WO2007068021A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der fluoreszenz einer probe sowie verwendung derselben - Google Patents

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WO2007068021A1
WO2007068021A1 PCT/AT2006/000517 AT2006000517W WO2007068021A1 WO 2007068021 A1 WO2007068021 A1 WO 2007068021A1 AT 2006000517 W AT2006000517 W AT 2006000517W WO 2007068021 A1 WO2007068021 A1 WO 2007068021A1
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light
sample
receiver
excitation
light source
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PCT/AT2006/000517
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English (en)
French (fr)
Inventor
Alessandro Bizzarri
Christian Konrad
Volker Ribitsch
Original Assignee
Joanneum Research Forschungsgesellschaft Mbh
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Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the fluorescence of a sample, wherein the sample is irradiated with a light of a wavelength which is suitable for exciting fluorescent light in the sample, and the fluorescent light emitted by the sample is received in a receiver and is converted into a measurement signal, wherein the receiver additionally a reference light is supplied in particular for compensating environmental influences and also converted into a reference measurement signal.
  • the invention further relates to a device for determining the fluorescence of a sample, comprising a light source for emitting a light of a wavelength, which is suitable for exciting fluorescent light in the sample, and a receiver, which receives the fluorescent light emitted by the sample and converted into a measurement signal, wherein the receiver in addition a reference light in particular for compensating environmental influences can be fed and converted from this into a reference measurement signal.
  • one wavelength should also be understood as meaning a narrow wavelength range which is around a central and defined wavelength, as is the case, for example, when using a light-emitting diode or LED.
  • Such methods and devices can be found, for example, DD-A 229 220, US-A 5,196,709 or DE-C 198 49 585.
  • the determination of the fluorescence of specific molecules is increasingly used in sensory applications for the determination of various analytes. In doing so, the molecules are put into an excited state by irradiation with light of a specific wavelength. The return of the molecules to the ground state is effected by emission of light which has a higher wavelength than the excitation light (Stoke's Shift). In addition, this issue is offset in time. Information about the sample to be determined can be obtained by measuring the intensity or the decay time of the fluorescent light. Areas of application for this phenomenon are in environmental analysis, in medical diagnostics, in the monitoring of numerous industrial processes and in an analysis in the laboratory.
  • a much more compact method is the determination of the time delay with a dominant time constant ⁇ of the radiated fluorescence light, which is also referred to as "life", “Decay Time”, or “Life Time”.
  • the determination of the time constant can be done by measuring the decay constant after pulse-shaped excitation (in the time domain), or by measuring the phase shift with sinusoidal excitation (in the frequency domain). Since the determination of the decay time constant or the phase shift is principally independent of the emitted intensity and is practically limited only by the subsequent instrumentation, effects of the dye (eg leaching, fading) can be neglected. The determination of the phase shift to detect the changes of selective dyes has become established in practical implementations because of the lower instrumental cost over a cooldown measurement.
  • the ratio of fluorescent light to excitation light is small and thus requires various optical methods (optical arrangement or optical filter) for separating the light from these two light sources.
  • the present invention aims to provide, starting from a method and a device of the type mentioned at the outset, simple optical arrangements and possibilities for referencing, and in particular to allow a precise evaluation while providing constructive, simple and therefore cost-effective designs.
  • a method of the type initially mentioned is essentially characterized in that the optical path of the excitation light entering the sample and the fluorescent light exiting the sample are from the optical path of the reference light having the same wavelength as the excitation light between the light sources and the receiver is disconnected.
  • the optical path of the excitation light entering the sample and the fluorescent light leaving the sample are separated from the optical path of the reference or reference light ensures that the reference light is completely unaffected Influencing the sample entails and thus that in fact only the excitation light passes through the sample.
  • an identical wavelength can be used for the excitation light as well as for the reference light according to the invention. Since, in contrast to the known state of the art for the reference light no different wavelength compared to the excitation light is used to avoid influencing the sample, so that correspondingly complex corrections, in particular with respect to environmental parameters, such as temperature of the sample, taking into account different wavelengths can be omitted.
  • the inventive method thus achieves a simplified evaluation in particular in that a same wavelength can be used both for the excitation light and for the reference light.
  • the environmental influences to be compensated are, for example, changes which occur due to temperature changes or tolerances of the respective components. According to the invention, identical light sources for excitation and referencing can thus be used, which makes it possible to improve the referencing since both have identical optical and electrical properties.
  • the invention preferably proposes that the separation of the optical paths is performed by an optical filter.
  • the reference light is supplied through an optical waveguide to the receiver, which can be ensured by using such an optical waveguide that no stray light of the reference light optionally enters the sample and thus influences this.
  • an essential feature of the present invention is that both the excitation light and the reference light have the same wavelengths, since according to the invention a corresponding separation of the optical paths is proposed.
  • the invention proposes that the reference light be made available by a separate light source which is identical to that used to provide the excitation light.
  • the excitation light source and the reference light source are driven by a common modulator.
  • the light emitted by the light source for emission of excitation light be transmitted between the optical path is switched by the sample and the separate optical path of the reference light.
  • the evaluation can be simplified hereby in that the light source, which provides both the excitation light and the reference light, is identical, so that the design effort, in particular without the use of an example common modulator or a more expensive driver circuit for the light source can be reduced because a usually simple switch is sufficient.
  • the ratio of fluorescent light to excitation light is small and it is necessary for a corresponding evaluation to the detection in the receiver subsequent per se known amplification and signal processing, in which context, according to a further preferred embodiment, it is proposed in a manner known per se, the measurement signals output by the receiver are amplified in an amplifier and subsequently processed in a signal processing unit and optionally displayed.
  • a device of the type mentioned above is essentially characterized in that the optical path of the excitation light entering the sample and the fluorescent light leaving the sample do not depend on the optical path of the reflector having the same wavelength as the excitation light - Ferenc light between the light source and receiver is separated.
  • the optical path of the excitation light entering the sample and the fluorescent light leaving the sample do not depend on the optical path of the reflector having the same wavelength as the excitation light - Ferenc light between the light source and receiver is separated.
  • an optical filter be used for the separation of the optical paths, as corresponds to a preferred embodiment of the device according to the invention.
  • two identical and separate light sources are provided for generating the light for irradiating the sample to excite fluorescence and to generate the reference light.
  • a common frequency modulator be provided for the two light sources.
  • a light source is provided, which is connected downstream of a switching device for supplying the light emitted from the light source to the sample and alternatively in the optical path of the reference light, whereby a reduction of the electronic effort is possible.
  • a light guide in particular a fiber cable, is provided for the supply of the reference light to the receiver.
  • the receiver be followed in a manner known per se by an amplifier and an evaluation or processing unit and, if appropriate, a display unit, as corresponds to a further preferred embodiment of the device according to the invention.
  • the light source or light sources is or are formed by an LED.
  • a preferred use of the method according to the invention and / or the device according to the invention is hiebei in a bioreactor, in the chemical and / or biochemical analysis or in medical diagnostics.
  • the invention will be explained in more detail with reference to embodiments shown in the drawing. In this show:
  • Fig. 1 is a schematic representation of a device for determining the fluorescence of a sample for carrying out a corresponding method according to the prior art
  • FIG. 2 shows, in a representation similar to FIG. 1, a first embodiment of a device according to the invention for determining the fluorescence of a sample for carrying out the method according to the invention
  • 3 shows a schematic, constructive design of a device according to the invention using two separate light sources
  • 4 shows a modified embodiment of a device according to the invention using two separate light sources
  • FIG. 5 shows a further modified embodiment of a device according to the invention using two separate light sources
  • FIG. 6 in a similar to Figure 2 representation of a modified embodiment of the device according to the invention using a common light source for the excitation light and the reference light and a switch;
  • Fig. 7 is a schematic representation similar to Figs. 4 and 5 of an embodiment of a device according to the invention using a common light sources and a switch.
  • FIG. 1 An embodiment according to the prior art, wherein both the excitation light and the reference light are passed through the sample 40, is shown in FIG. 1.
  • a sinusoidal modulation signal with the frequency f ⁇ 13 is generated with a frequency modulator 10, which supplies either an excitation light source 21 or a reference light source 31.
  • Both light sources 21, 31 are integrated into an optical cell in such a way that the excitation light 25 is prevented by optical filters 22, 23 and suitable geometric arrangement to a great extent from reaching the optical receiver 24, wherein the sample 40 as well as possible the filtered excitation light 26 is excited.
  • the optical filter 23 is selected in such a way that the fluorescent light 27 reaches the detector as unhindered as possible.
  • the reference light 32 passes through the optical filter 23 to the detector, care being taken that it does not cause fluorescence in the sample 40.
  • the optical filter 23 thus has the task of separating the fluorescent light 27 from the excitation light 26 as well as possible on the one hand and allowing the reference light 32 having a different wavelength to pass as unhindered as possible on the other hand.
  • the conversion of the incoming light into an electrical measurement signal 14, which is changed in an amplifier 11 in such a way that the amplified electrical measurement signal 15 is suitable for processing in an electronic signal processing 12 and from this together with the electrical reference signal 16 fluorescence data 17 can be generated.
  • Such a referencing method is based, on the one hand, on the separation of the optical excitation signal 26 and the fluorescence signal 27 by the optical filter 23 from the detector 24 and, second, on the best possible adaptation of the reference light source 31 to the excitation light source 21 in terms of electrical properties and temperature behavior, with a suitable geometric arrangement of the optical components must be given.
  • Fig. 1 the portion of the sample in which excitation is effected by the excitation light, so that subsequently the fluorescent light 28 exits, indicated by a hatched area 40 '.
  • the fact that the excitation light of the light source 21 as well as the reference or reference light of the light source 31 have different wavelengths is disadvantageous, so that additional compensations for taking account of ambient or environmental influences, For example, temperature at the different wavelengths of the excitation light 25 and the reference light 32 are required.
  • a red and a green LED are used as the light source 21 and 31, respectively. Since the signal and the reference are different LEDs 21 and 31 in the sense of light emission, physically other electrical properties as well, such as junction capacitance, temperature behavior, etc. result, which reduces the quality of the referencing.
  • the reference numerals for the same components of the embodiment of FIG. 1 have been maintained. It can be seen in particular that the excitation light 25 provided by the light source 21, which subsequently passes through the filter 22 and through the sample 40, as in the embodiment according to FIG. 1, in which an excitation occurs, after which the fluorescent light 27 emerges and in the Filter 23 passes, whereupon it is in turn supplied to the detector or optical receiver 24 as filtered fluorescent light 28.
  • the separation between the excitation light 25 and the resulting after passing through the sample fluorescent light 27 and 28 of the reference light 32 is effected in that the filter 23 to a spatial separation of the light paths 25, 27 and 28 and 32 is configured. It is provided here that no reflections of the reference light 23 to the sample 40 can occur, which in turn would cause it to excite and emit fluorescent light 27.
  • the design of the optical filter 23 must prevent transmission of reference light 32 to the sample, prevent transmission of the excitation light 26 to the optical receiver 24, but allow high transmission of the fluorescent light 27 to the optical receiver 24.
  • the evaluation of the recorded signals in the optical receiver or detector 24 is carried out as in the embodiment according to the prior art in Fig. 1 by the downstream amplifier 11, the electronic signal processing unit 12 and a possible display of data, which in turn is indicated by 17.
  • the advantage of the embodiment according to FIG. 2 by providing the separation of the optical paths lies in the fact that two identical light sources 21 and 31 can be used, so that a referencing or evaluation is simplified or compared to the prior art according to FIG More precise or precise can be performed, since additional influences by the use of two different light sources with different wavelength According to the prior art and the resulting, possibly additionally required compensations can be avoided.
  • the light source 21 formed for example by an LED directs its light on a prism 41, wherein the prism 41 nachgeschal a sample not shown - tet is.
  • light from the light source 31 for supplying the reference light through a fiber cable 42 is supplied to an element 43 formed by a glass plate, which is separated from the prism 41 by the filter denoted by 23 to separate the optical paths between signal light and light Reference light is interposed, wherein the supplied by the fiber cable 42 reference light is fed directly to the detector or optical receiver 24, wherein a preamplifier, which is connected downstream, in turn with 11 is indicated.
  • excitation light provided by the light source which in turn is indicated by 21, which passes the excitation filter 22 after passing through a so-called grin lens 44, passes through a dichroic filter 45 and, after passing through another grin Lens 46 is fed to a schematically indicated with 47 sensi- tive layer or sample to be examined.
  • the fluorescent light emitted by the sample 47 is transmitted via the dichroic filter 45 after passing through a in turn denoted by 23 emission filter supplied to the photodetector or optical receiver 24.
  • a further modified embodiment using two identical light sources 21 and 31 is indicated, wherein the light source 31 is coupled to provide the reference light via an optical waveguide 48 directly to the again designated 24 optical receiver or detector.
  • light provided by the excitation light source 21, after passing through the filter 22, is likewise supplied via an optical waveguide 49 and schematically indicated couplings 50 via another light waveguide 51 to the sample 52 to be tested, for example an O 2 -sensitive layer.
  • a supply of the fluorescent light after passing through the emission filter 23 in turn to the detector or optical receiver 24 takes place via the optical waveguides 51 and 53.
  • a modified embodiment is shown, wherein only a single, again denoted by 21 light source is used, from which with 25 designated light a switching device or a changeover switch 33 is supplied.
  • this switch either a forwarding of the light source 21 provided by the excitation light to the filter 22 and subsequently into the sample 40, from which fluorescent light 27 exits, which is supplied after passing through the filter 23 as fluorescent light 28 in turn designated the optical receiver or photodetector 24 for further processing.
  • switching takes place in the switching device 33 between the light path of the excitation light 25 through the sample 40 and a path of the reference light, again indicated 32, which is fed directly to the optical receiver or photodetector 24.
  • the coupling to a driver circuit or a frequency modulator not shown in detail is designated in FIG. 6 again.
  • the advantage of this embodiment lies in the fact that with only a single light source 21 Aus Siemens can be found, so that only a driver circuit is required. This results in a reduction of the expense by eliminating the separate reference light source, so that a more precise or more accurate evaluation, in particular by elimination of any existing component differences identer Lichtquel- len, as shown in Fig. 2, for example, 21 and 31, achievable is. This increase in accuracy outweighs in most cases by the provision of the switching device or the switch 33-related additional effort.
  • the light beam of the switching device or the changeover switch 33 is available.
  • the light on the optical path 32 of the reference light is in turn supplied directly to the detector or optical receiver 24.
  • the excitation light is supplied to a sensitive layer, again denoted by 47, similar to the embodiment according to FIG.
  • the fluorescent light formed therein is again supplied to the photodetector or optical receiver 24 after passing through the dichroic filter 45 and the emission filter 23.
  • a preferred application of the embodiments illustrated in FIGS. 2 to 7 is, for example, in a bioreactor, in a chemical and / or biochemical analysis or in medical diagnostics.

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Abstract

Bei einem Verfahren sowie einer Vorrichtung zur Bestimmung der Fluoreszenz einer Probe, wobei die Probe (40) mit einem Licht (25) einer Wellenlänge bestrahlt wird, welche zur Anregung von Fluoreszenzlicht (27, 28) in der Probe geeignet ist, und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht (28) in einem Empfänger (24) empfangen wird und in ein Meßsignal ungewandelt wird, wobei dem Empfänger (24) zusätzlich ein Referenzlicht (32) insbesondere zur Kompensierung von Umwelteinflüssen zugeführt und ebenfalls in ein ReferenzMeßsignal umgewandelt wird, ist vorgesehen, daß der optische Weg des in die Probe (40) eintretenden Anregungslichts (25) und die Probe (40) verlassenden Fluoreszenzlichts (27, 28) von dem optischen Weg (32) des eine gleiche Wellenlänge wie das Anregungslicht aufweisende Referenzlichts zwischen Lichtquellen (21, 31) und Empfänger (24) getrennt wird, wodurch sich bei vereinfachtem, konstruktivem Aufwand eine präzisere Auswertung des von einer Probe (40) ausgesandten Fluoreszenzlichts erzielen läßt.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR BESTIMMUNG DER FLUORESZENZ EINER PROBE SOWIE VERWENDUNG DERSELBEN
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz einer Probe, wobei die Probe mit einem Licht einer Wellenlänge bestrahlt wird, welche zur Anregung von Fluoreszenzlicht in der Probe geeignet ist, und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht in einem Empfänger empfangen wird und in ein Meßsignal umge- wandelt wird, wobei dem Empfänger zusätzlich ein Referenzlicht insbesondere zur Kompensierung von Umgebungseinflüssen zugeführt und ebenfalls in ein Referenz-Meßsignal umgewandelt wird. Die Erfindung bezieht sich weiters auf eine Vorrichtung zur Bestimmung der Fluoreszenz einer Probe, um- fassend eine Lichtquelle zur Aussendung eines Lichts einer Wellenlänge, welche zur Anregung von Fluoreszenzlicht in der Probe geeignet ist, und einen Empfänger, welcher das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht empfängt und in ein Meßsignal umwandelt, wobei dem Empfänger zusätzlich ein Referenzlicht insbesondere zur Kompensierung von Umgebungseinflüssen zuführbar und von diesem in ein Referenz-Meßsignal umwandelbar ist.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung soll unter dem Aus- druck "eine Wellenlänge" auch ein um eine zentrale und definierte Wellenlänge liegender, insbesondere enger Wellenlängenbereich verstanden werden, wie dies beispielsweise bei Verwendung einer Leuchtdiode bzw. LED der Fall ist.
Derartige Verfahren und Vorrichtungen sind beispielsweise der DD-A 229 220, der US-A 5 196 709 oder der DE-C 198 49 585 zu entnehmen. Die Bestimmung der Fluoreszenz von spezifischen Molekülen wird zunehmend in sensorischen Anwendungen zur Bestimmung diverser Analyten eingesetzt. Dabei werden die Moleküle durch Bestrahlung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge in einen angeregten Zustand versetzt. Die Rückkehr der Moleküle in den Grundzustand erfolgt durch Abstrahlung von Licht, welches eine höhere Wellenlänge als das Anregungs- licht aufweist (Stoke's Shift) . Zusätzlich ist diese Emission zeitlich versetzt. Informationen über die zu bestim- mende Probe können durch Messung der Intensität oder der Abklingzeit des Fluoreszenzlichts gewonnen werden. Einsatz- mδglichkeiten dieses Phänomens liegen in der Umweltanalytik, in der medizinischen Diagnostik, in der Überwachung von zahlreichen industriellen Prozessen und in einer Ana- lyse im Labor.
Die einfachstes Methode zur Bestimmung der Eigenschaften von Analyten mittels Fluoreszenzmessungen liegt in der De- tektion der Intensität des vom Fluoreszenzmolekül emittier- ten Lichts. Für praktische Anwendungen hat diese Methode allerdings einige schwerwiegende Nachteile. So haben Auswaschungen oder ein Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs, sowie Fluktuationen der Lichtquelle und Nicht-Linearitäten der optischen Detektoren einen direkten Einfluß auf das Meßergebnis. Während Änderungen betreffend den Farbstoff nur durch Kalibration mit definierten Konzentrationen des spezifischen Analyten kompensiert werden können, bedarf es bezüglich der Instrumentierung oftmals aufwendiger Temperaturstabilisierungen oder optischen Komponenten, um diese Effekte so gering wie möglich zu halten.
Eine weitaus kompaktere Methode bietet die Bestimmung der Zeitverzögerung mit einer dominierenden Zeitkonstante τ des abgestrahlten Fluoreszenzlichts, welche auch als "Lebensdauer", "Decay Time", oder "Life Time" bezeichnet wird. Die Bestimmung der Zeitkonstante kann durch Messung der Abklingkonstante nach pulsförmiger Anregung (im Zeitbereich) , oder durch die Messung der Phasenverschiebung bei sinusförmiger Anregung (im Frequenzbereich) erfolgen. Da die Bestimmung der Abklingzeitkonstante bzw. der Phasenverschiebung prinzipiell unabhängig von der emittierten Intensität ist und praktisch nur durch die nachfolgende Instrumentie- rung limitiert wird, können Effekte des Farbstoffs (z.B. Auswaschung, Ausbleichen) vernachlässigt werden. Die Bestimmung der Phasenverschiebung zur Erfassung der Änderungen von selektiven Farbstoffen hat sich in praktischen Umsetzungen aufgrund des geringeren instrumenteilen Auf- wands gegenüber einer Abklingzeitmessung durchgesetzt.
In jedem Fall ist es auch bei der Bestimmung der Phasenverschiebung nicht zuletzt aufgrund des Einsatzes in verschiedensten Umgebungen empfehlenswert, eine Referenzierung vor- zunehmen, um Temperatureinflüsse, welche die aktiven optischen Komponenten sowie die Auswertelektronik betreffen, zu kompensieren. Als einfachste Variante zur Realisierung einer Referenzierung, welche diese Aufgaben erfüllt, hat sich eine Bestimmung einer Phasenverschiebung des Meß- kreises ohne den selektiven Farbstoff erwiesen. Hierbei wird periodisch zwischen einer Signallichtquelle, welche die durch die Probe verursachte Phasenverschiebung bestimmt, und einer Referenzlichtquelle, welche die Phasenverschiebung der Instrumentierung bestimmt, um geschaltet und die wahre Phasenverschiebung durch Subtraktion der Referenzphasenverschiebung von der Signalphasenverschiebung ermittelt. Für Anwendungen in der Prozeßtechnik und in der medizinischen Diagnostik stellen Miniaturisierung, Automatisierung und geringe Kosten solcher Meßsysteme eine Voraussetzung für die Akzeptanz durch den Anwender dar. Aufwen- dige optische Anordnungen, welche insbesondere mit teuren optischen Filtern verbunden sind, stellen hier wesentliche Faktoren bzw. Nachteile dar.
Unabhängig von Referenzierungsmethoden und Stabilisierungs- techniken ist das Verhältnis von Fluoreszenzlicht zu Anregungslicht klein und bedarf somit diverser optischer Methoden (optische Anordnung bzw. optische Filter) zur Separation des Lichts dieser beiden Lichtquellen.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ausgehend von einem Verfahren sowie einer Vorrichtung der eingangs genannten Art einfache optische Anordnungen sowie Möglichkeiten zur Referenzierung zu bieten, und insbesondere unter Bereitstellung von konstruktiven, einfachen und somit ko- stengünstigen Ausbildungen eine genaue Auswertung zu ermöglichen.
Zur Lösung dieser Aufgaben ist ein Verfahren der eingangs genannten Art im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß der optische Weg des in die Probe eintretenden Anregungs- lichts und die Probe verlassenden Fluoreszenzlichts von dem optischen Weg des eine gleiche Wellenlänge wie das Anregungslicht aufweisende Referenzlichts zwischen Lichtquellen und Empfänger getrennt wird. Dadurch, daß erfindungsgemäß der optische Weg des in die Probe eintretenden Anregungslichts und des die Probe verlassenden Fluoreszenzlichts von dem optischen Weg des Bezugs- bzw. Referenzlichts getrennt ist, wird sichergestellt, daß das Referenzlicht keinerlei Beeinflussung der Probe mit sich bringt und daß somit tatsächlich nur das Anregungslicht durch die Probe hindurchtritt. Durch die erfindungsgemäß vorgeschlagene Trennung der optischen Wege des Anregungs- sowie des daraus resul- tierenden Fluoreszenzlichts von dem Referenz- bzw. Bezugslicht kann erfindungsgemäß eine idente Wellenlänge sowohl für das Anregungslicht als auch für das Referenzlicht eingesetzt werden, ergeben sich unmittelbar Vorteile bei der Auswertung, da im Gegensatz zum bekannten Stand der Technik für das Referenzlicht keine unterschiedliche Wellenlänge gegenüber dem Anregungslicht verwendet wird, um eine Beeinflussung der Probe zu vermeiden, so daß auch entsprechend aufwendige Korrekturen, insbesondere im Hinblick auf Umgebungsparameter, wie beispielsweise Temperatur der Probe, unter Berücksichtung der unterschiedlichen Wellenlängen entfallen können. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt somit eine vereinfachte Auswertung insbesondere dahingehend, daß sowohl für das Anregungslicht als auch für das Referenzlicht eine gleiche Wellenlänge verwendet werden kann. Bei den zu kompensierenden Umgebungseinflüssen handelt es sich beispielsweise um Änderungen, welche aufgrund von Temperaturänderungen oder durch Toleranzen der jeweiligen Bauteile entstehen. Erfindungsgemäß können somit baugleiche Lichtquellen für Anregung und Referenzierung ver- wendet werden, was eine Verbesserung der Referenzierung ermöglicht, da beide identische optische und elektrische Eigenschaften aufweisen.
Für eine konstruktiv einfache Trennung der optische Wege wird erfindungsgemäß bevorzugt vorgeschlagen, daß die Trennung der optischen Wege durch ein optisches Filter vorgenommen wird. Für eine besonders zuverlässige Trennung der optische Wege für das Anregungslicht als auch das Referenzlicht wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß das Referenzlicht durch einen Lichtwellenleiter dem Empfänger zugeführt wird, wobei durch Einsatz eines derartigen Lichtwellenleiters sichergestellt werden kann, daß auch keinerlei Streulicht des Referenzlichts gegebenenfalls in die Probe eintritt und somit diese beeinflußt.
Wie oben bereits angeführt, ist ein wesentlichen Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß sowohl das Anregungslicht als auch das Referenzlicht gleiche Wellenlängen aufweisen, da erfindungsgemäß eine entsprechende Trennung der optischen Wege vorgeschlagen wird. Zur Erzielung einer der- artigen gleichen Wellenlänge wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß das Referenzlicht von einer zur Bereitstellung des Anregungslichts identen, getrennten Lichtquelle zur Verfügung gestellt wird.
Zur besonders zuverlässigen Ansteuerung und zur Vereinfachung der nachfolgenden Auswertung insbesondere im Hinblick auf eine Phasenverschiebung wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß die Anre- gungslichtquelle und die Referenzlichtquelle von einem gemeinsamen Modulator angetrieben werden.
Anstelle der Verwendung von zwei im wesentlichen identen Lichtquellen zur Bereitstellung des Anregungslichts als auch des Referenzlichts wird gemäß einer alternativen Ausführungsform erfindungsgemäß bevorzugt vorgeschlagen, daß das von der Lichtquelle zur Aussendung von AnregungsIicht ausgesandte Licht zwischen dem optischen Weg zum Durchtritt durch die Probe und dem getrennten optischen Weg des Referenzlichts umgeschaltet wird. Es kann bei einer derartigen Ausführungsform somit mit einer einzigen Lichtquelle das Auslangen gefunden werden, wobei eine Umschaltung zwischen den optischen Wegen für das Anregungslicht als auch das Re- ferenzlicht vorgenommen wird. Die Auswertung läßt sich hie- bei dadurch vereinfachen, daß die Lichtquelle, welche sowohl das Anregungslicht als auch das Referenzlicht zur Verfügung stellt, ident ist, so daß auch der konstruktive Auf- wand insbesondere unter Verzicht auf einen beispielsweise gemeinsamen Modulator oder eine aufwendigere Treiberschaltung für die Lichtquelle reduziert werden kann, da ein üblicherweise einfacher Umschalter ausreichend ist.
Wie oben bereits angedeutet, ist das Verhältnis von Fluoreszenzlicht zu Anregungslicht klein und es ist für eine entsprechende Auswertung eine an die Detektion im Empfänger anschließende an sich bekannte Verstärkungs- und Signalverarbeitung erforderlich, wobei in diesem Zusammenhang, gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen wird, daß in an sich bekannter Weise die vom Empfänger ausgegebenen Meßsignale in einem Verstärker verstärkt und nachfolgend in einer Signalverarbeitungseinheit verarbeitet und gegebenenfalls dargestellt werden.
Zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben ist darüber hinaus eine Vorrichtung der eingangs genannten Art im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß der optische Weg des in die Probe eintretenden Anregungslichts und die Probe ver- lassenden Fluoreszenzlichts von dem optischen Weg des eine gleiche Wellenlänge wie das AnregungsIicht aufweisende Re- ferenzlichts zwischen Lichtquelle und Empfänger getrennt ist. Wie oben bereits ausgeführt, wird es durch Bereitstel- lung getrennter optischer Wege sowohl für das Anregungs- licht als auch das daraus nach Durchtritt durch die Probe resultierende Fluoreszenzlicht und das Referenz- bzw. Bezugslicht möglich, eine gleiche Wellenlänge sowohl für das Anregungslicht als auch das Fluoreszenzlicht einzusetzen, so daß ein entsprechender Auswerteaufwand insbesondere vereinfacht bzw. reduziert werden kann.
Für eine einfache und zuverlässige Trennung wird vorge- schlagen, daß zur Trennung der optischen Wege ein optisches Filter eingesetzt ist, wie dies einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung entspricht.
Zur Bereitstellung von einer gleichen Wellenlänge sowohl für das ReferenzIicht als auch das AnregungsIicht ist gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, daß zwei idente und getrennte Lichtquellen zur Erzeugung des Lichts zur Bestrahlung der Probe zur Anregung von Fluoreszenz und zur Erzeugung des Referenzlichts vorgesehen sind.
Für eine zuverlässige und einfache Ansteuerung dieser zwei identen Lichtquellen zur Bereitstellung einer jeweils gleichen Wellenlänge sowohl für das AnregungsIicht als auch das Fluoreszenzlicht wird darüber hinaus bevorzugt vorge- schlagen, daß ein gemeinsamer Frequenzmodulator für die zwei Lichtquellen vorgesehen ist .
Wie oben ebenfalls bereits ausgeführt, kann anstelle der Bereitstellung von zwei identen Lichtquellen mit einer Lichtquelle und einer Umschalteinrichtung das Auslangen gefunden werden, wobei sich in diesem Fall die nachfolgende Auswertung weiter vereinfachen bzw. reduzieren läßt, wobei in diesem Zusammenhang gemäß einer weiters bevorzugten Aus- führungsforra vorgeschlagen wird, daß eine Lichtquelle vorgesehen ist, welcher eine Umschalteinrichtung zur Zufuhr des von der Lichtquelle ausgesandten Lichts zur Probe und alternativ in den optischen Weg des Referenzlichts nachge- schaltet ist, wodurch eine Reduzierung des elektronischen Aufwands möglich ist,.
Für eine besonderes zuverlässige räumliche Trennung der optischen Wege von Referenzlicht und Anregungslicht wird ge- maß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß für die Zufuhr des Referenzlichts zu dem Empfänger ein Lichtleiter, insbesondere ein Faserkabel vorgesehen ist.
Zur Erzielung entsprechend starker und aussagekräftiger Signale wird darüber hinaus vorgeschlagen, daß in an sich bekannter Weise dem Empfänger ein Verstärker und eine Auswerte- bzw. Verarbeitungseinheit sowie gegebenenfalls eine Anzeigeeinheit nachgeschaltet ist, wie dies einer weiters bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung entspricht .
Zur Bereitstellung von zuverlässigen Lichtquellen, welche auch entsprechend kostengünstig herstellbar und miteinander abgleichbar sind, wird gemäß einer weiters bevorzugten Ausführungsform vorgeschlagen, daß die Lichtquelle bzw. Lichtquellen von einer LED gebildet ist bzw. sind.
Eine bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgt hiebei in einem Bioreaktor, in der chemischen und/oder biochemischen Analytik oder in der medizinischen Diagnostik. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert. In dieser zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Bestimmung der Fluoreszenz einer Probe zur Durchführung eines entsprechenden Verfahrens gemäß dem Stand der Technik;
Fig. 2 in einer zu Fig. 1 ähnlichen Darstellung eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Be- Stimmung der Fluoreszenz einer Probe zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 3 einen schematischen, konstruktiven Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung unter Verwendung von zwei getrennten Lichtquellen; Fig. 4 eine abgewandelte Ausführungsform einer erfindungs- gemäßen Vorrichtung unter Verwendung von zwei getrennten Lichtquellen;
Fig. 5 eine weitere abgewandelte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung unter Verwendung von zwei ge- trennten Lichtquellen;
Fig. 6 in einer zu Fig. 2 ähnlichen Darstellung eine abgewandelte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung unter Verwendung einer gemeinsamen Lichtquelle für das Anregungslicht und das Referenzlicht sowie eines Umschalters; und
Fig. 7 eine schematische Darstellung ähnlich den Fig. 4 und 5 einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung unter Verwendung einer gemeinsamen Lichtquellen und eines Umschalters .
Eine Ausführungsform gemäß dem Stand der Technik, wobei sowohl das Anregungslicht als auch das Referenzlicht durch die Probe 40 hindurchgeleitet wird, ist in Fig. 1 darge- stellt. Es wird mit einem Frequenzmodulator 10 ein sinuns- förmiges Modulationssignal mit der Frequenz fθ 13 generiert, welches entweder eine Anregungslichtquelle 21 oder eine Referenzlichtquelle 31 versorgt. Beide Lichtquellen 21, 31 sind in eine optische Zelle in der Weise integriert, daß durch optische Filter 22, 23 und geeignete geometrische Anordnung das Anregungslicht 25 in hohem Maße daran gehindert wird, zum optischen Empfänger 24 zu gelangen, wobei die Probe 40 möglichst gut mit dem gefilterten Anregungs- licht 26 angeregt wird. Des weiteren ist der optische Filter 23 in einer Weise ausgewählt, daß das Fluoreszenzlicht 27 möglichst ungehindert zum Detektor gelangt. Im Fall einer Referenzmessung gelangt das Referenzlicht 32 durch den optischen Filter 23 zum Detektor, wobei darauf zu ach- ten ist, daß dieses keine Fluoreszenz in der Probe 40 verursacht. Der optische Filter 23 hat somit die Aufgabe, einerseits das Fluoreszenzlicht 27 so gut wie möglich vom Anregungslicht 26 zu trennen und andererseits das eine unterschiedliche Wellenlänge aufweisende Referenzlicht 32 möglichst ungehindert passieren zu lassen. In jedem Fall erfolgt im optischen Empfänger 24 die Umwandlung des eingelangenden Lichts in ein elektrisches Meßsignal 14, welches in einem Verstärker 11 in der Weise verändert wird, daß das verstärkte elektrische Meßsignal 15 zur Verarbeitung in einer elektronischen Signalverarbeitung 12 geeignet ist und daraus gemeinsam mit dem elektrischen Referenzsignal 16 Fluoreszenzdaten 17 generiert werden können.
Eine derartige Referenzierungsmethode basiert zum einen auf der Trennung von optischem Anregungssignal 26 und Fluoreszenzsignal 27 durch den optischen Filter 23 von dem Detektor 24 und zum zweiten auf einer möglichst guten Anpassung der Referenzlichtquelle 31 an die Anregungslichtquelle 21 hinsichtlich elektrischer Eigenschaften und Temperaturverhalten, wobei eine geeignete geometrische Anordnung der optischen Komponenten gegeben sein muß.
In Fig. 1 ist der Teilbereich der Probe, in welchem durch das Anregungslicht eine Anregung erfolgt, so daß in weiterer Folge das Fluoreszenzlicht 28 austritt, durch einen schraffierten Bereich 40' angedeutet.
Bei dieser bekannten Ausführungsform gemäß dem Stand der Technik ist insbesondere die Tatsache nachteilig, daß Anregungslicht der Lichtquelle 21 als auch das Referenz- bzw. Bezugslicht der Lichtquelle 31 unterschiedliche Wellenlängen aufweisen, so daß zusätzliche Kompensationen zur Be- rücksichtigungen von Umgebungs- bzw. Umwelteinflüssen, beispielsweise Temperatur bei den unterschiedlichen Wellenlängen des Anregungslichts 25 als auch des Referenzlichts 32 erforderlich sind. Hiebei kann beispielsweise eine rote und eine grüne LED als Lichtquelle 21 bzw. 31 eingesetzt wer- den. Da Signal und Referenz unterschiedliche LEDs 21 bzw. 31 im Sinne der Lichtemission sind, ergeben sich physikalisch auch andere elektrische Eigenschaften, wie beispielsweise Junction Kapazität, Temperaturverhalten, etc., wodurch die Qualität der Referenzierung vermindert wird.
Bei der erfindungsgemäßen Ausführungsform gemäß Fig. 2 sind die Bezugszeichen für gleiche Bauteile der Ausführungsform gemäß Fig. 1 beigehalten worden. Es ist insbesondere ersichtlich, daß das durch die Lichtquelle 21 bereitgestellte Anregungslicht 25, welches in weiterer Folge, wie bei der Ausführungsform gemäß Fig. 1 durch den Filter 22 und durch die Probe 40 hindurchtritt, in welcher eine Anregung erfolgt, wonach das Fluoreszenzlicht 27 austritt und in den Filter 23 gelangt, worauf es wiederum als gefiltertes Fluoreszenzlicht 28 dem Detektor bzw. optischen Empfänger 24 zugeführt wird.
Die Trennung zwischen dem Anregungslicht 25 bzw. dem nach Durchtritt durch die Probe resultierenden Fluoreszenzlicht 27 bzw. 28 von dem Referenzlicht 32 erfolgt dadurch, daß der Filter 23 zu einer räumlichen Trennung der Lichtwege 25, 27 und 28 bzw. 32 ausgestaltet ist. Es ist hiebei vor- gesehen, daß es zu keinen Reflexionen des Referenzlichts 23 zur Probe 40 kommen kann, wodurch diese wiederum angeregt und Fluoreszenzlicht 27 emittieren würde. Die Gestaltung des optischen Filters 23 muß eine Transmission von Referenzlicht 32 zur Probe verhindern, eine Transmission des Anregungslichts 26 zum optischen Empfänger 24 verhindern, jedoch eine Transmission des Fluoreszenzlichts 27 zum optischen Empfänger 24 in hohem Maße erlauben.
Die Auswertung der im optischen Empfänger bzw. Detektor 24 aufgenommenen Signale erfolgt wie bei der Ausführung gemäß dem Stand der Technik in Fig. 1 durch den nachgeschalteten Verstärker 11, die elektronische Signalverarbeitungseinheit 12 sowie eine mögliche Anzeige von Daten, welche wiederum mit 17 angedeutet ist.
Der Vorteil der Ausführungsform gemäß Fig. 2 durch Bereitstellung der Trennung der optischen Wege liegt vor allem darin, daß zwei idente Lichtquellen 21 und 31 verwendet werden können, so daß eine Referenzierung bzw. Auswertung vereinfacht ist oder gegenüber dem Stand der Technik gemäß Fig. 1 genauer bzw. präziser durchgeführt werden kann, da zusätzliche Einflüsse durch die Verwendung zwei unterschiedlichen Lichtquellen mit unterschiedlicher Wellenlänge gemäß dem Stand der Technik und die daraus resultierenden, gegebenenfalls zusätzlich erforderlichen Kompensationen vermieden werden können.
Bei der in Fig. 3 dargestellten Ausführungsform, welche auf dem schematischen Diagramm von Fig. 2 basiert, ist ersichtlich, daß die beispielsweise von einer LED gebildete Lichtquelle 21 ihr Licht auf ein Prisma 41 lenkt, wobei dem Prisma 41 eine nicht näher dargestellte Probe nachgeschal- tet ist.
Demgegenüber wird Licht von der Lichtquelle 31 zur Bereitstellung des Referenz- bzw. Bezugslichts über ein Faserkabel 42 einem von einer Glasplatte gebildeten Element 43 zu- geführt, welches von dem Prisma 41 durch das wiederum mit 23 bezeichnete Filter zur Trennung der optischen Wege zwischen Signallicht und Referenzlicht zwischengeschaltet ist, wobei das durch das Faserkabel 42 zugeführte Referenzlicht direkt dem Detektor bzw. optischen Empfänger 24 zuge- führt wird, wobei ein Vorverstärker, welcher nachgeschaltet ist, wiederum mit 11 angedeutet ist.
Bei einer abgewandelten Ausführungsform gemäß Fig. 4 ist ersichtlich, daß von der wiederum mit 21 bezeichneten Lichtquelle bereitgestelltes Anregungslicht, welches nach Durchtritt durch eine sogenannte Grin-Linse 44 das Anregungsfilter 22 passiert, durch einen dichroitischen Filter 45 hindurchtritt und nach Durchtritt durch eine weitere Grin-Linse 46 einer schematisch mit 47 angedeuteten sensi- tiven Schicht bzw. zu untersuchenden Probe zugeführt wird. Das von der Probe 47 ausgesandte Fluoreszenzlicht wird über den dichroitischen Filter 45 nach Durchtritt durch ein wie- derum mit 23 bezeichnetes Emissionsfilter dem Photodetektor bzw. optischen Empfänger 24 zugeführt.
Im Gegensatz dazu erfolgt die Zufuhr von von der Licht- quelle 31 bereitgestelltem Referenzlicht unmittelbar zu dem Photodetektor 24, wobei zur Trennung der optischen Wege wiederum der Filter 23 verwendet wird.
In Fig. 5 ist eine weitere abgewandelte Ausführungsform unter Verwendung von zwei identen Lichtquellen 21 und 31 angedeutet, wobei die Lichtquelle 31 zur Bereitstellung des Referenzlichts über einen Lichtwellenleiter 48 unmittelbar mit dem wiederum mit 24 bezeichneten optischen Empfänger bzw. Detektor gekoppelt ist.
Demgegenüber wird von der AnregungsIichtquelle 21 bereitgestelltes Licht nach Passieren des Filters 22 ebenfalls über einen Lichtwellenleiter 49 und schematisch angedeutete Kopplungen 50 in weiterer Folge über einen weiteren Licht- Wellenleiter 51 der zu überprüfenden Probe 52, beispielsweise einer O2-sensitiven Schicht zugeführt. Über die Lichtwellenleiter 51 sowie 53 erfolgt eine Zufuhr des Fluoreszenzlichts nach einem Passieren des Emissionsfilters 23 wiederum zu dem Detektor bzw. optischen Empfänger 24.
In Fig. 6 ist eine abgewandelte Ausführungsform dargestellt, wobei lediglich eine einzige, wiederum mit 21 bezeichnete Lichtquelle verwendet wird, von welcher mit 25 bezeichnetes Licht eine Umschalteinrichtung bzw. einem Um- Schalter 33 zugeführt wird. In diesem Umschalter erfolgt entweder eine Weiterleitung des von der Lichtquelle 21 bereitgestellten Anregungslichts zu dem Filter 22 und in weiterer Folge in die Probe 40, aus welcher Fluoreszenzlicht 27 austritt, welches nach einem Passieren des Filters 23 als Fluoreszenzlicht 28 dem wiederum mit 24 bezeichneten optischen Empfänger bzw. Fotodetektor zur weiteren Verarbeitung zugeführt wird.
Wie in Fig. 6 durch den Doppelpfeil 55 angedeutet, erfolgt in der Umschalteinrichtung 33 eine Umschaltung zwischen dem Lichtweg des Anregungslichts 25 durch die Probe 40 und einem wiederum mit 32 bezeichneten Pfad des Referenzlichts, welches direkt dem optischen Empfänger bzw. Fotodetektor 24 zugeführt wird.
Die Kopplung mit einer nicht näher dargestellten Treiberschaltung bzw. einem Frequenzmodulator ist in Fig. 6 wie- derum 13 bezeichnet.
Der Vorteil dieser Ausführungsform liegt vor allem darin, daß mit lediglich einer einzigen Lichtquelle 21 das Auslangen gefunden werden kann, so daß auch nur eine Treiber- Schaltung erforderlich ist. Es ergibt sich somit eine Verringerung des Aufwands durch Entfallen der getrennten Referenzlichtquelle, so daß eine präzisere bzw. genauere Auswertung insbesondere durch eine Eliminierung von gegebenenfalls bestehenden Bauteilunterschieden identer Lichtquel- len, wie sie in Fig. 2 beispielsweise mit 21 und 31 bezeichnet sind, erzielbar ist. Diese Erhöhung der Genauigkeit überwiegt in den meisten Fällen den durch Vorsehen der Umschalteinrichtung bzw. des Umschalters 33 bedingten zusätzlichen Aufwand.
In der Darstellung gemäß Fig. 7 ist ersichtlich, daß nach Passieren eines Anregungsfilters 22 der Lichtstrahl der Umschalteinrichtung bzw. dem Umschalter 33 zur Verfügung ge- stellt wird, wobei das Licht auf dem optischen Pfad 32 des Referenzlichts wiederum unmittelbar dem Detektor bzw. optischen Empfänger 24 zugeführt wird.
Demgegenüber erfolgt nach einem Durchtritt durch einen wiederum mit 45 bezeichneten dichroitischen Filter eine Zufuhr des Anregungslichts zu einer ähnlich wie bei der Ausführungsform gemäß Fig. 4 wiederum mit 47 bezeichneten sensitiven Schicht. Das darin gebildete Fluoreszenzlicht wird neuerlich nach Passieren des dichroitischen Filters 45 und des Emissionsfilters 23 ebenfalls dem Photodetektor bzw. optischen Empfänger 24 zugeführt .
Es ist hiebei ersichtlich, daß insbesondere durch Bereit- Stellung lediglich einer einzigen Lichtquelle 21 der konstruktive Aufwand bei Erzielung einer höheren Auswertegenauigkeit verringert werden kann.
Eine bevorzugte Anwendung der in Fig. 2 bis 7 dargestellten Ausführungsformen erfolgt beispielsweise in einem Bioreaktor, in einer chemischen und/oder biochemischen Analytik oder in der medizinischen Diagnostik.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Verfahren zur Bestimmung der Fluoreszenz einer Probe, wobei die Probe (40, 47) mit einem Licht (25) einer Wellen- länge bestrahlt wird, welche zur Anregung von Fluoreszenzlicht (22, 28) in der Probe (40) geeignet ist, und das von der Probe (40, 47) emittierte Fluoreszenzlicht (28) in einem Empfänger (24) empfangen wird und in ein Meßsignal umgewandelt wird, wobei dem Empfänger (24) zusätzlich ein Referenzlicht (32) insbesondere zur Kompensierung von Umgebungseinflüssen zugeführt und ebenfalls in ein Referenz- Meßsignal umgewandelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Weg des in die Probe (40, 47) eintretenden Anregungslichts (25) und die Probe (40, 47) verlassenden Fluo- reszenzlichts (27, 28) von dem optischen Weg des eine gleiche Wellenlänge wie das Anregungslicht aufweisende Referenzlichts zwischen Lichtquellen (32, 21) und Empfänger (24) getrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung der optischen Wege (25, 27, 28, 32) durch ein optisches Filter (32) vorgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich- net, daß das Referenzlicht (32) durch einen Lichtwellenleiter dem Empfänger (24) zugeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, daß das Referenzlicht (32) von einer zur Bereit- Stellung des Anregungslichts (25) identen, getrennten Lichtquelle zur Verfügung gestellt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregungslichtquelle (21) und die Referenzlichtquelle (31) von einem gemeinsamen Modulator angetrieben werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Lichtquelle (21) zur Aussendung von Anregungslicht (25) ausgesandte Licht zwischen dem optischen Weg zum Durchtritt durch die Probe (40) und dem getrennten optischen Weg des Referenzlichts (32) umgeschaltet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise die vom Empfänger (24) ausgegebenen Meßsignale in einem Verstärker (11) verstärkt und nachfolgend in einer Signalverarbeitungseinheit (12) verarbeitet und gegebenenfalls dargestellt werden.
8. Vorrichtung zur Bestimmung der Fluoreszenz einer Probe, umfassend eine Lichtquelle (21) zur Aussendung eines Lichts einer Wellenlänge, welche zur Anregung von Fluoreszenzlicht (27, 28) in der Probe geeignet ist, und einen Empfänger (24) , welcher das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht (28) empfängt und in ein Meßsignal umwandelt, wobei dem Empfänger (24) zusätzlich ein Referenzlicht (32) insbesondere zur Kompensierung von Umgebungseinflüssen zuführbar und von diesem in ein Referenz-Meßsignal umwandelbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß der optische Weg des in die Probe (40, 47) eintretenden Anregungslichts (25) und die Probe verlassenden Fluoreszenzlichts (27, 28) von dem optischen Weg (32) des eine gleiche Wellenlänge wie das Anregungslicht aufweisende Referenzlichts zwischen Lichtquelle (21, 31) und Empfänger (24) getrennt ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Trennung der optischen Wege (25, 27, 28, 32) ein optisches Filter (23) eingesetzt ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß zwei idente und getrennte Lichtquellen (21, 31) zur Erzeugung des Lichts zur Bestrahlung der Probe (40) zur Anregung von Fluoreszenz und zur Erzeugung des Refe- renzlichts vorgesehen sind.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein gemeinsamer Frequenzmodulator (10) für die zwei Lichtquellen (21, 31) vorgesehen ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lichtquelle (21) vorgesehen ist, welcher eine Umschalteinrichtung (33) zur Zufuhr des von der Lichtquelle (21) ausgesandten Lichts zur Probe (40) und alterna- tiv in den optischen Weg des Referenzlichts (32) nachgeschaltet ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß für die Zufuhr des Referenzlichts zu dem Empfänger ein Lichtleiter (42, 48) , insbesondere ein Faserkabel vorgesehen ist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise dem Empfän- ger (24) ein Verstärker (11) und eine Auswerte- bzw. Verarbeitungseinheit (12) sowie gegebenenfalls eine Anzeigeeinheit (17) nachgeschaltet ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle bzw. Lichtquellen (21, 31) von einer LED gebildet ist bzw. sind.
16. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 15 in einem Bioreaktor, in der chemischen und/oder biochemischen Analytik oder in der medizinischen Diagnostik.
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