光硬化性榭脂中に固定ィ匕する技術は知られているものの、抗体が固定された微細ビーズを、マイクロチャネル内部に低流路抵抗を維持した状態で反応相として力ラム化することにつ、ては、何ら教示するところがな、。

課題を解決するための手段

[0010] そこで、発明者らは、流路抵抗を実用的な範囲に抑えつつ、微小ビーズのカラムを構築する手法にっ、て模索した結果、マイクロチャネルの断面を流路部とビーズを均質分散保持したカラム部に区分することにより、流路抵抗を抑える手法に思い至った

[0011] し力しながら、ビーズを均一分散保持したカラム部の親水性が低い場合には、検体等の液体を流下することはできても、カラムとしての機能はほとんど失われてしまうので、カラム部と流路部との間で液の浸透 *拡散が可能な程度の高い親水性を保った状態の三次元構造物を構築する手法が要請された。

[0012] し力も、免疫分析用のマイクロチャネルにおける問題は、抗体等の変性を避ける観点からビーズ等の導入後高温処理等ができな、ため、流路形成時に所望のカラム等を作り込んでおくことが難しぐその一方で、マイクロチャネルを形成した後に、該マイクロチャネル内にビーズを均質分散保持したカラム等の三次元構造物を事後的に製作することも相当難しい。

[0013] 発明者らは、マイクロチャネルを形成した後に三次元構造物を構築するために、まず、代表的な三次元塑造技術である光硬化性榭脂に対する露光処理によるリソダラフィー技術を応用することにつ、て検討した。し力し通常の光硬化性榭脂溶液を用 V、ただけでは、所望の三次元構造物をマイクロチャネル内に構築することはできても、本来のビーズカラムとしての機能を発揮しな、ことが判明した。

[0014] そこで、発明者らは、流路部とビーズカラム部間で十分な物質移動を可能にするために、三次元構造外形を維持できる範囲で緩くビーズを保持できる硬化処理にっヽて、光硬化性榭脂溶液の希釈割合と露光条件並びに三次元構造につ!ヽて模索した

[0015] その結果、 30%を越えて希釈された、一次抗体を固相化したビーズを懸濁した光硬化性榭脂溶液にあっても、遠心分離処理等を経ても崩れることのない、外径 40 m程度、高さ 100 m程度の円柱構造を形成できることを確認した。そして、マイクロチャネル内には、各カラム間の流路が確保されたため、三次元構造物の作り込みによる流路抵抗の増大は軽微で、ほとんど操作に支障とはならなヽことを確認した。

[0016] 本発明（1)は、一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが光硬化した親水性榭脂中に均質分散保持された微小構造物を少なくとも一部に配置した流路を備えた、免疫分析マイクロチップである。本発明（2)は、前記微小構造物が、前記微細ビーズが懸濁した親水性光硬化性榭脂溶液に対する露光処理によりパターユングされたものであることを特徴とする、本発明（1)の免疫分析マイクロチップである。

本発明（3)は、前記微小構造物が、親水性光硬化性榭脂溶液に対する露光処理によりパター-ングされた微小構造の周囲に、さらに導入された一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが懸濁された親水性光硬化性榭脂溶液に対する露光処理によりパター-ングされたものであることを特徴とする、本発明（1)の免疫分析マイク口チップである。

本発明（4)は、前記流路は、色調の異なる微細ビーズが分散保持された微小構造物が、流路方向に沿って順に配置されたものであることを特徴とする、本発明（1)〜本発明（3)の何れか 1発明の免疫分析マイクロチップである。

本発明（5)は、前記流路は、基板上に形成された溝と、開口部を少なくとも含む力バープレートによって形成されたものであることを特徴とする、本発明）〜本発明（

4)の何れか 1発明の免疫分析マイクロチップである。

本発明（6)は、前記流路は、幅 100 μ m以上 5000 μ m以下で深さが 50 μ m以上 200 m以下で、かつ毛細管現象により導入された液体を流路方向に流下可能な流路断面積の領域を少なくとも一部に含むものであることを特徴とする、本発明（1) 〜本発明（5)の何れか 1発明の免疫分析マイクロチップである。

本発明（7)は、前記流路は、開口部を少なくとも含む毛細管の内面によって区画された空間であることを特徴とする、本発明（1)〜本発明（4)の何れか 1発明の免疫分析マイクロチップである。

本発明（8)は、前記流路は、直径が 50 m以上 1000 m以下の円柱状又は一辺が 50 m以上 1000 m以下の角柱状であり、開口部を少なくとも含む毛細管の内面によって区画された空間であることを特徴とする、本発明（1)〜本発明（4)の何れ力 1発明の免疫分析マイクロチップである。

本発明（9)は、本発明（1)〜（8)の何れか 1発明の免疫分析マイクロチップと、標識された二次抗体を含む溶液又は標識された抗原を含む溶液、洗浄液、及び基質を含む試薬溶液が、該マイクロチップの流路に導入可能に同梱された、免疫分析用キットである。

本発明（10)は、流路を少なくとも 1つ含む基板を準備する工程、

一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが懸濁された親水性光硬化性榭脂溶液を導入し、毛細管現象により前記流路内に該親水性光硬化性榭脂溶液を充填する工程、

前記流路内に充填された前記親水性光硬化性榭脂溶液の少なくとも一部に対して、任意のパターンのフォトマスクを用いて露光を行う工程、

露光により硬化した領域を残し他の領域における未硬化の前記親水性光硬化性榭脂溶液を前記流路から除去し、さらにブロッキング溶液を流路に導入する工程、少なくとも被検出物質である抗原と、標識された二次抗体を含む溶液又は標識された抗原を含む溶液を前記流路内に順に又は同時に導入する工程、

洗浄後、基質を含む試薬溶液を前記流路内に導入する工程、

所定時間後に該二次抗体又は該抗原と該基質との反応生成物質の存在を検出する工程

とを少なくとも含む、微小構造物が配設された流路を含む検査チップを用いた免疫分析方法である。

本発明（11)は、前記流路は、開口部を含み、幅 100 m以上 5000 m以下で深さが 50 m以上 200 m以下であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、本発明（10)の方法である。本発明（12)は、前記流路は、基板上に形成された、幅 100 m以上 5000 m以下で深さが 50 m以上 200 m以下の上部開放の溝であり、少なくとも開口部を含むカバープレートにより覆われることによって形成されるものであることを特徴とする、本発明（10)の方法である。

本発明（13)は、前記流路は、開口部を含み、 50 m以上 1000 m以下の円柱状又は一辺が 50 μ m以上 1000 μ m以下の角柱状の毛細管の内面によって区画された空間であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、本発明（10)の方法である。

ここで、本発明における親水性光硬化性榭脂溶液とは、 1分子中に少なくとも 2個のエチレン性不飽和結合を有する親水性光硬化性榭脂 (a)、光重合開始剤 (b)を含んでなる水性液状組成物のことを、う。

[0018] 詳細には、上記親水性光硬化性榭脂 (a)は、一般に、 300〜30000、好ましくは 5 00〜20000の範囲内の数平均分子量を有し、水性媒体中に均一に分散するに充分なイオン性又は非イオン性の親水性基、例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、エーテル結合等を含み、かつ波長が約 250〜約 600nm の範囲内の活性光線を照射したとき、硬化して水に不溶性の榭脂に変わるものが好適に使用される。そのような光硬化性榭脂としては、包括固定化用の固定化担体として既に知られているものを用いることができる（例えば、特公昭 55— 40号公報、特公昭 55— 20676号公報、特公昭 62— 19837号公報等参照)。

[0019] 代表的なものとしては以下に記載するものを挙げることができる。

(i)ポリアルキレングリコールの両末端に光重合可能なエチレン性不飽和基を有する化合物：例えば、

'分子量 400〜6000のポリエチレングリコール 1モルの両末端水酸基を (メタ）アタリル酸 2モルでエステル化したポリエチレングリコールジ (メタ）アタリレート類、

'分子量 200〜4000のポリプロピレングリコール 1モルの両末端水酸基を (メタ）アタリル酸 2モルでエステル化したポリプロピレングリコールジ（メタ）アタリレート類、 '分子量 400〜6000のポリエチレングリコール 1モルの両末端水酸基をトリレンジイソシァネート、キシリレンジイソシァネート、イソホロンジイソシァネート等のジイソシァネート化合物 2モルでウレタン化し、次いで (メタ）アクリル酸 2—ヒドロキシェチル等の不飽和モノヒドロキシェチル化合物 2モルを付カ卩した不飽和ポリエチレングリコールウレタン化物、

'分子量 200〜4000のポリプロピレングリコール 1モルの両末端水酸基をトリレンジィソシァネート、キシリレンジイソシァネート、イソホロンジイソシァネート等のジイソシァネートイ匕合物 2モルでウレタン化し、次いで (メタ）アクリル酸 2—ヒドロキシェチル等の不飽和モノヒドロキシ化合物 2モルを付カ卩した不飽和ポリプロピレングリコールウレタン化物、など。

(ii)高酸価不飽和ポリエステル榭脂：不飽和多価カルボン酸を含む多価カルボン酸成分と多価アルコールとのエステル化により得られる酸価力 0〜200の不飽和ポリエステノレの塩類など。

(iii)高酸価不飽和エポキシ榭脂：エポキシ榭脂と (メタ)アクリル酸などの不飽和力ルポキシルイ匕合物との付加反応物に残存するヒドロキシル基に酸無水物を付カ卩して得られる酸価 40〜200の不飽和エポキシ榭脂など。

(iv)ァ-オン性不飽和アクリル榭脂：（メタ)アクリル酸及び (メタ）アクリル酸エステル力選ばれる少なくとも 2種の (メタ)アクリル系モノマーを共重合させて得られるカルボキシル基、リン酸基及び Z又はスルホン酸基を含有する共重合体に光重合可能なエチレン性不飽和基を導入した榭脂など。

(V)不飽和ポリアミド：トリレンジイソシァネート、キシリレンジイソシァネートなどのジィソシァネートとアクリル酸 2—ヒドロキシェチルなどのエチレン性不飽和ヒドロキシ化合物との付加物をゼラチンなどの水溶性ポリアミドに付加反応させた不飽和ポリアミドなど。

(vi) 不飽和ポリビニルアルコール榭脂：平均重合度 300— 5000、平均ケン化度が 7 0%以上のポリビュルアルコール榭脂と N-ヒドロキシアルキル (メタ）アクリルアミドとの縮合により重合性不飽和基が導入された榭脂。 N-ヒドロキシアルキル (メタ)アクリルアミドとしては例えば、 N-メチロールアクリルアミド、 N-メチロールメタクリルアミド、 Ν,Ν -ジメチロールアクリルアミド、 Ν,Ν-ジメチロールメタクリルアミド、 Ν-ヒドロキシェチルァクリルアミド、 Ν-ヒドロキシェチルメタクリルアミドなどが挙げられる。

以上に例示した如き光硬化性榭脂はそれぞれ単独で使用することができ、或いは 2種もしくはそれ以上組み合わせて使用してもよい。

[0020] これらの光硬化性榭脂のうち、本発明において特に有利に使用しうるものは、前記

(i)のポリアルキレングリコールの両末端に光重合可能なエチレン性不飽和基を有する化合物などであり、代表的なものとしては、関西ペイント株式会社から ENT— 100 0、 ENT— 2000、 ENT— 3400、 ENTG— 1000、 ENTG— 2000、 ENTG— 380 0、 ENTP— 2000、 ENTP— 4000、 ENTV— 500等の商品名で販売されているものを挙げることができる。

[0021] 光重合開始剤 (b)は、光照射により分解してラジカルを生成し、このものが重合開始種となって重合性不飽和基を有する榭脂間に橋かけ反応をおこさせるものであり、例えば、ベンゾインなどの α—カルボ-ル類；ベンゾインェチルエーテルなどのァシ口インエーテル類：ナフトールなどの多環芳香族化合物類;メチルベンゾインなどの a -置換ァシロイン類； 2 -シァノ— 2—ブチルァゾホルムアミドなどのァゾアミド化合物類などを挙げることができる。

[0022] 上記 (a)及び (b)の各成分の使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の種類等に応じて広範にわたって変えることができる力一般には、（a)成分の親水性光硬化性榭脂 100質量部に対し、光重合開始剤 (b)は 0.1〜5質量部、好ましくは 0 . 3〜3質量部の割合で使用するのが適当である。

[0023] なお、一次抗体を固相化するビーズには、ポリスチレン、ガラス、ラテックス、ァガロースなどを用いることが可能である。また、磁性、色素含有、蛍光色素含有ビーズや表面がカルボキシル基、アミノ基、エポキシ基などが表面処理されたビーズを用いることが可能である。粒径は 0. 1 μ m力 50 μ m程度のものを用いることができる。

[0024] なお、標識方法にはペルォキシダーゼの他に、アルカリフォスファターゼ、ダルコ一スォキシダーゼ、ゥレアーゼなどの酵素を用いることができる。さらに、その発色基質を選択することにより、蛍光、化学発光、有色などの発色を得ることができる。また、標識方法として金コロイドや量子ドットなどのナノ材料などを用いることが可能である。図面の簡単な説明

[0025] [図 1]本発明の微小構造物の製作に用いたフォトマスクの一例 (拡大写真)を示す図 [図 2]本発明のマイクロチャネル内部における微小構造物の配置の一例を示す図 [図 3]本発明の一次抗体が固相化されたビーズが親水性光硬化性榭脂に均質分散保持された微小構造物 (拡大写真)の一例を示す図

[図 4]本発明のビーズ色の異なる微小構造物を流路方向に配置したマイクロチャネルの一例を示す図

[図 5]本発明のマイクロチップにおける発色状態の一例を示す図

[図 6]本発明のマイクロチップのレイアウトの一例を示す模式図

[図 7]本発明の流路を複数配置したマイクロチップの一例を示す模式図

[図 8]本発明の実施例 1にかかる心疾患マーカー BNPについての濃度検量線の一例を示す図

[図 9]本発明の実施例 2にかかるプリオンタンパク質 rPrPについての濃度検量線の一例を示す図

[図 10]本発明の実施例 3にかかるキヤビラリ一チューブ内に三次元微小構造物を配置したマイクロチップの一例を示す模式図

[図 11]本発明の実施例 3にかかるマイクロチップの顕微鏡写真

符号の説明

C 光硬化性榭脂が光硬化して形成された微小構造物

B 一次抗体が表面に固相化されたビーズ粒子

FP 流路部

1 チップ本体

2 メイン流路

3 サブ流路

4 サブ流路

5 カラム領域

6 洗浄液用リザーバータンク

7 二次抗体溶液用リザーバータンク

8 廃液用タンク

9 ダイヤフラム

10 ダイヤフラム

11 試料導入口

12 試料等導入口

13 試料等排出口

14 検出窓

15 キヤビラリ一チューブ

16 開放端部

17 三次元構造物

発明を実施するための最良の形態 [0027] く光硬化性榭脂溶液の調製〉

光硬化性榭脂原液（関西ペイント製商品名： ENT— 2000)： 100 Uこ、水 100 Lと開始剤べンゾインェチルエーテル 2 Lを混合して、本発明に用いる光硬化性榭脂溶液とした。ここで、水による希釈は、該溶液をマイクロチャネル中に導入時の粘性を低減しつつ、光硬化後ゲルの親水性を向上させるためのものである。希釈割合は、 0. 1〜： L000%の範囲であれば、適用可能である。

[0028] 〈フォトマスク〉

三次元構造物を作製する際の光硬化性榭脂溶液に対する露光処理には、図 1〖こ例示されるフォトマスクを用いた。このフォトマスクは、露光波長光が透過しうる材質で構成されるフィルムであって、露光しな、部分に対応した遮光パターンが印刷されたものを用いた。図 1のフォトマスクは、直径 400 mの円形パターンがピッチ 600 m で最密配置されたものである。

[0029] 〈マイクロチップ用基板〉

本発明のマイクロチップ用基板には、ガラス製基板を用いた。基板コストを最小限に抑えるため、流路幅 1000 m、流路深さ 100 mの直線上の上部開放溝を有する基板に、導入口と排出口が穿作されたカバープレートを加熱圧着することにより、作製した。流路幅、流路深さを小さくすることは、三次元構造物を事後的に作り込む際、目詰まり等の支障となる恐れがあるとともに反応生成物による発色の視認性を改善するために、幅 100 μ m以上 5000 μ m以下で深さが 50 μ m以上 200 μ m以下であることが望ましぐ毛細管現象により液体を導入できる範囲のものに制限される。

[0030] 以上の部材を準備した上で、以下の手順により、前記マイクロチップのマイクロチヤネル内部に、光硬化性榭脂の三次元構造物を作製する予備実験を行い、諸条件を把握した。

[0031] (0希釈済みの光硬化性榭脂溶液をマイクロチップにピぺッタを用いて導入し、毛細管現象によってマイクロチャネル内を流下させ、全体に行き亘らせた。次に、 GO蛍光顕微鏡のステージにフォトマスクをおき、その上に予め準備しておいたマイクロチップをフォトマスクとマイクロチャネルとを位置合わせして設置し、対物レンズ及び絞りにより照射範囲を選択し、 NDフィルタ一により照射強度を制御して照射した。 [0032] 具体的な推奨される条件としては、対物レンズ 10倍、絞りなし、 NDフィルターなしの場合にあっては、照射時間は 3秒であり、光の強度は波長 364nmで 13mWZcm² である。その結果を図 2に示す。なお、図中 Cは、円柱状の微小構造物を上方から観察したものであって、平均直径はおよそ 420 m程度であると見積もられた。

[0033] そこで、上述の予備実験の条件を参考に、一次抗体が結合しているビーズが懸濁された親水性光硬化性榭脂溶液について、同様の三次元構造物（円柱状のビーズが均質に均一分散保持されたカラム)の作製を試みた。

[0034] 具体的には、（0)同様に、 ENT— 2000を 100 μ L、水を 100 μ L、開始剤べンゾィンェチルエーテル 1 _μ Lを混合し、光硬化性榭脂溶液を準備した。そして、予め用意しておいた一次抗体を固相化したビーズ溶液から 100 Lを取り分け、遠心分離処理にてその上清を廃棄して残ったビーズ溶液に光硬化性榭脂溶液 100 μ Lを導入し混合した。

[0035] 次に、（0こうして作製されたビーズが懸濁した光硬化性榭脂溶液 100 μ Lを、予め用意してぉ、たマイクロチップのマイクロチャネルに、導入口力もピペットで導入し、マイクロチャネルの毛細管現象によりマイクロチャネル内において該溶液を流下させ、全体に行き亘らせた。

[0036] そして、 GO蛍光顕微鏡のステージにフォトマスクをおき、その上に予め準備してお V、たマイクロチップをフォトマスクとマイクロチャネルとを位置合わせして設置し、対物レンズ及び絞りにより照射範囲を選択し、 NDフィルタ一により照射強度を制御して照射した。

[0037] 次に、露光により硬化した領域を残して、未硬化の光硬化性榭脂溶液をマイクロチャネルから洗浄'排出した。こうして、図 3に示すとおり、ビーズが略均一に分散保持された光硬化性榭脂の円柱状構造物（円柱の平均直径は 420 μ mと見積もられた)がマイクロチャネル中に作製することができた。また円柱構造物内部にほの暗く見える粒子（図中 B)が硬化したレジン中に分散保持されたビーズの陰影である。なお、図 3 のビーズが均質分散保持されたカラム周囲の灰色で示した領域 (図中 FP)は、酵素反応によって発色基質が発色し、カラム周辺が薄、青色を呈した。

[0038] このマイクロチャネルにシリンジポンプにより水を導入した力この円柱構造物は崩れることはな力つた。さらに、遠心分離機によりマイクロチップ内に導入された水溶液を排出してみたが、これによつても円柱状の立体構造物は崩れな力つた。以上のことから、こうして作製された三次元構造物は、通常想定されるマイクロチップに対する操作に対して、十分な物理的強度があることが確認できた。したがって、溶液のマイクロチャネル内の導入には毛細管現象が利用でき、排出には遠心分離機等を適用して迅速に処理できることが判明した。

[0039] さらに、導入するビーズ種 (表面に固相化された抗体種)を変更しつつ露光処理を繰り返すことによって、 1本のマイクロチャネル内に、複数種の検体について同時に検出可能なアツセィを構築したものを、図 4に示す。ここでは、検出操作の際の視認性を考慮して、抗体種に対応させてカラム毎に導入するビーズの色も変更した（図中、濃淡はカラムの色の違いを示す)。さらに、色ビーズと白又は透明ビーズの混合比を変えることによって、カラム色に濃淡や、マイクロチャネル方向にカラーグラデーションをつけることも可能である。

[0040] 一方、ビーズ色の選択による着色カラムを配置する技術を応用すれば、目視での検出感度を向上させることもできる。目視での発色検知は、個人差も手伝って、かなり高濃度の試料でなければ適用することが難しぐプライベートユースへの適用は制限されているのが実情である。例えば、一般人の青色発色に対する判別能力は、深さ 100 μ mのとき、熱レンズ顕微鏡出力値に換算して 1000 μ V前後であると考えられる。

[0041] し力しながら、この程度の発色強度の試料に対しては、発色検知に熟練を要するば力り力、プライベートでの検査ニーズの高い検体種の多くは 1000 μ V未満に相当する濃度の検体であることが多いため、目視感度を増感できなければ、実用性が損なわれることち懸念される。

[0042] そこで、本発明者らは、補色による視認性の違いに着目して、例えば、色相環にお V、て反対側に位置する色 (SAT Blueの青色に対する橙色）のビーズカラム群を中央にして、その前後に色相環で 90度に位置する黄緑色と紫色にビーズカラム群を、そして、さらにその周りに青色のビーズカラム群を配置する、 5群のカラム群力もなるマイクロチャネル構成を考案した。 [0043] これにより、青色発色が微かな、稀薄な検体濃度の試料 (例えば、熱レンズ顕微鏡出力値に換算して 1000 Vを僅か〖こ下回るような試料）にあっても、少なくとも中央の橙色のカラム群における発色を容易に識別可能になった。場合によっては、目視による観察を容易にするため、マイクロチャネルのカラムが配置された領域に対応するカバープレートに所要の曲率の凸部を設け、拡大視できるように構成しても良い。

[0044] 一方、本発明の免疫分析チップは、従来のタイタープレート法による分析時間（心疾患マーカー BNPの場合に 4— 5時間）を、おおよそ 20分と大幅に短縮することに成功したものの、、わゆる上述の特許文献 1に例示されるマイクロチップ ELISA法の分析時間約 15分に対し、同等と考えられる力本発明者らは、カラムデザインにさらに工夫を加えた。

[0045] すなわち、本発明の図 3に示す免疫分析マイクロチップは、各カラムの全体に亘って均質にビーズが分散保持された構成であることから、検体がカラム全体に含浸した後に発色剤が導入され、それがカラム全体に含浸し、さらにその発色した反応生成物がカラム力浸み出し、カラム周囲の流路部に一様に拡散するまでの時間を不可避的に要するシステムであり、その分時間が力かる。

[0046] そこで、本発明者らは、まず含浸する時間を短縮するために、ビーズの分布を円柱状の三次元構造物の周囲に限定することとした。すなわち、支柱となる親水性光硬化性榭脂層を先に形成し、その後で一次抗体が表面に固相化されたビーズが懸濁する親水性光硬化性榭脂溶液を導入して、先の支柱と同軸に位置決めした露光処理を施し、円筒状のカラムを作製することにより、含浸時間を短縮することに成功した

[0047] この場合、ビーズ量が減少することに伴い、反応生成物量も稀薄化することから、力ラム周辺の流路への反応生成物の浸出過程を省き、カラム毎にドーナツ状に分布するビーズ表面を直接熱レンズ顕微鏡等で局所分析することが望ましい。これにより、さらに分析時間を短縮でき、トータルで 5〜10分程度の分析時間の短縮が可能になる

[0048] 次に、本発明に力かる免疫分析マイクロチップのレイアウトの一例を図 6に模式的に示す。チップ本体（1)はガラス基板とカバープレートからなり、ガラス基板上にメイン流路（2)、サブ流路（3, 4)に相当する溝が形成されているとともに、洗浄液用リザーバータンク（6)と二次抗体溶液用リザーバータンク（7)に相当する凹部が形成されている。

[0049] またメイン流路 (2)には、光硬化性榭脂内にビーズが均質保持された微小構造物である柱状のカラムが溝の深さ方向に林立するカラム領域 (5)が複数箇所配置されている。但し、流路壁とカラムの間には隙間があり、液体の流下を妨げないように形成されている。カラム領域（5)毎に、色及び Z又は固相化されている一次抗体が異なるビーズが均質保持されている柱状のカラムとすることにより、領域毎に異なる検体について及び Z又は異なる視認性で一度に分析することが可能になる。

[0050] さらにメイン流路（2)の一端は、カバープレートに形成された試料導入口（11)とそれに対応する凹部に連通するとともに、他端は廃液用タンク（8)に連通している。該試料導入口（11)に対応する凹部には、 2つのサブ流路（3, 4)が連通する。これらのサブ流路（3, 4)は、他端側でそれぞれ洗浄液用リザーバータンク (6)と二次抗体溶液用リザーバータンク（7)に連通する。

[0051] 検体を含む試料を試料導入口（11)にマイクロシリンジ又はピペットを用いて導入する。メイン流路（2)はサブ流路（3, 4)よりかなり太いことから、導入された試料はサブ流路（3, 4)に侵入することなぐ毛細管現象によってメイン流路（2)内に流入する。試料のメイン流路（2)内への導入完了後、試料注入口（11)を栓等により閉鎖する。

[0052] 洗浄液用タンク (6)と二次抗体溶液用タンク（7)に対応するカバープレート領域には、気密性の弾性体力もなるダイヤフラム（9, 10)が配置され、洗浄液や二次抗体を含む二次抗体溶液をメイン流路（2)に導入したいときには、対応するダイヤフラム（9 , 10)を押下しリザーバータンクタンク（6, 7)内の液体を流下させる。前述のとおり、試料導入口（11)が密栓されていることから、ダイヤフラム（9, 10)の押下を加減することで、洗浄液や二次抗体溶液のメイン流路（2)内の位置を制御できる。

[0053] 一方、カバープレートは、少なくともカラム領域 (5)に対応する部分が透明に構成されてヽることから、該領域における導入された溶液の発色等を外部から観察できる。なお、図 6の態様では、リザーバータンクやドレインタンクを予めチップ内に作り込んだ検査キットの提供のために、 1つのチップに対しメイン流路（2)を 1つ設けたものについて説明を行ったが、試薬や洗浄液の導入排出を検体の導入排出と同様にピぺット等を用いて手動で行うことを想定するチップに関しては、図 7のように 1つのチップ本体（1)に対し、試料等導入口（12)と試料等排出口（13)を別々に設けた、カラム領域 (5)を含むメイン流路 (2)を複数本配置することもでき、複数種の免疫分析を同時平行的に実施可能となり好適である。図 7のようにカラム領域（5)を、カバーガラス力なる検出窓（14)部に集中配置することにより、図 5等の例示される配置に比べ、チップの外形サイズを小さく抑えることが可能になり、顕微鏡等の検出系に対する位置合わせ操作性等が向上し、より好適である。

[0054] なお、本発明に力かる免疫分析マイクロチップは、各カラム周辺の流路部体積を操作に支障とならな、範囲で小さく設定したことから、基質の酸化還元反応を停止する試薬を導入せずとも、二次抗体溶液導入から 10分程度で、基質と反応生成物の移動律速により発色が所定の水準に落ち着くので、分析の時間依存性から開放され、分析者の手際等に分析結果が大きく影響されなくなった。

実施例

[0055] (実施例 1)

本マイクロチップを心疾患マーカー：ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド BNPの検出に適用した例を以下に示す。ビーズに固相化する一次抗体、抗原、酵素標識二次抗体としては、塩野義製薬から提供された、 BC203、 BNP、 Fa -HRPをそれぞれ用いた。

[0056] 操作手順としては、一次抗体の結合したビーズと光硬化性榭脂溶液 (ENTG - 20 00を 100 μ L、水を 100 μ L、開始剤べンゾインェチルエーテル 1 μ L)を混合して作製した混合溶液を、毛細管現象によりマイクロチャネル内に導入し、フォトマスクを用いて、 NDフィルターなし、対物レンズ 4倍で、照射時間 4秒の露光を行った。

[0057] 未硬化の光硬化性榭脂溶液をマイクロチャネルから除去した上で、ビーズ等にタンノク質が非特異的に結合するのを防止するために、 1%—ゥシ血清アルブミン BSAとリン酸緩衝生理食塩水 PBSのブロッキング液 2 μ Lによりマイクロチャネル内部のビーズカラムを処理した。このブロッキング処理に要する時間は約 60分である。

[0058] 次に、前記抗原 (検体に相当する。 )と二次抗体溶液 2 μ Lをマイクロチャネル内に導入した。ビーズ上に固相化された一次抗体との反応する時間を考慮して、その状態で 10分間保持した。その後、 0. 01%のポリオキシモノラウレート Tween20と PBSの混合溶液 10 Lにより、マイクロチャネル内の洗浄を行った。

[0059] その後、 SAT Blue酸化還元系発色試薬 2 μ Lを導入し、ビーズ上に固相化された一次抗体—抗原—酵素標識二次抗体の検出系と接触させ、酵素標識にかかる酸ィ匕還元反応を通じて青色に発色させた。その結果を図 5に示す。図 5中、マイクロチヤネルにそって、縞状の陰影に表示された部分、ビーズカラムが配置された領域であつて、流路幅全体に亘つて青色を呈している。

[0060] 円柱状の構造物力その周囲の流路部に浸出し、青色を呈した流路部における酵素と反応した試薬を、熱レンズ顕微鏡を用いて検出した。以上の処理を、導入する抗原の濃度を 0. 1〜： LOOOpgZmLの範囲で変更して繰り返し、縦軸に熱レンズ顕微鏡の出力信号強度をとつて検量線形式でまとめたものを図 8に示す。

[0061] その結果、再現性は高ぐその検出限界は、 lOpgZmL程度であると見積もられた。心不全診断において、カットオフレベルを 100pg/mLに設定しており、本実施例の検出限界は、十分実用に耐えるものと評価された。

[0062] (実施例 2)

一方、本発明をプリオンタンパク質の検出に適用した例を以下に示す。検出系として、一次抗体に T2、抗原に rPrP、酵素標識二次抗体に T17を用いた点を除き、その他の条件は、上述の実施例 1と同じとした。

[0063] その結果を、図 9に示す。検出限界は一回の測定あたり 4pg程度であると見積もられた。検出限界が 60pgであると言われる ELISA法と同等であるものの、検出時間は、 ELISA法ではおよそ 4— 5時間であるのに対し、本発明では 20分程度で済むことから、実用上も十分な利点を備えていると評価された。

[0064] (実施例 3)

また、通常のリソグラフィー手法を用いて基板上に形成された流路に代えて、既存又は製作したキヤビラリ一チューブ (毛細管現象による液体の導入が可能な細管）を利用して、該チューブ内の既存の管内空間を流路として、本発明の微小構造物を作り込み、免疫分析マイクロチップとすることにつ、ても試みた。 [0065] キヤビラリ一チューブの断面は、円形、角形の何れであっても利用することができ、断面が円形の場合、直径は 50〜： LOOO /z mの範囲のものを利用でき、一方、断面が角形の場合、一辺が 50〜： L000 mの範囲のものを利用できる。また、その材質に特に制限はなく、ガラス製でもプラスチック製でも利用できる。

[0066] 但し、キヤビラリ一チューブを本発明にかかる微小構造物を作り込むための流路として利用するためには、微小構造物をパターユングする必要があることから、露光に必要とされる程度の露光光波長に対する透明度を持った材質であることを要する。また、微小構造物のパターニング精度の観点から、極端に複雑な断面形状を有するキャピラリーチューブの使用は避けるべきである。

[0067] ここで、円筒状のキヤビラリ一チューブを利用した場合における微小構造物の配置の一例を、図 10に模式的に示す。図 10の（a)は、キヤビラリ一チューブを一方の開放端側から見た側面図であり、図 10の (b)は、キヤビラリ一チューブをチューブ内に成形されら微小構造物の露光軸方向から見た正面図であり、図 10の（c)は、キヤビラリーチューブの斜視図である。

[0068] なお、内径力 30 m (外径が 900 μ m)、軸線長さが 32mm、管内容量が 10 μ L である、両側に開放端部（16)を有するキヤビラリ一チューブ（15)を用いた。但し、図 10はあくまで模式的に示したものであって、寸法比等を厳密に反映したものではない。

[0069] 具体的には、一次抗体として、マウス抗ヒ HgEモノクローナル抗体（ベックマンコールター製)、抗原として、ヒ HgE (ャマサ製)、酵素標識二次抗体として、 HRP—抗ヒト I gE抗体 (Goat- Poly) (KPL製)を採用して、次の操作手順にしたがって、キヤビラリ一チューブ内に本発明にかかる微小構造物を製造した。

[0070] 一次抗体の固定したビーズが光硬化性榭脂液に混合懸濁された液体に、キヤビラリーチューブの一端を浸漬し、キヤビラリ一チューブの毛細管現象を利用して、該光硬化性榭脂液を管内に導入した後、チューブの外側、微小構造物を配置したい箇所に合わせてフォトマスクを配置し、フィルターなし、対物レンズ倍率が 4倍の光学系を用いて、照射光量を 55mWZcm²に制御された光を 3秒間照射し、所定領域の光硬化性榭脂を硬化させ、フォトマスクの陰となった領域の未硬化光硬化性榭脂液を排出除去ずる。

[0071] 露光された領域には、光硬化した榭脂が微小構造物（17)としてキヤビラリーチユーブ（15)内の流路を横切る形で残置する。その様子を示す顕微鏡写真が図 11である。図 11のとおり、フォトマスクのパターンに沿った断面形状の三次元構造物（17)がキャピラリーチューブ（15)内に残置される。但し、露光用光源の照射光量や露光時間を制御することにより、光硬化性榭脂が硬化する深さは変化するので、キヤビラリーチユーブの形状による屈折効果とも相まって、フォトマスクのパターンに通りの円柱や角柱がキヤビラリ一チューブの反対側側面まで到達するとは限らず、泡がチューブ内面に張り付いたような形状の三次元構造物（図 10左側の白色を呈する領域)とすることもできる。このような三次元構造体形状を選択した場合、流路抵抗が小さくなり、試薬や検体等の液体の導入'排出が容易になるという利点がある。

[0072] この三次元構造物を含むキヤビラリ一チューブに対して、 1%—ゥシ血清アルブミン BSAとリン酸緩衝生理食塩水 PBSのブロッキング液 10 μ Lを導入し 60分間保持することによりブロッキング処理を施した後、前記抗原 (ヒ HgE (ャマサ製)）と二次抗体溶液 (HRP—抗ヒ HgE抗体 (Goat- Poly) (KPL製)） 10 Lを同様に毛細管現象を利用して導入して 10分間保持し、さらに 0. 01%のポリオキシモノラウレート Tween20と PBS の混合溶液 10 Lで洗浄を行い、 SAT blue酸ィ匕還元系発色試薬 10 Lを導入し 10 分間保持したところ、青色の発色が目視により確認できた。

[0073] (実施例 4)

実施例 3と同じ一次抗体が固定した橙色のビーズと白色のビーズを別々に用意し、実施例 3と同様な手法で、それぞれ別々のキヤビラリ一チューブ内に三次元構造物を作製した。これらのキヤビラリ一チューブに対して、 1%—ゥシ血清アルブミン BSAとリン酸緩衝生理食塩水 PBSのブロッキング液 10 μ Lを導入し 60分間保持することによりブロッキング処理を施した後、前記抗原 (ヒ HgE (ャマサ製) )と二次抗体溶液 (HR P—抗ヒ HgE抗体 (Goat- Poly) (KPL製)） 10 Lを同様に毛細管現象を利用して導入して 10分間保持し、さらに 0. 01%のポリオキシモノラウレート Tween20と PBSの混合溶液 10 Lで洗浄を行い、 SAT blue酸ィ匕還元系発色試薬 10 Lを導入し 10分間保持した。 [0074] その結果、白色ビーズを導入したキヤビラリ一チューブにおける発色強度と橙色ビーズを導入したキヤビラリ一チューブにおける発色強度は、物理量としては同じであるにも拘わらず、白色ビーズを導入したキヤビラリ一チューブにおける発色に比べ、橙色ビーズを導入したキヤビラリ一チューブにおける発色の方力ビーズと試薬の色のコントラストが鮮明であるためカゝ、視認性に優れてヽることを確認した。

産業上の利用可能性

[0075] 本発明は、基板上の汎用のマイクロチャネル (乃至汎用のキヤビラリ一チューブ）に対し事後的にビーズカラムの三次元構造物を作り込むことによって、少量の検体であつても、迅速簡便に且つ高感度に検出可能な免疫分析マイクロチップ乃至免疫分析用チップ、又はそのマイクロチップを用いた免疫分析方法を提供するものである。

[0076] また、本発明は、カラムにおける反応生成物を熱レンズ顕微鏡等の分析機器を用いて分析することにより、極微量の試料に対しても定量分析が可能であるとともに、ビーズの着色による視認性の向上により、複数種の検体を同時に検知可能であるばかりでなぐ極低濃度の場合を除く低濃度域の検体については、特別な分析機器を用いることなく目視での検出をも可能とした、可搬性に優れた免疫分析マイクロチップ乃至免疫分析用チップを提供するものである。また、実用的な観点から敬遠されてきたラジオアイソトープ、毒性物質、感染性が懸念されている物質に対して、被爆の可能性を低く抑えることが可能である。

Claims

請求の範囲

[1] 一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが光硬化した親水性榭脂中に均質分散保持された微小構造物を少なくとも一部に配置した流路を備えた、免疫分析マイク口チップ。

[2] 前記微小構造物が、前記微細ビーズが懸濁した親水性光硬化性榭脂溶液に対する露光処理により任意の形にパターユングされたものであることを特徴とする、請求項 1記載の免疫分析マイクロチップ。

[3] 前記微小構造物が、親水性光硬化性榭脂溶液に対する露光処理によりパターニングされた微小構造の周囲に、さらに導入された一次抗体が表面に固相化された微細ビーズが懸濁された親水性光硬化性榭脂溶液に対する露光処理によりパターニングされたものであることを特徴とする、請求項 1記載の免疫分析マイクロチップ。

[4] 前記流路は、一次抗体が表面に固相化された色調の異なる微細なビーズが分散保持された微小構造物が、流路方向に沿って順に配置されたものであることを特徴とする、請求項 1〜3の何れか 1項記載の免疫分析マイクロチップ。

[5] 前記流路は、基板上に形成された溝と、開口部を少なくとも含むカバープレートによって形成されたものであることを特徴とする、請求項 1〜4の何れか 1項記載の免疫分析マイクロチップ。

[6] 前記流路は、幅 100 μ m以上 5000 μ m以下で深さが 50 μ m以上 200 μ m以下で

、かつ毛細管現象により導入された液体を流路方向に流下可能な流路断面積の領域を少なくとも一部に含むものであることを特徴とする、請求項 1〜5の何れ力 1項記載の免疫分析マイクロチップ。

[7] 前記流路は、開口部を少なくとも含む毛細管の内面によって区画された空間であることを特徴とする、請求項 1〜4の何れか 1項記載の免疫分析マイクロチップ。

[8] 前記流路は、直径が 50 μ m以上 1000 μ m以下の円柱状又は一辺が 50 μ m以上 1 000 m以下の角柱状であり、開口部を少なくとも含む毛細管内面によって区画された空間であることを特徴とする、請求項 1〜4の何れか 1項記載の免疫分析マイクロチップ。

[9] 前記請求項 1〜8の何れか 1項記載の免疫分析マイクロチップと、標識された二次抗体を含む溶液又は標識された抗原を含む溶液、洗浄液、及び基質を含む試薬溶液力該マイクロチップの流路に導入可能に同梱された、免疫分析用キット。

[10] 流路を少なくとも 1つ含む基板を準備する工程、

とを少なくとも含む、微小構造物が配設された流路を含む検査チップを用いた免疫分析方法。

[11] 前記流路は、開口部を含み、幅 100 μ m以上 5000 μ m以下で深さが 50 μ m以上 200 /z m以下であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、請求項 10記載の方法。

[12] 前記流路は、基板上に形成された、幅 100 μ m以上 5000 μ m以下で深さが 50 μ m以上 200 m以下の上部開放の溝であり、少なくとも開口部を含むカバープレートにより覆われることによって形成されるものであることを特徴とする、請求項 10記載の方法。

[13] 前記流路は、開口部を含み、 50 m以上 1000 m以下の円柱状又は一辺が 50 μ m以上 1000 μ m以下の角柱状の細管の内面によって区画された空間であり、毛細管現象により開口部に導入された液体が流路方向に流下されるものであることを特徴とする、請求項 10記載の方法。