WO2007071578A2 - Verfahren zur herstellung von 5 -norbornen-2-carbonsäure aus 5-norbornen-2-carbonitril unter verwendung einer arylacetonitrilase - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 5 -norbornen-2-carbonsäure aus 5-norbornen-2-carbonitril unter verwendung einer arylacetonitrilase Download PDF

Info

Publication number
WO2007071578A2
WO2007071578A2 PCT/EP2006/069511 EP2006069511W WO2007071578A2 WO 2007071578 A2 WO2007071578 A2 WO 2007071578A2 EP 2006069511 W EP2006069511 W EP 2006069511W WO 2007071578 A2 WO2007071578 A2 WO 2007071578A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
norbornene
polypeptide
acid molecule
carbonitrile
Prior art date
Application number
PCT/EP2006/069511
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007071578A3 (de
Inventor
Maria Kesseler
Bernhard Hauer
Original Assignee
Basf Se
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Se filed Critical Basf Se
Priority to JP2008546361A priority Critical patent/JP2009519724A/ja
Priority to EP06841323A priority patent/EP1966381A2/de
Priority to US12/158,378 priority patent/US20080265206A1/en
Priority to CA002626763A priority patent/CA2626763A1/en
Publication of WO2007071578A2 publication Critical patent/WO2007071578A2/de
Publication of WO2007071578A3 publication Critical patent/WO2007071578A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of 5-norbornene-2-carboxylic acid from 5-norbornene-2-endo-carbonotril and / or 5-norbornene-2-exo carbonitrile.
  • the invention relates to a process in which 5-norbornene-2-carboxylic acid can be prepared at a high substrate concentration.
  • the invention relates to a polypeptide suitable for the enzymatic conversion of 5-norbornene-2-carbonitrile to 5-norbornene-2-carboxylic acid, in particular also at a high substrate concentration and a nucleic acid encoding the polypeptide, a composition comprising 5-norbornene-2 carbonitrile to 5-norbornene-2-endo-carboxylic acid and 5-norbornene-2-exo-carboxylic acid, and the use of the polypeptide.
  • 5-norbornene-2-carboxylic acid is used as a substrate for a variety of organic syntheses and is particularly suitable for the preparation of cyclic olefin copolymers (COC), pharmaceutical intermediates, pesticides or fragrances.
  • COC cyclic olefin copolymers
  • 5-norbornene-2-carboxylic acid can be produced substantially only chemically chemically.
  • a particular disadvantage is that the known processes lead to mixtures of isomers from which the I-someren have to be isolated by complex purification processes.
  • the invention therefore an object of the invention to provide a method to produce the fermentative economically 5-norbornene-2-carboxylic acid.
  • the invention relates to a process for the enzymatic preparation of
  • R1-R9 may each independently be: H. linear or branched alkyl of one to six carbon atoms, cycloalkyl of two to six carbon atoms, unsubstituted, amino, hydroxy or halo-substituted aryl of from 3 to 10 carbon atoms, and wherein
  • R5 and R7 as well as R8 and R9 can also form a cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms, e.g. Cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl;
  • R8 and R9 as well as R5 and R7 may also bear exocyclic double bonds with optional substituents;
  • R3 and R4 may form a ring (4,5,6) or may be part of a fused aromatic;
  • compound I in particular 5-norbornene-2-carbonitrile
  • compound II in particular 5-norbornene-2-carboxylic acid
  • arylacetonitrilases EC 3.5.5.5
  • Nitrilases are enzymes which catalyze the hydrolysis of nitriles into the corresponding carboxylic acids and ammonium ions (Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer Verlag Berlin / Heidelberg, 1992). Nitrilases were first described in plants (Thimann and Mahadevan (1964) Arch Biochem Biophys 105: 133-141) and later found in many microorganisms as well.
  • Nitrilases have different substrate specificities, but can roughly be classified into three groups: nitrilases specific for aliphatic nitriles, nitrilases, specific for aromatic nitriles and nitrilases specific for arylacetonitriles.
  • nitrilases The enzymatic synthesis of chiral and achiral carboxylic acid and ⁇ -hydroxycarboxylic acids with nitrilases is described in the prior art. Most nitrilases are very substrate specific and can only react a few substrates; Thus, their application is limited to the implementation of only one or a few nitriles with economic efficiency. It is therefore advantageous to provide nitrilases which can react new compounds with high efficiency or favorable conditions.
  • nitrilase as used herein includes all polypeptides that possess nitrilase activity.
  • nitrilase activity means the ability to hydrolyze nitriles in their corresponding carboxylic acids and ammonium.
  • nitrilase activity means the ability of an enzyme to catalyze the addition of two molar equivalents water to a nitrile group, so that the corresponding carboxylic acid is formed: R-CN + 2 H 2 O ⁇ R-COOH + NH 3.
  • nitrilase preferably includes enzymes of the EC classes 3.5.5.1 (nitrilases), 3.5.5.2 (ricinone nitrilases), 3.5.5.4 (cyanoalanine nitriles), 3.5.5.5 (aryl acetonitrile), 3.5.5.6 (bromoxynil), and 3.5.5.7 (aliphatic nitrilases). Most preferred are arylacetonitrilases (EC 3.5.5.5).
  • Arylacetonitrilases (EC 3.5.5.5) are usually mixed with aliphatics, e.g. Propionitrile or Korkklarenitril and benzonitriles hardly to not at all active. Therefore, it was surprising that an arylaceto-nitrilase was found, with which 5-norbornene-2-carbonotril can be converted with a high activity.
  • each of R 1 -R 9 may be independently: H. linear or branched alkyl of one to six carbon atoms, cycloalkyl of two to six carbon atoms, unsubstituted, amino, hydroxy or halo-substituted aryl of from 3 to 10 carbon atoms, and in which
  • R 5 and R 7 and R 8 and R 9 can also form cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms, for example cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl; R 8 and R 9 and R 5 and R 7 may also carry exocyclic double bonds with optional substituents, such as shown in compound IIb with R 5 , R 7 , R 10 , 11 each independently equal to H, alkyl or aryl having one to six carbon atoms; and
  • R 3 and R 4 may form a ring ( 4, 5, 6) or may be part of a fused aromatic;
  • the enzymes having activity according to the invention can be used to convert compound I to II in the process according to the invention as processed microorganisms or cells, eg as digests, free or immobilized enzymes, microorganisms or cells, or as partially or completely purified enzyme preparations, for example free or immobilized, used.
  • growing cells can also be used for the method according to the invention which contain the nucleic acids, nucleic acid constructs or vectors according to the invention.
  • dormant or open cells can be used.
  • open cells are meant, for example, cells which have been rendered permeable by treatment with, for example, solvents, or cells which have been treated by enzyme treatment, e.g. lysed, disrupted by mechanical treatment (e.g., French Press or ultrasound) or otherwise.
  • the crude extracts thus obtained are advantageously suitable for the process according to the invention.
  • purified or purified enzymes can be used for the process.
  • immobilized microorganisms or enzymes that can be used advantageously in the reaction.
  • free organisms or enzymes are used for the process according to the invention, they are expediently removed before extraction, for example by filtration or centrifugation.
  • a microorganism according to this invention can be cultured or propagated in a medium which allows the growth of this microorganism.
  • the medium can be of synthetic or natural origin.
  • Various media for microorganisms are known.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and optionally, small amounts of vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are e.g. Polyols, e.g. Glycerol, sugars such as e.g. Mono-, di- or polysaccharides (eg glucose, fructose, manose, xylolose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, succose, rafinose, starch or cellulose) complex sugar sources (eg molasses), sugar phosphates (eg fructose-1 -ex- biphosphate), sugar alcohols (eg mannitol), alcohols (eg methanol or ethanol), carboxylic acids (eg soybean oil or linseed oil), amino acids or amino acid mixtures (eg casamino acids, Difco) or certain amino acids (eg glycine, asparagine) or amino sugars, where the latter can also serve as sources of nitrogen.
  • sugars such as e.g. Mono-
  • Preferred nitrogen sources are organic and inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • ammonium salts eg NH 4 Cl or (NhU) 2 SO 4
  • nitrates eg NH 4 Cl or (NhU) 2 SO 4
  • urea e.g., urea
  • complex nitrogen sources such as heelylsate, soybean meal, wheat gluten, yeast extract, pepdone, meat extract, casein hydrolysates, yeast or potato protein
  • good nitrogen sources the latter also known as Serve carbon sources.
  • inorganic salts include calcium, magnesium, sodium, cobalt, manganese, potassium, zinc, copper and iron salt.
  • anions chloride, sulfate, sulfite and phosphate ions are particularly preferred.
  • Important for good productivity is the control of the Fe2 + or Fe3 + ion concentration in the medium.
  • the medium may additionally contain growth factors, e.g. Vitamins or growth enhancers such as biotin, 2-keto-1-gulonic acid, ascorbic acid, thiamine, folic acid, amino acids, carboxylic acids or substances such as e.g. DTT.
  • growth factors e.g. Vitamins or growth enhancers such as biotin, 2-keto-1-gulonic acid, ascorbic acid, thiamine, folic acid, amino acids, carboxylic acids or substances such as e.g. DTT.
  • the fermentation and growth conditions are selected so that a high yield of the desired product can be achieved (e.g., high nitrilase activity, especially high arylacetonitrilase activity).
  • Preferred fermentation conditions are between 15 ° C and 40 ° C, preferably 25 ° C to 37 °.
  • the pH is preferably regulated in the range of pH 3 to 9, more preferably between pH 5 and 8.
  • the fermentation lasts between a few hours and a few days, preferably between 8 hours and 21 days, more preferably 4 hours and 14 days.
  • the method according to the invention is carried out such that the enzymatic conversion of compound I to compound II is effected by incubation with a polypeptide or a medium containing a polypeptide and wherein the polypeptide is characterized in that the polypeptide is encoded by a nucleic acid molecule which comprises a nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule whose sequence, due to the degeneracy of the genetic code, can be derived from a polypeptide sequence encoded by a nucleic acid molecule of (a) or (b); (d) a nucleic acid molecule encoding a polypeptide whose sequence has an identity of at least 60% to the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the nucleic acid molecule of (a) or (b); (e) a nucleic acid molecule encoding a polypeptide derived from an aryl acetonitrile polypeptide wherein up to 25% of the amino acid residues are altered from SEQ ID NO: 2 by deletion, insertion, substitution or a combination thereof, and that still at least 30 has% of the enzymatic activity of SEQ ID NO: 2; and
  • nucleic acid molecule encoding a fragment or epitope of an arylaceto-nitrilase encoded by any of the nucleic acid molecules of (a) to (c);
  • Preferred enzymes having activity according to the invention comprise an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the nitrilase according to the invention saponifies very well phenylacetonitrile> phenylpropionitrile> mandelonitrile (moderate enantioselectivity) and is hardly or not at all active with aliphatics (for example propionitrile, subericinitrile) or benzonitriles. Therefore, in particular activity with norbornenitriles is surprising.
  • the stability and productivity of the enzyme of the invention under reactor condition is enormous and the handling simple, as a wide temperature and pH range is available and the enzyme has a high nitrile tolerance, i. no nitrile dosage is necessary.
  • “Functional equivalents” or analogues of the specifically disclosed enzymes in the context of the present invention are different polypeptides which furthermore have the desired biological activity, such as substrate specificity.
  • “functional equivalents” are understood to mean enzymes derived from compound I to implement compound II and having at least 50%, preferably 60%, more preferably 75%, most preferably 90% or more of the activity of an enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Functional equivalents are also preferably stable at temperatures of 0 0 C to 70 0 C and advantageously have a pH optimum between pH 5 and 8 and a temperature optimum in the range of 10 0 C to 50 ° C.
  • “functional equivalents” are in particular also understood as meaning mutants which are present in at least one sequence position of the abovementioned amino acids. Resequenzen have a different than the specifically mentioned amino acid but still possess one of the above biological activities. "Functional equivalents” thus include the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions, and / or inversions, which changes can occur in any sequence position as long as they result in a mutant having the property profile of the invention Equivalence is also given in particular when the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, ie, for example, identical substrates are reacted at different rates.
  • “functional equivalents” are in particular also understood as meaning mutants which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless possess one of the abovementioned biological activities.
  • Lente encompass the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions, said changes occurring in any sequence position as long as they lead to a mutant having the property profile of the invention Functional Equivalence especially if the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, ie, for example, identical substrates are reacted at different rates, the rate being not less than 30% of that of the unchanged polypeptide, preferably more than 100%, in particular more than 150 %, more preferably a speed increased by a factor of 2, 5, or 10.
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention.
  • Sacks of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts, such as, for example, sodium, calcium and ammonium salts. , Iron and zinc salts, and salts with organic bases, such as amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine, etc.
  • Acid addition salts such as salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid and salts with organic acids, such as acetic acid and Oxalic acid are also the subject of the invention.
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reaction with acyl groups.
  • “functional equivalents” also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, it is possible to determine regions of homologous sequence regions by sequence comparison and to determine equivalent enzymes on the basis of the specific requirements of the invention. "Functional equivalents” likewise include fragments, preferably individual domains or sequence motifs, of the polypeptides according to the invention which, for example, have the desired biological function.
  • Fusion equivalents are also fusion proteins which have one of the above-mentioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further functionally distinct heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without substantial substantial functional impairment of the fusion protein moieties)
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides or enzymes.
  • homologs to the specifically disclosed proteins which have at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed amino acid sequences, comprising "functional equivalents" Calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc Natl Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448
  • a percent homology of a homologous polypeptide of the invention means, in particular, percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of specifically described herein.
  • “functional equivalents” include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • Homologs of the proteins or polypeptides of the invention can be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation or shortening of the protein.
  • Homologs of the proteins of the invention can be identified by screening combinatorial libraries of mutants such as truncation mutants.
  • a variegated library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to the person skilled in the art (eg Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the process according to the invention is carried out at a reaction temperature of 5 to 75.degree.
  • the reaction temperature is room temperature or environmental dozenss- or more, for example 30 ° C or more but less than 70 0 C, preferably 60 0 C, 50 0 C or less.
  • the reaction temperature is about 35 to 45 ° C, for example 40 ° C, for xNon production.
  • the reaction temperature is between ambient and 50 ° C for the production of eNon.
  • Compound I can be both an enantiomeric mixture, for example R 1 S or end / exo enantiomers, and also enantiomerically pure, ie contain predominantly one enantiomer.
  • an enantiomerically pure substrate is reacted in the process according to the invention.
  • enantiomers which show an enantiomeric enrichment.
  • R-5-norbornene-2-endo-carbonitrile, S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile, R-5-norbornene-2-exo-carbonitrile, and / or S-5 Norbornene-2-exo-carbonitrile to the corresponding S-5-norbornene-2-exo saponified carboxylic acid, S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid, R-5-norbornene-2-exo-carboxylic acid and R-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid.
  • compound I is R-5-norbornene-2-endocarbonitrile and S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile or R-5-norbornene-2-exo-carbonitrile and S- ⁇ -norbornene exo-carbonitrile.
  • compound I is R-5-norbornene-2-endocarbonitrile or S-5-norbornene-2-endocarbonitrile or R-5-norbornene-2-exo-carbonitrile or S-5-norbornene- 2-exo-carbonitrile.
  • the invention also relates to a process in which an enantiomerically pure product is obtained.
  • the invention relates to a process in which, at a substrate concentration, at least 20 ⁇ m, preferably 50 ⁇ m, 70 ⁇ m, 10 ⁇ m, 15 ⁇ m, 20 ⁇ m, 25 ⁇ m, 30 ⁇ m, 40 ⁇ m, 50 ⁇ m, 70 ⁇ m, 100 ⁇ m, 200 ⁇ m, or more, and wherein the substrate, ie compound I, in particular R-5-norbornene-2-endocarbonitrile, S-5-norbornene-2-endocarbonitrile, R-5-norbornene-2-exo-carbonitrile, and / or S-5-norbornene 2-exo-carbonitrile to at least 50%, preferably to 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more to compound II is reacted.
  • the substrate ie compound I, in particular R-5-norbornene-2-endocarbonitrile, S-5-norbornene-2-endocarbonitrile, R
  • the substrate used is an isomer mixture, in particular a mixture of enantiomers, of compound I as the substrate, and the product is enriched in an isomer, in particular an enantiomer of compound II.
  • an endo- and exo- Enantiomer of the compound I is used and there is an accumulation of the endo or exo enantiomer of the compound II.
  • Particularly preferred in the method according to the invention for enrichment is a mixture of R-5-norbornene-2-endo-carbonitrile and / or S- 5-norbornene-2-endo-carbonitrile and R-5-norbornene-2-exo-carbonitrile and / or S-5-norbornene-2-exo-carbonitrile to the corresponding S-5-norbornene-2-exo-carboxylic acid and / or R-5-norbornene-2-exo-carboxylic acid and R-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid and / or S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid saponified, wherein it preferably to an enrichment of the endo-enantiomers norbornene acid comes.
  • the pH in the process according to the invention is advantageously maintained between pH 6 and 10, preferably between pH 7 and 9, particularly preferably between pH 7.5 and 8.5.
  • the product prepared in the process according to the invention for example R and / or S-5-norbornene-2-exo-carboxylic acid and / or R and / or S-5-norbornene-2 endo-carboxylic acid j .
  • suitable extractants are solvents such as, but not limited to, toluene, methylene chloride, butyl acetate, diisopropyl ether, benzene, MTBE or ethyl acetate.
  • the products can generally be obtained in good chemical purities, ie greater than 80%, preferably 85%, 90%, 95%, 98% or more, chemical purity.
  • the organic phase with the product can only be partially concentrated and the product crystallized out.
  • the solution is advantageously cooled to a temperature of 0 ° C to 10 ° C.
  • the crystallization can also be carried out directly from the organic solution or from an aqueous solution.
  • the crystallized product can be taken up again in the same or in another solvent for recrystallization and crystallized again.
  • the enantiomeric purity of the product can be further increased if necessary.
  • the product of the process according to the invention can be obtained in yields of from 60 to 100%, preferably from 80 to 100%, particularly preferably from 90 to 100%, based on the substrate used for the reaction, e.g. of R-5-norbornene-2-endo-carbonitrile, R-5-norbornene-2-exo-carbonitrile S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile, and / or S-5-norbornene-2-exo-carbonitrile isolate.
  • the isolated product is characterized by a high chemical purity of> 90%, preferably> 95%, particularly preferably> 98%.
  • the products have a high enantiomeric purity, which can be advantageously further increased if necessary by the crystallization.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • the operation of the process may advantageously be carried out in bioreactors, e.g. in Biotechnology, Volume 3, 2nd Edition, Rehm et al. Ed., (1993), especially Chapter II.
  • the invention also relates to a polypeptide which is suitable for the enzymatic saponification of the compound I to the compound II.
  • the polypeptide encodes a nitrilase, especially an arylacetonitrilase.
  • the polypeptide is characterized in that it is encoded by a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule comprising at least the polynucleotide of the coding sequence of Seq. ID No .: 1 or 3;
  • nucleic acid molecule whose sequence can be deduced from a polypeptide sequence encoded by a nucleic acid molecule according to (a) or (b) due to the degeneracy of the genetic code;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide whose sequence has an identity of at least 60% to the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the nucleic acid molecule of (a) or (b); (e) a nucleic acid molecule encoding a polypeptide derived from an aryl acetonitrile polypeptide wherein up to 15% of the amino acid residues are altered from SEQ ID NO: 2 or 4 by deletion, insertion, substitution, or a combination thereof has at least 30% of the enzymatic activity of SEQ ID NO: 2 or 4; and (f) a nucleic acid molecule encoding a fragment or epitope of an arylaceto-nitrilase encoded by any of the nucleic acid molecules of (a) to (c);
  • the polypeptide does not have the sequence according to Seq ID No .: 2 and / or 4. In one embodiment, the polypeptide also does not have the sequence described in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 called nitrilase. In one embodiment, the polypeptide also does not have the sequence of database entry AY885240.
  • the polypeptide according to the invention has the property of producing compound II, in particular norbornene acid, to a high percentage, even at a high substrate concentration, ie at a high concentration of compound I in the medium.
  • the polypeptide can be the substrate is reacted to at least 50%, preferably to 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more of compound II, wherein the substrate, ie compound I, in particular R-5 Norbornene-2-endo-carbonitrile, S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile, R-5-norbornene-2-exo-carbonit
  • the invention also relates to a nucleic acid molecule encoding the polypeptide of the invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention.
  • the nucleic acid molecule does not have the sequence of Seq. ID No. 1.
  • the nucleic acid molecule does not encode the nitrilase of Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989.
  • the nucleic acid molecule also does not have the sequence of database entry AY885240.
  • the invention particularly relates to nucleic acid sequences (single and double-stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) which code for an enzyme having activity according to the invention or can be used in the method according to the invention.
  • nucleic acid sequences which are e.g. for amino acid sequences according to SEQ ID NO: 2 or 4 or characteristic partial sequences thereof, or nucleic acid sequences according to SEQ ID NO: 1 or 3 or characteristic partial sequences thereof.
  • nucleic acid sequences mentioned herein can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the attachment of synthetic oligonucleotides and filling of gaps with the aid of the Klenow fragment of the DNA polymerase and ligation reactions and general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences (single and double stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) encoding one of the above polypeptides and their functional equivalents, e.g. accessible using artificial nucleotide analogs.
  • the nucleic acid sequence according to the invention differs in at least one base from that of Seq. ID No. 1 or 3.
  • the nucleic acid molecule also does not have the sequence described in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 called nitrilase.
  • the nucleic acid molecule also does not have the sequence of database entry AY885240.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides according to the invention or proteins or biologically active portions thereof, as well as nucleic acid fragments which are suitable, for example, for use as hybridization probes or Primers can be used for the identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention may additionally contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a portion thereof.
  • the nucleotide sequences of the invention enable the generation of probes and primers useful for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which is under "stringent" conditions (see below) at least about 12, preferably at least about 25, such as about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence of the invention or a corresponding nucleic acid sequence Antisense strands hybridizes.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, may be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated by means of standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences or a portion thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (such as described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
  • nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers prepared on the basis of this sequence.
  • the thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides of the invention may be further purified by standard synthetic methods, e.g. with an automatic DNA synthesizer.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be identified and isolated in principle from all organisms.
  • bacteria are called gram-negative and gram-positive bacteria.
  • the nucleic acids according to the invention from gram-negative bacteria are preferably made from ⁇ -proteobacteria, ⁇ -proteobacteria or v-proteobacteria, more preferably from bacteria of the orders of Burkholde ⁇ ales, Hydrogenophilales, Methylophilales, Neisseriales, Nitrosomonadales, Procabacterial or Rhodocyclales. Most preferably from bacteria of the family Rhodocyclaceae.
  • Nucleic acid sequences according to the invention can be prepared, for example, by conventional hybridization methods or the PCR technique from other organisms, e.g. isolate via genomic or cDNA libraries. These DNA sequences hybridize under standard conditions with the sequences according to the invention. For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides of the conserved regions, for example from the active site, which can be determined by comparisons with a nitrilase according to the invention, in particular arylacetonitrilases, in a manner known to the person skilled in the art. However, it is also possible to use longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences for the hybridization.
  • nucleic acid hybrids are about 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • the invention also relates to derivatives of the specifically disclosed or derivable nucleic acid sequences.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be derived from SEQ ID NO: 1 or 3 and differ therefrom by addition, substitution, insertion or deletion of individual or several nucleotides, but furthermore code for polypeptides having the desired property profile.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or are modified according to the codon usage of a specific source or host organism, in comparison to a specifically mentioned sequence, as well as naturally occurring variants, such as splice variants or allelic variants thereof.
  • the subject is also afforded by conservative nucleotide substitutions (ie, the amino acid in question is replaced by an amino acid of like charge, size, polarity, and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived by sequence polymorphisms from the specifically disclosed nucleic acids. These genetic polymorphisms may exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
  • Derivatives of a nucleic acid sequence according to the invention are, for example, allelic variants which have at least 50% homology at the derived amino acid level, preferably at least 75% homology, most preferably at least 80, 85, 90, 93, 95, 98 or 99% homology over the entire sequence - have area (with respect to homology at the amino acid level, see above comments on the polypeptides referred to). About partial regions of the sequences, the homologies may be advantageous higher.
  • derivatives are also to be understood as meaning homologs of the nucleic acid sequences according to the invention, for example fungal or bacterial homologs, truncated sequences, single stranded DNA or RNA of the coding and noncoding DNA sequence.
  • a homology of at least 50%, preferably of 75% or more, more preferably of 80%, most preferably of 90%, most preferably 95%, especially 98%, or more over the entire specified DNA range e.g.
  • nucleic acid or amino acid sequence of a DNA molecule or a protein to at least 40%, preferably at least 50%, more preferably at least 60%, also preferably at least 70%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% and most preferably at least 98% to the nucleic acid or amino acid sequences of the arylacetonitrilases, in particular to SEQ ID No. 1, 2, 3 or 4 or its functionally equivalent parts, preferably the homology over the entire sequence length of the arylacetonitrilases, in particular to SEQ ID No. 1, 2, 3 or 4 is determined.
  • identity between two proteins is meant the identity of the amino acids over a particular protein region, preferably the entire protein length, in particular, the identity obtained by comparison with the laser gene software of DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) using the CLUSTAL method (Higgins et al., 1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151). Homologies can also be computed using the laser gene software of DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) using the CLUSTAL method (Higgins et al., 1989). Appl. Biosci., 5 (2), 151).
  • the homology is thus preferably calculated over the entire amino acid or nucleic acid sequence range.
  • other programs are available to the person skilled in the art for the comparison of different sequences, which are based on different algorithms.
  • the algorithms of Meedleman and Wunsch or Smith and Waterman provide particularly reliable results.
  • the program PiIe Aupa can also be used for the sequence comparisons (J.Mol.Evolution. (1987), 25, 351-360, Higgins et al., (1989) Cabgos, 5, 151-153) or the programs Gap and Best Fit (Needleman and Wunsch, (1970), J. Mol. Biol., 48, 443-453 and Smith and Waterman (1981), Adv., Appl.
  • homology with the Gap program is determined via the full-length cDNA sequence.
  • the homology with the program Gap is determined over the entire genomic sequence.
  • homology with the program Gap is determined over the coding full-length sequence.
  • the promoters upstream of the indicated nucleotide sequences may be altered by one or more nucleotide exchanges, insertions, inversions and / or deletions, but without impairing the functionality or efficacy of the promoters.
  • the promoters can be increased in their activity by changing their sequence or can be completely replaced by more effective promoters of alien organisms.
  • Derivatives are also to be understood as variants whose nucleotide sequence has been changed in the range from -1 to -1000 bases upstream of the start codon or 0 to 1000 bases downstream after the stop codon in such a way that gene expression and / or protein expression is changed, preferably increased.
  • the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with the abovementioned coding sequences under “stringent conditions.”
  • stringent conditions thus refers to conditions under which one nucleic acid sequence binds preferentially to a target sequence, but does not or at least substantially reduces it to others sequences.
  • polynucleotides can be found in the screening of genomic or cDNA libraries and optionally multiply therefrom with suitable primers by means of PCR and then isolate, for example, with suitable probes.
  • polynucleotides of the invention can also be chemically synthesized. This property is understood as the ability of a poly- or oligonucleotide to bind under stringent conditions to a nearly complementary sequence, while under these conditions nonspecific binding between non-complementary partners is avoided.
  • the sequences should be 70-100%, preferably 90-100%, complementary.
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to one another for example, in the Northern or Southern Blot technique or in the primer binding in PCR or RT-PCR advantage.
  • oligonucleotides are used from a length of 30 base pairs.
  • the hybridization conditions are for DNA: DNA hybrids at 0.1 x SSC and temperatures between about 20 ° C to 45 ° C, preferably between about 30 ° C to 45 ° C.
  • the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between about 30 ° C. to 55 ° C., preferably between about 45 ° C.
  • temperatures for the hybridization are exemplary calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of about 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant genetics textbooks, such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, and can be made dependent upon length, for example, by formulas known to those skilled in the art of the nucleic acids, type of hybrids or G + C content. Further information on hybridization can be found in the following textbooks by the person skilled in the art: Ausubel et al.
  • Stringent conditions are understood, for example, in the Northern blot technique, the use of a 50 - 70 0 C, preferably 60 - 65 0 C warm wash, for example, 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (2Ox SSC: 3M NaCl , 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of nonspecifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides.
  • a 50 - 70 0 C preferably 60 - 65 0 C warm wash
  • 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (2Ox SSC: 3M NaCl , 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of nonspecifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides.
  • SDS 2Ox SSC: 3M NaCl , 0.3M Na citrate, pH 7.0
  • complementarity is meant the ability of one nucleic acid molecule to hybridize to another nucleic acid molecule due to hydrogen bonding between complementary bases.
  • the person skilled in the art knows that two nucleic acid molecules do not have to have 100% complementarity in order to be able to hybridize with one another.
  • Preference is given to a nucleic acid sequence which is intended to hybridize with another nucleic acid sequence to this at least 40%, at least 50%, at least 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, likewise particularly preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% or 100% complementary.
  • homology, complementarity and identity levels are to be determined over the entire protein or nucleic acid length.
  • Nucleic acid molecules are identical if they have identical nucleotides in the same 5'-3 'order.
  • the invention also relates to a method for producing a vector or expression construct comprising the insertion of the nucleic acid molecule according to the invention into a vector or expression construct.
  • the invention also relates to a nucleic acid construct or vector containing the nucleic acid molecule according to the invention or prepared in the process according to the invention or comprising a nucleic acid construct suitable for use in the process according to the invention.
  • the invention therefore relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream and optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • “Operational linkage” is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, etc. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ).
  • a nucleic acid construct according to the invention is in particular to be understood as meaning those in which the gene for a reaction according to the invention differs with one or more regulatory signals for the control, e.g. Increased, the gene expression was operatively or functionally linked.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically altered so that natural regulation is switched off and the expression of the genes was increased.
  • the nucleic acid construct can also be simpler, ie no additional regulatory signals have been inserted before the coding sequence and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased.
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the already mentioned “enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence, and additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory sequences Elements or Terminators
  • the nucleic acids according to the invention can be present in one or more copies in the construct
  • Further genes, such as antibiotic resistance or auxotrophy-complementing genes, optionally for selection on the construct, can also be contained in the construct.
  • Advantageous regulatory sequences for the process according to the invention are, for example, in promoters such as cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl " " T7-, T5-, T3 -, gal, trc, ara, rhaP (rhaP BAD ) SP6-, Iambda-P R - or contained in the Iambda-P L promoter, which are advantageously used in Gram-negative bacteria application.
  • Advantageous regulatory sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SPO2, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • the promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxidase e.g. - seaus Hansenula advantageous artificial regulator
  • the nucleic acid construct, for expression in a host organism is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • Vectors other than plasmids and phages are also all other vectors known to those skilled in the art, ie viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention. Suitable plasmids are described, for example, in E.
  • nucleic acid construct for expression of the further genes contained additionally 3'- and / or 5'-terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • genes and protein expression are intended to allow the targeted expression of genes and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can thereby preferably influence the gene expression of the introduced genes positively and thereby increase.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced in the form of a linear DNA into the microorganisms and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or of the nucleic acid according to the invention.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and in TJ. Silhavy, ML Berman and LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, ColD Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • the invention also relates to a host cell which has been stably or transiently transformed or transfected with the vector according to the invention or with the polynucleotide according to the invention or in which the polynucleotide according to the invention or a polynucleotide suitable for the method according to the invention is expressed as described above or in which such Compared to a wild type is expressed increased.
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed.
  • familiar cloning and transfection methods known to the person skilled in the art, such as, for example, co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, are used in order to express the stated nucleic acids in the respective expression system. Suitable systems are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F.
  • Homologously recombined microorganisms can also be produced according to the invention.
  • a vector is prepared which contains at least a portion of a gene or a coding sequence according to the invention, wherein optionally at least one amino acid deletion, addition or substitution has been introduced in order to modify the sequence according to the invention, eg functionally to disrupt ("Knockouf
  • the introduced sequence may, for example, also be a homologue from a related microorganism or be derived from a mammalian, yeast or insect source
  • the vector used for homologous recombination may be designed to mutate the endogenous gene upon homologous recombination or otherwise modified, but the functional protein is still encoded (eg the upstream regulatory region may be altered in such a way that is altered by the expression of the endogenous protein).
  • the altered portion of the gene of the invention is in the homologous recombination vector.
  • suitable vectors for homologous recombination is described, for example,
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct according to the invention.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • gram-positive or gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae,
  • Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae particularly preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium or Rhodococcus used. Very particularly preferred is the genus and species Escherichia coli. Further advantageous bacteria are also found in the group of alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria or gamma-proteobacteria.
  • the host organism or the host organisms according to the invention preferably contain at least one of the nucleic acid sequences described in this invention, nucleic acid constructs or vectors which encode an enzyme with activity according to the invention for the conversion of compound I to II.
  • the organisms used in the method according to the invention are grown or grown, depending on the host organism, in a manner known to those skilled in the art.
  • Microorganisms are usually contained in a liquid medium containing a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source mostly in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C attracted under oxygen fumigation.
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is regulated during the cultivation or not.
  • the cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed semi-continuously or continuously.
  • the ketone can be given directly for cultivation or advantageously after cultivation.
  • the enzymes may be isolated from the organisms by the method described in the Examples or used as crude extract for the reaction.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of polypeptides according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, which comprises cultivating a polypeptide-producing microorganism, optionally inducing the expression of the polypeptides and isolating them from the culture.
  • the Po Lypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant microorganism can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 0 C and a pH of 6 to 9. Specifically, suitable culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted if the polypeptides are not secreted into the culture medium and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells may optionally be treated by high frequency ultrasound, high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods.
  • polypeptides can be achieved by known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as
  • Sepharose chromatography Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as other conventional methods such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • anchors such as anchors.
  • hexa-histidine anchors which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibody: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor (NY ) Press).
  • anchors may be used to attach the proteins to a solid support, e.g. a polymer matrix, which may for example be filled in a chromatography column, or used on a microtiter plate or on another carrier.
  • these anchors can also be used to detect the proteins.
  • conventional markers such as fluorescent dyes, enzyme markers, which, after reaction with a substrate, have a detectable reactivity. or radioactive markers, alone or in combination with the anchors used to derivatize the proteins.
  • organisms in particular microorganisms, which have an increased acetonitrilase activity or in which the activity of the polypeptide according to the invention is increased in comparison to the wild type.
  • such an increase may be achieved by incorporation of a corresponding nucleic acid construct, e.g. the nucleic acid construct or vector according to the invention or by targeted or untargeted mutagenesis of the organism
  • the selected microorganisms are mutagenized according to the invention.
  • mutagenized is meant that into the genetic information, i. targeted or untargeted mutations are introduced into the genome of microorganisms.
  • Targeted or untargeted mutations alter one or more genetic information, i. the microorganisms are genetically modified. As a rule, this change leads to the fact that the affected genes are not or incorrectly expressed, so that the activity of the gene product is reduced or inhibited.
  • Targeted mutations mutate a particular gene or inhibit, reduce or alter its activity.
  • untargeted mutations one or more genes are randomly mutated or its activity inhibited, reduced or altered.
  • a population may be e.g. with a DNA population or bank which is suitable for the inhibition of various, as many as possible, in the optimal case of all genes, are transformed so that, statistically, a DNA fragment, preferably identifiable, is integrated into each gene of the microorganism.
  • the switched-off gene can be identified.
  • former mutagens that differ in their mode of action: e.g. Base analogs, e.g. 5-bromouracil, 2-aminopurine; Chemicals that react with DNA, e.g. nitrous acid, hydroxylamine; or alkylating compounds, such as monofunctional (eg ethyl methanesulfonate, dimethyl sulfate, methyl methanesulfonate), bifunctional (eg nitrogen mustard gas, mitomycin, nitrosoguanidines - dialkylnitrosamines, N-nitrosourea derivatives, N-alkyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine-), intercalating dyes (eg acridines, ethidium bromide).
  • Base analogs e.g. 5-bromouracil, 2-aminopurine
  • Chemicals that react with DNA e.g. nitrous acid, hydroxylamine
  • alkylating compounds such as monofunctional (eg e
  • Physical mutagenization is e.g. about irradiation of the organisms.
  • Several forms of radiation are highly mutagenic.
  • Mutations can also be induced by biological processes.
  • the standard procedure is transposon mutagenesis, in which insertion or transposition of a transposable element within or around a gene causes alteration, usually loss of gene activity. By identifying the insertion site of the transposon, the gene whose activity has been altered can be isolated.
  • Mutagenesis can alter the cellular activity of one or more gene products.
  • the cellular activity of the arylacetonitrilase described herein is increased, most preferably the polypeptide described herein.
  • the non-transgenic organisms according to the invention in particular
  • Microorganisms, plants and plant cells which are characterized by a modulation of the expression and / or the binding behavior of endogenous arylacetonitrilase and have a permanent or transient pathogen resistance, by the so-called "TILLING" approach (Targeting Induced Local Lesion in genomes) manufactured become.
  • TILLING Targeting Induced Local Lesion in genomes
  • This method is described in detail in Colbert et al. (2001, Plant Physiology, 126, 480-484), McCallum et al. (2000, Nat. Biotechnol., 18, 455-457) and McCallum et al. (2000, Plant Physiology, 123, 439-442).
  • the aforementioned references are explicitly incorporated herein by way of disclosure with respect to the "TILLING" method.
  • the TILLING procedure is a strategy of so-called reverse genetics that allows the production of high levels of point mutations in mutagenized microorganisms. or plant collections, eg, by chemical mutagenesis with ethylmethanesulphonate (EMS), combined with rapid systematic identification of mutations in target sequences.
  • EMS ethylmethanesulphonate
  • the target sequence is amplified by PCR in DNA pools of mutagenized M2 populations.
  • Denaturing and annealing reactions of the heteroallelic PCR products allow the formation of heteroduplexes in which one strand of DNA originates from the mutated and the other from the "wild-type" PCR product, at the point of point mutation, a so-called mismatch, either denaturing HPLC (DHPLC, McCallum et al., 2000, Plant Physiol., 123, 439-442) or with the cel mismatch detection system (Oleykowsky et al., 1998, Nucl. Acids Res.
  • mismatch either denaturing HPLC (DHPLC, McCallum et al., 2000, Plant Physiol., 123, 439-442) or with the cel mismatch detection system (Oleykowsky et al., 1998, Nucl. Acids Res.
  • Cel ⁇ is an endonuclease that recognizes mismatches in heteroduplex DNA and specifically cleaves the DNA at these sites The cleavage products can then be separated and detected by automated sequencing gel electrophoresis (Colbert et al., 2001, vide supra) Identification of target gene-specific mutations in a pool is analyzed according to individual DNA samples to isolate the microorganism or plant with the mutation In the case of the microorganisms, plants and plant cells according to the invention, after the production of the mutagenized populations by the use of primer sequences directed against arylacetonitrilase, the identification of the mutagenized plant cells or plants is carried out.
  • the TILLING method is generally applicable to all microorganisms and plants and plant cells.
  • the invention also relates to a composition containing substantially R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile and compositions comprising: R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid more than 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%; and / or containing R and / or S-5-norbornene-2-exo-carboxylic acid ratio less than 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%.
  • a composition has not hitherto been made in the prior art.
  • norbornene acid always resulted in an enantiomeric mixture of 5-norbornene-2-endo-carboxylic acid to 5-norbornene-2-exo-carboxylic acid ratio of about 0.6: about 0.4.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising substantially R- and / or S-5-norbornene-2-exo-carbonitrile and a composition containing R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid to form R- and / or S-5-norbornene-2-exo-carbonitrile. and / or S-5-norbornene-2-exo-carboxylic acid in a ratio of less than 0.6 to more than 0.4.
  • Such a composition has not hitherto been made in the prior art.
  • norbornene acid always resulted in an enantiomeric mixture of 5-norbornene-2-endo-carboxylic acid to 5-norbornene-2-exo-carboxylic acid ratio of about 0.6: about 0.4
  • the invention also relates to a composition which can be prepared by the process according to the invention.
  • the invention relates to a composition prepared by the method according to the invention.
  • the invention relates to the use of an enzyme, in particular a nitrilase, preferably an arylacetonitrilase, more preferably a polypeptide according to the invention having the sequence shown in SEQ ID no. 2 or 4 or a homolog or a functional fragment thereof for the enrichment of an isomer of the compound II from a mixture of isomers of the compound I.
  • an enzyme in particular a nitrilase, preferably an arylacetonitrilase, more preferably a polypeptide according to the invention having the sequence shown in SEQ ID no. 2 or 4 or a homolog or a functional fragment thereof for the enrichment of an isomer of the compound II from a mixture of isomers of the compound I.
  • the invention relates to the use of an enzyme, in particular a nitrilase, preferably an arylacetonitrilase, particularly preferably a polypeptide according to the invention having the sequence shown in SEQ ID no. 2 or 4 or a homologue or a functional fragment thereof for the enrichment of R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid from a mixture containing R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile and R- and / or S-5-norbornene-2-exo-carbonitrile.
  • an enzyme in particular a nitrilase, preferably an arylacetonitrilase, particularly preferably a polypeptide according to the invention having the sequence shown in SEQ ID no. 2 or 4 or a homologue or a functional fragment thereof for the enrichment of R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid from a mixture containing R- and / or S
  • the invention relates to the use of an arylacetonitrilase for reacting R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile and / or R- and / or S-5-norbornene-2-exo-carbonitrile to R- and / or S-norbornene-2-endo-carboxylic acid and / or R- and / or S-norbornene-2-exo-carboxylic acid.
  • the invention also relates to the use of an arylacetonitrilase for reacting R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile and / or R- and / or S-5-norbornene-2-exo-carbonitrile to the R- and / or S-endo and / or R and / or S-norbornene-2-exo-carboxylic acid.
  • the invention relates to the use of an enzyme, in particular a nitrilase, preferably an arylacetonitrilase, particularly preferably a polypeptide according to the invention having the sequence shown in SEQ ID no. 2 or 4 or a homolog or a functional fragment thereof for the reaction of R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile to isomerically pure R and / or S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid high substrate concentration.
  • an enzyme in particular a nitrilase, preferably an arylacetonitrilase, particularly preferably a polypeptide according to the invention having the sequence shown in SEQ ID no. 2 or 4 or a homolog or a functional fragment thereof for the reaction of R- and / or S-5-norbornene-2-endo-carbonitrile to isomerically pure R and / or S-5-norbornene-2-endo-carboxylic acid high substrate concentration.
  • the invention relates to the use of an enzyme, in particular a nitrilase, preferably an arylacetonitrilase, particularly preferably a polypeptide according to the invention, characterized in that a protein lypeptid is used, that is encoded by a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule comprising at least the polynucleotide of the coding sequence of Seq. ID No .: 1 or 3;
  • nucleic acid molecule whose sequence can be deduced from a polypeptide sequence encoded by a nucleic acid molecule according to (a) or (b) due to the degeneracy of the genetic code;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide whose sequence has an identity of at least 60% to the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the nucleic acid molecule of (a) or (b);
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide derived from an aryl acetonitrile se- crase polypeptide, wherein up to 25% of the amino acid residues are opposite
  • SEQ ID NO: 2 or 4 are altered by deletion, insertion, substitution or a combination thereof and which still has at least 30% of the enzymatic activity of SEQ ID NO: 2 or 4;
  • nucleic acid molecule encoding a fragment or epitope of an arylaceto-nitrilase encoded by any of the nucleic acid molecules of (a) to (c);
  • the polypeptide does not have the sequence according to Seq ID No .: 2 or 4. In one embodiment, the polypeptide also does not have the sequence described in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 called nitrilase. In one embodiment, the polypeptide also does not have the sequence of database entry AY885240.
  • the invention relates to the use of a polypeptide for the production of a compound of formula II by enzymatic reaction of a compound of formula I, wherein the polypeptide is characterized in that it is encoded by a nucleic acid molecule comprising nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule comprising at least the polynucleotide of the coding sequence of Seq. ID No .: 1 or 3;
  • nucleic acid molecule whose sequence can be deduced from a polypeptide sequence encoded by a nucleic acid molecule according to (a) or (b) due to the degeneracy of the genetic code;
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide whose sequence has an identity of at least 60% to the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the nucleic acid molecule of (a) or (b);
  • nucleic acid molecule encoding a polypeptide derived from an aryl acetonitrile polypeptide wherein up to 25% of the amino acid residues are altered from SEQ ID NO: 2 or 4 by deletion, insertion, substitution or a combination thereof has at least 30% of the enzymatic activity of SEQ ID NO: 2 or 4;
  • nucleic acid molecule encoding a fragment or epitope of an arylaceto-nitrilase encoded by any of the nucleic acid molecules of (a) to (c);
  • the polypeptide does not have the sequence of Seq ID No .: 2 or 4. In one embodiment, the polypeptide also does not have the sequence described in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 called nitrilase. In one embodiment, the polypeptide also does not have the sequence of database entry AY885240.
  • FIG. 1 shows enzymes with activity according to the invention.
  • a high activity was observed.
  • High activity was also observed at a high nitrile concentration.
  • Nitrilases from Biocatalytics were used as BTM at 2 mg / ml
  • the BASF nitrilases were used as recombinant whole cell biocatalysts (E. coli TG1 OpDHE system with GroELS chaperones, see PCT / EP 03 / 13367) and overnight in 30 ml LB with ampicillin (100 ⁇ g / ml), spectinomycin (100 ⁇ g / ml), chloramphenicol (20 ⁇ g / ml), IPTG (0.1 mM) and rhamnose monohydrate (0, 5 g / L) in 100 ml Erlenmeyer at 37 ° C.
  • the cells were washed 1x in 30 ml of 10 mM Pipes pH 7.0 and taken up in 3 ml buffer and optionally stored at -20 ° C.
  • nitrile was the Isomer mixture from the company Aldrich used.
  • the PCR was carried out according to Stratagene standard protocol with Pfu ultra-polymerase (Stratagene) and the following temperature program: 95 ° C for 5 minutes; 30 cycles at 95 ° C for 45 sec, 50 ° C for 45 sec, and 72 ° C for 1 min 30 sec; 72 ° C for 10 min .; 10 ° C until use.
  • the PCR product (1.2 kb) was isolated by agarose gel electrophoresis (1.2% E-gel, Invitrogen) and column chromatography (GFX kit, Amersham) and then digested with Ndel / HindIII and incubated in appropriate digested pDHE19.2 vector (a pJOE derivative, DE19848129) cloned.
  • E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 TG10: a RhaA " derivative of E. coli TG1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto). Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74, pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001) Mol. Microbiol.
  • Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478) was grown as described in the literature (Nagasawa et al., Arch. Microbiol 1988: 150, 89-94) and harvested. The cells were tested for their benzonitrilase activity as in Example 4 and showed full turnover after 15 min. The BASF nitrilase strains and E. coli TG10 + pDHE9632J1 (Example 4) were grown and harvested as in Example 1. Subsequently, the bio-dry masses were determined (R. rhodochrous J1: 3.5 g / L, E. coli strains: 0.8 g / L).
  • Nitrilase Nit Polypeptide Sequence from ADG93882 (WO2003097810-A2 Seq. ID349)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5-Norbornen-2-carbonsäure aus 5-Norbornen-2-endo-carbonotril und/oder 5-Norbornen-2-exo-carbonitril. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren bei der 5-Norbornen-2-carbonsäure bei einer hohen Substratkonzentration hergestellt werden kann. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Polypeptid geeignet zur enzymatischen Umsetzung von 5-Norbornen-2-carbonitril zu 5- Norbornen-2-carbonsäure, insbesondere auch bei einer hohen Substratkonzentration sowie eine Nukleinsäure codierend das Polypeptid, eine Zusammensetzung enthaltend 5- Norbornen-2-carbonitril zu 5-Norbornen-2-endo-carbonsäure und 5-Norbornen-2-exo-carbonsäure, und die Verwendung des Polypeptids.

Description

Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 5-Norbornen-2-carbonsäure
Beschreibung
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5-Norbornen-2- carbonsäure aus 5-Norbornen-2-endo-carbonotril und/oder 5-Norbornen-2-exo- carbonitril. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren bei der 5-Norbornen-2- carbonsäure bei einer hohen Substratkonzentration hergestellt werden kann. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Polypeptid geeignet zur enzymatischen Umsetzung von 5-Norbornen-2-carbonitril zu 5-Norbornen-2-carbonsäure, insbesondere auch bei einer hohen Substratkonzentration sowie eine Nukleinsäure codierend das Polypeptid, eine Zusammensetzung enthaltend 5-Norbornen-2-carbonitril zu 5-Norbornen-2-endo- carbonsäure und 5-Norbornen-2-exo-carbonsäure, und die Verwendung des Polypeptids.
5-Norbornen-2-carbonsäure wird als Substrat für eine Vielzahl organischer Synthesen verwendet und eignet sich besonders für die Herstellung von cyclisches Olefin- Copolymere (COC), pharmazeutische Intermediaten, Pestiziden oder Riechstoffen.
Bisher kann 5-Norbornen-2-carbonsäure im wesentlichen wirtschaftlich nur chemisch hergestellt werden. Nachteilig ist insbesondere, dass die bekannten Verfahren zu Isomerengemischen führen, aus denen durch aufwendige Aufreinigungsverfahren die I- someren isoliert werden müssen.
Ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 5-Norbornen-2-carbonsäure wird beschrieben in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989. Die dort beschriebene Nitrilase aus Rhodococcus rhodochrous zeigt jedoch eine sehr geringe Aktivität bei Umsetzung von 5-Norbornen-2-carbonitril (Tabelle 5) und kommt daher nicht in Frage, um in einem fermantativen Prozess eine wirtschaftliche 5-Norbornen-2-carbonsäureproduktion zu ermöglichen. Es wurde zudem festgestellt, dass das in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 als Nitrilase beschriebene Enzym eine Nitril-Hydratase ist.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem fermentativ wirtschaftlich 5-Norbornen-2-carbonsäure herzustellen wäre.
Die Aufgabe wird durch das hierin beschriebene erfindungsgemäße Verfahren und die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von
206/2005 StK/Ass 26.09.2006
Figure imgf000003_0001
Verbindung Il wobei
R1-R9 jeweils unabhängig voneinander sein können: H. lineares oder verzweigtes Al- kyl mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit zwei bis sechs Kohlenstoffatomen, unsubstituiertes, Amino-, Hydroxy- oder halo-substituiertes Aryl mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, und wobei
R5 und R7 sowie R8 und R9 auch ein Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffenato- men formen können, z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl;
R8 und R9 sowie R5 und R7 auch exocyclische Doppelbindungen mit optionalen Substituenten tragen können; und
R3 und R4 einen Ring (4,5,6) bilden können oder Teil eines annelierten Aromaten sein können;
aus
Figure imgf000003_0002
Verbindung I mit R1 bis R9 wie oben,
mittels einer Arylaceto-Nitrilase.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich Verbindung I, insbesondere 5- Norbornen-2 -carbonitril, zu Verbindung II, insbesondere 5-Norbornen-2-carbonsäure mit Arylacetonitrilasen (EC 3.5.5.5) vorteilhaft herstellen lässt. Nitrilasen sind Enzyme die die Hydrolyse von Nitrilen in die entsprechende Carbonsäuren und Ammoniumionen katalysieren (Faber, Biotransformations in Organic Che- mistry, Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1992). Nitrilasen wurden zuerst in Pflanzen beschrieben (Thimann and Mahadevan (1964) Arch Biochem Biophys 105:133-141 ) und später in vielen Mikroorganismen ebenfalls gefunden. Nitrilasen haben unterschiedliche Substratspezifitäten, können aber grob in drei Gruppen eingeordnet werden: Nitrilasen spezifisch für aliphatische Nitrile, Nitrilasen, spezifisch für aromatische Nitrile und Nitrilasen spezifisch für Arylacetonitrile.
Die enzymatische Synthese von chiralen und achiralen Carbonsäure und α-Hydroxycarbonsäuren mit Nitrilasen ist im Stand der Technik beschrieben. Die meisten Nitrilasen sind sehr substratspezifisch und können nur wenige Substrate umsetzen; somit ist ihre Anwendung auf die Umsetzung von nur einem oder wenigen Nitrilen mit einer wirtschaftlichen Effizienz beschränkt. Es ist daher vorteilhaft, Nitrilasen zur Verfügung zu stellen, die neue Verbindungen mit hoher Effizienz oder vorteilhaften Bedingungen umsetzen können.
Der Begriff "Nitrilase" wie hierin benutzt, umfasst alle Polypeptide, die eine Nitrilaseak- tivität besitzen.
Der Begriff "Nitrilaseaktivität" bedeutet hierin die Fähigkeit, Nitrile in ihren entsprechenden Carbonsäuren und Ammonium zu hydrolysieren. Vorzugsweise bedeutet "Nitrilaseaktivität" die Fähigkeit eines Enzyms die Addition von zwei molaren Äquivalenten Wasser an einen Nitrilrest zu katalysieren, so dass die entsprechende Carbonsäure gebildet wird: R-CN + 2 H2O ► R-COOH + NH3.
Vorzugsweise umfasst der Begriff "Nitrilase" Enzyme der EC-Klassen 3.5.5.1 (Nitrilasen), 3.5.5.2 (Ricininnitrilasen), 3.5.5.4 (Cyanoalaninnitrilasen), 3.5.5.5 (Arylacetonitri- lasen), 3.5.5.6 (Bromoxynil), sowie 3.5.5.7 (aliphatische Nitrilasen). Am meisten bevorzugt sind Arylacetonitrilasen (EC 3.5.5.5).
Arylacetonitrilasen (EC 3.5.5.5) sind in der Regel mit Aliphaten, z.B. Propionitril oder Korksäurenitril sowie Benzonitrilen kaum bis gar nicht aktiv. Daher war es überra- sehend, dass eine Arylaceto-Nitrilase gefunden wurde, mit der 5-Norbornen-2- carbonotril mit einer hohen Aktivität umgesetzt werden kann.
Vorzugsweise ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren Verbindungen II:
Figure imgf000005_0001
Verbindung IIb
mit R1-R9 jeweils unabhängig voneinander sein können: H. lineares oder verzweigtes Alkyl mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit zwei bis sechs Kohlenstoffatomen, unsubstituiertes, Amino-, Hydroxy- oder halo-substituiertes Aryl mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, und wobei
R5 und R7 sowie R8 und R9 auch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffenatomen formen können, z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl; R8 und R9 sowie R5 und R7 auch exocyclische Doppelbindungen mit optionalen Substituenten tragen können, wie z.B. gezeigt in Verbindung IIb mit R5, R7, R10,11 jeweils unabhängig voneinander gleich H, Alkyl oder Aryl mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen; und
R3 und R4 einen Ring (4,5,6) bilden können oder Teil eines annelierten Aromaten sein können;
und Verbindung I ist:
1
Figure imgf000005_0002
Verbindung I
mit R1 bis R1 1 wie oben. Erfindungsgemäß können die verwendeten Enzyme mit erfindungsgemäßer Aktivität zur Umsetzung der Verbindung I zu Il im erfindungsgemäßen Verfahren als prozessierte Mikroorganismen oder Zellen, z.B. als aufgeschlossen, freie oder immobilisierte En- zyme, Mikroorganismen oder Zellen, oder als teilweise oder vollständig gereinigte Enzympräparationen, beispielweise frei oder immobilisiert, verwendet werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können folglich auch wachsende Zellen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufgeschlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, z.B. lysiert, über eine mechanische Behandlung (z.B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode auf- gebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können.
Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweckmäßigerweise abgetrennt beispielsweise über eine Filtration oder Zentrifugation.
Ein Mikroorganismus gemäß dieser Erfindung kann gezüchtet oder vermehrt werden in einem Medium, das das Wachstum dieses Mikroorganismus erlaubt. Das Medium kann synthetischem oder natürlichem Ursprung sein. Verschiedene Medien für Mikroorganismen sind bekannt. Zum Wachstum von Mikroorganismen enthält das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und optional, geringe Mengen von Vitaminen und/oder Spurenelementen.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind z.B. Polyole, wie z.B. Glycerol, Zucker wie z.B. Mono-, Di- oder Polysaccaride (z.B. Glucose, Fructose, Manose, Xylolose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Succose, Rafinose, Stärke oder Zellulose) komplexe Zuckerquellen (z.B. Molasse), Zuckerphosphate (z.B. Fructose-1-ex- biphosphat), Zuckeralkohole (z.B. Mannit), Alkohole (z.B. Methanol oder Ethanol), Carbonsäuren (z.B. Sojaöl oder Leinenöl), Aminosäuren oder Aminosäurengemische (z.B. Casaminosäuren, Difco) oder bestimmte Aminosäuren (z.B. Glycin, Asparagin) oder Aminozucker, wobei die letzteren auch als Stickstoffquellen dienen können. Besonders bevorzugt sind Glucose und Polyole, besonders Glycerol.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind organische und anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Z.B. sind Ammoniumsalze (z.B. NH4CI oder (NhU)2SO4), Nitrate, Harnstoff und komplexe Stickstoffquellen wie z.B. He- felysate, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Pepdon, Fleischextrakt, Ka- seinhydrolysate, Hefe- oder Kartoffelprotein, gute Stickstoffquellen, wobei letztere auch als Kohlenstoffquellen dienen können.
Beispiele für anorganische Salze umfassen Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisensalz. Als entsprechende Anionen sind Chlorid, Sulfat, Sulfit und Phosphationen besonders bevorzugt. Wichtig für eine gute Produktivität ist die Kontrolle der Fe2+ oder Fe3+ lonenkonzentration im Medium.
Optional kann das Medium zusätzlich Wachstumsfaktoren enthalten wie z.B. Vitamine oder Wachstumsverstärker wie Biotin, 2-Keto-l-gulonsäure, Ascorbinsäure, Thiamin, Folsäure, Aminosäuren, Carbonsäuren oder Substanzen wie z.B. DTT.
Die Fermentation und Wachstumsbedingungen werden ausgewählt, so dass ein hoher Ertrag an dem gewünschten Produkt erzielt werden kann (z.B. hohe Nitrilaseaktivität, insbesondere hohe Arylacetonitrilase aktivität). Bevorzugte Fermentationsbedingungen sind zwischen 15°C und 40°C, vorzugsweise 25°C bis 37°. Der pH wird vorzugsweise im Bereich von pH 3 bis 9 noch mehr bevorzugt zwischen pH 5 und 8 reguliert. Im AII- gemeinen dauert die Fermentation zwischen einigen Stunden und einigen Tagen, vorzugsweise zwischen 8 Stunden und 21 Tagen, mehr bevorzugt 4 Stunden und 14 Tagen. Verfahren zur Optimierung von Medium und Fermentationsbedingungen sind im Stand der Technik bekannt (Applied Microbiol Physiology, A practical approach 1997, Seite 53 bis 73).
In einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren so durch geführt, dass die enzymatische Umsetzung von Verbindung I zu Verbindung Il erfolgt durch die Inkubation mit einem Polypeptid oder einem Medium enthaltend ein Polypeptid und wobei das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polypeptid codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül das ein Nukleinsäuremolekül umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das in Seq. ID No.: 2 oder 4 gezeigt wird; (b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest das Polynukleotid der codierenden Sequenz nach Seq. ID No.: 1 oder 3 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz aufgrund der Degen eriertheit des genetischen Codes abgeleitete werden kann von einer Polypeptidsequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird; (d) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids hat, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird; (e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das von einem Arylacetonitrila- se-Polypeptid abgeleitet wird wobei bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und das noch mindestens 30% der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO: 2 besitzt; und
(f) Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment oder ein Epitop einer Arylaceto-Nitrilase codiert, das von einem der Nukleinsäuremoleküle nach (a) bis (c) codiert wird;
oder eine komplementären Sequenz davon umfasst; und wobei optional das gebildete Produkt isoliert wird.
Bevorzugte Enzyme mit erfindungsgemäßer Aktivität umfassen eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4.
Die erfindungsgemäße Nitrilase verseift sehr gut Phenylaceto- nitril>Phenylpropionitrl>Mandelonitril (mäßige Enantioselektivität) und ist mit Aliphaten (z.B. Propionitril, Korksäuredinitrl) oder Benzonitrilen kaum bis gar nicht aktiv. Daher ist insbesondere Aktivität mit Norbornennitrilen überraschend.
Vorteilhaft ist zudem die Stabilität und Produktivität des erfindungsgemäßen Enzyms unter Reaktorbedingung enorm und die Handhabung einfach, da ein weiter Temperatur- und pH-Bereich zur Verfügung steht und das Enzym eine hohe Nitril-Toleranz besitzt, d.h. es ist keine Nitrildosierung notwendig.
Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten Enzyme mit erfindungsgemäßer Aktivität und die Verwendung dieser in den erfindungsgemäßen Verfahren.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rah- men der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Substratspezifität, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die von Verbindung I zu Verbindung Il umsetzen und die mindestens 50 %, bevorzugt 60 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % oder mehr der Aktivität eines Enzyms mit der in SEQ ID NO:2 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweisen. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise bei Temperaturen von 00C bis 700C stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 5 und 8 sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 100C bis 50°C.
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäu- resequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt wer- den.
Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn ; GIn
He Leu; VaI
Leu Me; VaI
Lys Arg ; GIn ; GIu
Met Leu ; Me
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
VaI Me; Leu
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquiva- lente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden, wobei die Geschwindigkeit nicht weniger als 30% der des unveränderten Polypeptids beträgt, vorzugsweise mehr als 100%, insbesondere mehr als 150%, besonders bevorzugt eine um den Faktor 2, 5, oder 10 erhöhte Geschwindigkeit.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursor" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
„Präkursor" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität.
Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. SaI- ze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgrup- pen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln. „Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispie- Ie für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutage- nese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.
Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Muta- genese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligo- nukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Protein- Sequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ).
In einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Reaktionstemperatur 5 bis 75°C durchgeführt. Bevorzugt beträgt die Reaktionstemperatur Um- gebungs- oder Raumtemperatur oder mehr, beispielsweise 30°C oder mehr, jedoch weniger als 700C, bevorzugt 600C, 500C oder weniger. In einer bevorzugten Ausfüh- rungsform beträgt die Reaktionstemperatur ungefähr 35 bis 45°C, z.B. 40°C, für die xNon-Herstellung. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Reaktionstemperatur zwischen Umgebungstemperatur und 50°C für die Herstellung von eNon.
Verbindung I kann sowohl ein Enantiomerengemisch, z.B. R1S oder end/exo- Enantiomere, als auch enantiomerenrein sein, d.h. überwiegend ein Enantiomer enthalten. In einer Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein enan- tiomerreines Substrat umgesetzt.
Unter isomerenreinen, enantiomerenreinen bzw. chiralen Produkten bzw. optisch aktiven Verbindungen sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantio- merenreinheiten von mindestens 70 % ee, bevorzugt von min. 80 %ee, besonders bevorzugt von min. 90 %ee, ganz besonders bevorzugt min. 98 %ee, noch mehr bevorzugt von 99%ee, und meisten bevorzugt von min. 99,5%ee erreicht.
In einer Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren R-5-Norbornen-2- endo-carbonitril, S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril, und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril zur entsprechenden S-5-Norbornen-2-exo- carbonsäure, S-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure, R-5-Norbornen-2-exo-carbonsäure bzw. R-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure verseift.
In einer weiteren Ausführungsform ist Verbindung I gleich R-5-Norbornen-2-endo- carbonitril und S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril oder R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril und S-δ-Norbornen^-exo-carbonitril.
In einer anderen Ausführungsform ist Verbindung I gleich R-5-Norbornen-2-endo- carbonitril oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril oder R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril.
Folglich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren, wobei ein enantiomerreines Produkt erhalten wird.
In einer Ausführung betrifft die Erfindung ein Verfahren, in dem bei einer Substratkonzentration mindestens 2OmM, vorzugsweise 5OmM, 7OmM, 10OmM, 15OmM, 20OmM, 25OmM, 30OmM, 40OmM, 50OmM, 70OmM, 100OmM, 200OmM, oder mehr beträgt und wobei das Substrat, also Verbindung I, insbesondere R-5-Norbornen-2-endo- carbonitril, S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril, und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril zu mindestens 50 %, vorzugsweise zu 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr zu Verbindung Il umgesetzt wird.
In einer Ausführungsform wird als Substrat ein Isomerengemisch, insbesondere ein Enatiomerengemisch, der Verbindung I als Substrat eingesetzt wird und im Produkt kommt es zu einer Anreicherung eines Isomers, insbesondere eines Enatiomers der Verbindung II. Vorzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein endo- und exo-Enantiomer der Verbindung I eingesetzt und es kommt zu einer Anreicherung des endo- oder exo-Enantiomers der Verbindung II. Besonders bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Anreicherung ein Gemisch aus R-5-Norbornen-2- endo-carbonitril und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril und R-5-Norbornen-2-exo- carbonitril und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril zur entsprechenden S-5- Norbornen-2-exo-carbonsäure und/oder R-5-Norbornen-2-exo-carbonsäure und R- 5- Norbornen-2-endo-carbonsäure und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure verseift, wobei es vorzugsweise zu einer Anreicherung der endo-Enantiomere der Norbornen- säure kommt.
Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 6 und 10, bevorzugt zwischen pH 7 und 9 , besonders bevorzugt zwischen pH 7,5 und 8,5 gehalten.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt, beispielsweise R- und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonsäure und/oder R- und/oder S-5-Norbornen-2- endo-carbonsäurej. lässt sich vorteilhaft aus der wässrigen Reaktionslösung über Extraktion oder Destillation gewinnen. Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden. Beispiele für geeignete Extraktionsmittel sind Lösungsmittel, wie Toluol, Methylenchlorid, Butylacetat, Diisopropylether, Benzol, MTBE oder Essigester, ohne darauf beschränkt zu sein.
Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 80 %, vorzugsweise 85%, 90%, 95%, 98% oder mehr, chemische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die organi- sehe Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0°C bis 10°C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung oder aus einer wässrigen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte Produkt kann nochmals im gleichen oder in einem anderen Lösungsmittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und nochmals kristallisiert werden.
Durch die anschließende optionale, vorzugsweise mindestens einmalig, durchgeführte Kristallisation kann die Enantiomerenreinheit des Produktes falls erforderlich weiter gesteigert werden.
Bei den genannten Aufarbeitungsarten lässt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100 %, bevorzugt von 80 bis 100 %, besonders bevorzugt von 90 bis 100 %, bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte Substrat, wie z.B. von R-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril S-5- Norbornen-2-endo-carbonitril, und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril isolieren. Das isolierte Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von > 90 %, bevorzugt > 95 % besonders bevorzugt von > 98 % aus. Weiterhin haben die Produkt eine hohe Enantiomerenreinheit, die vorteilhaft falls erforderlich durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.
Die Durchführung des Verfahrens kann vorteilhafterweise in Bioreaktoren erfolgen, wie z.B. beschrieben in Biotechnology, Band 3, 2. Auflage, Rehm et al Hrsg., (1993) insbesondere Kapitel II.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung auch ein Polypeptid, das geeignet zur enzymatischen Verseifung der Verbindung I zur Verbindung Il ist. Vorzugsweise codiert das Polypeptid eine Nitrilase, insbesondere eine Arylacetonitrilase . In einer Ausführungsform ist das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, dass es codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das in Seq. ID No.: 2 oder 4 gezeigt wird;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest das Polynukleotid der codierenden Sequenz nach Seq. ID No.: 1 oder 3 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz aufgrund der Degen eriertheit des geneti- sehen Codes abgeleitete werden kann von einer Polypeptidsequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(d) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids hat, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird; (e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das von einem Arylacetonitrila- se-Polypeptid abgeleitet wird wobei bis zu 15% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 oder 4 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und das noch mindestens 30% der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO: 2 oder 4 besitzt; und (f) Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment oder ein Epitop einer Arylaceto-Nitrilase codiert, das von einem der Nukleinsäuremoleküle nach (a) bis (c) codiert wird;
oder eine komplementären Sequenz davon umfasst.
In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid nicht die Sequenz nach Seq ID No.: 2 und/oder 4. In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid auch nicht die Sequenz der in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 genannte Nitrilase. In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid auch nicht die Sequenz des Datenbankeintrags AY885240.
In einer Ausführungsform hat das erfindungsgemäße Polypeptid die Eigenschaft, auch bei hoher Substratkonzentration, d.h. bei hoher Konzentration von Verbindung I im Medium zu hohem Prozentsatz Verbindung II, insbesondere Norbornensäure, herszu- stellen. Vorzugsweise kann das Polypeptid bei einer 5-Norbornen-2-endo-carbonitril- Konzentration von 2OmM, vorzugsweise 5OmM, 7OmM, 10OmM, 15OmM, 20OmM, 25OmM, 30OmM, 40OmM, 50OmM, 70OmM, 100OmM, 200OmM, oder mehr, das Substrat zu mindestens 50 %, vorzugsweise zu 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr zu Verbindung Il umgesetzt wird, wobei das Substrat, also Verbindung I, insbesondere R-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril, und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril ist. Beson- ders bevorzugt ist, wenn das Polypeptid bei einer Substratkonzentration von mindestens 15OmM das Substrat zu mindestens 65% innerhalb 24h bei 400C umsetzt Folglich betrifft die Erfindung auch ein Nukleinsäuremolekül, das das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid codierend ein erfindungsgemäßes Polypeptid. In einer Ausführungsform besitzt das Nukleinsäuremolekül nicht die Sequenz der Seq. ID No. 1. In einer Ausführungsform codiert das Nukleinsäuremolekül nicht die Nitrilase aus Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989. In einer Ausführungsform besitzt das Nukleinsäuremolekül auch nicht die Sequenz des Datenbankeintrags AY885240.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Aktivität kodieren oder in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, welche z.B. für Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:2 oder 4 oder charakteristische Teilsequenzen davon kodieren, oder Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:1 oder 3 oder charakteristische Teilsequenzen davon umfassen.
Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.
In einer Ausführungsform unterscheidet sich die erfindungsgemäße Nukleinsäurese- quenz in mindestens einer Base von der aus Seq. ID No. 1 oder 3. In einer Ausfüh- rungsform besitzt das Nukleinsäuremolekül auch nicht die Sequenz der in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 genannte Nitrilase. In einer Ausführungsform besitzt das Nukleinsäuremolekül auch nicht die Sequenz des Datenbankeintrags AY885240.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsge- mäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequen- zen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abge- trennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrie- ben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzipiell aus allen Organismen identifizieren und isolieren. Vorteilhaft lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die Homologen davon, aus Pilzen, Hefen, Archeen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien gram-negative und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aus gramnegativen Bakterien vorteilhaft aus α-Proteobakterien, ß-Proteobakterien oder v- Proteobakterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Ordnungen der Burkholdeήa- les, Hydrogenophilales, Methylophilales, Neisseriales, Nitrosomonadales, Procabacte- riales oder Rhodocyclales. Ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Familie der Rhodocyclaceae.
Besonders bevorzugt verwendet man Arylacetonitrilasen aus Pseudomonas spec.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Organismen, z.B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit einer erfindungsgemäßen Nitrilase, insbesondere Arylacetonitrilasen, in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedri- ger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.
So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen von SEQ ID NO:1 oder 3 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.
Unter Derivaten einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 50 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 75 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 80, 85, 90, 93, 95, 98 oder 99 % Homologie über den gesamten Sequenz- bereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.
Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Sequenzen beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen. So besitzen z.B. auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 50 %, bevorzugt von 75 % oder mehr, besonders bevorzugt von 80 %, ganz besonders bevorzugt von 90 %, am meisten bevorzugt 95%, insbesondere 98%, oder mehr über den gesamten angegebenen DNA-Bereich.
Unter „Homolog" oder "wesentlicher Sequenzhomologie" wird erfindungsgemäß allgemein verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz eines DNA- Moleküls bzw. eines Proteins zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, wei- ter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen der Arylacetonitrilasen, insbesondere zu SEQ ID No. :1 , 2, 3 bzw. 4 oder dessen funktionell äquivalenten Teilen identisch ist. Vorzugsweise wird die Homologie über die gesamte Sequenzlänge der Arylacetonitrilasen, insbesondere zu SEQ ID No. :1 , 2, 3 bzw. 4 bestimmt.
Unter "Identität zwischen zwei Proteinen" wird die Identität der Aminosäuren über einen bestimmten Proteinbereich verstanden, vorzugsweise die gesamte Proteinlänge, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL- Methode (Higgins et al., 1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151 ) berechnet wird. Homologien können ebenfalls mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode (Higgins et al., 1989), Comput. Appl. Biosci., 5 (2), 151 ) berechnet werden. Für die Sequenzvergleiche können die voreingestellten Parameter der Seite http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ Last updated: 10/17/2005 1 1 :27:35 mit folgenden Programmen der FTP DIRECTORY: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/unix/clustalw/ ParClustalO.Ltar.gz [Nov 28 2001] 823975
ParClustalO.2.tar.gz [Jun 27 2002] 2652452
README [Jun 13 2003] 673 clustalwi .δ.UNIX.tar.gz [JuI 4 1999] 4725425 clustalwi .δ.mp.tar.gz [May 2 2000] 174859 clustalw1.81.UNIX.tar.gz [Jun 7 2000] 555655 clustalwi .82.UNIX.tar.gz [Feb 6 2001] 606683 clustalw1.82.mac-osx.tar.gz [Oct 15 2002] 669021 clustalw1.83.UNIX.tar.gz [Jan 30 2003] 166863
wie in Figur 2 gezeigt verwendet werden.
Bevorzugt wird die Homologie also über den gesamten Aminosäure- bzw. Nuklein- säuresequenzbereich berechnet. Neben den oben genannten Programmen stehen dem Fachmann für den Vergleich verschiedener Sequenzen noch weitere Programme zur Verfügung, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen. Dabei liefern die Algorithmen von Meedleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche kann z.B. auch das Programm PiIe Aupa verwendet werden (J. Mol. Evolution. (1987), 25, 351 - 360; Higgins et al., (1989) Cabgos, 5, 151 - 153) oder die Programme Gap und Best Fit (Needleman und Wunsch, (1970), J. Mol. Biol., 48, 443 - 453 sowie Smith und Waterman (1981 ), Adv., Appl. Math., 2, 482 - 489), die im GCG-Software-Paket der Genetics Computer Group (575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 5371 1 ) enthalten sind. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Homologie mit dem Programm Gap über die cDNA-Volllängensequenz bestimmt. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Homologie mit dem Programm Gap über die gesamte genomische Sequenz bestimmt. In einer ganz beson- ders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Homologie mit dem Programm Gap über die codierende Vollängensequenz bestimmt.
Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, Insertionen, Inversionen und/oder Deletionen verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Verände- rung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -1000 Basen stromaufwärts vor dem Startkodon oder 0 bis 1000 Basen stromabwärts nach dem Stopkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen unter „stringenten Bedingungen" hybridisieren. Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich damit auf Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz präferentiell an eine Zielsequenz bindet, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen.
Diese Polynukleotide lassen sich bei der Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden. Unter dieser Eigenschaft versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bin- düngen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisie- rungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA- Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrie- ben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridi- zation: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot- Technik die Verwendung einer 50 - 70 0C, vorzugsweise 60 - 65 0C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1 % SDS (2Ox SSC: 3M NaCI, 0,3M Na- Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleoti- de. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z:B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Mit dem Begriff "Komplementarität" wird die Fähigkeit eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben, mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen zu hybridisieren. Der Fachmann weiß, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nicht über eine 100%ige Komplementarität verfügen müssen, um miteinander hybridisieren zu können. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer anderen Nukleinsäuresequenz hybridisieren soll, zu dieser zu mindestens 40%, zu mindestens 50%, zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 70%, beson- ders bevorzugt zu mindestens 80%, ebenfalls besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% bzw. 100% komplementär.
Bevorzugt sind Homologie-, Komplementaritäts- und Identitätsgrade über die gesamte Protein- bzw. Nukleinsäurelänge zu bestimmen. Nukleinsäuremoleküle sind identisch, wenn sie gleiche Nukleotide in gleicher 5'-3'- Reihenfolge aufweisen.
Folglich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors oder Expressionskonstrukts, umfassend die Insertion des erfindungsgemäßen Nukleinsäu- remoleküls in einen Vektor oder Expressionskonstrukts.
Folglich betrifft die Erfindung auch ein Nukleinsäurekonstrukt oder Vektor, enthaltend das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder hergestellt im erfindungsgemäßen Verfahren oder enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt geeignet zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.
Gegenstand der Erfindung sind folglich Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylie- rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Unter einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind insbesondere solche zu verstehen, bei weichen das Gen für eine erfindungsgemäße Umsetzung mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten Εnhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq"' T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD)SP6-, Iambda-PR- oder im Iambda-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase, beispielswei- seaus Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inse- riert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-IN113-B1 , Igt1 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'- und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pou- wels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.
Folglich betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor oder mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid stabil oder transient transformiert oder transfiziert wurde oder in der das erfindungsgemäße Polynukleotid oder ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Polynukleotid wie oben beschrieben exprimiert wird oder in dem ein solches im Vergleich zu einem Wildtyp erhöht expri- miert wird.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren oder Konstrukte sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemä- ßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige KIo- nierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Pro- toplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz zu verändern, z.B. funktionell zu disrumpieren ("Knockouf- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass da- durch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäßen Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 :503.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae,
Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta- Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden.
Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäurese- quenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Aktivität zur Umsetzung von Verbindung I zu Il kodieren.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroor- ganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoff- begasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Das Keton kann direkt zur Anzucht gegeben werden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Po- lypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fer- mentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 4O0C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfah- ren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-
Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo- dies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reakti- onsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch Organismen, insbesondere Mikro- Organismen eingesetzt werden, die eine erhöhte Acetonitrilase-Aktivität haben oder bei denen die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids erhöht ist im Vergleich zum Wildtyp.
Beispielsweise kann eine solche Erhöhung durch Einbringen eines entsprechenden Nukleinsäurekonstruktes, wie z.B. dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt oder Vektor oder durch gezielte oder ungezielte Mutagnese des Organismus erreicht werden
Die ausgewählten Mikroorganismen werden erfindungsgemäß mutagenisiert. Unter mutagenisiert wird verstanden, dass in die Erbinformationen, d.h. in das Genom der Mikroorganismen gezielt oder ungezielt Mutationen eingeführt werden. Bei gezielten oder ungezielten Mutationen werden eine oder mehr Erbinformationen verändert, d.h. die Mikroorganismen werden genetisch verändert. In der Regel führt diese Veränderung dazu, dass die betroffenen Gene nicht oder fehlerhaft exprimiert werden, so dass die Aktivität des Genproduktes reduziert oder inhibiert ist.
Bei gezielten Mutationen wird ein bestimmtes Gen mutiert oder dessen Aktivität inhibiert, reduziert oder verändert. Bei ungezielten Mutationen wird zufällig eine oder mehrere Gene mutiert oder dessen/deren Aktivität inhibiert, reduziert oder verändert.
Um gezielte Mutationen in einer großen Anzahl von Mikroorganismen durchzuführen, kann eine Population z.B. mit einer DNA-Population oder Bank, die sich zur Inhibierung von verschiedenen, möglichst vielen, im optimalen Fall aller Gene eignet, transformiert werden, so dass statistisch gesehen in jedes Gen des Mikroorganismus ein, vorzugsweise identifizierbares, DNA-Fragment integriert wird. Durch Analyse des Integrationsorts kann das ausgeschaltete Gen identifiziert werden.
Bei ungezielten Mutationen wird eine große Anzahl an Mikroorganismen mit einem mutagenen Reagenz behandelt. Die Menge des Reagenz oder die Intensität der Behandlung wird so gewählt, dass statistisch gesehen, eine Mutation eines jeden Gens erfolgt. Verfahren und Reagenzien zur Mutagenese von Mikroorganismen sind dem Fachmann ausreichend bekannt. Die praktische Durchführung der verschiedenen Methoden sind in zahlreichen Publikationen zugänglich, z.B. auch in A.M. van Harten (1998), "Mutation breeding: theory and practical applications", Cambridge University Press, Cambridge, UK, E Friedberg, G Walker, W Siede (1995), „DNA Repair and Mu- tagenesis", Blackwell Publishing, K. Sankaranarayanan, J. M. Gentile, L. R. Ferguson (2000) „Protocols in Mutagenesis", Elsevier Health Sciences. Der Fachmann weiß, dass die spontane Mutationsrate in Zellen sehr niedrig ist und es eine große Anzahl von chemischen, physikalischen und biologischen Agenzien gibt, die Mutationen induzieren können. Diese Agenzien werden Mutagene genannt. Man unterscheidet biologische, physikalische und chemische Mutagene.
Es gibt verschiedene Klassen von ehem. Mutagenen, die sich in ihrer Wirkungsweise unterscheiden: Z.B. Basenanaloga, wie z.B. 5-Bromuracil, 2-Aminopurin; Chemikalien, die mit DNA reagieren, wie z.B. salpetrige Säure, Hydroxylamin; oder alkylierende Verbindungen, wie monofunktionale (z.B. Ethylmethansulfonat, Dimethylsulfat, Methyl- methansulfonat), bifunktionale (z.B. Stickstoff-Senfgas, Mitomycin, Nitrosoguanidine - Dialkylnitrosamine, N-Nitrosoharnstoffderivate, N-Alkyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine-), interkalierende Farbstoffe (z.B. Acridine, Ethidiumbromid).
Physikalische Mutagenisation erfolgt z.B. über Bestrahlung der Organismen. Mehrere Formen von Strahlung sind stark mutagen. Man kann 2 Klassen unterscheiden: nicht- ionisierende Strahlung (z.B. UV) und ionisierende Strahlung (z.B. Röntgenstrahlung). Auch durch biologische Prozesse könne Mutationen induziert werden. Das Standard- vorgehen ist dabei die Transposonmutagenese, bei der es durch Insertion eines transponierbaren Elementes innerhalb oder in der Umgebung eines Genes zur Veränderung, in der Regel zum Verlust einer Genaktivität kommen. Durch die Identifizierung des Insertionsorts des Transposons kann das Gen, dessen Aktivität verändert wurde, isoliert werden.
Durch die Mutagenese kann die zelluläre Aktivität von ein oder mehreren Genprodukten verändert werden. Vorzugsweise ist die zelluläre Aktivität der hierein beschriebenen Arylacetonitrilase , besonders bevorzugt des hierin beschriebenen Polypeptids erhöht. Bevorzugt können die erfindungsgemäß nicht-transgenen Organismen, insbesondere
Mikroorganismen, Pflanzen und Pflanzenzellen, die sich durch eine Modulation der Expression und/oder des Bindungsverhaltens der endogenen Arylacetonitrilase auszeichnen und eine permanente oder transiente Pathogenresistenz besitzen, durch den so genannten "TILLING"-Ansatz (Targeting Induced Local Lesion in Genomes) herge- stellt werden. Dieses Verfahren ist im Detail in Colbert et al. (2001 , Plant Physiology, 126, 480 - 484), McCallum et al. (2000, Nat. Biotechnol., 18, 455 - 457) und McCallum et al. (2000, Plant Physiology, 123, 439 - 442) beschrieben worden. Die vorgenannten Referenzen werden hier explizit als Offenbarung hinsichtlich der "TILLING"-Methode eingeführt.
Das TILLING-Verfahren ist eine Strategie der so genannten reversen Genetik, das die Produktion hoher Dichten von Punktmutationen in mutagenisierten Mikroorganismen- oder Pflanzenkollektionen, z.B. durch chemische Mutagenese mit Ethylmethansulpho- nat (EMS), mit der schnellen systematischen Identifizierung von Mutationen in Zielsequenzen kombiniert. Zunächst wird die Zielsequenz über PCR in DNA-Pools mutageni- sierter M2-Populationen amplifiziert. Denaturierungs- und Annealingsreaktionen der heteroallelischen PCR-Produkte erlauben die Ausbildung von Heteroduplexen, bei denen ein DNA-Strang von dem mutierten und der andere vom „Wildtyp" PCR-Produkt stammt. An der Stelle der Punktmutation erfolgt ein sogenannter Mismatch, der entweder über denaturierende HPLC (DHPLC, McCallum et al., 2000, Plant Physiol., 123, 439-442) oder mit dem Cel\ Mismatch-Detektionssystem (Oleykowsky et al., 1998, Nucl. Acids Res. 26, 4597-4602) identifiziert werden kann. Cel\ ist eine Endonuklease, die Mismatche in Heteroduplex-DNA erkennt und spezifisch an diesen Stellen die DNA spaltet. Die Spaltungsprodukte können dann über automatisierte Sequenzierungs- Gelelektrophorese aufgetrennt und detektiert werden (Colbert et al., 2001 , vide supra). Nach Identifizierung von Zielgen-spezifischen Mutationen in einem Pool werden indivi- duelle DNA-Proben entsprechend analysiert, um den Mikroorganismus oder die Pflanze mit der Mutation zu isolieren. Auf diese Weise wird bei den erfindungsgemäßen Mikroorganismen, Pflanzen und Pflanzenzellen nach der Herstellung der mutagenisier- ten Populationen durch Verwendung gegen Arylacetonitrilase gerichtete Primerse- quenzen die Identifizierung der mutagenisierten Pflanzenzellen bzw. Pflanzen durchge- führt. Das TILLING-Verfahren ist generell für alle Mikroorganismen und Pflanzen und Pflanzenzellen anwendbar.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung auch eine Zusammensetzung, enthaltend im wesentlichen R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril und Zusammensetzungen enthaltend: R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure zu mehr als 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%; und/oder enthaltend R- und/oder S-5-Norbornen-2- exo-carbonsäure-Verhältnis weniger als 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1 %. Eine solche Zusammensetzung wurde bisher im Stand der Technik nicht hergestellt. Die chemische Herstellung von Norbornensäure führte immer zu einem Enantiomerengemisch von 5- Norbornen-2-endo-carbonsäure zu 5-Norbornen-2-exo-carbonsäure-Verhältnis von ungefähr 0,6:ungefähr 0,4.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, enthaltend im wesentlichen R- und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril und eine Zusammensetzung enthaltend R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure zu R- und/oder S-5- Norbornen-2-exo-carbonsäure in einem Verhältnis von weniger als 0,6 zu mehr als 0,4. Eine solche Zusammensetzung wurde bisher im Stand der Technik nicht hergestellt. Die chemische Herstellung von Norbornensäure führte immer zu einem Enantiomeren- gemisch von 5-Norbornen-2-endo-carbonsäure zu 5-Norbornen-2-exo-carbonsäure- Verhältnis von ungefähr 0,6: ungefähr 0,4
Folglich betrifft die Erfindung auch eine Zusammensetzung, herstellbar nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines En- zyms, insbesondere einer Nitrilase, bevorzugt einer Arylacetonitrilase , besonders bevorzugt eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit der Sequenz gezeigt in SEQ ID No. 2 oder 4 oder ein Homolog oder ein funktionelles Fragment davon zur Anreicherung eines Isomers der Verbindung Il aus einem Isomerengemisch der Verbindung I.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Enzyms, insbesondere einer Nitrilase, bevorzugt einer Arylacetonitrilase , besonders bevorzugt eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit der Sequenz gezeigt in SEQ ID No. 2 oder 4 oder ein Homolog oder ein funktionelles Fragment davon zur Anreicherung von R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure aus einem Gemisch enthaltend R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril und R- und/oder S-5-Norbornen-2-exo- carbonitril.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Arylacetonitrilase zur Umsetzung von R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril und/oder R- und/oder S-5- Norbornen-2-exo-carbonitril zu R- und/oder S-Norbornen-2-endo-carbonsäure und/oder R- und/oder S-Norbornen-2-exo-carbonsäure.
Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung einer Arylacetonitrilase zur Umsetzung von R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril und/oder R- und/oder S-5- Norbornen-2-exo-carbonitril zur R- und/oder S-Endo- und/oder R- und/oder S- Norbor- nen-2-exo-carbonsäure.
Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung eines Enzyms, insbesondere einer Nitrilase, bevorzugt einer Arylacetonitrilase , besonders bevorzugt eines erfindungsgemä- ßen Polypeptids mit der Sequenz gezeigt in SEQ ID No. 2 oder 4 oder ein Homolog oder ein funktionelles Fragment davon zur Umsetzung von R- - und/oder S-5- Norbornen-2-Endo-carbonitril zur isomerenreiner R- und/oder S-5-Norbornen-2-endo- carbonsäure bei hoher Substratkonzentration.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Enzyms, insbesondere einer Nitrilase, bevorzugt einer Arylacetonitrilase , besonders bevorzugt eines erfindungsgemäßen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass ein Po- lypeptid verwendet wird, dass codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül , das ein Nukleinsäuremolekül umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dass in Seq. ID No.: 2 oder 4 gezeigt wird;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest das Polynukleotid der codierenden Sequenz nach Seq. ID No.: 1 oder 3 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz aufgrund der Degen eriertheit des genetischen Codes abgeleitete werden kann von einer Polypeptidsequenz, die von ei- nem Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(d) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids hat, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das von einem Arylacetonitrila- se-Polypeptid abgeleitet wird wobei bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber
SEQ ID NO:2 oder 4 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und das noch mindestens 30% der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO: 2 oder 4 besitzt; und
(f) Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment oder ein Epitop einer Arylaceto-Nitrilase codiert, das von einem der Nukleinsäuremoleküle nach (a) bis (c) codiert wird;
oder eine komplementären Sequenz davon umfasst.
In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid nicht die Sequenz nach Seq ID No.: 2 oder 4. In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid auch nicht die Sequenz der in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 genannte Nitrilase. In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid auch nicht die Sequenz des Datenbankeintrags AY885240.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines Polypeptids zur Herstellung einer Verbindung der Formel Il durch enzymatische Umsetzung einer Verbindung der Formel I, wobei das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, dass es codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, das Nukleinsäuremolekül umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dass in Seq. ID No.: 2 oder 4 gezeigt wird;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest das Polynukleotid der codierenden Sequenz nach Seq. ID No.: 1 oder 3 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz aufgrund der Degen eriertheit des genetischen Codes abgeleitete werden kann von einer Polypeptidsequenz, die von ei- nem Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird; (d) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids hat, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dass von einem Arylacetonitri- lase-Polypeptid abgeleitet wird wobei bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 oder 4 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und das noch mindestens 30% der enzymati- schen Aktivität von SEQ ID NO: 2 oder 4 besitzt;
(f) Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment oder ein Epitop einer Arylaceto-Nitrilase codiert, das von einem der Nukleinsäuremoleküle nach (a) bis (c) codiert wird;
oder eine komplementären Sequenz davon umfasst.
In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid nicht die Sequenz nach Seq ID No.: 2 oder 4. In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid auch nicht die Sequenz der in Eur. J. Biochem. 182, 349-156, 1989 genannte Nitrilase. In einer Ausführungsform besitzt das Polypeptid auch nicht die Sequenz des Datenbankeintrags AY885240.
Figuren:
Figur 1 zeigt Enzyme mit erfindungsgemäßer Aktivität. Bei Einsatz des isomerenreinen exo-Norbornennitrils konnte eine hohe Aktivität beobachtete werde. Eine hohe Aktivität konnte auch bei einer hohen Nitrilkonzentration beobachtet werden.
Die obige Beschreibung und die nachstehenden Beispiele dienen nur der Verdeutlichung der Erfindung. Die für den Fachmann offensichtlichen, zahlreich möglichen Abwandlungen sind erfindungsgemäß ebenfalls umfasst.
Beispiele
1. Umsetzung von 5-Norbornen-2-endo/exo-carbonitril mit verschiedenen Nitrilasen
Nitrilasen der Firma Biocatalytics („Nit101-108") wurden als BTM mit 2 mg/ml eingesetzt. Die BASF-Nitrilasen wurden als rekombinante Ganzzellbiokatalysatoren einge- setzt (E. coli TGl OpDHE-System mit GroELS-Chaperonen vgl. PCT/EP 03/13367) und dazu über Nacht in 30 ml LB mit Ampicillin (100 μg/ml), Spectinomycin (100 μg/ml), Chloramphenicol (20 μg/ml), IPTG (0,1 mM) und Rhamnose-Monohydrat (0,5 g/L) im 100 ml-Erlenmeyer bei 37°C angezogen. Die Zellen wurden 1x in 30 ml 10 mM Pipes pH7.0 gewaschen und in 3 ml Puffer aufgenommen und ggf. bei -20°C verwahrt. Als Nitril wurde das Isomerengemisch der Fa. Aldrich eingesetzt.
Assay: 10 - 200 μl Zellen (10fach-Konzentrat) 100 μl lOO mM Nitril in MeOH ad 1000 μl 10 mM Pipes pH7,0 3 bis 21 h bei 40 °C schütteln
Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände per RP-HPLC auf 5-Norbornen-2- endo/exo-carbonsäure untersucht.
Die Ergebnisse sind in dem Diagramm der Figur 1 dargestellt.
2. Umsetzung von 5-Norbornen-2-endo-carbonitril mit Nitrilase 338 und Isolierung
30 ml Nitril und 1-20 g/L Zellen TG10+pDHE338 wurden in 0,5 L 10 mM NaH2PO4, pH7,5 in einem Glasreaktor bei 250 rpm und 40°C gerührt. Nach 7-24 h wurde der Umsatz zu 5-Norbornen-2- endo-carbonsäure per HPLC analysiert und war fast vollständig (<3 mM Nitril).
Nach Abtrennung der Zellen wurde die Roh-5-Norbornen-2-carbonsäure im Rotationsverdampfer aufkonzentriert (ca. 2 M) und mit einem Volumen Heptan sauer (pH2 mit H2SO4) extrahiert. Nach Abziehen des Lösungsmittels und Trocknen wurde 5- Norbornen-2- endo-carbonsäure als Feststoffe (Smp. 46°C) in über 99%iger Reinheit (H-NMR, HPLC) erhalten.
3. Umsetzung von 5-Norbornen-2-exo-carbonitril mit Nitrilase 338 und Isolierung
30 ml Nitril und 1-20 g/L Zellen TG10+pDHE338 wurden in 0,5 L 10 mM NaH2PO4, pH7,5 in einem Glasreaktor bei 250 rpm und 40°C gerührt. Nach 1-7 d wurde der Umsatz zu 5-Norbornen-2-endo-carbonsäure per HPLC analysiert und war fast vollständig (<3 mM Nitril). Nach Abtrennung der Zellen wurde die Roh-5-Norbornen-2-carbonsäure im Rotations- Verdampfer aufkonzentriert (ca. 2 M) und mit einem Volumen Heptan sauer (pH2 mit H2SO4) extrahiert. Nach Abziehen des Lösungsmittels und Trocknen wurde 5- Norbornen-2-endo-carbonsäure als Feststoffe (Smp. 42°C) in über 99%iger Reinheit (H-NMR, HPLC) erhalten. 4. Vergleichsbeispiel Rhodococcus rhodochrous J1-Nitrilase, Klonierung und Expression
Zur Klonierung der Nitrilase aus Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478) wurden an Hand der Sequenz D1 1425 (J. Biol. Chem. 267 (29), 20746-20751 (1992)) die Primer Mke 638 und Mke639 ausgesucht und das Nitrilasegen durch PCR von einer Einzelkolonie des Stammes amplifiziert.
PCR:
Figure imgf000036_0001
Primer:
Figure imgf000036_0002
Die PCR wurde nach Stratagene-Standardvorschrift mit Pfu ultra-Polymerase (Strata- gene) und dem folgenden Temperatur-Programm durchgeführt: 95°C für 5 Minuten; 30 Zyklen mit 95°C für 45 sec, 50°C für 45 sec, und 72°C für 1 min 30 sec; 72°C für 10 min.; 10°C bis zur Verwendung. Das PCR-Produkt (1 ,2 kB) wurde durch Agarosegel- Electrophorese (1 ,2%E-Gel, Invitrogen) und Säulen-Chromatographie (GFX-Kit, A- mersham) isoliert und anschließend mit Ndel/Hindlll verdaut und in entsprechend verdauten pDHE19.2-Vektor (ein pJOE-Derivat, DE19848129) kloniert. Die Ligationsan- sätze wurden in E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 transformiert (TG10: ein RhaA"-Derivat von E. coli TG1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61 , 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001 ), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413). 6 Transformanten wurden gepickt und analysiert: Die 6 Transformanten wurden in 3OmL LBAmp/Spec/Cm 0,1 mM IPTG/0,5g/L Rhamnose in 10OmL EMK (Schikanen) 18 h bei 37°C angezogen, bei 5000g/10min zentrifugiert , einmal mit 1 OmM KH2PO4 pH8,0 gewaschen und in 3 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Sie wurden 1 :10 verdünnt mit 1 OmM KH2PO4 pH8,0 und 6 mM Benzonitril auf ihre Aktivität hingetestet. Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände per RP-HPLC auf Benzoesäure und Benzonitril untersucht. 4 Klone waren aktiv und zeigten bereits nach 15 min Vollumsatz zu Benzoesäure. Die Sequenzierung dieser 4 Klone ergab als Insert des erhaltenen Plasmids pDHErrhJI die in D11245 dargestellte Nukleinsäuresequenz der Nitrilase aus R. rhodochrous J1 5. Umsetzung von 5-Norbornen-2-endo/exo-carbonitril mit verschiedenen Nitrilasen
Rhodococcus rhodochrous J1 (FERM BP-1478) wurde wie in der Literatur beschieben angezogen (Nagasawa etc al., Arch. Microbiol. 1988: 150,89-94) und geerntet. Die Zellen wurden wie in Beispiel 4 auf ihre Benzonitrilase-Aktivität getestet und zeigten Vollumsatz nach 15 min. Die BASF-Nitrilase-Stämme und E. coli TG10+pDHE9632J1 (Beispiel 4) wurden wie in Beispiel 1 angezogen und geerntet. Anschließend wurden die Biotrockenmassen bestimmt (R. rhodochrous J1 : 3.5 g/L, E.coli-Stämme: 0,8 g/L).
Assay: x μl Zellsuspension (6 g/L BTM)
200-1000 mM Nitril
0 - 0,5mM DTT ad 1000 μl 20 mM KH2PO4 pH8,0
0,3 - 6d bei 40 °C schütteln
Zur Verfolgung der Umsetzung wurden Proben gezogen, zentrifugiert und die Über- stände per RP-HPLC auf 5-Norbornen-2- endo/exo-carbonsäure und deren Säureami- de untersucht.
Gebildete eNOS bei verschiedenen eNON-Konzentrationen:
Figure imgf000037_0001
Gebildete eNOSamid bei verschiedenen eNON-Konzentrationen:
Figure imgf000037_0002
Gebildete xNOS bei verschiedenen eNON-Konzentrationen:
Figure imgf000038_0001
Gebildete xNOSamid bei verschiedenen eNON-Konzentrationen:
Figure imgf000038_0002
Übersicht Vergleichssequenzen:
1. a)Polypeptidsequenz der Nitrilase NitA aus Pseudomonas fluorescens EBC191 (DSM7155) aus AY885240
2. Polypeptidsequenz der Nitrilase Nit aus ADI64602 (WO2003097810-A2 Seq. ID175)
3. Polypeptidsequenz der Nitrilase Nit aus ADG93882 (WO2003097810-A2 Seq. ID349)

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur enzymatischen Herstellung von
Figure imgf000039_0001
Verbindung Il wobei
R1 -R9 jeweils unabhängig voneinander sein können: H. lineares oder verzweigtes Al- kyl mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit zwei bis sechs Kohlenstoffatomen, unsubstituiertes, Amino-, Hydroxy- oder halo-substituiertes Aryl mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, und wobei
R5 und R7 sowie R8 und R9 auch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffenatomen formen können, z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl; R8 und R9 sowie R5 und R7 auch exocyclische Doppelbindungen mit optionalen Substituenten tragen können; und
R3 und R4 einen Ring (4,5,6) bilden können oder Teil eines annelierten Aroma- ten sein können. aus
Figure imgf000039_0002
Verbindung mit R1 bis R9 wie oben,
1 Seq/Fig 2 mittels einer Arylaceto-Nitrilase.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die enzymatische Umsetzung von Verbindung I erfolgt durch die Inkubation mit einem Polypeptid oder einem Medium enthaltend ein Polypeptid und wobei das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polypeptid codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäu- remolekül umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das in Seq. ID No.: 2 oder
4 gezeigt wird;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest das Polynukleotid der codierenden Sequenz nach Seq. ID No.: 1 oder 3 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes abgeleitete werden kann von einer Polypeptidsequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(d) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz eine I- dentität von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids hat, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird; (e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das von einem Arylaceto- nitrilase-Polypeptid abgeleitet wird bei dem bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und das noch mindestens 30% der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO: 2 besitzt; und (f) Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment oder ein Epitop einer Arylaceto-
Nitrilase codiert, das von einem der Nukleinsäuremoleküle nach (a) bis (c) codiert wird; oder eine komplementären Sequenz davon umfasst; und und optional das gebildete Produkt isoliert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Verbindung I ausgewählt ist aus R-5- Norbornen-2-endo-carbonitril, S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, R-5-Norbornen- 2-exo-carbonitril, und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Verbindung I R;S-5- Norbornen-2-endo-carbonitril oder R,S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R-5-Norbornen-2-endo- carbonitril, S-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril, und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril zur entsprechenden S-5-Norbornen-2- exo-carbonsäure, S-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure, R-5-Norbornen-2-exo- carbonsäure und/oder R-5-Norbornen-2-endo-carbonsäure verseift wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei ein im wesentlichen enanti- omerreines Substrat umgesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein im wesentlichen enanti- omerreines Produkt erhalten wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei bei einer Substratkonzentration von mindestens 2OmM der Verbindung I oder mehr 50 % oder mehr des Substrats zu Verbindung Il umgesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei ein Isomerengemisch der Verbindung I als Substrat eingesetzt wird und es im Produkt zu einer Anreicherung eines Isomers kommt.
10. Polypeptid, geeignet zur enzymatischen Verseifung der Verbindung I zur Verbindung II, wobei das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, dass es codiert wird von einem Nukleinsäuremolekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das in Seq. ID No.: 2 gezeigt wird;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest das Polynukleotid der codierenden Sequenz nach Seq. ID No.: 1 umfasst;
(c) Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes abgeleitete werden kann von einer Polypeptidsequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(d) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz eine I- dentität von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids hat, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das von einem Arylaceto- nitrilase-Polypeptid abgeleitet wird, bei dem bis zu 15% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und das noch mindestens 30% der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO: 2 besitzt; und
(f) Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment oder ein Epitop einer Arylaceto- Nitrilase codiert, das von einem der Nukleinsäuremoleküle nach (a) bis (c) codiert wird; oder eine komplementären Sequenz davon umfasst; und wobei das Polypeptid nicht die Sequenz nach Seq ID No.: 2 besitzt.
1 1. Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid eine Arylacetonitrilase ist.
12. Polypeptid nach Anspruch 10 oder 1 1 , wobei in einer Zusammensetzung enthaltend eine 5-Norbornen-2-endo-carbonitril-Konzentration von 200 mM oder mehr das Polypeptid Verbindung I zu 50% oder mehr umsetzt.
13. Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei in einer Zusammenset- zung enthaltend eine 5-Norbornen-2-exo-carbonitril-Konzentration von 200 mM oder mehr das Polypeptid Verbindung I zu 50% oder mehr umsetzt.
14. Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Polynukleotid codierend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Nukleinsäuremolekül nicht die Sequenz der Seq. ID No. 1 oder 3 hat.
15. Verfahren zur Herstellung eines Vektors oder eines Expressionskonstrukts, umfassend die Insertion des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 14 in einen Vektor oder in ein Expressionskonstrukt.
16. Vektor oder Expressionskonstrukt, enthaltend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 oder hergestellt nach Anspruch 15.
17. Vektor nach Anspruch 16, wobei das Nukleinsäuremolekül funktionell mit Regula- tionssequenzen verbunden ist, die die Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt erlauben.
18. Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 16 oder 17 oder das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 stabil oder transient transformiert oder transfiziert wurde oder das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14 oder des Polypeptids nach einem der Ansprüche 10 bis 13 exprimiert.
19. Zusammensetzung, enthaltend im wesentlichen 5-Norbornen-2-endo-carbonitril und ein Endo-Norbornensäure zu Exo-Norbornensäureverhältnis von_>0,6:< 0,4.
20. Zusammensetzung, enthaltend im wesentlichen 5-Norbornen-2-exo-carbonitril und ein Endo-Norbornensäure zu Exo-Norbornensäureverhältnis von <0,6:>0,4.
21. Zusammensetzung, herstellbar gemäß Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
22. Verwendung eines Enzyms zur Anreicherung eines Isomers der Verbindung Il aus einem Isomerengemisch der Verbindung I.
23. Verwendung nach Anspruch 22 zur Anreicherung von R- und/oder S-5- Norbornen-2-endo-carbonsäure aus einem Gemisch enthaltend R- und/oder S-5-
Norbornen-2-endo-carbonitril und R- und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril.
24. Verwendung einer Arylacetonitrilase zur Umsetzung von S-5-Norbornen-2-endo- carbonitril, R-5-Norbornen-2-endo-carbonitril, R-5-Norbornen-2-exo-carbonitril und/oder S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril zu beziehungsweise R-Norbornen-2- endo-carbonsäure, S-Norbornen-2-endo-carbonsäure, R-Norbornen-2-exo- carbonsäure und/oder S- Norbornen-2-exo-carbonsäure.
25. Verwendung einer Arylacetonitrilase zur Umsetzung von R,S-5-Norbornen-2- endo-carbonitril oder R,S-5-Norbornen-2-exo-carbonitril zur R,S-Norbornen-2- endo- oder R,S-Norbornen-2-exo-carbonsäure.
26. Verwendung einer Nitrilase zur Umsetzung von 5-Norbornen-2-Endo-carbonitril zu im wesentlichen isomerenreiner Endo-Norbornensäure bei hoher Substrat- konzentration.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid verwendet wird, dass codiert wird von einem Nukleinsäure- molekül, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst ausgewählt aus der Gruppe be- stehend aus:
(a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das in Seq. ID No.: 2 oder 4 gezeigt wird;
(b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest das Polynukleotid der codierenden Sequenz nach Seq. ID No.: 1 oder 3 umfasst; (c) Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes abgeleitete werden kann von einer Polypeptidsequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(d) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz eine I- dentität von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids hat, welches durch das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder (b) codiert wird;
(e) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das von einem Arylaceto- nitrilase-Polypeptid abgeleitet wird wobei bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 oder 4 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und das noch mindestens 30% der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO: 2 oder 4 besitzt; und (f) Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment oder ein Epitop einer Arylaceto- Nitrilase codiert, das von einem der Nukleinsäuremoleküle nach (a) bis (c) codiert wird; oder eine komplementären Sequenz davon umfasst.
PCT/EP2006/069511 2005-12-20 2006-12-11 Verfahren zur herstellung von 5 -norbornen-2-carbonsäure aus 5-norbornen-2-carbonitril unter verwendung einer arylacetonitrilase WO2007071578A2 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008546361A JP2009519724A (ja) 2005-12-20 2006-12-11 アリールアセトニトリラーゼを使用して５−ノルボルネン−２−カルボニトリルから５−ノルボルネン−２−カルボン酸を製造する方法
EP06841323A EP1966381A2 (de) 2005-12-20 2006-12-11 Verfahren zur herstellung von 5-norbornen-2-carbonsäure aus 5-norbornen-2-carbonitril unter verwendung einer arylacetonitrilase
US12/158,378 US20080265206A1 (en) 2005-12-20 2006-12-11 Method for the Enzymatic Production of 5-Norbornen-2-Carboxylic Acid
CA002626763A CA2626763A1 (en) 2005-12-20 2006-12-11 Method for producing 5-norbornen-2-carboxylic acid from 5-norbornen-2-carbonitrile using an arylacetonitrilase

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05112441.0 2005-12-20
EP05112441 2005-12-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007071578A2 true WO2007071578A2 (de) 2007-06-28
WO2007071578A3 WO2007071578A3 (de) 2007-11-08

Family

ID=38189009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2006/069511 WO2007071578A2 (de) 2005-12-20 2006-12-11 Verfahren zur herstellung von 5 -norbornen-2-carbonsäure aus 5-norbornen-2-carbonitril unter verwendung einer arylacetonitrilase

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20080265206A1 (de)
EP (1) EP1966381A2 (de)
JP (1) JP2009519724A (de)
CN (1) CN101341251A (de)
CA (1) CA2626763A1 (de)
WO (1) WO2007071578A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3002542A1 (fr) * 2013-02-28 2014-08-29 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
EP3098250A1 (de) 2015-05-26 2016-11-30 Covestro Deutschland AG Verfahren zur herstellung von polyethercarbonatpolyolen

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6067204B2 (ja) * 2010-04-20 2017-01-25 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス細菌のためのランダムゲノム挿入及び欠失ツール
US8883897B2 (en) * 2012-05-25 2014-11-11 New Functional Polymers LLC Functional norbornanyl ester derivatives, polymers and process for preparing same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076655A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 Basf Aktiengesellschaft Modified nitrilases and their use in methods for the production of carboxylic acids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076655A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 Basf Aktiengesellschaft Modified nitrilases and their use in methods for the production of carboxylic acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOBAYASHI, M. ET AL.: "Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous J1" EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, Bd. 182, Nr. 2, 1989, Seiten 349-356, XP001052651 in der Anmeldung erwähnt *
MATOISHI, K. ET AL.: "Rhodococcus rhodochrous IFO 15564-mediated hydrolysis of alicyclic nitriles and amides: stereoselectivity and use for kinetic resolution and asymmetrization" TETRAHEDRON: ASYMMETRY, Bd. 9, Nr. 7, 9. April 1998 (1998-04-09), Seiten 1097-1102, XP004131334 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3002542A1 (fr) * 2013-02-28 2014-08-29 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
CN104017832A (zh) * 2013-02-28 2014-09-03 瑟维尔实验室 (7s)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用
EP2772547A1 (de) * 2013-02-28 2014-09-03 Les Laboratoires Servier Enzymatisches Syntheseverfahren der (7S)-3,4-Dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-Carbonsäure, und Anwendung bei der Synthese von Ivabradin und seinen Salzen
WO2014131996A1 (fr) * 2013-02-28 2014-09-04 Les Laboratoires Servier Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
CN104017832B (zh) * 2013-02-28 2017-04-12 瑟维尔实验室 (7s)‑3,4‑二甲氧基双环并[4.2.0]辛‑1,3,5‑三烯‑7‑甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用
MD4440C1 (ro) * 2013-02-28 2017-05-31 Les Laboratoires Servier Procedeu de sinteză enzimatică a acidului (7S)-3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-carboxilic şi aplicarea acestuia în sinteza ivabradinei şi a sărurilor sale
EP3098250A1 (de) 2015-05-26 2016-11-30 Covestro Deutschland AG Verfahren zur herstellung von polyethercarbonatpolyolen
WO2016188991A1 (de) 2015-05-26 2016-12-01 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung von polyethercarbonatpolyolen

Also Published As

Publication number Publication date
US20080265206A1 (en) 2008-10-30
WO2007071578A3 (de) 2007-11-08
JP2009519724A (ja) 2009-05-21
CN101341251A (zh) 2009-01-07
CA2626763A1 (en) 2007-06-28
EP1966381A2 (de) 2008-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1929001B1 (de) Neue dehydrogenasen, deren derivate und ein verfahren zur herstellung von optisch aktiven alkanolen
EP2334801B1 (de) Verfahren zur herstellung von l-phenylephrin unter verwendung einer alkoholdehydrogenase
WO2001032890A1 (de) L-pantolacton-hydrolase und ein verfahren zur herstellung von d-pantolacton
EP1123386B1 (de) Verfahren zur herstellung chiraler carbonsäuren aus nitrilen mit hilfe einer nitrilase oder mikroorganismen, die ein gen für die nitrilase enthalten
EP3201184B1 (de) Verfahren zur biokatalytischen cyclisierung von geranyllinalool und dabei erhaltene cyclisierungsprodukte
EP2948555B1 (de) Verfahren zur herstellung von alpha, omega-alkandiol
EP1745133A2 (de) Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole aus alkanonen unter verwendung einer dehydrogenase aus azoarcus
EP2171074B1 (de) Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole unter Verwendung einer Dehydrogenase aus Azoarcus sp. EbN1
EP2825661B1 (de) Verfahren zur herstellung von terpen-nitrilen aus terpen-oximen unter verwendung einer aldoxim dehydratase
EP3161144A2 (de) Verfahren zur biokatalytischen ganzzellreduktion von dehydrocholsäureverbindungen, und 7-beta-hydroxysteroid-dehydrogenase-mutanten
EP1863918A2 (de) Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole durch enzymatische reduktion
EP1613745B1 (de) L-carnitin dehydrogenasen, deren derivate und ein verfahren zur herstellung von substituierten (s)-alkanolen
WO2007071578A2 (de) Verfahren zur herstellung von 5 -norbornen-2-carbonsäure aus 5-norbornen-2-carbonitril unter verwendung einer arylacetonitrilase
EP0904348B1 (de) Verfahren zur herstellung von aminoalkoholen und derivaten davon
EP1969132B1 (de) Enzymatische reduktion zur herstellung optisch aktiver alkohole
US20220042051A1 (en) Lipoxygenase-catalyzed production of unsaturated c10-aldehydes from polyunsatrurated fatty acids
EP2038407B1 (de) Proteine mit esterase-aktivität
WO2012069434A1 (de) Verfahren zur herstellung n-heterozyklischer optisch aktiver alkohole
EP0912751B1 (de) Verfahren zur herstellung von d-prolinderivaten mittels mikroorganismen
DE10029194A1 (de) L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton
DE19952501A1 (de) L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton
WO2003093467A1 (de) Proteine mit (r)-hydroxynitril lyase-aktivität aus prunus laurocerasus und sorbus aucuparia

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680048080.1

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2626763

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006841323

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008546361

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12158378

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006841323

Country of ref document: EP