WO2014010700A1 - アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法 - Google Patents

アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2014010700A1
WO2014010700A1 PCT/JP2013/069038 JP2013069038W WO2014010700A1 WO 2014010700 A1 WO2014010700 A1 WO 2014010700A1 JP 2013069038 W JP2013069038 W JP 2013069038W WO 2014010700 A1 WO2014010700 A1 WO 2014010700A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
salt
amino compound
amino
amino acid
mass spectrometry
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/069038
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
利郎 松井
俊明 渡辺
Original Assignee
国立大学法人九州大学
学校法人福岡大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人九州大学, 学校法人福岡大学 filed Critical 国立大学法人九州大学
Priority to JP2014524880A priority Critical patent/JPWO2014010700A1/ja
Publication of WO2014010700A1 publication Critical patent/WO2014010700A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/66—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/46—Two or more oxygen, sulphur or nitrogen atoms
    • C07D239/47—One nitrogen atom and one oxygen or sulfur atom, e.g. cytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06147—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and His-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06156—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Trp-amino acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to an amino compound, a highly sensitive mass spectrometric method thereof, and a biomarker assay method. More specifically, an amino compound obtained by derivatization of an amino acid derivative such as a final saccharified product and a nitrobenzene compound and a salt thereof, and a mass spectrometric method capable of quantifying the amino compound quickly with high sensitivity and high accuracy , And a biomarker assay method using the same.
  • Diabetes is a condition in which the blood sugar level is pathologically high.
  • various organs are damaged as hyperglycemia continues for a long period of time.
  • lifestyle improvement oral hypoglycemic drug administration, and insulin injection.
  • prediabetes which is a potential diabetic army that is extremely difficult to determine only by measuring blood glucose levels in health examinations, that is, an early diagnosis method and a treatment system.
  • the Japan Diabetes Society has guided the implementation of fasting blood glucose (FPG) in the primary health checkup and the oral glucose tolerance test (OGTT) in the secondary health checkup as diagnostic criteria for prediabetes and diabetes.
  • FPG blood glucose
  • OGTT oral glucose tolerance test
  • Glucose intolerance in pre-diabetic patients is difficult to accurately diagnose only by the FPG test and glycated hemoglobin (HbA1c) test in the primary health checkup. Is recommended to take a secondary health checkup for OGTT.
  • this OGTT lacks the subject's long restraint time and convenience, and also has a problem such as imposing a physical burden of sugar (glucose) load and accompanying danger such as a rapid increase in blood glucose level,
  • the reality is that it is not as widespread as the blood glucose testing method by blood tests in general health examinations.
  • many potential prediabetics have failed to undergo a second OGTT health checkup, progressing to true diabetes without being aware of diabetes or its complications, and more severe Complications or necessitating renal dialysis.
  • a test is usually performed using fasting blood glucose (FPG), occasional blood glucose or glycated hemoglobin (HbA1c) as a determination index, and the FPG value is 100 mg / dL or higher, or the HbA1c value is 5.2%. If it is above, it is diagnosed that there is a suspicion of insulin resistance or IGT caused by it. However, since IGT due to insulin resistance appears as a major initial change after postprandial hyperglycemia, it is necessary to say that any index used in the conventional primary health check is insufficient in terms of accuracy, Conventional primary health checkup methods cannot be used as an early diagnosis of prediabetes.
  • FPG fasting blood glucose
  • HbA1c glycated hemoglobin
  • a primary health checkup a subject who is suspected of having insulin resistance or IGT using these indexes is subjected to a 75 g oral glucose tolerance test (secondary health checkup or subsequent health checkup ( 75 g OGTT), blood insulin, HOMA-R, etc. are tested to determine whether insulin resistance or IGT is positive, and a definitive diagnosis of prediabetes has been made.
  • these inspections are expensive and troublesome.
  • Final glycated products are also called glycated proteins, Maillard reaction products, and the like, and are protein derivatives having various structures generated by non-enzymatic reaction between a reducing sugar such as glucose and the amino group of the protein.
  • AGEs are the result of disruption of the functions of these proteins resulting from glycation modification of extracellular matrix proteins, membrane proteins, and intracellular proteins, and cell functions dependent on them, or the cellular responses caused by receptors with AGEs as ligands. Involved in the development and exacerbation of various lesions.
  • AGEs those derived from glyceraldehyde and methylglyoxal (MG), which are produced as glycolytic intermediates or by-products, are expected to be diagnostic markers for the onset and prognosis of diabetes and impaired glucose tolerance.
  • MG glyceraldehyde and methylglyoxal
  • Non-patent document 2 shows that the serum level of methylglyoxal-derived hydroimidazole was measured in an ELISA system using a polyclonal antibody of methylglyoxal-derived hydroimidazole for the serum of type 2 diabetic patients. It has been reported that it has increased.
  • the non-patent document 2 shows that there is a significant correlation between the serum level of methylglyoxal-derived hydroimidazole and the serum level of N ⁇ - (carbonylmethyl) lysine, which is one of AGEs, Serum levels of methylglyoxal-derived hydroimidazoles have been reported to be unrelated to fasting blood glucose plasma levels or hemoglobin levels.
  • Non-patent Document 3 as a result of measuring plasma of a type 1 diabetic patient using LC / MS / MS, the concentration of an adduct due to glycation or oxidation of protein and the concentration of its free residue (free adduct) increased. It shows that. For example, methyl glyoxal-derived hydroimidazolone, glyoxal-derived hydroimidazolone, or other AGEs such as N ⁇ - (carbonylmethyl) lysine, N ⁇ - (carbonylethyl) lysine, and free adducts thereof (free addct) are increased. It has been reported that
  • Non-patent document 4 suggests that methylglyoxal-derived hydroimidazolone free adduct is excellent as a marker for diabetic patients as a result of tandem mass spectrometry of plasma of type 1 diabetic patients.
  • Non-Patent Document 5 shows that as a result of measuring plasma and urine samples of type 1 diabetic patients by LC-MS / MS, in addition to an increase in blood glucose level and insulin level after glucose loading, methylglyoxal-derived hydroimidazole free adduct was added.
  • N ⁇ - (carbonylmethyl) lysine, N ⁇ - (carbonylethyl) lysine, glyoxal-derived hydroimidazolone, N ⁇ - [5- (2,3,4-trihydroxybutyl) -5-hydro-4-imidazolone 2- Ill] -ornithine (3DG-H1) and other free adducts have also been reported to increase.
  • this paper shows that not only hyperglycemia occurs after meals, but also a high carbonyl stress state is induced. Furthermore, this document describes tandem mass spectrometry results for many AGEs including argypirimidine and amino acids (arginine, lysine, methionine, tyrosine and tryptophan) in addition to methylglyoxal-derived hydroimidazolone free adduct. ing.
  • amino acid analysis is also very important for clinical fields, such as innate metabolic disorder assays, and has the potential to be used for diagnostic biomarker searches.
  • Amino acid analysis is used, for example, as a diagnosis of congenital amino acidosis, the severity of liver dysfunction, and a guideline for treatment.
  • amino acid profiles have been applied to the diagnosis of progressive fibrosis and the like in patients with chronic hepatitis C.
  • Non-patent Document 6 the possibility of analyzing the degree of health of living organisms using an amino acid profile as an index has been reported (Non-patent Document 6).
  • An amino acid automatic analyzer was developed for amino acid analysis as described above. This apparatus measures the colorimetric color of amino acids using a ninhydrin reagent and requires a very long time for analysis.
  • Non-patent Document 6 a precolumn derivatization method has been developed, and various derivatizing agents used in this precolumn derivatization method have been developed.
  • this derivatization method is a complicated and time-consuming technique.
  • an automatic amino acid analysis method combining this derivatization method and a mass spectrometry method has also been developed, but further improvement has been demanded for this method.
  • the present inventors have conducted extensive studies in view of such circumstances, and as a result, the terminal amino groups of methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivatives (MG-H1) and argpyrimidine (AP) of AGEs are replaced with nitrobenzene compounds.
  • MG-H1 methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivatives
  • AP argpyrimidine
  • the present invention enables amino acid compounds and salts thereof obtained by derivatization of amino acid derivatives, particularly final glycation products, and nitrobenzene compounds, and quantification of amino compounds quickly and with high sensitivity. It is an object of the present invention to provide a mass spectrometric method and a biomarker assay method using the same.
  • the present invention provides an amino compound represented by the general formula [I] or a salt thereof.
  • R means an amino substituent
  • Z means a nitrophenyl group
  • an amino compound or a salt thereof in which the amino substituent is an amino acid residue or a substituted amino acid residue or a peptide residue in which the amino acid residue and / or the substituted amino acid residue is a peptide bond.
  • the amino acid residue or substituted amino acid residue or the constituent amino acid of the peptide residue is alanine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine. , Lysine, leucine, methionine, proline, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan or tyrosine or a substitute thereof, preferably arginine, lysine, valine, tyrosine, methionine, glycine, histidine, glutamic acid or tryptophan or a substitute thereof An amino compound or a salt thereof is provided.
  • the present invention provides, as another preferred embodiment thereof, an amino compound or a salt thereof in which the substituted amino acid residue is a residue of a final glycation product (AGE), preferably an arginine derivative or a lysine derivative.
  • AGE final glycation product
  • the present invention provides, as another preferred embodiment thereof, an amino compound or a salt thereof, wherein the peptide of the above peptide residue is a peptide bond of 2 to 10 amino acids.
  • the present invention provides, as another preferred embodiment thereof, an amino compound or a salt thereof in which the nitrophenyl group is represented by the general formula [IIIb].
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 may be the same or different and each represents a hydrogen atom or a nitro group. However, at least one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 means a nitro group.
  • the amino compound is an amino compound represented by the general formula [Ia] or a salt thereof.
  • R, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 each have the same meaning as described above.
  • the amino compound is an amino compound represented by the general formula [Ii] or a salt thereof.
  • R has the same meaning as described above.
  • the amino compound is a nitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative represented by the general formula [Ib] or a nitrophenylated argpyrimidine derivative represented by the general formula [Ic].
  • An amino compound or a salt thereof is provided.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 all have the same meaning as described above.
  • the amino compound is a trinitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative represented by the structural formula [Iii] or a trinitrophenylated argon represented by the structural formula [Iiii].
  • An amino compound which is a pyrimidine derivative or a salt thereof is provided.
  • a mass spectrometric method for an amino compound or a salt thereof wherein the amino compound represented by the general formula [I] or a salt thereof is measured by mass spectrometry.
  • R means an amino substituent, for example, an amino acid residue or a substituted amino acid residue or a peptide residue
  • Z means a nitrophenyl group
  • the present invention provides, as a preferred embodiment thereof, a mass spectrometric method of the amino compound represented by the general formula [Ia] or a salt thereof.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 may be the same or different and each represents a hydrogen atom or a nitro group. However, at least one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 means a nitro group, and R has the same meaning as described above.
  • the amino compound is a nitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative represented by the general formula [Ib] or a nitrophenylated argpyrimidine derivative represented by the general formula [Ic].
  • a method for mass spectrometry of an amino compound or a salt thereof is provided.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 all have the same meaning as described above.
  • the amino compound is a trinitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative represented by the structural formula [Iii] or an amino compound represented by the structural formula [Iiii] or a salt thereof.
  • a mass spectrometry method is provided.
  • the amino acid derivative represented by the general formula [II] or a salt thereof and the nitrobenzene compound represented by the general formula [III] are reacted to represent the general formula [I].
  • a method for mass spectrometry of an amino compound or a salt thereof which comprises a step of mass-analyzing the amino compound or a salt thereof obtained in the above step.
  • R means an amino substituent, for example, an amino acid residue or a substituted amino acid residue or a peptide residue.
  • X means an amino group-reactive functional group
  • Z means a nitrophenyl group
  • R and Z have the same meaning as described above.
  • the reaction of the amino acid derivative represented by the general formula [II] or a salt thereof and the nitrobenzene compound represented by the general formula [III] is carried out by using an alkaline aqueous solution or water and an organic solvent.
  • a mass spectrometric method for an amino compound or a salt thereof which is a mixed solution and the pH of the solution is 8 to 10.
  • the present invention provides, as a preferred embodiment thereof, a method for mass spectrometry of an amino compound or a salt thereof in which the above reaction is performed in a sample.
  • the present invention provides a mass spectrometric method for amino compounds in which the amino acid derivative or salt thereof is a biomarker.
  • the present invention provides a method for mass spectrometry of an amino compound or a salt thereof, wherein the amino compound represented by the general formula [I ′] or a salt thereof is subjected to mass spectrometry, wherein the derivatization residue is derivatized.
  • Agents are sulfonyl compounds such as 1-pyrenesulfonyl chloride (PSC) and dansyl chloride (DNS-Cl); 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC), 4-dimethylaminosulfonyl-7-fluorobenzoxadiazole (DBD-F), 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan (NBD-F), 2,3-naphthalenedialdehyde (NDA); 3-aminopyridyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (APDS), etc.
  • PSC 1-pyrenesulfonyl chloride
  • DNS-Cl dansyl chloride
  • FMOC 9-fluorenylmethyl chloroformate
  • DBD-F 4-dimethylaminosulfonyl-7-fluorobenzoxadiazole
  • NDA 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan
  • NDA 2,3-naphthalenedialdehyde
  • Mass spectrometry method of malonate compound phosphonium compound such as (5-succinimidoxy-5-oxopentyl) triphenylphosphonium bromide (SPTPP); or amino compound which is a pyridinium compound such as 2-chloro-1-methylpyridinium salt or a salt thereof I will provide a.
  • phosphonium compound such as (5-succinimidoxy-5-oxopentyl) triphenylphosphonium bromide (SPTPP); or amino compound which is a pyridinium compound such as 2-chloro-1-methylpyridinium salt or a salt thereof I will provide a.
  • R ′ means a substituted amino acid residue or peptide residue having the same meaning as R, and Z ′ means a derivatized residue.
  • the present invention provides a biomarker assay method for quantifying the biomarker concentration in a biological sample using the intensity data of the mass spectrum obtained by the mass spectrometry method of the amino compound.
  • the present invention provides a novel amino compound that is a derivatization product of an amino acid derivative and a derivatizing agent such as a nitrobenzene compound, preferably a glycated protein degradation product that is a reaction intermediate product such as protein glycolysis is a nitrobenzene compound or the like.
  • the present invention provides a novel glycated protein hydrolyzate derivative that is derivatized with a derivatizing agent useful for diagnosing abnormal glucose tolerance.
  • the present invention also provides a mass spectrometric method capable of rapid, highly sensitive and highly accurate quantification of the amino compound, and a biomarker assay method using the same.
  • FIG. 3 is a mass spectrum (MS, MS / MS) of a methyl oxalol-derived hydroimidazolone derivative (MG-H1).
  • 3 is a mass spectrum (MS, MS / MS) of a 2,4,6-trinitrophenyl derivative of MG-H1 (MG-H1-TNP). It is a mass spectrum (MS, MS / MS) of argypirimidine (AP).
  • 2 is a mass spectrum (MS, MS / MS) of a 2,4,6-trinitrophenyl derivative of AP (AP-TNP). It is a figure which shows the fragmentation pattern of the 2,4,6-trinitrophenyl derivative (MG-H1-TNP) of MG-H1 estimated from a mass spectrum.
  • FIG. 5 is a calibration curve prepared using an internal standard method for the concentration of MG-H1-TNP and the peak intensity of the mass spectrum.
  • 2 is a calibration curve prepared using an internal standard method for the concentration of AP-H1-TNP and the peak intensity of the mass spectrum.
  • 2 is a graph showing the influence of pH on 2,4,6-trinitrophenylation of MG-H1.
  • 2 is a graph showing the effect of pH on 2,4,6-trinitrophenylation of AP. It is a chart which shows the protocol of pretreatment of rat plasma.
  • a nitrobenzene compound will be described as an example of the derivatizing agent.
  • the derivatizing agent is not limited to the nitrobenzene compound at all. It should be understood that other derivatizing agents are naturally included within the scope of the present invention. Therefore, in this specification, although the nitrophenyl group which is a residue of a nitrobenzene compound is explained also about the residue which derivatized the terminal amino group of the amino acid derivative with the derivatizing agent, this is also limited at all. Rather, it should be understood that residues of other derivatizing agents are included as well.
  • the amino compound according to the present invention can be represented by the general formula [I].
  • R means an amino substituent
  • Z means a nitrophenyl group
  • amino substituent means an amino acid residue or a substituted amino acid residue or a peptide residue.
  • amino acid residue means a residue obtained by removing an amino group from an unsubstituted amino acid.
  • alanine since it is also called 2-aminopropanoic acid, the amino acid residue obtained by removing the amino group from 2-aminopropanoic acid is a carboxyethyl group.
  • the amino acid residue in the case of lysine is a 1-carboxyl-5-aminopentyl group.
  • substituted amino acid residue refers to an amino acid residue obtained by removing an amino group from the amino acid, and a residue other than a carboxyl group constituting the amino acid, that is, an atomic group is a substituent. It means an atomic group formed by substitution with an amino acid residue having a substitution moiety (moiety).
  • the substituted amino acid residue include a 1-carboxyl-5- (carboxylmethyl) aminopentyl group in which a 5-methyl group of the lysine residue is substituted with a carboxymethyl group.
  • Another example is a substituted amino acid residue obtained by converting an amino-iminomethyl group of an arginine residue into a 2-pyrimidinyl group.
  • the term “peptide residue” means a residue in which a terminal amino group is excluded from a terminal amino acid of a peptide formed by peptide bonding of the amino acid and / or a substituted amino acid.
  • the peptide residue means a residue in which the amino group is excluded from the terminal amino acid valine.
  • amino acid derivative means an unsubstituted amino acid derivative, a substituted amino acid derivative in which an amino acid moiety other than the N-terminal amino group is modified with a substituent or the like, unless otherwise specified. is doing.
  • amino compound used in the present invention is a nitrophenylation in which the N-terminal amino group of the amino acid derivative [II] or a salt thereof is nitrophenylated by the nitrobenzene compound [III].
  • An amino compound is meant.
  • amino acids of amino acid residues or substituted amino acid residues, or amino acids of peptide constituent amino acids of peptide residues are not particularly limited as long as they are compounds having both amino group and carboxy functional groups.
  • Examples include amino acids that are constituents of proteins such as tryptophan and tyrosine, preferably arginine and lysine, and substituted amino acid residues having a substitution moiety formed by substituting residues other than the carboxyl group constituting them with a substituent. That.
  • Preferred amino acids include, for example, preferably arginine, lysine, valine, tyrosine, methionine, glycine, histidine, glutamic acid or tryptophan.
  • substituted amino acid residue used in the present invention is a residue of a substituted amino acid derivative having another atomic group formed by bonding an arbitrary substituent to a residue other than the terminal amino group of the amino acid. Means.
  • amino acid derivatives are not particularly limited as long as they do not depart from the object of the present invention, and include, for example, degradation products, intermediate products, or metabolites of biological components such as amino acids.
  • Glycation end products produced by the saccharification reaction, ornithine, the degradation product of arginine, creatinine, a metabolite of creatinine phosphate, which is an energy source for muscles, and biotechnology that shows glutathione deficiency in the liver
  • AABA ⁇ -aminobutyric acid
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • biomarkers and hippuric acid are preferable.
  • guanosine group on the side chain of arginine and methylglyoxal or an amino group of lysine and a reaction intermediate product such as lipid peroxidation, Maillard reaction, glycolysis, etc.
  • AGEs and the like are preferred. Of these AGEs, preferred are substituted arginine derivatives and substituted lysine derivatives.
  • substituted arginine derivatives include alkyl-substituted arginine derivatives in which the guanidino group of arginine is modified with a substituent such as carboxylmethyl group and carboxylethyl group, guanidino groups such as imidazolones, pyrimidines, and imidazopyridines in a cyclic structure. And cyclic arginine derivatives.
  • examples of the alkyl-substituted arginine derivative include carboxymethylarginine (CMA) and the like.
  • Examples of imidazolones of cyclic arginine derivatives include imidazolone, glyoxal hydroimidazolone (GH), methylglyoxal hydroimidazolone (MG-H), N ⁇ - [5- (2,3,4-trihydroxy). Butyl) -5-hydro-4-imidazolone-2-yl] -ornithine (3-DG-H) and the like.
  • Examples of pyrimidines include argpyrimidine and tetrahydropyrimidine.
  • Examples of imidazopyridines include pentosidine.
  • a methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative represented by the structural formula [IIa] (MG-H1: N ⁇ - (5-hydro-5-methyl-4-imidazolone 2) is particularly preferable.
  • -Yl) -ornithine or argpyrimidine (AP) represented by the structural formula [IIb].
  • amino acid derivative has a three-dimensional structure and can be represented by the structural formula [IIc] or the structural formula [IId].
  • substituted lysine derivatives include alkyl-substituted lysine derivatives in which the amino group of lysine is modified with a substituent such as carboxylmethyl group or carboxylethyl group, and the amino group of lysine has a cyclic structure. And cyclic lysine derivatives.
  • alkyl-substituted lysine derivative examples include carboxymethyl lysine (CML), carboxyethyl lysine (CML) and the like.
  • cyclic lysine derivative examples include viralin, pyrrole derivatives such as FTP (Formyl Therosyl Pyrrole), GOLD (glyoxal-derived lysine dimer), MOLD (methylglyoxal-derived lysine dimer), DOLD (3-deoxyglucose).
  • Imidazole derivatives such as lysine-derived lysine dimer
  • pyridine derivatives such as GLAP (Glyceraldehyde-derived pyridinium) and GA-pyridine (glycolaldehyde-pyridine)
  • imidazopyridine derivatives such as pentosidine.
  • the peptide residue peptide represented by the substituent R is not particularly limited in the number of the amino acids constituting the peptide, but preferably 2 to 10 amino acids, preferably Is a peptide composed of 2 to 6, more preferably 2 to 4 peptide bonds.
  • Examples of such peptides include dipeptides such as valyltyrosine, lysyltyrosine, methionyltyrosine, glycyltyrosine, histidyltyrosine, glutamyltyrosine, tryptophanyltyrosine, histidinyltryptophan, carnosine and anserine, and tripeptides such as glutathione.
  • enkephalin caxitocin, vasopressin and the like can be mentioned.
  • dipeptides such as valyltyrosine, lysyltyrosine, methionyltyrosine, glycyltyrosine, histidyltyrosine, glutamyltyrosine, tryptophanyltyrosine and histidinyltryptophan are preferred.
  • the peptide may be any of a digested protein, a metabolite such as a final glycation product, and a physiologically active peptide such as a peptide hormone, and is a molecular biomarker used for diagnosis and prognosis prediction of various diseases. Also good.
  • the substituent Z is a residue of a nitrobenzene compound obtained by nitrophenylating the terminal amino group of the amino acid derivative [II], and can be represented by the general formula [IIIb].
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 may be the same or different and each represents a hydrogen atom or a nitro group. However, at least one of R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 means a nitro group.
  • examples of the nitrophenyl group include a mono-, di- or tri-nitrophenyl group, preferably a tri-nitrophenyl group, particularly preferably a 2,4,6-nitrophenyl group.
  • the position of the nitro substituent is not particularly limited, but in the case of one, 2-position, in the case of 2, 2-position and 4-position, in the case of 3, 2-position, 4-position and It should be in the 6-position.
  • amino compound according to the present invention is generally represented by the general formula [I], and more specifically can be represented by the general formula [Ia].
  • R, Z, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 all have the same meaning as described above.
  • amino compound represented by the structural formula [Ia] include, for example, a nitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative represented by the structural formula [Ib] or the structural formula [Ic]. And nitrophenylated argpyrimidine derivatives represented.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 all have the same meaning as described above.
  • a more preferred amino compound can be represented by, for example, general formula [Ii].
  • R has the same meaning as described above.
  • amino compound for example, a nitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative represented by the structural formula [Iii] or a nitrophenylated argpyrimidine derivative represented by the general formula [Iiii] is more preferable.
  • the amino compound [I] according to the present invention can be obtained by derivatizing an amino acid derivative represented by the general formula [II] or a salt thereof with a nitrobenzene compound represented by the general formula [III].
  • R has the same meaning as described above.
  • X means an amino group-reactive functional group
  • Z has the same meaning as described above.
  • amino compound [Ia] of the present invention can be obtained by a derivatization reaction between the amino acid derivative [II] or a salt thereof and a nitrobenzene compound represented by the general formula [IIIa].
  • amino compound [Ii] of the present invention can be obtained by a derivatization reaction between the amino acid derivative [II] or a salt thereof and a trinitrobenzene compound represented by the general formula [IIIc].
  • the amino group-reactive functional group represented by X is not particularly limited as long as it is a reactive functional group that derivatizes an amino acid or a substituted amino acid ([II]) with a nitrophenyl.
  • Aromatic nucleophilicity of nitrobenzene derivatives such as atoms, halogen atoms selected from bromine atoms or iodine atoms, or sulfonic acids or sulfonates, alkyl sulfonate groups, aryl sulfonate groups, perfluoroalkyl sulfonate groups, etc. Any functional group that can be a leaving group in the substitution reaction is exemplified.
  • nitrobenzene compounds include, for example, 2,4,6-trinitrofluorobenzene, 2,4,6-trinitrochlorobenzene, 2,4,6-trinitrobromobenzene, 2,4,6-trinitro.
  • examples include iodobenzene and 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid or a salt thereof, among which 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid or a salt thereof is particularly preferable.
  • the salt include alkali metal salts such as sodium salt, alkaline earth metal salts such as potassium salt, and the like.
  • the amino acid derivative and the nitrobenzene compound are tens of several hours at room temperature in an alkaline aqueous solution or a mixed solution of water and an organic solvent. This can be done by mixing for a minute. Preferably it is carried out in an alkaline aqueous solution.
  • the organic solvent with high affinity with water such as ethanol, is preferably used as an organic solvent.
  • the pH of these solutions is preferably 8 to 10, and more preferably 8.5 to 9.5.
  • the pH of the solution is too high, the possibility of decomposition of the amino acid derivative to be analyzed or this compound increases, and if it is too low, the nitrophenylation reaction does not proceed rapidly.
  • the pH is a value directly measured by a pH meter.
  • the room temperature is a temperature of about 15 ° C. to 40 ° C., and the reaction is preferably performed at around 30 ° C.
  • the mixing may be carried out by any method, and mixing is performed for 1 minute or more and 1 hour or less, preferably 5 minutes to 40 minutes. Usually, mixing for 30 minutes is sufficient.
  • One feature of the present invention is that the nitrophenylation reaction can be performed under such mild conditions.
  • a substance to be analyzed in a sample may be isolated and subjected to nitrophenylation, or may be subjected to nitrophenylation as it is in a sample containing impurities. Since the present invention can directly perform nitrophenylation in such a sample, loss due to isolation can be reduced, and even in the case where only a small amount of a substance to be analyzed is contained. It is an excellent method that can be measured. Further, it is not necessary to perform a complicated operation, and measurement can be performed easily. In particular, when the target sample is a biological sample or the like, it is effective because there are few substances to be analyzed and there are many impurities.
  • an amino acid derivative in a sample it is possible to derivatize an amino acid derivative as a biomarker in a sample with a nitrobenzene compound by adding a nitrobenzene compound to the biological sample, Naturally, such derivatized amino acid derivatives can be measured as biomarkers.
  • What is used as a sample in the present invention is not limited as long as it contains a final glycation product to be measured and the like that become an amino compound obtained by derivatization of an amino acid derivative and a nitrobenzene compound according to the present invention.
  • a sample derived from a living body is called a biological sample.
  • alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt
  • alkaline earth metal salts such as lithium salt, ammonium salt and the like
  • a derivatizing agent in addition to the nitrobenzene compound, other derivatizing agents that derivatize other amino groups can naturally be used.
  • derivatizing agents include, for example, nitrobenzene compounds such as nitrobenzene sulfonic acid compounds and fluoro-nitrobenzene, sulfonyl compounds such as 1-pyrenesulfonyl chloride (PSC) and dansyl chloride (DNS-Cl), and 9-fluorene.
  • Nylmethyl chloroformate FMOC
  • DBD-F 4-dimethylaminosulfonyl-7-fluorobenzoxadiazole
  • NBD-F 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan
  • 2,3-naphthalene Carbamate compounds such as aldehyde (NDA), 3-aminopyridyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (APDS), 3-chlorocarbonyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2-quinoxalinone (DMEQ-COCl), 3 -Nitrophenylisothiosi , 3-pyridyl isothiocyanate, 4- (dimethylamino) phenyl isothiocyanate, isothiocyanate compounds such as fluorescein-5-isothiocyanate (FITC), malonate compounds such as diethyl ethoxymethylene malonate, (5-succinimidoxy-5- Examples thereof include phosphonium compounds such as
  • the amino compound according to the present invention is represented by the general formula [I ′].
  • R ′ means an amino acid residue, a substituted amino acid residue or a peptide residue having the same meaning as R, and Z ′ means a derivatized residue.
  • the derivatized residue means a residue obtained by derivatizing the amino group of the substituted amino acid derivative (R′-NH 2 ) with the derivatizing agent.
  • the amino group of the substituted amino acid derivative (R′-NH 2 ) is dansylated, that is, dimethylaminonaphthalenesulfonylated, and this dansyl group is called a derivatized residue. be able to.
  • the ionization method of the sample used for mass spectrometry is not particularly limited, but it is preferable to use MALDI method, ESI method, APCI method and the like widely used for detection and quantification of biomolecules.
  • MALDI method ESI method
  • APCI method APCI method
  • LC / MS, GC / MS, etc. combined with a separation technique
  • an ESI method or an APCI method as a sample ionization method.
  • a tandem mass spectrometry method such as MS / MS or MS 3 can be used.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the present invention can provide an assay method capable of detecting and quantifying a biomarker rapidly, with high sensitivity and high accuracy by selecting the biomarker as an analysis target. That is, the biomarker assay method of the present invention comprises reacting an N-terminal amino group of a biomarker that is an amino acid derivative with a derivatizing agent such as a nitrobenzene compound to derivatize the N-terminal amino group such as nitrophenylation.
  • a derivatizing agent such as a nitrobenzene compound
  • the biomarker is not particularly limited as long as it is an amine compound having an amino group.
  • the method to which the assay method of the present invention can be particularly preferably applied include amino acid derivatives and sugar metabolites.
  • Final glycation products (AGEs) produced by the reaction biogenic amines catecholamine (dopamine, noradrenaline, adrenaline), indoleamine (serotonin, melatonin), imidazoleamine (histamine), acetylcholine, polyamine (putrescine, spermidine, Spermine) and the like.
  • MG-H1 trinitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivatives
  • AP trinitrophenylated argpyrimidine derivative
  • N-2,4,6-trinitrophenyl derivatives of MG-H1 and AP which are AGEs that can be detected and quantified with high sensitivity by mass spectrometry, and are useful as diagnostic indicators of impaired glucose tolerance It is.
  • a calibration curve method or an isotope dilution method is used.
  • mass spectrometry one of the techniques for quantitative analysis of a substance to be analyzed is a calibration curve method.
  • the calibration curve method shows that the relationship (calibration curve) between several standard samples containing known amounts of standard substances and different concentrations and the signal intensities obtained from these standard samples is theoretically a linear relationship. This is a method of using and quantifying the concentration of the sample from the signal intensity obtained from the unknown sample.
  • the calibration curve method is roughly classified into an external standard method, an internal standard method, and a standard addition method depending on the preparation method of the standard sample.
  • the isotope dilution method focuses on the isotope ratio of a specific element that constitutes the measurement target compound, and after adding a certain amount of spikes with a known isotope ratio to reach the equilibrium of the isotope composition of the measurement target compound
  • the isotope ratio of the sample before and after spike addition is measured, and the element concentration of the sample is obtained from the change in the isotope composition.
  • the advantage is that the detection limit is as low as about 1 pg.
  • Quantitative data of biomarkers obtained as described above can be used for prediction and diagnosis of disease onset, progression, prognosis and the like. That is, as one embodiment of the present invention, an N-terminal amino group of a biomarker that is an amino acid derivative or peptide is reacted with a derivatizing agent such as a trinitrophenylating agent, and the N-terminal amino group is trinitrophenylated or the like.
  • mass spectrum intensity data obtained by using the mass spectrometric method mass spectrometric analysis of the amino acid derivative or peptide in which the N-terminal amino group is derivatized such as trinitrophenylation, etc.
  • a method for diagnosing a disease comprising a step of quantifying a biomarker concentration in a biological sample and a step of diagnosing the onset, progression, prognosis, etc. of the disease based on the biomarker concentration data thus obtained It is about.
  • the diagnostic method of the present invention is useful because it can simultaneously measure and quantify a plurality of types of AGEs. That is, the present invention is a method capable of performing nitrophenylation in a sample, and is analyzed by mass spectrometry. Therefore, when measuring target substances having different mass numbers, it can be combined with mass spectrometry.
  • the present invention provides an excellent method capable of simultaneously measuring (quantifying). According to the present invention, costs and labor can be greatly reduced as compared with the conventional early diagnosis method.
  • Trinitrophenylated methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative (MG-H1-TNP) [Iii] was prepared as follows. Methylglyoxal-derived hydroimidazolone derivative (MG-H1) [IIa] was dissolved in 0.1 M boric acid solution (pH 9.3), and 30 mM 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sodium salt (TNBS) -0. After adding 10 ⁇ L of 1M boric acid solution (pH 9.3), the mixture was thoroughly mixed. The resulting mixture was incubated at 30 ° C. for 20 minutes for derivatization.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sodium salt
  • MG-H1-TNP Derived MG-H1
  • MG-H1-TNP Derived MG-H1
  • MG-H1-TNP was equilibrated with 100% CH 3 CN / 0.1% formic acid (3 mL) and 0.1% formic acid (3 mL) respectively, Sep-Pak Plus C 18
  • the fraction eluted with 100% CH 3 CN / 0.1% formic acid (3 mL) was dried to dryness with a centrifugal evaporator.
  • the fraction dried product was redissolved in 1.5 mL of deionized water, freeze-dried, and stored at ⁇ 40 ° C.
  • a trinitrophenylated argpyrimidine derivative (AP-TNP) [Iiii] was prepared as follows. Argupyrimidine [IIb] was treated in substantially the same manner as in Example 1 to obtain a trinitrophenylated argpyrimidine derivative (AP-TNP) [Iiii].
  • the mass spectra (MS and MS / MS) of MG-H1, AP, MG-H1-TNP and AP-TNP are shown in FIGS. 2 and 4, the N-2,4,6-trinitrophenyl derivatives of MG-H1 and AP are represented as “MG-H1-TNP” and “AP-TNP”, respectively.
  • Precursor ions used for MS / MS measurement are [M + H] + ions for each compound.
  • the one having the highest peak intensity was selected as an ion peak to be monitored in the LC-MRM-MS / MS analysis described later.
  • fragmentation patterns of MG-H1-TNP and AP-TNP predicted from the MS spectrum and MS / MS spectrum shown in FIGS. 3 and 4 are shown in FIGS. 5 and 6, respectively.
  • LC-MRM-MS / MS analysis LC-MRM-MS / MS analysis of MG-H1, AP, MG-H1-TNP and AP-TNP was performed under the following conditions. Each sample concentration was 10 nmol / L, and all were dissolved in 0.1% formic acid aqueous solution.
  • Mass chromatograms of MG-H1, AP, MG-H1-TNP, and AP-TNP are shown in FIGS. 7 and 8, respectively. From the results shown in FIG. 7, it was confirmed that the peak intensity increased to about 1500 times when the N-terminal amino group of MG-H1 was 2,4,6-trinitrophenylated.
  • MG-H1-TNP and AP-TNP calibration curves using deuterated form of MG-H1-TNP (MG-H1-d3-TNP) as internal standard was made.
  • dilution was performed by a procedure (see Table 1) in which a 0.1% formic acid aqueous solution was added immediately before injection, and measurement was performed from the high concentration side.
  • 1 ⁇ mol / mL aqueous solutions of MG-H1-TNP and AP-TNP were prepared as stock solutions, and diluted with water so that the final concentrations were 400, 200, 40, 20, 4, 2 pmol / mL.
  • FIG. A calibration curve shown in FIGS. From these, for MG-H1-TNP, a detection limit of 2.05 pmol / mL, a quantification limit of 6.20 pmol / mL, and for AP-TNP, a detection limit of 0.11 pmol / mL and a quantification limit of 0.33 pmol / mL were obtained. It was.
  • the detection limit was 5.3 nmol / L and the quantification limit was 16 nmol / L.
  • the detection limit was 2.7 nmol / L, and the quantification limit was 8.0 nmol / L.
  • the calibration curve it was confirmed that good linearity with a correlation coefficient of 0.996 or more was obtained, and that quantitative analysis at the pmol level (concentration nM / L level) was possible for each.
  • the sample was subjected to -MS analysis, and the concentration of 2,4,6-trinitrophenyl compound was determined by a calibration curve method.
  • the results are as shown in FIGS. 11 and 12, and it was confirmed that derivatization was possible quantitatively at pH 8.5 to 9.3 in either case of MG-H1-TNP or AP-TNP. It was done.
  • LC-MS analysis using a calibration curve prepared by the standard addition method confirmed that the plasma concentrations of MG-H1 and AP could be quantified.
  • Val-Tyr Using the dipeptide Val-Tyr instead of AGEs MG-H1 and AP, the change in detection sensitivity due to 2,4,6-trinitrophenylation was confirmed by the same procedure as above. As a result of the examination, it was confirmed that the peak intensity increased about 50 times by 2,4,6-trinitrophenylation as in the case of MG-H1 (Table 2).
  • the present invention is, for example, an amino compound obtained by derivatizing an amino acid derivative including a metabolite such as a final glycation product or an intermediate product obtained by saccharifying a protein that is an in vivo component in a metabolic process with a derivatizing agent such as a nitrobenzene compound. Since the compound is particularly useful for diagnosis of impaired glucose tolerance, it is a mass spectrometric method capable of quantifying these compounds quickly, with high sensitivity and high accuracy. Therefore, it can be expected that assaying these amino compounds as biomarkers will be useful for the prevention and diagnosis of various diseases, and thereby useful for the development of preventive and therapeutic agents for the diseases.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

　耐糖能異常の診断に有用な、最終糖化産物を始めとする糖化タンパク質分解物誘導体の誘導体化されたアミノ酸誘導体およびペプチド等のアミノ化合物、ならびにその迅速、高感度かつ高精度な定量が可能な質量分析方法およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供すること。　本発明は、特に、質量分析に好適な誘導体化された新規な糖化タンパク質分解物誘導体を提供する。また、本発明に係るアミノ酸誘導体およびペプチド等のアミノ化合物の高感度質量分析方法は、アミノ酸誘導体またはペプチドのＮ末端アミノ基とトリニトロフェニル化剤またはその他の誘導体化剤とを反応させ、前記Ｎ末端アミノ基を誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基が誘導体化されたアミノ酸誘導体またはペプチドを質量分析する工程を有する。さらに、本発明は、得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程を有するバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。

Description

アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法
　本発明は、アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法に関する。更に詳しくは、最終糖化産物を始めとするアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物およびその塩、ならびにこのアミノ化合物を迅速に高感度かつ高精度で定量が可能な質量分析方法、およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法に関するものである。
　糖尿病は、血糖値が病的に高い状態をいうが、血糖値の異常に起因する急性症状以外に、高血糖状態が長期間継続することに伴い、種々の臓器が障害を受け、糖尿病慢性期合併症を発症すると、治療が非常に困難になるため、早期に発症を診断し、生活習慣の改善、経口血糖降下薬の投与、インスリン注射等の処置を開始することが重要である。
　しかし、生活習慣病を主因とする糖尿病患者数は年々増加の一途を辿っており、厚生労働省の推計では９００万人を超えるのはもはや時間の問題と言われている。その糖尿病患者数に加えて、いわゆる糖尿病予備軍が１０００万人以上いると推定されることから、糖尿病疾患患者数は近い将来激増することは想像に難くない。しかしながら、実際に糖尿病の治療を受けている患者はわずか３００万人足らずであり、また十分な診断を受けずに放置して治療が遅れたために腎症に至る患者が、毎年１万人ずつ増加し続けているのが現状である。その上、糖尿病の患者の約半数は心筋梗塞や脳梗塞等の虚血性疾患で死亡していることを考え合わせると、糖尿病とその合併症、ならびにいわゆる隠れ糖尿病（糖尿病前症）に対する対策は、医療経済からしても極めて重要である。とりわけ、健康診断の血糖値測定のみでは判定が極めて困難な潜在的糖尿病予備軍である糖尿病前症に対する対策、つまり早期診断方法と治療システムの確立は急務である。
　しかも、近年、糖尿病前症の中でも、空腹時血糖値（ＦＰＧ）は正常であるのに、耐糖能障害（ＩＧＴ）のために食後血糖値が極端に高くなり、これにより心血管障害を引き起こす患者が増加していることが指摘されている。このため、米国糖尿病学会や世界保健機構は、糖尿病前症をれっきとした疾患と定め、生活習慣の質的改善と薬物治療による糖尿病前症のＩＧＴ改善の重要性を唱えている。前述したように、このような糖尿病前症といわれる患者は、日本でも、推定１０００万人を超えていると考えられるところから、糖尿病前症に対する予防ならびに治療対策は極めて重要である。
　日本糖尿病学会では、糖尿病前症や糖尿病の診断基準として、一次健康診断では空腹時血糖値（ＦＰＧ）、また二次健康診断では経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の実施を指導してきた。糖尿病前症患者の耐糖能障害は、一次健康診断のＦＰＧ検査やグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）検査だけでは正確に診断することが困難であるところから、一次健康診断で糖尿病前症が疑われる被検者に対しては、ＯＧＴＴの二次健康診断の受診を勧められている。しかしながら、このＯＧＴＴは、被験者の長い拘束時間や簡便性に欠けている上に、糖（グルコース）負荷という身体的負担を課するとともに急激な血糖値上昇等の危険が伴う等の問題があり、一般の健康診断での血液検査による血糖値検査法のように普及していないのが実情である。その結果、潜在的な糖尿病前症の多くが、ＯＧＴＴの二次健康診断の受診を怠ってしまい、糖尿病やその合併症を自覚することなく未治療のまま真性の糖尿病に進行し、さらに重篤な合併症を発症するか、または腎透析を余儀なくされるに至っている。
　一次健康診断では、通常、空腹時血糖（ＦＰＧ）、随時血糖あるいはグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を判定指標とした検査が実施されていて、ＦＰＧ値が１００ｍｇ／ｄＬ以上、またはＨｂＡ１ｃ値が５．２％以上であれば、インスリン抵抗性もしくはそれによるＩＧＴの疑いありと診断されている。しかし、インスリン抵抗性によるＩＧＴは、食後高血糖が主たる初期変化として現れてくることから、従来の一次健康診断で使用されているいずれの指標も精度の点で不十分と言わざるを得ず、従来の一次健康診断法は、糖尿病前症の早期診断としては利用することができない。
　そこで、現実的には、一次健康診断において、これらの指標を用いてインスリン抵抗性あるいはＩＧＴが疑われる被検者に対して、二次健康診断あるいはそれ以降の健康診断で７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇ ＯＧＴＴ）、血中インスリン、ＨＯＭＡ－Ｒ等の検査により、インスリン抵抗性もしくはＩＧＴが陽性であるかどうかを検査して、糖尿病前症の確定診断がなされている。これらの検査は、当然のことながら費用も手間もかかることになる。
　そこで、もし一次健康診断で用いた同じ血糖測定用採血サンプルでＯＧＴＴと同等の精度で糖尿病前症の診断を確定できる方法があれば、糖尿病前症患者の検出率は飛躍的に向上するとともに、二次健康診断でのＯＧＴＴ検査は不要となり、世界保健機構等が提唱する糖尿病前症の早期診断ならびに治療による糖尿病化阻止戦略を強力に推し進めることが可能となる。
　他方、近年、糖尿病慢性期合併症のリスクファクターとして、種々の最終糖化産物が注目を集めている。最終糖化産物（ＡＧＥ類）は、糖化タンパク質、メイラード反応産物等とも呼ばれ、グルコース等の還元糖とタンパク質のアミノ基との非酵素的な反応により生成する種々の構造を有するタンパク質誘導体である。ＡＧＥ類は、細胞外マトリックスタンパク質、膜タンパク質および細胞内タンパク質の糖化修飾に起因するこれらのタンパク質の機能及びそれに依存する細胞機能の破綻、あるいはＡＧＥ類をリガンドとするレセプターが引き起こす細胞応答の結果として、種々の病変の発症及び増悪に関与している。例えば、ＡＧＥ類レセプターの１つであるＲＡＧＥ類によってＡＧＥ類が認識されると、細胞内ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる細胞内酸化ストレス物質の産生が亢進し、これが上皮細胞における遺伝子発現を変化させることにより、種々の糖尿病性血管障害が発症すると考えられている（非特許文献１参照）。
　ＡＧＥ類の中でも、解糖系の中間体または副産物として産生されるグリセルアルデヒドやメチルグリオキサール（ＭＧ）に由来するものは、糖尿病および耐糖能異常の発症および予後予測等に関する診断マーカーとして期待を集めている（非特許文献２、３、４、５）。
　非特許文献２には、２型糖尿病患者の血清について、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールのポリクロナール抗体を用いたＥＬＩＳＡ系で測定した結果、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルが同齢健常人に比較して増加しているとの報告がなされている。同非特許文献２は、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルと、ＡＧＥ類の１種であるＮε－（カルボニルメチル）リジンの血清レベルとの間には、同様に有意な相関関係があるが、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルは、空腹時血糖の血漿レベルやヘモグロビンレベルとは関連性はなかったと報告している。
　非特許文献３は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて１型糖尿病患者の血漿を測定した結果、タンパク質の糖化または酸化による付加生成物の濃度ならびにその遊離残基（free adduct）の濃度が増加していることを示している。例えば、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロンやグリオキサール由来ヒドロイミダゾロンあるいはその他のＡＧＥ類であるＮε－（カルボニルメチル）リジン、Ｎε－（カルボニルエチル）リジン、ならびにこれらの遊離付加物（ｆｒｅｅ　ａｄｄｕｃｔ）が増加していることが報告されている。
　非特許文献４は、１型糖尿病患者の血漿をタンデム質量分析した結果、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン遊離付加物が糖尿病患者のマーカーとして優れていることを示唆している。
　非特許文献５は、１型糖尿病患者の血漿ならびに尿サンプルをＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した結果、糖負荷後の血糖値とインスリン値の上昇に加えて、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾール遊離付加物を初めとして、Ｎε－（カルボニルメチル）リジン、Ｎε－（カルボニルエチル）リジン、グリオキサール由来ヒドロイミダゾロン、Ｎδ－［５－（２，３，４－トリヒドロキシブチル）－５－ヒドロ４－イミダゾロン２－イル］－オルニチン（３ＤＧ－Ｈ１）等のｆｒｅｅ　ａｄｄｕｃｔも増加することを報告している。即ち、この論文は、食後には高血糖になるだけでなく、高カルボニルストレス状態も誘発されることを示している。さらに、この文献には、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン遊離付加物の他、アルグピリミジンを含む多くのＡＧＥ類、ならびにアミノ酸（アルギニン、リジン、メチオニン、チロシンおよびトリプトファン）についてのタンデム質量分析結果が記載されている。
　上述したように、これらのＡＧＥ類をタンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）分析する手法が報告されている。しかしながら、これらのＡＧＥ類についての測定は、ＥＬＩＳＡ法等の免疫化学的手法を用いた総量評価以外に有効な手法が存在しないのが現状であり（特許文献１）、個別のＡＧＥ類およびその分解産物について確立した測定法は殆ど存在しておらず、ましてや臨床に応用可能な測定法は存在してないと言わざるを得ない。これらの個別のＡＧＥ類の定量は、糖尿病および耐糖能異常の診断のみならず、メタボローム解析等においても有用であることから、ＡＧＥ類についてより迅速に高感度かつ高精度に個別の化合物を測定できるアッセイ法が強く望まれている。
　ＡＧＥ類分析の他に、アミノ酸分析も、臨床分野、例えば先天的な代謝障害のアッセイにとって非常に重要であり、また診断のバイオマーカー検索に使用できる可能性を持っている。アミノ酸分析は、例えば、先天性アミノ酸症の診断や、肝臓機能障害の重症度や治療の指針等として使用されている。また、最近の報告では、アミノ酸のプロファイルが、慢性Ｃ型肝炎患者の進行型線維症等の診断に応用されている。さらに、アミノ酸のプロファイルを指標として用いて、生物の健康度合いの分析の可能性までも報告されている（非特許文献６）。
　上述したようなアミノ酸分析のために、アミノ酸自動分析装置が開発された。この装置はニンヒドリン試薬を用いたアミノ酸の比色を測定するものであり、分析には非常に時間を要するものである。
　上記のような比色測定方法の他に、プレカラム誘導体化法が開発され、このプレカラム誘導体化法に使用する誘導体化剤も様々なものが開発されている（非特許文献６）。しかし、この誘導体化法は複雑で時間を要する技術である。さらに、この誘導体化法と質量分析方法を組み合わせた自動アミノ酸分析方法も開発されているが、この方法にしても更なる改良が求められていた。
特開２００８－２２４４５３号公報
Marie-Paule Wautier他著、「Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE」、American Journal of Physiology -Endocrinology and Metabolism、（米国）、アメリカ生理学会（American Physiological Society）、２００１年５月、第２８０巻、Ｅ６８５－Ｅ６９４ Kilhovd, B.K., et al. Metabolism, Vol 52, No 2 (February), 2003: pp. 163-167 Rabbani, N., and Thornalley, P.J. Amino Acids DOI 10.1007/s00726-010-0783-0 Ahmed, N., et al. Diabetologia (2005) 48: 1590-1603 Ahmed, N., et al. Diabetes Care, Vol. 28, No. 10, October  2005, pp. 2465-2471 Shimbo, K., et al. Biomed. Chromatogr. 2010; 24: 683-691.
　そこで、本発明者らは、かかる事情に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、ＡＧＥ類のメチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ－Ｈ１）ならびにアルグピリミジン（ＡＰ）の末端アミノ基をニトロベンゼン系化合物で誘導体化することによって、質量分析における感度が大幅に向上する上に、ＡＧＥ類に加えて、その他のアミノ酸誘導体またはペプチド等のアミノ化合物にも応用できることを見いだして、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明は、特に最終糖化産物を始めとするアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物およびその塩、ならびにこのアミノ化合物を迅速に高感度かつ高精度で定量が可能な質量分析方法、およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明は、一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
　本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基または該アミノ酸残基ならびに／もしくは置換アミノ酸残基がペプチド結合したペプチド残基であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
　本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体、好ましくはアルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
　本発明は、その好ましい別の態様として、上記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）、好ましくはアルギニン誘導体またはリジン誘導体の残基であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
　本発明は、その好ましい別の態様として、上記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているアミノ化合物またはその塩を提供する。
　本発明は、その好ましい別の態様として、上記ニトロフェニル基が、一般式［IIIb］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　式［IIIb］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
　本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　式［Ia］において、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ前記と同じ意味を有する。
　本発明は、そのより好ましい別の態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　　式［Ii］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
　本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　式［Ib］及び［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
　本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　本発明は、その別の形態として、一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基、例えば、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
　本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　式［Ia］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。
　本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　式［Ib］及び［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
　本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　本発明は、その別の形態として、一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物を反応させて一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
　上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　式［II］において、Ｒは、アミノ置換基、例えば、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　式［III］において、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　式［Ｉ］において、ＲおよびＺは、前記と同じ意味を有する。
　本発明は、そのより好ましい態様として、前記一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８～１０でおこなうことを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
　本発明は、その好ましい態様として、上記反応が試料中で行われるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
　本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであるアミノ化合物の質量分析方法を提供する。
　本発明は、さらに別の形態として、一般式［I'］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、上記誘導体化残基の誘導体化剤が、１－ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ－Ｃｌ）等のスルホニル化合物；９－フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４－ジメチルアミノスルホニル－７－フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ－Ｆ）、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｆ）、２、３－ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）；３－アミノピリジル－Ｎ－ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物；３－クロロカルボニル－６、７－ジメトキシ－１－メチル－２－キノキサリノン（ＤＭＥＱ－ＣＯＣｌ）、３－ニトロフェニルイソチオシアネート、３－ピリジルイソチオシアネート、４－（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物；ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物、（５－サクシニミドキシ－５－オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物；または２－クロロ－１－メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物であるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　式［I'］において、Ｒ’は、前記Ｒと同じ意味を有する置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。
　本発明は、さらに別の形態として、上記のアミノ化合物の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
　本発明によって、アミノ酸誘導体のＮ末端アミノ基を誘導体化することにより、質量分析におけるイオン化効率が向上し、試料中に少量しか存在しない最終糖化産物等の分子バイオマーカーやペプチドホルモンについても、質量分析方法を用いて迅速、高感度かつ高精度な定量分析が可能になる。したがって、本発明は、アミノ酸誘導体とニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤との誘導体化生成物である新規なアミノ化合物、好ましくはタンパク質の解糖等の反応中間産物である糖化タンパク質分解物がニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤で誘導体化された、耐糖能異常の診断に有用な新規な糖化タンパク質分解物誘導体を提供する。また、本発明は、そのアミノ化合物についての迅速、高感度かつ高精度な定量が可能な質量分析方法およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ－Ｈ１）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。 ＭＧ－Ｈ１の２，４，６－トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ－Ｈ１-ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。 アルグピリミジン（ＡＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。 ＡＰの２，４，６－トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。 質量スペクトルより予測されるＭＧ－Ｈ１の２，４，６－トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ－Ｈ１-ＴＮＰ）のフラグメンテーションパターンを示す図である。 質量スペクトルより予測されるＡＰの２，４，６－トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）のフラグメンテーションパターンを示す図である。 （Ａ）はＭＧ－Ｈ１の、（Ｂ）はＭＧ－Ｈ１の２，４，６－トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ－Ｈ１-ＴＮＰ）のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示すマスクロマトグラムである。 （Ａ）はＡＰの、（Ｂ）はＡＰの２，４，６－トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）のＬＣ－ＭＳ分析の結果を示すマスクロマトグラムである。 ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰの濃度と質量スペクトルのピーク強度について、内部標準法を用いて作製した検量線である。 ＡＰ－Ｈ１－ＴＮＰの濃度と質量スペクトルのピーク強度について、内部標準法を用いて作製した検量線である。 ＭＧ－Ｈ１の２，４，６－トリニトロフェニル化に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。 ＡＰの２，４，６－トリニトロフェニル化に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。 ラット血漿の前処理のプロトコールを示す図表である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではなく、下記の実施形態は、本発明を具体的に詳細に説明するために例示的に記載するものである。したがって、下記の実施形態から想到される形態もまた、本発明の範囲に包含されるものと理解されるべきである。
　なお、本明細書においては、説明を簡潔にするために、誘導体化剤としてはニトロベンゼン化合物を例に挙げて説明するが、本発明においては、誘導体化剤はニトロベンゼン化合物に一切限定されるものではなく、その他の誘導体化剤も本発明の範囲に当然包含されるものとして理解されるべきである。したがって、本明細書においては、誘導体化剤でアミノ酸誘導体の末端アミノ基を誘導体化した残基についても、ニトロベンゼン化合物の残基であるニトロフェニル基について説明するが、これについても一切限定されるものではなく、その他の誘導体化剤の残基も同様に包含されるものと理解されるべきである。
　本発明に係るアミノ化合物は、一般式［Ｉ］で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
　上記一般式において、用語「アミノ置換基」は、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味する。
　ここで、用語「アミノ酸残基」とは、非置換アミノ酸からアミノ基を除外した残基を意味している。例えば、アラニンの場合には、２－アミノプロパン酸と別称されるので、２－アミノプロパン酸からアミノ基を除外したアミノ酸残基は、カルボキシルエチル基である。同様に、リジンの場合のアミノ酸残基は１－カルボキシル－５－アミノペンチル基である。
　また、上記一般式において、用語「置換アミノ酸残基」とは、上記アミノ酸からアミノ基を除外したアミノ酸残基であって、該アミノ酸を構成するカルボキシル基以外の残基、つまり原子団が置換基で置換されて形成された原子団、つまり置換部分（moiety）を有するアミノ酸残基を意味している。置換アミノ酸残基の例としては、上記リジン残基の５－アミノ基にカルボキシルメチル基が置換した１－カルボキシル－５－（カルボキシルメチル）アミノペンチル基が挙げられる。また別の例として、例えば、アルギニン残基のアミノ－イミノメチル基が２－ピリミジニル基に変換した置換アミノ酸残基等も挙げることができる。
　さらに、上記一般式において、用語「ペプチド残基」とは、上記アミノ酸および／または置換アミノ酸がペプチド結合して形成されたペプチドの末端アミノ酸から末端アミノ基が除外された残基を意味している。例えば、ペプチドＶａｌ－Ｔｙｒの場合、ペプチド残基とは、末端アミノ酸のバリンからアミノ基が除外された残基を意味する。
　本発明において、用語「アミノ酸誘導体」とは、特段の定めがない限り、非置換アミノ酸誘導体、もしくはＮ末端アミノ基以外のアミノ酸部分が置換基等で修飾されている置換アミノ酸誘導体、またはペプチドを意味している。
　したがって、本発明において使用する用語「アミノ化合物」は、特段の定めがない限り、アミノ酸誘導体［II］またはその塩のN末端アミノ基が、ニトロベンゼン化合物［III］によりニトロフェニル化されたニトロフェニル化アミノ化合物を意味している。
　本発明において、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸、またはペプチド残基のペプチド構成アミノ酸のアミノ酸は、広義には、アミノ基とカルボキシ基の両方の官能基を有する化合物であれば、特に限定されるものではないが、狭義には、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシン、好ましくはアルギニンおよびリジン等のタンパク質の構成成分であるアミノ酸およびそれらを構成するカルボキシル基以外の残基が置換基で置換されて形成された置換部分を有する置換アミノ酸残基が挙げられる。
　好ましいアミノ酸としては、例えば、好ましくはアルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはトリプトファンが挙げられる。
　また、本発明において使用する用語「置換アミノ酸残基」は、上記アミノ酸の末端アミノ基以外の残基に任意の置換基が結合して形成された別の原子団を有する置換アミノ酸誘導体の残基を意味している。かかるアミノ酸誘導体としては、本発明の目的を逸脱しない限り、特に限定されるものではなく、例えば、アミノ酸等の生体成分の分解生成物や中間生成物、または代謝産物等が挙げられ、例えば、タンパク質の糖化反応によって生成される各種最終糖化産物（ＡＧＥ類）、アルギニンの分解生成物であるオルニチン、筋肉へのエネルギー供給源のクレアチニンリン酸の代謝産物であるクレアチニン、肝臓中のグルタチオン欠乏を示すバイオマーカーであるオフタルミン酸生合成の中間体のα－アミノ酪酸（ＡＡＢＡ）、主に神経伝達物質として作用するγ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）等の他、各種疾患の診断および予後予測等に用いられる分子バイオマーカーや、馬尿酸等も挙げられる。これらアミノ酸のうち、上記ＡＧＥ類等が好ましい。より好ましいのは、例えば、アルギニンの側鎖のグアノシル基とメチルグリオキサール、またはリジンのアミノ基とグリオキサールもしくはメチルグリオキサール等の脂質過酸化、メイラード反応、解糖等の反応中間産物との反応により生成されるＡＧＥ類等が挙げられる。かかるＡＧＥ類等のうち、好ましいものとしては、置換アルギニン誘導体や置換リジン誘導体等が挙げられる。
　置換アルギニン誘導体としては、例えば、アルギニンのグアニジノ基がカルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基等の置換基で修飾されたアルキル置換アルギニン誘導体、イミダゾロン類、ピリミジン類、イミダゾピリジン類等のグアニジノ基が環状構造になっている環状アルギニン誘導体等が挙げられる。
　更に具体的には、アルキル置換アルギニン誘導体としては、例えば、カルボキシルメチルアルギニン（ＣＭＡ）等が挙げられる。また、環状アルギニン誘導体のイミダゾロン類としては、例えば、イミダゾロン、グリオキサールヒドロイミダゾロン（Ｇ－Ｈ）、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ－Ｈ）、Ｎδ－［５－（２，３，４－トリヒドロキシブチル）－５－ヒドロ４－イミダゾロン２－イル］－オルニチン（３－ＤＧ－Ｈ）等が挙げられる。ピリミジン類としては、例えば、アルグピリミジン、テトラヒドロピリミジン等が挙げられる。イミダゾピリジン類としては、例えば、ペントシジン等が挙げられる。
　これら置換アルギニン誘導体のうち、特に好ましいのは、例えば、構造式［IIa］で表されるメチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ－Ｈ１：Ｎδ－（５－ヒドロ－５－メチル－４－イミダゾロン２－イル）－オルニチン）、または構造式［IIb］で表されるアルグピリミジン（ＡＰ）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　更に具体的には、上記アミノ酸誘導体は、立体構造を有し、構造式［IIc］または構造式［IId］でそれぞれ表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　また、上記ＡＧＥ類のうち、置換リジン誘導体としては、例えば、リジンのアミノ基がカルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基等の置換基で修飾されたアルキル置換リジン誘導体、リジンのアミノ基が環状構造を有している環状リジン誘導体等が挙げられる。
　アルキル置換リジン誘導体としては、例えば、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシエチルリジン（ＣＭＬ）等が挙げられる。また、環状リジン誘導体としては、例えば、ビラリン、ＦＴＰ（Ｆｏｒｍｙｌ　Ｔｈｅｒｏｓｙｌ　Ｐｙｒｒｏｌｅ）等のピロール誘導体、ＧＯＬＤ（グリオキサール由来リジン二量体）、ＭＯＬＤ（メチルグリオキサール由来リジン二量体）、ＤＯＬＤ（３－デオキシグルコソン由来リジン二量体）等のイミダゾール誘導体、ＧＬＡＰ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ）、ＧＡ－ピリジン（ｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ－ピリジン）等のピリジン誘導体、ペントシジン等のイミダゾピリジン誘導体等が挙げられる。
　さらに、上記一般式［Ｉ］において、置換基Ｒで表されるペプチド残基のペプチドとしては、そのペプチドを構成する上記アミノ酸の数は特に限定されないが、上記アミノ酸が２個～１０個、好ましくは２個～６個、より好ましくは２個～４個ペプチド結合して構成されているペプチドであるのがよい。かかるペプチドとしては、例えば、バリルチロシン、リシルチロシン、メチオニルチロシン、グリシルチロシン、ヒスチジルチロシン、グルタミルチロシン、トリプトファニルチロシン、ヒスチジニルトリプトファン、カルノシン、アンセリン等のジペプチド、グルタチオン等のトリペプチド等が挙げられる。その他に、エンケファリン、カキシトシン、バソプレッシン等を挙げることができる。これらペプチドのうち、バリルチロシン、リシルチロシン、メチオニルチロシン、グリシルチロシン、ヒスチジルチロシン、グルタミルチロシン、トリプトファニルチロシンならびにヒスチジニルトリプトファン等のジペプチドが好ましい。また、ペプチドは、タンパク質の消化物、最終糖化産物等の代謝産物、ペプチドホルモン等の生理活性ペプチドのいずれであってもよく、各種疾患の診断および予後予測等に用いられる分子バイオマーカーであってもよい。
　一方、上記一般式［I］において、置換基 Z は、アミノ酸誘導体［II］の末端アミノ基をニトロフェニル化したニトロベンゼン化合物の残基であって、一般式［IIIb］ で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　式［IIIb］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも、同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
　ここで、ニトロフェニル基としては、例えば、モノ－、ジ－またはトリ－ニトロフェニル基、好ましくはトリ－ニトロフェニル基、特に好ましくは２、４、６－ニトロフェニル基が挙げられる。ニトロ置換基の位置にしても、特に限定はないが、１個の場合は２－位、２個の場合は２－位と４－位、３個の場合に２－位、４－位ならびに６－位であるのがよい。
　したがって、本発明に係るアミノ化合物は、一般的には、一般式［Ｉ］で表され、より具体的には、一般式［Ia］で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　式［Ia］において、Ｒ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
　本発明において、構造式［Ia］で表されるアミノ化合物の好ましい例としては、例えば、構造式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体、または構造式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　式［Ib］および［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
　さらに好ましいアミノ化合物は、例えば、一般式［Ii］で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　式［Ii］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
　したがって、アミノ化合物としては、例えば、構造式［Iii］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体、または一般式［Iiii］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体がさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　上記のトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体およびトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体の立体構造式（［Iiv］および［Iv］）はそれぞれ次のように表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　本発明に係るアミノ化合物［Ｉ］は、一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物で誘導体化反応することにより得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　式［II］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　式［III］において、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚは上記と同じ意味を有する。
　より具体的には、本発明のアミノ化合物［Ia］は、アミノ酸誘導体［II］またはその塩と、一般式［IIIa］ で表されるニトロベンゼン化合物との誘導体化反応により得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　式［IIIa］において、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
　更に具体的には、本発明のアミノ化合物［Ii］は、アミノ酸誘導体［II］またはその塩と、一般式［IIIc］で表されるトリニトロベンゼン化合物との誘導体化反応により得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　式［IIIc］において、Ｘは前記と同じ意味を有する。
　ここで、Ｘで表されるアミノ基反応性官能基としては、アミノ酸または置換アミノ酸（［II］）をニトロフェニル誘導体化する反応性官能基であれば特に限定されないが、例えば、塩素原子、フッ素原子、臭素原子もしくはヨウ素原子から選ばれるハロゲン原子、またはスルホン酸またはスルホン酸塩、アルキルスルホン酸エステル基、アリールスルホン酸エステル基、パーフルオロアルキルスルホン酸エステル基等の、ニトロベンゼン誘導体の芳香族求核置換反応において脱離基となり得る任意の官能基が挙げられる。
　そこで、好ましいニトロベンゼン化合物としては、例えば、２，４，６－トリニトロフルオロベンゼン、２，４，６－トリニトロクロロベンゼン、２，４，６－トリニトロブロモベンゼン、２，４，６－トリニトロヨードベンゼンおよび２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸またはその塩等が挙げられ、これらのうち特に好ましいのは、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸またはその塩である。塩としては、例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、カリウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明において、上記アミノ酸誘導体のＮ末端アミノ基をニトロベンゼン化合物で誘導体化するには、上記アミノ酸誘導体とニトロベンゼン化合物とを、アルカリ性の水溶液または、水と有機溶媒の混合溶液中にて室温で数十分間混合することにより行うことができる。好ましくはアルカリ性水溶液中で行われる。また、水と有機溶媒との混合溶液を用いる場合、有機溶媒としてはエタノール等の水との親和性が高い有機溶媒が好ましく用いられる。これらの溶液のｐＨは８～１０であることが好ましく、より好ましくは８．５～９．５であるのがよい。溶液のｐＨが高すぎると、分析対象のアミノ酸誘導体またはこの化合物が分解する可能性が増大し、低すぎるとニトロフェニル化反応が迅速に進行しなくなる。ここでｐＨとは、ｐＨメータにより直接測定される値である。なお、室温とは１５℃から４０℃程度の温度であり、３０℃前後で反応を行うことが好ましい。また、混合はいかなる方法であってもよく、１分以上１時間以下、好ましくは５分から４０分間の混合が行われる。通常は３０分間の混合で十分である。
　本発明の特徴の一つは、かかる温和な条件下で、ニトロフェニル化反応を行うことができることである。試料中の分析対象となる物質を単離してニトロフェニル化を行ってもよいが、夾雑物等を含むような試料中でそのままニトロフェニル化を行ってもよい。本発明はこのような試料中でそのままニトロフェニル化を行うことができるため、単離によるロス等を低減することができ、分析対象となる物質が少量しか含まれないような場合であっても測定することができるという優れた方法である。また、複雑な操作を行う必要が無く、簡便に測定することができる。特に対象試料が生体試料等の場合は、分析対象となる物質が少なく、かつ、夾雑物が多い状態であることが多いため有効である。
　また、例えば、試料中のアミノ酸誘導体を測定するに当たっては、生体試料に、ニトロベンゼン化合物を添加することにより、試料中のバイオマーカーとしてのアミノ酸誘導体をニトロベンゼン化合物で誘導体化することも可能であるとともに、かかる誘導体化したアミノ酸誘導体をバイオマーカーとして測定できることは当然のことである。
　本発明において試料となるものは、測定対象となる最終糖化産物等の、本発明によってアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物となるものを含有するものであればよい。また、生体由来の試料を生体試料とよぶ。
　さらに、アミノ酸誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リチウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等を使用することができる。
　本発明においては、誘導体化剤として、上記ニトロベンゼン化合物の他に、その他のアミノ基を誘導体化する誘導体化剤も使用できることは当然のことである。かかる誘導体化剤としては、例えば、ニトロベンゼンスルホン酸化合物、フルオロ－ニトロベンゼン等のニトロベンゼン化合物の他に、１－ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ－Ｃｌ）等のスルホニル化合物、９－フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４－ジメチルアミノスルホニル－７－フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ－Ｆ）、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｆ）、２、３－ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）、３－アミノピリジル－Ｎ－ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物、３－クロロカルボニル－６、７－ジメトキシ－１－メチル－２－キノキサリノン（ＤＭＥＱ－ＣＯＣｌ）、３－ニトロフェニルイソチオシアネート、３－ピリジルイソチオシアネート、４－（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物、ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物、（５－サクシニミドキシ－５－オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物、または２－クロロ－１－メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物等を挙げることができる。これらの誘導体化剤も、上記ニトロベンゼン化合物と実質的に同様に使用することができる。
　つまり、本発明において、上記誘導体化剤を使用する場合は、本発明に係るアミノ化合物は、一般式［Ｉ'］で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　式［I'］において、Ｒ’は上記Ｒと同じ意味を有するアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。
　ここで、誘導体化残基は、上記誘導体化剤が、置換アミノ酸誘導体（Ｒ’－ＮＨ２）のアミノ基を誘導体化した残基を意味している。例えば、誘導体化剤としてダンシルクロライドを使用した場合、置換アミノ酸誘導体（Ｒ’－ＮＨ２）のアミノ基がダンシル化、つまり、ジメチルアミノナフタレンスルホニル化されるので、このダンシル基が誘導体化残基ということができる。
　したがって、この場合も、本明細書において、ニトロベンゼンスルホン酸を誘導体化剤として用いた場合についての記載を実質的に同様に適用することができる。
　本発明において、質量分析に用いられる試料のイオン化法については、特に制限はないが、生体分子の検出および定量に広く用いられているＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法、ＡＰＣＩ法等用いられるのが好ましい。分離技術と組み合わせたＬＣ／ＭＳやＧＣ／ＭＳ等においては、試料のイオン化法としてはＥＳＩ法やＡＰＣＩ法を用いられるのがよい。分析には、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ３等のタンデム質量分析方法を用いることができる。この場合、プロダクトイオンの検出には、例えば、夾雑物の影響を排除し高感度な検出が可能な多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いるのが好ましい。
　次に、本発明に係る質量分析方法を用いたバイオマーカーのアッセイ方法について説明する。
　本発明は、分析対象としてバイオマーカーを選択することにより、バイオマーカーを、迅速に、高感度かつ高精度に検出および定量できるアッセイ方法を提供することができる。すなわち、本発明のバイオマーカーのアッセイ方法は、アミノ酸誘導体であるバイオマーカーのＮ末端アミノ基とニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤とを反応させ、Ｎ末端アミノ基をニトロフェニル化等の誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基がニトロフェニル化等の誘導体化されたアミノ酸誘導体またはその塩を質量分析する工程と、質量分析方法を用いて得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程を有している。
　本発明において、バイオマーカーとしては、アミノ基を有するアミン化合物である限り、特に制限はないが、本発明のアッセイ方法が特に好ましく適用できるものとしては、例えば、アミノ酸誘導体と糖の代謝産物との反応により生成される最終糖化産物（ＡＧＥ類）等や、生体アミンであるカテコールアミン(ドパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)、インドールアミン(セロトニン、メラトニン)、イミダゾールアミン(ヒスタミン)、アセチルコリン、ポリアミン(プトレシン、スペルミジン、スペルミン)等が挙げられる。
　本発明のアッセイ方法による分析対象のバイオマーカーとして特に好ましいＡＧＥ類としては、例えば、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ－Ｈ１）、および構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ）を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　これらはそれぞれ、ＭＧ－Ｈ１およびＡＰのＮ－２，４，６－トリニトロフェニル誘導体であり、質量分析方法により高感度で検出および定量が可能なＡＧＥであり、耐糖能異常の診断指標として有用である。
　本発明において、アッセイ対象となるアミノ酸誘導体またはペプチドの濃度をマススペクトルの面積強度から定量するためには、例えば、検量線法または同位体希釈法が用いられる。質量分析において、分析対象物質を定量分析する手法の一つに検量線法が挙げられる。検量線法は、既知量の標準物質を含み、濃度の異なるいくつかの標準試料と、これらの標準試料から得られる信号強度との関係（検量線）が理論的には線形関係になることを利用し、未知試料から得られた信号強度からその試料の濃度を定量する方法である。標準とする試料の調製法により、検量線法は、外部標準法、内部標準法、標準添加法に大別されるが、本アッセイ方法ではいずれの方法を用いてもよい。同位体希釈法は、測定対象化合物を構成する特定の元素の同位体比に着目し、同位体比が既知のスパイクを一定量添加して測定対象化合物の同位体組成を平衡に到達させた後、スパイク添加前後の試料の同位体比を測定し、同位体組成の変化から試料の元素濃度を求める方法であり、検出限界が１ｐｇ程度と低いことが利点として挙げられる。
　上記の様にして得られたバイオマーカーの定量データは、疾患の発症、進行度、予後等の予測や診断に用いることができる。すなわち、本発明の一実施形態としては、アミノ酸誘導体またはペプチドであるバイオマーカーのＮ末端アミノ基とトリニトロフェニル化剤等の誘導体化剤とを反応させ、Ｎ末端アミノ基をトリニトロフェニル化等の誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基がトリニトロフェニル化等の誘導体化されたアミノ酸誘導体またはペプチドを質量分析する工程と、質量分析方法を用いて得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程と、このようにして得られるバイオマーカーの濃度データを元に、疾患の発症、進行度、予後等に関する診断を行う工程を有する疾患の診断方法に関するものである。
　本発明の診断方法は、複数種のＡＧＥ類を同時に測定、定量できることからも有用である。すなわち、本発明は、試料中でニトロフェニル化を行うことができる方法であり、また質量分析により分析するものであるから、質量数が異なる対象物質を測定する場合、質量分析法と組み合わせることで同時に測定（定量）することができる優れた方法を提供するものである。本発明により、従来の早期診断法に比べて、費用および手間を大幅に削減することができる。
　以下、本発明の実施例に基づいて、本発明の特徴、作用効果についてより具体的に説明する。これらの実施例はあくまでも例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
　トリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰ）［Iii］を次のようにして製造した。
　メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ－Ｈ１）［IIa］を０．１Ｍホウ酸溶液（ｐＨ９．３）に溶解させ、３０ｍＭ　２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＴＮＢＳ）－０．１Ｍホウ酸溶液（ｐＨ９．３）を１０μＬ添加後、十分に混和した。得られた混合物を３０℃にて２０分間インキュベー卜して、誘導体化を行った。誘導体化したＭＧ－Ｈ１（ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰ）を、それぞれ、１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ギ酸（３ｍＬ）及び０．１％ギ酸（３ｍＬ）で平衡化したＳｅｐ－Ｐａｋ Ｐｌｕｓ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に負荷し、０．１％ＦＡ（３ｍＬ）で洗浄後、１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ギ酸（３ｍＬ）にて溶出した画分を遠心エバポレータで乾固した。画分乾固物は脱イオン水１．５ｍＬで再溶解し、凍結乾燥後、－４０℃で保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　トリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ－ＴＮＰ）［Iiii］を次のようにして製造した。
　アルグピリミジン［IIb］を、実施例１と実質的に同様に処理してトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ－ＴＮＰ）［Iiii］を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　質量スペクトルの測定
　ＭＧ－Ｈ１およびＡＰ、ならびに上記の様にして調製したＭＧ－Ｈ１およびＡＰのＮ－２，４，６－トリニトロフェニル誘導体（それぞれ「ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰ」および「ＡＰ－ＴＮＰ」）を０．１％ギ酸に溶解させ、質量スペクトルの測定を行った。測定条件は下記のとおりである。
　・イオン化モード　ＥＳＩ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ
　・スキャン範囲　１００～５００ｍ／ｚ
　・ドライガス　３３０℃、８．０Ｌ／分
　・ネブライザーガス　２７６ｋＰａ
　・キャピラリー電圧　－２７５０Ｖ
　・スキマー電圧　４０Ｖ
　・キャピラリー出口電圧　１２４Ｖ
　ＭＧ－Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰおよびＡＰ－ＴＮＰの質量スペクトル（ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ）を、それぞれ、図１、２、３、４に示す。なお、図２、４において、ＭＧ－Ｈ１およびＡＰのＮ－２，４，６－トリニトロフェニル誘導体は、それぞれ、「ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰ」、「ＡＰ－ＴＮＰ」と表記されている。ＭＳ／ＭＳの測定に用いたプリカーサーイオンは、ぞれぞれの化合物についての［Ｍ＋Ｈ］＋イオンである。得られた質量スペクトルのうち、ピーク強度の最も大きなものを、後述するＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ／ＭＳ分析においてモニターの対象となるイオンピークとして選択した。
　また、図３、図４に示すＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルより予測されるＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰおよびＡＰ－ＴＮＰのフラグメンテーションパターンを、それぞれ図５および図６に示す。
ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ／ＭＳ分析
　下記の条件下で、ＭＧ－Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰおよびＡＰ－ＴＮＰのＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。サンプル濃度はいずれも１０ｎｍｏｌ／Ｌとし、いずれも０．１％ギ酸水溶液に溶解させた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
　・移動相　ＭｅＯＨ－０．１％ギ酸水溶液
　・流速　０．２０ｍＬ／分
　・グラジエント　０～１００％（２５分）
　・固定相　Ｗａｔｅｒｓ　Ａｔｌａｎｔｉｓ　Ｔ３（φ２．１×１００ｍｍ）
　・カラムオーブン温度　４０℃
＜ＭＳ条件＞
　・イオン化モード　ＥＳＩ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ
　・スキャン範囲　１００～５００ｍ／ｚ
　・ドライガス　３３０℃、８．０Ｌ／分
　・ネブライザーガス　２７６ｋＰａ
　・キャピラリー電圧　－２７５０Ｖ
　・スキマー電圧　４０Ｖ
　・キャピラリー出口電圧　１２４Ｖ
　・インジェクション体積　２５μＬ
　ＭＧ－Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰおよびＡＰ－ＴＮＰのマスクロマトグラムを、それぞれ、図７、８に示す。図７の結果より、ＭＧ－Ｈ１のＮ末端アミノ基を２，４，６－トリニトロフェニル化することにより、ピーク強度が１５００倍程度に増大することが確認された。
検量線の作製ならびに検出限界および定量限界の決定
　内部標準としてＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰの重水素化体（ＭＧ－Ｈ１－ｄ３－ＴＮＰ）を用いて、ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰおよびＡＰ－ＴＮＰの検量線を作製した。酸による分解の影響を避けるために、インジェクション直前に０．１％ギ酸水溶液を添加する手順（表１参照）で希釈を行い、高濃度側から測定を行った。まず、原液として、ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰおよびＡＰ－ＴＮＰの１μｍｏｌ／ｍＬ水溶液を調製し、終濃度が４００、２００、４０、２０、４、２ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように水で希釈した。各濃度について、これらの等モル混合物２５μＬに、ＭＧ－Ｈ１－ｄ３－ＴＮＰの４００ｐｍｏｌ／ｍＬ水溶液２５μＬを加え、０．２％ギ酸水溶液５０μＬを加えて十分混和し、うち２５μＬをＬＣ－ＭＳ分析に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
　得られた質量スペクトルにおけるＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰまたはＡＰ－ＴＮＰと、ＭＧ－Ｈ１－ｄ３－ＴＮＰとのピーク強度比をＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰまたはＡＰ－ＴＮＰの濃度に対しプロットすることにより、図９および１０に示す検量線が得られた。これらより、ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰについて、検出限界２．０５ｐｍｏｌ／ｍＬ、定量限界６．２０ｐｍｏｌ／ｍＬ、ＡＰ－ＴＮＰについて、検出限界０．１１ｐｍｏｌ／ｍＬ、定量限界０．３３ｐｍｏｌ／ｍＬという結果が得られた。同様にＣＭＬ－ＴＮＰについて検量線を作製し濃度換算すると、検出限界５．３ｎｍｏｌ／Ｌ、定量限界１６ｎｍｏｌ／Ｌであった。また、ＣＥＬ－ＴＮＰについては、検出限界２．７ｎｍｏｌ／Ｌ、定量限界８．０ｎｍｏｌ／Ｌであった。検量線については、相関係数０．９９６以上の良好な直線性が得られると共に、それぞれについてｐｍｏｌレベル（濃度としてｎＭ／Ｌレベル）での定量分析が可能であることが確認された。これらの数値は、従来より用いられている誘導体化剤であるダンシルクロリドやＮＤＡ（２，３－ナフタレンジアルデヒド）における検出限界の１／１００～１／２００であり、２，４，６－トリニトロフェニル化により大幅な感度向上が可能であることを示している。
２，４，６－トリニトロフェニル化におけるｐＨの影響
　実施例１および２においてＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰおよびＡＰ－ＴＮＰのそれぞれの調製において、反応液のｐＨを７．５、８．０、８．５にした場合における誘導体化率を、ＬＣ－ＭＳ分析を用いて算出した。遠心エバポレータ処理により得られた乾固物を０．２％ギ酸水溶液１００μＬに溶解し、内部標準としてＭＧ－Ｈ１－ｄ３－ＴＮＰの２００ｐｍｏｌ／ｍＬ水溶液５０μＬを加え、十分に混和した後、２５μＬをＬＣ－ＭＳ分析に供し、検量線法により２，４，６－トリニトロフェニル体の濃度を決定した。結果は、図１１、１２に示すとおりであり、ＭＧ－Ｈ１－ＴＮＰまたはＡＰ－ＴＮＰのいずれの場合についても、ｐＨ８．５～９．３で、定量的に誘導体化が可能であることが確認された。
ラット血漿スパイク試験
　ＳＤラットのコントロール血漿に対し、ＭＧ－Ｈ１、ＡＰおよび内部標準であるＭＧ－Ｈ１－ｄ３をスパイクし、回収後、２，４，６－トリニトロフェニル化を行った。血漿に対する前処理は、図１３に示すプロトコール（E.M.N. Nakashima et al., Anal. Biochem., 414, 109-116（2011）参照）に準拠して行い、スパイクしたＭＧ－Ｈ１、ＡＰおよびＭＧ－Ｈ１－ｄ３の同時検出を試みた。標準添加法により作製した検量線を用いたＬＣ－ＭＳ分析により、ＭＧ－Ｈ１およびＡＰについて、血漿中濃度の定量が可能であることが確認された。
Ｖａｌ－Ｔｙｒを用いた検討
　ＡＧＥ類であるＭＧ－Ｈ１およびＡＰの代わりにジペプチドＶａｌ－Ｔｙｒを用いて、上記と同様の手順により、２，４，６－トリニトロフェニル化による検出感度の変化を検討した結果、ＭＧ－Ｈ１の場合と同様、２，４，６－トリニトロフェニル化によりピーク強度が約５０倍に増大することが確認された（表２）。
ジペプチドを用いた検討
　実施例８と実質的に同様にして下記ジペプチドを調製し、検出感度の変化を検討した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
　この発明は、例えば、生体内成分であるタンパク質が代謝過程で糖化等された最終糖化産物や中間産物等の代謝産物を始めとするアミノ酸誘導体をニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤により誘導体化したアミノ化合物であって、特に耐糖能異常の診断に有用な化合物であるところから、これらのあの化合物を迅速、高感度かつ高精度に定量することが可能である質量分析方法である。したがって、これらのアミノ化合物をバイオマーカーとしてアッセイすることにより様々な疾患の予防や診断に役立ち、これによりその疾患の予防薬や治療薬の開発に役に立つことが期待できる。

Claims (25)

  1. 　一般式［Ｉ］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。）
  2. 　請求項１に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ置換基がアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基または複数の該アミノ酸残基ならびに／もしくは置換アミノ酸残基がペプチド結合したペプチド残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
  3. 　請求項２に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
    前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
  4. 　請求項２または３に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
    前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
  5. 　請求項２ないし４のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
    前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
  6. 　請求項５に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、アルギニン誘導体またはリジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
  7. 　請求項２に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
    前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合していることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
  8. 　請求項１ないし７のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記ニトロフェニル基が、一般式［IIIb］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
  9. 　請求項１ないし８のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
  10. 　請求項９に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
  11. 　請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
  12. 　請求項１１に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  13. 　一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     　（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。）
  14. 　請求項１３に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
    前記アミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
  15. 　請求項１３または１４に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
    前記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     　（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
  16. 　請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     　（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
  17. 　請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、
    構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  18. 　一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物を反応させて一般式［I］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
    上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     　（式中、Ｒはアミノ置換基を意味する。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     （式中、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     　（式中、ＲおよびＺは、前記と同じ意味を有する。）
  19. 　前記一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８～１０でおこなうことを特徴とする請求項１８に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
  20. 　請求項１８または１９に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
    前記アミノ置換基がアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
  21. 　請求項１８ないし２０のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記反応が試料中で行われることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
  22. 　請求項１８ないし２１のいずれか１項に記載の質量分析方法であって、
    前記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであることを特徴とするアミノ化合物の質量分析方法。
  23. 　一般式［I'］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     　（式中、Ｒ’は、置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。）
  24. 　請求項２３に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
    前記誘導体化残基の誘導体化剤が、
    　１－ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ－Ｃｌ）等のスルホニル化合物；
    　９－フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４－ジメチルアミノスルホニル－７－フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ－Ｆ）、４－フルオロ－７－ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ－Ｆ）、２、３－ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）；
    　３－アミノピリジル－Ｎ－ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物；
    　３－クロロカルボニル－６、７－ジメトキシ－１－メチル－２－キノキサリノン（ＤＭＥＱ－ＣＯＣｌ）；
    　３－ニトロフェニルイソチオシアネート、３－ピリジルイソチオシアネート、４－（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン－５－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物；
    　ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物；
    　（５－サクシニミドキシ－５－オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物；
    　または２－クロロ－１－メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物から選択された少なくとも１以上の誘導体化剤であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
  25. 　請求項１３ないし２４のいずれか１項に記載のアミノ化合物の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うことを特徴とするバイオマーカーのアッセイ方法。
PCT/JP2013/069038 2012-07-12 2013-07-11 アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法 WO2014010700A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014524880A JPWO2014010700A1 (ja) 2012-07-12 2013-07-11 アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-156746 2012-07-12
JP2012156746 2012-07-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014010700A1 true WO2014010700A1 (ja) 2014-01-16

Family

ID=49916141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/069038 WO2014010700A1 (ja) 2012-07-12 2013-07-11 アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2014010700A1 (ja)
WO (1) WO2014010700A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3341720A4 (en) * 2015-08-29 2019-04-03 PreventAGE Healthcare, LLC METHOD FOR IMPROVING DIABETES MANAGEMENT
WO2023016517A1 (zh) * 2021-08-11 2023-02-16 复旦大学 萘磺酰类化合物、其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997007396A1 (en) * 1995-08-14 1997-02-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Separation of polar compounds by affinity countercurrent chromatography
JP2007163423A (ja) * 2005-12-16 2007-06-28 Ajinomoto Co Inc 質量分析計によるアミノ酸分析方法
WO2007132164A2 (en) * 2006-05-02 2007-11-22 Royal Holloway And Bedford New College Analysis of proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997007396A1 (en) * 1995-08-14 1997-02-27 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Separation of polar compounds by affinity countercurrent chromatography
JP2007163423A (ja) * 2005-12-16 2007-06-28 Ajinomoto Co Inc 質量分析計によるアミノ酸分析方法
WO2007132164A2 (en) * 2006-05-02 2007-11-22 Royal Holloway And Bedford New College Analysis of proteins

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHUSHAN, R. ET AL.: "Marfey's reagent for chiral amino acid analysis: a review", AMINO ACIDS, vol. 27, no. 3-4, 2004, pages 231 - 247 *
BHUSHAN, R. ET AL.: "Use of Marfey's reagent and analogs for chiral amino acid analysis: assessment and applications to natural products and biological systems", J CHROMATOGRAPHY B, vol. 879, no. 29, 2011, pages 3148 - 3161 *
CREVELING C.R. ET AL.: "Use of dansyl derivatives and mass spectrometry for identification of biogenic amines", CLIN CHEM., vol. 14, no. 4, 1968, pages 302 - 309 *
DIBELLO, C. ET AL.: "Thin-layer chromatography of dinitropyridyl- and nitropyrimidyl-amino acids", J CHROMATOGRAPHY, vol. 17, 1965, pages 506 - 512 *
FUJII, K. ET AL.: "A nonempirical method using LC/MS for determination of the absolute configuration of constituent amino acids in a peptide: Combination of Marfey's method with mass spectrometry and its practical application", ANAL CHEM, vol. 69, no. 24, 1997, pages 5146 - 5151 *
FUJII, K. ET AL.: "A nonempirical method using LC/MS for determination of the absolute configuration of constituent amino acids in a peptide: Elucidation of limitations of Marfey's method and of its separation mechanism", ANAL CHEM, vol. 69, no. 16, 1997, pages 3346 - 3352 *
HARADA, K. ET AL.: "Abnormal elution behavior of ornitine derivatized with 1-fluoro-2,4- dinitrophenyl-5-leucinamide in advanced Marfey's method", J CHROMATOGRAPHY A, vol. 921, no. 2, 2001, pages 187 - 195 *
HUI Y. ET AL.: "A new derivatization method coupled with LC-MS/MS to enable baseline separation and quantification of dimethylarginines in human plasma from patients to receive on-pump CABG surgery", ELECTROPHORESIS, vol. 33, no. 12, 2012, pages 1911 - 1920 *
MANICA D.P. ET AL.: "Analysis of the stability of amino acids derivatized with naphthalene-2,3 -dicarboxaldehyde using high-performance liquid chromatography and mass spectrometry", ANAL BIOCHEM., vol. 322, no. 1, 2003, pages 68 - 78 *
SHAH A.J. ET AL.: "Development of a protocol for the automated analysis of amino acids in brain tissue samples and microdialysates", J CHROMATOGR B, vol. 735, no. 2, 1999, pages 133 - 140 *
SIGNOR, A. ET AL.: "Chemical modification of arginine by nitromalondialdehyde. Synthesis and properties of 5-(5-nitro-2-pyrimidyl)ornithyl derivatives", BIOCHEMISTRY, vol. 10, no. 14, 1971, pages 2748 - 2752 *
STUDIER, M.H. ET AL.: "Mass spectrometry of DNP-amino acids combination with paper chromatography", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 40, no. 4, 1970, pages 894 - 900 *
SU C.L. ET AL.: "Selective detection of homocysteine by laser desorption/ionization mass spectrometry", RAPID COMMUN MASS SPECTROM., vol. 20, no. 22, 2006, pages 3303 - 3308 *
YANG W.C. ET AL.: "Enhancement of amino acid detection and quantification by electrospray ionization mass spectrometry", ANAL CHEM., vol. 78, no. 13, 2006, pages 4702 - 4708 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3341720A4 (en) * 2015-08-29 2019-04-03 PreventAGE Healthcare, LLC METHOD FOR IMPROVING DIABETES MANAGEMENT
WO2023016517A1 (zh) * 2021-08-11 2023-02-16 复旦大学 萘磺酰类化合物、其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2014010700A1 (ja) 2016-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kehm et al. Protein oxidation-formation mechanisms, detection and relevance as biomarkers in human diseases
AU2013206252B2 (en) Methods for improving diabetes management
Percy et al. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility
US9658234B2 (en) Method for analysis of compounds with amino group and analytical reagent therefor
Wa et al. Characterization of glycation adducts on human serum albumin by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
US8216847B2 (en) Means and method for predicting diabetes
Tong et al. Epidermal growth factor receptor phosphorylation sites Ser991 and Tyr998 are implicated in the regulation of receptor endocytosis and phosphorylations at Ser1039 and Thr1041
Rossing et al. The urinary proteome in diabetes and diabetes‐associated complications: new ways to assess disease progression and evaluate therapy
Hortin et al. Diagnostic potential for urinary proteomics
Klupczynska et al. A study of low-molecular-weight organic acid urinary profiles in prostate cancer by a new liquid chromatography-tandem mass spectrometry method
Jagadeeshaprasad et al. Targeted quantification of N-1-(carboxymethyl) valine and N-1-(carboxyethyl) valine peptides of β-hemoglobin for better diagnostics in diabetes
Jagadeeshaprasad et al. Albumin abundance and its glycation status determine hemoglobin glycation
WO2014010700A1 (ja) アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法
WO2017039743A1 (en) Methods for improving diabetes management
Suraj et al. Development, validation and application of a micro–liquid chromatography–tandem mass spectrometry based method for simultaneous quantification of selected protein biomarkers of endothelial dysfunction in murine plasma
WO2019152728A1 (en) Methods of quantifying methylglyoxal-induced nucleic acid adducts
MIYANO et al. Development of precolumn derivatization–LC/MS for amino-acid-focused metabolomics
Dikunets et al. Simultaneous Quantification of Plasma Catecholamines and Metanephrines by LC-MS/MS
Van de Merbel et al. Liquid chromatographic method for the quantitative determination of Nϵ-carboxymethyllysine in human plasma proteins
US20210109116A1 (en) p53 Peptides as Markers in the Diagnosis and Prognosis of Alzheimer's Disease
Sutton et al. Performance characteristics of an FT MS‐based workflow for label‐free differential MS analysis of human plasma: standards, reproducibility, targeted feature investigation, and application to a model of controlled myocardial infarction
Li et al. Simultaneous quantification of apolipoproteins AI, E, and J in human plasma by LC-MS/MS for clinical application to diabetes mellitus complicated with cardiovascular disease
Kumari et al. Targeted metabolomics reveals hippurate as a urinary potential marker for diabetic nephropathy
Duong et al. Serum Amine Profiling through Fluorine-Labeled 19F NMR Analysis
Korytowska-Przybylska et al. Development of a novel method for the simultaneous detection of trimethylamine N-oxide and creatinine in the saliva of patients with chronic kidney disease–Its utility in saliva as an alternative to blood

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13816839

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014524880

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13816839

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1