CN101171339A - 借助酶催还原生产旋光醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过酶催还原对应的酮来制备式(I)的旋光烷醇的方法，尤其是制备(1S)－3－甲基氨基－1－(2－噻吩基)丙－1－醇和(1S)－3－氯－1－(2－噻吩基)丙－1－醇的方法。

Description

借助酶催还原生产旋光醇的方法
本发明涉及通过酶催还原对应的酮来制备旋光烷醇的方法，尤其涉及制备(1S)-3-甲基氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇和(1S)-3-氯-1-(2-噻吩基)丙-1-醇的方法。
发明背景
(1S)-3-甲基氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇(“度洛西汀(Duloxetine)醇”)是度洛西汀合成中的结构单元。Duloxetine是一种目前处于批准阶段的药物，意欲用在抑郁和失禁适应症领域。
EP-B-0273658描述了制备对应于度洛西汀的碱的方法，包括使2-乙酰基噻吩与甲醛和二甲胺以曼尼希反应反应，还原由此得到的曼尼希碱的酮基以获得外消旋的(S)-3-N，N-二甲基氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，用氟化萘使醇官能团醚化并最终将二甲基氨基基团转化为甲基氨基官能团。想要的萘基醚对映体使用手性原料获得或者通过在终产物阶段拆分外消旋化合物获得，该拆分例如使用旋光酸经由盐或在手性固定相上层析进行。
US-5,362,886描述了类似的方法，其包括将S-扁桃酸加至还原酮基后获得的外消旋丙醇。在该方法中获得的醇的S对映体用在随后的反应阶段中。
EP-A-0457559也描述了类似于EP-B-0273658的方法。其中，曼尼希碱的酮基通过使用不对称还原系统LAH-lcb(氢化锂铝[(2R，2S)-(-)-4-二甲基氨基-1，2-二苯基-3-甲基-2-丁醇])被还原为S对映体形式的醇。除了成本以外，其缺点还在于LAH-lcb还原系统的敏感性，其仅稳定数秒钟。
W.J.Wheeler和F.Kuo在Journal of Labelled Compounds andRadiopharmaceuticals，第XXXVI卷，No.3，第213至223页中描述了制备度洛西汀的方法。为此，使噻吩-2-羰酰氯与乙烯基三正丁基锡烷在催化量的苄氯双(三苯基膦)钯(II)存在下在DMPU(二甲基亚丙基脲)中以Stille偶联反应，得到式(V)的1-(噻吩-2-基)丙烯酮：
Figure S2006800155881D00021
随后通过氯化氢处理将其转化为式(VI)的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮：
Figure S2006800155881D00022
以此方式得到的氯丙酮随后使用手性氧氮杂亚硼烷基(oxazaborylidine)和BH3还原，得到式(VII)的(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇：
Figure S2006800155881D00023
以此方式得到的醇通过依次与碘化钠，随后与甲胺反应转化为(S)-3-甲基氨基-1-(噻吩-2-基)-丙-1-醇。接着依次与氢化钠，1-氟萘和氯化氢反应产生氢氯化物形式的度洛西汀。
Figure S2006800155881D00024
Hal＝卤素。
T.Stillger等人在Chemie Ingenieur Technik(74)，第1035-1039页，2002，描述了底物偶合辅因子再生方法，用于酶催和对映选择地还原5-氧代己酸乙酯，以得到(S)-5-羟基己酸乙酯。
发明概述
因此，本发明的目的是发现立体特异性地还原取代的烷酮如3-甲基氨基-1-(2-噻吩基)丙酮和3-氯-1-(2-噻吩基)丙酮的方法，该反应方法意欲能以低廉的方式以及尽可能定量地获得产物。
由于令人惊讶地发现，具有脱氢酶活性的酶，尤其是可从固氮弓菌(Azoarcus)属微生物制备的那些，能够立体特异地催化上述反应并伴随辅因子再生。
本发明主要涉及制备式I的旋光烷醇的方法：
Figure S2006800155881D00031
其中
n为0至5的整数；
A为任选取代的支化或未支化的C1-C6烷基或“Cyc”基团，
Cyc为任选取代的单或多环的、饱和或不饱和的碳环或杂环，以及
R1为卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4彼此独立地为氢或低级烷基或低级烷氧基，且X-为抗衡离子，
该方法包括在包含式II的烷酮的介质中
Figure S2006800155881D00032
其中n、A和R1如上所定义，
使选自脱氢酶、醛还原酶和羰基还原酶类的酶在还原等价物存在下孵育，其中式II的化合物酶催还原得到式I的化合物，并且在反应中消耗的还原等价物通过借助酶(E)使供体醇反应获得对应的供体酮而再生，并且所述供体酮从反应介质中至少部分地移除，以及分离所形成的产物(I)。
适合于本发明的酶(E)尤其是醛-酮还原酶家族的酶、醛-酮还原酶总家族的酶(K.M.Bohren，B.Bullock，B.Wermuth and K.H.Gabbay J.Biol.Chem.1989，264，9547-9551)，以及短链醇脱氢酶/还原酶(SDR)的酶。后面的酶类例如详细描述于H.Jornvall，B.Persson，M.Krook，S.Atrian，R.Gonzalez-Duarte，J.Jeffery and D.Gosh，Biochemistry，1995，34，第6003-6013页或U.Oppermann，C.Filling，M.Hult，N.Shafquat，X.Q.Wu，M.Lindh，J.Shafquat，E.Nordling，Y.Kallberg，B.Persson andH.Jornvall，Chemico-Biological Interactions，2003，143，第247-253页中。
在提及的这些酶类中，短链醇脱氢酶是尤其适合的。
本发明的尤其适合的实施方案为在上述方法中使用酶(E)，其中E具有多肽序列：
(i)SEQ ID NO：2或
(ii)与SEQ ID NO：2相比，其中至多25％的氨基酸残基已通过缺失、插入、取代或其组合而改变，并且其保留了SEQ ID NO：2酶活性的至少50％。
在尤其优选的实施方案中，该方法用于制备式III的1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的衍生物，
Figure S2006800155881D00041
其中R1＝Cl或NHCH3，
其中，在包含式IV的1-(2-噻吩基)丙酮的衍生物的介质中，
Figure S2006800155881D00042
将该化合物酶催还原以得到式III的化合物，并且分离形成的基本上对映体纯的产物。
优选在该方法中使用具有脱氢酶活性的酶，该酶可从固氮弓菌属、Azonexus、Azospira、Azovibrio、Dechloromonas、高铁杆菌属(Ferribacterium)、Petrobacter、Propionivibrio、Quadricoccus、红环菌属(Rhodocyclus)、Sterolibacterium、陶厄氏菌属(Thauera)以及动胶菌属(Zoogloea)的微生物制备。
尤其优选固氮弓菌属物种的脱氢酶。
由于其氨基酸序列，固氮弓菌属物种EbN1的苯基乙醇-脱氢酶可以包括在短链醇脱氢酶/还原酶(SDR)中。该酶类例如详细描述于H.Jornvall，B.Persson，M.Krook，S.Atrian，R.Gonzalez-Duarte，J.Jeffery and D.Gosh，Biochemistry，1995，34，第6003-6013页或U.Oppermann，C.Filling，M.Hult，N.Shafquat，X.Q.Wu，M.Lindh，J.Shafquat，E.Nordling，Y.Kallberg，B.Persson and H.Jornvall，Chemico-Biological Interactions，2003，143，第247-253页中。在SDR类中，各个代表的氨基酸序列可以彼此差异很大。然而特定的氨基酸或氨基酸区域已知在SDR类中高度保守。C.Filling，K.D.Berndt，J.Benach，S.Knapp，T.Prozorovski，E.Nordling，R.Ladenstein，H.Jornvall and U.Oppermann，Journal of BiologicalChemistry，2002，277，第25677-25684页描述了重要的保守SDR区域。
固氮弓菌属物种的实例为Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、Azoarcus communis、Azoarcus evansii、Azoarcus indigens、Azoarcustoluclasticus、Azoarcus tolulyticus、Azoarcus toluvorans、固氮弓菌属物种、固氮弓菌属物种22Lin、固氮弓菌属物种BH72、固氮弓菌属物种CC-11、固氮弓菌属物种CIB、固氮弓菌属物种CR23、固氮弓菌属物种EB1、固氮弓菌属物种EbN1、固氮弓菌属物种FL05、固氮弓菌属物种HA、固氮弓菌属物种HxN1、固氮弓菌属物种mXyN1、固氮弓菌属物种PbN1、固氮弓菌属物种PH002、固氮弓菌属物种T以及固氮弓菌属物种ToN1。
尤其优选使用固氮弓菌属EbN1脱氢酶。
在该方法尤其优选的实施方案中，具有脱氢酶活性的酶选自包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列或从其衍生的如下序列的酶，该序列中至多25％、优选至多20％、尤其优选至多15％、尤其是至多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％的氨基酸残基已通过缺失、取代、插入或缺失、取代和插入的组合而改变，其中该与SEQ ID NO：2相比改变了的多肽序列保留了SEQ ID NO：2酶活性的至少50％、优选65％、尤其优选80％、尤其是高于90％。就此而言，SEQ ID NO：2的酶活性是指以对映选择性方式还原其中R1＝Cl的式(IV)的酮以得到通式(III)的(S)醇的能力。用于确定酶活性的精确条件记述在实施例3和4中。
本发明的方法在添加还原等价物，尤其是NADH或NADPH的条件下进行。在反应中消耗的还原等价物使用供体醇来再生，优选异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、3-己醇，所述供体醇在反应条件下被酶(E)催氧化得到对应的供体酮。
在本发明优选的实施方案中，所添加的供体醇不仅用来再生消耗的还原等价物，还用作共溶剂。优选在液体两相系统中操作，一相由水或水溶混性溶剂组成，另一相由供体醇组成。所用的供体醇优选2-戊醇。
还原等价物优选以基于使用的每摩尔烷酮(II)为0.001至100mmol，尤其优选0.01至1mmol还原等价物的量使用。
本发明的方法包括从反应混合物至少部分地移除由于再生消耗的还原等价物过程中的供体醇氧化而产生的供体酮。优选从反应介质中完全移除形成的供体酮。这可以通过多种方式进行，例如经由选择性膜或通过提取或蒸馏方法。优选使用蒸馏移除酮。通过蒸馏移除酮常常也引起部分供体醇以及有时也甚至是部分水相被移除。蒸馏导致的这些损失通常通过计量加入额外量的供体醇以及，合适的话，水来弥补。基于反应体积，蒸馏速率在0.02％/min至2％/min，优选0.05％/min至1％/min的范围内。反应器的夹套温度优选比内部反应器温度高5-70开尔文，优选高10-40开尔文。
该蒸馏在1-500毫巴，优选10-200毫巴的压力下特别好地进行。
在优选的实施方案中，使通式II的化合物，例如式IV化合物在微生物存在下反应，该微生物选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、红球菌科(Rhodococcaceae)和诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌。特别地，所述微生物尤其可以是已用编码具有上述脱氢酶活性的酶的核酸构建体转化的重组微生物。
本发明尤其涉及
-从自然来源分离或重组制备产生具有脱氢酶活性的酶的微生物，
-使所述微生物增殖，
-若合适的话，从所述微生物分离具有脱氢酶活性的所述酶或制备包含所述酶的蛋白部分，以及
-将根据阶段b)的微生物或根据阶段c)的酶转移至包含式I化合物的介质中。
本发明还涉及包含编码上述多肽的序列的编码核酸序列。
本发明还涉及包含上述编码核酸序列的表达盒，其可操作地连接于至少一个调节核酸序列。
本发明还涉及包含至少一个这种表达盒的重组载体。
本发明还涉及已用至少一种本发明的载体转化的原核或真核宿主。
最后，本发明涉及具有如上所述脱氢酶活性的酶或产生所述酶的微生物用于制备式I或III的化合物的用途，涉及其进一步的处理，例如用于制备度洛西汀(式VIII)：
Figure S2006800155881D00071
发明详述：
A.通用术语和定义
除非另有说明，适用以下通用含义：
“卤素”为氟、氯、溴或碘，尤其是氟或氯。
“低级烷基”为具有1至6个碳原子的直链或支化的烷基基团，例如甲基，乙基，异丙基或正丙基，正、异、仲或叔丁基，正戊基或2-甲基丁基，正己基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，2-乙基丁基。
“低级烯基”为上述具有2至6个碳原子的烷基基团的单或多不饱和类似物，优选单或双不饱和类似物，双键可位于碳链的任何位置。
“低级烷氧基”为上述烷基基团的以氧为末端的类似物。
“芳基”为单或多环的，优选单或双环的任选取代的芳族基团，尤其是经由任何环位置结合的苯基或萘基，例如1-或2-萘基。若合适的话，这些芳基基团可以带有1或2个相同或不同的选自上述卤素、低级烷基、低级烷氧基或三氟甲基的取代基。
取代的烷酮、(S)-烷醇及其衍生物
可根据本发明通过酶催化获得的烷醇为以上式(I)的那些，其中
n为0至5的整数；
A为任选取代的支化或未支化的C1-C6烷基或“Cyc”基团，
Cyc为任选取代的单或多环的、饱和或不饱和的碳环或杂环，以及
R1为卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4彼此独立地为氢或低级烷基或低级烷氧基，且X-为抗衡离子。
用于酶催合成的上式II的烷酮是本身已知的化合物，可通过应用公知的有机合成方法获得(参见，例如EP-A-0 273 658)。
在上述化合物中，n优选0、1或2，尤其是1。
可以提及的A的实例尤其为具有一个、两个、三个和四个碳原子的烷基基团，例如甲基，乙基，正和异丙基，正、异和叔丁基。
基团A还可为单或多取代的，例如单或二取代的。适合的取代基的实例为卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、-OH、-SH、-NO2或其中R2和R3如上定义的NR2R3，优选卤素或低级烷基。
可以提及的碳环和杂环基团Cyc的实例尤其为具有至多4个，优选1或2个相同或不同的选自O、N和S的环杂原子的单或双环基团，优选单环的基团。
这些碳环或杂环尤其包含3至12、优选4、5或6个环碳原子。可以提及的实例为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基，其单或多不饱和类似物，例如环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基；以及具有1至4个选自O、N和S的杂原子的5至7元饱和或单或多不饱和杂环基团，若合适的话，杂环可稠合至另一杂环或碳环。尤其必须提及的是衍生自吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、哒嗪、吡嗪、苯并呋喃、吲哚和喹啉的杂环基团。
这种情况下，基团Cyc可以经由任何环位置，优选经由环碳原子结合至烷酮或烷醇。
适合的Cyc基团的实例为2-噻吩基、3-噻吩基；2-呋喃基、3-呋喃基；2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基；4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基；3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基以及4-氯-2-噻吩基。
基团Cyc还可以为单或多取代的，例如单或二取代的。取代基优选位于环碳原子上。适合的取代基的实例为卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、-OH、-SH、-NO2或其中R2和R3如上定义的NR2R3，优选卤素或低级烷基。
R1尤其是卤素、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3以及R2、R3和R4各自彼此独立地为氢或低级烷基或低级烷氧基，X-为抗衡离子，优选R2、R3和R4中的任意基团为氢。适合的抗衡离子的实例为酸阴离子，如当制备酸加成盐时所产生的酸阴离子。其实例例如在EP-A-0273658中提到，在这里对其引用。基团R1的优选实例尤其是氟或氯以及NR2R3，其中R2和R3相同或不同且为氢或甲基、乙基或正丙基；R1尤其优选是氯或-NH甲基。
C.具有脱氢酶活性的合适的酶
优选的具有脱氢酶活性的酶包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
本发明同样包括明确公开的具有脱氢酶活性的酶的“功能等价物”，以及它们在本发明方法中的用途。
在本发明范围内，明确公开的酶的“功能等价物”或同源物为与这些酶不同但是仍具有期望的生物活性，例如底物特异性的多肽。因此，“功能等价物”例如是指将3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮还原为对应的S醇且具有含列在SEQ ID NO：2中的氨基酸序列的酶的活性的至少50％、优选60％、尤其优选75％、极其优选90％的酶。功能等价物也优选在pH4至10稳定，并有利地具有pH5至8之间的最佳pH，以及在20℃至80℃之间的最适温度。
根据本发明，“功能等价物”还尤其指这样的突变体，其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置具有不同于明确提及的氨基酸的氨基酸，但是具有上述生物活性之一。“功能等价物”因此包括可通过一个或多个氨基酸添加、氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒位获得的突变体，所述改变可能在任何序列位置发生，只要它们导致突变体具有本发明的性能特征。尤其是当突变体和未改变的多肽的反应性模式定性地一致时，亦即以不同的速率被转换相同的底物时也出现功能等价。
在下表中可找到适合的氨基酸取代的实例：
原始残基    取代实例
Ala         Ser
Arg         Lys
Asn         Gln；His
Asp         Glu
Cys         Ser
Gln         Asn
Glu         Asp
Gly         Pro
His         Asn；Gln
Ile         Leu；Val
Leu         Ile；Val
Lys         Arg；Gln；Glu
Met         Leu；Ile
Phe         Met；Leu；Tyr
Ser         Thr
Thr         Ser
Trp         Tyr
Tyr         Trp；Phe
Val         Ile；Leu
根据本发明，“功能等价物”还尤其指这样的突变体，其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置具有不同于明确提及的氨基酸的氨基酸，但是具有上述生物活性之一。“功能等价物”因此包括可通过一个或多个氨基酸添加、氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒位获得的突变体，所述改变可能在任何序列位置发生，只要它们导致突变体具有本发明的性能特征。尤其是当突变体和未改变的多肽的反应性模式定性地一致时，亦即以不同的速率被转换相同的底物时也出现功能等价。
在以上意义上的“功能等价物”也是所述多肽的“前体”以及所述多肽的“功能衍生物”和“盐”。
就此而言，“前体”为具有或不具有期望生物活性的多肽的天然或合成前体。
用语“盐”指本发明蛋白分子的羧基盐和氨基基团的酸加成盐。羧基盐可以以本身已知的方式制备，包括无机盐，如钠、钙、铵、铁和锌盐，以及与有机碱，例如胺，例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等的盐。类似地，本发明还涉及酸加成盐，例如与无机酸如盐酸或硫酸的盐和与有机酸如乙酸和草酸的盐。
本发明多肽的“功能衍生物”也可借助已知技术在功能性氨基酸侧基上或在它们的N末端或C末端制备。这种类型的衍生物例如包括羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺，该酰胺可通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得；自由氨基基团的N-酰基衍生物，该衍生物通过与酰基基团反应而制备；或自由羟基的O-酰基衍生物，该衍生物通过与酰基基团反应而制备。
“功能等价物”自然也包括可从其它生物获得的多肽以及天然产生的变体。例如，可通过序列比较确定同源序列区域，并且基于本发明的具体指导可确定等价酶。
“功能等价物”也包括本发明多肽的片段，优选独立结构域或序列基序，其中该片段具有例如期望的生物功能。
“功能等价物”还可以是融合蛋白，其含有任意上述多肽序列或由其衍生的功能等价物以及至少一种在功能上与其不同并且在N末端或C末端功能连接的其它异源序列(即没有任何实质性的融合蛋白部分相互间功能损伤)。这类异源序列的非限定性实例例如为信号肽或酶。
包括在本发明中的“功能等价物”为明确公开的蛋白的同源物。所述同源物与明确公开的氨基酸序列之一具有至少60％，优选至少75％，尤其是至少85％，如90％、95％或99％的同源性，如使用Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法计算的。本发明同源多肽的同源性百分比尤其是基于本文明确描述的任意氨基酸序列的总长而言的氨基酸残基同一性百分比。
在可能的蛋白糖基化情况下，本发明的“功能等价物”包括去糖基化或糖基化形式以及可通过改变糖基化模式获得的修饰形式的上述类型的蛋白。
本发明蛋白或多肽的同源物也可以通过突变产生，例如通过点突变或蛋白的截短产生。
本发明蛋白的同源物可通过筛选突变体如截短突变体的组合库来鉴别。例如，蛋白变体的多样化库可以通过在核酸水平的组合突变来产生，例如通过酶催连接合成的寡核苷酸的混合物。有许多方法可用于从简并寡核苷酸序列制备潜在的同源物库。可在DNA合成仪中化学合成简并基因序列，随后将该合成基因连接到适合的表达载体中。使用简并的基因组使在混合物中制备编码期望的潜在蛋白序列组的所有序列成为可能。合成简并寡核苷酸的方法对技术人员来说是已知的(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。
现有技术中已知多种筛选已通过点突变或截短而制备的组合库的基因产物的技术，以及在cDNA库筛选具有所选择的性能的基因产物的技术。这些技术可适合于快速筛选通过组合突变本发明同源物而产生的基因库。最经常使用的筛选大基因库(其经历高流通量分析)的技术包括将基因库克隆进可复制的表达载体中，用得到的载体库转化合适的细胞并在这样的条件下表达组合基因，在该条件下对期望的活性的检测有助于分离编码所检测到的产物的基因的载体。可将递推系统突变(REM)(增加库中的功能性突变体频率的技术)与筛选试验组合使用来鉴别同源物(Arkin and Yourvan(1992)PNAS 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering6(3)：327-331)。
D.编码脱氢酶的核酸序列
本发明尤其涉及编码本发明具有脱氢酶活性的酶的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。优选编码例如根据SEQID NO：2的氨基酸序列或其特征性部分序列的核酸序列，或优选包含根据SEQ ID NO：1核酸序列或其特征性部分序列的核酸序列。
本文提及的所有核酸序列可以以本身已知的方式通过化学合成从核苷酸构件来制备，例如通过双螺旋的各个重叠、互补核酸构件的片段缩合来合成。例如，寡核苷酸可以以本身已知的方式使用亚磷酰胺化方法化学合成(Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York，第896-897页)。在Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning：A laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述了合成的寡核苷酸的组装，借助DNA聚合酶Klenow片段的填平缺口和连接反应以及通用的克隆方法。
本发明还涉及编码任意上述多肽及其可例如通过使用人工核苷酸类似物得到的功能等价物的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)。
本发明涉及分离的编码本发明多肽或蛋白或其生物活性部分的核酸分子，以及涉及例如可用作杂交探针或引物以鉴别或扩增编码本发明核酸的核酸片段。
本发明核酸分子还可以包含从编码基因区域的3’和/或5’端起的未翻译的序列。
本发明还包括互补于具体描述的核苷酸序列或其部分的核酸分子。
本发明的核苷酸序列使产生可用于在其它细胞类型和生物体中鉴别和/或克隆同源序列的探针和引物成为可能。这种类型的探针和引物通常包括在“严格”条件(见下文)下杂交至本发明核酸序列有义链或对应反义链的至少约12、优选至少约25，例如约40、50或75个连续核苷酸的核苷酸序列区域。
“分离的”核酸分子从该核酸天然来源中存在的其它核酸分子移除，而且可以基本上无细胞材料或培养基(当其通过重组技术制备)或者没有化学前体或其它化学品(当其化学合成)。
本发明的核酸分子可以借助标准的分子生物学技术和本发明提供的序列信息来分离。例如，可通过使用具体公开的完整序列之一或其部分作为杂交探针并使用标准杂交技术(例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd edition，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中描述)来从适合的cDNA库中分离cDNA。此外，包含任意公开的序列或其部分的核酸分子可使用聚合酶链式反应和基于该序列构建的寡核苷酸引物来分离。以此方式扩增的核酸可以被克隆进适合的载体中，并通过DNA测序分析来表征。本发明的寡核苷酸也可以使用例如自动DNA合成仪通过标准合成方法制备。
本发明的核酸序列原则上可从任何生物体鉴定并分离。有利的是，本发明的核酸序列或其同源物可从真菌、酵母、古细菌(archeae)或细菌中获得。可提及的细菌为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。本发明的核酸优选从革兰氏阴性细菌分离，有利的是从α-蛋白细菌，β-蛋白细菌或γ-蛋白细菌分离，尤其优选从伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氢菌目(Hydrogenophilales)、嗜甲基菌目(methylophilales)、奈瑟菌目(Neisseriales)、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)、普罗卡杆菌目(Procabacteriales)或红环菌目(Rhodocyclales)的细菌分离，极其优选从红环菌科(Rhodocyclaceae)的细菌分离，特别优选从固氮弓菌属分离，特别优选从Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、Azoarcus communis、Azoarcus evansii、Azoarcus indigens、Azoarcus toluclasticus、Azoarcustolulyticus、Azoarcus toluvorans、固氮弓菌属物种、固氮弓菌属物种22Lin、固氮弓菌属物种BH72、固氮弓菌属物种CC-11、固氮弓菌属物种CIB、固氮弓菌属物种CR23、固氮弓菌属物种EB1、固氮弓菌属物种EbN1、固氮弓菌属物种FL05、固氮弓菌属物种HA、固氮弓菌属物种HxN1、固氮弓菌属物种mXyN1、固氮弓菌属物种PbN1、固氮弓菌属物种PH002、固氮弓菌属物种T和固氮弓菌属物种ToN1中分离。
尤其优选使用固氮弓菌属物种EbN1的脱氢酶。
本发明的核酸序列例如可通过使用常规的杂交方法或PCR技术，例如通过基因组库或cDNA库而从其它生物体分离。这些DNA序列与本发明序列在标准条件下杂交。对于杂交而言，有利的是使用例如来自活性位点的保守区域的短寡核苷酸，该保守区域可以以技术人员已知的方式通过与本发明的脱氢酶比较而鉴别。但是，也可以使用本发明核酸的较长片段或完整序列来杂交。所述标准条件随使用的核酸(寡核苷酸、较长片段或完整序列)而变化，或取决于用于杂交的核酸类型，DNA或RNA。因此，例如用于DNA：DNA杂交的熔解温度为约比用于相同长度DNA：RNA杂交体的温度低约10℃。
取决于核酸，标准条件例如指42至58℃的温度，在浓度0.1至5x SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2)的缓冲水溶液中或另外还存在50％甲酰胺，例如42℃，在5x SSC中，50％甲酰胺。有利的是，用于DNA：DNA杂交体的杂交条件为0.1x SSC以及约20℃至45℃的温度，优选约30℃至45℃。对于DNA：RNA杂交体，杂交条件有利的是0.1x SSC和约30℃至55℃的温度，优选约45℃至55℃。所述的用于杂交的这些温度为熔解温度值，例如是对具有约100核苷酸和50％G+C含量，并且无甲酰胺的核酸计算的值。用于DNA杂交的实验条件描述在专门的遗传学教科书中，例如Sambrook等人，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989，并且可以使用技术人员已知的公式计算，例如作为核酸长度、杂交体类型或G+C含量的函数计算。关于杂交，技术人员可从以下教材中获得进一步的信息：Ausubel等人(eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York；Hames and Higgins(eds)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(ed)，1991，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press，Oxford。
本发明还涉及具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此，本发明的其它核酸序列可以从SEQ ID NO：1衍生，与其不同之处在于添加、取代、插入或缺失单个或两个或多个核苷酸，但仍然编码具有期望的性能特征的多肽。
本发明还包括包含“沉默”突变的那些核酸序列，或与具体提及的序列相比基于特定来源生物体或宿主生物体的密码子选择而改变的那些核酸序列，及其天然产生的变体，例如剪接变体或等位基因变体。
本发明还涉及可通过保守核苷酸取代(即，所讨论的氨基酸被具有相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸替换)获得的序列。
本发明还涉及由于序列多态性而衍生自具体公开的核酸的分子。作为天然变异的结果，这些遗传多态性可存在于群体内的个体之间。这些天然变异通常导致基因的核苷酸序列1至5％的变异。
本发明核酸序列的衍生物例如指等位基因变体，在衍生的氨基酸水平上，其在整个序列区域上至少40％，优选至少60％，极其优选至少80、85、90、93、95或98％同源(关于氨基酸水平上的同源性，读者可参见以上与多肽有关的讨论)。有利的是，同源性可以在序列的亚区域上较高。
此外，衍生物也指本发明核酸序列的同源物，例如真菌或细菌同源物、截短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如在DNA水平上，它们在所述整个DNA区域上至少40％，优选至少60％，尤其优选至少70％，极其优选至少80％同源。
此外，衍生物例如指与启动子的融合物。位于所述核苷酸上游的启动子可以由一个或多个核苷酸替代、插入、倒位和/或缺失而改变，但是不损害启动子的功能和有效性。另外，所述启动子的有效性可以通过改变其序列而增加，或启动子可以被活性更高的启动子完全替代，包括来自其它生物体的那些。
衍生物也指这样的变体，其起始密码子上游-1至-1000碱基区域或终止密码子下游0至1000碱基区域的核苷酸序列被改变，以便改变，优选增加基因表达和/或蛋白表达。
本发明还包括在“严格条件”下与上述编码序列杂交的核酸序列。这些多核苷酸可通过筛选基因组库或cDNA库而找到，并且，若合适的话，使用适合的引物通过PCR从其扩增并随后例如使用合适的探针分离。此外，本发明的多核苷酸也可以化学合成。这种性能指多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下与几乎互补的序列结合的能力，其中在这些条件下，不会形成非互补配偶体之间的非特异性键。为此，所述序列应该70-100％，优选90-100％互补。互补序列能够彼此特异结合的性能例如用在Northern或Southern印迹技术中，或用于PCR或RT-PCR中的引物结合。至少30碱基对长的寡核苷酸通常用于这个目的。例如在Northern印迹技术中，严格条件指使用50-70℃，优选60-65℃的洗涤溶液，例如含有0.1％SDS的0.1x SSC缓冲液(20x SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)用于洗脱非特异性杂交的cDNA探针或寡核苷酸。如上所述，仅保持彼此结合的核酸为高度互补的那些。严格条件的建立是技术人员已知的，并例如描述在Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。
E.本发明构建体的实施方案
本发明还涉及包含位于调节核酸序列遗传控制下的编码本发明多肽的核酸序列的表达构建体；还涉及包含至少一种这些表达构建体的载体。
本发明的这类构建体优选包含特定编码序列的5’-上游启动子和3’-下游终止子序列，以及若合适的话，还有其它的常规调节元件，它们在各种情况下都可操作地与编码序列连接。
“可操作的连接”指启动子、编码序列、终止子以及合适的话其它调节元件的序列排列为这样的方式，即每种调节元件能够完成其在表达编码序列中的所需功能。可操作连接的序列的实例为导向序列以及增强子、聚腺苷酸化信号等。其它的调节元件包括选择标记物、扩增信号、复制起点等。适合的调节序列例如描述在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。
本发明核酸构建体尤其指其中用于本发明脱氢酶的基因可操作地或功能性地连接至一种或多种调节信号，以便调节，例如增加该基因的表达的那些。
除了这些调节序列之外，这些序列的天然调节仍可存在于实际结构基因的上游，并且若合适的话，可已经遗传改变以使得天然调节关闭且基因表达增加。但是，核酸构建体还可以具有更简单的设计，即在编码序列的上游没有插入额外的调节信号并且天然启动子连同其调节作用未被除掉。作为替代，使天然调节序列突变，以便不再有任何调节作用且基因的表达增加。
有利的是，优选的核酸构建体也包含一种或多种以前提及的增强子序列，其功能性地连接于启动子并使核酸序列的表达增加。其它有利的序列如其它的调节元件或终止子也可在DNA序列的3’端插入。本发明的核酸可以以一个或多个拷贝存在于构建体中。如果为筛选所述构建体所需，该构建体也可以包含其它的标记物，如抗生素抗性或营养缺陷-补足基因。
对本发明方法有利的调节序列例如包括在启动子中，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-PL启动子，这些启动子有利地用在革兰氏阴性细菌中。其它有利的调节序列例如包括在革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母或真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。就此而言，例如来自异常汉逊酵母(Hansenula)的丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶启动子也是有利的。也可能使用人工启动子来调节。
为了在宿主生物体中表达，有利的是将核酸构建体插入诸如质粒或噬菌体的载体中，其使得基因能够在宿主中最佳表达。除了质粒和噬菌体之外，载体还意味着技术人员已知的任何其它载体，即，例如，诸如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒的病毒，转座子，IS元件，噬粒，粘粒以及线性或环形DNA。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。这些载体构成了本发明进一步的实施方案。适合的质粒的实例为大肠杆菌(E.coli)中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11或pBdCl，链霉菌(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214，棒杆菌(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒为可能的质粒的一小部分。其它质粒为技术人员熟知，例如可在Cloning Vectors(Eds.Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)一书中找到。
为了表达其它存在的基因，有利的是该核酸构建体还包含3’-末端和/或5’-末端调节序列用于增强表达，对其进行选择以基于宿主生物体和所选的基因优化表达。
这些调节序列旨在使基因和蛋白表达能够特异表达。取决于宿主生物体，例如，这可以指仅在诱导后表达或超表达，或者立即表达和/或超表达。
就此而言，所述调节序列或因子可以优选有积极影响并由此增强已导入的基因的表达。因此，调节元件可以通过使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)有利地在转录水平上被增强。但是，除此之外，还可以通过例如改善mRNA的稳定性来增强翻译。
在载体的进一步的实施方案中，所述包含本发明核酸构建体或本发明核酸的载体也可有利地以线性DNA形式引入微生物中，并通过异源或同源重组整合进宿主生物体基因组中。这种线性DNA可由线性化的载体如质粒构成，或仅由本发明的核酸构建体或核酸构成。
为了能够在生物体中最佳表达异源基因，有利的是根据该生物体使用的特定密码子选择来改变核酸序列。该密码子选择能容易地借助计算机分析所关注生物体的其它已知基因而确定。
本发明的表达盒通过将适合的启动子融合到适合的编码核苷酸序列以及终止子信号或聚腺苷酸化信号中而制备。为此目的，使用通用的重组和克隆技术，例如描述在T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular Cloning： A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)以及T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience(1987)中的技术。
为了在适合的宿主生物体中实现表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入能使基因在宿主中优化表达的宿主特异性载体中。载体为技术人员所熟知，可以在“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人，Eds.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。
F.本发明有用的宿主生物体
借助本发明载体或构建体，可以制备例如用至少一种本发明的载体转化的并可以用于产生本发明多肽的重组微生物。有利的是，将本发明的上述重组构建体引入适合的宿主系统并表达。在这一点上，优选使用技术人员已知的常见克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以便使所述核酸在特定的表达系统中表达。适合的系统例如描述在Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等人，Eds.，Wiley Interscience，New York 1997，或Sambrook等人MolecularCloning：A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。
根据本发明，也可以制备同源重组微生物。为此，制备这样的载体，其包含本发明基因或编码序列的至少一部分，若合适的话，其中已引入至少一个氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸取代以便修饰，例如功能上破坏本发明的序列(敲除载体)。所引入的序列也可为来自相关微生物的类似物或源自例如哺乳动物、酵母或昆虫来源。或者，用于同源重组的载体也可以这样设计，以使得在同源重组情况下，内源基因被突变或以其它方式被改变但仍然编码功能性蛋白(例如，上游的调节区可已经改变，以至于内源蛋白的表达由此被改变)。本发明基因的经改变的部分位于同源重组载体中。适合于同源重组的载体的构建例如描述在Thomas，K.R.and Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503中。
适合于本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物体原则上为任何原核或真核生物体。有利地，诸如细菌、真菌或酵母的微生物被用作宿主有机体。有利的是使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌，尤其优选埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、琼脂杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。极其优选大肠杆菌属和种。此外，其它有利的细菌可在α-蛋白细菌，β-蛋白细菌或γ-蛋白细菌中找到。
就此而言，本发明的宿主生物体优选包含在本发明中描述的并且编码本发明具有脱氢酶活性的酶的核酸序列、核酸构建体或载体的至少一种。
取决于宿主生物体，用于本发明方法的生物体以技术人员已知的方式生长或培养。微生物通常在0℃至100℃，优选10℃至60℃温度并且同时通氧气情况下在液体培养基中生长，该培养基包含通常为糖形式的碳源、通常为有机氮形式如酵母提取物，或盐形式如硫酸铵的氮源，微量元素如铁盐、锰盐、镁盐，以及若合适的话，还有维生素。就此而言，营养液的pH可以保持或不保持在固定值，即在培养过程中可以调节或不调节。培养可以是分批、半分批或连续进行。营养物可以在发酵开始时引入或以半连续或连续方式随后供入。酮可以直接加入到培养物中，或有利地在培养后加入。酶可以通过使用实施例中描述的方法从生物体中分离，或作为粗提取物用于所述反应。
G.本发明的多肽的重组制备
本发明还涉及重组制备本发明多肽或其功能性的生物活性片段的方法，其中培养产生多肽的微生物，若合适的话，诱导多肽的表达并从培养物分离所述多肽。若需要的话，所述多肽也可以以此方式以工业规模生产。
重组生物体也可通过已知方法培养和发酵。细菌例如可以在20至40℃的温度和6至9的pH下在TB培养基或LB培养基中增殖。适合的培养条件例如详细描述在T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)中。
如果多肽被分泌进培养基中，则随后使细胞破裂并通过已知的蛋白分离方法从裂解液中获得产物。细胞可以根据需要通过高频超声，通过例如在弗氏压碎器中的高压，通过渗透压，通过去垢剂、水解酶或有机溶剂的作用，通过使用匀浆器或通过以上列出的两种或更多种方法的组合来破裂。
多肽可以使用已知的层析方法，例如分子筛层析(凝胶过滤)，如QSepharose层析，离子交换层析和疏水层析来纯化，也可使用其它的常规方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳来纯化。适合的方法例如描述在Cooper，T.G.，Biochemische Arbeitsmethoden [原称：The toolsof biochemistry]，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中。
可以有利地通过使用载体系统或寡核苷酸来分离重组蛋白，该载体系统或寡核苷酸通过特定核苷酸序列来延伸cDNA，由此编码经改变的多肽或融合蛋白，它们用于例如简化纯化过程。这种类型的适合的修饰例如为用作锚的“标签”，例如称为六组氨酸锚的修饰，或可被抗体作为抗原识别的表位(例如描述在Harlow，E.and Lane，D.，1988，Antibodies：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)。这些锚可以用于将蛋白附着到固体支持物，如聚合物基质(其例如可被包装进层析柱中)，或附着到微量滴定板或其它支持物。
同时，这些锚也可以用于鉴别蛋白。所述蛋白也可以通过使用常规标记物如荧光染料、在与底物反应后形成可检测反应产物的酶标记物或放射性标记物来鉴别，它们单独使用或与锚结合使用来衍生所述蛋白。
H.实施本发明的方法来制备(S)-烷醇
根据本发明使用的具有脱氢酶活性的酶可以在本发明方法中作为游离或固定化酶使用。
有利的是，本发明的方法在0-95℃的温度下，优选在10-85℃的温度下，尤其优选在15-75℃的温度下进行。
在本发明方法中，有利的是pH保持在pH4至12，优选pH4.5至9，尤其优选pH5至8。
在本发明的方法中，对映体纯或手性产物或旋光醇指表现出对映体富集的对映体。在该方法中优选实现至少70％ee，优选至少80％ee，尤其优选至少90％ee，极其优选至少98％ee的对映体纯。
本发明的方法可以使用包含本发明的核酸、核酸构建体或载体的生长的细胞。也可以使用静息细胞或破裂细胞。破裂细胞指例如已经通过用例如溶剂处理而变得通透的细胞，或通过酶处理、通过机械处理(例如弗氏压碎或超声处理)或通过其它方法而破碎的细胞。以此方式获得的粗提取物有利地适用于本发明的方法。本方法还可以使用纯化或部分纯化的酶。有利地应用在反应中的固定化微生物或酶也是合适的。
当用于本发明的方法时，在提取前方便地移除游离生物体或酶，例如通过过滤或离心。
在本发明方法中产生的产物，例如(1S)-3-甲基氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇可有利地通过萃取或蒸馏从含水反应溶液获得。为了增加收率，该萃取可以重复数次。适合的萃取剂的实例为诸如甲苯、二氯甲烷、醋酸丁酯、二异丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯的溶剂，但不限于这些。
或者，在本发明方法中产生的产物，例如(1S)-3-甲基氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇可有利地通过萃取或蒸馏或/和结晶从反应溶液的有机相获得。为了增加收率，该萃取可以重复数次。适合的萃取剂的实例为诸如甲苯、二氯甲烷、醋酸丁酯、二异丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯的溶剂，但不限于这些。
在浓缩有机相之后，通常可获得具有良好化学纯度，即高于80％的化学纯度的产物。但是，在萃取后，含有该产物的有机相也可仅部分浓缩并可以结晶产物。为此，有利的是将溶液冷却到0℃至10℃的温度。该结晶也可直接从有机溶液或从水溶液进行。结晶的产物可再悬浮于相同或不同溶剂中以重新结晶和再结晶。如果必要，随后的至少进行一次的有利的结晶可以进一步增加产物的对映体纯度。
上述的后处理类型使得本发明方法的产物以60至100％、优选80至100％、尤其优选90至100％的收率(基于用于该反应的底物，例如3-甲基氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-酮)分离。分离的产物特征在于＞90％，优选＞95％，尤其优选＞98％的高化学纯度。此外，产物具有高的对映体纯度，若合适的话，其可通过结晶有利地进一步增加。
本发明的方法可分批、半分批或连续操作。
所述方法可以方便地在例如在Biotechnology，第3卷，第2版，Rehm等人Eds.，(1993)中，尤其是第二章所描述的生物反应器中进行。
以上的说明和以下的实施例仅用于解释本发明。本发明也包括多种可能的改进，这对技术人员而言是显而易见的。
本发明方法的优点在于式(I)的旋光烷醇的特别高的收率和烷酮(II)的基本上定量的转化。
实验部分：
实施例1：借助合成的寡核苷酸克隆固氮弓菌属物种EbN1苯乙醇脱氢酶
固氮弓菌属物种EbN1苯乙醇脱氢酶的基因序列已保存在数据库(Genbank ID 25956124，区域：25073至25822)中。通过已知方法从其合成所述基因的寡核苷酸衍生自苯乙醇脱氢酶基因的核酸序列。表1总结了所述寡核苷酸的DNA序列。图3表明了各个寡核苷酸相对于整个固氮弓菌属物种EbN1苯乙醇脱氢酶基因的位置。制备合成基因的方法已描述在例如Y.P.Shi，P.Das，B.Holloway，V.Udhayakumar，J.E.Tongren，F.Candal，S.Biswas，R.Ahmad，S.E.Hasnain and A.A.Lal，Vaccine 2000，18，第2902-2914页中。所得到的序列与发表的序列相同。
将PCR产物用限制性内切核酸酶NdeI和BamHI消化并克隆进已经相应消化的pDHE19.2载体(DE19848129)中。将连接混合物转化进大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。将pDHEEbN1质粒转化进大肠杆菌菌株TG10pAgro4 pHSG575(TG10：大肠杆菌TG1的RhaA-衍生物(Stratagene)；pAgro4：Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gene 61，63-74；pHSG575：T.Tomoyasu等人，(2001)，Mol.Microbiol. 40(2)，397-413)。
将重组的大肠杆菌称为大肠杆菌LU 11558。
表1
用于制备固氮弓菌属物种EbN1苯乙醇脱氢酶的合成基因的寡核苷酸
#1  GAGCGATTTGCGGTCGAAGGTGCCGACATCGCAATCGCGGATCTGGTGCCGGCCCCGGAAGCCGAGGCAGCAATCAGGAACCTCGGTCGGCGCGT
#2  GCACCTTCGACCGCAAATCGCTCCGCAATTGCCCGCCCGATGCCGTTGGCACCGCCGGTAATTACTGCAAGCTTGTCCTTCAGTCTTTGCGTCAT
#3  AAACGTGGAGATGACCTGCTTTCCGAATGCTTCTACGTCGCCAGGTTGCGAGACATCGCACTTCACGGTCAGAACGCGCCGACCGAGGTTCCTGA
#4  GGACCTGGGGAAGGACGGAATCACTGTTAACGCCATCGCGCCGAGCCTTGTCCGCACGGCAACAACCGAAGCTTCTGCATTGTCCGCGATGTTCGAC
#5  GAAAGCAGGTCATCTCCACGTTTGGTCGCTGCGACATCCTCGTCAACAACGCGGGAAT
 TTACCCGCTGATTCCTTTTGACGAGCTGACCTTTGAAC
#6  AGGAACGCAGCTGCGCCCGTCAGATCCAGGGGCACCTGAAGACGCGGAATCGCCTGAAGCATGTTTGGCAGCACGTCGAACATCGCGGACAATGCAG
#7  GATTCCGTCCTTCCCCAGGTCCGAGGCAAGGGCGCGGGTAAAGCCTATGTTTGCCGCTTTCGTGCTGATGTAATGGGTATACGCCTCGATCTTTAGC
#8  GAAGGCTTTTGTCCCCGGGATGAAGAGGAACGGGTGGGGACGCATCATCAACCTGACTTCGACGACATATTGGCTAAAGATCGAGGCGTATACCC
#9  CATCCCGGGGACAAAAGCCTTCGCCATAAGAAAACCTGAATCGACGTTGATCTCGAATGTTTTCTTCCACTGTTCAAAGGTCAGCTCGTCAAAAG
#10  GACGGGCGCAGCTGCGTTCCTGGCTTCCGATGACGCCAGTTTTATTACAGGCCAGACGCTCGCGGTTGATGGCGGTATGGTGAGACACTGA
#11  TCAGTGTCTCACCATACCGCCATC
#12  ATGACGCAAAGACTGAAGGACAAG
实施例2：借助PCR克隆固氮弓菌属物种EbN1苯乙醇脱氢酶
固氮弓菌属物种EbN1苯乙醇脱氢酶的基因序列已保存在数据库(Genbank ID 25956124，区域：25073至25822)中。寡核苷酸(引物MKe0387和MKe0388)衍生自苯乙醇脱氢酶基因的核酸序列，其用于借助如下PCR扩增来克隆该脱氢酶基因。
PCR：
模板  引物 产物长度
来自固氮弓菌属物种EbN1的亚克隆DNA或来自固氮弓菌属物种EbN1的染色体DNA  MKe0387和MKe0388 约750bp
引物：
引物编号  序列(5′-＞3′)  位置
MKe0387  GGGAATTCCATATGACGCAAAGACTGAAGG N-末端引物
Mke0388  CGCGGATCCTCAGTGTCTCACCATACCGCC C-末端引物
将等摩尔量(各130ng)的引物MKe0387和MKe0388混合。使用PfuTurbo聚合酶(Roche Applied Science)和以下的温度梯度程序按照标准Stratagene方案进行PCR：95℃ 5min；95℃ 45sec，55℃ 45sec，以及72℃ 1min，30循环；72℃ 10min.；10℃，直至使用。通过琼脂糖凝胶电泳(1.2％E-Gel，Invitrogen)和柱层析(GFX试剂盒，Amersham Pharmacia)分离PCR产物(～0.75kB)，随后测序(测序引物：MKe0387和MKe0388)。所得到的序列与发表的序列相同。将PCR产物用限制性内切核酸酶NdeI和BamHI消化并克隆进也已经相应地消化的pDHE19.2载体(DE19848129)。将连接混合物转化进大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。以此方式获得的质粒pDHEEbN1中的插入为SEQ ID NO：1中显示的核酸序列，其中该插入通过对对应的克隆测序来揭示。
将pDHEEbN1质粒转化进大肠杆菌菌株TG10 pAgro4 pHSG575(TG10：大肠杆菌TG1的RhaA-衍生物(Stratagene)；pAgro4：Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gene 61，63-74；pHSG575：T.Tomoyasu等人(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。
将重组的大肠杆菌称为大肠杆菌LU 11558。
实施例3：大肠杆菌LU 11558重组苯乙醇脱氢酶的提供
在37℃下将大肠杆菌LU 11558在100ml锥形瓶(挡板)中在20ml的LB-Amp/Spec/Cm(100μg/L氨苄西林；100μg/L大观霉素；20μg/L氯霉素)、0.1mM IPTG、0.5g/L鼠李糖中培养18h，以5000*g离心10min，用10mM TRIS*HCl，pH7.0洗涤一次并在2ml相同缓冲液中再悬浮。
通过用0.7ml的玻璃珠(d＝0.5mm)在振动磨中将大肠杆菌LU 11558细胞浆破裂(3×5min，在冰上中间冷却)来制备无细胞的蛋白粗提取物。
实施例4：大肠杆菌LU 11558重组脱氢酶活性的测定
在每种情况下，将6种转化体在37℃下在100ml锥形瓶(挡板)中在20ml的LBAmp/Spec/Cm(100μg/L Amp；100μg/L Spec；20μg/L Cm)、0.1mM IPTG、0.5g/L鼠李糖中培养18h，以5000*g离心10min，用10mMTRIS/HCl，pH 7.0洗涤一次并在2ml相同缓冲液中再悬浮。将100ml的细胞悬浮液在摇动下在900μl含有50μl/ml葡萄糖DH、100mM葡萄糖、100mM NaCl、1mM NADH、1mM NADPH的50mM MES pH 6以及10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮中孵育20分钟。反应混合物以类似于实施例4的方式进行分析。平均而言，产生了0.13mM的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，对应于6.6U/L的培养悬浮液活性。在含有已通过用0.7ml的玻璃珠(d＝0.5mm)在振动磨中使细胞破裂(3×5min，在冰上中间冷却)获得的粗提取物的类似反应混合物中，测量到0.21mM的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，对应于10.7U/L的活性。在培养过程中没有添加鼠李糖的对照实验中，没有检测到3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
实施例5：分析3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
可通过HPLC测定3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的浓度。取决于对固定相和流动相的选择，除了浓度以外也可测定ee值。
a)非手性分析
使用以下系统来定量反应：
固定相：Chromoltih SpeedROD RP18，50*4，6μm，Merck(Darmstadt，Germany)，加热至45℃
流动相：洗脱液A：10mM KH2PO4，pH2.5洗脱液B：乙腈梯度：0-0.5min，35％B；0.5-1.0min 35至80％B；1.0-1.2min 80％B；1.2-1.3min 80％-35％ B；1.3-2.0min35％B；
流速：  1.5 ml/min
检测：  230和260nm的UV检测
停留时间：3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮：约1.6min3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇：约1.3min
使用可靠材料生成校正系列，基于此可确定未知样品的浓度。
b)手性分析
固定相：Chiracel OD-H，250*4，6μm，Daicel，加热至40℃
流动相：洗脱液A：正己烷
洗脱液B：异丙醇
无梯度，2.5％B
流速：1.0ml/min
检测：230和260nm的UV检测
停留时间：3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮：约9.5min
(1S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇：约16.6min
(1R)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇：约18.3min
使用可靠材料生成校正系列，基于此可确定未知样品的浓度。
实施例6：大肠杆菌LU 11558重组脱氢酶活性的测定
在每种情况下，将6种大肠杆菌LU 11558转化体在37℃下在100ml锥形瓶(挡板)中在20ml的LBAmp/Spec/Cm(100μg/L Amp；50μg/LSpec；10μg/L Cm)、0.1mM IPTG、0.5g/L鼠李糖中培养18h，以5000*g离心10min，用10mM TRIS/HCl，pH7.0洗涤一次并在2ml相同缓冲液中再悬浮。将100ml的细胞悬浮液在摇动下在900μl含有50μl/ml葡萄糖DH、100mM葡萄糖、100mM NaCl、1mM NADH、1mM NADPH的50mM MES pH6以及10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮中孵育20分钟。反应混合物以类似于实施例4的方式进行分析。平均而言，产生了0.13mM的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，对应于6.6U/L的培养悬浮液活性。在含有已通过用0.7ml的玻璃珠(d＝0.5mm)在振动磨中使细胞破裂(3×5min，在冰上中间冷却)获得的粗提取物的类似反应混合物中，测量到0.21mM的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇，对应于10.7U/L的活性。在培养过程中没有添加鼠李糖的对照实验中，没有检测到3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
实施例7：使用重组固氮弓菌属物种EbN1脱氢酶以及2-戊醇制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在0.75L反应器中，在250rpm和40℃下将大肠杆菌LU 11558静息细胞(1-20g/L生物量)与0.2mM NAD+和185mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(12.5ml)在221ml的50mM KH2PO4和250ml的2-戊醇中搅拌。通过用5M NaOH滴定将反应保持在pH5.5。通过HPLC分析监测反应，直至在有机相中TACA浓度为50-350mM。
实施例8：使用重组固氮弓菌属物种EbN1脱氢酶以及2-戊醇制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在4L反应器中，在250rpm和40℃下将大肠杆菌LU 11558静息细胞(1-20g/L生物量)与0.2mM NAD+和370mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(200ml)在1432ml的50mM KH2PO4和2000ml的2-戊醇中搅拌。通过用5M NaOH滴定将反应保持在pH5.5。通过HPLC分析监测反应，直至在有机相中TACA浓度为100-650mM。
实施例9：使用重组固氮弓菌属物种EbN1脱氢酶以及2-戊醇制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在4L反应器中，在250rpm和40℃下将大肠杆菌LU 11558静息细胞(1-20g/L生物量)与0.2mM NAD+和370mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(200ml)在1432ml的50mM KH2PO4和2000ml的2-戊醇中搅拌。通过用5M NaOH滴定将反应保持在pH5.5。应用约85毫巴的真空和50-70℃的夹套温度。在反应过程中连续地再引入以2-10ml/min的蒸馏速率获得的水和2-戊醇蒸馏物量。通过HPLC分析监测反应，直至在有机相中TACA浓度为300-700mM。除了0-30％的剩余部分外，3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮反应。
实施例10：使用重组固氮弓菌属物种EbN1脱氢酶以及2-戊醇制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在0.75L反应器中，在250rpm和40℃下将大肠杆菌LU 11558静息细胞(1-20g/L生物量)与0.2mM NAD+和200mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(12.5ml)在221ml的50mM KH2PO4和250ml的2-戊醇中搅拌。通过用5M NaOH滴定将反应保持在pH5.5。通过HPLC分析监测反应，直至在有机相中TACA浓度为50-320mM。

Claims (13)

1.一种制备式I的旋光烷醇的方法：
Figure S2006800155881C00011
其中
n为0至5的整数；
A为任选取代的支化或未支化的C1-C6烷基或“Cyc”基团，
Cyc为任选取代的单或多环的、饱和或不饱和的碳环或杂环，以及
R1为卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-，其中R2、R3和R4彼此独立地为氢或低级烷基或低级烷氧基，且X-为抗衡离子，
所述方法包括在包含式II的烷酮的介质中：
Figure S2006800155881C00012
其中n、A和R1如上所定义，
使选自脱氢酶、醛还原酶和羰基还原酶类的酶在还原等价物存在下孵育，其中式II的化合物酶催还原得到式I的化合物，并且在反应中消耗的还原等价物通过借助酶(E)使供体醇反应获得对应的供体酮而再生，并且所述供体酮从反应介质中至少部分地移除，以及分离所形成的产物(I)。
2.根据权利要求1的方法，其中所述酶(E)为醇脱氢酶。
3.根据权利要求1的方法，其中所述酶(E)具有多肽序列：
(i)SEQ ID NO：2或
(ii)与SEQ ID NO：2相比，其中至多25％的氨基酸残基已通过缺失、插入、取代或其组合而改变，并且其保留了SEQ ID NO：2酶活性的至少50％。
4.根据权利要求1的方法，用于制备式III的1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的衍生物：
Figure S2006800155881C00021
其中R1＝Cl或NHCH3，
其中，在包含式IV的1-(2-噻吩基)丙酮的衍生物的介质中：
Figure S2006800155881C00022
将该化合物酶催还原得到式III的化合物，并且分离所形成的基本上对映体纯的产物。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶选自固氮弓菌属的微生物的酶。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶由根据SEQ IDNO：1的核酸序列或其功能等价物编码。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所使用的供体醇为2-戊醇。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在反应过程中从供体醇形成的供体酮通过蒸馏从所述反应介质中至少部分地移除。
9.根据权利要求8的方法，其中所述供体酮在反应过程中通过蒸馏从酶反应器中移除。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述式II的化合物在选自肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、乳杆菌科、链霉菌科、红球菌科和诺卡氏菌科细菌的微生物存在下反应。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物为已用编码根据权利要求1-3中任一项的定义的酶的核酸构建体转化的重组微生物。
12.具有如下多肽序列的酶(E)在制备式I或III的化合物中的用途：
i SEQ ID NO：2或
ii与SEQ ID NO：2相比，其中至多25％的氨基酸残基已通过缺失、插入、取代或其组合而改变，并且其保留了SEQ ID NO：2酶活性的至少50％。
13.根据权利要求12的用途，用于制备度洛西汀的方法中。
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