WO2007066698A1 - 抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体 - Google Patents

抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2007066698A1
WO2007066698A1 PCT/JP2006/324385 JP2006324385W WO2007066698A1 WO 2007066698 A1 WO2007066698 A1 WO 2007066698A1 JP 2006324385 W JP2006324385 W JP 2006324385W WO 2007066698 A1 WO2007066698 A1 WO 2007066698A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
seq
replaced
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/324385
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Atsushi Ochiai
Emi Hosaka
Kazuyasu Nakamura
Akiko Furuya
Yuji Ohki
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Japan As Represented By President Of National Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Japan As Represented By President Of National Cancer Center filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority to EP06834140A priority Critical patent/EP1959009A4/en
Priority to JP2007549159A priority patent/JP5095416B2/ja
Priority to CA002632419A priority patent/CA2632419A1/en
Priority to AU2006323706A priority patent/AU2006323706A1/en
Publication of WO2007066698A1 publication Critical patent/WO2007066698A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • 0003 P P gene is coupled to (which is referred to as an anti-P P body below) by the C of P P gene.
  • human chimera since it is produced using a human chimera or a gene assembly technique, it can be produced as a morphological child. For example, if a class is used as the human body (denoted as below) (denoted as C area below) (the C area is denoted as C), antibody cells (below denoted as CC) It is possible to produce human chimeras and
  • the C 2 in the body is at least the modification that replaces the s at position 9 of the Ano sequence shown in Sequence 45 with another, and the replacement of Se at the position Se with another.
  • the e of the 3rd to 35th sequence is represented by the e of the 3rd, the Se of the 3rd, the Po of the 4th to Pe, the s of the 44th to s, and the 45th.
  • the body or antibody according to (3) The body or antibody according to (3).
  • the piece is a piece selected from ab ab, (ab), one piece (sc), (abod), dissi (s), and C (((23).
  • the body structure is s 62 at the 4th position in the Ano sequence shown in array 2.
  • Figure 22 shows the SSPG (using 5 to 2 ginger) purified PPC. Is the case and is the result of the case. , Both 9 and 9 are molecular units, 2 are PP chimera 348, and 3 to 8 are anti-P PC e. Each.
  • the chain portion 25 a is shown.
  • 144 shows the reactivity of the prepared PP bodies to PP human PC g in cytometh.
  • Cells the horizontal axis is degrees.
  • C the responsiveness of the PP human body with anomalous residue is shown.
  • the reactivity to PP was shown using a body that recognizes the area of PP in cytometh.
  • the number in the graph is 382 responsiveness.
  • the reactivity of 382 was defined as the reactivity of 382 to PP. Reactivity with PP or PP at time () is shown.
  • the enzyme has a basic sequence represented by the sequence as follows under the stringent conditions: ⁇ Idition, pray-dose, Southern-dye, Eq. It means the obtained ability, specifically, using a PC or a glass with a row or PC, if it has a row or a row of PC or slide glass fixed, After performing the exercise on sodium, C, use ⁇ 2 degree SC (consisting of 5 degree sodium, 5 degree sodium, 5 degree sodium of f degree SC), and iterate under C cases. You can improve what you can do by washing the slides.
  • the anoic acid on the ano sequence represented by 002 2 has a substituted or added ano sequence is oec a Co
  • G (Cos o O e a) is 5 in the base sequence
  • a in the sequence is (Cos o e e d a) is 2 in the base sequence
  • (Pe a o ceo de s a c) in the sequence is
  • the regions corresponding to the 35th to 75th and the 3rd to 54th positions in the array of arrays shown by Sequence 2 are shown by Sequence 2 when using e ⁇ 2.
  • the region corresponding to the 36th to 76th and 29th to 47th of the Ano row is the cell region.
  • the values used for prediction are the values used for these programs.
  • an epidemiological method for cells expressed by the PP gene is used, and a fixed source such as a fluorescent color method is expressed.
  • a method for confirming the compatibility of the somatic body with the cell-specific source is preferably used. Physically, the color method described in Reference (24) can be mentioned.
  • cells obtained by the gene assembly technique include cells expressing po, which are obtained by introducing a vector containing a po-containing c into an animal cell or the like. Specifically, there is a cell in which the PP gene plus cP P described in the reference is introduced to express a po.
  • CC 2 and C 3 of the body are 3 and 5, respectively, and CC and 2 of the antibody are C 2 and C 3, respectively.
  • the Akira gene construct includes a human chimeric body, a human body, a human body, an antibody fragment, and the like, which are produced by gene assembly. In the gene assembly, it has the characteristics of knuckle body, low antigen, and prolonged blood phase reduction. Are preferred as therapeutic agents.
  • human chimera of the present invention include a human chimera of which the antibody has an amino acid sequence of sequences 4 to 9.
  • the human and non-human body C and A in the human body were transplanted into the human body at and at different positions.
  • the human body can be produced by constructing a human body expression vector by inserting the above into an animal vector having C and a gene encoding C in the human body, and expressing the vector by inserting into the animal.
  • any one can be used as long as it is an ortho sequence of a human body and an ortho sequence of a human body.
  • An array of body and body groups is used.
  • the C of 004 body any of those belonging to n may be used, but those of G class are preferable, and G G2 G3 G4 belonging to G class
  • the amino acid of the antibody is represented by the deviation of sequences 3 to 35, or the deviation of the antibodies of sequence 3 to 35 is represented by Se 4 of G 27 of G 27 Po Po of the 44th, s of the 45th, e of the 49th, a of the 72nd, and a of the 97th, in which at least one anno is replaced by another, and Is an array shown in array 36, or an array shown in array 36 G of 3rd, 5th of 35th “42nd a 46th e 9th s 7th P e 7th And at least 77 selected from the e of the 77th column is a group of columns in which at least one group is replaced by another group.
  • G of 27 is P e
  • P of 4 is P e
  • s of 44 is s
  • G of 45 is e
  • e of 49 is e
  • a of 72 is, and An in which the a of the 97th is replaced by
  • G of 27 is P e
  • Se of 3 is
  • P o of 4 is P e
  • s of 44 is s
  • G of 45 is, a of 72 is, and 97 Ocular an with a replaced by
  • G of 27 is P e, Se of 3 is, P o of 4 is P e, G of 45 is e, e of 49 is e, a of 72 is, and 97 An with the a of the eye replaced by
  • the introduced amino acids of 6 are, specifically, the ones represented by the deviations of sequences 3 to 35
  • G of 27 was replaced by P e
  • P of 4 was replaced by P e
  • G of 45 was replaced by e
  • e of 49 was replaced by e
  • a of 72 was replaced by and a of 97 was replaced by.
  • G of the 27th is replaced by P e
  • s of the 44th is replaced by s
  • G of the 45th is replaced by e
  • e of 49th is replaced by e
  • a of 72nd is replaced by a
  • a of 97th is replaced by.
  • G of 27 was replaced by P e
  • Se of 3 was replaced by P e of 4 was replaced by P e
  • s of 44 was replaced by s
  • a of 72 was replaced by, and a of 97 was replaced by.
  • the 27th G is replaced by P e
  • the 3rd Se is replaced by
  • the 44th s is replaced by s
  • the 49th e is replaced by e
  • the 72nd a is replaced by
  • the 97th Aa is replaced by.
  • G of the 27th is replaced by P e
  • s of the 44th is replaced by s
  • G of the 45th is replaced by a
  • G of the 27th is replaced by P e
  • G of the 45th is replaced by e
  • e of the 49th is replaced by e
  • a of the 72nd is replaced by a
  • a of the 97th is replaced by
  • G of the 27th to P e Se of the 3rd to G, G of the 45th to, a of the 72nd to and a of the 97th to, and
  • the introduced amino acid of 005 03 is specifically the amino acid shown by the deviation of sequences 3 to 35.
  • the introduced amino acid of 005 48 is specifically the amino acid shown in Sequence 36.
  • the third G is a, the fifth is e, the 35th is Pe, the a is 42, the s is 69, the s is Se, the seventh Pe is, and the seventh is To Se, and the substitution of e of the 77th e with e,
  • the introduced amino acid of 006 56 is specifically the amino acid shown in Sequence 36.
  • the third G is replaced by a, the fifth by e, the 35th by P e, the 42 a by Se, the 46th e by, and the seventh P e replaced by. ,
  • the third G is replaced by a
  • the fifth is replaced by e
  • the 35th is replaced by Pe
  • the 46th e is replaced by the seventh Pe
  • the 77th e replaced by e.
  • the third G is replaced by a, the fifth by e, the 42nd by Se, the 46th by e, the 7th by Pe, and the 77th by e. ,
  • the introduced amino acid of 005 7 specifically includes the amino acid shown in Sequence 36.
  • the fifth is replaced by e
  • the 35th is replaced by P e
  • the 42nd a is replaced by Se
  • the 46th e is replaced by
  • the 7th Pe is replaced by
  • the 42nd a is replaced by Se
  • the 46th e is replaced by s
  • the 69th s is replaced by Se
  • the 7th Pe is replaced by ⁇
  • the 7th is replaced by Se.
  • the third G is replaced by a, the 35th is replaced by Pe, the 46th e is replaced by, and the seventh Pe is replaced by
  • the third G is replaced by a, the 42nd a by Se, the 46th e by and the seventh P e replaced by
  • the fifth is replaced by e
  • the 35th is replaced by P e
  • the 46th e is replaced by
  • the 7th P e is replaced by
  • the 5th is replaced with e
  • the 42nd a is replaced by Se
  • the 46th e is replaced by
  • the 7th Pe is replaced by
  • the third G replaced by a, the fifth by e, the 46th by e, and the seventh P e replaced by
  • An example is an ano series in which the 42nd a is replaced by Se, the 46th e is replaced by, and the 7th Pe is replaced by.
  • the introduced amino acid of 006 02 is specifically the amino acid shown in Sequence 36.
  • the introduced amino acid of 006 1 is specifically shown in SEQ ID NO: 36.
  • the clear body specifically includes the different ano sequences shown in sequences 58 to 63, but preferably the different ano sequences shown in sequences 58 59 6 62 and 63. And more preferably the sequence represented by SEQ.
  • Examples of the clear body include the body consisting of and having the above-mentioned ano series.
  • Array 53 has the ano sequence represented by array 59 array 53 has the ano sequence represented by array 6 array 55 has the ano sequence represented by array 62 but array 5 is the array Has an array represented by 58 Human having sequence No. 53 having the sequence shown in sequence 58 human has sequence No. 53 having sequence shown in sequence 63 but sequence No. 56 having sequence No. shown in sequence 62 has sequence No. 53 An example is a body having the amino acid sequence shown in Sequence 62. More preferred is
  • Clarifications include ab (ab) ab Sc dabod ds and C.
  • 006 ab is a piece of (chain of 22 obtained by treating G with white matter It is cleaved at the 4th ano), and is a fragment with a resistance of 50,000 molecules in which one half of the chain and the body are bound together.
  • 006 4 (ab) has a molecular resistance of 2 ab, which is composed by combining two conjugate parts of the range of G in Pep. It is a mentor.
  • Ming (ab) can be made with the following ab or a combination.
  • B of light which does not have a consensus sequence that binds to the region of light, specifically recognizes the structure of the region of the region expressed by the PP gene, and detects and of the gene construct that binds to the region c Can be expressed and produced by inserting the ab fragment of the body into a product vector or a product vector, and inserting the vector into a product vector.
  • 006 Sc is a piece of P or P that is an antigenicity obtained by linking a book and a book using an appropriate window marker (hereinafter referred to as P).
  • Ming's dabod constructs the drive of sc such that the anolog of P is under 8 and inserts into either the product vector or into the product vector and inserts the vector into or into. And can be manufactured.
  • 006 ds is the one obtained by substituting each of the above with an anosine, and then connecting via a stain bond.
  • the antibody can be selected based on the body structure of the antibody according to the method described by Ano e e et al. For substitution with stain (Po eee 7 697 (994)).
  • Include C of Ming is a gene that specifically recognizes the body structure of the region of the region expressed by the PP gene that has no consensus sequence that binds to the region of Ming, and Construct a vector and put into a product vector or into a product vector and store a vector It can be expressed and manufactured by packaging.
  • radioisotopes examples include 21 and the like, which can be bound to the body by, for example, the Clan method.
  • a method of binding a daunoine body a method of binding a noino body's amino group via glutaldehyde, or a method of coupling a daunoine's group to an amino group via water solubility. The method etc. are given.
  • cytokines that activate immune cells, such as human interface 2, human quarts, and human quarts.
  • the agent used may be a label used in usual epidemiological or standard methods.
  • examples include qualities such as acocatase, peokida, and laze, qualities such as austenite and tin, and qualities such as online (C) R C.
  • any one can be used as long as it can express the gene of interest such as large intestine and animal cell.
  • the vector used is one that can be autonomous or chromosomal in the host cell to be used and contains a suitable vector in a position capable of transcribing the polynucleotide.
  • a suitable vector in a position capable of transcribing the polynucleotide.
  • the kuta is autonomous while being a pect, a bot, a knot that includes a row and a row.
  • the kuta may also contain genes that control it.
  • putters derived from large intestine and the like such as putter (P) ac putter, P putter, P putter, and 7 putter
  • P putter
  • P putter P putter
  • P putter P putter
  • 7 putter can be given.
  • artificially designed filters such as tandem filters with two rows of P, parameters, ac 7 parameters, and e parameters can also be used.
  • a plus which is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 8) from the start of the in-dagger (S e a a o) which is the body sequence as the above-mentioned rectifier.
  • the base sequence of the sequence will be optimal for the host.
  • the group can be substituted with, which can improve the target.
  • large intestine e large intestine 2 e, large intestine, large intestine C, large intestine 3276, large intestine W 485, large intestine J 9 , Large intestine, large intestine o 49, large intestine W, large intestine 49, etc. can be used.
  • any method can be used as long as it is the method of introducing the above.
  • the method of using um ions Poc a cad Sc S 69 2 (972) Ge e 7 7 (982) oec a Ge The method described in ea Ge e cs 68 (979) can be cited.
  • po When produced in the large intestine, po can be expressed in the formula such that it is soluble in the cytoplasm, insoluble in the cytoplasm, or soluble in the Plascus sp. .
  • Cytomega Wis (C) eda e ea
  • S 4 putter Towe putter
  • meta-imputer hitopter
  • S You can give them some things.
  • 008 is human (a a a),
  • the transformant obtained as described above is cultivated on the ground,
  • an indexer may be added to the soil if necessary.
  • soupi may be added to the soil when using microorganisms that have been replaced with ac-actuator, and indo-acetic acid may be added to the soil when using microorganisms that have been converted using putters.
  • the recombinants such as microorganisms and animal cells that possess the cultivated bacterium, which are clarified, are cultured according to the usual method to produce po. By, it is possible to manufacture
  • a host there are various methods for producing a host, such as a method of producing in a host, a method of secreting in a host, and a method of producing above, and an appropriate method can be selected depending on the host cell to be used. In addition, it may be produced by expressing it as a po in a white matter with any white matter.
  • the purification can be carried out by a single method or a combination of methods such as a chromatographic method using a gas, a gas, etc., a method using a molecule, a method using an actogram, a cut, a motion, etc.
  • the cells When po is formed insoluble in the cytoplasm and expressed, the cells are similarly recovered and then centrifuged to recover the solubility of po. Soluble in collected white matter Soluble in white matter. By diluting or diluting the liquid, the white matter is restored to a normal three-dimensional structure, and then the product can be obtained by the same production method as above.
  • the conductor such as 0096 or its body is secreted into cells, the conductor such as the upper port or its body can be recovered.
  • d a ced C e ec, Kin P a aca Po e ec oo s e, S ece e a, Pe Se e, Shimadzu, etc.
  • a suitable agent eg, India's Agent (Co eeedsa) ammonium hydroxide pertussis vaccine. If is a part, an animal (e), ee (e oc a), etc., and a protein are prepared and used as immunity.
  • the reaction of the protein with the antigen was determined by the standard method such as bodes abo aoaa (Cod S abo abo ao 9 88.)
  • the antibody showed sufficient antibody titer against the used source.
  • the source of the cells is a mouse, rat or musta.
  • the cells containing cells such as the immunized mouse, rat, or musta are taken out 3 to 7 days after the antigen, and the antibody cells are collected. If you use a
  • the above-mentioned myelocytes were mixed with or (PS) (Natrium 83, Nka.2, Saline 7.65, G., 7 2), cells and antibody 5 to 4 and centrifuged (2, 5). After discarding the cells, loosening the precipitated cells, and then, using C, add Poignry (PG) 2 2 and Methis 7 2 to 2 to one cell, and After repeating 2 several times, add the ground so that the total amount becomes 5. (9, 5), discard the cells, loosen the cells, and gently blow them out with a female pet. Suspend in ground OO plus xanthine (o), gin (5X o), and anten (o).
  • PS Proliferhine
  • gin gin
  • anten o
  • the following methods can be used as methods for specifically recognizing the body structure of the region that is expressed by the P P gene and selecting the one that produces the body that binds to the region.
  • Nokuna 34 As an example of an id producing Nokuna, which recognizes the body structure of the region, there is Id3 producing Nokuna 34.
  • Ylide 34 is attached as P 8643 at the Research Center for Industrial Science and Technology, Research Center (6, Higashi, Higashi, Japan), based on the Tapes agreement with the date of June 24, Heisei.
  • the gene arrangement in the 0113 region can be determined, for example, by querying c of the body and as follows. Body ano, above. It can be determined by deducing from the gene sequence or by directly analyzing the antibody using a scanner. . a Co b o a o a a Seco d d o (Cod S abo abo a o P ess 989
  • the antibody region is c Show how to play.
  • the c is synthesized by extracting the protein that produces the mouse body.
  • the generated c is clanged into a plus or other knucker to make a c-liner.
  • the C of a us field is the one with a fraction of, or the cage with the c of is a plus.
  • the base sequence and each of the amino acid sequences of and.
  • the method for preparing the cells is an guandine eosod zo.543 (987), and the method for preparing the cells is the o (a) odized cesium column oec a Co abo aoaa. Seco ddo (Cod S abo abo ao Pess 989) and the like.
  • a kit for preparing cells as ac soa o (o e) Q c Pe P f ca o (P a ac), etc. may be mentioned.
  • a conventional method oec a Co abo aoaa Seco ddo (Cod Sa bo a bo ao Pess 89) e Po ocos oec a oo) S ee 34, is a commercially available kit, for example, Se.
  • the method using Sc Pas d S seo CS es sad Pas d Co (G CO) or ZPCS es s (S aaee) can be mentioned. Is a c-embedded cector. Anything can be used.
  • any one can be used as long as it can introduce, express and retain the c-lyer.
  • e S ae es 5 8 (992) C6 Ge e cs 39 44 (954) 88 9 Sce ce 222 778 (983) 522 oo 66 (983) 8 2U oo 6 8 (966) 5 Ge e 38 27 (985 ) Is used. 0119 C As a c-kun of the body of a non-human body, such as a human being, the isotope is the recognized one. ⁇ The idea is the plaque idea oec a Co abo.
  • aoaa Seco ddo Cod Sa bo abo ao Pess 989.
  • c is prepared by preparing the ply, and c e is used as a mold.Po e ase C a Reac o PC oec a Co abo aoaa Seco ddo Cod S abo abo ao P ess (989) e Po ocos oec a oo S ee
  • Cut c selected by 0120 method with appropriate restriction, esc
  • the region of the body, particularly C is an important region that defines the original compatibility of the antibody. Therefore, it is possible that the affinity of the antibody for any of the groups in the antibody range, especially C, may be altered. Therefore, when creating a region that does not have the above-mentioned consensus sequence, it is necessary to modify it to an ano sequence that does not change the original compatibility of the antibody.
  • the physical method is shown below. In order to change the consensus s that binds to the 0125 region and the amino acid sequence that does not change the compatibility of the Se or the body of the body, changes that directly affect the body structure of the antibody or the body structure of the antibody. It is necessary to exclude the alterations that influence and indirectly affect the antigen.
  • an antigen that may affect the compatibility of the antigen is excluded. It is of utmost importance to measure how efficiently the mutations in Therefore, X U ⁇ o ⁇ 2 535 (977) is the body structure of the body due to the computer Poe ee 7 5 (994) and so on. However, based on the information on the body structures of these antibodies, there is a possibility that the compatibility of the antibody origin may differ depending on the region of the antibody, particularly C. Therefore, when introducing a mutation, it is necessary to make a variant and study the relationship with the modification of anoic acid.
  • a column for designing the amino acid sequence in the region where the mutation is introduced is designed. Based on the measured columns, synthesize a different number of before and after, and use them to create a PC. In this case, it is preferable to design a total of 6 PCs and a PC that can be created.
  • the amplified product is determined by adding esc S () (S aaee) or the like to determine the nucleotide sequence by the method described in (), and the sensation sequence that binds to the antibody region is present.
  • a plus is obtained containing c with a sequence that encodes the sequence of regions of a different gene. Make sure that.
  • a positive base sequence containing an amino acid in the 0129 region and a gene having a sequence which is a sequence of the gene sequence obtained in the above-mentioned manner is determined by the method described in this (). Confirm that it has been applied. 0130 (3) Gene assembly
  • a somatic expression vector in which the C and C of the human body are incorporated is an animal vector in which the C and C of the human body are incorporated, and the C and C of the human body are added to the animal vector. Can be built by singing each.
  • C of human body It can be C and C of any human body, for example, C of human body class and C of class.
  • a color body composed of xontone and c can be used, but it is preferable to use c.
  • any vector can be used, so long as it can express the gene encoding the C region of the human body in combination.
  • G 7 (C o ec o ⁇ 3 3 (99)
  • G 3 (oc e 3 7 (987)
  • SG274 (Ge e 27 223 (984))
  • C (Poc a ca Sc S 78 527 (98))
  • SG bd2 4 (C o ec o 4 73 (99))
  • S Sed 3 C o ec o / 3 79 (993)
  • Vectors used for vector include S4's pattern U ⁇ oce ⁇ 37 (987)), Us blood disease virus's (oc eos es Co ⁇ 49 96 (987)), and immunogen. Examples include chain printers (Ce 4 479 (985)) and sensors (Ce 1 33 7 7 (983)).
  • Human body C and C-containing, but integrated somatic expression vectors can be used with either the antibody and the type in which the chain is on a different vector or on the same vector (tandem). However, due to the construction of human body expression vectors, the introduction of animal cells, the transfer of chains in animals, and the like, the tandem-type human bodies containing C and C are incorporated. Expression vectors are preferred U. oe ods 67 27 (994)). Examples of somatic expression vectors in which tandem type human C and C-dosing are incorporated include X WO 97 354) 8 (b do a 7 559 (998)).
  • the C and C of the human body as described in (3) are incorporated into the body expression vector in which the C or C of the human body is incorporated into the body of the human body, respectively.
  • Each of these clones can be cloned to construct a human chimera expression vector.
  • each c of the non-human body or is composed of the three base sequences of the non-human body or of the human body C or the five base sequences of C.
  • a human chimeric expression vector can be constructed so that each gene is expressed in an appropriate form in each gene stream.
  • the c in the human body can be constructed as follows.
  • any human body can be used as long as it is natural.
  • a human body or a human body registered in a database such as Po eaaa or a human body or a human body group of a human body.
  • Se ces (99) and the like in order to produce a human C-body with sufficient pouring, homology () of the target non-human body is sufficient. In particular, it is desirable to select an array that has each 6).
  • the desired human body or ortho cell array is planted with the desired non-human body or C cell cell array, and the human body or ortho cell array is respectively planted.
  • the calculated Ano sequence is converted into a sequence by taking into account the frequency of use found in the base sequence of the body's genes, and it is converted into a sequence of the human body. Select each column to add the column of or. Based on the measured row, Later we synthesize a number of and use them to perform the PC method. [0135] Also, by introducing an appropriate restriction element sequence at the five ends of the synthesis located at both ends, the somatic expression vector constructed in (3) can be easily cunged with a c or a somatic expression. .
  • the sequence of PC and amplification is determined by adding esc S () (S aaee), etc. to the plus, respectively, and the nucleotide sequence is determined by the method described in (). To get a plus.
  • the C of the constructed body is added to the C or C gene of the human body of the integrated body expression vector.
  • Kung and human expression vector can be constructed respectively.
  • the human chimera body or body expression vector described in (3) 3 and (3) 5 was used to evaluate the human chimera body or body transientness. You can do the present.
  • any cell can be used as long as it is a human chimera or a host capable of expressing the body, and further, CO 7 (CC C) is commonly used.
  • CO 7 CC C
  • Examples of cds Res CC ess 283 (99) CS 7 cell vectors include estran e ods cec cds Res CC ess 283 (99) kon P oc a cad Sc S 84 74 3 (987).
  • An example of a cell vector is Ct pon 2 25789 Co ec oo 3 33 (99).
  • the host into which the human chimera expression vector or the somatic expression vector is introduced may be any cell as long as it is a host capable of expressing the human chimera or the somatic expression vector.
  • Us SP2 4 (CC C 58)
  • Us P3X63 8 653 (CC C 8)
  • Examples include gene-deficient C O (WO 5 35586) and rat 23 P2 G 62 (CC C 662).
  • 0144 cell white matter such as enzymes involved in the formation of cell quo GPs, and white matter such as enzymes involved in the 6th position of guan at the end of the gu It is also possible to use a host with reduced or decreased sex such as white matter involved in the body's transport, preferably a CO cell deficient in the 6th gene described in W 5 35586.
  • a human chimera or a trait that stably expresses the body according to the method disclosed in 2 25789, G4 8 acid salt (below, G 4 8 It can be selected by selecting the place containing the drug such as SG). As the place, P 4 (oe), G (this pharmaceutical), X 3 (J), (1 oe), b do a S (oe), or each of these places such as cattle (below, S is noted), etc.
  • G4 8 acid salt (below, G 4 8 It can be selected by selecting the place containing the drug such as SG).
  • P 4 (oe), G (this pharmaceutical), X 3 (J), (1 oe), b do a S (oe), or each of these places such as cattle (below, S is noted), etc.
  • It can be used to elevate the human body.
  • Human chimera or traits that can be purified using ptain color can be purified using ptain color.
  • other purification methods usually used for producing white matter can be used.
  • it can be purified by filtration, ion chromatography, and combination.
  • Manufactured human chimera body or body is antibody body, under poadhodge, SSPG notation ae 227 68 (97) Western Standard o oco a bod ⁇ es P ⁇ c ⁇ es ad ac ⁇ ce ⁇ d ed o cade • c Pess (996), bodes abo aoaa Cod S abo abo ao (988), etc.
  • the original compatibility of the produced Ming gene or antibody fragment and the binding to PP can be determined by surface plasmin using S and Ca ceo • 1 oe • 36 373 (993) or Aco e. Cytotoxic activity against CC can be measured and evaluated for CC properties, CC e ⁇ 36 373 (993). In addition, these effects are uniquely recognized in the body structure of the region which is produced by the PP gene and is not produced by the Ming gene assembly and described in the above-mentioned by introducing the modification into the region. Then
  • Oxygen that has this activity can damage cells expressing a specific source, and thus can be used as a therapeutic drug for diseases.
  • oral administration or oral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intramuscular administration can be performed. , If desired, can be given intravenously.
  • the forms include, capsules, agents, capsules, emulsions, loci, injections, tapes, and the like.
  • Suitable agents for oral administration include injections, suppositories, agents and the like.
  • Ordinary dose is usually ⁇ 8 depending on the purpose, administration, administration method, treatment duration, age, body weight, etc.
  • the consensus of 0158 is an array consisting of s at the 59th position, Se at the 6th position, and Se at the 6th position in the array shown in array 2.
  • C 2 has the array shown in array 45. To do.
  • the sequence shown by 45 it is an array consisting of the union sensation, the 9th sth eye and the 9th Se.
  • the amino acid sequence represented by 0159 45 the amino acid at the 9th position is arbitrary, so Se at the 9th position and the Se position was modified.
  • Existing senoces of poes of oo ca ees se e ea ada se ces (99) was analyzed using the method of mpunting.
  • a ply having the base sequence shown in 22 to 27 below for introducing an anion and the ply having the sequence shown in sequence 28 are used to prepare PC.
  • create array 24 e • 2 In order to produce sequence 25 e ⁇ 3, in order to produce sequence 23 e ⁇ 4, in order to produce sequence 22 e ⁇ 5, in order to produce sequence 26 e ⁇ 6, in order to produce sequence 26 e ⁇ 6, sequence 27
  • Each of the (asks) described in (1) was used as a ply. At the 3 end of these 6 classes, there is a sequence of elements for X3 recombination described in (2) of Reference 2.
  • the temperature of the PC was 72 C after 25 reaction cycles consisting of 94 3 heating, 94 3 heating, 58 C 3 heating, and 74 C heating.
  • Ge e PC S se 97 (Applied Systems) was used.
  • the size of the PC product obtained was 3 b.
  • the reaction was performed according to the written description using eeao C Sec ec S Read Reac o (Pos ses), and the nucleotide sequence was analyzed by Kensa PS 37 of the same company, and the target modified variant expression was performed. I confirmed that the vector was obtained.
  • the expression in the body was determined by the conventional method bod ee.
  • 0169 is a cell PCg s Joa Of C which is a cell confirmed to express the expression of P P gene. I used e 395 (976).
  • the PP chimera 348 described in Reference 2 was used as a control, and CC 4 276 (WO 64754) was used as a control.
  • FIG. Shows the mean (), and the horizontal axis shows the antibody degree. All 6 bodies were shown to bind to PCg cells, which was of the antibody.
  • the CC property of the variant obtained in 1. was determined as follows.
  • P 4 S (CS was cultured using P 4 (m 2 oe), centrifuged and After the site was P 4 (oe) containing P 64 S (5) 5 S, the cell density was adjusted to 2X according to the CC site and used as the target solution.
  • the pute was centrifuged, and the dehydrogenase () property of was measured by using o o c es () and obtaining the data according to the statement.
  • the data for separation was obtained by using the CC land instead of the land and, and the data for the land separation was obtained by using the CC land instead of the target and.
  • the data for the separation were obtained by using CC medium instead of the antibody and Kata, reacting by adding 5 go X solution 45 minutes before the completion of the reaction, and obtaining the same product as above. It was set by CC.
  • the CC property was measured by the following formula using the PP chimera 348 described in Reference 2 as a control.
  • the 27th G3th Se4th Po which is considered to change the dimension of the antigenic position in the OO's base group and influence the sex of the antibody.
  • 44th s 45th G 49th e 72nd a, and 97th a, O 3rd G, 5th 35th 42nd a 46th e 7th P e, and 77 E of each was selected.
  • at least the upper ANO sequence was changed to the one that exists in the same way as in Us 3, and the and of the modified field were designed.
  • G at the 27th position in the ANO sequence indicated by the deviations of sequences 3 to 35 is designated as Pe
  • Se at the third position is designated as P e
  • Po at the fourth position is designated as Pe.
  • the third G of the array shown in array 36 is a
  • the fifth is e
  • the 35 is Pe
  • the a is Se
  • the e is 46.
  • the c which is the anod of the P P body designed in the implementation (), was constructed using a PC as follows.
  • 0188 octets (64-67) will be final o
  • the designed antibody was separated from the chain segment of the PP us 34 chain shown at the ⁇ 22th position in sequence 38 to form a complete antibody antibody.
  • I converted the sequence of electrons into genes.
  • the corresponding gene was determined.
  • Design a base sequence of c that encodes the complete antibody range amino acid sequence by setting the determined gene, and then add a PC sequence at the 5-3 end.
  • Including was added. Divide the measured base sequence into four base sequences from the 5 side (the base sequence has about 2 rows at its end), and arrange them in alternating order of sense and antisense strands. Synthetic octets (7-74) were synthesized.
  • the thus obtained plus solution was used to transform a large intestine strain, a plus was prepared from the resulting trait, and the base sequence was analyzed using eeao C Sec S Read Reac o (ed o.). A plus S having the desired base sequence (57) was obtained.
  • SW is changed from (a) (7) ⁇ Synthetic 75 to 78) having ano of xo, ply ply (aaa S zo) located at the end and 4 ply (aaa S zo) were subjected to PC reaction at 4 o.
  • a PC ⁇ 8 5 gas, the target ⁇ 4 b near the piece of the gene was taken out using Ge e ac o (QG).
  • the sec S () (bottom, S) processed by S a was tuned, and the target S (including S 58) was acquired.
  • a ply composite (94) was used for PC reaction, and a 5-gene piece was obtained.
  • a 3-gene piece was obtained using a 3-ply (aaa S zo) synthetic o93).
  • a PC reaction was performed using these genes and ply 32 plies, and amplified gene fragments were extracted using Ge e ac o (QG). Then, it was subjected to elementary treatment with a peculiar restriction co and sW: ⁇ 85 gas, the target piece near 4 b was emitted using Ge e ac o (QG). The gene fragment was inserted into the open position of S incorporating the restriction sW sequence, and Kuta S 3 2 containing the desired gene (6) was obtained. did.
  • the degree was measured with a calibrator.
  • the P P human chimera 348 in Reference 2 or the 382 produced in the experiment was used.
  • a normal human vein 5 was collected, and sodium () 5 was added and mixed.
  • Mononuclear cells (P C) were separated according to the manual using o o e (CO). Centrifugation was carried out in the separated PC and CC sites 2, and the solution was used as a suitable solution.
  • step (2) 5 (diluted to a cell ratio of 2) was added to the cuta solution prepared in 2.
  • the modified body was set at 5 in CC ground, 5 was obtained by diluting 8 times with 5x from 3x, the total amount was 5, and it was 4 in C. , And the pute were centrifuged, and the dehydrogenase () property of was measured by using C o c es () and obtaining the data according to the statement.
  • Separation data was obtained by using CC land instead of Kuta and, and Cta separation data was obtained by performing the same operation as above using CC land instead of target and.
  • the cP P prepared in 1. was used as a template and was located in the vector Ply 2 and P P gene, and contained the mutant amino acid.
  • the vector 8S 3 containing the 0226 P P gene was used as a model, and the peculiar restriction co and the o containing the sequence of d (45) were used for PC response to amplify the desired gene.
  • the widened gene pieces were treated with the restriction co and d 1.
  • the expression vector S c s which can contain c and s at the C-terminus of the protein, was treated with the restrictions co and d 1 and the amino acid was appropriately inserted to produce S P P.
  • the expression vector SPP a was subjected to restriction treatment with the restriction co and d 1, and the obtained gene fragment was inserted into the co and d sites of c 3 ct and c c containing the desired PP (7). 3 ⁇ o Obtained PP.
  • the vector prepared in the above 5 () and the P P vector cP P prepared in were transferred into CG44 (C86) by the Cottpon method to obtain the trait.
  • G4 8 (Nacalai Tesque) was added at the end of 6 and cultivated to produce mutant P P, C O P P C O P P C C 2 C O G C O SQ, and C O.
  • the binding property to was carried out by using fluorescence as follows.
  • 0229 (5) has no consensus sequence to bind to, or 3X of each fresh PP body, or the trait that did the above.
  • a solution in which the PP chimera was diluted for C (SPS, ⁇ 2, O ⁇ 5a) was dispensed with c and was subjected to 36 times.
  • C P human G () (Beckon Ta) diluted 5 times with C
  • the reaction consisted of 5 C for 3 hours and 72 C for 25 cycles and 72 C for 7 hours.
  • the materials were separated with a gasse, and a piece of 6 b was taken out with G C S (O 2).
  • C OPO Kuta was ligated with OPO Co (o e), and then the colon strain was transformed with P oc a cad Sc S 69 2 (972) of N et al.
  • the plus was extracted from the obtained transformant using a plus kit (Gen), and S was added as a kung vector for adding the 3 cs sequence of the 0235 PP piece obtained with the plus CPP containing the human PP gene. It was made.
  • 0239 cells were diluted with 3 fields containing 5 G4 8 so that the cells became 25. Aliquots of 2 were dispensed on 96 utts, and kuning was performed by the limit.
  • the cells prepared in (2) were administered to 3 6 ab C mice with the whooping cough vaccine laboratory). Five minutes later every week. The more part of Usus was subjected to the color method using the cells whose body price is shown below, and it was measured with 8S stem (Applied ion system) and cytometer (Beckenta). The organs were removed after the final 3 days.
  • the 0242 organ was thinned in (sse a ed) (), loosened with tweezers and centrifuged (25 X, 5).
  • the thus-obtained sodium chloride (P 766) was added, and the blood cells were removed by processing ⁇ 2.
  • the sample () was used in the field 3 for cell combination.
  • 0243 color method using 2 3 cells (ooeccooe ssa ec oo) I used a cell.
  • Scoed ed becc S Two to three cells were incubated with Inbitogen, and cells separated by S (Inbitogen) were suspended in the same place, and 3 cells were added to each 96 wells. The mouse serum as a primary body or X-ray on the needle, and the secondary body at 647 U.S.G.
  • the 0250 water was centrifuged (2 X, 5) to remove solids.
  • Cluster When the class of purified PP us 34 was determined by the S method using an iping kit, the class of PP us 34 was G.
  • 0255 PC was heated at 94C for 5 minutes, 94C for 5 minutes, 72C for 3 minutes for reaction cycle 5, 94C for 5 minutes, 7C for 3 hours, and C for 3 hours. , 9.
  • the somatic expression vector X3 was constructed as follows.
  • the liquid was used to transform large intestine 5 (Yobo).
  • a positive was prepared from the obtained trait kun, reacted according to the manual using eeao C ce Se S ec S Read Reac o (Po s ses), and the nucleotide sequence was analyzed by Kensa PS 37 of the same company, and the desired sequence was analyzed. It was confirmed that plus 3 g and 34 shown in 8 having a base sequence were obtained.
  • the reaction was performed according to the manual using eeao C ce Se c S Read Reac o (Pos ses), and the nucleotide sequence was analyzed by the company's Kensa PS 37. It was confirmed that the pluses obtained by c were added.
  • the trait 348 introduced with X3 was obtained.
  • the results are shown in the figure.
  • the PP chimera 348 produced was found to have a band of about 5 kilotons (hereinafter referred to as d) in the molecule under the conditions, and two bands of 5 d 25 d under the conditions.
  • the G class is the molecule 5d, and under the condition the SS bond in the molecule is cleaved, and it is decomposed into chains with 5d and about 25d bodes abo aoaa Cod S abo abo ao C ae 4 (988) o oco a bodes P c es ad Pac ce cade c Pess ed (996) . It is shown in the amino acid sequence 29 of PP chimera 348.
  • a cancer therapeutic agent using a gene or fragment, a vector comprising the gene or fragment, a method of a body comprising a transformant or a transformant obtained by transforming a vector. Will be provided.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　癌等の発症に関与すると考えられるヒトＰＥＲＰ（ｐ５３　ａｐｏｔｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ＰＭＰ－２２）遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体が求められている。本発明により、可変領域にＮ結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体を提供する。該抗体はＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現する各種疾患の治療に有用である。

Description

明 細 書
抗 PERP遺伝子組換え抗体
技術分野
[0001] 本発明は、可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、 PE RP (p53 apoptosis effector related to PMP— 22)遺伝子によりコードされ るポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合 する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該遺伝子組換え抗体または該抗体断片 を用いる癌の治療薬に関する。更に、本発明は該遺伝子組換え抗体をコードする D NA、該 DNAを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換 体および該形質転換体を培養することを特徴とする抗体の製造方法に関する。 背景技術
[0002] PERP (ある!/、は THWまたは PIGPC1とも称される）の遺伝子配列は公知であり（ 特許文献 1〜13)、該 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドは 193アミノ酸か らなる蛋白質で、一次配列力も 4回膜貫通蛋白であると推定されている。 PERP遺伝 子によりコードされるポリペプチドは P53依存性アポトーシスに関わる蛋白質であるこ とが知られている（非特許文献 1)。さらに PERP遺伝子ノックアウトマウスより調製した 胸腺細胞と神経細胞では、 DNAダメージの際のアポトーシス誘導が部分的に阻害さ れることが示された (非特許文献 2)。また、 PERPは高転移性癌細胞においては発 現が低下する遺伝子としても報告されて!ヽる (非特許文献 3)。
[0003] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体 (以下、抗 PERP抗体 と表記する）としては、これまでに、 PERP遺伝子産物の C末端細胞内の部分べプチ ドまたは第一細胞外ループの部分ペプチドを免疫原として用いて作製されたポリクロ ーナル抗体が知られている（非特許文献 4、 5)。これらのポリクローナル抗体はウェス タンブロッテイングあるいは免疫組織染色に使用可能であることが示されている。これ までに PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識 し、かつ該細胞外領域に結合する抗体は知られて 、な 、。
[0004] 一般にヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物とし て認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体 （Human Anti M ouse Antibody :HAMA) が誘導されることが知られている。 HAMAは投与され たマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献 6〜9)、マウス抗体の体 内からの消失を速め（非特許文献 7、 10、 11)、マウス抗体の治療効果を減じてしまう ことが知られている（非特許文献 12、 13)。
[0005] これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗 体力もヒト型キメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子組換え抗体の作製が試みられてい る。
ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較して ヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス 抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（非特 許文献 14、 15)。すなわち、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体 に比べ、ヒトにおいて副作用が少なぐその治療効果が長期間持続することが期待さ れる。
[0006] また、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため 、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖 (以下、 H 鎖と表記する）定常領域 (以下、 C領域と表記する）（H鎖 C領域を、 CHと表記する）と して glサブクラスを使用すれば、抗体依存性細胞傷害 (以下、 ADCCと表記する)活 性などのエフェクター機能の高 、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体を作製することができ（ 非特許文献 14)、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（非特許 文献 15)。特に PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現細胞数を減少さ せる治療にぉ ヽては、抗体の Fc領域 (抗体 H鎖のヒンジ領域以降の領域)を介した 補体依存性細胞傷害活性 (以下、 CDC活性と表記する)や ADCC活性等の細胞傷 害活性の高さがその治療効果に重要であるために、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較して望ましい（非特許文献 16、 17)。
[0007] さらに、ヒト型キメラ抗体やヒト化抗体は、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩に より、 Fab, Fab'、 F (ab' ) 、一本鎖抗体 (以下、 scFvと表記する）（非特許文献 18)
2
、 2量体化 V領域断片（以下、 Diabodyと表記する）（非特許文献 19)、ジスルフイド安 定化 V領域断片（以下、 dsFvと表記する）（非特許文献 20)、 CDRを含むペプチド（ 非特許文献 21)などの、分子量の小さい抗体断片としても作製でき、これらの抗体断 片は、完全な抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れている (非特許文献 22)
[0008] 以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒト以外 の動物の抗体よりもヒト型キメラ抗体、ヒトイ匕抗体または該抗体断片の方が望まし 、こ とを示している。
抗体を含め、生体内に存在する多くの蛋白質は糖鎖により修飾されている。糖鎖は 、ァスパラギン残基に特異的に結合する N結合型糖鎖と、セリン残基ゃスレオニン残 基に結合する O結合型糖鎖に分類される。特に N結合型糖鎖を有する糖蛋白質に は該糖鎖が結合するための、 3アミノ酸残基力もなる、コンセンサス配列（ァスパラギ ン—任意のアミノ酸—セリンまたはスレオニン）が存在する（非特許文献 23)。但し、 全てのコンセンサス配列に N結合型糖鎖が結合するわけではない。たとえば、成熟 型ヒト TNF— α受容体 IIでは、 2力所の Ν結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列う ち、 1力所は 100%Ν結合型糖鎖が結合しているが、もう 1力所には 50%程度の確率 でしか Ν結合型糖鎖は結合しな ヽ（非特許文献 24)。同様の現象がゥシ DNaselでも 確認されており、さらに遺伝子組換え体生産のための宿主細胞が変わると糖鎖結合 のパターンが大きく変化し、同一のアミノ酸配列でも蛋白質発現の環境によりその糖 鎖付加の状態は一定ではな!ヽ (非特許文献 25)。
[0009] 通常 IgG型のヒト抗体には、その定常領域に 1力所の N結合型糖鎖が結合するコン センサス配列を有している。しかし、可変領域中にも N結合型糖鎖が結合するコンセ ンサス配列を有している抗体は、糖鎖の結合が変化し、医薬品として均一な抗体の 安定供給が困難となる。さらに、糖鎖は蛋白質同士の結合に必須である場合もあり、 例えば LFA— 3 (lymphocyte function— associated antigen 3)では CD2と の結合に N結合型糖鎖が必要であると報告されており、抗体の結合部位である可変 領域に糖鎖が結合することにより、抗体の抗原への結合性が変化してしまう可能性が 考えられる (非特許文献 26)。
特許文献 1： WO98/55508 特許文献 2:W099/54461
特許文献 3:WO00Z55350
特許文献 4:WOOlZ22920
特許文献 5:WOOlZ66719
特許文献 6： WO00/61612
[0010] 特許文献 7:WO02Z00174
»8:WO02/47534
特許文献 9： US2003 - 0064947
特許文献 10:US2OO3— 0065157
特許文献 11 :WO00/55629
特許文献 12:WO02Z60317
特許文献 13 :US2002— 0119463
[0011] 非特許文献 1: Genes & Development 14, 704(2000)
非特許文献 2:Curr. Biol. , 13, 1985(2003)
非特許文献 3: Anticancer Research 20, 2801(2000)
[0012] 非特許文献 4:Pro Sci社ホームページ、 [on line]、 [平成 16年 3月 31日検索]、ィ ンターネット <http:ZZwww. prosci— inc. com/ Antibody— TDS/ 2451%
20PERP. html>
非特許文献 5: Novus Biologicals社ホームページ、 [on line]、 [平成 16年 3月 3 1日検索]、インターネット <http:Z / www. novus― biologicals . com./ print― data— sheet. php/4400>
非特許文献 6:J. Clin. Oncol. , 2, 881(1984)
非特許文献 7: Blood, 65, 1349(1985)
[0013] 非特許文献 8: J. Natl. Cancer Inst. ， 80， 932(1988)
非特許文献 9:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242(1985)
非特許文献 10:J. Nucl. Med. , 26, 1011(1985)
非特許文献 11 :J. Natl. Cancer Inst. , 80, 937(1988)
非特許文献 12 :J. Immunol. , 135, 1530(1985) 非特許文献 13： Cance r Re s 46, 6489 ( 1986)
[0014] 非特許文献 14： Cance r Re s 5 6, 1 1 1 8 (19 96) 非特許文献 15： I mmu n o 1 . ， 8 5, 6 68 ( 1 9 95)
非特許文献 16： J . I mmu n o 1. ， 1 4 4， 1 3 8 2 ( 19 90) 非特許文献 17： Nature, 322 ， 3 2 3 ( 1 9 8 8)
非特許文献 18： Sc i ence ， 24 2， 4 23 ( 1 9 88)
非特許文献 19： ature B i o t e c hn o 1 . , 15, 629
( 1997)
非特許文献 20 ： M o 1 e c u ] L a r I mmu n o ] L. ， 32， 249
( 1995)
[0015] 非特許文献 21 ： J . B i o l. C h e m. 27 ] L, 2966 (199
6)
非特許文献 22： Canc e r Re s 5 2, 3 4 0 2 ( 19 92) 非特許文献 23： B i o c h e m . J. , 1 9 5, 6 3 9 ( 198 1) 非特許文献 24: B i o c h e m i s t r y 32 3 1 31 (1 993) 非特許文献 25： B i o c h e m . J. ， 3 5 5, 2 4 5 (20 01) 非特許文献 26： Trends i n G 1 y c o s c i e n c e and G 1 c o t e c h n o 1 o , 1 15 1 ( 199 9) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0016] 医薬品として均一な抗体を安定に供給するためには、 アミノ酸置換等で N 結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を改変する必要がある。 しかしな がら、 相補性決定領域は抗体の への結合性に直接寄与している領域で あるため、 抗原への結合性を保持したままアミノ酸改変を行うことは容易 ではない。 本発明の課題は、 可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセン サス配列を有さない、 P E R P遺伝子によりコードされるポリぺプチドの 細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、 該細胞外領域に結合する、 遺伝 子組換え抗体または抗体断片、 該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を用 いる癌の治療薬、 該遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコ一ドする DN A、 該 DNAを含んでなるベクタ一、 該べク夕一を形質転換して得られる 形質転換体または該形質転換体を培養することを含む抗体の製造方法を提 供することにある。
課題を解決するための手段
to正された用紙 (規則 91) 本発明は、以下の（1)〜（31)に関する。
(1) 抗体の可変領域 (以下、 V領域と記す) N結合型糖鎖が結合するコンセンサス 配列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体 構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断 片。
(2) 抗体の重鎖可変領域 (以下、 VHと記す)および軽鎖可変領域 (以下、 VLと記 す）の全ての相補性決定領域（Comprimentarity Determining Region;以下、 CDRと記す）に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、請求項 1に記 載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(3) 抗体の VHの CDR1および CDR3力 それぞれ配列番号 3および 5で示される アミノ酸配列を含む、 (1)または（2)記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(4) 抗体の VLの CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示さ れるアミノ酸配列を含む、 (1)または（2)記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(5) 抗体の VHの CDR1および CDR3力 それぞれ配列番号 3および 5で示される アミノ酸配列を含み、かつ、抗体の VLの CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 1 1、 12および 13で示されるアミノ酸配列を含む、（1)または 2記載の遺伝子組換え抗 体または抗体断片。
(6) 抗体の VHの CDR2が、配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを 他のアミノ酸残基に置換する改変および 11番目の Serを他のアミノ酸残基に置換す る改変のうち、少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（1)〜（5)のい ずれ力 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(7) 配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを他のアミノ酸残基に置換 する改変が、 9番目の Asnを極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変である、 (6)に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(8) 極性側鎖を有するアミノ酸残基が Tyrまたは Serである、 (7)に記載の遺伝子組 換え抗体または抗体断片。
(9) 配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを他のアミノ酸残基に置換 する改変が、 9番目の Asnを Glyに置換する改変である、（6)に記載の遺伝子組換え 抗体または抗体断片。
(10) 配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 11番目の Serを他のアミノ酸残基に置 換する改変が、 11番目の Serを非極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変で ある、（4)〜（9)の ヽずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(11) 非極性側鎖を有するアミノ酸残基が Alaである、（10)に記載の遺伝子組換え 抗体または抗体断片。
(12) 抗体の VHの CDR2が、配列番号 4および 6〜10のいずれ力 1つで示される アミノ酸配列を含む、（1)〜（11)の!ヽずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または 抗体断片。
(13) 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれ る、 (1)〜（12)のいずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(14) ヒト型キメラ抗体の VHが、（14)〜（19)のいずれか 1つで示されるアミノ酸配 列を含む、 (13)に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(15) ヒト型キメラ抗体の VLが配列番号 20で示されるアミノ酸配列を含む、（13)に 記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(16) ヒト型キメラ抗体の VH力 配列番号 14〜19のいずれか 1つで示されるァミノ 酸配列を含み、かつ、 VLが配列番号 20で示されるアミノ酸配列を含む、（13)に記 載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
(17) ヒト化抗体の VH力 配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列 または配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列の 27番目の Glyを P heに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45 番目の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目 の Alaを Thrに置換する改変カゝら選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸 配列を含む、 (13)に記載のヒト化抗体または抗体断片。
(18) ヒトイヒ抗体の VL力 配列番号 36で示されるアミノ酸配列または配列番号 36で 示されるアミノ酸配列の 3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Phe【こ、 42番目の Alaを Ser【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 69番目の Aspを Ser【こ、 7 0番目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに、および 77番目の Leuを Metに置換 する改変力 選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、（13) に記載のヒト化抗体または抗体断片。
(19) ヒト化抗体の VH力 配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列 または配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列の 27番目の Glyを P heに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45 番目の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目 の Alaを Thrに置換する改変カゝら選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸 配列を含み、かつ、
ヒト化抗体の VL力 配列番号 36で示されるアミノ酸配列または配列番号 36で示さ れるアミノ酸配列の 3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Phe に、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番 目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに、および 77番目の Leuを Metに置換する 改変から選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、
(13)に記載のヒト化抗体または抗体断片。
(20) ヒト化抗体の VH力 配列番号 51〜56のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列 を含む、（13)に記載のヒト化抗体または抗体断片。
(21) ヒト化抗体の VL力 配列番号 58〜63のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列 を含む、（13)に記載のヒト化抗体または抗体断片。
(22) ヒト化抗体の VH力 配列番号 51〜56のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列 を含み、かつヒトイ匕抗体の VL力 配列番号 58〜63のいずれ力 1つに示されるァミノ 酸配列を含む、 (13)に記載のヒト化抗体または抗体断片。
(23) ハイプリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)力 生産されるモノクローナ ル抗体が認識するェピトープに結合する、 (1)〜（22)のいずれか 1項に記載の遺伝 子組換え抗体または抗体断片。
(24) 抗体断片が、 Fab, Fab '、 F (ab ' ) 、一本鎖抗体 (scFv)、二量体化 V領域 (
2
Diabody)、ジスルフイド安定化 V領域（dsFv)および CDRを含むペプチドから選ば れる抗体断片である（1)〜（23)のいずれ力 1項に記載の抗体断片。
(25) 該立体構造が、配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 40番目の Asp、 62番目 の Gluおよび 63番目の Gluを少なくとも含む立体構造である、 (1)〜（24)のいずれ 力 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
(26) (1)〜（25)のいずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片をコ ードする DNA。
(27) (26)に記載の DNAを含有する組換え体ベクター。
(28) (27)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株
(29) (28)に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（1)〜（25)のいず れか 1項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該 抗体断片を採取することを特徴とする（1)〜（25)のいずれか 1項に記載の遺伝子組 換え抗体または抗体断片の製造方法。
(30) (1)〜（25)のいずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片を有 効成分として含有する PERP遺伝子が関与する疾患の治療剤。
(31) PERP遺伝子が関与する疾患が癌である、（30)に記載の治療剤。
発明の効果
[0018] 本発明によると、 V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、 P ERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認 識し、該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または抗体断片、該遺伝子組 換え抗体または該抗体断片を用いる癌の治療薬、該遺伝子組換え抗体または該抗 体断片をコードする DNA、該 DNAを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換し て得られる形質転換体または該形質転換体を培養することを含む抗体の製造方法 が提供される。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]図 1に、プラスミド pKANTEX3411CDRvl〜v6の造成工程を示す。
[図 2]図 2に、精製した抗 PERPCDR改変抗体の SDS— PAGE (5〜20%グラジェン トゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。 Aは還元条件、 Bは非還元条件での結果 をそれぞれ示す。 A、 B共に、レーン 1と 9が分子量マーカー、 2が抗 PERPキメラ抗体 KM3481、 3〜8が左から順に抗 PERPCDR改変抗体 ver. l〜ver. 6の泳動パタ ーンをそれぞれ示す。
[図 3]図 3に、フローサイトメトリーでの各抗体の反応性を示す。図の縦軸は平均蛍光 強度を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。図中、◊は抗 PERPキメラ抗体 KM3481 を、國は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 1を、▲は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 2を、 ♦は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 3を、參は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 4を、口は 抗 PERPCDR改変抗体 ver. 5を、△は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 6を、〇は陰性 対照である抗 CCR4キメラ抗体をそれぞれ示す。
[図 4]図 4に、各抗体の ADCC活性を示す。各図の縦軸は細胞傷害活性 (％)を、横 軸は抗体濃度をそれぞれ示す。図中、◊は抗 PERPキメラ抗体 KM3481を、國は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 1を、▲は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 2を、♦は抗 PER PCDR改変抗体 ver. 3を、參は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 4を、ロは抗 PERPC DR改変抗体 ver. 5を、△は抗 PERPCDR改変抗体 ver. 6をそれぞれ示す。
[図 5]図 5に、 PERP遺伝子導入細胞のクローン毎の PERP発現を、抗 Myc抗体を用 いたウェスタンブロッテイングにより調べた結果を示す。図中のクローンナンバーは、 4 種の PERPZCHO細胞の各クローンを示す。 Negaは、遺伝子を導入していない C HOZDG44細胞を示す。図中の矢印は、 PERP遺伝子によりコードされるポリぺプ チド鎖の分子量である約 25kDaを示す。
[図 6]図 6に、 FMATでの KM3411の反応性を示す。グラフは縦軸に蛍光強度と細 胞数の積算値を示す。
[図 7]図 7に、フローサイトメトリーでの KM3411の反応性を示す。各図の縦軸は細胞 数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。
[図 8]図 8に、プラスミド pKM3411VH9と pKM3411VL11の造成工程を示す。
[図 9]図 9に、プラスミド pKANTEX3411の造成工程を示す。
[図 10]図 10に、精製した抗PERPキメラ抗体のSDS— PAGE (5〜20%グラジェント ゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそ れぞれ電気泳動を行った結果である。レーン 1と 6が分子量マーカー、 2と 4力抗 PER Pマウス抗体 KM3411、 3と 5が抗 PERPキメラ抗体 KM3481の泳動パターンをそれ ぞれ示す。 [図 11]図 11に、抗 PERPヒト化抗体作製の工程を示す。
[図 12]図 12に、フローサイトメトリーでの、作製した抗 PERPヒト化抗体の、 hPERP発 現細胞 CHOZhPERP (KC1359)に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を 、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。 Aは、単に CDRをヒトフレームワークに挿入した ヒト化抗体および、 H鎖あるいは L鎖のみアミノ酸改変を加えたヒト化抗体の反応性を 示す。 Bは、アミノ酸改変残基数を減らしたヒト化抗体の反応性を示す。
[図 13]図 13に、フローサイトメトリーでの、作製した抗 PERPヒト化抗体の、 hPERP発 現細胞 CHOZhPERP (KC1359)に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を 、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。 A, B, Cでは、アミノ酸改変残基の最適化を行 つた抗 PERPヒト化抗体の反応性を示す。
[図 14]図 14に、フローサイトメトリーでの、作製した抗 PERPヒト化抗体の、 hPERP発 現細胞ヒト肺癌細胞株 PC— 9に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横 軸は蛍光強度をそれぞれ示す。 A, B, Cでは、アミノ酸改変残基の最適化を行った 抗 PERPヒト化抗体の反応性を示す。
[図 15]図 15に、作製した各抗 PERPヒト化抗体のヒト肺癌細胞株 PC - 9に対する AD CC活性を示す。縦軸は細胞傷害活性 (％)を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
[図 16]図 16に、作製した各抗 PERPヒト化抗体のヒト脾癌細胞株 BxPC - 3に対する ADCC活性を示す。縦軸は細胞傷害活性 (％)を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す
[図 17]図 17に、作製した各抗 PERPヒト化抗体の hPERP発現 CHO細胞 CHOZhP
ERP (KC9033)に対するヒト肺癌細胞株 PC— 9に対する ADCC活性を示す。各図 の縦軸は細胞傷害活性 (%)を、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。
[図 18]図 18に、 N型糖鎖の結合するコンセンサス配列を有さな ヽ抗 PERPヒト型キメ ラ抗体 KM3821の、ェピトープ解析の結果に基づく変異 PERPの模式的な図を示し た。
[図 19]図 19に、フローサイトメトリ一での PERPの細胞外領域を認識する抗体を用 ヽ た、各変異 PERPに対する反応性を示した。グラフ中の数値は、 KM3821の反応性 である。 KM3821の反応性は、 KM3821の hPERPに対する反応性を 100%とした 時の、各変異 PERPあるいはサル PERPに対する反応性（％)で示した。
[図 20]図 20に、フローサイトメトリーでの、各変異 PERP発現細胞に対する KM3821 の反応性から明らかになったェピトープを、模式的に示した。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 本発明は、 V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、 PERP 遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、 該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または該抗体断片に関する。
PERP遺伝子としては、配列番号 1で示される塩基配列があげられる。上記の塩基 配列において 1以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列を含む遺 伝子、配列番号 1で示される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する塩基 配列、好ましくは 80%以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは 90%以上 の相同性を有する塩基配列、最も好ましくは 95%以上の相同性を有する塩基配列を 含む遺伝子、ならびに配列番号 1で示される塩基配列を有する DNAとストリンジェン トな条件下でノヽイブリダィズする DNAを含む遺伝子なども本発明の PERP遺伝子に 包含される。
[0021] ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、配列番号 1で示される塩 基配列を有する DNAをプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラー ク'ノヽィブリダィゼーシヨン法、サザンブロット'ハイブリダィゼーシヨン法、 DNAマイク ロアレイ法などにより得られるハイブリダィズ可能な DNAを意味し、具体的には、ノ、ィ ブリダィズしたコロニーまたはプラーク由来の DNA、もしくは該配列を有する PCR産 物もしくはオリゴ DNAを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、 0. 7〜 ImolZLの塩化ナトリウム存在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1 〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mmolZL塩ィ匕ナトリウ ム、 15mmolZLクェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65°C条件下でフィルターもしく はスライドグラスを洗浄することにより同定できる DNAをあげることができる。ハイプリ グイセーシヨン【ま、 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 Current Prot ocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987— 1997)、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edi tion (Oxford University, 1995) ]などに記載されている方法に準じて行うことが できる。ハイブリダィズ可能な DNAとしては、配列番号 1で示される塩基配列と少なく とも 60%以上の相同性を有する DNA、好ましくは 80%以上の相同性を有する DNA 、さらに好ましくは 90%以上の相同性を有する DNA、よりさらに好ましくは 95%以上 の相同性を有する DNA、最も好ましくは 99%以上の相同性を有する DNAをあげる ことができる。
[0022] 真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が 認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列 に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明の PERP遺伝子に包含される。
PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドとしては、配列番号 2で示されるァミノ 酸配列を有するポリペプチド、配列番号 2で示されるアミノ酸配列にお 、て 1以上の アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、な らびに配列番号 2で示されるアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列 を有するポリペプチド、好ましくは 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する ポリペプチド、さらに好ましくは 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリ ペプチド、特に好ましくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリぺプ チド、最も好ましくは 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド などがあげられる。
[0023] 配列番号 2で示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入ま たは付カ卩されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 [Molecular Cloning, A L ab oratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987— 1997)、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) ]などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 2で示さ れるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAに部位特異的変異を導入 することにより得ることができる。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は特 に限定されないが、好ましくは 1個〜数十個、例えば、 1〜20個、より好ましくは 1個 〜数個、例えば、 1〜 5個のアミノ酸である。
[0024] 本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の 相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってょ 、が、塩基配列にっ 、て ίま、 BLAST i. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)〕にお!/、てデフオノレトのノ ラメータを 用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、 BLAST2 [Nucleic Acids Res. , 25, 3389 (1997)； Genome Res. , 7, 649 (1997)； http : //www. nc bi. nlm. nih. gov/ Education/ BLASTinf o/ inf ormation3. html]【こお ヽて デフォルトのパラメータを用いて算出される数値などがあげられる。
デフォルトのパラメータとしては、 G (Cost to open gap)が塩基配列の場合は 5 、アミノ酸配列の場合は 11、—E (Cost to extend gap)が塩基配列の場合は 2、 アミノ酸配列の場合は 1、—q (Penalty for nucleotide mismatch)がー 3、—r (reward for nucleotide match)力 S—— e (expect value)力丄 、—— W(wordsize )が塩基配列の場合は 11残基、アミノ酸配列の場合は 3残基、—y (Dropoff (X) for blast extensions in bits)が blastn の場合は 20、 blastn以外のプログラムで ίま 7、— X(X dropoff value for gapped alignment in bits)力 15および一 Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits)力 Sblastnの場合 は 50、 blastn以外のプログラムでは 25である（http : ZZwww. ncbi. nlm. nih. g ov/blast/ html/ blastcgihelp . html)。
[0025] 配列番号 2で示されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公 知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号 2で示されるアミノ酸配列を コードする DNAの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体 を培養することにより作製することができる。また、こうして作製されるポリペプチドまた は DNAに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 部分配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配 列を有するポリペプチドを得ることができる。
[0026] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域とは、例えば配列番号 2 で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラム sosu
I (http： / / sosui. proteome. bio. tuat. ac. jpZ sosuiframeO. html)または卞 測プログラム TMHMM ver. 2 (http : //www. cbs. dtu. dk/services/TM HMM- 2. 0/)などを用いて予測された領域があげられる。
[0027] 具体的には、 SOSUIを用いた場合には配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 35〜 75番目および 130〜154番目に相当する領域力 TMHMM ver. 2を用いた場合 には配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 36〜76番目および 129〜147番目に相 当する領域が細胞外領域としてあげられる。このとき、予測に用いられるノ メータは これらの予測プログラムにデフォルトの値が用いられる。
[0028] また、本発明における PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域と しては、文献 [Genes & Development, 14, 704 (2000) ]で予測される細胞外 ドメインの 33〜75番目および 129〜150番目に相当する領域であってもよい。
本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片は、 PERP遺伝子によりコードされる ポリペプチドの天然型の立体構造を認識し、かつ該ポリペプチドの細胞外領域に安 定的に結合することができる。細胞外領域としては、 PERP遺伝子によりコードされる ポリペプチドの細胞外領域のループ 1およびループ 2があげられる。細胞外領域とし ては、少なくとも細胞外領域のループ 1の 40番目の Aspを含む領域があげられ、例 えば配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 40番目の Asp, 62番目の Gluおよび 63番 目の Gluを少なくとも含む立体構造があげられる。
[0029] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造としては、配列番 号 1で示される塩基配列を有する PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが天 然状態でとりうる立体構造と同等の立体構造を有して 、れば 、ずれでもよ 、。
本発明の遺伝子組換え抗体が結合することを確認する方法としては、例えば、 PE RP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞に対する公知の免疫学的 検出法が用いられ、蛍光細胞染色法などの特定の抗原が発現した細胞と特定抗原 に対する抗体の結合性を確認する方法が好適に用いられる。具体的には、参考例 1 (2) 4に記載の蛍光抗体染色法があげられる。また、公知の免疫学的検出法 [Mo noclonal Antiooaies― Principles and practice, Third edition, Academi c Press (1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harb or Laboratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイェンティフィ ック（ 1987) ]などを組み合わせて確認することもできる。
[0030] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞としては、ヒト体内に天 然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から榭立された細胞株または遺 伝子組換え技術により得られた細胞などがあげられる。
ヒト体内に天然に存在する細胞としては、癌患者体内において該ポリペプチドが発 現している細胞があげられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで 該ポリペプチドが発現している細胞があげられる。
[0031] ヒト体内に天然に存在する細胞から榭立された細胞株としては、上記の癌患者から 得られた該ポリペプチドが発現して 、る細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ポ リペプチドが発現している細胞株があげられ、例えば、ヒトから樹立された細胞株であ る脾癌細胞株 Capan— 2 (ATCC HTB— 80)または BxPC— 3 (ATCC CRL— 1 687)、大腸癌細胞株 Colo205 (ATCC CCL— 222)、 HT29 (ATCC HTB— 3 8)または WiDr(ATCC CCL— 218)、肺癌細胞株 NCI— HI 28 (ATCC HTB— 120)または NCI— H69 (ATCC HTB— 119)、乳癌細胞株 MCF7 (ATCC HT B- 22)または子宫癌細胞株 MCAS (JCRB 0240)などがあげられる。
[0032] 遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、該ポリペプチドをコ ードする cDNAを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入すること により得られる、該ポリペプチドが発現した細胞などがあげられ、具体的には、参考例 1に記載の PERP遺伝子発現プラスミド pcPERPmHを導入し、該ポリペプチドが発 現した細胞などがあげられる。
[0033] 本発明の V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな 、遺伝子組 換え抗体としては、 V領域の全ての CDRに N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配 列を有さない、遺伝子組換え抗体があげられ、具体的には、抗体の VHの CDR1お よび CDR3が、それぞれ配列番号 3および 5で示されるアミノ酸配列および Zまたは 抗体の VLの CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるァ ミノ酸配列を含む、遺伝子組換え抗体があげられる。 [0034] 上記の抗体の VHの CDR1および CDR3力 それぞれ配列番号 3および 5で示され るアミノ酸配列を含む、遺伝子組換え抗体において、抗体の VHの CDR2としては、 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗体の VHの CDR2であって、 かつ、該 CDR2を有する遺伝子組換え抗体が、 PERP遺伝子によりコードされるポリ ペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合すること ができれば特に限定されないが、例えば、配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番 目の Asnを他のアミノ酸残基に置換する改変および 11番目の Serを他のアミノ酸残 基に置換する改変のうち、少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、 C DR2があげられる。配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを他のアミノ 酸残基に置換する改変としては、例えば、 9番目の Asnを極性側鎖を有するアミノ酸 残基に置換する改変があげられる。極性側鎖を有するアミノ酸残基としては、具体的 には、 Glu、 His, Lys、 Tyr、 Arg、 Cys、 Thrおよび Serなどがあげられる。他に、配 列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを他のアミノ酸残基に置換する改 変としては、 Glyに置換する改変があげられる。配列番号 45で示されるアミノ酸配列 の 11番目の Serを他のアミノ酸残基に置換する改変としては、例えば、 11番目の Ser を、非極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換するアミノ酸残基に置換する改変があげ られる。非極性側鎖を有するアミノ酸残基としては、 Trp、 Ile、 Phe、 Leu、 Met、 Val 、 Pro, Alaおよび Glyなどがあげられる。上記の抗体の VHの CDR2としては、具体 的には、配列番号 4、 6〜10のいずれ力 1つのアミノ酸配列を含む CDR2などがあげ られる。
[0035] 本発明の遺伝子組換え抗体の具体例としては、抗体の VHの CDR1、 CDR2およ び CDR3が、それぞれ配列番号 3、配列番号 4および 6〜10のいずれ力 1つおよび 配列番号 5でそれぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1、 C DR2および CDR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配列 を含む遺伝子組換え抗体があげられる。 具体的には、
抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 3、 4および 5で それぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1、 CDR2および C DR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子 組換え抗体、
抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 3、 6および 5で それぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1、 CDR2および C DR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子 組換え抗体、
抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 3、 7および 5で それぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1、 CDR2および C DR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子 組換え抗体、
抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 3、 8および 5で それぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1、 CDR2および C DR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子 組換え抗体、
抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 3、 9および 5で それぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1、 CDR2および C DR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子 組換え抗体、および
抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 3、 10および 5で それぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1、 CDR2および C DR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配列を含む遺伝子 組換え抗体、
などがあげられるが、抗体の VHの CDR1、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番 号 3、 8および 5でそれぞれ示されるアミノ酸配列および Zまたは抗体の VLの CDR1 、 CDR2および CDR3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示されるアミノ酸配 列を含む遺伝子組換え抗体が好まし ヽ。
本発明の遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または 抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体 において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低ぐ血中半減期が延長され たものは、治療薬として好ましい。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLとヒト抗体の CHおよび 軽鎖定常領域 (以下、 CLと表記する）とからなる抗体をいう。
[0037] 本発明のヒト型キメラ抗体は、以下のようにして作製することができる。まず、 PERP 遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、 かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマより、 V Hおよび VLをコードする cDNAを取得し、その配列を铸型として変異導入プライマ 一を用いて PCRを行うことにより、 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さ ない VHおよび VLをコードする cDNAを作製する。作製した cDNAを、ヒト抗体の C Hおよび CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入 してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ ること〖こより、ヒ卜型キメラ抗体を製造することができる。
[0038] ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン (以下、 hlgと表記する）に属す ればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属 する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができ る。また、ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよぐ κク ラスある!/、は λクラスのものを用いることができる。
[0039] 本発明のヒト型キメラ抗体としては、具体的には、抗体の VHが配列番号 14〜19の いずれか 1つで示されるアミノ酸配列および Ζまたは抗体の VLが配列番号 20で示さ れるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体などがあげられる。
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列をヒト 抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいい、 CDR移植抗体、再構成 抗体 (reshaped― antibody)などとも！、つ。
[0040] 本発明のヒト化抗体は、以下のように作製することができる。まず、 PERP遺伝子に よりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細 胞外領域に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ 力 産生されるヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列から、 N 結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない VHおよび VLの CDRのアミノ酸 配列を設計し、設計した VHおよび VLの CDRを任意のヒト抗体の VHおよび VLの F Rに移植した可変領域をコードする cDNAを作製する。作製した cDNAを、ヒト抗体 の CHおよび CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿 入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させるこ とにより、ヒト化抗体を製造することができる。
[0041] ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来の VHおよび VLの F Rのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、 Protein Data Bankなどのデータベースに登録されて!、るヒト抗体の VHおよび VLの FRの ノ酸酉己歹1 J、ま 7こ ίま： sequences oi Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)などに記載の、ヒト抗体の V Hおよび VLの FRの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。
[0042] ヒトイ匕抗体の CHとしては、 hlgに属すれば!/、かなるものでもよ!/、が、 hlgGクラスのも のが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hlgG 1、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といつ たサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒトイ匕抗体の CLとしては、 hlgに属 すればいずれのものでもよく、 κクラスあるいはえクラスのものを用いることができる。
[0043] 本発明のヒトイ匕抗体としては、具体的には、抗体の VHが配列番号 30〜35のいず れか 1つで示されるアミノ酸配列、または配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示され るアミノ酸配列中の 27番目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の Lys、 4 5番目の Gly、 49番目の Ile、 72番目の Val、および 97番目の Alaから選ばれる少な くとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列および Zまた は抗体の VLが配列番号 36で示されるアミノ酸配列、または配列番号 36で示される アミノ酸配列中の 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番 目の: Leu、 69番目の Asp、 70番目の Phe、 71番目の Thr、および 77番目の: Leu力ら 選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列 をそれぞれ含むヒト化抗体などがあげられる。
[0044] 抗体の VHは配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列中の 27番 目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の Lys、 45番目の Gly、 49番目の I le、 72番目の Val、および 97番目の Alaのうち少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のァ ミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列としては、導入される改変の数に特に制限はな いが、好ましくは抗体の VHが配列番号 30〜35のいずれか 1つで示されるアミノ酸配 列中の 27番目の Gly、 41番目の Pro、 49番目の Ile、 72番目の Val、および 97番目 の Alaが、さらに好ましくは 27番目の Gly、 72番目の Val、および 97番目の Alaが他 のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体などがあげられる。
抗体の VHにおいて、配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列中 の 27番目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の: Lys、 45番目の Gly、 49 番目の Ile、 72番目の Val、および 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ 酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列としては、配列番号 30〜35の いずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の 27番目の Glyを Phe〖こ、 30番目の Serを T hrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目の Glyを Argに、 49 番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換する 改変から選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
[0045] 8つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の いずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の 27番目の Glyを Phe〖こ、 30番目の Serを T hrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目の Glyを Argに、 49 番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換した アミノ酸配列があげられる。
[0046] 7つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の V、ずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の
30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目 の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の A1 aを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目 の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の A1 aを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目 の Lvsを Asnに、 45番目の Glyを Argに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の A laを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 45番目 の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の A1 aを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目 の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の A1 aを Thrに置換したアミノ酸配列、および
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目 の Lysを Asnに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の A1 aを Thrに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
6つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の V、ずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の
27番目の Glyを Pheに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目 の Glyを Argに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
27番目の Glyを Phe【こ、 41番目の Proを Phe【こ、 45番目の Glyを Arg【こ、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目の Glyを Argに、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目 の Glyを Argに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 45番目の Glyを Argに、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
30番目の Serを Thrに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目の Glyを Argに、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目 の Lysを Asnに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミ ノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 45番目 の Glyを Argに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目 の Glyを Argに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 44番目の Lysを Asnに、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、および
27番目の Glyを Phe【こ、 30番目の Serを Thr【こ、 45番目の Glyを Arg【こ、 49番目 の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したァミノ 酸配列、
などがあげられる。 5つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の Vヽずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の
27番目の Glyを Pheに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Phe【こ、 41番目の Proを Phe【こ、 45番目の Glyを Arg【こ、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 41番目の Proを Pheに、 49番目の lieを Metに、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Phe【こ、 44番目の: Lysを Asn【こ、 45番目の Glyを Arg【こ、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 49番目の lieを Metに、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 45番目の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 45番目の Glyを Argに、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目の Glyを Argに、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 44番目の Lysを Asnに、 49番目の lieを Metに、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 45番目の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Phe【こ、 30番目の Serを Thr【こ、 41番目の Proを Phe【こ、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、 27番目の Glyを Phe【こ、 30番目の Serを Thr【こ、 44番目の: Lysを Asn【こ、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Phe【こ、 30番目の Serを Thr【こ、 45番目の Glyを Arg【こ、 72番目 の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、および
27番目の Glyを Pheに、 30番目の Serを Thrに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
4つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の V、ずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の、
27番目の Glyを Pheに、 41番目の Proを Pheに、 72番目の Valを Argに、および 9 7番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 72番目の Valを Argに、および 9 7番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Phe【こ、 45番目の Glyを Arg【こ、 72番目の Valを Arg【こ、お Jび 97 番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Pheに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97 番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 72番目の Valを Argに、および 97 番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 44番目の Lysを Asnに、 72番目の Valを Argに、および 9 7番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 45番目の Glyを Argに、 72番目の Valを Argに、および 97 番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97 番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glyを Phe【こ、 30番目の Serを Thr【こ、 72番目の Valを Arg【こ、および 97 番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、
27番目の Glvを Phe【こ、 30番目の Serを Thr【こ、 41番目の Proを Phe【こ、および 9 7番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、および
41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番目の Glyを Argに、および 4 9番目の lieを Metに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
[0050] 3つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の
V、ずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の
27番目の Glyを Phe〖こ、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置 換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換 したアミノ酸配列、および
27番目の Glyを Pheに、 41番目の Proを Pheに、および 97番目の Alaを Thrに置 換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
[0051] 2つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の
V、ずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の
72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列、およ び
27番目の Glyを Pheに、および 30番目の Serを Thrに置換したアミノ酸配列、 などがあげられる。
1つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 30〜35の
V、ずれか 1つで示されるアミノ酸配列中の
27番目の Glyを Pheに置換したアミノ酸配列、
30番目の Serを Thrに置換したアミノ酸配列、
41番目の Proを Pheに置換したアミノ酸配列、
44番目の Lysを Asnに置換したアミノ酸配列、
45番目の Glyを Argに置換したアミノ酸配列、
49番目の lieを Metに置換したアミノ酸配列、
72番目の Valを Argに置換したアミノ酸配列、および 97番目の Alaを Thrに置換したアミノ酸配列
があげられる。
[0052] 抗体の VLにおいて、配列番号 36で示されるアミノ酸配列中の 3番目の Gln、 5番目 の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の： Leu、 70番目の Phe、 71番目の T hrおよび 77番目の Leuから選ばれる少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換 されたアミノ酸配列としては、導入される改変の数は、特に制限はないが、好ましくは 3番目の Gln、 5番目の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の： Leu、 70番目 の Phe、および 77番目の Leuが、さらに好ましくは 46番目の Leu、 70番目の Phe、お よび 77番目の Leu力 最も好ましくは 46番目の Leu、および 70番目の Pheが置換さ れたアミノ酸配列があげられる。
抗体の VLにおいて、配列番号 36で示されるアミノ酸配列中の 3番目の Gln、 5番目 の Thr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の： Leu、 69番目の Asp、 70番目の P he、 71番目の Thr、および 77番目の Leuから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基 が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列としては、配列番号 36で示されるァミノ 酸配列中の 3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42 番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番目の Ph eを Tyrに、 71番目の Thrを Serに、および 77番目の Leuを Metに置換する改変から 選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列があげられる。
[0053] 9つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の 3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Phe に、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番 目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに、および 77番目の Leuを Metに置換した アミノ酸配列などがあげられる。
[0054] 8つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の
5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、 46番目のし euを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Ser に、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、 3番目の Ginを Valに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Ser に、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leu を Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに、 および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 46番目の Le uを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに 、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の A1 aを Serに、 69番目の Aspを Serに、 70番目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに 、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の A1 aを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに 、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の A1 aを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 71番目の Thrを Serに 、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の A1 aを Ser【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 69番目の Aspを Ser【こ、 70番目の Pheを Tyr【こ 、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の A1 aを Ser【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 69番目の Aspを Ser【こ、 70番目の Pheを Tyr【こ 、および 71番目の Thrを Serに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
7つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の 3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Phe に、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列などがあげられる。
[0056] 6つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の A1 aを Serに、 46番目の Leuを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸 配列、
3番目の Ginを Valに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したァミノ 酸配列、
5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、 46番目のし euを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したァミノ 酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 46番目の Le uを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸 配列、および
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leu を Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配 列、
などがあげられる。
[0057] 5つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の
3番目の Ginを Valに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、 46番目のし euを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
35番目の Tyrを Phe【こ、 42番目の Alaを Ser【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 70番目 の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 46番目の Le uを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leu を Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Val【こ、 35番目の Tyrを Phe【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
5番目の Thrを lie【こ、 35番目の Tyrを Phe【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 70番目の P heを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
5番目の Thrを lieに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の P heを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の Ph eを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、および
42番目の Alaを Ser【こ、 46番目の： Leuを Trp【こ、 69番目の Aspを Ser【こ、 70番目 の Pheを Tyrに、および 71番目の Thrを Serに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
4つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の
3番目の Ginを Valに、 35番目の Tyrを Pheに、 46番目の Leuを Trpに、および 70 番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、および 70 番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
5番目の Thrを lie【こ、 35番目の Tyrを Phe【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、および 70 番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
5番目の Thrを lieに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、および 70番 目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
35番目の Tyrを Phe【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 70番目の Pheを Tyr【こ、および 7 7番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 7 7番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 46番目の Leuを Trpに、および 70番 目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
3番目の Ginを Valに、 46番目の Leuを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77 番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、および
5番目の Thrを lie【こ、 46番目の: Leuを Trp【こ、 70番目の Pheを Tyr【こ、および 77 番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
[0059] 3つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の
3番目の Ginを Valに、 46番目の Leuを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換 したアミノ酸配列、
5番目の Thrを lieに、 46番目の Leuを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換し たアミノ酸配列、
46番目の Leuを Trpに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置 換したアミノ酸配列、
35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、および 46番目の Leuを Trpに置 換したアミノ酸配列、および
42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置 換したアミノ酸配列などがあげられる。
[0060] 2つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の
46番目の Leuを Trpに、および 70番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、 3番目の Ginを Valに、および 5番目の Thrを lieに置換したアミノ酸配列、および 70番目の Pheを Tyr、および 77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、 などがあげられる。
[0061] 1つの改変が導入されたアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号 36で示され るアミノ酸配列中の
3番目の Ginを Valに置換したアミノ酸配列、
5番目の Thrを lieに置換したアミノ酸配列、
35番目の Tyrを Pheに置換したアミノ酸配列、
42番目の Alaを Serに置換したアミノ酸配列、
46番目の Leuを Trpに置換したアミノ酸配列、
69番目の Aspを Serに置換したアミノ酸配列、
70番目の Pheを Tyrに置換したアミノ酸配列、
71番目の Thrを Serに置換したアミノ酸配列、および
77番目の Leuを Metに置換したアミノ酸配列、
などがあげられる。
本発明のヒトイ匕抗体の VHとしては、具体的には配列番号 51〜56に表されるいず れかのアミノ酸配列があげられる力 好ましくは、配列番号 51、 53、 55および 56に表 される 、ずれかのアミノ酸配列があげられ、よりこの好ましくは配列番号 53で表される アミノ酸があげられる。
本発明のヒトイ匕抗体の VLとしては、具体的には配列番号 58〜63に表されるいず れかのアミノ酸配列があげられる力 好ましくは、配列番号 58、 59、 60、 62および 63 に表されるいずれかのアミノ酸配列があげられ、より好ましくは配列番号 62で表され るアミノ酸配列があげられる。
本発明のヒトイ匕抗体としては、上述のアミノ酸配列を有する VHおよび VL力 なるヒ トイ匕抗体があげられるが、具体的には、
VHが配列番号 53、 VLが配列番号 59に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体
VHが配列番号 53、 VLが配列番号 60に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体 VHが配列番号 55、 VLが配列番号 62に表されるアミノ酸配列を有するヒトイ匕抗体
VHが配列番号 51、 VLが配列番号 58に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体 VHが配列番号 53、 VLが配列番号 58に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体
VHが配列番号 53、 VLが配列番号 63に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体
VHが配列番号 56、 VLが配列番号 62に表されるアミノ酸配列を有するヒトイヒ抗体
VHが配列番号 53、 VLが配列番号 62に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体 があげられる。より好ましくは、
VHが配列番号 55、 VLが配列番号 62に表されるアミノ酸配列を有するヒトイ匕抗体
VHが配列番号 51、 VLが配列番号 58に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体 VHが配列番号 53、 VLが配列番号 58に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体 VHが配列番号 53、 VLが配列番号 63に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体
VHが配列番号 56、 VLが配列番号 62に表されるアミノ酸配列を有するヒトイヒ抗体 VHが配列番号 53、 VLが配列番号 62に表されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体 などがあげられる。
[0062] また、本発明の遺伝子組換え抗体としては、ハイプリドーマ KM3411 (FERM BP
- 8643)力 生産されるモノクローナル抗体が認識するェピトープに結合する遺伝 子組換え抗体も包含される。
本発明の抗体断片としては、 Fab、 F (ab' ) 、 Fab，、 scFv、 diabody, dsFvおよび
2
CDRを含むペプチドなどがあげられる。
[0063] Fabは、 IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の 22 4番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフィ ド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fabは、本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列 を有さな ヽ、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造 を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体の VHおよび VLを コードする cDNAを取得し、該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現べク ターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真 核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0064] F (ab' ) は、 IgGのヒンジ領域の 2個のジスルフイド結合の下部を酵素ペプシンで分
2
解して得られた、 2つの Fab領域力 Sヒンジ部分で結合して構成された、分子量約 10万 の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明の F (ab，） は、下記の Fab，をチォエーテル結合あるいはジスルフイド結合
2
させ、作製することができる。
[0065] & は、上記 （& ） のヒンジ領域のジスルフイド結合を切断した分子量約 5万の
2
抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明の Fab，は、本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配 列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構 造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体の VHおよび VL をコードする cDNAを取得し、該抗体の Fab，断片をコードする DNAを原核生物用 発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あ るいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0066] scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する）を 用いて連結した、 VH— P—VLないしは VL— P—VHポリペプチドで、抗原結合活 性を有する抗体断片である。
本発明の scFvは、本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配 列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構 造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体の VHおよび VL をコードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物 用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核 生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0067] diabodyは、 scFvが二量体ィ匕した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗 体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗 原結合活性とすることもできる。
本発明の diabodyは、 scFvをコードする DNAを Pのアミノ酸配列の長さが 8残基以 下となるように構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターある 、は真核生物用発現 ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによ り発現させ、製造することができる。
[0068] dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポ リペプチドを該システィン残基間のジスルフイド結合を介して結合させたものをいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 [Protein En gineering, 7, 697 (1994)〕に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択するこ とがでさる。
[0069] 本発明の dsFvは、本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配 列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構 造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体の VHおよび VL をコードする cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物 用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核 生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0070] CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構 成される。複数の CDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカ一を介し て結合させることができる。
本発明の CDRを含むペプチドは、本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合する コンセンサス配列を有さない、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体の VHおよび VLの CDRをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現べクタ 一あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは 真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0071] また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc法（フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法） 、 tBoc法 (t ブチルォキシカルボニル法)などの化学合成法によって製造することも できる。
本発明の遺伝子組換え抗体は、本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合するコ ンセンサス配列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領 域の立体構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体また は抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学 的あるいは遺伝子工学的に結合させた融合抗体を包含する。
[0072] 本発明の融合抗体は、本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス 配列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体 構造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断 片の H鎖あるいは L鎖の N末端側あるいは C末端側、抗体またはその抗体断片中の 適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖などに放射性同 位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などをィ匕学的手法 [抗体工学入門、 金光修著、地人書館（1994) ]により結合させることにより製造することができる。
[0073] また、本発明の融合抗体は、可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配 列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構 造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断片 をコードする DNAと、結合させたい蛋白質をコードする DNAを連結させて発現用べ クタ一に挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより 製造することができる。
[0074] 放射性同位元素としては、 1311、 1251などがあげられ、例えば、クロラミン T法などによ り抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン'マスタード、サイクロフォスフアミドなどのアル キル化剤、 5—フルォロウラシル、メソトレキセートなどの代謝括抗剤、ダウノマイシン 、ブレオマイシン、マイトマイシン C、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物ァノレカロイド、タモキシフェン 、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤 [臨床腫瘍学、 日本臨床腫瘍研究会 編、癌と化学療法社（1996) ]、またはハイド口コーチゾン、プレドニゾンなどのステロ イド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チォマレート、ぺ-シラミン などの免疫調節剤、サイクロフォスフアミド、ァザチォプリンなどの免疫抑制剤、マレイ ン酸クロルフエ-ラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤 [炎症と抗 炎症療法、医歯薬出版株式会社（1982) ]などがあげられる。例えば、ダウノマイシン と抗体を結合させる方法としては、ダルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗 体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルポジイミドを介してダウノマイシンのアミ ノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
[0075] 高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール (以下、 PEGと表記する）、アルブミ ン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビュルピロリ ドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの 高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（1)化学的、物理的あ るいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（2)血中半減期の顕著な延長 、（3)免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される [バイオコンジュ ゲート医薬品、廣川書店（1993) ]。例えば、 PEGと抗体を結合させる方法としては、 PEG化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる [バイオコンジュゲート医薬品、 廣川書店（1993) ]。 PEG化修飾試薬としては、リジンの ε —ァミノ基の修飾剤 (特開 昭 61— 178926)、ァスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤 ( 特開昭 56— 23587)、アルギニンのグァ -ジノ基の修飾剤（特開平 2— 117920)な どがあげられる。
[0076] 蛋白質としては、免疫担当細胞を活性ィ匕するサイト力イン、例えば、ヒトインターロイ キン 2、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激 因子、ヒトインターロイキン 12などがあげられる。また、癌細胞を直接傷害する活性を 有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との 融合抗体については、抗体または抗体断片をコードする cDNAに蛋白質をコードす る cDNAを連結させ、融合抗体をコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物ある いは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生 物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
[0077] 融合抗体を検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬として使用す る場合の薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体があ げられる。標識体としては、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼ、ルシフェラ ーゼなどの酵素、アタリジ-ゥムエステル、口フィンなどの発光物質、フルォレシン 'ィ ソチアネート（FITC)、 RITCなどの蛍光物質などがあげられる。
[0078] 以下に、本発明の遺伝子組換え抗体の製造方法について、具体的に説明する。
1.ハイプリドーマが産生する、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗 PERPモノクロ ーナル抗体の作製
(1)抗原の調製
本発明において用いられるポリペプチドは、 [Molecular Cloning, A Laborat ory Manual, second Edition (Cold spring Harbor Laboratory Press , 1989)、 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & So ns, 1987— 1997) ]などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、 該ポリペプチドをコードする DNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる
[0079] まず、該ポリペプチドをコードする cDNAを含む完全長 cDNAを適当な発現べクタ 一のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際も し必要であれば、完全長 cDNAをもとにしてポリペプチドをコードする部分を含む適 当な長さの DNA断片を調製し、上記完全長 cDNAの代わりに該 DNA断片を使用し てもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入 することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
[0080] 宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるもので あれば!/、ずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製または染色体中への 組込が可能で、ポリペプチドをコードする DNAを転写できる位置に適当なプロモー ターを含有して ヽるものが用いられる。 [0081] 大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合には、該組換えベクターは、 原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、 本発明にお 、て用いられる DNAおよび転写終結配列を含むベクターであることが好 ましい。該組換えベクターは、さら〖こ、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいても よい。
発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれも Roche D iagnostics社製）、 pKK233— 2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX- 1 (Promega社製）、 pQE— 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58 — 110600)、 pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (198 4) ]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989) ]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985) ]、 pBluescript II SK (-) (Stratagene 社製）、 pTrs30 [大腸菌 JM109ZpTrS30 (FERM BP— 5407)より調製]、 pTrs 32 [大腸菌 JM109ZpTrS32 (FERM BP— 5408)より調製]、 pGHA2 [大腸菌 I GHA2 (FERM BP— 400)より調製、特開昭 60— 221091]、 pGKA2 [大腸菌 I GKA2 (FERM BP— 6798)より調製、特開昭 60— 221091]、 pTerm2 (US468 6191、 US4939094, US5160735) , pSupex, pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG 400 Ci. Bacteriol. , 172, 2392 (1990) ]、 pGEX(Pharmacia社製）、 pETシステ ム（Novagen社製）、 pME18SFL3などをあげることができる。
[0082] プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいか なるものでもよい。例えば、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモーター、 PLプロモー ター、 PRプロモーター、 T7プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来する プロモーターなどをあげることができる。また、 Ptrpを 2つ直列させたタンデムプロモ 一ター、 tacプロモーター、 lacT7プロモーター、 letlプロモーターなどのように、人為 的に設計改変されたプロモーターも用いることができる。
[0083] また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン'ダルガルノ
(Shine Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜 18塩基）に 調節したプラスミドを用いることが好ま U、。本発明にお 、て用いられるポリペプチド をコードする DNAの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるよう に塩基を置換することができ、これにより、 目的とするポリペプチドの生産率を向上さ せることができる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結 配列は必ずしも必要ではな 、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置すること が好ましい。
[0084] このような宿主細胞として用いられる原核生物としては、例えば、ェシエリヒア属など に属する原核生物を用いることができ、具体的には大腸菌 XL1— Blue、大腸菌 XL2 -Blue,大腸菌 DH1、大腸菌 MC1000、大腸菌 KY3276、大腸菌 W1485、大腸 菌 JM109、大腸菌 HB101、大腸菌 No. 49、大腸菌 W3110、大腸菌 NY49などが 用!/、ることができる。
[0085] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) , Gene, 17, 107 (1982)、 Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) ]に記載の方法などをあげることができる。
[0086] 本発明において用いられるポリペプチドを大腸菌で生産した場合には、ベクターの 種類により該ポリペプチドは、細胞質内に可溶型として、細胞質内に不溶性顆粒とし てまたはペリプラズミックスペースに可溶型としてなどの発現様式で発現させることが できる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAI、 p cDM8 (フナコシ社より市販）、 pAGE107 [特開平 3— 22979 ;Cytotechnology, 3 , 133, (1990) ]、 pAS3— 3 (特開平 2— 227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840 , (1987) ]、 pcDNAl/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pA GE103 C1. Biochemistry, 101, 1307 (1987) ]、 pAGE210、 pME18SFL3など をあげることができる。
[0087] プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用い ることができ、例えば、サイトメガロウィルス (CMV)の IE (immediate early)遺伝子 のプロモーター、 SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチ ォネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーターなどをあげるこ とができる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いて ちょい。
[0088] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である COS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637細胞（特 開昭 63 - 299)などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 1 33 (1990) ]、リン酸カルシウム法（特開平 2— 227075)、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987) ]などをあげ、ること力 Sできる。
[0089] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 [Molecular Cloning, A Lab oratory Manual, second Edition (Cold spring Harbor Laboratory Pr ess, 1989) ]に記載されている方法などに準じて、分泌生産、融合蛋白質発現など を行うことができる。真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が 付加されたポリペプチドを得ることができる。
[0090] 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチド を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明において用いられるポリ ペプチドを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の 培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル β D チォガラタトピラノシドなどを、 trpプロモーターを用 いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸 などを培地に添加してもよ ヽ。
[0091] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical Associ ation, 199, 519 (1967) ]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952) ]、 ダルベッコ改変 MEM培地 [Virology, 8, 396 (1959) ]、 199培地 [Proc. Soc. E xp. Biol. Med. , 73, 1 (1950) ]またはこれら培地に牛胎児血清などを添カ卩した培 地などを用いることができる。培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下な
2 どの条件下で 1〜7日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン などの抗生物質を培地に添加してもよい。
[0092] 上記のとおり、本発明において用いられるポリペプチドをコードする DNAを組み込 んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞など由来の形質転換体を、通常の 培養方法に従って培養して該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より採取するこ とにより、本発明にお 、て用いられるポリペプチドを製造することができる。
ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分 泌させる方法、および宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞 から、適切な方法を選択することができる。また、任意の蛋白質と蛋白質工学的に融 合させて融合ポリペプチドとして発現させて生産させてもよい。
[0093] ポリペプチドが宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンら の方法 Q[. Biol. Chem. , 264, 17619 (1989) ]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)、特開平 05— 336963または WO94Z23021]などに記載の方法を準用することにより、該 遺伝子産物を宿主細胞外に積極的に分泌させることもできる。また、特開平 2— 227 075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺 伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0094] ポリペプチドは、例えば、以下のようにして、上記の培養物などから単離'精製する ことができる。
ポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心 分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントン ガウリンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精 製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA— 75 (三菱化学社 製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— Sepharose FF (P harmacia社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセフ ァロース、フエ-ルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分 子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシン グ法、等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用 い、精製標品を得ることができる。
[0095] また、ポリペプチドが細胞質内に不溶性顆粒を形成して発現した場合は、同様に細 胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ポリペプチドの不溶 性顆粒を回収する。回収した該蛋白質の不溶性顆粒を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する 。該可溶ィ匕液を希釈または透析することにより、該蛋白質を正常な立体構造にまき戻 した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
[0096] ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる 。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離などの手法により処理することにより、固 形物を取り除いた培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を 用いることにより、精製標品を得ることができる。
[0097] また、本発明にお 、て用いられるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分ペプチド は、 Fmoc法（フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシ カルボニル法)などの化学合成法によっても製造することができる。また、 Advanced ChemTech社、ノ ーキン'エノレマ一社、 Pharmacia社、 Protein Technology I nstrument社、 Synthecell—Vega社、 PerSeptive社、島津製作所などのぺプチ ド合成機を利用して化学合成することもできる。
上記の方法により得られるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分配列を有する ペプチドを抗原として用いることができる。
[0098] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターなどに上記のように調製した抗原を免 疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
[0099] 免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例え ば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant)や水酸化ァ ルミ-ゥムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原 が部分ペプチドである場合には、 BSA (ゥシ血清アルブミン）や KLH (Keyhole Li mpet hemocyanin)などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原 として用いる。
[0100] 抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 5〜： L0回行う。各投与後 3〜7 日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔A ntibodies— A Laboratory Manual (し old spring Harbor Laboratory, 19 88)〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマ ウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として用いる。
[0101] ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。該 ポリクローナル抗体力 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の 立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する活性を有して ヽることは 、後述（6)に記載の方法で調べることができる。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後 3〜7 日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などの抗体産生細胞を含む 組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を ME M培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200rpm、 5分 間）した後、上清を捨て、トリス一塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (pH7. 65)で 1〜2分間処 理し赤血球を除去し、 MEM培地で 3回洗浄して融合用抗体産生細胞として提供す る。
[0102] (3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、 8—ァザ グァニン耐性マウス（BALBZcマウス由来）骨髄腫細胞株 P3— X63Ag8— U1 (P3 — U丄ノ [じ urrent Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (19 / 8 ) ]、 P3— NS 1/1— Ag41 (NS— l) [European J. Immunology, 6, 511 (19 76) ]、 SP2Z0— Agl4 (SP— 2) [Nature, 276, 269 (1978) ]、 P3—X63—Ag8 653 (653) [J. Immunology, 123, 1548 (1979) ]、 P3—X63—Ag8 (X63) [Na ture, 256, 495 (1975) ]など力用いられる。これらの細胞株は、 8—ァザグァニン 培地〔RPMI— 1640培地にグルタミン（1. 5mmolZL)、 2—メルカプトエタノール（5 X 10" mol/L)、ジヱンタマイシン（10 μ g/ml)および牛胎児血清（FCS)をカロえ た培地（以下、正常培地という。）に、さらに 8—ァザグァニン（15 gZml)をカ卩えた 培地〕で継代する力 細胞融合の 3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日 2 X 107 個以上の細胞数を確保する。
[0103] (4)細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞を MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1 . 83g、リン酸一カリウム 0. 21g、食塩 7. 65g、蒸留水 1リットル、 pH7. 2)でよく洗浄 し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞 = 5〜10 : 1になるよう混合し、遠心分離（ 1200rpm、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しな がら、 37°Cで、ポリエチレングライコ一ルー 1000 (PEG— 1000) 2g、 MEM 2mL およびジメチルスルホキシド 0. 7mLの混液 0. 2〜lmLを、 1 X 108個の抗体産生細 胞にカロえ、 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mLを数回加えた後、 MEM培地を加えて 全量が 50mLになるようにする。遠心分離（900rpm、 5分間）後、上清を捨て、ゆる やかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を HA T培地〔正常培地にヒポキサンチン（10_4molZL)、チミジン（1. 5 X 10"5mol/L) およびアミノプテリン (4 X 10_7molZL)をカ卩えた培地〕 lOOmL中に懸濁する。この 懸濁液を 96ゥエル培養用プレートに 100 LZゥエルずつ分注し、 5%COインキュ
2 ベータ一中、 37°Cで 7〜14日間培養する。
[0104] 培養後、培養上清の一部をとり後述するハイプリドーマの選択方法により、 PERP 遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、 かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを含むゥエルを選択す る。ついで、限界希釈法によりクローユングを 2回繰り返し〔1回目は、 HT培地 (HAT 培地力もアミノプテリンを除いた培地）、 2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強 い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ株として選択す る。
[0105] (5)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2, 6, 10, 14ーテトラメチルペンタデカン（Pristane) O. 5mLを腹 腔内投与し、 2週間飼育する〕した 8〜： L0週令のマウスまたはヌードマウスに、（4)で 得られた抗 PERPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 2 X 106〜5 X 107細 胞 Z匹を腹腔内注射する。 10〜21日でハイプリドーマは腹水癌化する。このマウス 力も腹水を採取し、遠心分離 (3000rpm、 5分間）して固形分を除去後、 40〜50% 硫酸アンモ-ゥムで塩祈した後、力プリル酸沈殿法、 DEAE—セファロースカラム、プ 口ティン A—力ラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、 IgGあるいは、 IgM 画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法に より行う。蛋白量の定量は、ローリー法および 280nmでの吸光度より算出する。
[0106] (6)ハイプリドーマの選択方法
PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に 認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイプリドーマを選択する方 法としては、以下の方法があげられる。
[0107] 天然型の立体構造を保っている PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細 胞外領域に結合できる性質の抗体を選択するには、 PERP遺伝子によりコードされる ポリペプチドがヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内から榭立された細胞株また は遺伝子組換え技術により得られた細胞に対する結合性を調べることができる方法 であれば!/、ずれでもよぐ FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステム社） を用いる蛍光抗体染色法やフローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法などの方法 があげられる。具体的な方法としては、実施例 4の（3)または実施例 5の（2)に記載の 方法などがあげられる。
[0108] また、これらの反応性を確認するための方法は、公知の免疫学的測定法 [Monocl onal Antibodies― Principles and practice, Thira edition, Academic Press (1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) ]、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイェンティフィ ック（ 1987) ]などを組み合わせることもできる。
[0109] PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドがヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト 体内から榭立した細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、前 述した細胞があげられる力 該ポリペプチドの発現の有無が明らかである遺伝子組 換え技術により得られた PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞 を用いるのが好ましい。このような、遺伝子組換え技術により得られた細胞は、陰性対 照として該ポリペプチドが発現して 、な 、細胞の調製が容易である。
[0110] 前述の方法で選択される、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外 領域の立体構造を認識するモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマの具体例 としては、モノクローナル抗体 KM3411を生産するハイブリドーマ細胞株 KM3411 などがあげられる。ハイプリドーマ KM3411は平成 16年 2月 24日付でブタペスト条 約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許性物寄託センター (日本国 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM BP— 8643として寄託されて いる。
[0111] 2. V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗 体の作製
V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有する抗体の当該コンセン サス配列に改変を導入することにより、抗体の V領域に N結合型糖鎖が結合するコン センサス配列を有さな 、抗体を作製することができる。以下にその作製例を示す。
[0112] (1)V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有する抗体の V領域をコ ードする遺伝子配列またはアミノ酸配列の解析
V領域の遺伝子配列またはアミノ酸配列を解析することにより、 N結合型糖鎖が結 合するコンセンサス配列である、 Asn— Xaa Ser/Thr (Xaaは任意のアミノ酸残基 を、 SerZThrは Ser残基または Thr残基であることをそれぞれ示す）力 V領域に含 まれて!/、るか否かを調べる。
[0113] V領域の遺伝子配列は、例えば、以下のようにして抗体の VHおよび VLをコードす る cDNAをクローユングすることにより、決定することができる。抗体のアミノ酸配列は 、上記の cDNAの遺伝子配列力 推定する力、または、抗体を直接ペプチドシーケ ンサ一などを用いて解析することにより決定できる [Molecular Cloning, A Lab oratory Manual, second Edition (Cold spring Harbor Laboratory Pr ess, 1989) ]。
[0114] 以下にマウス抗体などを産生するハイプリドーマから、抗体可変領域をコードする c DNAをクローニングする方法を示す。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞より mRNAを抽出し、 cDNAを合成 する。合成した cDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローユングして c DNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体の C領域部分或いは V 領域部分をコードする DNAをプローブとして用い、 VHまたは VLをコードする cDN Aを有する組換えファージ或 、は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファ ージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体の VHまたは VLの全塩基配 列をそれぞれ決定し、塩基配列より VHまたは VLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定 する。
[0115] ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ノ、ムスター、ラビットなどのハイプリドーマ細 胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ノ、イブリドーマ細胞力も全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァ-ジン —トリフルォロ酢酸セシウム法 [Methods in Enzymol. , 154, 3 (1987) ]、また 全 RNAから mRNAを調製する方法としては、オリゴ (dT)固定ィ匕セルロースカラム法 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ]等があげられる。また、ハイプリドー マ細胞から mRNAを調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Ki t (Invitrogen社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製 )等があげられる。
[0116] cDN Aの合成および cDN Aライブラリ一作製法としては、常法 [Molecular Cloni ng, A Laboratory Manual, second Edition (Cold spring Harbor La b oratory Press, 1989)； Current Protocols in Molecular Biology) , Su pplement 1 34]、或いは市販のキット、例えば、 Super Script™ Plasmid S ystem for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製;） や ZAP— cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製）を用いる方法等があげられる
[0117] cDNAライブラリーの作製の際、ハイプリドーマ細胞カゝら抽出した mRNAを铸型と して合成した cDNAを組み込むベクターは、該 cDNAを組み込めるベクターであれ ばいかなるものでも用いることができる。例えば、 ZAP Express [Strategies, 5, 5 8 (1992) ]、 pBluescript II SK ( + ) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1 989) ]、 λ ZAPII (Stratagene社製）、 gtlO、 l gtl l [DNA Cloning : A Prac tical Approach, I, 49 (1985) ]、 Lambda
BlueMid (Clontech社製）、 λ ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 pcD2 [Mol. Cell. Biol. , 3, 280 (1983) ]および pUC18 [Gene, 33, 103 (1985) ] 等が用いられる。
[0118] ファージ或いはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入する大 腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであれば！/、か なるものでも用いることができる。例えば、 XL1— Blue MRF' [Strategies, 5, 81 ( 1992) ] , C600 [Genetics, 39, 440 (1954) ] , Y1088, Y1090 [Science, 222 , 778 (1983) ]、 NM522 Q1. Mol. Biol. , 166, 1 (1983) ]、 K802 Q[. Mol. Biol . , 16, 118 (1966) ]および JM105 [Gene, 38, 275 (1985) ]等力 ^用!ヽられる。
[0119] cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLをコードする cDN Aクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロ ^ ~ ·ハイブリダィゼーシヨン法或いはプラーク'ノヽィブリダィゼーシヨン法 [Molecula r し lonmg, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Ha rbor Laboratory Press, 1989) ]により選択することができる。また、プライマーを 調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを铸型として、 Polym erase Chain Reaction [以" h、 PCRと表 tiする； Molecular Cloning, A Labo ratory Manual, Second Edition^ Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess (1989) ； Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 - 34]により VHまたは VLをコードする cDNAを調製することもできる。
[0120] 上記方法により選択された cDNAを、適当な制限酵素等で切断後、 pBluescript SK ( -) (Stratagene社製)等のプラスミドにクローユングし、通常用いられる塩基配 列解析方法、例えば、サンガー（Sanger, F. )らのジデォキシ法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) ]等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例 えば、 A. L. F. DNAシークェンサ一（Pharmacia社製）等を用いて解析することで 該 cDNAの塩基配列を決定することができる。
[0121] 決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の 抗体の VHおよび VLの全アミノ酸配列 [Sequences of Proteins of Immunolo gical Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]と比較す ることにより、取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完 全なアミノ酸配列をコードして ヽるかをそれぞれ確認することができる。分泌シグナル 配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体の V Hおよび VLの全アミノ酸配歹 IJ [Sequences of Proteins of Immunological I nterest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]と比較することに より、分泌シグナル配列の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれら が属するサブグループを知ることができる。また、 VHおよび VLの各 CDRのアミノ酸 配列についても、既知の抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列 [Sequences of Pro terns of Immunological Interest, US Dept. Healtn and Human Servi ces (1991) ]と比較することによって見出すことができる。
[0122] 更に VHおよび VLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、 S WIS S— PROTや PIR— Protein等に対して BLAST法 ϋ. Mol. Biol. , 215, 403 (1990) ]等の配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
[0123] (2) V領域に Ν結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗 体の作製
V領域に、 Ν結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列 (Asn— Xaa— SerZThr)を 有さな 、抗体の V領域は、 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列の Asn残基お よび Zまたは Ser残基 ZThr残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、作製する ことができる。
[0124] 抗体の V領域、特に CDRは、抗体の抗原への結合性を規定する重要な領域であ る。従って、抗体の V領域、特に CDRにおける、任意のアミノ酸残基への置換は、抗 体の抗原への結合性が変化してしまう可能性がある。従って、上記コンセンサス配列 を有さな ヽ V領域を作製する際には、抗体の抗原への結合性が変化しな ヽアミノ酸 配列に改変する必要がある。その具体的な方法を以下に示す。 [0125] V領域の N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列中の Asn残基、並びに Ser残 基または Thr残基を抗体の抗原への結合性が変化しな ヽアミノ酸配列に改変するた めには、直接抗原との結合に影響する改変や抗体の立体構造に変化を及ぼし、間 接的に抗原との結合に影響する改変を除外する必要がある。
直接抗原との結合に影響する改変や抗体の立体構造に変化を及ぼし、間接的に 抗原との結合に影響する改変を除外するためには、抗原への結合性に影響を与える 可能性の少ないアミノ酸残基の部位特異的変異を如何に効率よく予測するかが、最 も重要である。そのために X線結晶解析 Q[. Mol. Biol. , 112, 535 (1977) ]或い はコンピューターモデリング [Protein Engineering, 7, 1501 (1994) ]等による抗 体の立体構造の構築および解析を行う。しかしながら、これら抗体の立体構造の情 報に基づいても、抗体の V領域、特に CDRへの変異の導入は、抗体の抗原への結 合性を変化させる可能性がある。そのため、変異の導入に際しては、数種の改変体 を作製し、アミノ酸の改変との抗原結合活性との相関を検討する等の、試行錯誤が必 要である。
[0126] このようにして、抗体の抗原への結合性に影響を与える可能性の少な 、アミノ酸残 基の部位特異的変異を推定した後、変異が導入された抗体 V領域のアミノ酸配列を コードする DNA配列を設計する。設計した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長 さからなる数本の合成 DNAを合成し、それらを用いて PCRを行う。この場合、 PCR での反応効率および合成可能な DNAの長さから、 H鎖、 L鎖とも 6本の合成 DNAを 設計することが好ましい。
[0127] また、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入 することで、後述する本項（3)— 1に記載のヒト抗体の CHおよび CLをコードする DN Aが組み込まれた抗体発現用ベクターに容易に変異が導入された抗体 V領域のアミ ノ酸配列をコードする DNAをクローニングすることができる。
PCR後、増幅産物を pBluescript SK (—）（Stratagene社製）等のプラスミドにそ れぞれクローユングし、本項（1)に記載の方法により塩基配列を決定し、抗体の V領 域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体の V領 域のアミノ酸配列をコードする DNA配列を有する cDNAを含むプラスミドが取得され たことを確認する。
[0128] または、変異を導入する基となった抗体の V領域をコードする cDNAにクンケル法 などの公知の部位特異的変異導入法 [Molecular Cloning, A Laboratory Ma nual, Second Edition^ Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989] を用いたり、変異を導入する基となった抗体の V領域をコードする cDNA中に存在す る制限酵素認識部位を利用して、 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を含む 部分のアミノ酸配列をコードする DNAに、 PCR等で変異を導入し、変異を導入する 基となった抗体の V領域をコードする cDNAと置換して、設計した DNA配列を有す る cDNAを含むプラスミドを作製することもできる。
[0129] V領域のアミノ酸残基は、上記のようにして得られた遺伝子組換え抗体の VHまた は VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列を有する cDNAを含むプラスミドの塩基 配列を本項（1)に記載の方法により決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
[0130] (3)遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作 製方法を示す。
(3) - 1 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み込まれた抗体発現用べク ターの構築
ヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み込まれた抗体発現用ベクターと は、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み込まれた動物細胞用発現べク ターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAを それぞれクローユングすることにより構築することができる。
[0131] ヒト抗体の C領域は任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、例えば、ヒト抗 体の γ 1サブクラスの CHおよび κクラスの CLなどがあげられる。ヒト抗体の CHおよ び CLをコードする DNAとしてはェキソンとイントロンからなる染色体 DNAを用いるこ とも、 cDNAを用いることもできる力 cDN Aを用いるのが好ましい。動物細胞用発現 ベクターとしては、ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであ ればいかなるものでも用いることができる。例えば、 pAGE107〔Cytotechnol. , 3, 133 (1990)〕、 pAGE103 ( i. Biochem. , 101, 1307 (1987)、 pHSG274〔Ge ne, 27, 223 (1984)〕、 pKCR〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981 )〕、 pSGlbd2— 4〔Cytotechnol. , 4, 173 (1990)〕、 pSElUKlSedl— 3〔Cyt otechnol. , 13, 79 (1993)〕などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いる プロモーターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーター i. Biochem. , 1 01, 1307 (1987)〕、モロ-一マウス白血病ウィルスの LTR〔Biochem. Biophys. Res. Commun. , 149, 960 (1987)〕、免疫グロブリン H鎖のプロモーター〔Cell, 41, 479 (1985)〕とェンノヽンサ一〔Cell, 33, 717 (1983)〕など力あげゝられる。
[0132] ヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み込まれた抗体発現用ベクターは 、抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター 上に存在するタイプ (タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現 ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体 H鎖お よび L鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点力 タンデム型のヒト抗体の CHお よび CLをコードする DNAが組み込まれた抗体発現用ベクターの方が好ましい Ci. I mmunol. Methods, 167, 271 (1994)〕。タンデム型のヒト抗体の CHおよび CLを コードする DNAが組み込まれた抗体発現用ベクターとしては、 PKANTEX93 (WO 97/10354) , pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)〕など力あげられる。
構築したヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み込まれた抗体発現用べ クタ一は、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の動物細胞での発現に使用できる。
[0133] (3)— 2 ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項（3)— 1に記載のヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み込まれた 抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコードするそれぞれの遺伝子の上 流に、それぞれヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLをコードする cDNAをそれぞ れクロー-ングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト 以外の動物の抗体の VHまたは VLをコードするそれぞれの cDNAを、ヒト以外の動 物の抗体の VHまたは VLの 3，末端側の塩基配列とヒト抗体の CHまたは CLの 5 '末 端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 D NAとそれぞれ連結し、それぞれを本項（3)— 1に記載のヒト抗体の CHおよび CLを コードする DNAが組み込まれた抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコ ードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクロ 一ユングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、 V領域の N 結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列に変異が導入された抗体 VHまたは VLをコ ードする cDNAを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 DNAを用いて PCR法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項（3)— 1に記載のヒト抗体の CHおよ び CLをコードする DNAが組み込まれた抗体発現用ベクターにクローユングすること ちでさる。
(3)— 3 ヒトイ匕抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト化抗体の VHまたは VLをコードする cDNAは、以下の様にして構築することが できる。
まず、 V領域の N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列に変異が導入された抗 体の VHまたは VLの CDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体の VHまたは VLのフレ ームワーク領域 (以下、 FRと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。ヒト抗体 の VHまたは VLの FRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかな るものでも用いることができる。例えば、 Protein Data Bank等のデータベースに 登録されて!ヽるヒト抗体の VHまたは VLの FRのアミノ酸配列、ヒト抗体の VHまたは V Lの FRの各サブグループの共通アミノ酸配列 [Sequences of Proteins of Im munological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ] 等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型 CDR移植抗体を作製する ためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLの FRのアミノ酸配列とでき るだけ高！、相同性 (少なくとも 60%以上)をそれぞれ有するアミノ酸配列を選択するこ とが望ましい。次に、選択したヒト抗体の VHまたは VLの FRのアミノ酸配列に目的の ヒト以外の動物の抗体の VHまたは VLの CDRのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト 化抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を 抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services ( 1991) ]を考慮して DNA配列に変換し、ヒトイ匕抗体の VHまたは VLのアミノ酸配列を コードする DNA配列をそれぞれ設計する。設計した DNA配列に基づき、 100塩基 前後の長さからなる数本の合成 DNAを合成し、それらを用いて PCR法を行う。
[0135] また、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入 することで、本項 (3)— 1で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト化抗体の VHまたは VLをコードする cDNAをクローユングすることができる。 PCR反応後、増 幅産物を pBluescript SK (—）（Stratagene社製）等のプラスミドにそれぞれクロー ニングし、本項（1)に記載の方法により塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体の VHま たは VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列を有するプラスミドを取得する。
[0136] (3)— 4 ヒト化抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、 V領域の N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列に変異が導入さ れた抗体の VHおよび VLの CDRのみをヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただ けでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうこと が知られている [BIOZTECHNOLOGY, 9, 266 (1991) ]。この原因としては、元 のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLでは、 CDRのみならず、 FRのいくつかのァ ミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残 基が CDRの移植に伴!、、ヒト抗体の VHおよび VLの FRの異なるアミノ酸残基へと変 化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗 体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与して 、るァ ミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接 的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動 物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させるこ とが行われている [BIOZTECHNOLOGY, 9, 266 (1991) ]。ヒト化抗体の作製 にお 、ては、それら抗原結合活性に関わる FRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定 する力が、最も重要な点であり、そのために X線結晶解析 Q[. Mol. Biol. , 112, 535 (1977) ]或いはコンピューターモデリング [Protein Engineering, 7, 1501 (1994) ]等による抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の 立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その 一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されておらず、現 状ではそれぞれの抗体につ!、て数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性 との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
[0137] ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸残基は、改変用合成 DN Aを用いて本項（ 3) ー3に記載の PCRを行うことにより、達成できる。 PCR後の増幅産物について本項 (1)に記載の方法により、塩基配列を決定し、 目的の改変が施されたことを確認する
[0138] (3)— 5 ヒト化抗体発現ベクターの構築
本項（3)— 1に記載のヒト抗体の CHおよび CLをコードする DNAが組み込まれた 抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコードするそれぞれの遺伝子の上 流に、構築したヒト化抗体の VHまたは VLをコードする cDNAをそれぞれクローニン グし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
[0139] 例えば、本項（3)— 3および（3)— 4でヒト化抗体の VHまたは VLを構築する際に 用いる合成 DNAのうち、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の 認識配列を導入することで、本項（3)— 1に記載のヒト抗体の CHおよび CLをコード する DNAが組み込まれた抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHまたは CLをコードす るそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクロー- ングすることができる。
[0140] (3)— 6 ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の一過性発現
作製したヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するた めに、本項（3)—3および（3)—5に記載のヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体発現べ クタ一を用いてヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発 現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を発現で きる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる力 その発現量の高さ 力ら、 COS— 7細胞（ATCC CRL 1651)が一般に用いられる [Methods in Nuc leic Acids Res. , CRC press, 283 (1991) ]。 COS— 7細胞への発現ベクター の導入法としては、 DEAE—デキストラン法 [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991) ]、リポフエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987) ]等があげられる。
[0141] 発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の発現量 および抗原結合活性は酵素免疫抗体法 [以下、 ELISA法と表記する； Monoclonal Antibodies― Principles and practice, Third edition, Academic Press ( 1996)、 Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab oratory ( 1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（198 7) ]等により測定できる。
[0142] (3) - 7 ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の安定発現
本項（3)—2および（3)—5に記載のヒト型キメラ抗体発現ベクターまたはヒト化抗体 発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体またはヒト化抗 体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクト口ポレーシヨン法 [特開平 2 — 257891、 Cytotechnology, 3, 133 ( 1990) ]等力あげられる。
[0143] ヒト型キメラ抗体発現ベクターまたはヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞と しては、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれ ば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウス SP2Z0— Agl4細胞 (AT CC CRL1581)、マウス P3X63— Ag8. 653細胞（ATCC CRL1580)、ジヒドロ 葉酸還元酵素遺伝子（以下、 dhfrと表記する）が欠損した CHO細胞 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 ( 1980) ]、レクチン而性を獲得した Lec 13 [Somatic
Cell and Molecular genetics, 12, 55 ( 1986) ]、 a 1—6フコース転移酵素 遺伝子が欠損した CHO細胞（WO05Z35586)、ラット YB2Z3HL. P2. G11. 16 Ag. 20細胞（ATCC CRL1662)などがあげられる。
[0144] 上記宿主細胞の他、細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースの合成に関与する酵素 などの蛋白質、 N—グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端の N—ァセチルダルコサミ ンの 6位にフコースの 1位が oc結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質また は細胞内糖ヌクレオチド GDP—フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質など の活性が低下または欠失した宿主細胞、好ましくは WO05Z35586に記載の a 1— 6フコース転移酵素遺伝子が欠損した CHO細胞などを用いることもできる。
[0145] 発現ベクターの導入後、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体を安定に発現する形質転 ^ttは、特開平 2— 257891に開示されている方法に従い、 G418硫酸塩 (以下、 G 418と表記する： SIGMA社製)等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養するこ とにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、 RPMI 1640培地（Invitrogen社 製）、 GIT培地（日本製薬社製）、 EX— CELL301培地 (JRH社製）、 IMDM培地 (I nvitrogen社製）、 Hybridoma— SFM培地（Invitrogen社製）、またはこれら培地 に牛胎児血清（以下、 FBSと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いる ことができる。得られた形質転 ·を培地中で培養することで培養上清中にヒト型キ メラ抗体またはヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト型キメラ抗 体またはヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は ELISA法等により測定できる。 また、形質転 ·は、特開平 2— 257891に開示されている方法に従い、 dhfr増幅 系等を利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
[0146] ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体は、形質転 ·の培養上清よりプロテイン Aカラム を用いて ffr することができる [Monoclonal Antibodies― Principles and pra ctice, Third edition, Academic Press (1996ノ、 Antibodies— A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ]。また、その他に通常 、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行 、、精製すること ができる。精製したヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体の H鎖、 L鎖或いは抗体分子全 体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [以下、 SDS— PAGEと表記する： N ature, 227, 680 (1970) ]やウェスタンブロッテイング法 [Monoclonal Antibod ies— Principles and practice, Third edition, Academic Press、丄 99oノ、 A ntibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (19 88) ]等で測定することができる。
[0147] 3.本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片の活性評価
精製した本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片の抗原への結合性、 PERP 発現細胞株に対する結合性は ELISA法および蛍光抗体法 [Cancer Immunol. I mmunother. , 36, 373 (1993) ]または BIAcore™などを用いた表面プラズモン 共鳴等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、 CDC活 性、 ADCC活性等を測定し、評価することができる [Cancer Immunol. Immunot her. , 36, 373 (1993) ]。また、これらの結果を、本発明の遺伝子組換え抗体作製 の基となった、上記 1.に記載の、 V領域に改変を導入していない、 PERP遺伝子に よりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細 胞外領域に結合するモノクローナル抗体での測定結果と比較することにより、 V領域 に導入した改変による、抗体の抗原への結合性への影響がわかる。
[0148] 4.本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明の可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、 PER P遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し 、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、 PERP遺伝子 によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療に用いることができる。
[0149] PERP遺伝子が関与する疾患としては、該遺伝子が発現している細胞が関与する 疾患であればいかなるものでもよぐ例えば癌があげられる。癌としては、上皮由来の 癌があげられ、具体的には、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、 直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌または脾臓癌などがあげられる。
[0150] 本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片を有効成分として含有する治療剤に は、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を制御することを特徴とする 治療剤、および ADCC活性や CDC活性、あるいはアポトーシス誘導作用による治療 剤が含まれる。
遺伝子組換え抗体の有する ADCC活性や CDC活性は、例えば、特開平 6— 205 694に記載の方法で測定することができる。このような活性を有する抗体は、 in vivo において、特定の抗原が発現した細胞を傷害することができるため、疾患の治療薬と して用いることができる。ヒ HgGクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト 化抗体およびヒト抗体は治療剤として、有効に用いられる [Cancer Res. , 56, 111 8 (1996) ]。
[0151] 本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、変性を受けていない天然型の P ERP遺伝子によりコードされるポリペプチドを認識することができるので、生体内で存 在する PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現している細胞を認識するこ とができる。従って、本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、 in vivoまた は in vitroにおいて、 PERP遺伝子が発現している細胞を傷害することができる。特 に、 PERP遺伝子は癌において発現が亢進していることから、本発明の遺伝子組換 え抗体または抗体断片は癌の治療剤として使用することができる。また、高い ADCC 活性が付与された本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、 PERP遺伝子 が発現している細胞を減ずる治療に用いられる治療剤として、特に有効に用いられる
[0152] 本発明の遺伝子組換え抗体または抗体断片、またはこれらの融合抗体を含有する 治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体のみを 含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される 1以上の担体と一緒に混 合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤と して提供するのが望ましい。
[0153] 投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあ げることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげること ができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤 、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
[0154] 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソル ビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのダリ コール類、ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル 類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添 加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ 糖、ショ糖、マン-トールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤 、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシ プロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グ リセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
[0155] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射 剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製 される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製さ れる。また、噴霧剤は該抗体または抗体断片自体、ないしは受容者の口腔および気 道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体などを用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示され る。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が 可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分 を添カロすることちできる。
[0156] 投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体 重などにより異なる力 通常成人 1日当たり gZkg〜8mgZkgである。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定さ れるものではない。
実施例
[0157] (実施例 1) 可変領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、 PE RP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識 し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体の作製
参考例 1 (2)に記載の方法で作製された、抗 PERP抗体産生ハイプリドーマ KM34 11 (FERM BP— 8643)から生産される抗 PERPマウス抗体 KM3411を基に、本 発明の遺伝子組換え抗体を作製した。該抗体は、参考例 2 (1)— 3に記載されている ように、配列番号 21で示される VH中に、 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列 を有していた。以下、 V領域に N結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない遺伝 子組換え抗体の VHのアミノ酸配列の設計を行った。
(1)V領域に N結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない遺伝子組換え抗体の VHのアミノ酸配列の設計
V領域に N結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない改変抗体の VHのァミノ 酸配列を以下のようにして設計した。
[0158] N結合型糖鎖結合のコンセンサス配列は、配列番号 21で示されるアミノ酸配列の 5 9番目の Asn、 60番目の Tyrおよび 61番目の Serからなる配列である。配列番号 21 で示されるアミノ酸配列にぉ 、て、 CDR2は配列番号 45で示されるアミノ酸配列を有 する。配列番号 45で示されるアミノ酸配列において、 N結合型糖鎖結合のコンセン サス配列は、 9番目の Asn、 10番目の Tyrおよび 11番目の Serからなる配列である。
[0159] 配列番号 45で示されるアミノ酸配列において、 10番目のアミノ酸は任意であること から、 9番目の Asnと 11番目の Serを改変候補残基とした。既存の抗体配列 [Seque nces oi Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]との比較やアミノ酸の性質等を勘案し、抗 PERPCDR 改変抗体の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて解析し、アミノ酸 配列の設計を行った。三次元構造座標作製に関してはソフトウェア AbM (Oxford Molecular社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェア Pro— Explore (Oxf ord Molecular社製）あるいは ViewerLite ( Accelrys社製）を用 、てそれぞれ添 付の使用説明書に従って行った。得られた結果を抗 PERPマウス抗体の三次元構造 と比較し、抗原結合部位の三次元構造を変化させず、抗体の結合活性に影響を与 えないと考えられるアミノ酸と置換するアミノ酸として、 9番目の Asnについては Ser、 Glyまたは Tyrを置換するアミノ酸として、および Zまたは 11番目の Serについては A laを置換するアミノ酸としてそれぞれ選択した。
[0160] これらの設計されたアミノ酸改変 VHとして、少なくとも 1以上のアミノ酸残基を置換 し、以下の 6種類の、 V領域に N結合型糖鎖結合のコンセンサス配列を有さない遺伝 子組換え抗体の VHを設計した。以下、 59番目の Asnを Serに置換した VH^ver. 1 、 Glyに置換した ver. 2、 Tyrに置換した VHを ver. 3、 61番目の Serを Alaに置換し た VHを ver. 4、 59番目の Asnを Serに、かつ 61番目の Serを Alaに置換した VHを v er. 5、 59番目の Asnを Glyに、かつ 61番目の Serを Alaに置換した VHを ver. 6とそ れぞれ略記する。
[0161] (2) - 1 V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない遺伝子組換 え抗体の発現ベクターの作製
参考例 2 (1) - 2で作製したプラスミド pKM3411H # 9を铸型として、アミノ酸改変 を導入するための以下の配列番号 22〜27で示される塩基配列を有するプライマー と、配列番号 28で示される DNA配列を有するプライマーとを用いて PCRを行い、目 的の cDNA断片を増幅した。 ver. 1を作製するためには配列番号 24、 ver. 2を作製 するためには配列番号 25、 ver. 3を作製するためには配列番号 23、 ver. 4を作製 するためには配列番号 22、 ver. 5を作製するためには配列番号 26、 ver. 6を作製 するためには配列番号 27に記載の合成 DNA (ファスマック社製)をそれぞれプライ マーとして用いた。これら 6種類の合成 DNAの 3 '末端には、参考例 2の（2)— 1に記 載の PKANTEX3411と組み換えるための制限酵素の認識配列が含まれる。 PCR は 94°C3分間加熱後、 94°C30秒間、 58°C30秒間、 74°C1分間からなる反応サイク ルを 25回行った後、 72°Cで 10分間反応させた。 PCRは GeneAmp PCR syste m9700 (アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。得られた PCR産物のサ ィズは!、ずれも約 300bpであった。
[0162] 参考例 2 (2)— 1に記載の抗 PERPキメラ抗体発現用ベクター PKANTEX3411と 上記で得られた Ver. l〜Ver. 6をコードする DNAを含む PCR産物とを用いて、 VH 領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな 、遺伝子組換え抗体 (以 下、改変抗体と記す)発現ベクターをそれぞれ構築した。なお、 VHにおいては Ver. l〜Ver. 6であるものの、発現ベクターの名称は、 pKANTEX3411CDRvl〜v6と
Β§ίί己す。。
得られた 6種類の PCR産物は制限酵素 Notl (宝酒造社製)と Xhol (宝酒造社製） で消化後、反応液をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction
Kit (QIAGEN社製）を用いて、約 0. 3kbの Notl—Xhol断片を回収した。 pKAN TEX3411を制限酵素 Notl (宝酒造社製）と HindIII (New England BioLabs社 製）で消化後、反応液をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extract ion Kit (QIAGEN社製）を用いて、約 10kbの Notl—Hindlll断片を回収した。ま た、 pKANTEX3411を制限酵素 Hindlll (New England BioLabs社製）と Xhol (宝酒造社製)でも消化し、同様の方法で約 3kbpの Hindlll— Xhol断片も回収した
[0163] 得られた 3種類の断片を Ligation high (東洋紡績社製)を用いて添付の説明書 に従って連結し、得られた反応液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質 転換した。得られた形質転 ·のクローンより各プラスミド DNAを調製して制限酵素 処理を行い、目的の約 0. 3kbの Notl—Xhol断片が挿入された、図 1に示した改変 抗体発現ベクター PKANTEX341 lCDRvl〜v6が得られたことを確認した。得られ 7こへクタ ~~は、 BigDye Terminator Cycle sequencing FS Ready Reacti on Kit (PE Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社の D NAシーケンサー ABI PRISM 3700により塩基配列を解析し、目的の改変が施さ れた、改変抗体発現ベクターが得られたことを確認した。
[0164] (2) - 2 改変抗体の動物細胞での発現
本実施例の（2)— 1で得られた改変抗体発現ベクター pKANTEX341 lCDRvl 〜v6を用いて、該抗体の動物細胞での発現を、常法 [Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company (1992) ]【こより行!ヽ、 pK ANTEX3411CDRvl〜v6が導入された 6種類の形質転換株を取得した。
[0165] (3) 精製抗体の取得
本実施例（2)— 2で得られた形質転換株を、通常の培養法で培養した後、細胞懸 濁液を回収し、 3000rpm、 4°Cの条件で 5分間の遠心分離を行って培養上清を回収 した後、培養上清は 0. 22 μ m孔径 MillexGVフィルター（ミリポア社製)を用いて濾 過滅菌した。得られた培養上清より Mab Select (アマシャム'バイオサイエンス社製 )カラムを用いて、添付の説明書に従い、改変抗体 ver. 1〜6をそれぞれ精製した。
[0166] 得られた抗体の VH領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな 、 改変抗体 ver. 1〜6の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュェントゲ ル (ATTO社製、カタログ番号: E— T520L)を用いて電気泳動を行った後、添付の 説明書に従い、 SDS— PAGEにより確認した。対照としては参考例 2に記載の抗 PE RPキメラ抗体 KM3481を用いた。
[0167] 結果を図 2に示した。精製した改変抗体は、非還元条件下では分子量が約 150キ 口ダルトン（以下、 Kdと表記する）の 1本のバンド力 還元条件下では約 50Kdと約 25 Kdの 2本のバンドが認められた。これらの分子量は、 IgGクラスの抗体は、非還元条 件下では分子量は約 150Kdであり、還元条件下では分子内の S— S結合が切断さ れ、約 50Kdの分子量を持つ H鎖と約 25Kdの分子量を持つ L鎖に分解されると 、う 報告 [Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora tory, Chapter 14 (1988)、 Monoclonal Antibodies― Principles and Pr actice, Academic Press Limited (1996) ]と一致し、改変抗体が正しい構造 の抗体分子として発現されて ヽることが確認された。
[0168] (実施例 2) 改変抗体の活性評価
(1) 膜表面上の PERPへの結合性 (蛍光抗体法）
実施例 1で精製した抗 PERPCDR改変抗体の PERP発現細胞株への結合活性を 以下の方法により確認した。
[0169] 細胞株としては、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現していることが 確認された細胞株である非小細胞肺癌細胞株 PC9株 [British Journal of Cane er, 39, 15 (1976) ]を用いた。
1ゥエル当たり 2 X 105個の PC9細胞を 96ゥエル U字プレートに分注し、改変抗体を
FCM用緩衝液（1%BSA— PBS、 0. 02%EDTA、 0. 05%NaN )にて 50 gZm
3
Lから 5倍希釈で 6段階に希釈した改変抗体を 50 LZゥエルで分注し、氷中で 30 分間反応した。 FCM用緩衝液で 2回洗浄後、 PE標識抗ヒ HgG (H + L)抗体 (ベック マン ·コールター社製）を FCM用緩衝液にて 50倍に希釈した溶液を 50 μ LZゥエル で加えた。遮光し氷中で 30分間反応後、 FCM用緩衝液で 3回洗浄し、フローサイト メーターで蛍光強度を測定した。尚、対照として参考例 2に記載の抗 PERPキメラ抗 体 KM3481を、陰性対照として抗 CCR4抗体 KM2760 (WO0lZ64754)を用い て、同様にして蛍光強度を測定した。
[0170] 結果を図 3に示した。縦軸には平均蛍光強度 (MFI)、横軸には、抗体濃度を示し た。 6種類すベての改変抗体力PC9細胞に結合することが示され、その結合の強さ は抗体の濃度依存的であった。
[0171] (2) 改変抗体の ADCC活性
実施例 1で取得した改変抗体の ADCC活性を、以下のようにして測定した。標的細 胞には PC9を用い、エフェクター細胞溶液の調製には lymphoprep (NYCOMED 社製)を用いた。
[0172] (2)— 1 標的細胞溶液の調製
RPMI 1640 - FBS ( 10)培地 [FCSを 10%含む RPMI 1640培地（Invitrogen社 製) ]を用いて培養した各細胞株を遠心分離操作および懸濁により ADCC活性測定 用培地である RPMI1640— FBS (5) [5%FBSを含む RPMI1640培地（Invitroge n社製) ]で洗浄した後、 ADCC活性測定用培地によって、細胞濃度を 2 X 105細胞 ZmLに調製し、標的細胞溶液とした。
[0173] (2) - 2 エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mLを採取し、へノ《リンナトリウム (清水製薬社製) 0. 5mLを加え 穏やかに混ぜた。これを lymphoprep (NYCOMED 社製）を用いて添付の使用説 明書に従い、単核球 (PBMC)画分を分離した。分離した PBMC画分は、 ADCC活 性測定用培地で遠心分離して 3回洗浄後、適宜懸濁し、エフェクター細胞溶液とした
[0174] (2) - 3 ADCC活性の測定
96ゥエル U字底プレート (Falcon社製）に上記（2)— 1で調製した標的細胞溶液の 50 L (1 X 104細胞 Zゥエル)を分注した。次 、で（2)— 2で調製したエフェクター細 胞溶液を 50 μ L (エフェクター細胞と標的細胞の比が 20： 1になるように希釈したもの )を添加した。更に、改変抗体を ADCC活性測定用培地で希釈し、各最終濃度 0. 0 01〜1 μ gZmLとなるように加えて全量を 150 μ Lとし、 37°Cで 4時間反応させた。 反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)活性を、 LD H- Cytotoxic Test (和光純薬社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光 度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェク ター細胞溶液および抗体溶液の代わりに ADCC活性測定用培地を用いて、また、ェ フエクタ一細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わり に ADCC活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的 細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりに A DCC活性測定用培地を用い、反応終了の 45分前に 15 /z Lの 9% Triton X— 10 0溶液を添加して反応させ、上記と同様の操作を行うことで取得した。 ADCC活性は 次式により求めた。尚、対照として参考例 2に記載の抗 PERPキメラ抗体 KM3481を 用いて、以下の式により ADCC活性を測定した。
[0175] (式）
ADCC活性 (％) = { (検体の吸光度 エフェクター細胞自然遊離の吸光度 標的 細胞自然遊離の吸光度) / (標的細胞全遊離の吸光度 標的細胞自然遊離の吸光 度)） X 100
結果を図 4に示した。 PC9細胞に対して、改変抗体は ADCC活性を有しており、そ の活性は抗体の濃度依存的であった。
[0176] (実施例 3) N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗 PERPヒト化抗 体の作製
(1) N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな 、抗 PERPヒト化抗体の VH および VLのアミノ酸配列の設計
まず、 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな 、抗 PERPヒト化抗体の VHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
[0177] 配列番号 3で示されるアミノ酸配列を有する抗体 VHの CDR1、配列番号 4、 6〜10 のいずれ力 1つのアミノ酸配列を有する抗体 VHの CDR2および配列番号 5で示され るアミノ酸配列を有する抗体 VHの CDR3のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体の VHの FRのアミノ酸配列を選択した。力バットらは、既知の様々なヒト抗体の VHをそ のアミノ酸配列の相同性から 3種類のサブグループ（HSG Ι〜ΠΙ)に分類し、更に、 それらのサブグループ毎に共通配列を報告している [SEQUENCES of Protein s of Immunological Interest, U¾ Dept. Health and Human Servic es (1991) ]0それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考 えられることから、それら共通配列を基に抗 PERPヒト化抗体の VHのアミノ酸配列を 設計することとした。より結合活性の高い抗 PERPヒト化抗体を作製するために、設計 にあたってはヒト抗体の VHの 3種類のサブグループの共通配列の FRのアミノ酸配 列のうち、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を 特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗 PERPモノクローナル抗体である 、抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHの FRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有す る FRのアミノ酸配列を選択した。
[0178] 相同性を検索した結果、 HSGI、 HSGIIおよび HSGIIIの相同性はそれぞれ 54. 0 %、 74. 7%および 60. 9%であった。従って、 KM3411の VH領域の FRのアミノ酸 配列はサブグループ IIと最も高 、相同性を有して 、た。 [0179] 以上の結果から、ヒト抗体の VHのサブグループ IIの共通配列の FRのアミノ酸配列 の適切な位置に抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHの CDRのアミノ酸配列を移植 した。し力し、配列番号 37に記載の KM3411の VHのアミノ酸配列中の 47番目の II e、 86番目の Ile、 100番目の Gln、 107番目の Glu、および 111番目の Thriま、カノ ットらがあげるヒト抗体 FRのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される 頻度が高 、アミノ酸残基ではな 、が、比較的高 、頻度で使用されるアミノ酸残基であ るため、上記の KM3411のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした 。このようにして、配列番号 30〜35のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する含む 、抗 PERPヒト化抗体の VHのアミノ酸配列を設計した。また、実施例 2の結果から、 V 領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな 、改変抗体 ver. 1〜6の 中で、最も結合活性が高カゝつた抗体は ver. 4であったことから、この V領域に N結合 型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない改変抗体 ver. 4 (以下、 KM3821と 記す）の CDR2を有する HVを HVO (配列番号 33)とした。
[0180] 次に、抗 PERPヒト化抗体の VLのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
配列番号 11〜13でそれぞれ示される抗体 VLの CDR1〜3のアミノ酸配列を移植 するためのヒト抗体の VLの FRのアミノ酸配列を選択した。力バットらは、既知の様々 なヒト抗体の VLをそのアミノ酸配列の相同性から 4種類のサブグループ（HSG 1〜1 V)に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している [Sequenc es of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]。そこで VHの場合と同様にして、ヒト抗体の VLの 4種 類のサブグループの共通配列の FRのアミノ酸配列のうち、 PERP遺伝子によりコード されるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域 に結合する抗 PERPモノクローナル抗体である、抗 PERPマウス KM3411の VLの F Rのアミノ酸配列と最も高 、相同性を有する FRのアミノ酸配列を選択した。
[0181] 相同性を検索した結果、 HSGI、 HSGII、 HSGIIIおよび HSGIVの相同性はそれ ぞれ 67. 5%、 62. 5%、 66. 2%および 65. 0%であった。従って、 KM3411の VL の FRのアミノ酸配列はサブグループ Iと最も高 、相同性を有して 、た。
[0182] 以上の結果から、ヒト抗体の VLのサブグループ Iの共通配列の FRのアミノ酸配列 の適切な位置に抗 PERPマウス抗体 KM3411の VLの CDRのアミノ酸配列を移植し 、配列番号 36に記載の抗 PERPヒトイ匕抗体の VLのアミノ酸配列 LVOを設計した。
[0183] 上記で設計した抗 PERPヒトイ匕抗体の VHのアミノ酸配列 HVOおよび VLのアミノ酸 配列 LVOは、選択したヒト抗体の FRのアミノ酸配列に抗 PERPマウス抗体 KM3411 の CDRのアミノ酸配列のみを移植した配列である力 一般に、ヒト化抗体を作製する 場合には、単なるヒト抗体の FRへのマウス抗体の CDRのアミノ酸配列の移植のみで は結合活性が低下してしまうことが多い。結合活性の低下を回避するため、ヒト抗体と マウス抗体で異なっている FRのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考え られるアミノ酸残基を、 CDRのアミノ酸配列の移植とともに、改変することが行われて いる。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられる FRのアミ ノ酸残基を以下のようにして同定した。
[0184] まず、上記で設計した抗 PERPヒトイ匕抗体の VHのアミノ酸配列 HVOおよび VLのァ ミノ酸配列 LVOよりなる抗体 V領域 (HVOLVO)の三次元構造をコンピューターモデ リングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェア AbM ( Oxford Molecular社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェア Pro— Exp lore (Oxford Molecular社製）あるいは ViewerLite (Accelrys社製）を用いてそ れぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗 PERPマウスモノクローナル抗体 KM3411の V領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更 に、 HVOLVOの VHおよび VLの FRのアミノ酸配列において、抗 PERPマウス抗体 K M3411と異なって!/、るアミノ酸残基にっ 、て順次、抗 PERPマウス抗体 KM3411の 相当する位置に見られるアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列力 なる三次元構造モ デルを同様にして構築し、抗 PERPマウス抗体 KM3411、 HVOLVOおよび改変体 の V領域の三次元構造を比較した。
[0185] その結果、 HVOLVOの FRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変 化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、 HV0では 27番目の Gly、 30番目の Ser、 41番目の Pro、 44番目の Lys、 45番目の Gly、 49番 目の Ile、 72番目の Val、および 97番目の Alaを、 LV0では 3番目の Gln、 5番目の T hr、 35番目の Tyr、 42番目の Ala、 46番目の： Leu、 70番目の Phe、および 77番目 の Leuをそれぞれ選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも 1つ以上 のアミノ酸配列をマウス抗体 KM3411の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、 様々な改変を有するヒト化抗体の VHおよび VLを設計した。具体的には、抗体 VHに ついては、配列番号 30〜35のいずれかで示されるアミノ酸配列の 27番目の Glyを P heに、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45 番目の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目 の Alaを Thrに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも 1つの改変を導入した。また、 VLについては、配列番号 36で示されるアミノ酸配列の 3番目の Ginを Valに、 5番目 の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Pheに、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Tr pに、 70番目の Pheを Tyrに、および 77番目の Leuを Metに置換するアミノ酸改変の うち、少なくとも 1つの改変を導入した。
[0186] (2) 抗 PERPヒト化抗体の VHをコードする cDNAの構築
本実施例（1)で設計した抗 PERPヒトイ匕抗体の VHのアミノ酸配列 HV0をコードす る cDNAを、 PCRを用いて以下のようにして構築した。
[0187] まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号 37の 1〜18番目に示される抗 PERPマウ ス抗体 KM3411の H鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とし た。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1つのアミノ酸残基に対して複 数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻 度 [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定 した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体 V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を設計し、更に 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマ 一の結合塩基配列（ヒトイヒ抗体発現用ベクターへクローユングするための制限酵素 認識配列も含む)を付加した。設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 4本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約 20塩基の重複配列を有 するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌタレ ォチド (配列番号 64〜67)を合成した。
[0188] 各オリゴヌクレオチド (配列番号 64〜67)を最終濃度が 0. 1 μ molZLとなるように 50 μ Lの反応液に加えて、 0. 5 mol/L M13RVプライマー（Takara Shuzo社 製）、 0. 5 molZL M13M4プライマー（Takara Shuzo社製）および 1単位の K OD polymerase (東洋紡績社製）を用いて、 KOD polymeraseに添付の使用説 明書に従い、 PCRを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件 (94 °C 30秒間、 50°C 30秒間、 74°C 60秒間のサイクルを 30サイクル）に従った。該 反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後 に、プラスミド pBluescript II SK (—）（Stratagene社製）に連結した。このようにし て得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株を形質転換し、形 質転^ の株よりプラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Seque ncing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems社製)を用いて塩 配列を解析した結果、 目的の塩基配列 (配列番号 50)を有するプラスミドを得た。
[0189] 次に、本実施例（1)で設計した FRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリ ゴヌクレオチドを作製し、上記の PCRを行うか、上記で作製した HV0をコードする cD NAを含むプラスミド DNAを铸型として変異を有する合成 DNAをプライマーとして P CRを行い、増幅遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺 伝子コドンについては、抗 PERPマウス抗体 KM3411に見られる遺伝子コドンとなる ように行った。また、以下、特に記載の無い場合、 94°C 30秒間、 55°C 30秒間、 7 2°C 60秒間のサイクルを 35サイクルの PCR反応で反応させた。 PCR反応は KOD -plus polymerase (TO YOBO社製）を使用して行った。また、以下で使用した合 成オリゴ DNAはファスマック社製のものである。なお、以下において、改変するァミノ 酸残基はアルファベット一文字で標記し、右上に改変するアミノ酸残基の番号を記載 した。
[0190] (a) G27S3°P41K44G45I4V2A97を F27T3°F41N44R45M49R72T97へ改変した VH (以下 、 HV8)の作製
0. 1 /z molZLのアミノ酸変異を有する合成 DNA (配列番号 64、 69、 68、 70)と、 その両端に位置するプライマー M13RVプライマー（Takara Shuzo社製）および、 M13M4プライマー（Takara Shuzo社製）を 0. 4 μ molZL加え、 PCR反応を行つ た。 PCR反応液を、 Gel extraction kit (QIAGEN社製）を用いて精製し、 0. 8— 1. 5%のァガロース電気泳動を行い、目的の 0. 45kbp付近の遺伝子断片を Gel e xtraction kit (QIAGEN社製）を用いて抽出した。特異的な制限酵素 Smalで処 理した pBlusecript II sk (—）（以下、 pBS)にサブクローユングを行い、目的の遺 伝子（配列番号 51)を含むベクター pBSZHV8を取得した。
[0191] (b) G27P41A97を F27F41T97へ改変した VH (以下、 HV3)の作製
上記（a)と同様にして、合成 DNA (配列番号 64、 79、 66、 70)とその両端に位置 する M13RVおよび M13M4プライマーを用いて、 PCR反応を行い、目的の遺伝子 (配列番号 52)を含むベクター pBSZHV3を取得した。
[0192] (c) G27P41V72A97を F27F41R72T97へ改変した VH (以下、 HV4)
上記と同様にして、合成 DNA (配列番号 64、 79、 80、 70)とその両端に位置するプ ライマーを用いて、 PCR反応を行い、目的の遺伝子 (配列番号 53)を含むベクター p BSZHV4を取得した。
[0193] (d) G27S3GP41A97を F27T3GF41T97へ改変した VH (以下、 HV4— 2)
上記（b)で作製した pBSZHV3を铸型にして、 M13RVプライマー（Takara Shu zo社製）と合成オリゴ DNA (配列番号 84)を用いて PCR反応を行 、、約 0. 3kbpの 遺伝子断片 5，一 GSを取得した。また、同様に PBSZHV3を铸型にして合成オリゴ DNA (配列番号 85)および M13M20プライマーを用いて PCR反応を行い、約 0. 4 kbpの遺伝子断片 3'— PAを取得した。これら、作製した遺伝子断片および Ml 3RV 、 M13M20 プライマーを用いて、 PCR反応を行い、 Gel extraction kit (QIAG EN社製)を用いて増幅遺伝子断片を抽出した。その後、特異的な制限酵素 Notlお よび Apalで酵素処理を行い、 0. 8- 1. 5%のァガロース電気泳動を行い、目的の 0 . 45kbp付近の遺伝子断片を Gel extraction kit (QIAGEN社製）を用いて抽出 した。抽出した遺伝子断片を、 pBSの適切な場所に挿入し、目的の遺伝子 (配列番 号 54)を含むベクター pBSZHV4— 2を取得した。
[0194] (e) G27S3GI49V72A97を F27T3 M49R72T97へ改変した VH (以下、 HV5 - 2)
上記（d)で作製した、 PBS/HV4— 2を铸型にして、 T3プライマー（Takara Shu zo社製）および合成オリゴ DNA (配列番号 86)を用いて PCR反応を行い、 5，—GS PI遺伝子断片を取得した。また、上記 (c)で作製した pBSZHV4を铸型にして、 T7 プライマー（Takara Shuzo社製）および合成オリゴ DNA (配列番号 87)を用いて P CR反応を行い、 3， - VA遺伝子断片を取得した。これら、作製した遺伝子断片と T3、 Τ7プライマーを用いて PCR反応を行い、約 0. 5kbpの GSPIVA遺伝子断片を作製 した。この遺伝子断片を铸型にして、 T3プライマーと合成オリゴ DNA (配列番号 92) を用いて PCR反応を行い 5'— HV5— 2遺伝子断片を、また T7プライマーと合成オリ ゴ DNA (配列番号 91)を用いて PCR反応を行 、3 ' -HV5 2遺伝子断片を取得し た。作製した 2つの遺伝子断片および T3、 Τ7プライマーを用いて PCR反応を行い、 以下は上記 (c)と同様にして、目的の遺伝子 (配列番号 55)を含むベクター pBSZH V5— 2を取得した。
[0195] (f) G27P41I49V72A97を F27F41M49R72T97へ改変した VH (以下、 HV5 - 3)
上記（c)で作製した HV4を铸型にして、 T3プライマー (Takara Shuzo社製）と合 成オリゴ DNA (配列番号 86)を用いて PCR反応を行い、 5，一 GPI遺伝子断片を取 得した。また、同様にして T7プライマー (Takara Shuzo社製）と合成オリゴ DNA ( 配列番号 87)を用いて PCR反応を行い、 3'—VA遺伝子断片を取得した。作製した 遺伝子断片とおよび T3、 Τ7プライマーを用いて PCR反応を行い、以下は上記 ( と 同様にして、目的の遺伝子 (配列番号 56)を含むベクター pBSZHV5— 3を取得し た。
[0196] (3)抗 PERPヒト化抗体の VLをコードする cDNAの構築
本実施例（1)で設計した抗 PERPヒトイ匕抗体の VLのアミノ酸配列をコードする cDN Aを、 PCRを用いて以下のようにして構築した。
[0197] まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号 38の 1〜22番目に示される抗 PERPマウ ス抗体 KM3411の L鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とし た。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。 1つのアミノ酸残基に対して複 数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻 度 [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991) ]を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定 した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体 V領域のアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を設計し、更に 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅用プライマ 一の結合塩基配列（ヒトイヒ抗体発現用ベクターへクローユングするための制限酵素 認識配列も含む)を付加した。設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 4本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約 20塩基の重複配列を有 するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌタレ ォチド (配列番号 71〜74)を合成した。
[0198] 各オリゴヌクレオチド (配列番号 71〜74)を最終濃度が 0. 1 μ molZLとなるように 50 μ Lの反応液に加えて、 0. 5 mol/L M13RVプライマー（Takara Shuzo社 製）、 0. 5 molZL M13M4プライマー（Takara Shuzo社製）および 1単位の K OD polymerase (東洋紡績社製）を用いて、 KOD polymeraseに添付の使用説 明書に従い、上記（3)と同様に PCRを行った。反応液をエタノール沈殿した後、滅菌 水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミド pBluescript II SK (- ) (Stratagene社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液 を用いて大腸菌 DH5 α株を形質転換し、形質転換株よりプラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator じ ycie sequencing FS Ready Reaction Kit {App lied Biosystems社製)を用いて塩基配列を解析した結果、 目的の塩基配列（配 列番号 57)を有するプラスミド pBSZLVOを取得した。
[0199] 次に、本実施例（1)で設計した FRのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリ ゴヌクレオチドを作製し、上記の PCRを行うか、上記で作製した LV0をコードする cD NAを含むプラスミド DNAを铸型として変異を有する合成 DNAをプライマーとして P CRを行い、増幅遺伝子断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺 伝子コドンについては、抗 PERPマウス抗体 KM3411で見られる遺伝子コドンとなる ように行った。
また以下、特に記載の無い場合、 94°C 30秒間、 55°C 30秒間、 72°C 60秒間の サイクルを 35サイクルの PCR反応で反応させた。 PCR反応は KOD—plus polym erase (TO YOBO社製)を使用して行った。また、以下で使用した合成オリゴ DN A はファスマック社製のものである。以下において、改変するアミノ酸残基はアルファべ ット一文字で標記し、右上に改変するアミノ酸残基の番号を記載した。
[0200] (a) G3T5Y35A42L46F7°L77を V3L5F35S42W46Y7°M77へ改変した VL (以下、 LV7) 0. 1 molZLのアミノ酸変異を有する合成 DNA (配列番号 75〜78)と、その両端 に位置するプライマー M13RVプライマー（Takara Shuzo社製）および、 M13M4 プライマー（Takara Shuzo社製）を 0. 4 μ mol/L加え、 PCR反応を行った。 PCR 反応液を 0. 8 - 1. 5%のァガロース電気泳動を行い、 目的の 0. 4kbp付近の遺伝 子断片を Gel extraction kit (QIAGEN社製）を用いて抽出した。制限酵素 Smal で処理した pBlusecript II sk (—）（以下、 pBS)にサブクロー-ングを行い、 目的 の遺伝子（配列番号 58)を含むベクター pBSZLV7を取得した。
[0201] (b) L46F7を W46Y7 へ改変した VL (以下、 LV2)
上記 (a)と同様に、 4本の合成オリゴ DNA (配列番号 71、 72、 81、 74)と両端に位 置する M13RVプライマー、 M13M4プライマーを用いて PCR反応を行い、以下は 上記 (a)同様にして、 目的の遺伝子 (配列番号 59)を含むベクター pBSZLV3を取 得した。
[0202] (c) L46F70L77を W46Y70M77へ改変した VL (以下、 LV3)
上記 (a)と同様に、 4本の合成オリゴ DNA (配列番号 71、 72、 81、 78)と両端に位 置する M13RVプライマー、 M13M4プライマーを用いて PCR反応を行い、以下は 上記 (a)同様にして、 目的の遺伝子 (配列番号 60)を含むベクター pBSZLV3を取 得した。
[0203] (d) A42L46F7Gを S42W46Y7Gへ改変した VL (以下、 LV3 - 2)
上記 (b)で作製した pBSZLV2を铸型として、 M13RVプライマーと合成オリゴ DN A (配列番号 94)を用いて PCR反応を行い、 5'—AL遺伝子断片を取得した。また、 M13M20プライマー（Takara Shuzo社製）と合成オリゴ DNA (配列番号 93)を用 いて、 3'—F遺伝子断片を取得した。これらの遺伝子断片および Ml 3RVプライマー 、 M13M20プライマーを用いて PCR反応を行い、 Gel extraction kit (QIAGEN 社製)を用いて増幅遺伝子断片を抽出した。その後、特異的な制限酵素 EcoRIおよ び BsiWIで酵素処理を行い、 0. 8- 1. 5%のァガロース電気泳動を行い、 目的の 0 . 4kbp付近の遺伝子断片を Gel extraction kit (QIAGEN社製）を用いて抽出し た。抽出した遺伝子断片を、制限酵素 BsiWI認識配列を組み込んだ pBSの適切な 場所に挿入し、 目的の遺伝子 (配列番号 61)を含むベクター pBSZLV3— 2を取得 した。
[0204] (e) Y35L46F7°L77を F35W46Y7°M77へ改変した VL (以下、 LV4)
上記 (c)で作製した pBSZLV3を铸型として、 T3プライマーおよび合成オリゴ DN A (配列番号 90)を用いて PCR反応を行い、 5' LV4遺伝子断片を取得し、また同 様にして T7プライマーおよび合成オリゴ DNA (配列番号 89)を用いて PCR反応を 行い、 3'— YLFL遺伝子断片を取得した。これらの遺伝子断片および T3、 Τ7プライ マーを用いて PCR反応を行い、以下は (d)と同様にして目的の遺伝子 (配列番号 62 )を含むベクター PBS/LV4を取得した。
[0205] (f) A42L46D69F7°T71を S42W46S69Y7°S71へ改変した VL (以下、 LV5― 2)
上記 (d)で作製した pBs/LV3 - 2を铸型とし、 T7プライマーと合成オリゴ DNA ( 配列番号 83)を用いて PCR反応を行い、 5'—DFT遺伝子断片を取得し、また、同 様にして T3プライマーと合成オリゴ DNA (配列番号 82)を用いて PCR反応を行い、 3 '—DFT遺伝子断片を取得した。これらの遺伝子断片および T7, T3プライマーを 用いて PCR反応を行 、、以下は（d)と同様にして目的の遺伝子 (配列番号 63)を含 むベクター PBSZLV5— 2を取得した。
[0206] (4)抗 PERPヒト化抗体発現ベクターの構築
WO97Z10354に記載のヒト化抗体発現用ベクター PKANTEX93の適当な位置 に本実施例（2)および（3)で得られた HVOおよび LVOをコードするそれぞれの cDN A、あるいはそれらの改変体をコードする cDNAを挿入し、各種抗 PERPヒトイ匕抗体 発現ベクターを構築した（図 11)。
HVOLVO, HV8LV0, HV0LV7, HV4LV2, HV4LV3, HV8LV7, HV4LV7, HV4LV5— 2、 HV5- 2LV4, HV5— 3LV4および HV4LV4の 11種類の N結合 型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗 PERPヒト化抗体を作製した。 (5)抗 PERPヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の取得 抗 PERPヒト化抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清力 の抗体の精 製は、実施例 1 (2)— 2および（3)に記載の方法と同様にして行った。
[0207] (実施例 4) N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗 PERPヒト化抗 体の活性評価 (1)ヒト PERP (hPERP)発現細胞の作製
参考例 1 (1)と同様にして、 pcPERPmHを用いて CHOZDG44 (KC861)の形質 転換株を作製した。その結果、 hPERPを中程度発現する形質転換株 (KC1359)、 および高発現して 、る形質転 · (KC9033)を取得した。
[0208] (2) 膜表面上の PERPへの結合性 (蛍光抗体法）
実施例 3 (5)で精製した N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな ヽ抗 P
ERPヒト化抗体の、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現している CH
OZPERP (KC1359)あるいは実施例 1 (1)で用いている PC9細胞に対する結合活 性を、蛍光抗体法を用いて、下記のように実施した。
[0209] 1ゥエル当たり 2-3 X 105個の CHOZPERPあるいは PC9細胞を 96ゥエル U字プレ ートに分注し、各 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない抗 PERPヒト 化抗体を FCM用緩衝液（1%BSA—PBS、 0. 02%EDTA、 0. 05%NaN )にて 1
3
0 μ gZmLから 2倍希釈で 8段階に希釈した改変抗体を 100 μ LZゥエルで分注し、 あるいは 10 gZmLから 5倍希釈で 8段階に希釈した改変抗体を 100 LZゥエル で分注して、氷中で 30分間反応した。 FCM用緩衝液で 1回洗浄後、 PE標識抗ヒト I gG (H + L)抗体（ベックマン'コールター社製）を FCM用緩衝液にて 50倍に希釈し た溶液を 100 LZゥエルでカ卩えた。遮光し氷中で 30分間反応後、 FCM用緩衝液 で 2回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。陽性対象として、参考例 2記載の抗 PERPヒト型キメラ抗体 KM3481、あるいは実施例 1で作製した N結合型 糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな ヽ抗 PERPヒト型キメラ抗体 KM3821 (K M3821)を用いた。
その結果、 KM3821の CDRを単にヒトフレームワークに移植した HV0LV0、およ び L鎖のみアミノ酸改変を加えた HV0LV7は、 CHOZPERPに対する結合活性が 殆ど無かった力 H鎖のアミノ酸改変をカ卩えた HV8LV0は、 KM3821の約 1Z5ま で結合活性が増カロした（図 12— A)。更に、アミノ酸改変残基数を減らし、 H鎖 L鎖両 方にアミノ酸改変をカ卩えた HV4LV2および HV4LV3では、 HV8LV0と同等まで結 合活性が増カロした（図 12— B)。
[0210] 更に、アミノ酸改変残基数を増やした HV4LV7、 HV8LV7では、 HV4LV3よりも 活性が増加し、 V、ずれの抗体とも KM3821と同等の結合活性を有して 、た（図 13— A)。
[0211] これらの結果から、 HV4LV3で改変している L鎖のアミノ酸改変残基 L46FTOL77以 外の、 G3T5Y35A42のアミノ酸改変、あるいは HV4で改変しているアミノ酸 G27P4V72 A97以外の S3 K44G45I49のアミノ酸改変が、活性上昇に関与する可能性が考えられ たため、以下のように VHに更なるアミノ酸改変を行った抗 PERPヒト化抗体の結合活 性を測定した。
[0212] その結果、 HV5- 2LV4, HV5— 3LV4、 HV4LV4および HV4LV5— 2では、い ずれも HV4LV3よりも活性が増加し、 KM3821と同等の結合活性を有していた（図 13— C)。この中で、最もアミノ酸改変残基数が少ない HV4LV4は、 HV4LV3のアミ ノ酸改変に L鎖の Y35から F35へのアミノ酸改変を加えた可変領域であり、 Y35のァミノ 酸改変が、 N型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな 、抗 PERPヒト化抗体の活 性上昇に大きく関与していることが明らかとなった。また、ヒト肺癌細胞株 PC— 9に対 する結合活性も同様な反応性を有していた（図 14— A, B, C)
[0213] (3) 改変抗体の ADCC活性
以下の方法を用いて、改変抗体である HV5— 2LV4、 HV5— 3LV4、 HV4LV4 および HV4LV5— 2の ADCC活性の ADCC活性の測定を行った。
[0214] (3- 1) 標的細胞溶液の調製
ヒト脾癌細胞株 BxPC— 3およびヒト肺癌細胞株 PC— 9は、 RPMI1640— FBS (1 0)培地 [10%FCSおよび 50 μ gZmLゲンタマイシンを含む RPMI1640培地（Invi trogen社製） ]を用いて培養を行 ヽ、ヒト PERP発現 CHOZDG44細胞（KC1359 および KC9033)は IMDM— CHO培地 [10%FCS、 1 X HT supplement (Invit rogen社製）、 50 gZmLゲンタマイシンおよび 0. 5mgZmLG418 (ナカライテス ク社製)を含む IMDM培地 (Invitrogen社製) ]を用いて培養した。各細胞を拡大培 養後、遠心分離操作および懸濁により ADCC活性測定用培地である RPMI 1640 FBS (l) [1%FBSを含むフエノールレッド不含 RPMI1640培地（Invitrogen社製） ]で洗浄した後、 ADCC活性測定用培地によって、細胞濃度を 2 X 105細胞/ mLに 調整し、標的細胞溶液とした。 [0215] (3- 2) エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mLを採取し、へノ《リンナトリウム (清水製薬社製) 0. 5mLを加え 穏やかに混ぜた。これを polymorphoprep (NYCOMED社製）を用いて添付の使 用説明書に従い、単核球 (PBMC)画分を分離した。分離した PBMC画分は、 ADC C活性測定用培地で遠心分離して 2回洗浄後、適宜懸濁し、エフェクター細胞溶液と した。
[0216] (3- 3) ADCC活性の測定
96ゥエル U字底プレート (Falcon社製）に上記（2)— 1で調製した標的細胞溶液の 50 L (1 X 104細胞 Zゥエル)を分注した。次 、で（2)— 2で調製したエフェクター細 胞溶液を 50 μ L (エフェクター細胞と標的細胞の比が 20： 1になるように希釈したもの )を添加した。更に、改変抗体を ADCC活性測定用培地で、 3 /z gZmLから 5倍希 釈で 8段階希釈したものを 50 Lカ卩え、全量を 150 Lとし、 37°Cで 4時間反応させ た。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)活性を、 LDH- Cytotoxic Test (和光純薬社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸 光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフ エタター細胞溶液および抗体溶液の代わりに ADCC活性測定用培地を用いて、また 、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代 わりに ADCC活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標 的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりに ADCC活性測定用培地を用い、反応終了の 45分前に 20 Lの 9% Triton X—1 00溶液を添加して細胞を破壊し、上記と同様の操作を行うことで取得した。 ADCC 活性は次式により求めた。尚、対照として KM3821を用いて、実施例 2と同様にして ADCC活性を測定した。
[0217] その結果、今回作製し、 CHOZPERPに対する結合活性力 KM3821と同等で あった HV8LV7、 HV5— 3LV4および HV4LV4は、いずれの抗体も KM3821と同 等の ADCC活性を有していた。更に、 ADCC活性は、ヒト肺癌細胞株（図 15)、ヒト脾 癌細胞株 BxPC— 3 (図 16)および CHOZPERP高発現細胞株（KC9033) (図 17) いずれの標的細胞においても、 KM3821と同等であった。し力し、 HV5— 2LV4は 、 KM3821と比べて、わずかに ADCC活性が低い傾向が認められた。
[0218] (実施例 5) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造 を特異的に認識する、 KM3821のェピトープ解析
(1)変異 PERP発現ベクターの構築
ヒト PERPとマウス PERPの細胞外領域ループ 1あるいはループ 2のアミノ酸残基を 比較し、アミノ酸残基の異なる部分をマウスのアミノ酸残基に改変するため、参考例 1 で作製したヒト PERP発現ベクター pcPERPmHを铸型にして、アミノ酸変異有するプ ライマーおよび pcDNA3. 1 +ベクターに特異的なプライマー（配列番号 112ある!/ヽ は 113)を用いて、各変異 PERP発現ベクターを作製した（図 18)。アミノ酸残基改変 後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、マウス PERP (accession No. NP_ 071315)で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、以下、特に記載の無い 場合、 94。C 30秒間、 58。C 30秒間、 72。C 60秒間のサイクルを 25— 35サイクル の PCR反応で反応させた。 PCR反応は KOD—plus polymerase (TO YOBO社 製)を使用して行った。また、以下で使用した合成オリゴ DNAはファスマック社製のも のである。以下において、改変するアミノ酸残基はアルファベット一文字で標記し、右 上に改変するアミノ酸残基の番号を記載した。
[0219] (a) D40G42K50S52Q53E6¾63を N40I42R50F52D53D62D63へ改変した変異 PERP (以下 、 mL- 1)
参考例 1で作製された pcPERPmHを铸型として、ベクター側に位置するプライマ 一（配列番号 112)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DN A (配列番号 103)を用いて PCR反応を行い、 1. 5%ァガロース電気泳動を行い約 0 . 3kbpの遺伝子断片を、 Gel extraction kit (QIAGEN社製）を用いて抽出し、 5 ， 一 mL— 1遺伝子断片を取得した。同様にして、 pcPERPmHを铸型として、ベクタ 一側に位置するプライマー（配列番号 113)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異アミノ 酸を含む合成オリゴ DNA (配列番号 102)を用いて PCR反応を行 ヽ、約 0. 7kbpの 3' mL— 1遺伝子断片を取得した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側のプライ マー（配列番号 112、 113)を用いて PCR反応を行い、増幅させた約 0. 8kbpの遺伝 子断片をを Gel extraction kit (QIAGEN社製)を用いて抽出した。抽出後、特異 的な制限酵素 EcoRIおよび Xbalで酵素処理を行 、、ァガロース電気泳動を行!、、 約 0. 7kbpの遺伝子断片を上記と同様に抽出した。取得した遺伝子断片を、制限酵 素 EcoRIおよび Xbalで処理し、 pcDNA3. 1 +の適切な位置に挿入し、目的の遺伝 子（配列番号 96)を含むベクター pcDNA3. 1 + ZmL— 1を取得した。
[0220] (b)T138A141T146を R138D141N146へ改変した変異 PERP (以下、 mL— 2)
(a)と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号 112)と、 PERP遺伝 子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配列番号 105)を用いて、約 0. 6kbpの 5'—mL— 2遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（ 配列番号 113)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA( 配列番号 104)を用いて、約 0. 4kbpの 3'—mL— 2遺伝子断片を作製した。取得し た遺伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号 112、 113)を用いて PCR反 応を行い、目的の遺伝子（配列番号 97)を含むベクター pcDNA3. 1 + ZmL— 2を 取得した。
[0221] (c) D40G42K50S52Q53E62E63T138A141T146を N40I42R5V2D53D62D63R138D141N146 へ改変した変異 PERP (以下、 mPERP)
(b)で作製した pcDNA3. 1 + ZmL— 2を铸型にして、（a)と同様にして、ベクター 側に位置するプライマー（配列番号 112)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異アミノ酸 を含む合成オリゴ DNA (配列番号 103)を用いて PCR反応を行い、約 0. 3kbpの 5， — mPERP遺伝子断片を作製し、同様に pcDNA3. l + /mL— 2を铸型として、ベ クタ一側に位置するプライマー（配列番号 113)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異 アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配列番号 102)を用いて PCR反応を行 、、約 0. 7k bpの 3'— mPERP遺伝子断片を取得した。取得した遺伝子断片及び、ベクター側の プライマー（配列番号 112、 113)を用いて PCR反応を行 、、目的の遺伝子 (配列番 号 98)を含むベクター pcDNA3. 1 + ZmPERPを取得した。
[0222] (d) D4°G42を N4°I42へ改変した変異 PERP (以下、 DG)
(a)と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号 112)と、 PERP遺伝 子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配列番号 107)を用いて、約 0. 35kbpの 5'—DG遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（配 列番号 112)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配 列番号 106)を用いて、約 0. 7kbpの 3'—DG遺伝子断片を作製した。取得した遺伝 子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号 112、 113)を用いて PCR反応を行 い、 目的の遺伝子（配列番号 99)を含むベクター pcDNA3. 1 + ZDGを取得した。
[0223] (e) K5°S52Q53を R5°F5¾53へ改変した変異 PERP (以下、 KSQ)
(a)と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号 112)と、 PERP遺伝 子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配列番号 109)を用いて、約 0. 4kbpの 5'—KSQ遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（配 列番号 113)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配 列番号 108)を用いて、約 0. 6kbpの 3'—KSQ遺伝子断片を作製した。取得した遺 伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号 112、 113)を用いて PCR反応を 行い、 目的の遺伝子（配列番号 100)を含むベクター pcDNA3. 1 +ZKSQを取得 した。
[0224] (f) E6¾63を D6 63へ改変した変異 PERP (以下、 EE)
(a)と同様にして、ベクター側に位置するプライマー（配列番号 112)と、 PERP遺伝 子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配列番号 111)を用いて、約 0. 4kbpの 5'— EE遺伝子断片を作製し、一方、ベクター側に位置するプライマー（配 列番号 113)と、 PERP遺伝子内に位置し、変異アミノ酸を含む合成オリゴ DNA (配 列番号 110)を用いて、約 0. 6kbpの 3'—KSQ遺伝子断片を作製した。取得した遺 伝子断片及び、ベクター側のプライマー（配列番号 112、 113)を用いて PCR反応を 行い、 目的の遺伝子（配列番号 101)を含むベクター pcDNA3. 1 +ZEEを取得し た。
[0225] (2)サル PERP遺伝子クロー-ング
国立感染症研究所力-クイザル cDNAライブラリーから、ヒト PERP遺伝子配列を 検索子にして検索を行った結果、力-クイサル延髄由来 cDNAクローン (QmoA— 1 1464)と高い相同性を示した。この遺伝子力も予測されるアミノ酸配列（配列番号 11 6)力ら、サル PERP細胞外領域ループ 1およびループ 2に、ヒト PERPヒト PERPの細 胞外領域と 2つのアミノ酸が異なることが分力つた。従って、サル PER遺伝子をクロー ユングし、サル PERPを発現させた細胞を構築した。
[0226] サル PERPの遺伝子を含む発現ベクター pME18SFL3を铸型とし、特異的な制限 酵素 EcoRIおよび、 Hindlllの配列を含む合成オリゴ DNA (配列番号 114, 115)を 用いて、 PCR反応を行い、 目的の遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子断片を、制限 酵素 EcoRIおよび Hindlllで処理した。タンパク質の C末端に Mycタグおよび Hisタ グが揷入できる発現ベクター pBS— mycHisを制限酵素 EcoRIおよび Hindlllで処 理し、アミノ酸のコドンが適切に合うように挿入し、 pBS— PERPtagを作製した。さら に、発現ベクター pBS— PERPtagから、制限酵素 EcoRIおよび Hindlllで制限酵素 処理を行い、得られた遺伝子断片を、 pcDNA3. 1 +ベクターの、 EcoRIおよび Hin dillサイトに挿入し、 目的のサル PERPmH (配列番号 117)を含むべクターpcDNA 3. 1 + ZmonPERPを取得した。
[0227] (3)変異 PERP発現細胞の構築
上記実施例 5 (1)で作製した各発現ベクターおよび参考例 1で作製したヒト PERP 発現ベクター pcPERPmHを、エレクト口ポレーシヨン法により CHOZDG44 (KC86 1)に遺伝子導入を行い、形質転 ·の取得を行った。エレクト口ポレーシヨン後、 G4 18け力ライテスタ社製)薬剤耐性を獲得した変異 PERP発現細胞を取得した。エレ タトロポレーシヨンを行った後、終濃度 0. 6mg/mLの G418 (ナカライテスタ社製)を 添加し、 10- 20日間培養を行い、変異 PERPが導入された各形質転換株、 CHO/ hPERP、 CHO/mPERP、 CHO/mL— 1、 CHO/mL— 2、 CHO/DG, CHO ZKSQ、および CHO/EEを作製した。
[0228] (4) KM3821のヒト PERP発現細胞または変異 PERP発現細胞に対する反応性の 検討
実施例 3 (5)で精製した N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな ヽ抗 P ERPキメラ抗体の、上記実施例 5 (2)で作製したヒト PERPあるいは変異 PERP形質 転換株に対する結合活性を、蛍光抗体法を用いて、下記のように実施した。
[0229] (5) N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな ヽ抗 PERPヒト化抗体の反応
1ゥエル当たり 1 -3 X 105個の新鮮な各形質転換株、あるいは上記細胞内染色処理 を行った形質転換細胞株に、各 N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さな ぃ抗 PERPキメラ抗体を FCM用緩衝液（1%BSA—PBS、 0. 02%EDTA、 0. 05 %NaN )にて gZmLに希釈した溶液を、 100 LZゥエルで分注し、氷中で 3
3
0— 60分間反応した。 FCM用緩衝液で 1回洗浄後、 PE標識抗ヒト IgG (H + L)抗体 (ベックマン ·コールター社製）を FCM用緩衝液にて 50倍に希釈した溶液を 100 μ L Ζゥエルでカ卩えた。遮光し氷中で 30— 60分間反応後、 FCM用緩衝液で 2回洗浄し 、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。
[0230] 図 19中の細胞外染色における、各変異 PERPに対する KM3821の反応性は、 K M3821の hPERPに対する反応性を 100%とした時の、各変異 PERPある!/、はサル PERPに対する反応性（％)で示した。
[0231] その結果、 KM3821は、マウス PERPの細胞外領域を有する mPERP、および PE RP細胞外領域のループ 1のみがマウスのアミノ酸である mL— 1にはまったく反応せ ず、 PERP細胞外領域のループ 2のみがマウスのアミノ酸である mL— 2には反応した ことから、ヒト PERP細胞外領域のループ 1に反応することが明らかになった（図 19)。 更に、 KM3821は、 PERP細胞外領域のループ 1の中心部分にあたる 50番目、 52 番目および 53番目がマウスのアミノ酸である KSQには反応する力 40番目、 42番 目がマウスのアミノ酸である DGには、 hPERPに対する反応性に比べ 1Z10以下ま で、 KM3821の反応性が低下し、また、 62番目、 63番目がマウスのアミノ酸である E Eでも、 hPERPに比べ約 1 Z3まで KM3821の反応性が低下して 、た（図 19)。
[0232] 一方、 KM3821は、 PERP細胞外領域のループ 1内の 42番目のアミノ酸と、ルー プ 2内の 138番目のアミノ酸力 ヒト PERPのアミノ酸と異なるサル PERPに対して、 h PERPと同等に反応したことから、 42番目と 138番目のアミノ酸は、 KM3821の hPE RPに対する結合に対する影響は少ないと考えられる。
[0233] 以上の結果から、 KM3821は、ヒト PERP細胞外領域のループ 1内の 40番目の As Pを強く認識し、このアミノ酸残基と 62番目の Glu、 63番目の Glu力もなる、立体構造 を認識していることが明らかになった（図 19および図 20)。
[0234] (参考例 1) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造 を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗 PERPモノクローナル抗体の作 製 (1) PERP発現細胞の造成
ヒト PERP遺伝子を含むプラスミド HEMBA1006335 (GenBankァクセッション番 号； AK074585、 L) ^ L, lO X ExTaq 緩衝液 : L、 2mmol/L d
NTPを 2 L、 10 molZLの配列番号 39および配列番号 40に示される塩基配列 からなるプライマーをそれぞれ 2 L、 ExTaq polymerase (宝酒造社製） 0. 5 L 、滅菌水 10. 5 L力 なる溶液を、 94°Cで 5分間加熱後、 94°Cで 30秒間、 65°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間からなる反応を 25サイクル、 72°Cで 7分間反応させた。反応 産物をァガロースゲル電気泳動で分離し、約 0. 6kbの増幅断片を GENECLEAN Spin Kit (BIO101社製）を用いて抽出した。該断片と、 pCRII—TOPOベクターと を TOPO TA cloning Kit (Invitrogen社製）を用いて連結した後、コーェンらの 方法 [Proc. Nalt. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972) ]により大腸菌 DH5 a 株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット (キアゲン社製)を用 V、てプラスミドを抽出し、ヒト PERP遺伝子を含むプラスミド pCRII— PERPを取得した
[0235] PERP断片の 3'末端側に myc— Hisタグ配列を付加するためのクローユングベクタ 一として pBSmHを以下のようにして作製した。
pcDNA3. 1 (— ) Zmyc— HisC (Invitrogen社製]を Pmelで消化し、上記と同様 にして約 170bpの myc— Hisタグをコードする遺伝子を含む DNA断片を取得した。 該断片と、 Xbalおよび Kpnlで消化後、 T4 DNA polymerase (宝酒造社製）で末 端の平滑化を行った pBluescriptll SK (—）（ストラタジーン社製）とを DNAライゲ ーシヨンキット ver. 2 (宝酒造社製）により、連結した後、大腸菌 DH5 α株を形質転換 した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット (キアゲン社製)を用いてプラスミド を抽出し、プラスミド pBSmHを取得した。 pBSmHは、制限酵素 Xbalで該プラスミド を消化し、約 2. 9kbpおよび約 160bpの 2本の断片が生じた。
[0236] 上記の pCRII— PERPを EcoRIと Hindlllで消化し、 PERP遺伝子を含む断片を 取得した。該断片と、 EcoRIと Hindlllで消化した pBSmHとを DNAライゲーシヨンキ ット ver. 2 (宝酒造社製）により連結した後、大腸菌 DH5 α株を形質転換した。得ら れた形質転換体よりプラスミド抽出キット (キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、 プラスミド pBS - PERPmHを取得した。
[0237] pBS— PERPmHを EcoRIと Xbalで消化し、 PERP遺伝子および myc— Hisタグを コードする遺伝子を含む断片を取得した。該断片と、 EcoRIと Xbalで消化した pcDN A3. l + (Invitrogen社製）とを DNAライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造社製）により 連結した後、大腸菌 DH5 a株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽 出キット（キアゲン社製)を用いてプラスミドを抽出し、ヒト PERPの発現プラスミド pcP ERPmHを取得した。
[0238] pcPERPmHは、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990) ]に より以下のようにして CHO/DG44細胞 [Somatic Cell and Molecular Gene tics, 12 (6) , 555 (1986) ]へ導入した。
細胞は、 10%ゥシ胎児血清 (ライフテクノロジ一社製）、 1 X HT supplement (ライ フテクノロジ一社製）、 1% Penicillin— streptomycin (ライフテクノロジ一社製）を 添加した IMDM培地 (ライフテクノロジ一社製）（以下、 A3培地と表記する）で培養し たものを用いた。 CHOZDG44細胞を K—PBS緩衝液 [137nmolZL塩化カリウム 、 2. 7nmolZL塩化ナトリウム、 8. ImmolZLリン酸一水素ニナトリウム、 1. 5nmol ZLリン酸二水素一ナトリウム、 4mmolZL塩ィ匕マグネシウム緩衝液]に懸濁して 8 X 106細胞 ZmLの濃度に調製し、該細胞懸濁液 200 Lを上記発現プラスミド pcPER PmH 4 μ gと混和した。該混和液をキュベット（電極間距離 2mm)に移し、 GenePu lserll (バイオラッド社製）装置を用いてパルス電圧 0. 35kV、電気容量 250 μ Fの条 件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を A3培地中に懸濁し、 37°C、 5%COインキュベータ一中で培養した。 1日間培養後
2
、0. 5mg/mL G418 (カルビオケム社製）を添カ卩した A3培地に培地交換し、培養 を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約 2週間後に、 G418に耐 性を有する形質転換細胞株を取得した。
[0239] 得られた形質転換細胞を 1. 25細胞 ZmLとなるよう 0. 5mg/mL G418を添カロし た A3培地で希釈後、 96ゥエルプレートに 200 /z Lずつ分注して、限界希釈法による クロー-ングを行った。
上記で取得された形質転換細胞 1〜5 X 105個を 15 Lの 1 X PAGE bufferに 溶解して 95°Cで 5分間処理し、 SDS—ポリアクリルアミド電気泳動 [Antibodies— A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)〕にて分画 後、 PVDF膜にブロッテイングした。 BSA— PBSでブロッキング後、抗 mycモノクロ一 ナル抗体 9E10 (MBL社製）を室温で 1時間反応させた。 Tween— PBSで洗浄した 後、第二抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグロブリン抗体 (ダコ社製） を室温で 1時間反応させた。 Tween— PBSでよく洗浄した後、検出は ECL— detect ion kit (アマシャム社製）を用いて行 、、 X線フィルム上に感光させた。
図 5に結果を示した。分子量 25kDa付近にシグナルが認められた株を PERP発現 株（以下、 PERPZCHO細胞と表記する）とした。
[0240] (2) モノクローナル抗体の作製
(2)— 1 免疫原の調製
上記（1)で造成した PERP発現株を 10%牛胎児血清入り Iscove' s Modified D ulbecco' s培地 (インビトロジェン社製)で 2〜3日培養後、 1匹あたりの細胞数が 6 X 106個から 1 X 107個の細胞数となるように PBSに懸濁した。
[0241] (2) - 2 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
参考例 1 (2) - 1で調製した細胞を、百日咳ワクチン (千葉県血清研究所製） 1 X 10 9細胞とともに 6週令雌 BalbZCマウス 3匹に投与した。投与 1週間後より、毎週 1回、 計 5回投与した。該マウスの眼底より部分採血し、その血中抗体価を以下に示す細 胞を用いた蛍光抗体染色法を行 、、 FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシ ステム社製)およびフローサイトメーター（ベックマンコールター社製)で測定し、十分 な抗体価を示したマウス力も最終免疫 3日後に脾臓を摘出した。
[0242] 脾臓を MEM (Minimum Essential Medium)培地（日水製薬社製）中で細断 し、ピンセットでほぐし、遠心分離（250 X g、 5分間）した。得られた沈殿画分にトリス —塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (pH7. 6)を添カ卩し、 1〜2分間処理することにより赤血球 を除去した。得られた沈殿画分 (細胞画分)を MEM培地で 3回洗浄し、細胞融合に 用いた。
[0243] (2) - 3 細胞を用いた蛍光抗体染色法（FMAT:Fluorometric Microvolume Assay Technologyノ アツセィ用の細胞は参考例 1 (1)で造成した PERPZCHO細胞と CHOZDG44 細胞を用いた。 10%牛胎児血清入り Iscove' s Modified Dulbecco' s培地 [イン ビトロジェン社]で 2〜3日培養し、 Tripsin— EDTA溶液 (インビトロジェン社製）で剥 離した細胞を同一の培地に懸濁し、 FMAT用黒色 96ゥエルプレートに 7 X 103個 Z 100 /z L培地 Zゥエルで播種し、 1晚培養した。該プレートに一次抗体として被免疫 マウス抗血清あるいはハイプリドーマ培養上清を 5 LZゥエルで分注し、二次抗体と して ALEXA647標識抗マウスィムノグロブリン G (H+L) (モレキュラープローブ社 製）を 50 LZゥエルで分注し、遮光下で 4時間放置した。レーザー光 633nmHeZ Neで励起される 650nm〜685nmの波長を FMAT8100HTSシステム（アプライ ドバイォシステム社製)で測定した。
[0244] (2) -4 細胞を用いた蛍光抗体染色法 (フローサイトメトリー）
アツセィ用の細胞は参考例 1 (1)で造成した PERPZCHO細胞と CHOZDG44 細胞を用いた。 10%牛胎児血清入り Iscove' s Modified Dulbecco，s培地（イン ビトロジェン社製)で 2〜3日培養し、 0. 02%EDTA溶液 (ナカライテスタ社製)で剥 離した細胞を PBSで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるために BSA— PBSを 用いて、氷温中で 20分ブロッキングした。 1 X 106個 Z100 μ LZBSA— PBSとなる ように 96ゥエル U字プレートに分注し、遠心分離（1800rpm、 2分間）した後、上清を 除いて一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイプリドーマ培養上清を 50 LZゥェ ル分注し、氷温中で 30分間反応させた。 PBSを用いて遠心分離法で 3回洗浄し、二 次抗体として ALEXA488標識抗マウスィムノグロブリン G (H+L) (モレキュラープロ 一ブネ土製）を 20 LZゥェルカ卩えて氷温で遮光下、 30分間反応させた。再び PBSを 用いて洗浄し、 PBSに懸濁してレーザー光 488nmArで励起される 510〜530nm の波長をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定した。
[0245] (2) - 5 マウス骨髄腫細胞の調製
8—ァザグァニン而性マウス骨髄腫細胞株 P3X63Ag8U. 1 : P3—U1 [ATCC C RL- 1597 : European Journal of Immunology, 6, 511 (1976) ]を正常培地 (10%ゥシ胎児血清添加 RPMI培地)で培養し、細胞融合時に 2 X 107個以上の細 胞を確保し、細胞融合に供した。 [0246] (2)— 6ハイブリドーマの作製
上記（2)— 2で得られたマウス脾細胞と（2)— 5で得られた骨髄腫細胞とを 10： 1に なるよう混合し、遠心分離 (250 X g、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群を よくほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングライコール— 1000 (PEG— 1 000) 2g、 MEM培地 2mLおよびジメチルスルホキシド 0. 7mLの混液 0. 2〜： LmL ZlO8マウス脾細胞を加え、 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mLを数回加えた後、 M EM培地をカ卩えて全量が 50mLになるようにした。遠心分離（900rpm、 5分間）後、 上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆる やかに細胞を HAT培地 1 OOmL中に懸濁した。
[0247] この懸濁液を 96ゥエル培養用プレートに 200 μ LZゥエルずつ分注し、 5%CO
2ィ ンキュベータ一中、 37°Cで 10〜14日間培養した。培養後、培養上清を本参考例（2 )一 3および（2)— 4に記載した蛍光抗体染色で調べ、 PERPZCHO細胞に反応し て CHO/DG44細胞に反応しな 、ゥエルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈 法によるクローユングを 2回繰り返し、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの 細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗 PERP 抗体産生ハイブリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)を確立した。
[0248] 図 6には、ハイプリドーマ KM3411の培養上清に含まれるモノクローナル抗体の、 FMAT法における PERPZCHO細胞および CHOZDG44細胞に対する反応性を 示した。ハイプリドーマ KM3411が生産するモノクローナル抗体 KM3411は、 PER PZCHO細胞にのみ特異的に反応した。
[0249] (2) - 7 モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（BALBZc)に参考例 1 (2) 5で得られた ノ、イブリドーマ株を 5〜20 X 106細胞 Z匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後、 ノ、イブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（1〜 8mLZ匹）した。
[0250] 該腹水を遠心分離 (1200 X g、 5分間)し固形分を除去した。精製 IgGモノクローナ ル抗体は、力プリル酸沈殿法 [Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spr ing Harbor Laboratory (1988) ]により精製することにより取得した。サブクラスタ ィビングキットを用いた ELISA法により、精製した抗 PERPマウス抗体 KM3411のサ ブクラスを決定したところ、抗 PERPマウス抗体 KM3411のサブクラスは IgGlであつ た。
[0251] (2) -8 モノクローナル抗体の反応性の検討一蛍光細胞染色 (フローサイトメトリー） 上記（2) -4 に示した方法に従って行なった。結果を図 7に示す。 KM3411は P ERPZCHO細胞および大腸癌細胞株 Colo205に反応して、 CHOZDG44細胞 および PERPmRNAが発現してな!、PC1には反応しなかった。
[0252] (参考例 2) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造 を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗 PERPキメラ抗体の作製 (1) PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異 的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗 PERPマウス抗体の可変領域をコード する cDNAの単離、解析
[0253] (1) 1 抗 PERPマウス抗体産生ハイブリドーマ細胞からの mRN Aの調製
参考例 1に記載のハイプリドーマ KM3411より、 mRNAの調製キットである Fast Track 2. 0 Kit (Invitrogen社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリ ドーマ細胞 4 X 107細胞より約 39 μ gの mRNAを調製した。
[0254] (1) 2 抗 PERPマウス抗体 KM3411の H鎖および L鎖可変領域の遺伝子クロー ユング
上記（1)— 1で取得した抗 PERPマウス抗体 KM3411の mRNAの 1 μ g力ら、 BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences社製）を用 いて、添付の使用説明書に従い、 5，側にキット添付の BD SMART II™ A Olig onucleotide配列を有する cDNAを取得した。その cDNAを铸型として、キット添付 のユニバーサルプライマー Amixと、配列番号 41で示したマウス Ig ( y )特異的プライ マーを用いて PCR反応を行 ヽ VHの cDNA断片を増幅した。また Ig ( γ )特異的ブラ イマ一の代わりに配列番号 42で示したマウス Ig ( κ )特異的プライマーを用いて PCR を行 、VLの cDNA断片を増幅した。
[0255] PCRは、 94°Cで 5分間加熱後、 94°Cで 15秒間、 72°Cで 3分間力もなる反応サイク ルを 5回、 94°Cで 15秒間、 70°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間力もなる反応サイクルを 5 回、 94°Cで 15秒間、 68°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間力もなる反応サイクルを 30回そ れぞれ行った後、 72°Cで 10分間反応させた。 PCRは GeneAmp PCR system9 700 (アプライドバイォシステムズ社製)を用いて行った。得られた PCR産物は H鎖、 L鎖共に約 500bpのサイズであった。
[0256] 得られた PCR産物の塩基配列を決定するため、 pBluescriptll SK (—）ベクター（ Stratagene社製）を Smalで消化して得られた DNAを約 0. 05pmolと、上記で得ら れたそれぞれの PCR産物約 0. 5pmolを TAKARA DNA Ligation Kit ver. 2 (宝酒造社製）の Solutionlを 6 μ L、制限酵素 Smalを 0. 3 μ L入れ合計 12. 3 μ L· とし、 22°Cでー晚、反応させた。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶液を 用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換した。形質転換株のクローンよ り各プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS R eady Reaction Kit (PEバイオシステムズ社製）を用い添付の説明書に従って反 応後、同社のシーケンサー ABI PRISM3700により塩基配列を解析した。その結 果、 cDNAの 5 '末端に開始コドンと推定される ATG配列が存在する、完全長の H鎖 cDNAを含むプラスミド pKM3411H # 9および L鎖 cDNAを含むプラスミド pKM34 11L # 4が取得された。
[0257] (1) 3 抗 PERPマウス抗体の V領域のアミノ酸配列の解析
プラスミド PKM3411H # 9に含まれて!/、た VHの全塩基配列を配列番号 43に、該 配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型 VHの全アミノ酸配列を配列番 号 37に、プラスミド pKM3411L # 4に含まれて!/、た VLの全塩基配列を配列番号 44 におよび該配列力も推定された、シグナル配列を含んだ分泌型 VLの全アミノ酸配列 を配列番号 38にそれぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ [SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest, U¾ Dept. Health and Hu man Services ( 1991) ]との比較、並びに精製した抗 PERPマウス抗体 KM3411 の H鎖および L鎖の N末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製 ： PPSQ - 10)を用いて解析した結果との比較から、単離した各々の cDNAは分泌 シグナル配列を含む抗 PERPマウス抗体 KM3411をコードする完全長 cDNAであり 、 H鎖については配列番号 37に記載のアミノ酸配列の 1から 18番目力 L鎖につい ては配列番号 38に記載のアミノ酸配列の 1から 22番目が分泌シグナル配列であるこ とが明ら力となった。
[0258] 次に、抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHおよび VLのアミノ酸配列の新規性につ いて検討した。配列解析システムとして GCG Package (version 9. 1、 Genetics Computer Group社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースを B LASTP法 [Nucleic Acids Res. , 25, 3389 (1997) ]により検索した。その結果 、 VH、 VLともに完全に一致するアミノ酸配列は認められず、抗 PERPマウス抗体 K M3411の VHおよび VLは新規なアミノ酸配列を有して ヽることが確認された。
[0259] また、抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHおよび VLの CDRを、既知の抗体のアミ ノ酸配列と比較することにより同定した。抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHの CDR 1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列を配列番号 3、 45および 5に、 VLの CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列を配列番号 11、 12および 13にそれぞれ示した。
[0260] (2) 抗 PERPキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
(2)— 1 抗 PERPキメラ抗体発現ベクター pKANTEX3411の構築
WO97Z10354に記載のヒト化抗体発現用ベクター PKANTEX93と上記（1) 2 で得られたプラスミド PKM3411H # 9および pKM3411L # 4を用いて抗 PERPキメ ラ抗体発現ベクター PKANTEX3411を以下のようにして構築した。
[0261] 抗 PERPマウス抗体 KM3411の VHをコードする cDNAを PCR法によって得るた めに配列番号 46と 47の塩基配列を有する合成 DNAを、 VLをコードする cDNAを 得るために配列番号 48と 49の塩基配列を有する合成 DNAをそれぞれ設計、合成 した。それぞれの合成 DNA (ジェンセット社製）は 5，末端に pKANTEX93へクロー ユングするための制限酵素認識配列を含んでいる。上記（1) 2で得られたプラスミ ド pKM3411H # 9の 20ngを の KOD DNA Polymerase添付 PCR Buff er # 1 (東洋紡績社製）、 0. 2mmol/L dNTPs、 lmmol/L塩ィ匕マグネシウム、 0. 5 molZLの配列番号 46と 47に示される塩基配列の合成 DNAを含む緩衝液 に添加し、サーマルサイクラ一を用いて、 94°Cで 3分間加熱した後、 2. 5単位の KO D DNA Polymerase (東洋紡績社製）を添カ卩し、 94°Cで 30秒間、 58°Cで 30秒間 、 74°Cで 1分間からなる反応サイクルを 25サイクル行った。同様に、参考例 2 (1) - 2 で得られたプラスミド PKM3411L # 4の 20ngを 50 μ Lの KOD DNA Polymeras e添付 PCR Buffer # 1 (東洋紡績社製）、 0. 2mmol/L dNTPs、 ImmolZL塩 ィ匕マグネシウム、 0. 5 molZLの配列番号 48と 49でそれぞれ示される塩基配列の 合成 DNAを含む緩衝液に添カ卩し、上記の方法で PCRを行なった。該反応液 40 L をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 社製）を用いて、約 0. 47kbの VHの PCR産物、約 0. 45kbの VLの PCR産物をそれ ぞれ回収した。
[0262] 次に、プラスミド pBluescriptll SK (—）（Stratagene社製）を制限酵素 Smal (宝 酒造社製）で消化した DN AO. 05pmolと、上記で得られたそれぞれの PCR産物約 0. 5pmolを滅菌水にカロ免て とし、さらに TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝酒造社製） 10 μ L、制限酵素 Smal (宝酒造社製) 0. 5 Lをカ卩えて 2 2°Cで一晩にわたって反応させた。このようにして得られた組換えプラスミド DNA溶 液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換した。得られた形質転換株 のクローンより各プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequen cing FS Ready Reaction Kit (PE Biosystems社製）を用いて添付の説明書 に従って反応後、同社の DNAシーケンサー ABI PRISM 3700〖こより塩基配列を 解析し、目的の塩基配列を有する図 8に示したプラスミド pKM3411VH9および pK Μ3411 VL 11が得られたことを確認した。
[0263] 次にヒト化抗体発現用ベクター pKANTEX93と上記で得られた pKM3411VLl l をそれぞれ制限酵素 BsiWI (New England BioLabs社製)で消化後、引き続き制 限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消化した。消化後の反応液をァガロースゲル電気泳 動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、約 0. 45 kbの VLの EcoRI— BsiWI断片と、約 12. 7kbの pKANTEX93の EcoRI— BsiWI 断片をそれぞれ回収した。
[0264] 得られた 2種類の断片を Ligation high (東洋紡績社製)を用いて添付の説明書 に従って連結し、得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株 (東 洋紡績社製)を形質転換した。得られた形質転 ·のクローンより各プラスミド DNA を調製して制限酵素処理により確認し、目的の約 0. 45kbの EcoRI— BsiWI断片が 挿入された、図 9に示したプラスミド pKANTEX3411VLが得られたことを確認した。
[0265] 次に、上記で得られた pKANTEX3411VLと pKM3411VH9をそれぞれ制限酵 素 Apal (宝酒造社製)で消化後、引き続き制限酵素 Notl (宝酒造社製)で消化した。 消化後の反応液をァガロースゲル電気泳動した後、約 13. 2kbの pKANTEX3411 VL由来の Apal— Notl断片、約 0. 47kbの pKM3411VH9由来の Apal— Notl断 片をそれぞれ回収した。得られた 2種類の断片を Ligation high (東洋紡績社製)を 用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて 大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換した。得られた形質転換株のクローン より各プラスミド DNAを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約 0. 47kbの A pal - Notl断片が挿入された、図 9に示したプラスミド PKANTEX3411が得られた ことを確認した。該プラスミドに関して、 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (PE Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従 つて反応後、同社の DNAシーケンサー ABI PRISM 3700により塩基配列を解析 した結果、目的の KM3411の VHをコードする cDNAおよび VLをコードする cDNA がそれぞれクローユングされたプラスミドが得られたことを確認した。
[0266] (2) - 2 抗 PERPキメラ抗体の動物細胞での発現
上記（2) - 1で得られた抗 PERPキメラ抗体発現ベクター PKANTEX3411を用い て抗 PERPキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法 [Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company ( 1992) ]【こより行!ヽ、 pKA NTEX3411が導入された形質転^ ¾KM3481を取得した。
[0267] (3) 精製抗体の取得
上記（2)— 2で得られた形質転換株を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液 を回収し、 3000rpm、 4°Cの条件で 5分間の遠心分離を行って培養上清を回収した 後、培養上清は 0. 22 μ m孔径 MillexGVフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅 菌した。得られた培養上清より Mab Select (アマシャム'バイオサイエンス社製)カラ ムを用いて、添付の説明書に従い、抗 PERPキメラ抗体 KM3481を精製した。
[0268] 得られた抗 PERPキメラ抗体 KM3481の精製標品の精製度および発現分子サイ ズを、グラジュェントゲル (ATTO社製、カタログ番号： E— T520L)を用いて、添付の 説明書に従い、 SDS— PAGEにより確認した。抗 PERPマウス抗体 KM3411を対 照として同時に泳動した。
結果を図 10に示した。精製した抗 PERPキメラ抗体 KM3481は、非還元条件下で は分子量が約 150キロダルトン（以下、 Kdと表記する）の 1本のバンド力 還元条件 下では約 50Kdと約 25Kdの 2本のバンドが認められた。これらの分子量は、 IgGクラ スの抗体は、非還元条件下では分子量は約 150Kdであり、還元条件下では分子内 の S— S結合が切断され、約 50Kdの分子量を持つ H鎖と約 25Kdの分子量を持つ L 鎖に分解されるという報告 [Antibodies— A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor Laboratory, Chapter 14、1988)、 Monoclonal Antibodies― Principles and Practice, Academic Press Limited (1996) ]と一致し、抗 PERPキメラ抗体 KM3481が正し ヽ構造の抗体分子として発現されて!ヽることが確 認された。抗 PERPキメラ抗体 KM3481のアミノ酸配列は配列番号 29に示される。 産業上の利用可能性
本発明によると、 V領域に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、 P ERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認 識し、該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または抗体断片、該遺伝子組 換え抗体または該抗体断片を用いる癌の治療薬、該遺伝子組換え抗体または該抗 体断片をコードする DNA、該 DNAを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換し て得られる形質転換体または該形質転換体を培養することを含む抗体の製造方法 が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 抗体の可変領域 (以下、 V領域と記す）に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配 列を有さな 、、 PERP遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構 造を特異的に認識し、該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または抗体断片
[2] 抗体の重鎖可変領域 (以下、 VHと記す)および軽鎖可変領域 (以下、 VLと記す） の全ての相補性決定領域（Comprimentarity Determining Region;以下、 CD Rと記す）に N結合型糖鎖が結合するコンセンサス配列を有さない、請求項 1に記載 の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[3] 抗体の VHの CDR1および CDR3が、それぞれ配列番号 3および 5で示されるアミ ノ酸配列を含む、請求項 1または 2記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[4] 抗体の VLの CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13で示される アミノ酸配列を含む、請求項 1または 2記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[5] 抗体の VHの CDR1および CDR3が、それぞれ配列番号 3および 5で示されるアミ ノ酸配列を含み、かつ、抗体の VLの CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 1 2および 13で示されるアミノ酸配列を含む、請求項 1または 2記載の遺伝子組換え抗 体または抗体断片。
[6] 抗体の VHの CDR2が、配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを他の アミノ酸残基に置換する改変および 11番目の Serを他のアミノ酸残基に置換する改 変のうち、少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項 1〜5のい ずれ力 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[7] 配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを他のアミノ酸残基に置換する 改変が、 9番目の Asnを極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変である、請求 項 6に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[8] 極性側鎖を有するアミノ酸残基が Tyrまたは Serである、請求項 7に記載の遺伝子 組換え抗体または抗体断片。
[9] 配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 9番目の Asnを他のアミノ酸残基に置換する 改変が、 9番目の Asnを Glyに置換する改変である、請求項 6に記載の遺伝子組換 え抗体または抗体断片。
[10] 配列番号 45で示されるアミノ酸配列の 11番目の Serを他のアミノ酸残基に置換す る改変が、 11番目の Serを非極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換する改変である、 請求項 4〜9のいずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[11] 非極性側鎖を有するアミノ酸残基が Alaである、請求項 10に記載の遺伝子組換え 抗体または抗体断片。
[12] 抗体の VHの CDR2が、配列番号 4および 6〜10のいずれ力 1つで示されるァミノ 酸配列を含む、請求項 1〜11の!ヽずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗 体断片。
[13] 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体力も選ばれる、請 求項 1〜12のいずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[14] ヒト型キメラ抗体の VH力 配列番号 14〜19のいずれか 1つで示されるアミノ酸配 列を含む、請求項 13に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
[15] ヒト型キメラ抗体の VLが配列番号 20で示されるアミノ酸配列を含む、請求項 13〖こ 記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
[16] ヒト型キメラ抗体の VH力 配列番号 14〜19のいずれか 1つで示されるアミノ酸配 列を含み、かつ、 VLが配列番号 20で示されるアミノ酸配列を含む、請求項 13に記 載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
[17] ヒト化抗体の VH力 配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列また は配列番号 30〜35のいずれか 1つで示されるアミノ酸配列の 27番目の Glyを Phe に、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番 目の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換する改変カゝら選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配 列を含む、請求項 13に記載のヒト化抗体または抗体断片。
[18] ヒト化抗体の VL力 配列番号 36で示されるアミノ酸配列または配列番号 36で示さ れるアミノ酸配列の 3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Phe に、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番 目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに、および 77番目の Leuを Metに置換する 改変から選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、請求項 13 に記載のヒト化抗体または抗体断片。
[19] ヒト化抗体の VH力 配列番号 30〜35のいずれ力 1つで示されるアミノ酸配列また は配列番号 30〜35のいずれか 1つで示されるアミノ酸配列の 27番目の Glyを Phe に、 30番目の Serを Thrに、 41番目の Proを Pheに、 44番目の Lysを Asnに、 45番 目の Glyを Argに、 49番目の lieを Metに、 72番目の Valを Argに、および 97番目の Alaを Thrに置換する改変カゝら選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配 列を含み、かつ、
ヒト化抗体の VL力 配列番号 36で示されるアミノ酸配列または配列番号 36で示さ れるアミノ酸配列の 3番目の Ginを Valに、 5番目の Thrを lieに、 35番目の Tyrを Phe に、 42番目の Alaを Serに、 46番目の Leuを Trpに、 69番目の Aspを Serに、 70番 目の Pheを Tyrに、 71番目の Thrを Serに、および 77番目の Leuを Metに置換する 改変から選ばれる少なくとも 1つの改変が導入されたアミノ酸配列を含む、
請求項 13に記載のヒト化抗体または抗体断片。
[20] ヒト化抗体の VH力 配列番号 51〜56のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を含 む、請求項 13に記載のヒト化抗体または抗体断片。
[21] ヒトイ匕抗体の VL力 配列番号 58〜63のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を含 む、請求項 13に記載のヒト化抗体または抗体断片。
[22] ヒト化抗体の VH力 配列番号 51〜56のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列を含 み、かつヒト化抗体の VL力 配列番号 58〜63のいずれか 1つに示されるアミノ酸配 列を含む、請求項 13に記載のヒト化抗体または抗体断片。
[23] ハイプリドーマ KM3411 (FERM BP— 8643)力 生産されるモノクローナル抗体 が認識するェピトープに結合する、請求項 1〜22のいずれか 1項に記載の遺伝子組 換え抗体または抗体断片。
[24] 抗体断片が、 Fab、 Fab '、 F (ab ' ) 、一本鎖抗体（scFv)、二量体化 V領域 (Diabo
2
dy)、ジスルフイド安定化 V領域 (dsFv)および CDRを含むペプチド力 選ばれる抗 体断片である請求項 1〜23のいずれか 1項に記載の抗体断片。
[25] 該立体構造が、配列番号 2で示されるアミノ酸配列の 40番目の Asp、 62番目の G1 uおよび 63番目の Gluを少なくとも含む立体構造である、請求項 1〜24のいずれ力 1 項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
[26] 請求項 1〜25の 、ずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片をコード する DNA。
[27] 請求項 26に記載の DNAを含有する組換え体ベクター。
[28] 請求項 27に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
[29] 請求項 28に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項 1〜25のいず れか 1項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体または該 抗体断片を採取することを特徴とする請求項 1〜25のいずれか 1項に記載の遺伝子 組換え抗体または抗体断片の製造方法。
[30] 請求項 1〜25の 、ずれか 1項に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片を有効 成分として含有する PERP遺伝子が関与する疾患の治療剤。
[31] PERP遺伝子が関与する疾患が癌である、請求項 30に記載の治療剤。
PCT/JP2006/324385 2005-12-06 2006-12-06 抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体 WO2007066698A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06834140A EP1959009A4 (en) 2005-12-06 2006-12-06 GENETICALLY RECOMBINANT ANTI-PERP ANTIBODIES
JP2007549159A JP5095416B2 (ja) 2005-12-06 2006-12-06 抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体
CA002632419A CA2632419A1 (en) 2005-12-06 2006-12-06 Genetically recombinant anti-perp antibody
AU2006323706A AU2006323706A1 (en) 2005-12-06 2006-12-06 Genetically recombinant anti-PERP antibody

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-352297 2005-12-06
JP2005352297 2005-12-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007066698A1 true WO2007066698A1 (ja) 2007-06-14

Family

ID=38122844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/324385 WO2007066698A1 (ja) 2005-12-06 2006-12-06 抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8093362B2 (ja)
EP (1) EP1959009A4 (ja)
JP (1) JP5095416B2 (ja)
AU (1) AU2006323706A1 (ja)
CA (1) CA2632419A1 (ja)
WO (1) WO2007066698A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109391434A (zh) * 2017-08-11 2019-02-26 中兴通讯股份有限公司 参考信号的配置方法及装置
JP2019534844A (ja) * 2016-09-08 2019-12-05 ウリィ・テクノロジーズ・コーポレーション ｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する脱糖化抗体及びその用途

Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5623587A (en) 1979-08-03 1981-03-05 Mitsuwa Seiki Co Ltd Vane type compressor
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
JPS61178926A (ja) 1984-03-06 1986-08-11 Takeda Chem Ind Ltd 化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法
JPS63299A (ja) 1986-04-22 1988-01-05 イミユネツクス・コ−ポレ−シヨン ヒトｇ−ｃｓｆタンパク質の発現
JPH02117920A (ja) 1988-05-06 1990-05-02 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
US4939094A (en) 1985-08-28 1990-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused antigen polypeptide
JPH02227075A (ja) 1988-09-29 1990-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
JPH05336963A (ja) 1991-12-17 1993-12-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
JPH06205694A (ja) 1992-09-07 1994-07-26 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒト化抗体
WO1994023021A1 (en) 1993-03-29 1994-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,3-FUCOSYLTRANSFERASE
WO1997010354A1 (en) 1995-09-11 1997-03-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ANTIBODY AGAINTS α-CHAIN OF HUMAN INTERLEUKIN 5 RECEPTOR
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1998055508A2 (en) 1997-06-03 1998-12-10 Sagami Chemical Research Center HUMAN PROTEINS HAVING TRANSMEMBRANE DOMAINS AND DNAs ENCODING THESE PROTEINS
WO1999005446A1 (en) 1997-07-21 1999-02-04 Itsac N.V. Connector assembly for a fluid connection
WO2000055350A1 (en) 1999-03-12 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. Human cancer associated gene sequences and polypeptides
WO2000055629A2 (en) 1999-03-15 2000-09-21 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosing and treating breast cancer
WO2001010883A1 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Massachusetts Institute Of Technology Cell death gene and uses thereof
WO2001022920A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
WO2001066719A1 (fr) 2000-03-07 2001-09-13 Chiba-Prefecture Nouveau gene clone en neuroblastome humain et nouveaux fragments de gene
WO2002000174A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2002047534A2 (en) 2000-12-12 2002-06-20 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2002060317A2 (en) 2001-01-30 2002-08-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
US20020119463A1 (en) 2000-07-28 2002-08-29 Mary Faris Prostate cancer markers
US20030065157A1 (en) 2001-04-04 2003-04-03 Lasek Amy W. Genes expressed in lung cancer
US20030064947A1 (en) 1998-03-18 2003-04-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
WO2005121338A1 (ja) * 2004-06-07 2005-12-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗ｐｅｒｐ抗体

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1287129A1 (en) 2000-05-19 2003-03-05 F.Hoffmann-La Roche Ag A process for determing the tumoricidal potential of a sample by the use of a nucleic acid which is downregulated in human tumor cells
AU2002367318B2 (en) 2002-01-02 2007-07-12 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20060286090A1 (en) * 2005-04-21 2006-12-21 Attardi Laura D Mediators of epithelial adhesion and their role in cancer and skin disorders
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer

Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5623587A (en) 1979-08-03 1981-03-05 Mitsuwa Seiki Co Ltd Vane type compressor
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
US4686191A (en) 1981-12-25 1987-08-11 Hakko Kogyo Co., Ltd. Kyowa Recombinant plasmid containing human interferon-beta gene
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
JPS61178926A (ja) 1984-03-06 1986-08-11 Takeda Chem Ind Ltd 化学修飾ペプチドホルモンおよびその製造法
US4939094A (en) 1985-08-28 1990-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused antigen polypeptide
JPS63299A (ja) 1986-04-22 1988-01-05 イミユネツクス・コ−ポレ−シヨン ヒトｇ−ｃｓｆタンパク質の発現
JPH02117920A (ja) 1988-05-06 1990-05-02 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
JPH02227075A (ja) 1988-09-29 1990-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
US5160735A (en) 1989-06-19 1992-11-03 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Plasminogen activator
JPH05336963A (ja) 1991-12-17 1993-12-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
JPH06205694A (ja) 1992-09-07 1994-07-26 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒト化抗体
WO1994023021A1 (en) 1993-03-29 1994-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,3-FUCOSYLTRANSFERASE
WO1997010354A1 (en) 1995-09-11 1997-03-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ANTIBODY AGAINTS α-CHAIN OF HUMAN INTERLEUKIN 5 RECEPTOR
WO1998055508A2 (en) 1997-06-03 1998-12-10 Sagami Chemical Research Center HUMAN PROTEINS HAVING TRANSMEMBRANE DOMAINS AND DNAs ENCODING THESE PROTEINS
WO1999005446A1 (en) 1997-07-21 1999-02-04 Itsac N.V. Connector assembly for a fluid connection
US20030064947A1 (en) 1998-03-18 2003-04-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2000055350A1 (en) 1999-03-12 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. Human cancer associated gene sequences and polypeptides
WO2000055629A2 (en) 1999-03-15 2000-09-21 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosing and treating breast cancer
WO2001010883A1 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Massachusetts Institute Of Technology Cell death gene and uses thereof
WO2001022920A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
WO2001066719A1 (fr) 2000-03-07 2001-09-13 Chiba-Prefecture Nouveau gene clone en neuroblastome humain et nouveaux fragments de gene
WO2002000174A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20020119463A1 (en) 2000-07-28 2002-08-29 Mary Faris Prostate cancer markers
WO2002047534A2 (en) 2000-12-12 2002-06-20 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2002060317A2 (en) 2001-01-30 2002-08-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
US20030065157A1 (en) 2001-04-04 2003-04-03 Lasek Amy W. Genes expressed in lung cancer
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
WO2005121338A1 (ja) * 2004-06-07 2005-12-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗ｐｅｒｐ抗体

Non-Patent Citations (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Antibodies-A Laboratmy Manual", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
"Antibodies-A Laboratory Mamial", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
"Antibodies-A Laboratory manual", 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
"Antibodies-A Laboratory Manual", vol. 14, 1988, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
"Antibody Engineering, A Practical Guide", 1992, W. H. FREEMAN AND COMPANY
"Antibody Engneering, A Practical Guide", 1992, FREEMAN AND COMPANY
"BLAST", J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403
"BLAST2", NUCLEIC ACIDS RES, vol. 25, 1997, pages 3389
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
"DNA Cloning, J: Core Techniques, A Practical Approach", 1995
"Methods in Nucleic Acids Res.", 1991, CRC PRESS, pages: 283
"Molecular Antibodies-Principles and Practice", 1996, ACADEMIC PRESS
"Molecular Cloning, A Laboratory Mamual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
"Monoclonal Anlibody Experiment Manual", 1987, KODANSHA SCIENTIFIC
"Monoclonal Antibodies-Principles and practice", 1996, ACADEMIC PRESS
"Monoclonal Antibody Experiment Manual", 1987, KODANSHA SCIENTIFIC
AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 53, 1989, pages 277
AGRICULTURAL BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 48, 1984, pages 669
ARRTICANCER RESEARCH, vol. 20, 2000, pages 2801
ATCC CRL-1597: EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 6, 1976, pages 511
ATTARDI L.D. ET AL.: ""PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family", GENES DEV., vol. 14, no. 6, 2000, pages 704 - 718, XP002436523 *
BIOCHEM. BIOPHYS. RES COMMUN, vol. 149, 1987, pages 960
BIOCHEM. J, vol. 355, 2001, pages 245
BIOCHEM. J., vol. 195, 1981, pages 639
BIOCHEMISTRY, vol. 32, 1993, pages 3131
BLOOD, vol. 65, 1985, pages 1349
BRITISH JOURNAL OF CANCER, vol. 39, 1976, pages 15
CANCER IMMUNO IMMUNOTHER., vol. 36, 1993, pages 373
CANCER IMMUNOL. IMMUNOTHER., vol. 36, 1993, pages 373
CANCER RES., vol. 46, 1986, pages 6489
CANCER RES., vol. 52, 1992, pages 3402
CANCER RES., vol. 56, 1996, pages 1118
CELL, vol. 33, 1983, pages 717
CELL, vol. 41, 1985, pages 479
CO M.S. ET AL.: "Genetically engineered deglycosylation of the variable domain increases the affinity of an anti-CD33 monoclonal antibody", MOL. IMMUNOL., vol. 30, no. 15, 1993, pages 1361 - 1367, XP002425227 *
COHEN ET AL., PROC. NATL. ACAD SCI., USA, vol. 69, 1972, pages 2110
CURR. BIOL., vol. 13, 2003, pages 1985
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BICALOGY, pages 1 - 34
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 1 - 34
CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMINITNOLOGY, vol. 18, 1978, pages 1
CYLOTECHNOLOGY, vol. 3, 1990, pages 133
CYTOLECHNOLOGY, vol. 3, 1990, pages 133
CYTOTECHNOL., vol. 13, 1993, pages 79
CYTOTECHNOL., vol. 3, 1990, pages 133
CYTOTECHNOL., vol. 4, 1990, pages 173
CYTOTECHNOLOGY, vol. 3, 1990, pages 133
DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, vol. I, 1985, pages 49
ELISA: "Monoclonal Antibodies-Principles and practice", 1996, ACADEMIC PRESS
EUROPECM J IMMUNOLOGY, vol. 6, 1976, pages 511
GENE, vol. 17, 1982, pages 107
GENE, vol. 27, 1984, pages 223
GENE, vol. 33, 1985, pages 103
GENE, vol. 34, 1985, pages 315
GENE, vol. 38, 1985, pages 275
GENES & DEVELOPMENT, vol. 14, 2000, pages 704
GENES DEVELOP., vol. 4, 1990, pages 1288
GENETICS, vol. 39, 1954, pages 440
GENOME RES., vol. 7, 1997, pages 649, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html>
HIROKAWA SHOTEN, BIOCONJUGATE DRUG, 1993
HYBRIDOMA, vol. 17, 1998, pages 559
IMMUNOL., vol. 85, 1995, pages 668
ISHIYAKU SHUPPAN, INFLAMMATION AND ANTI-INFLAMMATORY THERAPY, 1982
J BIAL. CHEM., vol. 271, 1996, pages 2966
J IMMUNOLOGY, vol. 123, 1979, pages 154
J. BACTERIOL., vol. 172, 1990, pages 2392
J. BIOCHEM., vol. 101, 1987, pages 1307
J. BIOCHEMISTRY, vol. 101, 1987, pages 1307
J. IMMUNOL. METHODS, vol. 167, 1994, pages 271
J. IMMUNOL., vol. 135, 1985, pages 1530
J. IMMUNOL., vol. 144, 1990, pages 1382
J. MOL. BIOL., vol. 112, 1977, pages 535
J. MOL. BIOL., vol. 16, 1966, pages 118
J. MOL., vol. 166, 1983, pages 1
J. MOL., vol. 215, 1990, pages 403
J. NATL. CANCER INST., vol. 80, 1988, pages 932
J. NATL. CANCER INST., vol. 80, 1988, pages 937
J. NUCL. MED., vol. 26, 1985, pages 1011
J: CLIN. ONCOL., vol. 2, 1984, pages 881
LOWE ET AL., PROC, NATL. ACAD SCI. USA, vol. 86, 1989, pages 8227
METHODS IN ENZYMOL, vol. 154, 1987, pages 3
MOL. CELL. BIOL., vol. 3, 1983, pages 280
MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 168, 1979, pages 111
MOLECULAR IMMTINOL, vol. 32, 1995, pages 249
NATURE BIOTECHNOL, vol. 15, 1997, pages 629
NATURE, vol. 227, 1970, pages 680
NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
NATURE, vol. 276, 1978, pages 269
NATURE, vol. 322, 1988, pages 323
NATURE, vol. 329, 1987, pages 840
NUCLEIC ACID RES., vol. 25, 1997, pages 3389
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 10, 1982, pages 6487
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 11, 1989, pages 9494
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 13, 1985, pages 4431
PAULSON ET AL., J. BIOL. CHEM, vol. 264, 1989, pages 17619
PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 69, 1972, pages 2110
PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 78, 1981, pages 1527
PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 1242
PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 4306
PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 488
PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 84, 1987, pages 7413
PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 77, 1980, pages 4216
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 79, 1982, pages 6409
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 84, 1987, pages 7413
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
PROTEIN ENGINEERING, Z, 1994, pages 1501
REITER ET AL., PROTEIN ENGINEERING, 1994, pages L 697
SANGER, F. ET AL., PROC. NATL. ACAD SCI. USA, vol. 74, 1977, pages 5463
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
SCIENCE, vol. 222, 1983, pages 778
SCIENCE, vol. 242, 1988, pages 423
See also references of EP1959009A4 *
SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 1991
SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL. INTEREST, 1991
SEQUENCES OFPROTEINS OF IMMUNOLGICAL INTEREST, 1991
SOMATIC CELL AND MOLECULAR GENETICES, vol. 12, 1986, pages 55
SOMATIC CELL AND MOLECULAR GENETICS, vol. 12, no. 6, 1986, pages 555
STRATEGIES, vol. 5, 1992, pages 81
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
TRENDS IN GLYCOSCIENCE AND GLYCATECHHOLOGY, vol. 11, 1991, pages 1
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019534844A (ja) * 2016-09-08 2019-12-05 ウリィ・テクノロジーズ・コーポレーション ｃｌｅｃ１４ａに特異的に結合する脱糖化抗体及びその用途
CN109391434A (zh) * 2017-08-11 2019-02-26 中兴通讯股份有限公司 参考信号的配置方法及装置

Also Published As

Publication number Publication date
EP1959009A1 (en) 2008-08-20
EP1959009A4 (en) 2010-04-28
US20080267953A1 (en) 2008-10-30
US8093362B2 (en) 2012-01-10
JP5095416B2 (ja) 2012-12-12
JPWO2007066698A1 (ja) 2009-05-21
AU2006323706A1 (en) 2007-06-14
AU2006323706A8 (en) 2008-05-22
CA2632419A1 (en) 2007-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3946256B2 (ja) ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
JP5425775B2 (ja) 抗ｃｄ２７抗体
TWI501777B (zh) 人類抗ｃｄ２７單株抗體
JP5586146B2 (ja) ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体
JP5730570B2 (ja) 抗システムａｓｃアミノ酸トランスポーター２（ａｓｃｔ２）抗体
JPWO2008114733A1 (ja) 抗Ｃｌａｕｄｉｎ−４抗体
JP5532401B2 (ja) ヘパリン結合上皮細胞増殖因子様増殖因子に結合するモノクローナル抗体
JP5812869B2 (ja) 抗システムａｓｃアミノ酸トランスポーター２（ａｓｃｔ２）抗体
KR20120110141A (ko) 항 ＩｇＡ１ 항체
JP2022547850A (ja) 抗ｔｉｇｉｔ免疫阻害剤及び応用
JP5651893B2 (ja) 抗ｐｅｒｐ抗体
US11912775B2 (en) Anti-human CCR1 monoclonal antibody
WO2016063522A1 (ja) 抗ヒトＧａｓ６モノクローナル抗体
WO2007066698A1 (ja) 抗ｐｅｒｐ遺伝子組換え抗体
JP2001046066A (ja) 新規な相補性決定領域を有するヒトｖｅｇｆ受容体ｋｄｒに対する抗体
JP3679406B2 (ja) 遺伝子組換え抗体
AU2014357450B2 (en) Antibodies targeting B-cell receptor complex membrane bound IgM and uses thereof
KR20230114745A (ko) 신규 항-cd47 항체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2007549159

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2006834140

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006834140

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006323706

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006323706

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20061206

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2632419

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE