CN102914525B - 基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像装置及方法,包括荧光激发光路,参考光路以及荧光成像光路,余弦调制的高频激发光,激发荧光样品产生同频率的荧光并成像在像增强器感光面上;同时调制频率为与激发光频率相近的参考光也照射在像增强器感光面上;荧光图像和参考光在像增强器的感光面上叠加形成外差图像;最后通过锁相放大和极坐标相图分析,合成荧光样品的荧光寿命图像,本发明荧光寿命显微成像装置及方法具有荧光时间测量分辨率高,成像效率高和抗干扰能力强等优点,同时对核心部件-像增强器的技术要求放宽。
Description
技术领域
本发明涉及荧光寿命显微成像装置,特别是借助光学加法外差调制原理,对生物和化学样品进行荧光寿命显微成像的装置及方法。
背景技术
由于荧光蛋白质分子(FP)的出现,利用荧光标记和荧光测量技术研究活体细胞和生物组织的生物物理化学问题,已成为生命科学研究的热点之一。由于荧光寿命显微成像技术具有信号选择性好、灵敏度高、抗背景噪声干扰能力强等优点,因此在生物医学领域中有广泛的应用前景。
荧光寿命显微成像技术主要有两种方法,第一种是时域脉冲法,代表技术是德国Becker&HicklGmbH公司的TCSPC技术,优点是荧光时间测量的分辨率高,达到~10ps,但是成像效率极低。另一种是频率域正弦调制法,代表技术是荷兰LambertInstruments公司荧光寿命显微成像系统。优点是成像效率高,比时域脉冲法快400倍,但是荧光时间测量的分辨率低,达~100ps。因此如何使荧光寿命显微成像装置的同时具有时间测量分辨率高和成像效率高的优点,一直是迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明提出了一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像装置及方法,继承了频率域荧光寿命显微镜的成像效率高和抗干扰能力强等优点,同时解决了频率域荧光寿命显微成像技术的时间测量分辨率低的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像装置,包括三个光路:首先是荧光激发光路,包含计算机、射频信号发生器1、射频功率放大电路1、电流源1、射频直流偏置器1、高亮度光源LED1、光学滤波器组、物镜和荧光样品;其次是参考光光路,包含计算机、射频信号发生器2、射频功率放大电路2、电流源2、射频直流偏置器2、高亮度光源LED2、分光镜、现场可编程门阵列(FPGA)控制的像增强器和CCD相机;最后是荧光成像光路,包括荧光样品、物镜、光学滤波器组、分光镜、现场可编程门阵列(FPGA)控制的像增强器,CCD相机以及计算机。
一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像方法,其具体步骤为:
1)、计算机控制信号发生器1输出一个频率为f1的余弦调制信号,经射频功率放大1以及直流偏置1后驱动LED1产生激发光E1(t):
上式中,E10,m1以及分别为激发光的直流分量,调制度和初始相位。
2)、激发光经滤波片组和物镜照射荧光样品,其荧光在像增强器感光面上的分布为:
上式中,F0(x,y)、m(x,y,f1)以及ΔΦ(x,y,f1)分别为在像素(x,y)处样品荧光直流分量、在调制频率f1下的荧光调制度以及荧光与激发光E1(t)之间的相角差。
3)、在进行1)操作的同时,计算机控制信号发生器2输出一个频率为f2=f1+2·Δf的余弦调制信号,经射频功率放大2以及直流偏置2后驱动LED2产生参考光E2(t),经过分光镜照射在像增强器上。参考光表达式如下:
上式中,E20、m2以及分别为参考光的直流分量,调制度和初始相位。
4)调节信号发生器2的信号增益和直流偏置大小,使LED2光强的幅值与样品荧光的光强幅值接近。在像增强器的感光面上,荧光和参考光叠加,形成外差图像:
此时像增强器上的光强I(x,y,t)是频率为(f1+f2)/2的余弦波,其幅值被Δf=(f2-f1)/2的低频余弦波所调制,Δf满足0<Δf<<f2,且Δf≠0。由于CCD相机的响应时间远远低于频率(f1+f2)/2,因此,在CCD相机成像的时间间隔内,
其中,代表时间积分,C为常数。
5)、计算机控制FPGA门控选通电路输出一个低电平有效的脉冲信号,其频率与光外差调制的差频Δf=(f2-f1)/2相同,脉冲的起始相移为α弧度。该脉冲信号作为像增强器的门控选通信号。光强I(x,y,t)通过光学透镜或光锥,像增强器荧光屏发光聚焦在CCD相机的像平面上,且仅仅呈现选通时刻的光外差调制的差频合成图像。CCD相机通过调整曝光时间,收集到足够的光子,采集到清晰的宽场图像,送入计算机处理。如果计算机控制FPGA的选通脉冲的起始相移α分别为0,2π,......,2π等共N步相移序列,这样CCD相机采集到N幅对应于一个差频周期1/Δf均分N份的选通图像。
6)、像增强器上的光强I(x,y,t)的离散傅里叶变换为:
在调制频率f1下,荧光样品的调制度m(x,y,f1)以及相位延迟ΔΦ(x,y,f1)可通过下式求得:
经过与标准样品对比的Factor校正环节,就可以得出荧光样品在该外差调制频率下的调制度m(x,y,f1)以及相位延迟ΔΦ(x,y,f1)。
7)、创建一个极坐标空间,根据样品在外差频率f1下的调制度m(x,y,f1)和相位延迟ΔΦ(x,y,f1),可确定样品的时间分辨荧光过程在极坐标相空间的位置(ρ,θ):
通过相空间位置(ρ,θ),根据下式计算样品荧光寿命图像τ(x,y)为:
与现有的时域和频域方法相比,本发明主要具有以下几点优势:
1、将(4)式与(2)式比较可知,光学加法外差调制后的荧光调制度m(x,y,f1)比直接检测的荧光调制度增加了一倍。因此,光学加法外差法的荧光寿命成像受随机噪声影响小,时间测量精度高。本装置的荧光时间测量分辨率达到~10ps,接近目前最好的TCSPC技术指标。
2、继承了频率域显微成像方法的优点:成像效率高,是TCSRC技术高100倍以上。
3、抗干扰能力强。
4、对于重要部件-像增强器的技术要求放宽,可靠性高。
附图说明
图1基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像装置结构图
图2像增强器上的光学加法外差调制信号的波形图
具体实施方式
以外差调制频率f1=60MHz和差频Δf=20KHz为例,下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像装置,如图1所示,包括三个光路:首先是荧光激发光路,包含计算机、射频信号发生器1、射频功率放大电路1、电流源1、射频直流偏置器1、高亮度光源LED1、光学滤波器组、物镜和荧光样品。其次是参考光光路,包含计算机、射频信号发生器2、射频功率放大电路2、电流源2、射频直流偏置器2、高亮度光源LED2、分光镜、现场可编程门阵列(FPGA)控制的像增强器以及CCD相机。最后是荧光成像光路,包括荧光样品、物镜、光学滤波器组、分光镜、现场可编程门阵列(FPGA)控制的像增强器,CCD相机以及计算机。
一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像方法,其具体步骤为:
1)、计算机控制信号发生器1输出一个频率为f1=60MHz的余弦调制信号,经射频功率放大1以及直流偏置1后驱动LED1产生激发光E1(t):
上式中,E10,m1以及分别为激发光的直流分量,调制度和初始相位。
2)、激发光经滤波片组和物镜照射样本产生荧光,样品的荧光为:
上式中,F0(x,y)、m(x,y,f1)以及ΔΦ(x,y,f1)分别为在像素(x,y)处样品荧光的直流分量、在调制频率f1下的荧光调制度以及荧光与激发光E1(t)之间的相角差。
3)、计算机控制信号发生器2输出一个频率为f2=f1+20KHz的余弦调制信号,经射频功率放大2以及直流偏置2后驱动LED2产生参考光,经过分光镜照射在像增强器上。参考光的表达式如下:
上式中,E20、m2以及分别为参考光的直流分量,调制度和初始相位。
4)、通过调节信号发生器2的信号增益和直流偏置大小,使LED2光强的幅值与样品荧光的光强幅值接近。如图2所示,此时,像增强器上的光强为:
此时像增强器上的光强I(x,y,t)是频率为(f1+f2)/2的余弦波,其幅值被Δf=(f2-f1)/2=10KHz的低频余弦波所调制。由于CCD相机的响应时间远远低于频率(f1+f2)/2,因此,在CCD相机成像的时间间隔内,
其中,代表时间积分,C为常数。
5)、计算机控制FPGA门控选通电路输出一个低电平有效的脉冲信号,其频率与光外差调制的差频Δf=(f2-f1)/2=10KHz相同,脉冲的低电平宽度为250ns;脉冲的起始相移为0弧度。该脉冲信号作为像增强器的门控选通信号。光强I(x,y,t)通过光学透镜或光锥,像增强器荧光屏发光聚焦在CCD相机的像平面上,且仅仅呈现选通时刻的光外差调制的差频合成图像。CCD相机通过调整曝光时间,收集到足够的光子,采集到清晰的宽场图像,送入计算机处理。如果计算机控制FPGA的选通脉冲的起始相移分别为0,π/4,......,2π等共8步相移序列,这样CCD相机采集到8幅对应于一个差频周期1/Δf均分8份的选通图像。
6)、像增强器上的外差光强I(x,y,t)离散傅里叶变换如下:
于是在调制频率f1下,荧光样品的调制度m(x,y,f1)以及相位延迟ΔΦ(x,y,f1)为:
7)、创建一个极坐标空间,根据样品在外差频率f1下的调制度m(x,y,f1)和相位延迟ΔΦ(x,y,f1),
可确定样品的时间分辨荧光过程在极坐标相空间的位置(ρ,θ):
通过相空间位置(ρ,θ),根据下式计算样品荧光寿命图像τ(x,y)为:
上述实施过程中,高亮度LED2可以产生任意波形的频率为f2=f1+20KHz的周期参考光,在本发明技术方案的基础上,LED2产生除余弦调制外的周期参考光不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (3)
1.一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像装置,光学主体包括荧光激发光路,参考光路以及荧光成像光路,所述荧光激发光路包括计算机、第一射频信号发生器、第一射频功率放大电路、第一电流源、第一射频直流偏置器、第一高亮度光源LED、光学滤波器组、物镜和荧光样品;所述参考光路包括计算机、第二射频信号发生器、第二射频功率放大电路、第二电流源、第二射频直流偏置器、第二高亮度光源LED、分光镜、现场可编程门阵列(FPGA)控制的像增强器和CCD相机;所述荧光成像光路包括荧光样品、物镜、光学滤波器组、分光镜、现场可编程门阵列(FPGA)控制的像增强器、CCD相机以及计算机。
2.一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像方法,其特征在于包括以下步骤:
1)计算机控制第一射频信号发生器输出一个频率为f1的余弦调制信号,经第一射频功率放大电路以及第一射频直流偏置器后驱动第一高亮度光源LED产生激发光E1(t):
式中,E10、m1以及分别为激发光的直流分量,调制度和初始相位;
2)激发光经滤波片组和物镜照射荧光样品产生荧光图像:
式中,F0(x,y)、m(x,y,f1)以及Δφ(x,y,f1)分别为在像素(x,y)处样品荧光直流分量、在调制频率f1下的荧光调制度以及荧光与激发光E1(t)之间的相角差;
3)在步骤1)进行的同时,计算机控制第二射频信号发生器输出一个频率为f2=f1+2·Δf的余弦调制信号,其中Δf为第一高亮度光源LED与第二高亮度光源LED差频的一半,经第二射频功率放大电路以及第二射频直流偏置器后驱动第二高亮度光源LED产生参考光E2(t):
式中,E20、m2以及分别为参考光的直流分量,调制度和初始相位;
4)荧光图像F(x,y,t)与参考光E2(t)在像增强器感光面上叠加,形成外差图像I(x,y,t):
3.根据权利要求2所述的一种基于光学加法外差调制的新型荧光寿命显微成像方法,其特征在于,调制参考光的信号可以为任意波形的周期信号;CCD采集到的图像是光外差调制合成图像I(x,y,t)的低频分量Δf=(f2-f1)/2部分,Δf满足0<Δf<<f2,且Δf≠0。
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