CN102159719B - 使用aromatoleum aromaticum ebn1(固氮弧菌属物种ebn1)的醇脱氢酶生产l-去氧肾上腺素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产取代的光活性醇的多阶段方法，包括酶催化的合成步骤，特别是由醇脱氢酶所催化的合成步骤。本发明的方法尤其适合生产去氧肾上腺素，即3-[(1R)-1-羟基-2-甲氨基-乙基]-酚。

Description

使用AROMATOLEUM AROMATICUM EBN1(固氮弧菌属物种EBN1)的醇脱氢酶生产L-去氧肾上腺素的方法
本发明涉及生产取代的光活性醇的多阶段方法，包括酶催化的合成步骤，特别是由醇脱氢酶所催化。本发明的方法尤其适合生产去氧肾上腺素，即3-[(1R)-1-羟基-2-甲氨基-乙基]-酚。
发明背景
去氧肾上腺素是拟交感类中的药理学活性物质并且拥有对α1-肾上腺素能受体的激动剂活性。除了丢失3-羟基外，它在结构上与肾上腺素相同并且主要可用作局部血管收缩剂。作为鼻滴液的活性物质，去氧肾上腺素因此对粘膜具有解充血药的作用。在眼药水中，它也具有散瞳作用，因此造成瞳孔放大。
已在文献中描述了去氧肾上腺素的生产。除了生产象外消旋物一样的想要产物然后用适当的手性辅助试剂进行切割将它转变成产物的多种方法以外，认为立体选择性合成的方法是优选的，因为它随后能够避免所得到的50％的不正确对映体的不经济破坏。
从现有技术中已知的生产L-去氧肾上腺素盐酸盐的方法包括根据Tetrahedron Letters 30(1989),367-370或Chem.Pharm.Bull.43(5)(1995)738-747对前手性N-苄基-N-甲基-2-氨基-m-苄氧基苯乙酮盐酸盐的不对称氢化作用。
Achiwa等人在Tetrahedron Letters 30(1989),367-370中描述了3-苄氧基-2-(N-苄基-N-甲基)-氨基苯乙酮盐酸盐作为底物与氢在催化剂[Rh(COD)Cl]2/(2R,4R)-4-(二环己基膦)-2-(二苯基膦-甲基)-N-甲基-氨基吡咯烷存在下的不对称氢化作用。通过蒸发对反应混合物过滤并浓缩后立即切割苄基氮保护基团并且获得去氧肾上腺素作为产物。D-对映体作为杂质以至少7.5％(85％ ee)的比例与L-对映体一起生产。对于该反应，催化剂必须以相对于底物为1:2000的摩尔比来使用。这一方法的缺点实质上是所获得的需要用作药物产品的L-去氧肾上腺素不能经济地纯化为至少98％ee的纯度。
在Chem.Pharm.Bull.43(5)(1995)738-747中，说明了约1000:1的底物与催化剂的摩尔比对于不对称氢化作用是优选的。然而，尽管在不对称反应步骤中使用了相当大量的催化剂，但是没有昂贵的纯化过程就不能以足够的纯度将产物生产为用于药物目的的L-对映体，而只可以获得具有相对高比例的D-对映体作为杂质的混合物产物。对于工业规模的L-去氧肾上腺素的生产，将近20小时的相对长的不对称氢化作用步骤的反应时间也代表了对于设备而言昂贵且耗时的反应步骤，且不能忽视安全性风险。
WO 00/43345中描述的方法满足了经济上有意义地生产L-去氧肾上腺素盐酸盐所述的一些条件，但是其也仍旧需要使用保护基团，以致该方法变得不很经济。此外，即使根据这一方法，但是在立体选择步骤中，只获得93％ee的想要的产物，以致再一次必须在这之后进行昂贵的纯化。
发明简要说明
因此，本发明要解决的问题是提供生产光活性醇，如L-去氧肾上腺素的新方法，该方法可以比现有技术更加经济地进行。特别地，所述改进方法将不需要使用保护基团并且将会拥有高的立体选择性。
出人意料地，上述问题可以通过提供根据所附专利权利要求生产式IV的取代的光活性醇的方法来解决。
基于此，本发明尤其使得生产活性物质去氧肾上腺素(3-[(1R)-1-羟基-2-甲氨基-乙基]-酚；4)的出乎意料地有益的方法成为可能。这一优选的实施方式可以由下面的反应方案来表示：
方案1：
这之中的两个关键步骤之一是3'-羟基苯乙酮(3-HAP,1)的选择性侧链氯化成3'-羟基-2-氯苯乙酮(HCAP,2)。
第二个关键步骤涉及HCAP(2)对映选择性还原成(R)-3-(2-氯-1-羟乙基)-酚(HCPE,3)，特别是使用酶，即醇脱氢酶(ADH)。
本发明提供的方法与上面讨论的现有技术的一些基本点显著不同。
因此，不需要使用保护基团就实现了整个合成，使得该方法比现有技术更加经济。这是出人意料且超乎预期的，特别是对于第一阶段。
脱氢酶作为氢化作用催化剂的应用提供了得到高光学纯度的(R)-3-(2-氯-1-羟乙基)-酚(HCPE,3)的经济途径。并未形成显著量的不想要的对映体(想要的对映体的％ee值在>98％的范围，例如>99％高至约100％，例如高至约99.9％)。
此外，反应可以(不限于此)在有机溶剂和水的两相体系中进行，这更允许更加经济的操作。于是酮向想要的醇的完全转化是可能的。因为通过提取从催化剂残基(蛋白质)分离产物，所以混合物的进一步处理会由于它的两相性质而是特别有利的。此外，有机相的使用减少了生物催化剂向低分子量酚酮的暴露，使得防止了催化剂的失活和/或抑制。
附图说明
图1示出来自(固氮弧菌属物种(Azoarcus sp))Aromatoleumaromaticum EbN1的苯基-乙醇脱氢酶的核酸序列和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO:1和2)。
发明详细说明
1.优选实施方式
本发明的第一个方面涉及生产式IV的取代的光活性醇或者其盐，例如特别是无机酸(如HCl)的酸加成盐的方法，在各种情形下，该光活性醇或者其盐以在立体异构体方面为纯的形式(例如(R)或(S)形式)，或者为立体异构体的混合物(例如外消旋物)，
其中
Cyc代表单环或多环，特别是单环、4-7元，特别是5-或6-元，饱和或不饱和的，特别是不饱和的，主要是芳香的、碳环的或杂环的，特别是碳环的环，其具有至少一个游离羟基，并且任选地被取代一次或多次，并且在6元环的情形下，羟基尤其是在具有氨基的Cyc的侧链的间位上；以及
R1和R2彼此独立地代表H或者相同或不同的烷基，其任选被取代一或多次；
其中
a)Cyc具有上面规定含义的式I
的酮是卤代的，例如特别是氯化的，在特别是脂肪醇存在下，并且尤其是与磺酰氯反应得到式II的卤代的，特别是氯化的化合物
其中Cyc具有上面规定的含义并且Hal代表卤素原子，例如F、Br或者特别是Cl；
b)生成的式II的化合物任选在在先的分离或富集后，被酶促还原为式III的醇
其中Cyc和Hal具有上面规定的含义；和
c)生成的式III的醇任选在在先的分离或富集后与式HNR1R2的胺反应得到式IV的化合物，其中R1和R2具有上面规定的含义，并且任选地，这些从反应混合物中分离，任选地以在立体异构体方面为纯的形式。
用于合成的上式I的酮是本身已知的化合物并且可以使用通常已知的有机合成方法来获得。
特别地，在阶段a)中的反应在每摩尔式I的酮中存在1至10、2至8或3至5摩尔当量的脂肪醇的条件下发生。
适当的脂肪醇特别是具有1至6，特别是1至4个碳原子，和1至5，特别是1至3个羟基的一元醇或多元醇，特别是具有1至4个碳原子的一元醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇；或更长链的一元醇，例如正戊醇和正己醇，或多元醇，如丙二醇、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇或1,3,5戊三醇；和所述醇的异构形式。
在阶段c)中的化学反应特别可以在开链或环醚的溶液中发生。适当的醚特别是MTBE、甲基-THF、二噁烷并且特别是THF。
特别地，本发明的阶段b)的反应是由选自醇脱氢酶(ADH)(E.C.1.1.1.1)的至少一种酶来催化的。
ADH例如选自来自Aromatoleum(固氮弧菌属(Azoarcus))属的微生物，特别是来自细菌Aromatoleum aromaticum EbN1的脱氢酶。
例如进行阶段b)的酶选自具有选自下述多肽序列的酶：
(i)SEQ ID NO:2或
(ii)相对于SEQ ID NO:1，至多25％，例如1至24％、2至20％、3至15％或4至10％的氨基酸残基通过添加、缺失、插入、置换、倒位或它们的组合而改变的序列，和/或仍旧具有SEQ ID NO:2的酶的酶促活性的至少50％，例如至少60、70、80、90、95、96、97、98、99、100或大于100％，例如1至20倍，或2至10倍或3至5倍的活性的序列。
根据另一实施方式，阶段b)中的反应随添加还原等效物，特别是NADH或NADPH，并且任选地同时或者随时间迁移而使反应中消耗的还原等效物再生来发生。
为此，再生可以以本身已知的方式而酶促地、电化学地或电酶促地发生(Biotechnology Progress,2005,21,1192；Biocatalysis andBiotransformation,2004,22,89；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2001,40,169；Biotechnol Bioeng,2006,96,18；Biotechnol Adv.,2007,25,369；Angew.Chem.Int.Ed.Engl,2008,47,2275；Current Opinion in Biotechnology,2003,14,421；Current Opinion in Biotechnology,2003,14,583)。特别地，再生酶促地发生，并且再生酶选自ADH(EC.1.1.1.1)和与ADH不同的脱氢酶，例如特别是葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)、甲酸盐脱氢酶(EC 1.2.1.2或EC 1.2.1.43)、和亚磷酸盐脱氢酶(EC 1.20.1.1)并且优选在所谓的“牺牲醇(sacrificial alcohol)”例如丁烷-或戊烷-2-醇存在下，它在还原等效物的酶促再生中被消耗，即被氧化。
特别地，阶段b)中的反应可以在天然地或重组地表达ADH的微生物存在下，或者在含有源自该微生物(即获自细胞，或获自该细胞的细胞提取物)的ADH的部分存在下，或者在纯的或基本纯的酶存在下发生。此外，本发明使用的酶(以纯的形式、以富集的形式、或者作为含酶细胞提取物)以本身已知的方式被使用、溶解、分散或在支持物上固定化。
例如，阶段b)中的反应在选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、红球菌科(Rhodococcaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)和诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌的微生物存在下，或者在源自它们的部分或提取物存在下发生。适当的属的实例特别包括埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和芽孢杆菌属(Bacillus)。适当的物种的实例特别是大肠杆菌。
特别地，微生物可以是转化有编码上述定义的ADH的核酸构建体的重组微生物。任选地，所用的重组微生物可以另外表达不同于上述定义的ADH的外源或内源脱氢酶以支持辅因子再生。
在另一实施方式中，阶段b)中的反应可以在两相液态反应介质中进行。为此，例如，使用水性-有机反应介质，式II的离析物和式III的产物在有机相中比在水相中更加可溶解，例如水相-醚相(aqueous-ethereal phase)，或者例如水/庚烷和水/己烷相。
本发明的另一目的涉及生产通式II的化合物的方法，
其中Cyc和Hal具有上面规定的含义，
其中Cyc具有上面规定含义的式I
的酮是卤代的，例如特别是氯化的，特别是在脂肪醇存在下，与适当的卤化剂例如特别是磺酰氯反应得到式II的卤代的，特别是氯化的化合物。
在阶段a)中的反应特别是在每摩尔式I的酮中存在1至10，例如2至8或3至5摩尔当量的醇的条件下发生。
本发明的另一目的涉及生产式III的化合物的方法
其中Cyc和Hal具有上面规定的含义；其中Cyc和Hal具有上面规定含义的通式II的化合物被酶促还原为式III的醇。这期间，按上面的限定进行酶促反应。
根据本发明，Cyc尤其代表单环、碳环或杂环4-、5-或6-元芳香环，具有至少一个HO-基团，例如特别是3-羟苯基。Hal尤其代表氯原子。
本发明的另一目的涉及上述定义的醇脱氢酶或者上述定义生产这一酶的微生物在生产式III或IV的化合物，特别是生产(3-[(1R)-1-羟基-2-甲氨基-乙基]-酚)中的应用。
2.定义
2.1  通用术语
除非另有声明，否则应用下面的通用含义：
根据本发明，“光活性的”是分子中具有至少一个不对称中心的化合物。
根据本发明，“游离羟基”指非衍生的形式(例如作为酯或醚基团)的羟基。
根据本发明，术语“在立体异构体方面为纯的或在对映体方面为纯的产物”例如(3-[(1R)-1-羟基-2-甲氨基-乙基]-酚或(R)-3-(2-氯-1-羟乙基)-酚指展示对映体富集的对映体。特别地，在本发明的方法中，获得了至少90％ee，优选至少95％ee，尤其优选至少98％33，并且非常尤其优选至少99％ee或更多的对映体纯度。
“对映体纯度”由下述参数定义
ee％＝[XA-XB]/[XA+XB]＊100，
其中XA和XB代表对映体A和B的摩尔分数。
反应在纯酶、富集酶或整个细胞存在下“酶促地”发生。
2.2  特定化学术语
“单环或多环”残基是包括一或多个环基的残基，并且在多环残基的情况下，所述环基可以直接连在一起或者通过常用的桥基连在一起或者可以彼此缩合。
“碳环”残基唯一地包括环碳原子；“杂环”残基还包括一或多个，例如1、2或3个相同或不同的环杂原子，例如N、O或S。
这些碳环或杂环的环特别包括3至12，优选4、5或6环碳原子。作为实例，可提及环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、其单或多不饱和类似物，例如环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基；和具有1至4个杂原子的5-至7-元饱和或者单或多不饱和杂环残基，它们选自O、N和S，其中杂环可以任选地与另一杂环或碳环缩合。特别可提及源自吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、哒嗪、吡嗪、苯并呋喃、吲哚和喹啉的杂环残基。
适当的“取代基”的非限制性实例选自卤素、OH、-SH、-NO2、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基和芳基。
“卤素”代表氟、氯、溴或碘，特别是氟、溴或氯。
“低级烷基”代表具有1至6个碳原子的线性或分支烷基，例如甲基、乙基、异或正丙基、正，异，仲或叔丁基、正戊基或2-甲基-丁基、正己基、2-甲基-戊基、3-甲基-戊基、2-乙基-丁基。
“低级烯基”代表具有2至6个碳原子的前述烷基的单或多，优选单或双不饱和类似物，其双键位于碳链的任何位置。
“低级烷氧基”代表前述烷基的以氧为末端的类似物。
“芳基”代表单环或多环，优选单环或双环，任选地经取代的芳基，特别是通过任何环位置结合的苯基或萘基，例如1-或2-萘基。这些芳基可以任选地具有1或2个相同或不同的取代基，该取代基选自上面定义的卤素、低级烷基、低级烷氧基或者三氟甲基。
适当的Cyc残基的实例是苯基、萘基、2-噻吩基、3-噻吩基；2-呋喃基、3-呋喃基；2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基；4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-n-丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基；3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基、和4-氯-2-噻吩基，其另外具有至少一个羟基环取代基。
3.本发明的方法的特定实施方式
下面参考前述方案1所示的多阶段反应，解释本发明的进一步的实施方式。基于此，对这一具体描述的方法的修改在本领域技术人员能力范围内。
3.1.3'-羟基苯乙酮的选择性侧链氯化
使用磺酰氯进行酮的α-氯化的原理本身是已知的并且描述于，例如D.P.Wyman等人，J.Organic.Chem.29卷,1964，第1956至1960页。
US 4,310,702和D.Masilamani等人，J.Organic.Chem.,46卷,1981，第4486至4489页报道了使用磺酰氯来氯化酮通常造成单或多氯化酮的混合物并因此造成不想要的副产物。为了解决该问题，该出版物教导了使用醇或醚作为缓和剂。此外，这一出版物教导了酚与磺酰氯的反应，这首先导致相应的磺酸酯然后是多种氯酚。US 5,710,341涉及通过用磺酰氯氯化相应的酮来生产α-氯烷基芳基酮，它也教导了使用脂肪醇来增加对于想要的产物(即单-α-氯化酮)的选择性。
出人意料地，现在发现在US 5,710,341中教导的条件下，有利地用于合成去氧肾上腺素的3-羟基苯乙酮的反应(即氯化反应)几乎完全产生相应的α-氯烷基芳基酮。为了控制选择性，向反应混合物中加入1-10当量的醇(C1-C10)，特别优选使用3和5当量之间的醇。此外，反应是在于该反应条件下为惰性的溶剂中进行，例如不溶于水的芳香物、醚、酯和卤代溶剂。优选地，在酯和卤代溶剂，特别优选在乙酸乙酯或二氯甲烷中进行。
这对于本领域技术人员是出人意料的，因为与D.Masilamani教导的方式类似，预期在分子中存在的酚官能团的反应导致相应氯酚的形成。有益地，可以不使用保护基团来进行反应。
3.2  3'-羟基-2-氯苯乙酮的对映选择性氢化作用
通过酶来催化2的反应。酶是来自(固氮弧菌属)Aromatoleumaromaticum EbN1的脱氢酶EbN1，它在特定情况下在大肠杆菌中重组制备。
已知脱氢酶适合作为生产光活性羟基化合物的生物催化剂。它们是被充分表征的生物催化剂，已经用于许多技术工艺中(Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43,788；Tetrahedron,2004,60,633；Chiral catalysis-asymmetrichydrogenation supplement to Chemistry Today,2004,22,26；CurrentOpinion in Chemical Biology,2004,8,120；Organic Process Research &Development,2002,6,558；Tetrahedron:Asymmetry,2003,14,2659；Chiralcatalysis-asymmetric hydrogenation supplement to Chemistry Today,2004,22,43)。
脱氢酶将酮或醛转变成相应的二级或初级醇；该反应在原理上是可逆的。它们催化对映选择性氢化物转移到羰基化合物的前手性碳原子。
氢化物离子被所谓的辅因子如NADPH或NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)变为[空隙(lacuna)]。由于这些是非常昂贵的化合物，它们只以催化量加入到反应混合物中。被还原的辅因子在反应期间被同时发生的第二个氧化还原反应所再生。根据整个反应的热动力学和动力条件，诸如异丙醇的低成本二级醇(所谓的“牺牲醇”)可以作为反应的最终的氢化物供体而产生，如从Meerwein-Ponndorf-Verley反应所知。通常，可以通过相同的生物催化剂(底物耦合)进行酮还原和牺牲醇氧化。
或者，可以使用第二种催化剂来再生消耗的辅因子。已知的实例是甲酸盐脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或亚磷酸盐脱氢酶，它们来自传递NAD或NADP的氢化物离子的甲酸、葡萄糖或亚磷酸盐的氧化(Biocatalysis andBiotransformation,2004,22,89；Applied Microbiology and Biotechnology,1997,48,699；Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1998,62,167；Methods Enzymol.,1987,136,9；Ann.N.Y.Acad.Sci.,1984,434,91；FEBSJournal,2005,272,3816；Applied Microbiology and Biotechnology,2003,61,133)。
在此检测的反应的还原等效物或者起源自异丙醇(或另一种二级所谓的“牺牲醇”)或者起源自葡萄糖，异丙醇氧化成丙酮，葡萄糖在平行反应中氧化成葡糖酸丙酮。鉴于许多牺牲醇被也进行2到R-3还原的相同酶氧化是可能的，对于葡萄糖的氧化，需要加入葡萄糖脱氢酶作为第二种酶。
或者，代替葡萄糖脱氢酶，也能够使用另一种再生体系，例如亚磷酸盐脱氢酶(Biotechnol Bioeng,2006,96,18)或电化学辅因子再生(Angew.Chem.Int.Ed Engl.,2001,40,169),(Angewandte ChemieInt.Ed.Engl.,1999,29,388)。
已经在下面的BASF SE的专利申请中描述了生产R-3的适当的生物催化剂：(DE 2004022686，EP 2005004872，WO 2005108590)或(EP06123814，WO2008055988A3)。
3.2  L-去氧肾上腺素的生产
这一生产L-去氧肾上腺素以及它的盐的新方法总结为将还原后获得的组分3与甲基胺反应得到想要的产物。
这在许多在反应条件下为惰性的多种溶剂，如水、醇或醚中实现。尤其优选醚，其中起始原料3最大限度地溶解，用于以经济上有意义的浓度操作。尤其优选使用THF。反应后，L-去氧肾上腺素可以作为碱以及以它的盐的形式获得，例如WO 00/43345教导的方法，但不排除它法。
4.发明的进一步实施方式
4.1  醇脱氢酶
本发明使用的酶特别选自醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)。
不限于此，此种酶优选获自固氮弧菌(有时也称作Azoarcus)属的微生物，例如Aromatoleum aromaticum，特别是EbN1株。
优选的具有ADH活性的酶包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
本发明也包括在本发明方法中具体公开的ADH的“功能等效物”及其应用。
在本发明范围内具体公开的酶的“功能等效物”或类似物是还具有想要的生物活性如底物特异性的多种多肽。例如“功能等效物”理解为包括将3'-羟基-2-氯苯乙酮2还原成相应的R-醇(R)-3-(2-氯-1-羟乙基)酚3并且具有包括以SEQ ID NO:2列出的氨基酸序列之一的酶活性的至少20％，优选50％，尤其优选75％，非常尤其优选90％的酶。
本发明将“功能等效物”理解为尤其包括在前述氨基酸序列的至少一个序列位置具有除了具体规定的氨基酸以外但又具有前述生物活性之一的突变体。“功能等效物”因此包括通过一或多个氨基酸添加、置换、缺失和/或倒位可获得的突变体，其中所规定的改变可以在任何序列位置上发生，只要它们造成具有本发明的特性谱的突变体。特别地，功能等效也在突变体和未改变的多肽之间的反应类型定性相符(即例如相同的底物以不同的速度转变)时实现。
上述意义中的“功能等效物”也是所述多肽的“前体”以及该多肽的“功能衍生物”和“盐”。
“前体”是具有或不具有想要的生物活性的多肽的天然或合成的前体。
术语“盐”指本发明的蛋白质分子的羧基基团的盐以及氨基基团的酸加成盐。羧基基团的盐可以按本身已知的方式来制备并且包括无机盐，例如钠、钙、氨、铁和锌盐以及有机碱的盐，例如胺，例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等等。本发明也涵盖酸加成盐例如具有无机酸的盐，例如盐酸或硫酸和有机酸的盐，例如乙酸和草酸。
本发明的多肽的“功能衍生物”也可以通过已知技术在功能性氨基酸侧基团上或者在它们的N-或C-端上制备。这样的衍生物包括例如通过与氨或者与初级或二级胺反应可获得的羧酸基团的脂肪酯、羧酸基团的酰胺；通过与酰基基团的反应制备的游离氨基基团的N-酰基衍生物；或者通过与酰基基团反应制备的游离羟基的O-酰基衍生物。
“功能等效物”自然也包括可从其他生物获得的多肽，以及天然发生的变体。例如，使用序列比较能够基于本发明的具体说明测定同源序列区的结构域并且测定等效酶。
“功能等效物”也包括本发明的肽的片段，优选单个结构域或序列基序，它们例如具有想要的生物功能。
“功能等效物”还是融合蛋白，其具有前述多肽序列之一或者源自它们的功能等效物以及至少一种其他功能不同的、以功能性N-或C-端连接的异源序列(即没有融合蛋白部分间相互的实质性功能损伤)。所述异源序列的非限制性实例是例如信号肽或酶。
本发明也包括的“功能等效物”是具体公开的蛋白质的同源物。这些与具体公开的氨基酸序列之一拥有至少60％，优选至少75％，尤其是至少85％，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性。本发明的同源性多肽的同源性百分数特别指参照在此具体公开的氨基酸序列之一的全长的氨基酸残基的同一性百分数。
两序列之间的“同一性”特别指各个全序列长度上残基的同一性，特别是通过使用Vector NTI Suite 7.1(Vector NTI Advance 10.3.0,Invitrogen Corp.)(或来自Informax(USA)公司的软件)，使用ClustalMethod(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequencealignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989 Apr；5(2):151-1)，按下面的参数设定，进行比较来计算的同一性：
多重比对参数
两两比对参数
在可能的蛋白质糖基化的情况下，本发明的“功能性等效物”包括去糖基化或糖基化形式的上面规定的类型的蛋白质以及通过改变糖基化类型可获得的修饰形式。
本发明的蛋白质或多肽的同源物可以通过诱变来产生，例如通过点突变或蛋白质截短。
本发明的蛋白质的同源物可以通过筛选突变体的组合库，例如截短突变体来鉴定。例如，可以通过在核酸水平上的组合诱变，例如通过合成的寡核苷酸的混合物的酶促连接来生产蛋白质变体的不同库。存在许多方法可以用来从简并寡核苷酸序列生产潜在的同源物的库。可以在自动化DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，并且合成的基因可以随后连接到适当的表达载体中。简并组的基因的使用使得能够在一种编码想要组的潜在蛋白序列的混合物中制备所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如，Narang,S.A.(1983)Tetrahedron39:3；Itakura等人，(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等人，(1984)Science 198:1056；Ike等人，(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。
在组合库中筛选基因产物，以及筛选cDNA库中具有所选特性的基因产物的若干技术是现有技术中已知的，该组合库是通过点突变或截短产生的。这些技术可以适于快速筛选通过本发明同源物的组合诱变所产生的基因库。最常用于筛选大的基因库的技术(这形成高通量分析的基础)包括将基因库克隆到可复制的表达载体中，用得到的载体库转化适当的细胞并且表达组合基因，该表达在对想要活性的检测能促进编码其产物被检测的基因的载体分离的条件下进行。循环综合诱变(Recursiveensemble mutagenesis，REM)是增加库中功能突变体的频率的技术，它可以与鉴定同源物的筛选检测组合使用(Arkin and Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815；Delgrave等人，(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。
4.2  编码核酸序列
在本发明的上下文中，术语“表达”或“过表达”描述在微生物体内一或多种由相应DNA编码的酶的细胞内活性的产生和增加。为此，能够例如在生物体内插入基因，用另一基因代替现有基因，增加基因的拷贝数，使用强启动子或使用编码相应的具有高活性的酶的基因，并且这些措施可以任选地组合。
本发明特别涉及编码具有ADH活性的酶的核酸序列。优选包括SEQID NO:1的序列的核酸序列，或者源自SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核酸序列。
在此提及的所有核酸序列(单和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以通过化学合成以本身已知的方式从核酸构造单元来生产，例如通过双螺旋的个体重叠的、互补核酸构造单元的片段缩合而生产。寡核苷酸的化学合成可以例如根据亚磷酰胺方法以已知方式来进行(Voet,Voet，第二版，Wiley Press New York，第896-897页)。合成寡核苷酸的添加以及使用DNA聚合酶的Klenow片段填充缺口和连接反应以及通用克隆方法描述于Sambrook等人，(1989),Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
本发明也涉及编码上述多肽之一及其功能等效物的核酸序列(单和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，该核酸序列可以例如使用人工核苷酸类似物来获得。
本发明涉及分离的核酸分子以及核酸片段，其编码本发明的多肽或蛋白质或其生物活性节段，该核酸片段可以用作例如鉴定或者扩增本发明的编码核酸的杂交探针或引物。
本发明的核酸分子可以另外含有来自基因编码区的3'-和/或5'-端的未翻译序列。
本发明还包括与具体描述的核苷酸序列或其节段互补的核酸分子。
本发明的核苷酸序列使得能够生产可以用于在其他细胞类型和生物中鉴定和/或克隆同源序列的探针和引物。所述探针或引物通常包括在“严谨”条件(见下文)下与本发明核酸序列的正义链或相应的反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区。
“分离的”核酸分子是从存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子，并且此外在通过重组技术生产它时可以基本上没有其他细胞物质或培养基，或者当化学合成它时基本上没有化学前体或其他化学物。
可以通过分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息来分离本发明的核酸分子。例如，可以使用具体公开的完整序列之一或其节段作为杂交探针以及标准杂交技术(如描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989)自适当的cDNA库分离cDNA。此外，包括公开的序列之一或其节段的核酸分子可以使用基于这一序列所制备的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应来分离。因此扩增的核酸可以克隆到适当的载体中并且可以通过DNA序列分析来表征。本发明的寡核苷酸还可以通过标准合成方法，例如使用自动化DNA合成仪来产生。
本发明的核酸序列，例如SEQ ID NO:1或其衍生物，同源物或这些序列的部分，可以例如使用常用杂交方法或PCR技术从适当的微生物如通过基因组或cDNA库来分离。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。有益地，使用短寡核苷酸用于杂交。此外，本发明的核酸的较长片段或完整序列可以用于杂交。这些标准条件根据所用核酸(寡核苷酸、较长片段或完整序列)或者根据将哪种类型的核酸DNA或RNA用于杂交而变化。例如，DNA:DNA杂交体的熔解温度比相同长度的DNA:RNA杂交体的熔解温度低大约10℃。
“标准条件”应理解为，例如取决于核酸，在具有浓度为0.1至5xSSC(1X SSC＝0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠，pH 7.2)或者另外存在50％甲酰胺的水性缓冲溶液中为42和58℃之间的温度，例如42℃在5xSSC,50％甲酰胺。有益地，对于DNA:DNA杂交体的杂交条件是0.1xSSC并且温度在约20℃至45℃之间，优选在约30℃至45℃之间。对于DNA:RNA杂交体，杂交条件有益地是0.1x SSC并且温度在约30℃至55℃之间，优选在约45℃至55℃之间。这些所述用于杂交的温度是在没有甲酰胺时，具有大约100个核苷酸的长度以及50％的G+C含量的核酸的经计算的熔解温度的实例。用于DNA杂交的实验条件描述于相关的遗传学课本中，例如Sambrook等人，“Molecular Cloning”,Cold SpringHarbor Laboratory,1989，并且可以使用本领域技术人员已知的关于核酸长度、杂交体类型或G+C含量的公式来计算。本领域技术人员可以在下面的课本中发现杂交的进一步信息：Ausubel等人编，1985,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York；Hames和Higgins编，1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRLPress at Oxford University Press,Oxford；Brown编，1991,EssentialMolecular Biology:A Practical Approach,IRL Press at Oxford UniversityPress,Oxford。
本发明也涉及具体公开的衍生物或可衍生的核酸序列。
因此，本发明的其他核酸序列可以源自例如SEQ ID NO:1，并且可以通过一个或若干核苷酸的添加、置换、插入或缺失而与SEQ ID NO:1不同，但是仍旧编码具有想要的特性谱的多肽。
相比于具体说明的序列，包括所谓的沉默突变或者对应于一旦是特殊起源或宿主生物而改变的密码子使用的核酸，以及天然发生的变异，例如其剪接变体或等位变体也包括在本发明中。
也涉及通过保守核苷酸置换(即，目的氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或可溶性的氨基酸所代替)可获得的序列。
本发明也涉及通过序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。这些基因多态性可以由于天然变异而存在于群体内的个体之间。这些天然变异通常引起基因的核苷酸序列中1至5％的变异。
具有SEQ ID NO:1的序列的本发明核酸序列的“衍生物”例如应理解为等位变体，它在衍生的氨基酸水平上具有在整个序列区的至少40％同源性，优选至少60％同源性，非常特别优选至少80％同源性(对于在氨基酸水平的同源性，应参考上面关于多肽的说明)。在序列的部分区域上，同源性可以有益地更高。
此外，“衍生物”也应理解为本发明的核酸序列，特别是SEQ IDNO:1的同源物，例如真菌或细菌同源物，截短序列、编码或非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如SEQ ID NO:1在DNA水平的同源物具有在SEQ ID NO:1所示整个DNA区域上至少40％，优选至少60％，尤其优选至少70％，非常尤其优选至少80％的同源性。
此外，“衍生物”应理解为例如具有启动子的融合物。启动子在所述核苷酸序列之前，可以通过一或多个核苷酸交换、插入、倒位和/或缺失来改变，而不会损伤启动子的功能性和效力。此外，启动子的效力可以通过改变他们的序列来增加或者可以用甚至来自不同种的生物体的更有效的启动子来完全代替它们。
“衍生物”也应理解为在其起始密码子前方上游-1至-1000碱基区或者在终止密码子后面下游0至1000碱基区的核苷酸序列被改变，以致基因表达和/或蛋白表达被改变，优选增加的变体。
此外，本发明也包括与前述编码序列在“严谨条件”下杂交的核酸序列。这些多核苷酸可以通过检查基因组或cDNA库而被发现，并且任选地用适当的引物通过PCR扩增它们然后例如用适当的探针分离它们。此外，本发明的多核苷酸也可以是化学合成的。这一特性应理解为多或寡核苷酸在严谨条件下结合最互补序列的能力，而在这些条件下，不发生在非互补搭档之间的非特异结合。为此，该序列应70-100％，优选90-100％互补。互补序列能够彼此特异结合的特性被用在例如Northern或Southern印迹技术中或者在PCR或RT-PCR中用于引物结合。通常，起始于30个碱基对长度的寡核苷酸被用于此。“严谨条件”例如在Northern印迹技术中，应理解为为洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸，加热至50-70℃，优选60-65℃的洗涤溶液，例如具有0.1％ SDS的0.1x SSC缓冲液(20x SSC:3M NaCl,0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)的使用。如上所提及，只有高度互补的核酸保持彼此结合。严谨条件的设定是本领域技术人员已知的并且描述于例如Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。
4.3  本发明使用的构建体
本发明还使用表达构建体和载体，该表达构建体含有在调控核酸序列的遗传控制下编码本发明酶的核酸序列；该载体包括这些表达构建体至少之一。
优选地，本发明的所述构建体包括各编码序列的5'-上游的启动子和3'-下游的终止子序列以及任选的其他常用调控元件，在每种情况下，该调控元件有效地与编码序列相连接。
“有效连接”理解为启动子、编码序列、终止子和任选地其它调控元件以每种调控元件都可以按照需要在表达编码序列时履行其功能的方式进行的顺序排列。可有效连接的序列的实例是靶序列和增强子、聚腺苷酸化信号等。其它调控元件包括可筛选的标记、扩增信号、复制起点等。适当的调控序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)。
本发明使用的核酸构建体特别应理解为具有SEQ ID NO:1序列的ADH，以及其衍生物和同源物，以及可从SEQ ID NO:1衍生的、已经有效地或功能上连接到一或多个有益地控制(例如增加)基因表达的调控信号的核酸序列。
除了这些调控序列，存在于真正结构基因前面的这些序列的天然调控仍可以存在并且任选地可以被遗传改变以便关闭天然调控并且增加基因的表达。然而，核酸构建体也可以更简单地构建，即不在编码序列(例如SEQ ID NO:1或其同源物)之前插入其他调控信号并且不去除天然启动子的调控。取而代之，该天然调控序列突变以致不再发生调控并且基因表达增加。
优选的核酸构建体有益地也含有与启动子功能性连接的一或多个前述“增强子”序列，它使得核酸序列的表达增加成为可能。也在DNA序列的3'-端，可以插入其他有益的序列，例如其他调控元件或终止子。可以在构建体中含有一或多个拷贝的本发明的核酸。构建体也可以含有其他标记，例如抗生素抗性或营养缺陷型互补基因，任选地用于构建体的筛选。
用于本发明方法的有利的调控序列包含在例如启动子中，如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP(RhaPBAD)SP6-、lambda-PR-或在lambda-PL-启动子，该调控序列有利地可应用于革兰氏阴性细菌。其他有利的调控序列包含在例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中，在酵母菌或真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在这一点上，丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶的启动子，例如来自汉逊酵母属(Hansenula)也是有益的。人工启动子也可以用于调控。
对于表达，核酸构建体在宿主生物中有利地插入载体，例如质粒或噬菌体，该载体允许基因在宿主中的最佳表达。除了质粒和噬菌体，载体也理解为任何本领域技术人员已知的其他载体，例如病毒，例如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或者可以经染色体复制。这些载体代表本发明的另一实施方式。适当的质粒例如大肠杆菌pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、gt11或pBdCI中，在链霉菌pIJ101、plJ364、plJ702或plJ361中，在芽孢杆菌pUB110、pC194或pBD214中，在棒状杆菌pSA77或pAJ667中，在真菌pALS1、pIL2或pBB116中，在酵母菌2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23中或在植物pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51中。前述质粒代表可能的质粒的小部分选择。其它的质粒自然是本领域技术人员已知的并且可见于例如书籍Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中。
有利地，核酸构建体为了表达存在的其他基因另外含有3'-和/或5'-末端调控序列用于增加表达，这些序列根据所选宿主生物和基因来选择用于最佳表达。
这些调控序列应使得基因和蛋白质表达的目的表达成为可能。这可以意味着，例如根据宿主生物，基因只在诱导后表达或过表达，或者它立即表达和/或过表达。
调控序列或因子可以随后优选地对插入基因的表达具有正效应并因此增加该表达。因此，可以使用强转录信号如启动子和/或增强子在转录水平有益地发生调控元件的加强。然而此外，翻译加强也是可能的，例如使mRNA的稳定性得以改善而实现。
在载体的另一实施方式中，含有本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体也可以有益地以线性DNA的形式插入微生物中并且通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。这一线性DNA可以由线性载体如质粒或者仅由本发明的核酸构建体或核酸所构成。
对于异源基因在生物体中的最佳表达，有利地根据该生物体特异的密码子使用来改变核酸序列。密码子使用可以基于对目的生物的其他已知基因的计算机评估而容易地测定。
本发明的表达盒是通过将适当的启动子与适当的编码核苷酸序列以及终止子或聚腺苷酸化信号融合来制备。为此使用常见的重组和克隆技术，如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)以及在T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experimentswith Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)以及在Ausubel,F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所述。
对于在适当宿主生物体中表达，重组核酸构建体或基因构建体有利地插入宿主特异的载体中，该载体允许基因在该宿主中的最佳表达。载体自然是本领域技术人员已知的并且可见于例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人编，Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中。
4.4  本发明可以使用的宿主
利用本发明的载体，可以生产例如转化有本发明至少一种载体的重组微生物并且该重组微生物可以用于生产本发明所用的多肽或用于进行本发明的酶促反应。
有益地，上面所述的本发明的重组构建体插入适当的宿主体系中并表达。优选地，将本领域技术人员已知的常见克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆病毒转染等用于在各表达体系中表达所述核酸。适当的体系例如描述于Current Protocols in MolecularBiology,F.Ausubel等人编，Wiley Interscience,New York 1997，或者Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第二版，ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989。
也可以根据本发明生产同源重组微生物。为此，生产含有本发明的基因的至少一个节段或编码序列的载体，该载体中任选地整合有至少一个氨基酸缺失、添加或置换，以便改变本发明的序列，例如功能性地破坏它(“敲除”载体)。整合的序列也可以例如是来自相关微生物的同源物或者可以源自哺乳动物、酵母或昆虫源。用于同源重组的载体可以替代地被设计以便在同源重组期间，内源基因以某些其他方式突变或改变，但仍旧编码功能蛋白(例如可以以改变内源蛋白的表达作为结果的方式来改变位于上游的调控区)。本发明基因的改变的节段在同源重组载体中。用于同源重组的适当载体的构建描述于例如Thomas,K.R.andCapecchi,M.R.(1987)Cell 51:503。
原则上，所有原核或真核生物体都可以当做用于本发明的核酸或核酸构建体的重组宿主生物体。有益地，将诸如细菌、真菌或酵母菌的微生物用作宿主生物体。有益地，使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、链霉菌科、芽孢杆菌科或诺卡氏菌科的细菌，尤其优选埃希氏菌属、假单胞菌属、链霉菌属、诺卡氏菌属、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。非常尤其优选大肠杆菌的属和种。此外，可以在α-变形菌门(proteobacteria)、β-变形菌门或γ-变形菌门种类中发现其他有益的细菌。
本发明的宿主生物于是优选地含有本发明所述的编码ADH酶的核酸序列、核酸构建体或载体中至少其一。
取决于宿主生物，本发明方法所使用的生物体以本领域技术人员已知的方式生长或培养。通常，微生物在0℃和100℃之间，优选10℃和60℃之间在通氧气下，在液体培养基中生长，该液体培养基含有通常是糖的形式的碳源，通常是有机氮源如酵母提取物或盐如硫酸铵形式的氮源，痕量元素如铁、锰和镁盐并且任选维生素。液体培养基的pH可以维持在固定值，即在培养期间被调控的或不被调控的。培养可以是分批、半分批或连续的。营养物可以在发酵初始时提供或者更多营养物可以半连续或连续地送料。
可以将待转化的酮直接加入培养基或者有益地在培养后加入。
用于反应的酶可以从生物体分离或者可以作为原始提取物而使用。
宿主生物体含有例如1U/l的酶活性，例如ADH活性，优选100U/l，尤其优选大于1000U/l的酶活性。
4.5  酶的重组生产：
本发明使用的酶也可以通过重组生产获得，其中培养产生这一酶的微生物，任选地诱导多肽的表达并且将后者从培养物中分离。如果需要，也可以以这种方式在工业规模生产该多肽。
可以以已知的方法培养并发酵重组微生物。细菌可以在例如TB或LB培养基中，并在20至40℃的温度以及6-9的pH值生长。适当的培养条件具体描述于例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1989)。
然后，如果没有在培养基中分泌多肽，那么破坏细胞并且通过已知的蛋白分离方法从裂解物获得产物。可以任选地通过高频超声、通过高压，例如在弗氏细胞压碎器中，通过渗透、通过去垢剂，裂解酶或有机溶剂作用，通过均质器，或者通过若干前述方法的组合来破坏细胞。
可以用已知的层析方法，例如分子筛层析(凝胶过滤)，例如Q-琼脂糖层析，离子交换层析和疏水层析，以及通过其他常见方法例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳实施多肽的纯化。适当的方法描述于例如Cooper,F.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[biochemicalprocedures],Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York或者Scopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin。
为了分离重组蛋白质，可有益地使用加长所限定核苷酸序列的cDNA并因此编码改变的多肽或融合蛋白的载体体系或寡核苷酸，其用于例如更容易地纯化。这一种类的适当的改变例如用作锚定物的所谓的“标签”，例如已知为六聚组氨酸锚定物或可以被抗体认作抗原的表位的改变(描述于例如Harlow,E.和Lane,D.,1988,Antibodies:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)。这些锚定物可以用于将蛋白质固定到固体支撑物如聚合物基质上，其可以例如用作层析柱的填料，或者可以用在微滴定板上或在一些其他支撑物上。
同时，这些锚定物也可以用来识别蛋白质。对于蛋白质的识别，还可能将常见的标记，例如荧光染料、酶标记(它们在与底物反应后形成可检测的反应产物)或者放射活性标记，以单独或与锚定物组合使用来衍生该蛋白质。
4.6  执行本发明的工艺步骤b)以生产光活性醇
所用酶可以在本发明的工艺步骤中用作游离的或固定化的酶。
本发明的工艺步骤有益地在0℃和60℃之间，优选在10℃和40℃之间，尤其优选在15℃和35℃之间的温度下进行。
在本发明的工艺步骤期间的pH值有益地保持在pH4和12之间，优选在pH 4.5和9之间，尤其优选在pH 5和8之间。
对于本发明的方法，能够使用含有本发明的核酸、核酸构建体或载体的生长细胞。也可以使用静止的或破坏的细胞。破坏的细胞应理解为例如通过用例如溶剂处理而可渗透的细胞，或者通过酶处理，通过机械处理(例如弗氏破坏或超声)或通过一些其他方法被破碎的细胞。得到的原始提取物适于本发明的方法。纯化的或部分纯化的酶也可以用于本方法。固定化微生物或酶也是适合的。
如果将游离生物或酶用于本发明的方法，在提取之前，希望将它们例如通过过滤或离心而分离。
如果使用两相(水/有机)反应介质，这促进产物分离，因为有价值的产物可以优先溶解在有机相中。例如，特别使用基本上不溶于水的溶剂如醚形成两相体系。
相反，如果在酶促过程步骤中使用单相反应介质，那么得到的产物可以通过提取或蒸馏或者有益地通过提取和蒸馏从水性反应溶液中获得。提取可以重复若干次以增加产率。适当的提取剂的实例是溶剂，例如甲苯，二氯甲烷、乙酸丁酯、二异丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯，但不限于此。
通过蒸发浓缩有机相后，通常可以以良好的化学纯度，即高于80％、90％、95％或99％化学纯度来获得产物。然而提取后，具有产物的有机相也可以通过蒸发而只部分浓缩，并且可以使产物析晶。为此，有益地，冷却溶液至0℃-10℃的温度。结晶也可以直接从有机溶液或从水性溶液发生。可以在相同或在不同的溶剂中再次吸收结晶产物来重复结晶，并且可以再结晶。由于至少进行一次后续有利的结晶，如果需要，产物的对映体纯度可以进一步增加。
在前述处理步骤中，本发明方法的产物可以基于用于反应的底物，以60至100％，优选80至100％，尤其优选90至100％的产率来分离。分离产物的特征为>90％，优选>95％，尤其优选>98％的高化学纯度。此外，产物具有高对映体纯度，如果需要，该对映体纯度可以有益地通过结晶进一步增加。
本发明的方法可以分批、半分批或连续地操作。
可以按照例如Biotechnology,3卷，第二版，Rehm等人编(1993)，特别是第II章所述，有利地在生物反应器中进行该方法。
上面的说明和下面的实例只用于解释本发明。本发明也涵盖对于本领域技术人员显而易见的多种可能的修改。
实验部分
实施例1：HCAP,2的合成(在乙酸乙酯中)：
用在410.11g(12.80mol)的甲醇和1200ml乙酸乙酯中的435.68g(3.20mol)的3-羟基苯乙酮填充具有叶轮式搅拌器、挡板、温度计和滴液漏斗的6000-ml Miniplant反应器。在20-30℃，随着冷却，在2h内将691.05g(5.12mol)的磺酰氯滴加到这一溶液中。滴加后，在室温中又搅拌该混合物1小时。然后在室温下用1600ml H2O水解该混合物并且分离得到的两相混合物。用800ml乙酸乙酯再提取水相一次。利用蒸馏桥从组合的有机相蒸馏甲醇和乙酸乙酯。同时，向蒸馏池中滴加1880ml异丙醇。获得2462.5g的17.3％的有价值产物的异丙醇溶液，这相当于426g(2.51mol)的含量。产率因此是78％。
实施例2：HCAP,2的合成(在二氯甲烷中)：
用在192.24g(6.00mol)的甲醇和1050ml CH2Cl2中的204.23g(1.50mol)的3-羟基苯乙酮填充具有叶轮式搅拌器、挡板、温度计和滴液漏斗的2000-ml Miniplant反应器。在20-30℃，随着冷却，在2h内将283.44g(2.10mol)的磺酰氯滴加到这一溶液中。滴加后，在室温中又搅拌该混合物1小时。然后在室温下用400ml H2O水解该混合物并且分离得到的两相混合物。相分离后，在常压下，利用蒸馏桥从有机相蒸馏甲醇和CH2Cl2。同时，以相同的速率向蒸馏池中滴加880ml异丙醇。获得837.78g的25.7％的有价值产物的异丙醇溶液，这相当于215g(1.26mol)的含量。产率因此是84％。
实施例3：HCPE,3的合成：
将按实施例1或2制备的酮2生物催化还原成R-3。为此，在适当的搅拌容器中，将1mM MgCl2,0.02mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和也用作辅因子再生的牺牲醇的282g异丙醇溶解在1.44L水性磷酸钾缓冲液(50mM,pH7)中。将过生产立体选择性脱氢酶(E.C.1.1.1.1)的重组大肠杆菌细胞(相当于3.75g生物干重)用作催化剂。适当的生物催化剂的生产描述于WO 2005/108590，实施例1-3，在此明确地对其通过引用作为参考。水相被1.3kg MtBE覆盖。将292.8g的2(作为异丙醇溶液)加入反应混合物中。在反应混合物中的2的浓度不应超过50mM。反应可以通过非手性或手性层析来监控。
反应后，有机相和水相由于不同的比重而分离。有价值的产物R-3主要在MtBE相中。
实施例4：去氧肾上腺素,4的合成：
在85ml THF中溶解15g(86.9mmol)的化合物R-3并在90℃在加压釜中与13.5g(435mmol)的甲基胺反应。进行反应直到离析物被完全转化(大约5小时)。然后冷却至室温并且通过蒸发浓缩得到的悬浮液。加入100g水，有价值产物的游离碱沉淀并分离。获得12.85g(76.8mmol,88％)的去氧肾上腺素游离碱。

Claims (21)

1.一种生产式IV的取代的光活性醇或者其盐的方法，在各种情形下，该光活性醇或其盐为立体异构纯的形式，或者为立体异构体的混合物，
其中
Cyc代表苯基，其具有至少一个游离羟基，和
R1和R2彼此独立地代表H或者C1-C6烷基残基；
其中
a)其中Cyc具有上面规定含义的式I的酮
在脂肪醇存在下，与卤化剂反应得到式II的卤代的化合物
其中Cyc具有上面规定的含义并且Hal代表氯原子或溴原子；
b)生成的式II的化合物被酶促还原为式III的醇
其中Cyc和Hal具有上面规定的含义；和
c)生成的式III的醇与式HNR1R2的胺反应得到式IV的化合物，其中R1和R2具有上面规定的含义；
其中阶段b)是通过选自醇脱氢酶(ADH)(E.C.1.1.1.1)的酶来催化，且阶段b)在两相液体反应介质中进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中阶段a)的反应在相对于每摩尔式I的烷酮存在1至10摩尔当量的醇的条件下发生。
3.如权利要求1所述的方法，其中阶段c)中的化学反应在开链或环状醚中以溶液形式发生。
4.如权利要求2所述的方法，其中阶段c)中的化学反应在开链或环状醚中以溶液形式发生。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述醇脱氢酶选自来自固氮弧菌属的微生物的酶。
6.如权利要求1所述的方法，其中醇脱氢酶是来自细菌Aromatoleumaromaticum EbN1的酶。
7.如权利要求1至6之一所述的方法，其中阶段b)的酶选自具有多肽序列的酶，该多肽序列是
SEQ ID NO:2。
8.如权利要求1至6之一所述的方法，其中阶段b)的反应是通过添加还原等效物而进行的，并且任选地再生在反应期间所消耗的还原等效物。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的还原等效物是NADH或NADPH。
10.如权利要求8所述的方法，其中再生是酶促地、电化学地、或电酶促地进行。
11.如权利要求10所述的方法，其中再生是酶促地发生的并且再生酶选自ADH以及与ADH不同的脱氢酶。
12.如权利要求10所述的方法，其中再生是酶促地发生的并且再生酶选自葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、亚磷酸脱氢酶。
13.如权利要求1至6之一所述的方法，其中阶段b)的反应在天然或重组地表达ADH的微生物存在下，或者在源自该微生物、含有ADH的部分存在下，或者在源自该微生物、含有ADH的提取物存在下发生。
14.如权利要求1至6之一所述的方法，其中阶段b)的反应在生产ADH的微生物存在下，或者在源自该微生物的含ADH的部分或提取物存在下发生，所述微生物选自肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、乳杆菌科、链霉菌科、红球菌科、红环菌科和诺卡氏菌科细菌。
15.如权利要求14所述的方法，其中微生物是重组微生物，其转化有编码根据权利要求1-7之一定义的醇脱氢酶的核酸构建体。
16.如权利要求1所述的方法，其中使用水相-有机反应介质，并且式II的离析物和式III的产物在有机相中比在水相中更加可溶。
17.一种生产式III的化合物的方法
其中Cyc和Hal具有权利要求1中规定的含义；其中Cyc和Hal具有权利要求1中规定含义的通式II的化合物被酶促还原为式III的醇
其中该反应通过选自醇脱氢酶(ADH)(E.C.1.1.1.1)的酶来催化，且该反应在两相液体反应介质中进行。
18.如权利要求17所述的方法，其中酶促反应按照权利要求5-16之一进行。
19.如权利要求7所述的方法，其中Cyc代表苯基，其具有至少一个游离羟基。
20.如权利要求1至6、16至18之一所述的方法，其中Cyc代表3-羟苯基残基并且Hal代表氯原子。
21.如权利要求19所述的方法，其中Cyc代表3-羟苯基残基并且Hal代表氯原子。
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