EP1863918A2 - Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole durch enzymatische reduktion - Google Patents

Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole durch enzymatische reduktion

Info

Publication number
EP1863918A2
EP1863918A2 EP06724927A EP06724927A EP1863918A2 EP 1863918 A2 EP1863918 A2 EP 1863918A2 EP 06724927 A EP06724927 A EP 06724927A EP 06724927 A EP06724927 A EP 06724927A EP 1863918 A2 EP1863918 A2 EP 1863918A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
enzyme
azoarcus
formula
nucleic acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06724927A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rainer STÜRMER
Jürgen Däuwel
Maria Kesseler
Brigitte Achatz
Michael Breuer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1863918A2 publication Critical patent/EP1863918A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/14—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen
    • C07D333/16—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of optically active alkanols by enzymatic reduction of the corresponding ketones, in particular the preparation of (1S) -3-methylamino-1- (2-thienyl) -propan-1-oI and (1S) -3 Chloro-1- (2-thienyl) -propan-1-ol.
  • duloxetine alcohol (1S) -3-Methylamino-1- (2-thienyl) -propan-1-ol
  • Duloxetine alcohol is a building block in the duloxetine synthesis.
  • Duloxetine® is an active pharmaceutical ingredient that is currently being approved and is to be used in the indication areas of depression and incontinence.
  • EP-B-0273658 describes a process for the preparation of the corresponding base of duloxetines by reacting 2-acetylthiophene in a Mannich reaction with formaldehyde and dimethylamine, reduction of the keto group of the resulting Mannich base to racemic (S) -3-N, N-dimethylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol, substitution of the alcohol function with naphthyl fluoride and finally conversion of the dimethylamino group into a methylamino function.
  • the desired enantiomer of the naphthyl ether is obtained by using chiral starting materials or by racemate separation at the stage of the end product, for example via the salts with optically active acids or chromatography on a chiral stationary phase.
  • No. 5,362,886 describes an analogous process in which the racemic propanol obtained after reduction of the keto group is admixed with S-mandelic acid. The resulting S-enantiomer of the alcohol is used in the subsequent reaction steps.
  • EP-A-0457559 also describes a method analogous to EP-B-0273658.
  • the keto group of Mannich base with the asymmetric reduction system LAH-Icb lithium aluminum hydride - [(2R, 2S) - (-) - 4-dimethylamino-1, 2-diphenyl-3-methyl-2-butanol]
  • LAH-Icb lithium aluminum hydride - [(2R, 2S) - (-) - 4-dimethylamino-1, 2-diphenyl-3-methyl-2-butanol]
  • the invention therefore an object of the invention to provide a way to stereospecific reduction of substituted alkanones, such as 3-methylamino-1- (2-thienyl) -propanone and 3-chloro-1- (2-thienyl) -propanone, to find , Where the reaction process should cost as quantitatively as possible lead to the product.
  • substituted alkanones such as 3-methylamino-1- (2-thienyl) -propanone and 3-chloro-1- (2-thienyl) -propanone
  • a first subject of the invention relates to a process for the preparation of optically active alkanols of the formula I.
  • n is an integer value of 0 to 5;
  • A is an optionally substituted C1-C6-branched or unbranched alkyl radical or a radical "Cyc",
  • Cyc is an optionally substituted, mono- or polynuclear, saturated or unsaturated, carbocyclic or heterocyclic ring, and R 1 is halogen, SH, OH, NO 2, NR 2 R 3 or NR 2 R 3 R 4+ X ", wherein R 2, R 3 and R 4 independently of one another alkoxy- H or a lower alkyl or Niedrigal- Rest and X "stands for a counterion,
  • n, A and R 1 have the meanings given above,
  • an enzyme (E) selected from the classes of dehydrogenases, aldehyde reductases and carbonyl reductases, incubated in the presence of reducing equivalents, wherein the compound of formula II to the compound of formula I is enzymatically reduced, and consumed in the course of the reaction Reduction equivalents by reacting a sacrificial alcohol to the corresponding sacrificial ketone with the aid of the enzyme (E) are regenerated and the sacrificial ketone is at least partially removed from the reaction medium, and isolated the product (I) formed
  • E enzyme selected from the classes of dehydrogenases, aldehyde reductases and carbonyl reductases
  • Enzymes (E) which are suitable according to the invention are, in particular, the enzymes of the families of aldo-keto-reductases of the aldo-keto-reductase superfamily (KMBohren, B.Bullock, B.Wermuth and KHGabbay J.Biol. Chem. 1989, 264, 9547-9551) and the short-chain alcohol dehydrogenases / reductases (shortchain alcohol dehydrogenases / reductases [SDR]).
  • the latter enzyme group is described in detail in, for example, H.Jomvall, B.Persson, M.Krook, S.Atrian, R.
  • a particularly suitable embodiment of the invention is the use of enzymes (E) in the o.g. Method, wherein E is a polypeptide sequence (i) SEQ ID NO: 2 or
  • R 1 Cl or NHCH 3 , which is in a derivative of 1- (2-thienyl) -propanone of the formula IV
  • this compound is enzymatically reduced to the compound of formula III, and isolated the product formed in substantially enantiomerically pure form.
  • an enzyme with dehydrogenase activity which can be produced from microorganisms of the genera Azoarcus, Azonexus, Azospira, Azovibrio, Dechloromonas, Ferribacterium, Petrobacter, Propionivib ⁇ o, Quadricoccus, Rhodocyclus, Sterolibacterium, Thauera and Zoogloea.
  • Dehydrogenases from species of the genus Azoarcus are particularly preferred.
  • the phenylethanol dehydrogenase from Azoarcus sp EbN 1 can be classified as short-chain alcohol dehydrogenases / reductases (SDRs).
  • SDRs short-chain alcohol dehydrogenases / reductases
  • Azoarcus species are Azoarcus anaerobius, Azoarcus buckelii, Azoarcus communis, Azoarcus evansii, Azoarcus indigens, Azoarcus toluclasticus, Azoarcus tolulyticus, Azoarcus toluvorans, Azoarcus sp., Azoarcus sp. 22Lin, Azoarcus sp. BH72, Azoarcus sp. CC-11, Azoarcus sp. CIB, Azoarcus sp. CR23, Azoarcus sp. EB1, Azoarcus sp. EbN1, Azoarcus sp.
  • the enzyme with dehydrogenase activity is selected from enzymes which comprise an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or a sequence derived therefrom in which up to 25%, preferably up to 20%, particularly preferably up to in particular up to 10,9,8,7,6,5,4,3,2,1% of the amino acid residues have been altered by a deletion, a substitution, an insertion or a combination of deletion, substitution and insertion, wherein the polypeptide sequences which are modified compared to SEQ ID NO: 2 still possess at least 50%, preferably 65%, particularly preferably 80%, in particular more than 90%, of the enzymatic activity of SEQ ID NO: 2.
  • R 1 Cl enantioselectively to the (S) -alcohol having the general formula (III).
  • the exact conditions for determining the enzymatic activity are given in Examples 3 and 4.
  • a sacrificial alcohol preferably iso propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 2-hexanol, 3-hexanol, which is oxidized under the reaction conditions by the enzyme (E) to the corresponding sacrificial ketone.
  • the added sacrificial alcohol is used not only for the regeneration of the spent reduction equivalents, but also as a co-solvent. It is preferred to operate in a liquid 2-phase system, one phase consisting of water or water-miscible solvent, and the other phase consisting of the sacrificial alcohol. Preference is given to using 2-pentanol as the sacrificial alcohol.
  • the reduction equivalents are preferably used in an amount of from 0.001 to 100 mmol, more preferably from 0.01 to 1 mmol of reduction equivalents per mole of alkanone (II) used.
  • the sacrificial ketone formed during the regeneration of the spent reduction equivalents by oxidation of the sacrificial alcohol is at least partially removed from the reaction mixture.
  • the sacrificial ketone formed is completely removed from the reaction medium. This can be done in various ways, for example by selective membranes or by extraction or distillation processes.
  • the distillation is used to remove the ketone.
  • the distillation rates are in the range from 0.02% / min to 2% / min, preferably from 0.05% / min to 1% / min, based on the reaction volume.
  • the jacket temperatures of the reactor are between 5-70 Kelvin, preferably between 10-40 Kelvin above the internal reactor temperature.
  • the distillation is carried out particularly well in a pressure range of 1-500 mbar, preferably 10-200 mbar.
  • a preferred embodiment is the reaction of the compound of the general formula II, such as the formula IV, carried out in the presence of a microorganism which is selected from bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae and Nocardiaceae.
  • the microorganism may be a recombinant microorganism transformed with a nucleic acid construct encoding an enzyme having dehydrogenase activity as defined above.
  • the invention furthermore relates to nucleic acid sequences which encode, comprising the coding sequence for a polypeptide as defined above.
  • the invention relates to expression cassettes comprising, in operative linkage with at least one regulatory nucleic acid sequence, a coding nucleic acid sequence as defined above.
  • Another object of the invention are recombinant vectors, comprising at least one such expression cassette.
  • the invention also relates to prokaryotic or eukaryotic hosts which are transformed with at least one vector according to the invention.
  • a final object of the invention relates to the use of an enzyme having dehydrogenase activity as defined above or a microorganism producing this enzyme for the preparation of compounds of the formulas I or III, and their further processing, for example for the preparation of duloxetines (formula VIII)
  • Halogen is fluorine, chlorine, bromine or iodine, in particular fluorine or chlorine.
  • “Lower alkyl” denotes straight-chain or branched alkyl radicals of 1 to 6 C atoms, such as methyl, ethyl, isopropyl or n-propyl, n-, i-, sec- or tert-butyl, n-pentyl or 2-methyl- Butyl, n-hexyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentane, 2-ethyl-butyl.
  • “Lower alkenyl” represents the mono- or polysubstituted, preferably mono- or diunsaturated, analogs of the abovementioned alkyl radicals having 2 to 6 carbon atoms, it being possible for the double bond to be in any position of the carbon chain.
  • “Lower alkoxy” refers to the oxygen-terminated analogs of the above alkyl groups.
  • Aryl is a mono- or polynuclear, preferably mononuclear or dinuclear, optionally substituted aromatic radical, in particular phenyl or a naphthyl bound via an arbitrary ring position, such as 1- or 2-naphthyl
  • Aryl radicals may optionally have 1 or 2 identical or different substituents selected from halogen, lower alkyl, lower alkoxy as defined above or trifluoromethyl.
  • Alkanols obtainable by enzymatic catalysis according to the invention are those of the above formula (I): in which n is an integer from 0 to 5;
  • A is an optionally substituted C1-C6-branched or unbranched alkyl radical or a radical "Cyc",
  • Cyc is an optionally substituted mono- or polynuclear, saturated or unsaturated, carbocyclic or heterocyclic ring, and R 1 is halogen, SH, OH, NO 2 , NR 2 R 3 or NR 2 R 3 R 4 + X " , wherein R 2 , R 3 and R 4 independently represent H or a lower alkyl or lower alkoxy radical and X "is a counterion.
  • alkanones of the above formula II used for the enzymatic synthesis are compounds which are known per se and are accessible using generally known organic synthesis methods (cf., for example, EP-A-0 273 658).
  • n in the above compounds is 0, 1 or 2, in particular 1.
  • alkyl radicals having one, two, three, and four carbon atoms such as methyl, ethyl, n- and iso-propyl, n-, iso- and tert.
  • the radicals A can furthermore be monosubstituted or polysubstituted, for example monosubstituted or disubstituted.
  • suitable substituents are halogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkoxy, -OH, -SH, -NO 2 or NR 2 R 3 , wherein R 2 and R 3 have the above meanings, preferably halogen or lower alkyl.
  • Cyc are, in particular, mono- or binuclear, preferably mononuclear, groups having up to 4, preferably 1 or 2, identical or different ring heteroatoms selected from among O, N and S: These carbo- or heterocyclic rings comprise in particular 3 to 12, preferably 4, 5 or 6 ring carbon atoms.
  • Examples which may be mentioned are cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyne, cyclohexyl, cycloheptyl, the mono- or polyunsaturated analogs thereof, such as cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl, cyclohexadienyl, cycloheptadienyl; and 5- to 7-membered saturated or mono- or polyunsaturated heterocyclic radicals having 1 to 4 heteroatoms, which are selected from O, N and S, wherein the heterocycle may optionally be condensed with another heterocycle or carbocycle.
  • heterocyclic radicals derived from pyrrolidine, tetrahydrofuran, piperidine, morpholine, pyrrole, furan, thiophene, pyrazole, imidazole, oxazole, thiazole, pyridine, pyran, pyrimidine, pyridazine, pyrazine, cumarone, indole and quinoline.
  • the radicals Cyc can be bonded to the alkanone or the alkanol via an arbitrary ring position, preferably via a ring carbon atom.
  • Suitable cyc radicals are 2-thienyl, 3-thienyl; 2-furanyl, 3-furanyl; 2-pyridyl, 3-pyridyl or 4-pyridyl; 2-thiazolyl, 4-thiazolyl or 5-thiazolyl; 4-methyl-2-thienyl, 3-ethyl-2-thienyl, 2-methyl-3-thienyl, 4-propyl-3-thienyl, 5-n-butyl-2-thienyl, 4-methyl-3-thienyl, 3-methyl-2-thienyl; 3-chloro-2-thienyl, 4-bromo-3-thienyl, 2-iodo-3-thienyl, 5-iodo-3-thienyl, 4-fluoro-2-thienyl, 2-bromo-3-thienyl, and 4 chloro-2-thienyl.
  • the radicals Cyc can furthermore be monosubstituted or polysubstituted, for example monosubstituted or disubstituted.
  • the substituents are on a ring carbon atom.
  • suitable substituents are halogen, lower alkyl, lower alkenyl, lower alkoxy, -OH, -SH, -NO 2 or NR 2 R 3 , wherein R 2 and R 3 have the above meanings, preferably halogen or lower alkyl.
  • R 1 represents in particular halogen, NR 2 R 3 or NR 2 R 3 R 4+ X ", wherein R 2, R 3 or R 2, R 3 and R 4 independently represent H or a lower alkyl or lower alkoxy radical and X 'is a counterion, preferably one of the radicals R 2 , R 3 and R 4 being H.
  • Suitable counterions are, for example, acid anions, as obtained, for example, in the preparation of an acid addition salt, for example in EP-AO 273 658, to which reference is hereby made:
  • Preferred examples of radicals R 1 are in particular fluorine or chlorine, and also NR 2 R 3 in which R 2 and R 3 are the same or different and are H or methyl, ethyl or n-propyl; R 1 particularly preferably represents chlorine or -NHMethyl.
  • Preferred enzymes with dehydrogenase activity comprise an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • “functional equivalents” or analogues of the specifically disclosed enzymes are different polypeptides which furthermore have the desired biological activity, such as substrate specificity. Chloro-1- (thien-2-yl) -propan-1-one reduce to the corresponding S-alcohol and the at least 50%, preferably 60%, more preferably 75%, most preferably 90% of the activity of an enzyme with having the amino acid sequence listed in SEQ ID NO: 2. Functional equivalents are also preferably between pH 4 and 10 stable and advantageously possess a pH optimum between pH 5 and 8 and a temperature optimum in the range of 2O 0 C to 80 0 C.
  • “functional equivalents” are in particular also understood to mean mutants which have a different amino acid than the one specifically mentioned in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences but nevertheless possess one of the abovementioned biological activities.
  • “Functional equivalents” thus include those by one or more Amino acid additions, - substitutions, deletions and / or inversions available mutants, said changes can occur in any sequence position, as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention.
  • Functional equivalence is also given in particular if the patterns of reactivity between the mutant and the unchanged polypeptide match qualitatively, ie For example, the same substrates are implemented at different speeds.
  • “functional equivalents” are in particular also understood as meaning mutants which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned but nevertheless have one of the abovementioned biological activities
  • “Functional equivalents” thus include those represented by a or multiple amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions of available mutants, said changes may occur in any sequence position, as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention.
  • Functional equivalence is especially given when the patterns of reactivity between see mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, ie, for example, the same substrates are reacted at different speeds.
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules of the invention.
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, egg salts and salts with organic bases, such as, for example, amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine, etc.
  • Acid addition salts for example salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and Oxalic acid are also the subject of the invention.
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtained by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reaction with acyl groups.
  • “functional equivalents” also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, it is possible to determine regions of homologous sequence regions by sequence comparison and to determine equivalent enzymes on the basis of the specific requirements of the invention. "Functional equivalents” likewise include fragments, preferably individual domains or sequence motifs, of the polypeptides according to the invention which, for example, have the desired biological function.
  • Fusion equivalents are also fusion proteins having one of the above-mentioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further functionally distinct heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie, without mutual substantial functional impairment of the fusion protein moieties)
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides or enzymes.
  • homologs to the specifically disclosed proteins which have at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed amino acid sequences, comprising "functional equivalents" Calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc Natl Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448
  • a percent homology of a homologous polypeptide of the invention means, in particular, percent identity of the amino acid residues relative to the total length of one of specifically described herein.
  • “functional equivalents” include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form as well as modified forms obtainable by altering the glycosylation pattern.
  • Homologs of the proteins or polypeptides of the invention can be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation or shortening of the protein.
  • Homologs of the proteins of the invention can be identified by screening combinatorial libraries of mutants such as truncation mutants.
  • a variegated library of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to prepare libraries of potential homologs from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be carried out in a DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set allows for the provision of all sequences in a mixture that encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods of synthesizing degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the invention relates in particular to nucleic acid sequences (single- and double-stranded DNA and RNA sequences, such as, for example, cDNA and mRNA) which code for an enzyme having dehydrogenase activity according to the invention.
  • nucleic acid sequences which code, for example, for amino acid sequences according to SEQ ID NO: 2 or characteristic partial sequences thereof, or nucleic acid sequences according to SEQ ID NO: 1 or characteristic partial sequences thereof.
  • All nucleic acid sequences mentioned herein can be prepared in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide units, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid units of the double helix.
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the attachment of synthetic oligonucleotides and filling of gaps with the aid of the Klenow fragment of the DNA polymerase and ligation reactions and general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences (single- and double-stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) coding for one of the above polypeptides and their functional equivalents, which are e.g. accessible by using artificial nucleotide analogs.
  • nucleic acid sequences single- and double-stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides or proteins or biologically active portions thereof according to the invention, as well as nucleic acid fragments which are e.g. for use as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids of the invention.
  • nucleic acid molecules of the invention may also contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a portion thereof.
  • the nucleotide sequences of the invention enable the generation of probes and primers useful for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which, under "stringent” conditions (see below), is at least about 12, preferably at least about 25, such as about 40, 50 or 75 consecutive nucleotides of a sense strand of one of the invention. hybridized to the invention nucleic acid sequence or a corresponding antisense strand.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, may be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated by means of standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences or a portion thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (such as described in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory, Col. Spring Harbor Laboratory Press, Col. Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers prepared on the basis of this sequence.
  • the thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides of the invention may be further purified by standard synthetic methods, e.g. with an automatic DNA synthesizer.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be identified and isolated in principle from all organisms.
  • the nucleic acid sequences according to the invention or the homologues thereof can be isolated from fungi, yeasts, archees or bacteria.
  • bacteria are called gram-negative and gram-positive bacteria.
  • the nucleic acids according to the invention are preferably made of ⁇ -proteobacteria, ⁇ -proteobacteria or ⁇ -proteobacteria, more preferably of bacteria of the orders of the Burkholderiales, Hydrogenophilales, Methylophilales, Neisseriales, Nitrosomonadales, Procabacterial or Rhodocyclales from Gram-negative bacteria.
  • Nucleic acid sequences according to the invention can be isolated from other organisms, for example via genomic or cDNA libraries, by conventional hybridization methods or the PCR technique, for example. These DNA sequences hybridize under standard conditions with the sequences according to the invention. For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides of the conserved regions, for example from the active center, which can be determined by comparisons with a dehydrogenase according to the invention in a manner known to the person skilled in the art. However, it is also possible to use longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences for the hybridization.
  • nucleic acid hybrids are about 10 0 C lower than that of DNA: RNA Hy hybrid of the same length.
  • the hybridization conditions for DNA DNA hybrids at 0.1 x SSC and temperatures between about 20 0 C to 45 0 C, preferably between about 30 0 C to 45 0 C.
  • DNA RNA Hy bride the hybridization conditions are advantageous at 0.1 x SSC and temperatures between about 30 0 C to 55 0 C, preferably between about 45 0 C to 55 0 C.
  • the invention also relates to derivatives of the specifically disclosed or derivable nucleic acid sequences.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be derived from SEQ ID NO: 1 and differ therefrom by addition, substitution, insertion or deletion of individual or several nucleotides, but furthermore can code for polypeptides having the desired property profile.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or are altered according to the codon usage of a specific source or host organism, in comparison with a specifically mentioned sequence, as well as naturally occurring variants, such as e.g. Splice variants or allelic variants, of which
  • Articles are also provided by conservative nucleotide substitutions (i.e., the amino acid in question is replaced by an amino acid of like charge, size, polarity, and / or solubility).
  • the invention also relates to the molecules derived by sequence polymorphisms from the specifically disclosed nucleic acids. These genetic polymorphisms can occur between individuals within a population due to natural variation exist. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene.
  • Derivatives of a nucleic acid sequence according to the invention are, for example, allelic variants which have at least 40% homology at the derived amino acid level, preferably at least 60% homology, very particularly preferably at least 80, 85, 90, 93, 95 or 98% homology over the entire sequence range (for homology at the amino acid level, reference is made to the above comments on the polypeptides). About partial regions of the sequences, the homologies may be advantageous higher.
  • Derivatives also include homologs of the nucleic acid sequences according to the invention, for example fungal or bacterial homologs, truncated sequences, single stranded DNA or RNA of the coding and noncoding DNA sequence.
  • promoters upstream of the indicated nucleotide sequences may be altered by one or more nucleotide exchanges, insertions, inversions and / or deletions without, however, impairing the functionality or efficacy of the promoters.
  • the promoters can be increased in their activity by changing their sequence or can be completely replaced by more effective promoters of alien organisms.
  • Derivatives are also to be understood as variants whose nucleotide sequence has been changed in the range from -1 to -1000 bases upstream of the start codon or 0 to 1000 bases downstream after the stop codon in such a way that gene expression and / or protein expression is changed, preferably increased.
  • the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with the abovementioned coding sequences under "stringent conditions.”
  • These polynucleotides can be used in the screening of genomic or cDNA sequences. Locate banks and, if appropriate, multiply them using suitable primers using PCR and then isolate them with suitable probes, for example.
  • polynucleotides of the invention can also be chemically synthesized. This property refers to the ability of a poly- or oligonucleotide to bind under stringent conditions to a nearly complementary sequence, while under these conditions nonspecific binding between non-complementary partners is avoided.
  • the sequences should be 70-100%, preferably 90-100%, complementary.
  • oligonucleotides are used from a length of 30 base pairs.
  • stringent conditions is meant, for example, in the Northern Blot technique, the use of a 50 - 70 0 C, preferably 60 - 65 0 C warm wash solution, for example 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (2Ox SSC: 3M NaCl , 0.3 M Na citrate, pH 7.0) for the elution of nonspecifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides.
  • stringent conditions is known to the person skilled in the art and is for example: in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
  • the invention also relates to expression constructs comprising, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream, as well as optionally further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • Promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements such that each of the regulatory elements has its function in expressing can fulfill the intended purpose on the coding sequence.
  • operably linked sequences are targeting sequences as well as enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • a nucleic acid construct according to the invention is in particular to be understood as meaning those in which the gene for a dehydrogenase according to the invention differs with one or more regulatory signals for the control, e.g. Increased, the gene expression was operatively or functionally linked.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically altered so that natural regulation is eliminated and expression of genes increased.
  • the nucleic acid construct can also be simpler, ie no additional regulatory signals have been inserted before the coding sequence and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation stops and gene expression is increased.
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the already mentioned “enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids of the invention may be contained in one or more copies in the construct.
  • the construct may also contain further markers, such as antibiotic resistance or auxotrophic complementing genes, optionally for selection on the construct.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl " " 17-, T5-, T3 , gal, trc, ara, rhaP (rhaP BAD ) SP6, Iambda-P R - or contained in the Iambda-P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria application.
  • promoters such as cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl " " 17-, T5-, T3 , gal, trc, ara, rhaP (rhaP BAD ) SP6, Iambda-P R - or contained in the Iambda-P L promoter
  • promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxidase are also advantageous. It is also possible to use artificial promoters for regulation.
  • the nucleic acid construct, for expression in a host organism is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • Vectors other than plasmids and phages are also all other vectors known to those skilled in the art, ie viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention. Suitable plasmids are described, for example, in E.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
  • nucleic acid construct for expression of the further genes contained additionally 3'- and / or 5'-terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • regulatory sequences are intended to allow the targeted expression of genes and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can thereby preferably influence the gene expression of the introduced genes positively and thereby increase.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced in the form of a linear DNA into the microorganisms and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or of the nucleic acid according to the invention.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • common recombination and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and TJ. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector for expression in a suitable host organism, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to the person skilled in the art and can be obtained, for example, from "cloning vectors" (Pou- PH et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the above-described recombinant constructs according to the invention are introduced into a suitable host system and expressed.
  • familiar cloning and transfection methods known to the person skilled in the art, such as, for example, co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, are used in order to express said nucleic acids in the respective expression system. Suitable systems are For example, in Current Protocols in Molecular Biology, F.
  • Homologously recombined microorganisms can also be produced according to the invention.
  • a vector is prepared which contains at least a portion of a gene or a coding sequence according to the invention, in which optionally at least one amino acid deletion, addition or substitution has been introduced in order to modify the sequence according to the invention, eg to functionally to disrupt it ("Knockout "- vector).
  • the introduced sequence may also be a homologue from a related microorganism or derived from a mammalian, yeast or insect source.
  • the vector used for homologous recombination may be such that the endogenous gene is mutated or otherwise altered upon homologous recombination, but still encodes the functional protein (eg, the upstream regulatory region may be altered such that expression of the endogenous protein is changed).
  • the altered portion of the gene of the invention is in the homologous recombination vector.
  • suitable vectors for homologous recombination is described, for example, in Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503.
  • all prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct according to the invention.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • gram-positive or gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, more preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium or Rhodococcus used.
  • genus and species Escherichia coli are also found in the group of alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria or gamma-proteobacteria.
  • the host organism or the host organisms according to the invention preferably contain at least one of the nucleic acid sequences described in this invention, nucleic acid constructs or vectors which code for an enzyme with dehydrogenase activity according to the invention.
  • microorganisms are usually contained in a liquid medium containing a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins, at temperatures between 0 0 C and 100 0 C, preferably between 10 0 C to 60 0 C attracted under oxygen fumigation.
  • a carbon source mostly in the form of sugars
  • a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate
  • trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins
  • the cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously. Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed semi-continuously or continuously.
  • the ketone can be given directly for cultivation or advantageously after cultivation.
  • the enzymes may be isolated from the organisms by the method described in the Examples or used as crude extract for the reaction.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of polypeptides according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, in which a polypeptide-producing microorganism is cultivated, if appropriate, the expression of the polypeptides is induced and these are isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant microorganism can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 0 C and a pH of 6 to 9. Specifically, suitable culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted if the polypeptides are not secreted into the culture medium and the product recovered from the lysate by known protein isolation techniques.
  • the cells may optionally be treated by high frequency ultrasound, high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods.
  • polypeptides can be achieved by known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as
  • Sepharose chromatography Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as other conventional methods such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • vector systems or oligonucleotides for the isolation of the recombinant protein, which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus encode altered polypeptides or fusion proteins eg serve a simpler cleaning.
  • suitable modifications include, for example, so-called “tags” as anchors, such as the modification known as hexa-histidine anchor, or epitopes which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibody: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor (NY) Press).
  • These anchors may serve to attach the proteins to a solid support, such as a polymer matrix, which may be filled, for example, in a chromatography column, or used on a microtiter plate or other support.
  • these anchors can also be used to detect the proteins.
  • conventional markers such as fluorescent dyes, enzyme labels which form a detectable reaction product upon reaction with a substrate, or radioactive labels alone or in combination with the anchors may be used to derivatize the proteins to recognize the proteins.
  • the enzymes with dehydrogenase activity used according to the invention can be used as free or immobilized enzyme in the process according to the invention.
  • the inventive method is advantageously carried out at a temperature between 0 0 C to 95 ° C, preferably between 10 0 C to 85 0 C, more preferably carried out between 15 0 C to 75 0 C.
  • the pH in the process according to the invention is advantageously maintained between pH 4 and 12, preferably between pH 4.5 and 9, particularly preferably between pH 5 and 8.
  • Enantiomerically pure or chiral products or optically active alcohols are to be understood in the process according to the invention as enantiomers which show enantiomeric nanification.
  • Enantiomeric purities of. are preferred in the process at least 70% ee, preferably from min. 80% ee, more preferably from min. 90% ee, most preferably min. 98% ee achieved.
  • Growing cells containing the nucleic acids, nucleic acid constructs or vectors according to the invention can be used for the method according to the invention.
  • dormant or open cells can be used.
  • open cells is meant, for example, cells that have been rendered permeable through treatment with, for example, solvents, or cells that have been disrupted by enzyme treatment, mechanical treatment (e.g., French Press or ultrasound) or otherwise.
  • the crude extracts thus obtained are advantageously suitable for the process according to the invention.
  • purified or purified enzymes can be used for the process.
  • immobilized microorganisms or enzymes that can be used advantageously in the reaction.
  • free organisms or enzymes are used for the process according to the invention, they are expediently removed before extraction, for example by filtration or centrifugation.
  • the product prepared in the process according to the invention for example (1S) -3-methylamino-1- (2-thienyl) -propan-1-ol, can advantageously be obtained from the aqueous reaction solution by extraction or distillation. The extraction can be repeated several times to increase the yield.
  • suitable extractants are solvents such as, but not limited to, toluene, methylene chloride, butyl acetate, diisopropyl ether, benzene, MTBE or ethyl acetate.
  • the product prepared in the process according to the invention for example (1S) -3-methylamino-1- (2-thienyl) -propan-1-ol, advantageously from the organic see phase of the reaction solution via extraction or distillation and / or crystallization win.
  • the extraction can be repeated several times to increase the yield.
  • suitable extractants are solvents such as, but not limited to, toluene, methylene chloride, butyl acetate, diisopropyl ether, benzene, MTBE or ethyl acetate.
  • the organic phase can also be partially concentrated with the product and the product crystallized out.
  • the solution is advantageously cooled to a temperature of 0 0 C to 10 0 C.
  • the crystallization can also be carried out directly from the organic solution or from an aqueous solution.
  • the crystallized product can be taken up again in the same or in another solvent for recrystallization and recrystallized again.
  • the product of the process according to the invention can be obtained in yields of from 60 to 100%, preferably from 80 to 100%, particularly preferably from 90 to 100%, based on the substrate used for the reaction, e.g. of 3-methylamino-1- (2-thienyl) -propan-1-one.
  • the isolated product is characterized by a high chemical purity of> 90%, preferably> 95%, particularly preferably> 98%.
  • the products have a high enantiomeric purity which, if necessary, can be further increased by crystallization.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • the operation of the process may advantageously be carried out in bioreactors, e.g. in Biotechnology, Volume 3, 2nd Edition, Rehm et al. Ed., (1993), especially Chapter II.
  • Example 1 Cloning of phenylethanol dehydrogenase from Azoarcus sp EbN1 by means of synthetic oligonucleotides.
  • the sequence of the phenylethanol dehydrogenase gene from Azoarcus sp EbN 1 is stored in databases (Genbank ID 25956124, region: 25073 to 25822). From the nucleic acid sequence of the phenylethanol dehydrogenase gene oligonucleotides were derived from which the gene was synthesized by known methods. The DNA sequence of the oligonucleotides is summarized in Table 1. Figure 3 shows the position of the individual oligonucleotides to the entire phenylethanol dehydrogenase gene from Azoarcus sp EbNL Process for the preparation of synthetic genes are described, for example, in Y.P. Shi, P. Das, B. Holloway, V.
  • the PCR product was digested with the restriction endonucleases Ndel and BamHI and cloned into appropriately digested pDHE19.2 vector (DE19848129).
  • the ligation mixtures were transformed into E. coli XL1 Blue (Stratagene).
  • the plasmid pDHEEbNI was transformed into strain E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: a RhaA derivative of E. coli TG1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S., Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto -Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40 (2), 397-413).
  • the recombined E. coli are designated E. coli LU 11558.
  • Example 2 Cloning of phenylethanol dehydrogenase from Azoarcus sp EbN1 by means of PCR
  • the sequence of the phenylethanol dehydrogenase gene from Azoarcus sp EbN 1 is stored in databases (Genbank ID 25956124, region 25073 to 25822). Oligonucleotides were derived from the nucleic acid sequence of the phenylethanol dehydrogenase gene (primers MKeO387 and MKeO388), which cloned the 0 dehydrogenase gene by PCR amplification as follows.
  • the PCR product ( ⁇ 0.75 kB) was isolated by agarose gel electrophoresis (1.2% E-gel, Invitrogen) and column chromatography (GFX kit, Amersham Pharmacia) and then sequenced (sequencing primer: MKeO387 and MKeO388). The sequence obtained is identical to the published sequence.
  • the PCR product was digested with the restriction endonucleases Ndel and BamHI and cloned into appropriately digested pDHE19.2 vector (DE19848129).
  • the ligation mixtures were transformed into E. coli XL1 Blue (Stratagene).
  • the sequencing of corresponding clones gave as an insert in the plasmid pDHEEbNI thus obtained the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
  • the plasmid pDHEEbNI was transformed into strain E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: a RhaA " derivative of E. coli TG1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S.; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001) Mol. Microbiol. 40 (2), 397-413) .
  • the recombi- nant E. coli are transfected with E. coli Designated LU 11558.
  • E. coli LU 11558 were dissolved in 20 ⁇ l LB-Amp / Spec / Cm (100 ⁇ g / l ampicillin, 10 ⁇ g / l spectinomycin, 20 ⁇ g / l chloramphenicol), 0.1 ml IPTG, 0.5 g / l rhamnose in 10 ⁇ l aller flask (Harassment). Taken for 18 h at 37 ° C, centrifuged at 5000 * g / 10min, washed once with 1OmM TRIS * HCl, pH 7.0 and resuspended in 2 mL of the same buffer.
  • Each 6 transformants were grown in 10 ⁇ M LBAmp / Spec / Cm (100 ⁇ g / L amp; 100 mg / ISpec; 20 ⁇ g / ICm) 0.1 mM IPTG 0.5 g / L rhamnose in 10 ⁇ L Erlenmeyer flasks (baffles) for 18 h at 37 ° C Centrifuged at 5000 * g / 10 min, washed once with 10 mM Tris / HCl pH 7.0 and resuspended in 2 ml of the same buffer.
  • the concentration of 3-chloro-1- (thien-2-yl) -propan-1-one and 3-chloro-1- (thien-2-yl) -propan-1-ol can be determined by HPLC. Depending on the choice of stationary and mobile phase, ee value can be determined in addition to the concentration. a) achiral analytics
  • Authentic material is used to create a calibration series that can be used to determine the concentration of unknown samples.
  • Authentic material is used to create a calibration series that can be used to determine the concentration of unknown samples.
  • Example 7 Preparation of (S) -3-chloro-1- (thien-2-yl) -propan-1-ol) with the recombinant dehydrogenase from Azoarcus sp EbN1 with 2-pentanol

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven-Alkanolen der Formel (I), durch enzymatische Reduktion der entsprechenden Ketone, insbesondere die Herstellung von (1S)-3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-ol und (1S)-3-Chlor-1-(2-thienyl)-propan-1-ol.

Description

Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkanolen durch enzymatische Reduktion der entsprechenden Ketone, insbesondere die Herstellung von (1S)-3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-oI und (1S)-3-Chlor-1- (2-thienyl)-propan-1 -ol.
Stand der Technik:
(1S)-3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-ol ("Duloxetinealkohol") ist Baustein in der Duloxetine-Synthese. Duloxetine® ist ein Pharmawirkstoff, der sich momentan in der Zulassung befindet und im Indikationsgebiet Depression und Inkontinenz eingesetzt werden soll.
EP-B-0273658 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung der korrespondierenden Base von Duloxetine durch Umsetzung von 2-Acetylthiophen in einer Mannich-Reaktion mit Formaldehyd und Dimethylamin, Reduktion der Ketogruppe der dabei erhaltenen Mannich-Base zum racemischen (S)-3-N,N-Dimethylamino-1-(thien-2-yl)propan-1-ol, Ve- retherung der Alkoholfunktion mit Naphthylfluorid und schließlich Umwandlung der Di- methylamino-Gruppe in eine Methylamino-Funktion. Das gewünschte Enantiomer des Naphtylethers erhält man durch Einsatz chiraler Ausgangsmaterialien oder durch Ra- cemattrennung auf der Stufe des Endprodukts, beispielsweise über die Salze mit optisch aktiven Säuren oder Chromatographie an einer chiralen stationären Phase.
US-5,362,886 beschreibt ein analoges Verfahren, bei dem das nach Reduktion der Ketogruppe erhaltene racemische Propanol mit S-Mandelsäure versetzt wird. Das hierbei erhaltene S-Enantiomer des Alkohols wird in die nachfolgenden Reaktionsstufen eingesetzt.
EP-A-0457559 beschreibt ebenfalls ein der EP-B-0273658 analoges Verfahren. Hierbei wird die Ketogruppe der Mannich-Base mit dem asymmetrischen Reduktionssystem LAH-Icb (Lithiumaluminiumhydrid-[(2R,2S)-(-)-4-Dimethylamino-1 ,2-diphenyl-3-methyl- 2-butanol]) zum Alkohol in Form des S-Enantiomers reduziert. Nachteilig hierbei ist neben den Kosten die Empfindlichkeit des Reduktionssystems LAH-Icb, das nur wenige Minuten stabil ist. W. J. Wheeler und F. Kuo beschreiben in Journal of Labelled Compounds and Radi- opharmaceuticals, Band XXXVI, Nr. 3, Seite 213 bis 223 ein Verfahren zur Herstellung von Duloxetine. Hierzu wird Thiophen-2-carbonsäurechlorid in einer Stille-Kopplung mit Vinyl-tri-n-butylstannan in Gegenwart katalytischer Mengen Benzylchlor- bis(triphenylphosphin)palladium(ll) in DMPU (Dimethylpropylenharnstoff) zu 1-(Thien- 2-yl)-propenon der Formel (V)
umgesetzt, welches anschließend durch Behandlung mit Chlorwasserstoff in 3-ChIoM- (thien-2-yl)-propan-1-on der Formel (VI)
überführt wird. Das so erhaltene Chlorpropanon wird anschließend unter Verwendung eines chiralen Oxazaborylidins und BH3 zu (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol der Formel (VII)
(VII) ()
reduziert. Der so erhaltene Alkohol wird durch sukzessive Umsetzung mit Natriumiodid und anschließend mit Methylamin in (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol überführt. Durch nachfolgende sukzessive Umsetzung mit Natriumhydrid, 1 -Fluornaphthalin und Chlorwasserstoff erhält man Duloxetine in Form des Hydrochlorids.
HaI = Halogen
T. Stillger et al. beschreiben in Chemie Ingenieur Technik (74) Seiten 1035-1039, 2002 substratgekoppelte Cofaktorregenerierungsverfahren zur enzymatischen enantioselek- tiven Reduktion von 5-Oxohexansäureethylester zu (S)-5-Hydroxy- hexansäureethylester.
Kurze Beschreibung der Erfindung:
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, einen Weg zur stereospezifischen Reduktion von substituierten Alkanonen, wie dem 3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propanon und dem 3-Chlor-1-(2-thienyl)-propanon, zu finden, wobei das Reaktionsverfahren auf kostengünstigem Weg möglichst quantitativ zum Produkt führen sollte.
Diese Aufgabe wurde durch den überraschenden Befund gelöst, dass Enzyme mit De- hydrogenase-Aktivität, insbesondere solche, die aus Mikroorganismen der Gattung Azoarcus herstellbar sind, zur stereospezifischen Katalyse der obigen Reaktion unter gleichzeitiger Cofaktorregenerierung befähigt sind.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven-Alkanolen der Formel I
worin n für einen ganzzahligen Wert von 0 bis 5 steht;
A für einen gegebenenfalls substituierten C1-C6- verzweigten oder unverzweigten Alkylrest oder einen Rest "Cyc" steht,
Cyc für einen gegebenenfalls substituierten, ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyclischen oder heterocyclischen Ring steht, und R1 für Halogen, SH, OH, NO2, NR2R3 oder NR2R3R4+X" steht, wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder einen Niedrigalkyl- oder Niedrigal- koxy-Rest stehen und X" für ein Gegenion steht,
wobei man in einem Alkanon der Formel Il
worin n, A und R1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
enthaltenden Medium, ein Enzym (E), ausgewählt aus den Klassen der Dehydrogenasen, Aldehydreduktasen und Carbonylreduktasen, inkubiert in Gegenwart von Reduktionsäquivalenten, wobei die Verbindung der Formel Il zur Verbindung der Formel I en- zymatisch reduziert wird, und die im Laufe der Reaktion verbrauchten Reduktionsäquivalente durch Umsetzen eines Opfer-Alkohols zum entsprechenden Opfer-Keton mit Hilfe des Enzyms (E) wieder regeneriert werden und das Opfer-Keton zumindest partiell aus dem Reaktionsmedium entfernt wird, und man das gebildete Produkt (I) isoliert
Erfindungsgemäß geeignete Enzyme (E) sind insbesondere die Enzyme der Familien der Aldo-Keto-Reduktasen der Aldo-Keto-Reduktase-Superfamily (K.M.Bohren, B.Bullock, B.Wermuth und K.H.Gabbay J.Biol. Chem. 1989, 264, 9547-9551) und der kurzkettigen Alkoholdehydrogenasen / Reduktasen (shortchain alcohol dehydrogena- ses / reductases [SDR]) zählen. Die letztere Enzymgruppe ist ausführlich beschrieben zum Beispiel bei H.Jomvall, B.Persson, M.Krook, S.Atrian, R.Gonzalez-Duarte, J.Jeffery und D.Gosh, Biochemistry, 1995, 34, S. 6003-6013 oder U. Oppermann, C.Filling, M.Hult, N.Shafquat, X.Q.Wu, M.Lindh, J.Shafquat, E.Nordling, Y.Kallberg, B.Persson und H.Jomvall, Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, S.247-253. Innerhalb dieser genannten Enzymklassen sind die kurzkettigen Alkoholdehydrogenasen besonders gut geeignet.
Eine besonders geeignete Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Enzymen (E) im o.g. Verfahren, wobei E eine Polypeptidsequenz (i) SEQ ID NO: 2 oder
(ii) bei der bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50% der enzymati- sehen Aktivität von SEQ ID NO:2 besitzt, besitzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dient das Verfahren zur Herstellung von Derivaten des 1-(2-thienyl)-(S)-propanol der Formel III
wobei R1 = Cl oder NHCH3 bedeuten, wobei man in einem ein Derivat des 1-(2-thienyl)-propanons der Formel IV
enthaltenden Medium diese Verbindung zur Verbindung der Formel III enzymatisch reduziert wird, und man das in im Wesentlichen enantiomerenreiner Form gebildete Produkt isoliert.
Vorzugsweise verwendet man bei diesen Verfahren ein Enzym mit Dehydrogenase- Aktivität, das aus Mikroorganismen der Gattungen Azoarcus, Azonexus, Azospira, A- zovibrio, Dechloromonas, Ferribacterium, Petrobacter, Propionivibήo, Quadricoccus, Rhodocyclus, Sterolibacterium, Thauera und Zoogloea herstellbar ist.
Besonders bevorzugt werden Dehydrogenasen aus Arten der Gattung Azoarcus.
Aufgrund ihrer Aminosäuresequenz kann man die Phenylethanol-Dehydrogenase aus Azoarcus sp EbN 1 zu den kurzkettigen Alkoholdehydrogenasen / Reduktasen (short- chain alcohol dehydrogenases / reductases [SDR]) zählen. Die Enzymgruppe ist aus- führlich beschrieben zum Besipiel bei H.Jornvall, B.Persson, M.Krook, S.Atrian,
R.Gonzalez-Duarte, J.Jeffery und D.Gosh, Biochemistry, 1995, 34, S. 6003-6013 oder U. Oppermann, C.Filling, M. HuIt, N.Shafquat, X.Q.Wu, M.Lindh, J.Shafquat, E.Nordling, Y.Kallberg, B.Persson und H.Jornvall, Chemico-Biological Interactions, 2003, 143, S.247-253. Innerhalb der Gruppe der SDR können sich die Aminosäurese- quenzen der einzelnen Vertreter stark voneinander unterscheiden. Dennoch ist be- kannt, dass bestimmte Aminosäuren oder Aminosäurenbereiche innerhalb der Gruppe der SDR stark konserviert sind. In C. Filling, K.D.Berndt, J. Benach, S. Knapp, T.Prozorovski, E.Nordling, R. Ladenstein, H.Jornvall und U.Oppermann, Journal of Bio- chemical Chemistry, 2002, 277, S.25677-25684 sind wichtige konservierte Bereiche der SDR beschrieben.
Beispiele für Azoarcus-Arten sind Azoarcus anaerobius, Azoarcus buckelii, Azoarcus communis, Azoarcus evansii, Azoarcus indigens, Azoarcus toluclasticus, Azoarcus tolulyticus, Azoarcus toluvorans, Azoarcus sp., Azoarcus sp. 22Lin, Azoarcus sp. BH72, Azoarcus sp. CC-11 , Azoarcus sp. CIB, Azoarcus sp. CR23, Azoarcus sp. EB1 , Azoarcus sp. EbN1, Azoarcus sp. FL05, Azoarcus sp. HA, Azoarcus sp. HxN1, Azoarcus sp. mXyN1 , Azoarcus sp. PbN1 , Azoarcus sp. PH002, Azoarcus sp. T und Azoar- cus sp. ToN 1.
Besonders bevorzugt verwendet man Dehydrogenasen aus Azoarcus sp EbN 1.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Enzym mit Dehydrogenase-Aktivität ausgewählt unter Enzymen, welche eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen oder eine davon abgeleitete Sequenz, bei der bis zu 25%, bevorzugt bis zu 20%, besonders bevorzugt bis zu 15% insbesondere bis zu 10,9,8,7,6,5,4,3,2,1 % der Aminosäurereste durch eine Deletion, eine Substitution eine Insertion oder eine Kombination aus Deletion, Substitution und Insertion verändert worden sind, wobei die gegenüber SEQ ID NO: 2 veränderten Polypeptidsequenzen noch mindestens 50%, bevorzugt 65%, besonders bevorzugt 80% , insbesondere mehr als 90 % der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO:2 besitzten. In diesem Zusammenhang soll unter enzymatische Aktivität von SEQ ID NO:2 die Fähigkeit verstanden werden, die Ketone der Formel (IV) mit R1 = Cl enantioselektiv zu dem (S)-Alkohol mit der allgemeinen Formel (III) zu reduzieren. Die genauen Bedingungen zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität sind in Beispiel 3 und 4 wiedergegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Zugabe von Reduktionsäquivalenten, insbesondere von NADH oder NADPH, durchgeführt. Zur Regenerierung der bei der Reaktion verbrauchten Reduktionsäquivalente wird ein Opfer-Alkohol, bevorzugt Iso- propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol eingesetzt, der unter den Reaktionsbedingungen durch das Enzym (E) zu dem entsprechenden Opfer-Keton oxi- diert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der zugesetzte Opfer-Alkohol nicht nur zur Regenerierung der verbrauchten Reduktionsäquivalente eingesetzt, sondern auch als Co-Lösungsmittel. Man arbeitet bevorzugt in einem flüssigen 2- Phasensystem, wobei die eine Phase aus Wasser oder mit Wasser mischbarem Lösungsmittel besteht, und die andere Phase aus dem Opfer-Alkohol besteht. Bevorzugt wird als Opfer-Alkohol 2-Pentanol eingesetzt.
Die Reduktionsäquivalente werden bevorzugt in einer Menge von 0,001 bis 100 mmol , besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 mmol Reduktionsäquivalente pro Mol eingesetztem Alkanon (II) eingesetzt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das bei der Regenerierung der verbrauchten Reduktionsäquivalente durch Oxidation des Opfer-Alkohols entstandene Opfer-Keton aus dem Reaktionsgemisch zumindest partiell entfernt . Bevorzugt entfernt man das gebildete Opfer-Keton vollständig aus dem Reaktionsmedium. Dies kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden, beispielsweise durch selektive Membranen oder durch Extraktions- oder Destillationsverfahren. Bevorzugt wird die Destillation zur Entfernung des Ketons eingesetzt. Üblicherweise wird bei der destillativen Abtrennung des Ketons auch ein Teil des Opfer-Alkohols und zum Teil auch noch Teile der wässrigen Phase mit entfernt. Diese Destillationsverluste werden in der Regel durch Nachdosieren des Opfer-Alkohols und ggf. des Wassers ausgeglichen. Die Destillationsraten liegen in einem Bereich von 0,02%/min bis 2%/min, bevorzugt von 0,05%/min bis 1%/min bezogen auf das Reaktionsvolumen. Die Manteltemperaturen des Reaktors liegen zwischen 5-70 Kelvin, bevorzugt zwischen 10-40 Kelvin über der Reaktorinnentemperatur.
Die Destillation wird besonders gut in einem Druckbereich von 1-500 mbar, bevorzugt 10-200 mbar durchgeführt.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist es, die Umsetzung der Verbindung der allgemei- nen Formel II, wie z.B. der Formel IV, in Gegenwart eines Mikroorganismus erfolgen zu lassen, der ausgewählt ist unter Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudo- monadaceae, Rhizobiaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae und Nocardiaceae. . Der Mikroorganismus kann insbesondere ein rekombinanter Mikroorganismus sein, der mit einem Nukleinsäurekonstrukt transformiert ist, welches für ein Enzym mit Dehydrogenase-Aktivität gemäß obiger Definition kodiert.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere einen ein Enzym mit Dehydrogenase-Aktivität produzierenden Mikroorganismus aus einer natürlichen Quelle zu isolieren oder rekombinant herzustellen, - diesen Mikroorganismus zu vermehren, aus dem Mikroorganismus das Enzym mit Dehydrogenase-Aktivität gegebenenfalls zu isolieren oder eine dieses Enzym enthaltende Proteinfraktion herzustellen, und den Mikroorganismus gemäß Stufe b) oder das Enzym gemäß Stufe c) in ein Medium zu überführen, das eine Verbindung der Formel I enthält.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem kodierende Nukleinsäuresequenzen, umfassend die kodierende Sequenz für ein Polypeptid gemäß obiger Definition.
Weiterhin betrifft die Erfindung Expressionskassetten, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine kodierende Nu- kleinsäuresequenz gemäß obiger Definition.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind rekombinante Vektoren, umfassend we- nigstens eine solche Expressionskassette.
Die Erfindung betrifft auch prokaryotische oder eukaryotische Wirte, welche mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind.
Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Enzyms mit Dehydrogenase-Aktivität gemäß obiger Definition oder eines dieses Enzym produzierenden Mikroorganismus zur Herstellung von Verbindungen der Formeln I oder III, und deren Weiterverarbeitung beispielsweise zur Herstellung von Duloxetine (Formel VIII)
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
A. Allgemeine Begriffe und Definitionen
Werden keine andere Angaben gemacht, so gelten folgende allgemeine Bedeutungen:
„Halogen" steht für Fluor, Chlor, Brom oder Jod , insbesondere Fluor oder Chlor.
„Niedrigalkyl" steht für geradkettige oder verzweigte Alkylreste 1 bis 6 C-Atomen, wie Methyl, Ethyl, i- oder n-Propyl, n-, i-, sec- oder tert.-Butyl, n-Pentyl oder 2-Methyl- Butyl, n-Hexyl, 2-Methyl-pentyl, 3-Methyl-pently, 2-Ethyl-butyl.
„Niedrigalkenyl" steht für die ein- oder mehrfach, vorzugsweise einfach oder zweifach ungesättigten Analoga oben genannter Alkylreste mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei die Doppelbindung in beliebiger Position der Kohlenstoffkette liegen kann.
„Niedrigalkoxy" steht für die Sauerstoff-terminierten Analoga obiger Alkylreste.
„Aryl" steht für einen ein- oder mehrkernigen, vorzugsweise ein- oder zweikernigen, gegebenenfalls substituierten aromatischen Rest, insbesondere für Phenyl oder für ein über eine beliebige Ringposition gebundenes Naphthyl, wie 1- oder 2-Naphthyl. Diese
Arylreste können gegebenenfalls 1 oder 2 gleiche oder verschiedene Substituenten tragen, ausgewählt unter Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkoxy gemäß obiger Definition oder Trifluormethyl.
Substituierte Alkanone, (S)-Alkanole und Derivate davon
Erfindungsgemäß durch enzymatische Katalyse zugängliche Alkanole sind solche obiger Formel (I) worin n für einen ganzzahligen Wert von 0 bis 5 steht;
A für einen gegebenenfalls substituierten C1-C6- verzweigten oder unverzweigten Alkylrest oder einen Rest "Cyc" steht,
Cyc für einen gegebenenfalls substituierten, ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyclischen oder heterocyclischen Ring steht, und R1 für Halogen, SH, OH, NO2, NR2R3 oder NR2R3R4+X" steht, wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder einen Niedrigalkyl- oder Niedrigalkoxy-Rest stehen und X" für ein Gegenion steht.
Die zur enzymatischen Synthese verwendeten Alkanone obiger Formel Il sind an sich bekannte Verbindungen und unter Anwendung allgemein bekannter organischer Syntheseverfahren zugänglich (vgl. z.B. EP-A- 0 273 658).
Vorzugsweise steht n in obigen Verbindungen für 0, 1 oder 2, insbesondere für 1.
Als Beispiele für A sind insbesondere Alkylreste mit ein, zwei, drei, und vier Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl , n- und iso-Propyl, n-, iso- und tert. Butyl zu nennen. Die Reste A können weiterhin ein- oder mehrfach, wie z.B. ein- oder zweifach, substituiert sein. Beispiele für geeignete Substituenten sind Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalke- nyl, Niedrigalkoxy, -OH, -SH, -NO2 oder NR2R3, wobei R2 und R3 obige Bedeutungen besitzen, bevorzugt Halogen oder Niedrigalkyl.
Als Beispiele für carbo- und heterocyclische Gruppen Cyc sind insbesondere ein- oder zweikernigen, vorzugsweise einkernige, Gruppen mit bis zu 4, vorzugsweise 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Ring-Heteroatomen, ausgewählt unter O, N und S sind zu nennen: Diese carbo- oder heterocyclischen Ringe umfassen insbesondere 3 bis 12, vorzugsweise 4, 5 oder 6 Ring-Kohlenstoffatomen. Als Beispiele können genannt werden Cy- clopropyl, Cyclobutyl, Cyclopenty, Cyclohexyl, Cycloheptyl, die ein- oder mehrfach ungesättigten Analoga davon, wie Cyclobutenyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Cyclohep- tenyl, Cyclohexadienyl, Cycloheptadienyl; sowie 5- bis 7-gliedrige gesättigte oder ein oder mehrfach ungesättigte heterocyclische Reste mit 1 bis 4 Heteroatomen, die ausgewählt sind unter O, N und S, wobei der Heterocyclus gegebenenfalls mit einem weiteren Heterocyclus oder Carbocyclus kondensiert sein kann. Insbesondere sind zu nennen heterocyclische Reste, abgeleitet von Pyrrolidin, Tetrahydrofuran, Piperidin, Morpholin, Pyrrol, Furan, Thiophen, Pyrazol, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyridin, Pyran, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Cumaron, Indol und Chinolin.
Die Reste Cyc können dabei über eine beliebige Ringposition, vorzugsweise über ein Ring-Kohlenstoffatom, an das Alkanon bzw. das Alkanol gebunden sein.
Beispiele für geeignet Cyc-Reste sind 2-Thienyl, 3-Thienyl; 2-Furanyl, 3-Furanyl; 2- Pyridyl, 3-Pyridyl oder 4-Pyridyl; 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl oder 5-Thiazolyl; 4-Methyl-2- thienyl, 3-Ethyl-2-thienyl, 2-Methyl-3-thienyl, 4-Propyl-3-thienyl, 5-n-Butyl-2-thienyl, 4- Methyl-3-thienyl, 3-Methyl-2-thienyl; 3-Chlor-2-thienyl, 4-Brom-3-thienyl, 2~lod-3- thienyl, 5-lod-3-thienyl, 4-Fluor-2-thienyl, 2-Brom-3-thienyl, und 4-Chlor-2-thienyl.
Die Reste Cyc können weiterhin ein- oder mehrfach, wie z.B. ein- oder zweifach, substituiert sein. Vorzugsweise sitzen die Substituenten an einem Ring-Kohlenstoffatom. Beispiele für geeignete Substituenten sind Halogen, Niedrigalkyl, Niedrigalkenyl, Nied- rigalkoxy, -OH, -SH, -NO2 oder NR2R3, wobei R2 und R3 obige Bedeutungen besitzen, bevorzugt Halogen oder Niedrigalkyl.
R1 steht insbesondere für Halogen, NR2R3 oder NR2R3R4+X", wobei R2, R3 bzw. R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder einen Niedrigalkyl- oder Niedrigalkoxy-Rest stehen und X' für ein Gegenion steht, wobei vorzugsweise einer der Reste R2, R3 und R4 für H steht. Geeignete Gegenionen sind beispielsweise Säureanionen, wie sie beispielsweise bei Herstellung eines Säureadditionssalzes anfallen. Beispiel hierzu sind z.B. in der EP-A-O 273 658 genannt, worauf hiermit Bezug genommen wird. Bevorzugte Beispiele für Reste R1 sind insbesondere Fluor oder Chlor, sowie NR2R3 worin R2 und R3 gleich oder verschieden sind und für H oder Methyl, Ethyl oder n-Propyl stehen; besonders bevorzugt steht R1 für Chlor oder-NHMethyl.
C. Geeignete Enzyme mit Dehydrogenase-Aktivität
Bevorzugte Enzyme mit Dehydrogenase-Aktivität umfassen eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret of- fenbarten Enzyme mit Dehydrogenase-Aktivität und die Verwendung dieser in den erfindungsgemäßen Verfahren.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rah- men der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Substratspezifität, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die von 3-Chlor-1-(thien-2- yl)-propan-1-on zum entsprechenden S-Alkohol reduzieren und die mindestens 50 %, bevorzugt 60 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der Akti- vität eines Enzyms mit der in SEQ ID NO:2 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 10 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 5 und 8 sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 2O0C bis 800C.
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. bei- spielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.
Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn ; GIn
He Leu; VaI
Leu Ne; VaI
Lys Arg ; GIn ; GIu
Met Leu ; He
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
VaI He; Leu
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotz- dem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwi- sehen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktiviät.
Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Ei- sen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhält- lieh durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln. „Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispie- Ie für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutage- nese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.
Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Muta- genese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligo- nukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degene- rierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Protein- Sequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der ge- wünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
D. Für die Dehydrogenasen kodierende Nukleinsäuresequenzen
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Dehydrogenase-Aktivität kodieren. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, welche z.B. für Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:2 oder charakteristische Teilsequenzen davon kodieren, oder Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder charakteristische Teilsequenzen davon umfassen. Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann bei- spielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppel- strängige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Ver- wendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abge- trennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrie- ben in Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzipiell aus allen Organismen identifizieren und isolieren. Vorteilhaft lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die Homologen davon, aus Pilzen, Hefen, Archeen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien gram-negative und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aus gramnegativen Bakterien vorteilhaft aus α-Proteobakterien, ß-Proteobakterien oder v- Proteobakterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Ordnungen der Burkholderia- les, Hydrogenophilales, Methylophilales, Neisseriales, Nitrosomonadales, Procabacte- riales oder Rhodocyclales. Ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Familie der Rhodocyclaceae. Insbesondere bevorzugt aus den Gattung Azoarcus. Insbesondere bevorzugt aus Arten Azoarcus anaerobius, Azoarcus buckelii, Azoarcus communis, Azoarcus evansii, Azoarcus indigens, Azoarcus toluclasticus, Azoarcus tolulyticus, A- zoarcus toluvorans, Azoarcus sp., Azoarcus sp. 22Lin, Azoarcus sp. BH72, Azoarcus sp. CC-11 , Azoarcus sp. CIB, Azoarcus sp. CR23, Azoarcus sp. EB1 , Azoarcus sp. EbN1, Azoarcus sp. FL05, Azoarcus sp. HA, Azoarcus sp. HxN1, Azoarcus sp. mXyN1, Azoarcus sp. PbN1, Azoarcus sp. PH002, Azoarcus sp. T und Azoarcus sp. ToNl
Besonders bevorzugt verwendet man Dehydrogenasen aus Azoarcus sp EbNL
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Organismen, z.B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit einer erfindungsgemäßen Dehydrogenase in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der ver- wendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca 10 0C niedriger als die von DNA: RNA-Hy briden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 αC in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 0C bis 45 0C, bevorzugt zwischen etwa 30 0C bis 45 0C. Für DNA: RNA-Hy bride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 0C bis 55 0C, bevorzugt zwischen etwa 45 0C bis 55 0C. Diese angegebenen Temperatu- ren für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA- Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrie- ben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridi- zation: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.
So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen von SEQ ID NO: 1 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon.
Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der na- türlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.
Unter Derivaten einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 40 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 60 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 80, 85, 90, 93, 95 oder 98 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen.
Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen. So besitzten z.B. auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 40 %, bevorzugt von mindestens 60 %, besonders bevorzugt von mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80 % über den gesamten angegebenen DNA- Bereich.
Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, Insertionen, Inversionen und/oder Deletionen verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Verände- rung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -1000 Basen stromaufwärts vor dem Startkodon oder 0 bis 1000 Basen stromabwärts nach dem Stopkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen unter „stringenten Bedingungen" hybridisieren. Diese Polynukleotide lassen sich bei der Durchmusterung von genomischen oder cDNA- Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden. Unter dieser Eigenschaft versteht man die Fähigkeit eines PoIy- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispiels- weise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50 - 70 0C, vorzugsweise 60 - 65 0C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (2Ox SSC: 3M NaCI, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA- Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z:B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
E. Ausgestaltungen erfindungsgemäßer Konstrukte
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsge- mäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Termi- natorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von
Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expressi- on der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylie- rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete re- gulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Unter einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind insbesondere solche zu verstehen, bei weichen das Gen für eine erfindungsgemäße Dehydrogenase mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq"' 17- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD)SP6-, Iambda-PR- oder im Iambda-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Wei- tere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Piizpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase, beispielswei- seaus Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inse- riert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-IH113-B1 , Igt11 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, plL2 oder pBB116, in Hefen 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Am- sterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'- und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkripti- onsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "En- hancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsge- mäßen Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die
Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen
"codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computeraus- Wertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in TJ. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pou- weis P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.
F. Erfindungsgemäß brauchbare Wirtsorganismen
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren oder Konstrukte sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfin- dungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige KIo- nierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protopla- stenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu brin- gen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Bio- logy, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz zu verändern, z.B. funktionell zu disrumpieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäßen Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 :503. Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta- Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden.
Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäurese- quenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Dehydrogenaseaktivität kodieren.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroor- ganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 0C und 100 0C, bevorzugt zwischen 10 0C bis 60 0C unter Sauer- stoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen
Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Das Keton kann direkt zur Anzucht gegeben werden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.
G. Rekombinante Herstellung der erfindungsgemäßer Polypeptide Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenen- falls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fer- mentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 4O0C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfah- ren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-
Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo- dies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N. Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
H. Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von (S)- Alkanolen
Die erfindungsgemäss verwendeten Enzyme mit Dehydrogenase-Aktivität können im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0 0C bis 95 °C, bevorzugt zwischen 10 0C bis 85 0C, besonders bevorzugt zwischen 15 0C bis 75 0C durchgeführt.
Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 4,5 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und 8 gehalten.
Unter enantiomerenreinen bzw. chiralen Produkten bzw. optisch aktiven Alkoholen sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu verstehen, die eine Enantiomere- nanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiomerenreinheiten von mindestens 70 %ee, bevorzugt von min. 80 %ee, besonders bevorzugt von min. 90 %ee, ganz besonders bevorzugt min. 98 %ee erreicht.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufgeschlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z.B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können.
Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweckmäßigerweise abgetrennt beispielsweise über eine Filtration oder Zentrifugation.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt, beispielsweise (1S)-3- Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-ol, lässt sich vorteilhaft aus der wässrigen Reaktionslösung über Extraktion oder Destillation gewinnen. Die Extraktion kann zur Erhö- hung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden. Beispiele für geeignete Extraktionsmittel sind Lösungsmittel, wie Toluol, Methylenchlorid, Butylacetat, Diisopropylether, Benzol, MTBE oder Essigester, ohne darauf beschränkt zu sein. Alternativ kann das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Produkt, beispielsweise (1S)-3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-ol, sich vorteilhaft aus der organi- sehen Phase der Reaktionslösung über Extraktion oder Destillation oder/und Kristallisation gewinnen. Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden. Beispiele für geeignete Extraktionsmittel sind Lösungsmittel, wie Toluol, Methylenchlorid, Butylacetat, Diisopropylether, Benzol, MTBE oder Essigester, ohne darauf beschränkt zu sein. Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 80 % chemische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0 0C bis 10 0C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung oder aus einer wässrigen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte Produkt kann nochmals im gleichen oder in einem anderen Lösungsmittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und nochmals kristalli- siert werden. Durch die anschließende vorteilhafte mindestens einmalig durchgeführte Kristallisation kann die Enantiomerenreinheit des Produktes falls erforderlich weiter gesteigert werden.
Bei den genannten Aufarbeitungsarten lässt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100 %, bevorzugt von 80 bis 100 %, besonders bevorzugt von 90 bis 100 %, bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte Substrat, wie z.B. von 3-Methylamino-1-(2-thienyl)-propan-1-on, isolieren. Das isolierte Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von > 90 %, bevorzugt > 95 % besonders bevorzugt von > 98 % aus. Weiterhin haben die Produkt eine hohe Enantio- merenreinheit, die vorteilhaft falls erforderlich durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.
Die Durchführung des Verfahrens kann vorteilhafterweise in Bioreaktoren erfolgen, wie z.B. beschrieben in Biotechnology, Band 3, 2. Auflage, Rehm et al Hrsg., (1993) insbesondere Kapitel II.
Die obige Beschreibung und die nachstehenden Beispiele dienen nur der Verdeutlichung der Erfindung. Die für den Fachmann offensichtlichen, zahlreich möglichen Abwandlungen sind erfindungsgemäß ebenfalls umfasst. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der besonders hohen Ausbeute des optisch aktiven Alkanols der Formel (I) bzw. der nahezu quantitativen Umwandlung von Alkanon (II).
Experimenteller Teil:
Beispiel 1 : Klonierung der Phenylethanol-Dehydrogenase aus Azoarcus sp EbN1 mittels synthetischer Oligonukleotide.
Die Sequenz des Phenylethanol-Dehydrogenasegens aus Azoarcus sp EbN 1 ist in Datenbanken hinterlegt (Genbank ID 25956124, Region:25073 bis 25822). Von der Nukleinsäuresequenz des Phenylethanol-Dehydrogenase-Gens wurden Oligonukleotide abgeleitet, aus denen nach bekannten Verfahren das Gen des synthetisiert wurde. Die DNA-Sequenz der Oligonukleotide ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Abbildung 3 zeigt die Position der einzelnen Oligonukleotide zum gesamten Phenyl- ethanol-Dehydrogenase-Gen aus Azoarcus sp EbNL Verfahren zur Herstellung von synthetischer Gene sind beispielsweise bei Y.P. Shi, P. Das, B. Holloway, V. Udhaya- kumar, J.E.Tongren, F. Candal, S. Biswas, R. Ahmad, S.E. Hasnain und A.A. LaI, Vac- eine 2000, 18, S. 2902-2914 beschrieben. Die erhaltene Sequenz ist mit der publizierten Sequenz identisch.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen Ndel und BamHI verdaut und in entsprechend verdauten pDHE19.2-Vektor (DE19848129) kloniert. Die Ligation- sansätze wurden in E. coli XL1 Blue (Stratagene) transformiert. Das Plasmid pDHEEbNI wurde in den Stamm E.coli TG10 pAgro4 pHSG575 transformiert (TG10: ein RhaA-Derivat von E.coli TG 1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61 , 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413). Die rekombianten E. coli werden mit E. coli LU 11558 bezeichnet.
Tabelle 1
Oligonukleotide zur Herstellung des synthetischen Phenylethanol-Dehydrogenase- Gens aus Azoarcus sp EbN 1 #1
#2
#3
#4
#5 GAAAGCAGGTCATCTCCACGTTTGGTCGCTGCGACATCCTCGTCMCAACGCGGGAATTTACCCGCTGATTCCTTTTGACGAGCTGACCTTTGAAC
#6
#7 GATTCCGTCCTTCCCCAGGTCCGAGGCAAGGGCGCGGGTAAAGCCTATGTTTGCCGCTTTCGTGCTGATGTAATGGGTATACGCCTCGATCTTTAGC
#8 GAAGGCT
#9 CATCCCGGGGACAAAAGCCτTCGCCATAAGAAAACCTGAATCGACGTTGATCTCGAATGTπTCπCCACTGTTCAAAGGTCAGCTCGTCAAAAG
#10 GACGGGCGCAGCTGCGπCCTGGCTTCCGATGACGCCAGTTTTATTACAGGCCAGACGCTCGCGGTTGATGGCGGTATGGTGAGACACTGA
#11 TCAGTGTCTCACCATACCGCCATC
#12 ATGACGCAAAGACTGAAGGACAAG
Beispiel 2: Klonierung der Phenylethanol-Dehydrogenase aus Azoarcus sp EbN1 mittels PCR
Die Sequenz des Phenylethanol-Dehydrogenasegens aus Azoarcus sp EbN 1 ist in Datenbanken hinterlegt (Genbank ID 25956124, Region 25073 bis 25822). Von der Nukleinsäuresequenz des Phenylethanol-Dehydrogenase-Gens wurden Oligo- nukleotide abgeleitet (Primer MKeO387 und MKeO388), die wie folgt der Klonierung des 0 Dehydrogenase-Gens durch PCR-Amplifikation dienten.
PCR:
Primer:
5 Je 130 ng der Primer MKeO387 und MKeO388 wurden equimolar gemischt. Die PCR wurde nach Stratagene-Standardvorschrift mit PfuTurbo-Polymerase (Roche Applied Science) und dem folgenden Temperatur-Gradienten-Programm durchgeführt: 95°C für 5 min; 30 Zyklen mit 95°C für 45 sec, 55°C für 45 sec, und 72°C für 1 min; 72°C für 10 min.; 100C bis zur Verwendung. Das PCR-Produkt (~0,75 kB) wurde durch Agarose- gel-Elektrophorese (1,2%E-Gel, Invitrogen) und Säulen-Chromatographie (GFX-Kit, Amersham Pharmacia) isoliert und anschließend sequenziert (Sequenzierprimer: MKeO387 und MKeO388). Die erhaltene Sequenz ist mit der publizierten Sequenz iden- tisch.
Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen Ndel und BamHI verdaut und in entsprechend verdauten pDHE19.2-Vektor (DE19848129) kloniert. Die Ligation- sansätze wurden in E.coli XL1 Blue (Stratagene) transformiert. Die Sequenzierung entsprechender Klone ergab als Insert im so erhaltenen Plasmid pDHEEbNI die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz,
Das Plasmid pDHEEbNI wurde in den Stamm E.coli TG10 pAgro4 pHSG575 transformiert (TG10: ein RhaA"-Derivat von E.coli TG 1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61 , 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413). Die rekombianten E. coli werden mit E.coli LU 11558 bezeichnet.
Beispiel 3: Bereitstellung rekombinanter Phenylethanol-Dehydrogenase aus E.coli LU 11558
E.coli LU 11558 wurden in 2OmL LB-Amp/Spec/Cm (100μg/l Ampicillin; 10Oμg/l Specti- nomycin; 20μg/l Chloramphenicol), 0,1mM IPTG, 0,5g/L Rhamnose in 10OmL Erlen- meyerkolben (Schikanen) 18 h bei 37°C angezogen, bei 5000*g/10min zentrifugiert, einmal mit 1OmM TRIS*HCI, pH7,0 gewaschen und in 2 mL des gleichen Puffers re- suspendiert.
Zellfreier Proteinrohextrakt wurde hergestellt indem Zellpaste von E.coli LU 11558 mit 0,7ml Glaskugeln (d=0,5mm) in einer Schwingmühle (3x 5min mit Zwischenkühlung auf Eis) aufgeschlossen wurde. Beispiel 4: Aktivitätsbestimmung der rekombinanten Dehydrogenase aus E.coli LU 11558
Je 6 Transformanten wurden in 2OmL LBAmp/Spec/Cm (100μg/l Amp; 100mg/ISpec; 20μg/ICm) 0,1mM IPTG 0,5g/L Rhamnose in 10OmL Erlenmeyerkolben (Schikanen) 18 h bei 37°C angezogen, bei 5000*g/10min zentrifugiert, einmal mit 1OmM Tris/HCI pH7,0 gewaschen und in 2 mL des gleichen Puffers resuspendiert. 100 mL Zellsuspension wurden 20 min in 900 μl 5OmM MES pH6 mit 50μl/ml Glucose-DH, 10OmM Glucose, 10OmM NaCI, 1mM NADH, 1mM NADPH und mit 10 mM 3-Chlor-1-(thien-2- yl)-propan-1-on schüttelnd inkubiert. Die Ansätze wurden analog zu Beispiel 4 analysiert. Im Durchschnitt wurden 0,13 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol gebildet, was einer Aktivität von 6,6 U/L Kultursuspension entspricht. In analogen Ansätzen mit Rohextrakt, der durch Zellaufschluß mit 0,7ml Glaskugeln (d=0,5mm) in einer Schwingmühle (3x 5min mit Zwischenkühlung auf Eis) gewonnen wurde, wurden 0,21 mM 3- ChIoM -(thien-2-yl)-propan-1-ol, entsprechend einer Aktivität von 10,7 U/L, gemessen. In Kontrollversuchen ohne Zusatz von Rhamnose bei der Anzucht war kein 3-ChIoM- (thien-2-yl)-propan-1 -ol detektierbar.
Beispiel 5 Analytik von 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on und 3-Chlor-1-(thien-2- yl)-propan-1-ol
Die Konzentration von 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on und 3-Chlor-1-(thien-2-yl)- propan-1-ol lassen sich mittels HPLC bestimmen. Je nach Wahl der stationären und mobilen Phase lassen sich neben der Konzentration auch ee-Wert bestimmen. a) achirale Analytik
Die Quantifizierung der Umsetzung wurde mit folgendem System durchgeführt: stationäre Phase: Chromoltih SpeedROD RP18, 50*4, 6μm, Merck (Darmstadt) temperiert auf 45°C mobilePhase: Laufmittel A: 1OmM KH2PO4, pH 2.5 Laufmittel B: Acetonitril
Gradient: 0-0.5 min, 35%B; 0.5-1.0 min 35 auf 80%B; 1.0-1.2 min 80%B; 1.2-1.3 min 80% - 35%B; 1.3-2.0 min 35%B; Flussrate: 1.5 ml/min
Detektion: UV-Detektion bei 230 und 260nm Retentionszeiten: 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on: ca. 1.6 min 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol: ca. 1.3 min
Mit authentischem Material wird eine Eichreihe erstellt, anhand derer die Konzentration unbekannter Proben bestimmt werden kann.
b) chirale Analytik stationäre Phase: Chiracel OD-H, 250*4, 6μm, Daicel, temperiert auf 400C mobilePhase: Laufmittel A: n-Hexan
Laufmittel B: iso-Propanol isokratisch mit 2.5% B Flussrate: 1.0 ml/min
Detektion: UV-Detektion bei 230 und 260nm
Retentionszeiten: 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on: ca. 9.5 min
(1S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol: ca. 16.6 min
(1 R)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol: ca. 18.3 min
Mit authentischem Material wird eine Eichreihe erstellt, anhand derer die Konzentration unbekannter Proben bestimmt werden kann.
Beispiel 6: Aktivitätsbestimmung der rekombinanten Dehydrogenase aus E.coli LU 11558
Je 6 Transformanten von E.coli LU 11558 wurden in 2OmL LBAmp/Spec/Cm (100μg/l Amp; 50mg/ISpec; 10μg/ICm) 0,1 mM IPTG 0,5g/L Rhamnose in 10OmL Erlenmeyer- kolben (Schikanen) 18 h bei 37°C angezogen, bei 5000*g/10min zentrifugiert, einmal mit 1OmM Tris/HCI pH7,0 gewaschen und in 2 mL des gleichen Puffers resuspendiert. 100 mL Zellsuspension wurden 20 min in 900 μl 5OmM MES pH6 mit 50μl/ml Glucose- DH, 10OmM Glucose, 10OmM NaCI, 1mM NADH, 1mM NADPH und mit 10 mM 3- ChIoM -(thien-2-yl)-propan-1-on schüttelnd inkubiert. Die Ansätze wurden analog zu Beispiel 4 analysiert. Im Durchschnitt wurden 0,13 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1- ol gebildet, was einer Aktivität von 6,6 U/L Kultursuspension entspricht. In analogen Ansätzen mit Rohextrakt, der durch Zellaufschluß mit 0,7ml Glaskugeln (d=0,5mm) in einer Schwingmühle (3x 5min mit Zwischenkühlung auf Eis) gewonnen wurde, wurden 0,21 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol, entsprechend einer Aktivität von 10,7 U/L, gemessen. In Kontrollversuchen ohne Zusatz von Rhamnose bei der Anzucht war kein 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol detektierbar. Beispiel 7: Herstellung von (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol) mit der rekom- binanten Dehydrogenase aus Azoarcus sp EbN1 mit 2-Pentanol
Ruhende Zellen von E. coli LU 11558 (1-20 g/L Biomasse) wurden mit 0,2 mM NAD+ und 185 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on (12,5 ml) in 221 ml 5OmM KH2PO4, und 250 ml 2-Pentanol bei 40 0C im 0,75 L-Reaktor gerührt (250 rpm). Die Reaktion wurde durch Titration mit 5 M NaOH bei pH 5,5 gehalten. Durch HPLC-Analytik wurde die Reaktion verfolgt bis zu einer Konzentration von 50-350 mM TACA in der organi- sehen Phase.
Beispiel 8: Herstellung von (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol) mit der rekom- binanten Dehydrogenase aus Azoarcus sp EbN1 mit 2-Pentanol
Ruhende Zellen von E. coli LU 11558 (1-20 g/L Biomasse) wurden mit 0,2 mM NAD+ und 370 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on (200 ml) in 1432 ml 5OmM KH2PO4, und 2000 ml 2-Pentanol bei 40 0C im 4 L-Reaktor gerührt (250 rpm). Die Reaktion wurde durch Titration mit 5 M NaOH bei pH 5,5 gehalten. Durch HPLC-Analytik wurde die Reaktion verfolgt bis zu einer Konzentration von 100-650 mM TACA in der organischen Phase.
Beispiel 9: Herstellung von (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol) mit der rekom- binanten Dehydrogenase aus Azoarcus sp EbN1 mit 2-Pentanol
Ruhende Zellen von E. coli LU 11558 (1-20 g/L Biomasse) wurden mit 0,2 mM NAD+ und 370 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on (200 ml) in 1432 ml 5OmM KH2PO4, und 2000 ml 2-Pentanol bei 40 0C im 4 L-Reaktor gerührt (250 rpm). Die Reaktion wurde durch Titration mit 5 M NaOH bei pH 5,5 gehalten. Es wurde ein Vakuum von ca. 85 mbar und eine Manteltemperatur von 50-70 0C angelegt. Die bei Destillationsraten von 2-10 ml/min erhaltenen Destillatmengen an Wasser und 2-Pentanol wurden während der Reaktion fortlaufend wieder zugegeben. Durch HPLC-Analytik wurde die Reaktion verfolgt bis zu einer Konzentration von 300-700 mM TACA in der organischen Phase. Das 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on wurde bis auf 0-30% Restanteil umge- setzt. Beispiel 10: Herstellung von (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol) mit der re- kombinanten Dehydrogenase aus Azoarcus sp EbN1 mit 2-Pentanol
Ruhende Zellen von E. coli LU 11558 (1-20 g/L Biomasse) wurden mit 0,2 mM NAD+ und 200 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on (12,5 ml) in 221 ml 5OmM KH2PO4, und 250 ml 2-Pentanol bei 40 0C im 0,75 L-Reaktor gerührt (250 rpm). Die Reaktion wurde durch Titration mit 5 M NaOH bei pH 5,5 gehalten. Durch HPLC-Analytik wurde die Reaktion verfolgt bis zu einer Konzentration von 50-320 mM TACA in der organi- sehen Phase.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven-Alkanolen der Formel I
worin n für einen ganzzahligen Wert von 0 bis 5 steht;
A für einen gegebenenfalls substituierten C1-C6- verzweigten oder unverzweigten Alkylrest oder einen Rest "Cyc" steht,
Cyc für einen gegebenenfalls substituierten, ein- oder mehrkernigen, gesättigten oder ungesättigten, carbocyclischen oder heterocyclischen Ring steht, und
R1 für Halogen, SH, OH, NO2, NR2R3 oder NR2R3R4+X" steht, wobei R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder einen Niedrigalkyl- oder Niedrigal- koxy-Rest stehen und X' für ein Gegenion steht,
wobei man in einem Alkanon der Formel Il
worin n, A und R1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
enthaltenden Medium, ein Enzym (E), ausgewählt aus den Klassen der Dehydrogenasen, Aldehydreduktasen und Carbonylreduktasen, inkubiert in Gegenwart von Reduktionsäquivalenten, wobei die Verbindung der Formel Il zur Verbindung der Formel I enzymatisch reduziert wird, und die im Laufe der Reaktion verbrauchten Reduktionsäquivalente durch Umsetzen eines Opfer-Alkohols zum ent- sprechenden Opfer-Keton mit Hilfe des Enzyms (E) wieder regeneriert werden und das Opfer-Keton zumindest partiell aus dem Reaktionsmedium entfernt wird, und man das gebildete Produkt (I) isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym (E) eine Alkoholdehydrogenase ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym (E) eine Polypeptidsequenz
(i) SEQ ID NO: 2 oder (ii) bei der bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID N0:2 durch
Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50% der enzymatischen Aktivität von SEQ ID NO:2 besitzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, zur Herstellung von Derivaten des 1-(2-thienyl)- (S)-propanol der Formel III
wobei R1 = Cl oder NHCH3 bedeuten,
wobei man in einem Derivate des 1-(2-thienyl)-propanon der Formel IV
enthaltenden Medium diese Verbindung zur Verbindung der Formel III enzyma- tisch reduziert wird, und man das in im Wesentlichen enantiomerenreiner Form gebildete Produkt isoliert.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym ausgewählt ist unter Enzymen aus Mikroorganismen der Gattung Azoarcus.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym von einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem funktionalen Äqui- valent davon kodiert wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Opfer-Alkohol 2-Pentanol eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man das während der Reaktion aus dem Opfer-Alkohol gebildete Opfer-Keton aus dem Reaktionsmedium destillativ zumindest partiell entfernt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung des Opfer-Ketons aus dem Enzymreaktor während der Reaktion destillativ erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Umsetzung der Verbindung der Formel Il in Gegenwart eines Mikroorganismus erfolgt, der ausgewählt ist unter Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonada- ceae, Rhizobiaceae, Lactobacillaceae, Streptomycetaceae, Rhodococcaceae und Nocardiaceae.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist, der mit einem Nukleinsäurekonstrukt transformiert ist, welche für ein Enzym gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
12. Verwendung eines Enzyms (E) mit einer Polypeptidsequenz i. SEQ ID NO: 2 oder ii. bei der bis zu 25% der Aminosäurereste gegenüber SEQ ID NO:2 durch Deletion, Insertion, Substitution oder einer Kombination davon verändert sind und die noch mindestens 50% der en- zymatischen Aktivität von SEQ ID NO:2 besitzt, zur Herstellung von Verbindungen der Formeln I oder III.
13. Verwendung nach Anspruch 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Duloxeti- ne.
EP06724927A 2005-03-07 2006-03-03 Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole durch enzymatische reduktion Withdrawn EP1863918A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200510010804 DE102005010804A1 (de) 2005-03-07 2005-03-07 Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole
PCT/EP2006/060452 WO2006094945A2 (de) 2005-03-07 2006-03-03 Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole durch enzymatische reduktion

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1863918A2 true EP1863918A2 (de) 2007-12-12

Family

ID=36603441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP06724927A Withdrawn EP1863918A2 (de) 2005-03-07 2006-03-03 Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole durch enzymatische reduktion

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1863918A2 (de)
JP (1) JP2008538076A (de)
CN (1) CN101171339A (de)
DE (1) DE102005010804A1 (de)
WO (1) WO2006094945A2 (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101796192B (zh) * 2007-06-20 2014-01-15 巴斯夫欧洲公司 使用固氮弧菌属物种(Azoarcus Sp)EBN1脱氢酶产生光学活性醇的方法
WO2010031776A2 (de) 2008-09-17 2010-03-25 Basf Se Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alkoholen
WO2010079068A1 (de) 2008-12-17 2010-07-15 Basf Se Verbesserte biokatalysatoren zur herstellung von duloxetinalkohol
EP2445890B1 (de) 2009-06-22 2015-05-06 SK Biopharmaceuticals Co., Ltd. Verfahren zur herstellung von carbaminsäure (r)-1-aryl-2-tetrazolylethylester
US8404461B2 (en) 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
ES2743161T3 (es) 2010-11-17 2020-02-18 Basf Se Procedimiento para la ciclación biocatalítica de terpenos y mutantes de ciclasa que pueden usarse en el mismo
DE102012017026A1 (de) 2012-08-28 2014-03-06 Forschungszentrum Jülich GmbH Sensor für NADP(H) und Entwicklung von Alkoholdehydrogenasen
WO2014086702A2 (de) 2012-12-03 2014-06-12 Basf Se Enzymatische reduktion von hydroxymethylfurfuralen
MX2018010024A (es) 2016-02-19 2018-11-09 Basf Se Ciclacion enzimatica de acido homofarnesilico.
BR112020017362A2 (pt) 2018-03-29 2020-12-29 Firmenich S.A. Método para produzir vanilina

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3574682B2 (ja) * 1993-09-24 2004-10-06 ダイセル化学工業株式会社 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法
DE60315958D1 (de) * 2002-03-18 2007-10-11 Biocatalytics Inc Alkohol-dehydrogenase mit hoher stabilität gegenüber lösungsmittel und temperatur
DE10315760A1 (de) * 2003-04-07 2004-10-21 Basf Ag L-Carnitin Dehydrogenasen, deren Derivate und ein Verfahren zur Herstellung von substituierten (S)-Alkanolen
DE10327454A1 (de) * 2003-06-18 2005-01-20 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
DE10345772A1 (de) * 2003-10-01 2005-04-21 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol
DE102004022686A1 (de) * 2004-05-05 2005-11-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2006094945A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102005010804A1 (de) 2006-09-14
WO2006094945A2 (de) 2006-09-14
WO2006094945A3 (de) 2007-03-15
CN101171339A (zh) 2008-04-30
JP2008538076A (ja) 2008-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1745133B1 (de) Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole aus alkanonen unter verwendung einer dehydrogenase aus azoarcus
WO2006094945A2 (de) Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole durch enzymatische reduktion
EP2334801B1 (de) Verfahren zur herstellung von l-phenylephrin unter verwendung einer alkoholdehydrogenase
EP1929001B1 (de) Neue dehydrogenasen, deren derivate und ein verfahren zur herstellung von optisch aktiven alkanolen
EP1670779B1 (de) Verfahren zur herstellung von 3-methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol
EP2171074B1 (de) Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole unter Verwendung einer Dehydrogenase aus Azoarcus sp. EbN1
EP1969132B1 (de) Enzymatische reduktion zur herstellung optisch aktiver alkohole
EP1613745B1 (de) L-carnitin dehydrogenasen, deren derivate und ein verfahren zur herstellung von substituierten (s)-alkanolen
WO2006053713A1 (de) Verfahren zur herstellung optisch aktiver alkohole
EP1966381A2 (de) Verfahren zur herstellung von 5-norbornen-2-carbonsäure aus 5-norbornen-2-carbonitril unter verwendung einer arylacetonitrilase
EP2643467A1 (de) Verfahren zur herstellung n-heterozyklischer optisch aktiver alkohole
US8658400B2 (en) Biocatalysts for manufacturing duloxetine alcohol
JP2006509518A (ja) ２−ヒドロキシ−３−（２−チエニル）プロパンニトリルのｒ及びｓ鏡像体の立体選択的製造のための化学酵素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20071008

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: BASF SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20080228

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20080910