WO2007069591A1 - 質量分析計によるアミノ酸分析方法 - Google Patents

質量分析計によるアミノ酸分析方法 Download PDF

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WO2007069591A1
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hydroxysuccinimidyl
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Naoyuki Yamada
Satoko Akashi
Koichi Suzuki
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Ajinomoto Co., Inc.
Shimadzu Corporation
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    • H01J49/0018—Microminiaturised spectrometers, e.g. chip-integrated devices, Micro-Electro-Mechanical Systems [MEMS]

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing amino acids and the like using a mass spectrometer, in particular, a method for efficiently mass-analyzing amino acids and the like by pretreating an analysis sample by microchip electrophoresis, and a sample for the same. It relates to a supply method.
  • capillary electrophoresis is used as a method for separating trace substances having charges such as ions, organic acids, amino acids, peptides, proteins, nucleic acids, and sugars.
  • Capillary electrophoresis is a common method for separating charged molecules in solution.
  • a method of performing amino acid analysis by CEZMSZMS that combines capillary electrophoresis (CE) and tandem mass spectrometry (MS / MS) is known (see Non-Patent Document 1). Even with this method, the analysis time is 15 minutes and the sensitivity is several fmol.
  • Sample movement and injection in the ⁇ chip are performed using a potential difference.
  • a method is used in which multiple reservoirs containing samples, buffers, reagents, etc. are connected by fine channels, and charged molecules such as samples are moved by the voltage difference between the reservoirs.
  • Accurate control of sample injection volume is important for accurate separation and quantitative analysis using chip CE.
  • a microchip having a structure for adjusting the sample amount has been developed (see Patent Documents 3, 5, and 6).
  • the spray ion mass spectrometer is a high-throughput and high-throughput analyzer capable of measuring mass in a few seconds.
  • the bottleneck of short-term analysis with a mass spectrometer is sample introduction time.
  • the time required between sample introductions is at least 1 minute or longer, so the performance of the mass spectrometer cannot be fully utilized.
  • a method for supplying a sample to a mass spectrometer at a higher speed there is a system using an acoustic injector (see Patent Document 4). This is a method that uses a microwell plate containing multiple sample solutions and generates sample force droplets in the microwell plate sequentially by acoustic pulses and supplies them to a mass spectrometer.
  • Patent Document 1 International Publication No. 03Z069328 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-83119
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 10-507516
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-205510
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2005-164242
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-242137
  • Non-Patent Document 1 Soga et al., Electrophoresis. 2004 Jul; 25 (13): 1964-72
  • Non-Patent Document 2 Gerard J. M. Bruin, Electrophoresis 2000, 21, 3931-3951
  • Non-patent literature 3 Lee. SJ and Lee, SY, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 64, 289-299
  • Non-patent literature 4 Y. Tachibana, K. Otsuka, b. Terabe, A. Aral, K. buzuki, b. Nakamura, J
  • Non-Patent Document 5 Japan Biochemical Society, New Chemistry Laboratory 1 Protein IV Structure-Activity Relationship Chapter 2
  • Non-Patent Document 6 The Chemical Society of Japan, 4th edition, Experimental Chemistry Course 22, Organic Synthesis IV Acids, Amino Acids-Peptides Chapter 2 Section 3 Synthesis of Protected Amino Acids, Maruzen
  • capillary electrophoresis is a technique for separation based on the difference in electrical properties of the substance to be measured. Therefore, when a sample is introduced into the separation channel in microchip electrophoresis, the moving speed varies depending on the electrical property of the substance to be measured. In the case of a mixed sample composed of a plurality of compounds, although the sample injection volume can be made constant, the rate of introduction into the separation flow path differs, and therefore the compound abundance ratio in the sample solution is increased. May change. This phenomenon is a serious problem when quantitative analysis is performed using a ⁇ -chip CE, and causes a decrease in the signal intensity of the detected peak. In particular, in the case of compounds with greatly different electrical properties such as amino acids, sugars, peptides, organic acids, etc., this is a more serious problem because it depends greatly on the ⁇ and salt concentration of the nofer used.
  • the present invention provides a sample pretreatment for efficiently and accurately injecting a sample when an amino acid is analyzed by a mass spectrometer. To provide a method.
  • the present inventors diligently studied to solve the above problems, derivatized an amino acid with a modifying reagent, subjected the amino acid derivative to microchip electrophoresis, and then introduced it into a mass spectrometer. It has been found that the injection of the sample is improved and the accuracy of the injection amount is improved, and the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following contents
  • analyte consisting of amino acids, amines, Z or peptides by mass spectrometry
  • the analyte is derivatized with a modifying reagent, and the derivative is subjected to microchip electrophoresis. And an eluate from the microchip electrophoresis is introduced into a mass spectrometer.
  • the step of converting the derivative converts the amino group or imino group of the analyte into any one of a strong rubamoyl group, a thiocarbamoyl group, a tertiary amine, and a quaternary ammonium salt.
  • R represents a hydrogen atom which is a side chain of an amino acid or an alkyl group which may have a substituent
  • R represents an alkyl which may have a substituent.
  • R and R independently represents an optionally substituted alkyl group, R and R together form a ring.
  • R and R represents an amino acid residue of a peptide
  • the other is a hydrogen atom
  • the modifying reagent is acetic anhydride, N-acetyl imidazole, N-acetyl succinimide, N-acetyl acetyl acetate, N-acetyl imidazole, Bolton hunter reagent, strong rubamate compound, isothiocyanate It is any compound selected from the group consisting of a compound, N-hydroxysuccinimide ester, dansyl silk mouthride, dub silk mouthride, dansyl fluoride, and NBD F (4-Fluoro-7-nitrobenzoforazan) ( The analysis method according to 1) to (4).
  • the above-mentioned strong rubamate compound is composed of 6-aminoquinolyl N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC), p-dimethylaminoaryl 1-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (DAHS), 3— Aminoviridyl N-hydroxysuccinimidyl force rubamate (APD S), p-Trimethylammosum-lil N-hydroxysuccinimidyl force rubamate Iodide (TAHS), Aminovirazyl N hydroxysuccinimidyl force rubamate, 9 Aminoacridyl® N hydroxysuccinimidyl rubamate and 1 naphthyl
  • AQC 6-aminoquinolyl N-hydroxysuccinimidyl carbamate
  • DAHS p-dimethylaminoaryl 1-N-hydroxysuccinimidyl carbamate
  • APD S Aminoviridyl N-hydroxysuccinimidyl
  • the mass spectrometer is an electrospray ionization mass spectrometer, an atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometer, a cold spray ionization mass spectrometer, or a laser spray ionization mass spectrometer (1) to (7 ) Amino acid analysis method.
  • a derivative represented by any one of (9) to (9) is prepared, the derivative is electrophoresed with a microchip electrophoresis apparatus, and the eluate from the microchip electrophoresis is supplied to the inlet of the analyzer. how to.
  • a pretreatment device for analyzing a sample containing a plurality of analytes consisting of amino acids, amines, and Z or peptides with a mass spectrometer, wherein the analyte and the modifying reagent are reacted.
  • a pretreatment apparatus comprising: a reaction unit that prepares the derivative according to (9) above; and a microphone chip electrophoresis unit that performs electrophoresis of the derivative.
  • FIG. 1-A This is a mass-elect mouth phloem when 17 kinds of amino acids were analyzed in Example 1.
  • Example 1 it is a mass elect mouth phloem when 17 kinds of amino acids were analyzed.
  • FIG. 2 shows a mass elect mouth pherogram (left) and a mass spectrum (right) when 17 types of amino acids were analyzed in Example 2.
  • FIG. 3 Mass-elect mouthpiece when analyzing four kinds of amino acid mixtures in Example 3. Program.
  • ⁇ -TAS In ⁇ -TAS, when a sample is moved by a potential difference, the moving speed differs depending on the electric property of the substance to be measured. In the case of mixed samples with multiple compound forces, the sample injection volume can be made constant, but the rate of reaching the injection site will vary, so the ratio of the compound in the sample solution will change. There is a risk of affecting. This phenomenon is a very serious problem when using ⁇ -TAS, especially when quantitative analysis is performed, in that the signal intensity at the detection peak is reduced or the quantitative performance is impaired. In particular, in the case of compounds with greatly different electrical properties, such as amino acids, sugars, peptides, and organic acids, this is a more serious problem because it depends greatly on the ⁇ and salt concentration of the buffer used.
  • the pKa of biomolecules such as amino acids, peptides, organic acids and nucleic acids is diverse, centering around neutrality. This diversity of pKa appears as a difference in mobility. This is particularly noticeable in the case of amino acids having amino groups and carboxyl groups.
  • the pKa of the amino group varies greatly depending on the type of amino acid. Therefore, in the method of the present invention, the amino group is modified with a modifying reagent so that it does not have basicity, is a molecule having a larger pKa, or is introduced by introducing a smaller molecule. Can be reduced. This can reduce the difference in mobility during sample introduction.
  • samples to be analyzed include “analytes comprising amino acids, amines (primary amines, secondary amines, etc.), and Z or peptides”.
  • analytes are compounds having an amino group and a Z or imino group in the molecule (may be in the form of a salt), and one or more amino groups may be present.
  • the analyte present in the sample may be one kind or a mixture of plural kinds, but the effect of the present invention is exhibited when a plurality of compounds are contained.
  • Specific examples include 20 natural amino acids, hydroxylysine hydroxyproline, non-natural amino acids such as homocystine and homoserine, and amines such as histamine and ortho. A plurality of such compounds may be included.
  • a peptide in which a plurality of amino acids such as dipeptidyl tripeptides are linked is also included in the analyte of the present invention.
  • proteomics for comprehensive analysis of proteins has played an important role in the field of life science research.
  • the protein to be analyzed The quality is cleaved with trypsin to produce peptide fragments, which are measured with a force mass spectrometer.
  • trypsin is an enzyme that cleaves at the carboxyl terminus of protein lysine or arginine residues
  • the peptide produced is a peptide with only one lysine or arginine residue at the C-terminus. Since the peptide thus prepared has a limited reaction site with the modifying reagent according to the present invention, it can be easily analyzed by the method of the present invention in the same manner as the amino acid amine.
  • Non-Patent Document 5 Many methods for derivatizing amino acid amino groups are known (see, for example, Non-Patent Document 5). As a derivatization method in which the positive charge of the amino group is retained, there is gua-zylation. In the adjustment of pKa, which is the main point of the present invention, it is preferable to convert an amino group to a strong rubermoyl group by subjecting it to a strong rumomoi or acetylene, or to convert to a thiocarbamoyl group by thiocarbamoylation. ⁇ .
  • acetylating reagents include acetic anhydride, N-acetyl imidazole, N-acetyl succinimide and N-acetyl acetyl acetate, N-acetyl imidazole, and Bolton-Hunter reagent.
  • powerful rubamate compounds, isothiocyanate compounds, N-hydroxysuccinimide esters and alkylating agents such as dansyl lip, dub silk lip, and dansyl fluoride, which are often used for amino group labeling of amino acids and peptides. Can be used.
  • a force rubamate compound that reacts with an amino acid to generate a derivative such as the above formula (1), more specifically 6-aminoquinolyl-N hydroxysuccinimidyl force rubamate (AQC), or p dimethylaminoa -Ril-N-hydroxysuccinimidyl-force rubamate (DAHS), 3-aminobilidyl-N-hydroxysuccinimidyl-force rubamate (APDS), p-trimethylammo-allyl-N-hydroxysuccinimidyl-force rubamate iodide (TAHS), aminovirazyl N-hydroxysuccinimidyl strength rubamate, 9-aminoacridyleu N-hydroxysuccinimidyl carbamate, or 1-naphthylamino-N-hydroxysuccinimidyl strength rubamate are more preferred.
  • AQC 6-aminoquinolyl-N hydroxysuccinimidyl force rubamate
  • isothiocyanate compounds that react with amino acids to form derivatives such as the above formula (2), more specifically, phenol isothiocyanate, fluorescein isothiocyanate and the like can be mentioned.
  • benzyloxycarbol (Z) group, t-butoxycarbole (Boc) group, 9 fluoromethoxycarboro -Frucyl group can also be introduced and converted to a force rubamoyl group (see Non-Patent Document 6, for example).
  • 6-aminoquinolyl-N hydroxysuccinimidyl force rubamate AQC
  • DAHS p-dimethylamino aryl-1-N hydroxysuccinimidyl force rubamate
  • APDS 3-aminobilylyl-N hydroxysuccinimidyl force Rubamate
  • TAHS p-trimethylammo-allyl-N-hydroxysuccinimidyl-force rubamate iodide
  • aminovirazyl-N-hydroxysuccinimidyl-force rubamate 9 aminoacridyl N-hydroxysuccinimidyl carbamate
  • 1-naphthylamino-N-hydroxysuccinimidyl force rubamate or the like can be used, and an effect of improving sensitivity in mass spectrometry can be achieved.
  • Derivative amines or amino acids can be detected and quantified by analyzing with a microchip electrophoresis-mass spectrometer. Since it is possible to perform mass separation with a mass spectrometer without performing compound separation on a microchip, it is possible to shorten the channel length of the microchip normally used for separation as much as possible, greatly increasing the analysis time. Can be realized. As a result, the auto-injector can inject an accurate volume without changing the ratio and concentration of the components of the sample. As a result, according to the present invention, it is possible to simultaneously achieve the stability of the amount of introduced sample, the increase in sensitivity, and the high speed.
  • microchip electrophoresis there is a method using a reverse phase carrier in addition to capillary electrophoresis. By using this together, it is possible to separate oral and isoleucine, for example, with compounds and amino acids having the same mass.
  • ⁇ -TAS a potential difference is often used when moving a sample or a reagent. Therefore, according to the present invention, compounds having different mobilities can be made uniform in mobility, and can be widely applied to ⁇ -TAS.
  • the mass spectrometric method used in the present invention is a method in which a liquid containing a sample eluted by microchip electrophoresis is atomized, injected into an atomizer, ionized, and measured in the gas phase. It is.
  • electrospray ionization ESI
  • atmospheric pressure examples include, but are not limited to, chemical ionization (APCI), cold spray ion mass spectrometry (CSI), and laser spray ionization (LSI).
  • APCI chemical ionization
  • CSI cold spray ion mass spectrometry
  • LSI laser spray ionization
  • the resulting ions are subjected to mass spectrometry and separated by mass-to-charge ratio (mZz) by applying various voltages to the electrodes.
  • This mass spectrometer plays an important role in the sensitivity and resolution of analytical data, the accuracy of mass, and the abundance of information that can be obtained from mass spectral data.
  • ion separation methods including magnetic, electric, ion trap, time-of-flight (TOF), quadrupole, And Fourier transform cyclotron type.
  • TOF time-of-flight
  • quadrupole quadrupole
  • Fourier transform cyclotron type Each of these has advantages and disadvantages. Forces that can be used alone or in conjunction with each other.
  • ESI using ESI a quadrupole mass spectrometer is usually used.
  • MSZMS quadrupoles in series
  • Measurement was performed with an IX chip electrophoresis mass spectrometer.
  • the ⁇ -chip electrophoresis mass spectrometer is the same as the chip electrophoresis apparatus in which an ESI emitter is mounted on a commercially available mass spectrometer (the apparatus disclosed in Patent Document 2 and Non-Patent Document 4).
  • the material of the microchip was quartz, and the channel shape was a channel width of 82 m, a channel depth of 36 m, and a separation channel length of 59 mm.
  • Positive EOF silica
  • Negative EOF PolyE-323 coated
  • Picotip New Objectve, FS360-50-15-N was used as the ESI emitter.
  • Measurement mass range mZz 160-800
  • Figures l-A and l-B show a mass-elect mouth pherogram when analyzed using a microchip after coating samples with 17 types of amino acids converted to AQC simultaneously. Samples were introduced by the Gate Injection method at 1 minute intervals for 1 second. All 17 AQC amino acids could be detected at 1 minute intervals.
  • Table 2 shows the same peak area, that is, the reproducibility of quantitativeness. When measured 5 times, all amino acids showed very high reproducibility.
  • Example 2 Mass-elect oral pherogram when a sample prepared by simultaneously AQCing 17 types of amino acids by the same method as in Example 1 was introduced into a mass spectrometer for 1 second at intervals of 2 minutes using a PolyE-323 coated microchip. Figure 2 shows the mass spectrum. AQC amino acids with good accuracy could be detected at 2-minute intervals.

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Abstract

　アミノ酸を質量分析計で分析する場合の試料の注入を効率的、かつ精度よく行うための試料の前処理方法を提供する。アミノ酸、アミン、及び／又はペプチドからなる分析物を含む試料を質量分析法により分析する方法において、前記分析物を修飾試薬により誘導体化し、当該誘導体をマイクロチップ電気泳動に供し、そして、前記マイクロチップ電気泳動からの溶出液を質量分析計へ導入する。

Description

明 細 書
質量分析計によるアミノ酸分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、質量分析計によるアミノ酸等の分析方法、特に、マイクロチップ電気泳 動により分析試料を前処理して効率的にアミノ酸等を質量分析する方法、並びにそ のための試料の供給方法に関する。
背景技術
[0002] アミノ酸を分析する方法は、アミノ酸アナライザーによる方法が最も精度が良ぐ普 及している。しかし、その分析時間は 1時間から 2時間と非常に長いこと、及び 10〜5 Opmolと感度が比較的低いことが課題である。感度の課題を克服するために、紫外 標識や蛍光標識を行う方法が開発され、蛍光検出によりその感度は lOOfmol程度ま で改善されているが、更なる感度向上が望まれている。また、分析時間の問題は解 決していない。最近、蛍光標識と液体クロマトグラフィー質量分析計 (以下、 LC M Sという。）を組み合わせることにより、感度向上に合わせて、分析時間の短縮が実現 されている（特許文献 1参照)。この方法を用いることにより、分析時間は 20分と大幅 に短縮することができる。感度は、質量分析装置の性能に依存するが、高価なタンデ ム質量分析計を用いれば、数 fmol以下で定量が可能である。
[0003] し力しながら、アミノ酸分析のニーズは幅広ぐ更なる高感度化、高速化が望まれて いる。液体クロマトグラフィーを用いる上では、いずれの性能向上も限界に達しており 、液体クロマトグラフィーを用いな 、新たな方法の開発が望まれて 、る。
[0004] 一方、イオン、有機酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、糖などの電荷を有す る微量物質を分離する方法として、毛細管電気泳動が用いられる。毛細管電気泳動 は、溶液中の荷電分子を分離する一般的な方法である。毛細管電気泳動 (CE)とタ ンデム質量分析 (MS/MS)を組み合わせた CEZMSZMSでアミノ酸分析を行う 方法が知られている (非特許文献 1参照)。この方法を用いても、分析時間は 15分、 感度も数 fmolと大幅な改善には至っていない。一方、従来の分析装置や反応装置 をミニチュア化し、チップ基盤上に集積させたミクロ化統合分析システム（ μ— TAS) の研究開発が近年盛んであり、実用化レベルに達した。ガラス基板やポリマー系の 基材に微細加工を施したマイクロチップを用いて、毛細管電気泳動を行う手法 (マイ クロチップ電気泳動： μチップ CE)が μ—TASの主要技術となって!/ヽる（非特許文 献 2及び 3参照)。また、 チップ CEに質量分析計を検出器として接続した; ζチップ CEZMSは、非常に高感度でかつ質量情報を得ることができる優れた装置である。 μチップ CEZMSや毛細管電気泳動 MSを用いることにより、アミノ酸やペプチド などを 90秒〜 15分程度で分離分析することができる (特許文献 2及び非特許文献 4 参照)。
[0005] μチップにおける試料移動および注入は、電位差を利用して行われる。サンプル や緩衝液や試薬などの入った複数のリザーバーを微細な流路で結び、リザーバー間 の電圧差で、サンプルなどの荷電分子を移動させる方法が用いられる。 チップ CE を用いて精度良く分離'定量分析を行うためには、サンプル注入量を正確に制御す ることが重要である。より正確にサンプルを注入するためにサンプル量調整用構造を 有するマイクロチップが開発されている（特許文献 3、 5、及び 6参照)。
[0006] 一方、スプレーイオンィ匕質量分析計は、高感度でかつ数秒で質量を測定できるス ループットの高い分析装置である。質量分析計での短時間分析のボトルネックは、サ ンプル導入時間である。特に、既存のオートインジェクターで連続分析を行う場合、 サンプル導入間に必要な時間は、最低でも 1分以上力かってしまうため、質量分析計 の性能を十分に活かすことができない。より高速に試料を質量分析計に供給するた めの方法としては、音響インジェクターを用いたシステムがある（特許文献 4参照)。多 検体の溶液試料を入れたマイクロウェルプレイトを用い、音響パルスにより、順次マイ クロウエルプレイト内の試料力 小滴を発生させ、質量分析計に供給する方法である
1S 未だ実用化には至っていない。また、今後発展が期待される TASとの組み 合わせが原理的に不可能である。
[0007] 特許文献 1：国際公開第 03Z069328号パンフレット
特許文献 2：特開 2001— 83119号公報
特許文献 3：特表平 10 - 507516号公報
特許文献 4：特開 2004 - 205510号公報 特許文献 5 :特開 2005— 164242号公報
特許文献 6：特開 2001 - 242137号公報
非特許文献 1：曽我ら、 Electrophoresis. 2004 Jul;25(13): 1964-72
非特許文献 2 : Gerard J. M. Bruin, Electrophoresis 2000,21,3931-3951
非特許文献 3： Lee.S.J. and Lee,S.Y.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2004,64,289-299 非特干文献 4 :Y.Tachibana, K.Otsuka, b.Terabe, A. Aral, K. buzuki, b. Nakamura, J
. Chromatogra. A, 2004, 1025, 287—296
非特許文献 5 :日本生化学会編、新生化学実験講座 1 タンパク質 IV構造活性相関 第 2章
非特許文献 6 :日本化学会編、第 4版実験化学講座 22、有機合成 IV 酸，アミノ酸- ペプチド 第 2章 3項 保護アミノ酸の合成、丸善
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] マイクロチップを用いる分析方法にぉ 、て、サンプル注入する容量を正確に調整で きる努力がなされている。一方、毛細管電気泳動は、測定対象物質の電気的性質の 違いにより分離する技術である。従って、マイクロチップ電気泳動において分離流路 にサンプルを導入する場合、測定対象物質の電気的性質の違いによって、その移動 速度が異なってしまう。複数の化合物からなる混合試料の場合には、サンプル注入 容量を一定にすることはできても、分離流路に導入される速度に違 、がでることから 、試料溶液中の化合物の存在比に変化を及ぼす恐れがある。この現象は、 μチップ CEを用いて定量分析を行う際の重大な問題点であり、検出ピークの信号強度を低 下させる原因となる。特に、アミノ酸、糖、ペプチド、有機酸など、電気的性質が大きく 異なる化合物の場合には、用いるノ ッファーの ρΗや塩濃度によって、大きく左右さ れ、より深刻な課題である。
[0009] このような種々の課題を有する従来技術にお!、て、本発明は、アミノ酸を質量分析 計で分析する場合の試料の注入を効率的、かつ精度よく行うための試料の前処理方 法を提供することにある。
課題を解決するための手段 [0010] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、アミノ酸を修飾試薬により 誘導体化し、当該アミノ酸誘導体をマイクロチップ電気泳動に供した後に、質量分析 計へ導入することによって、試料の注入が効率ィ匕され、かつ注入量の精度も向上す ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の内容を含む
[0011] (1)アミノ酸、ァミン、及び Z又はペプチドからなる分析物を含む試料を質量分析法 により分析する方法において、前記分析物を修飾試薬により誘導体化し、当該誘導 体をマイクロチップ電気泳動に供し、そして、前記マイクロチップ電気泳動からの溶出 液を質量分析計へ導入することを特徴とする分析方法。
[0012] (2)前記誘導体ィ匕する工程が、前記分析物のアミノ基又はイミノ基を力ルバモイル基 、チォカルバモイル基、 3級ァミン、及び 4級アンモ-ゥム塩の何れかへ変換すること である（1)記載の分析方法。
[0013] (3)前記誘導体が、芳香族環を有する 3級ァミン又は 4級アンモニゥム塩の構造であ つて前記質量分析にぉ ヽてイオン化しゃす!/ヽ構造を有する（1)記載の方法。
[0014] (4)前記誘導体が、下記一般式（1)〜（9)の何れかで示される構造を有する（1)〜（ 3)何れか記載の分析方法。
[0015] [化 1]
Figure imgf000006_0001
[0016] [化 2]
Figure imgf000006_0002
(2)
[0017] [化 3] [ ] [2200]
(ん)
Figure imgf000007_0001
[Ϊ200]
Figure imgf000007_0002
[9^ ] [0200]
(
Figure imgf000007_0003
[S^ ] [6100]
Figure imgf000007_0004
剛 [8100]
(e)
Figure imgf000007_0005
SC.l7ZC/900Zdf/X3d T6S690/.00Z OAV
Figure imgf000008_0001
[0023] [化 9]
Figure imgf000008_0002
ただし、上記式（1)〜（9)において、 Rはアミノ酸の側鎖である水素原子又は置換 基を有していてもよいアルキル基を表し、 Rは置換基を有していてもよいアルキル基 又は芳香族性を示す炭素環若しくは複素環を含む置換基を表し、 Rと Rは相互に
2 3 独立して置換基を有していてもよいアルキル基を表し、 Rと Rは一緒になつて環を形
2 3
成してもよぐ又は Rと Rの一方がペプチドのアミノ酸残基を表すとき他方は水素原
2 3
子であってもよい。
[0024] (5)前記修飾試薬は、酢酸無水物、 N ァセチルイミダゾール、 N ァセチルスクシ ンイミド、 N ァセチルイミドアセテート、 N ァセチルイミダゾール、ボルトン ハンタ 一試薬、力ルバメートィ匕合物、イソチオシァネートイ匕合物、 N ヒドロキシスクシンイミ ドエステル、ダンシルク口ライド、ダブシルク口ライド、ダンシルフルオリド、及び NBD F(4- Fluoro-7-nitrobenzoforazan)からなる群より選択される何れかの化合物である (1)〜(4)記載の分析方法。
[0025] (6)前記力ルバメート化合物が、 6 ァミノキノリル N ヒドロキシスクシィミジルカル バメート（AQC)、 p ジメチルアミノア-リル一 N ヒドロキシスクシンィミジルカルバメ ート（DAHS)、 3—アミノビリジル一 N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート（APD S)、 p トリメチルアンモ-ゥムァ-リル一 N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート アイオダイド（TAHS)、アミノビラジル N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート、 9 アミノアクリジルー N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート、及び 1 ナフチル アミノー N—ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメートからなる群より選択される何れかで ある（5)に記載の分析方法。
[0026] (7)前記イソチオシァネート化合物が、フエ-ルイソチオシァネート又はフロォロセィ ンイソチォシァネートである（5)に記載の分析方法。
[0027] (8)前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、大気圧化学イオン 化質量分析計、コールドスプレーイオン化質量分析計又はレーザースプレーイオン 化質量分析計である（1)〜 (7)に記載のアミノ酸の分析方法。
[0028] (9)アミノ酸、ァミン、及び Z又はペプチドからなる複数の分析物を含む試料の分析 装置への供給方法であって、前記分析物と修飾試薬とを反応させて上記一般式 (1)
〜（9)の何れかで示される誘導体を調製し、当該誘導体をマイクロチップ電気泳動 装置により電気泳動し、前記マイクロチップ電気泳動からの溶出液を分析装置の注 入口に供給することを特徴とする方法。
[0029] (10)アミノ酸、ァミン、及び Z又はペプチドからなる複数の分析物を含む試料を質量 分析計で分析するための前処理装置であって、前記分析物と修飾試薬とを反応させ て上記（9)に記載の誘導体を調製する反応部と、当該誘導体を電気泳動するマイク 口チップ電気泳動部と、を備えることを特徴とする前処理装置。
発明の効果
[0030] 本発明の方法によれば、質量分析計によりアミノ酸分析を行う際の試料の導入が効 率化され、従来法に比較して短時間に多数の検体を分析できるようになる。また、注 入精度も向上し、定量性も向上することとなる。
図面の簡単な説明
[0031] [図 1-A]実施例 1において、 17種類のアミノ酸を分析したときのマスエレクト口フエログ ラムである。
[図 1-B]実施例 1にお 、て、 17種類のアミノ酸を分析したときのマスエレクト口フエログ ラムである。
[図 2]実施例 2において、 17種類のアミノ酸を分析したときのマスエレクト口フエログラ ム（左）とマススペクトル (右）である。
[図 3]実施例 3において、 4種類のアミノ酸混合物を分析したときのマスエレクト口フエ ログラムである。
発明を実施するための最良の形態
[0032] μ—TASにお 、て、電位差でサンプルを移動する場合、測定対象物質の電気的 性質の違いによって、その移動速度が異なってしまう。複数の化合物力もなる混合試 料の場合には、サンプル注入容量を一定にすることはできても、注入部位までに到 達する速度に違いがでることから、試料溶液中の化合物の存在比に変化を及ぼす恐 れがある。この現象は、 μ—TASを用いる際、特に定量分析を行う際に、検出ピーク の信号強度を低下させたり、定量性を損なう等の点で非常に重大な問題点である。 特に、アミノ酸、糖、ペプチド、有機酸など、電気的性質が大きく異なる化合物の場合 には、用いるバッファーの ρΗや塩濃度によって、大きく左右され、より深刻な課題で ある。アミノ酸、ペプチド、有機酸や核酸などの生体内分子の pKaは、中性付近を中 心にして、多様性がある。この pKaの多様性が移動度の差となって現れる。特に、アミ ノ基とカルボキシル基を持つアミノ酸の場合、より顕著である。アミノ酸の種類によって 、ァミノ基の pKaは大きく異なる。そこで、本発明の方法は、アミノ基を修飾試薬で修 飾し、塩基性を持たな 、ようにするかある 、はより pKaの大きな分子ある 、は小さな 分子を導入することで、 pKaの違いを低減することを可能にするものである。これによ り、サンプル導入時の移動度の差を低減することができる。
[0033] 本発明において、分析対象となる試料には、「アミノ酸、ァミン（1級ァミン、 2級アミ ン等）、及び Z又はペプチドからなる分析物」を含む。これらの分析物は、分子内にァ ミノ基及び Z又はイミノ基を有する化合物 (塩の形態でもよい。）であり、アミノ基ゃイミ ノ基は 1個でも複数でもよい。また、試料中に存在する分析物は 1種でも複数種の混 合物でもよいが、複数の化合物が含まれている場合に本発明の効果が発揮される。 具体的には、天然の 20種類のアミノ酸の他、ヒドロキシリジンゃヒドロキシプロリン、又 はホモシスティンやホモセリン等の非天然アミノ酸、及びヒスタミンやオル-チン等の ァミン類が含まれる。このような化合物を複数種含んでいてもよい。さらに、ジぺプチ ドゃトリペプチド等のアミノ酸が複数個連なったペプチドも本発明の分析物に含まれ る。近年、タンパク質の網羅的解析を目的とするプロテオミタスが生命科学研究の分 野で重要な役割を果たしている。一般的なプロテオミクスでは、解析対象のタンパク 質をトリプシンで切断してペプチド断片にして力 質量分析計で測定される。トリプシ ンはタンパク質のリジン残基やアルギニン残基のカルボキシル末端で切断する酵素 であるから生成するペプチドは C末端にリジン又はアルギニンを 1残基のみ持つぺプ チドである。このようにして調製されたペプチドは、本発明に係る修飾試薬との反応 部位が限定されているためアミノ酸ゃァミンと同様に本発明の方法により容易に分析 することが可能である。
アミノ酸のァミノ基の誘導体化方法は、多くの手法が知られて 、る（例えば、非特許 文献 5参照)。ァミノ基の正電荷が保持される誘導体化法としては、グァ -ジル化ゃァ ミジンィ匕がある。本発明の要点である pKaの調節においては、アミノ基を力ルバモイ ルイ匕やァセチルイ匕することにより力ルバモイル基に変換すること、又はチォカルバモ ィルイ匕することによりチォカルバモイル基に変換することが好まし ヽ。ァセチル化試薬 としては、酢酸無水物、 N ァセチルイミダゾール、 N ァセチルスクシンイミドおよび N ァセチルイミドアセテート、 N ァセチルイミダゾール、ボルトン—ハンター (Bolto n-Hunter)試薬などがある。また、アミノ酸やペプチドのアミノ基標識に良く用いられて いる力ルバメート化合物、イソチオシァネート化合物、 N ヒドロキシスクシンイミドエス テルやアルキル化剤であるダンシルク口ライド、ダブシルク口ライド、ダンシルフルオリ ド、などを用いることができる。具体的には、アミノ酸と反応して上記式（1)のような誘 導体を生ずる力ルバメート化合物、より具体的には、 6—ァミノキノリル—N ヒドロキ シスクシィミジル力ルバメート（AQC)や、 p ジメチルアミノア-リル一 N ヒドロキシ スクシンィミジル力ルバメート（DAHS)、 3—アミノビリジル一 N ヒドロキシスクシンィ ミジル力ルバメート（APDS)、 p トリメチルアンモ-ゥムァ-リル一 N ヒドロキシスク シンィミジル力ルバメートアイオダイド (TAHS)、アミノビラジル N ヒドロキシスクシ ンィミジル力ルバメート、 9 アミノアクリジルー N ヒドロキシスクシンィミジルカルバメ ート、又は 1 ナフチルアミノー N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート等がより好 ましい。また、アミノ酸と反応して上記式（2)のような誘導体を生ずるイソチオシァネー ト化合物、より具体的には、フエ-ルイソチオシァネート、フロォロセインイソチォシァ ネートなどが挙げられる。さらに、ァミノ基の保護基として一般的な、ベンジルォキシ カルボ-ル（Z)基、 t—ブトキシカルボ-ル（Boc)基、 9 フルォレ -ルメトキシカルボ -ル (Fmoc)基などを導入し、力ルバモイル基に変換することもできる（例えば、非特 許文献 6参照)。
[0035] また、質量分析の感度を向上させるためには、電荷を有する誘導体化がより好まし い。上述した荷電の調節作用を考慮すると芳香環 3級ァミンあるいは 4級アンモ-ゥ ム塩を有する誘導体がより好ましい。より具体的には、 6—ァミノキノリル—N ヒドロ キシスクシィミジル力ルバメート（AQC)や p ジメチルアミノア-リル一 N ヒドロキシ スクシンィミジル力ルバメート（DAHS)、 3—アミノビリジル一 N ヒドロキシスクシンィ ミジル力ルバメート（APDS)、 p トリメチルアンモ-ゥムァ-リル一 N ヒドロキシスク シンィミジル力ルバメートアイオダイド (TAHS)、アミノビラジル N ヒドロキシスクシ ンィミジル力ルバメート、 9 アミノアクリジルー N ヒドロキシスクシンィミジルカルバメ ート、又は 1 ナフチルアミノー N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート等を用いる ことができ、質量分析での感度向上効果を併せて図ることができる。
[0036] 誘導体ィ匕ァミンまたはアミノ酸は、マイクロチップ電気泳動—質量分析計で分析す ることにより、検出、定量することができる。マイクロチップでの化合物の分離を行わな くとも質量分析計で質量分離することができるため、通常分離に用いられるマイクロチ ップの流路長を極力短くすることが可能であり、分析時間の大幅な短縮を実現できる 。これにより、サンプルの構成成分の比率、濃度を変えずに、正確な容量を注入でき るオートインジェクターとなる。以上の結果、本発明により、導入サンプル量の安定ィ匕 、高感度化、高速ィ匕を同時に達成することが可能となる。
[0037] 一方、マイクロチップ電気泳動において、毛細管電気泳動以外に、逆相系担体を 用いる方法もある。これを併用することで、質量が同じ化合物、アミノ酸で例えれば口 イシンとイソロイシンの分離も可能になる。
[0038] 一般的に、 μ— TASにおいて、サンプルや試薬を移動する際に、電位差を利用す ることがしばしばある。従って、本発明により、移動度の異なる化合物を均一な移動度 にすることが可能となり、広く μ—TASに応用することができる。
[0039] 本発明において使用する質量分析法は、上記マイクロチップ電気泳動により溶出さ れる試料を含んだ液体を霧状にして、霧化装置に注入してイオンィ匕し、気相で測定 する方法である。霧化装置としては、エレクトロスプレ一一イオン化法 (ESI)、大気圧 化学イオン化法 (APCI)、コールドスプレーイオンィ匕質量分析計 (CSI)、レーザース プレーイオンィ匕法 (LSI)等が在るがこれらに限定されない。生じたイオンは質量分析 にかけられ、いろいろな電圧を電極にかけることによって、質量と電荷の比（mZz)に よって分離される。この質量分析部は、分析データの感度や分解能、質量の正確さ やマススペクトルデータ力 得られる情報の豊富さに重要な役割を果たして 、る。ィ オンの分離方法としては、現在、 6種類の基本的なタイプに分類することができ、それ らは、磁場型、電場型、イオントラップ型、飛行時間 (TOF)型、四重極型、及びフー リエ変換サイクロトロン型である。これらはそれぞれ長所と短所があり、単独で又は互 いに連結して用いることができる力 ESIによるイオンィ匕では通常、四重極質量分析 部が用いられる。さら〖こ、四重極を複数個直列につなぐことにより（MSZMS)多価ィ オンの測定と解釈が確実になる。
[0040] 以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明を 何ら限定するものではな 、。
実施例 1
[0041] [アミノ酸の誘導体化]
17種類のアミノ酸混合標準液、 H型（Amino Acids Mixture Standard Solution, Typ e H：和光純薬社製） 20 μ Lを硼酸緩衝液 (0. 2Μ硼酸塩、 ρΗ8. 8) 60 μ Lに添加し 、よく混合した。この混合液に、 6—ァミノキノリル一 N—ヒドロキシスクシィミジルカル ノメート（AQC)標識試薬溶液 (3 - 5mgの AQCを lmlのァセトニトリルに溶解ある!/ヽ は日本ウォーターズ社製 AccQ—Fluor (登録商標)試薬キットの試薬粉末を lmlの 試薬希釈液に溶解） 20 Lを添加した。得られた混合物を 55°Cで 10分間加熱した。 誘導体ィ匕したアミノ酸混合物は、希釈緩衝液 10mM (NH ) CO (pH8. 7)にて希
4 2 3
釈して、 IXチップ電気泳動質量分析計で測定を行った。
[0042] [ μチップ電気泳動質量分析計によるアミノ基修飾アミノ酸の測定]
μチップ電気泳動質量分析計は、市販の質量分析計に ESIェミッタを装着した チップ電気泳動装置 (特許文献 2及び非特許文献 4に開示された装置と同様である。
)を接続して使用した。
[0043] [ μチップ電気泳動の条件] マイクロチップの材質は石英であり、流路形状は流路幅 82 m、流路深さ 36 m、 分離流路長さ 59mmであった。流路表面処理としては、 Positive EOF (アルカリによる シラノール活性化）あるいは、 Negative EOF (PolyE— 323コーティングしたもの）を 使用した。 ESIェミッタとしては、 Picotip(New Objectve社製、 FS360- 50- 15- N)を使用 した。
[0044] [電気泳動条件]
サンプノレ導入： Gate Injection法
電位勾配 ： +400V/cm (Positive EOF)
-400V/cm (Negative EOF)
Gate比 : 2. 0
ESI電圧 : 3. OkV
[0045] [質量析計の測定条件]
測定機器 ： ESI— Q—tof—2 (Micromass社）
測定質量範囲 ： mZz 160- 800
スキャン時間 ： 1秒（1秒間積算したものが 1スキャン）
スキャン間の時間： 0. 1秒
コーン電圧 : 30V
コリジョン電圧 : 10V
ァータ処理 ： Mass Lynx v.3.5 (Micromass社)
[0046] [結果]
図 l—A、図 l—Bに 17種類のアミノ酸を同時に AQC化したサンプルをコ一ティン グして ヽな 、マイクロチップを用いて、分析したときのマスエレクト口フエログラムを示 した。 1分間隔で、 1秒間 Gate Injection法でサンプルを導入した。 17種類全ての AQ C化アミノ酸を 1分間隔で検出することができた。
[0047] このときのサンプル導入間隔の再現性を以下の表 1に示した。 5回測定したときの 再現性は、全てのアミノ酸につ 、て非常に精度がよ力つた。
[0048] [表 1] # 1 2 3 4 5 average SD RSD (%)
Gly 59. 4 60. 0 58. 8 60. 0 59. 4 59. 52 0. 502 0. 8
Ala 58. 2 60. 0 58. 8 59. 4 59. 4 59. 16 0. 684 1. 2
Ser 58. 2 60. 0 58. 8 60. 0 59. 4 59. 28 0. 782 1. 3
Pro 58. 2 58. 8 57. 6 59. 4 58. 8 58. 56 0. 684 1. 2
Va l 58. 2 58. 8 57. 6 59. 4 58. 8 58. 56 0. 684 1. 2
Thr 57. 6 58. 8 57. 6 59. 4 58. 8 58. 44 0. 805 1. 4
Le/ I l 57. 6 58. 2 57. 6 58. 2 58. 8 58. 08 0. 502 0. 9
Asp 75. 6 75. 6 75. 6 75. 0 75. 6 75. 48 0. 268 0. 4
Glu 73. 2 73. 8 73. 2 73. 8 74. 4 73. 68 0. 502 0. 7
Met 57. 6 58. 8 57. 6 59. 4 58. 8 58. 44 0. 805 1. 4
Hi s 57. 6 57. 0 56. 4 57. 0 57. 6 0. 502 0. 9
Phe 57. 6 58. 8 57. 6 59. 4 57. 6 58. 20 0. 849 1. 5
Arg 48. 6 49. 8 49. 8 49. 2 49. 8 49. 44 0. 537 1. 1
Tyr 57. 6 58. 2 56. 4 58. 2 57. 6 57. 60 0. 735 1. 3
Ly s 56. 4 57. 0 55. 2 57. 0 56. 4 56. 40 0. 735 1. 3 cyst ine 65. 4 67. 2 65. 4 66. 0 66. 6 66. 12 0. 782 1. 2
[0049] 同じぐピーク面積すなわち定量性の再現性を表 2に示した。 5回測定したとき、全 てのアミノ酸で非常に高 、再現性を示した。
[0050] [表 2]
Figure imgf000015_0001
実施例 2 [0051] 実施例 1と同じ方法により 17種類のアミノ酸を同時に AQC化したサンプルを PolyE — 323コーティングしたマイクロチップを用いて、質量分析に 2分間隔で 1秒間導入し たときのマスエレクト口フエログラムとマススペクトルを図 2に示した。 2分間隔で精度良 ぐ AQC化アミノ酸を検出することができた。
実施例 3
[0052] 実施例 1と同じ方法により、 Leu, Glu, Phe, Argの 4種類のアミノ酸混合物を AQC 化したサンプルを PolyE— 323コーティングしたマイクロチップを用いて、質量分析に 15秒間隔で 1秒間導入したときのマスエレクト口フエログラムを図 3に示した。 15秒間 隔でも正確にサンプルを導入することができ、質量を測定できた。本実施例では 15 秒間隔でのサンプル導入を行つたが、 2〜 3秒間隔でも可能である。

Claims

請求の範囲
[1] アミノ酸、ァミン、及び Z又はペプチドからなる分析物を含む試料を質量分析法に より分析する方法において、前記分析物を修飾試薬により誘導体化し、当該誘導体 をマイクロチップ電気泳動に供し、そして、前記マイクロチップ電気泳動からの溶出液 を質量分析計へ導入することを特徴とする分析方法。
[2] 前記誘導体化する工程は、前記分析物のアミノ基又はイミノ基を力ルバモイル基、 チォカルバモイル基、 3級ァミン、及び 4級アンモ-ゥム塩の何れかへ変換することで ある請求項 1に記載の分析方法。
[3] 前記誘導体が、芳香族環を有する 3級ァミン又は 4級アンモ-ゥム塩の構造であつ て前記質量分析にぉ ヽてイオン化しゃす！/ヽ構造を有する請求項 1に記載の分析方 法。
[4] 前記誘導体が、下記一般式（1)〜（9)の何れかで示される構造を有する請求項 1 〜3何れか一項記載の分析方法：
[化 1]
Figure imgf000017_0001
[化 2]
Figure imgf000017_0002
(2)
[化 3]
Figure imgf000017_0003
(3.)
Figure imgf000018_0001
o
R
:
〇
R
(9) ただし、上記式（1)〜（9)において、 Rはアミノ酸の側鎖である水素原子又は置換 基を有していてもよいアルキル基を表し、 Rは置換基を有していてもよいアルキル基 又は芳香族性を示す炭素環若しくは複素環を含む置換基を表し、 Rと Rは相互に
2 3 独立して置換基を有していてもよいアルキル基を表し、 Rと Rは一緒になつて環を形
2 3
成してもよぐ又は Rと Rの一方がペプチドのアミノ酸残基を表すとき他方は水素原
2 3
子であってもよい。
[5] 前記修飾試薬は、酢酸無水物、 N ァセチルイミダゾール、 N ァセチルスクシン イミド、 N ァセチルイミドアセテート、 N ァセチルイミダゾール、ボルトン ハンター 試薬、力ルバメートィ匕合物、イソチオシァネートイ匕合物、 N ヒドロキシスクシンイミド エステル、ダンシルク口ライド、ダブシルク口ライド、ダンシルフルオリド、及び NBD— F力 なる群より選択される何れかの化合物である請求項 1〜4何れか記載の分析方 法。
[6] 前記力ルバメート化合物力 6—ァミノキノリル N ヒドロキシスクシィミジル力ルバ メート（AQC)、 p ジメチルアミノア-リル一 N ヒドロキシスクシンィミジルカルバメー ト（DAHS)、 3—アミノビリジル一 N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート（APDS )、 p トリメチルアンモ-ゥムァ-リル一 N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメートァ ィオダイド (TAHS)、アミノビラジル N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート、 9 アミノアクリジルー N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメート、及び 1 ナフチルァ ミノ一 N ヒドロキシスクシンィミジル力ルバメートからなる群より選択される何れかであ る請求項 5に記載の分析方法。
[7] 前記イソチオシァネートイ匕合物力 フエ二ルイソチオシァネート又はフロォロセインィ ソチオシァネートである請求項 5に記載の分析方法。
[8] 前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオンィ匕質量分析計、大気圧化学イオンィ匕 質量分析計、又はレーザースプレーイオンィ匕質量分析計である請求項 1〜7何れか 一項記載の分析方法。
アミノ酸、ァミン、及び/又はペプチドからなる複数の分析物を含む試料の分析装 置への供給方法であって、前記分析物と修飾試薬とを反応させて下記一般式（1) (9)の何れかで示される誘導体を調製し、当該誘導体をマイクロチップ電気泳動装 置により電気泳動し、前記マイクロチップ電気泳動からの溶出液を分析装置の注入 口に供給することを特徴とする方法：
[化 10]
Figure imgf000020_0001
[化 11]
Figure imgf000020_0002
(2)
[化 12]
Figure imgf000020_0003
(3)
[化 13]
Figure imgf000020_0004
(4)
[化 14]
Figure imgf000021_0001
[化 15]
Figure imgf000021_0002
[化 16]
Figure imgf000021_0003
R3
(7)
[化 17]
Figure imgf000021_0004
[化 18]
Figure imgf000021_0005
ただし、上記式（1)〜（9)において、 Rはアミノ酸の側鎖である水素原子又は置換 基を有していてもよいアルキル基を表し、 Rは置換基を有していてもよいアルキル基 又は芳香族性を示す炭素環若しくは複素環を含む置換基を表し、 R
2と R
3は相互に 独立して置換基を有していてもよいアルキル基を表し、 Rと Rは一緒になつて環を形
2 3
成してもよぐ又は Rと Rの一方がペプチドのアミノ酸残基を表すとき他方は水素原
2 3
子であってもよい。
アミノ酸、ァミン、及び Z又はペプチドからなる複数の分析物を含む試料を質量分 析計で分析するための前処理装置であって、
前記分析物と修飾試薬とを反応させて請求項 9に記載の誘導体を調製する反応部 と、
当該誘導体を電気泳動するマイクロチップ電気泳動部と、
を備えることを特徴とする前処理装置。
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