WO2007058359A1 - グレリン及びその誘導体又はＧＨＳ－Ｒ１ａに作用する物質を有効成分とする皮膚修復促進治療剤 - Google Patents

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amino
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Noboru Murakami
Keiko Nakahara
Kenji Kangawa
Yujiro Hayashi
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University Of Miyazaki
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Asubio Pharma Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a skin cell proliferation action of a substance that acts on a growth hormone secretagogue receptor (GHS-R). More specifically, the present invention relates to a skin injury therapeutic agent, a skin regeneration promoting agent, a skin cell culture method and the like in the treatment of skin injury containing the substance as an active ingredient.
  • GHS-R growth hormone secretagogue receptor
  • Skin is the earliest tissue for which transplantation treatment has been attempted, even before the long history of skin transplantation. Furthermore, when looking at future transplantation regeneration research, it is considered that the organization that has been fully verified for access access and generation / regeneration processes through skin development research and hair regeneration research. Moreover, skin transplant regeneration research is a research area that can be directly applied to various skin diseases such as burns, congenital epidermolysis bullosa, Yes! /, And male pattern hair loss, and is important for skin damage or skin injury. Is expected to play an important role (Non-Patent Document 1).
  • the required skin for the cultured skin differs depending on the disease, the degree of injury, the transplant area, and the like. Transplantation of only the cultured epidermis is appropriate for moderate burns, etc., and patients with full-thickness skin need cultured skin that incorporates the dermis layer. In addition, for the treatment of intractable skin ulcers in diabetic patients and the like, it is desired to develop wound-covered cultured skin that is expected to release physiologically active substances (Non-patent Document 2).
  • cultured skin sheets used for skin transplantation include normal epidermal keratinocytes (Non-Patent Document 3) by a method developed by Green et al. And skin equivalent tissue devised by Bell et al. (Non-Patent Document 4).
  • Green et al. Succeeded in obtaining sufficient proliferation by suppressing the differentiation of epidermal keratinocytes by using 3T3 cells as supporting cells.
  • epidermal keratinocytes in the culture are stratified, so they have a sheet-like structure, and cultured cell structures similar to living organisms have proven clinically useful as an alternative to skin tissue.
  • Non-patent Document 5 Previously prepared a portion corresponding to the dermis using a material such as collagen, and cultured epidermal keratinocytes thereon. In this method, it is important to use a material for incorporating cells three-dimensionally to construct an artificial tissue, and collagen gel was a material suitable for this (Non-patent Document 5).
  • Non-patent Document 6 a substance that promotes cell proliferation and differentiation.
  • Some clinical applications such as IGF, TGF- ⁇ , and FGF are also wary of causing abnormalities in the cell division of other parts of the human body. Discovery of highly safe substances with such activity * Development is desired.
  • Ghrelin is a hormone whose gastric strength was also discovered in 1999. It has an amino acid sequence consisting of 28 residues, and the third amino acid from the N-terminus of the sequence is glycated with a fatty acid. It is a peptide having an extremely unusual chemical structure (Non-patent Document 8, Patent Document 1). Ghrelin acts as a growth hormone secretagogue receptor la (GHS-Rla) (Non-patent document 9), and promotes endogenous brain digestion that enhances the secretion of growth hormone (GH) from the pituitary gland.
  • GGS-Rla growth hormone secretagogue receptor la
  • Non-Patent Document 8 It has been shown to be a tubal hormone (Non-Patent Document 8), and recent studies have shown that darrelin increases appetite, increases body weight and fat by subcutaneous administration, and improves cardiac function It has also been clarified that it has actions such as (Non-Patent Documents 10 to 14).
  • darrelin has a GH secretion-promoting action and an appetite-enhancing action, an effect of burning fat through the action of GH and converting it into energy, or an effect of enhancing the muscles by expressing the anabolic action of GH. It is expected that can be extracted more effectively by increasing appetite (Non-patent Document 15).
  • Darrelin is an endogenous GHS for GHS—Rla, and was isolated and purified from rats for the first time, followed by vertebrates other than rats, such as humans, mice, pigs, chickens, unagi, ushi, horses, The amino acid of darrelin with a similar primary structure from Hedge, L (IZ ⁇ storm 2 solid) Hd) n3 ⁇ 4VcI (iMS33 ⁇ 43 ⁇ 4H & A3 ⁇ 4HH3cISld (0UBinq-u) sSD:
  • the peptide is a peptide having a specific structure in which the side chain hydroxyl group of the serine residue (S) or threonine residue (T) at the 3-position is acylated with a fatty acid such as octoate or decanoate. No bioactive peptide having such a hydrophobic modification structure has been isolated from living organisms other than darelin.
  • GHS-Rla growth hormone releasing peptide 2
  • GHRP-2 growth hormone releasing peptide 2
  • GHRP-6 His- D- Trp- Ala- Trp- D- Phe- Lys- N
  • L-692,429 MK-0751
  • L-163,191 MK-0677
  • ipamorelin ipamorelin, NN161
  • tabimorelin tabmorelin, NN703
  • CP-424,391 CP-424,391
  • GHS-Rla is expressed in skin cells, and substances acting on GHS-Rla, including ghrelin, act on skin cells to show the proliferation effect of skin cells. No reports have been found yet.
  • Patent document 1 International publication 01Z07475 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Kyoto University 21st Century COE Program HP “Formation of an international center for fusion transplantation regeneration treatment” Research on skin transplantation regeneration, http: ⁇ www.kuhp.kyoto-u.ac.jp ⁇ coe / memberl5. html
  • Non-Patent Document 2 Takamura: Bio Venture, 1: 58 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Rheinwald and Green: Cell, 6: 331 (1975)
  • Non-Patent Document 4 Bell et al: Science, 211: 1052 (1981)
  • Non-Patent Document 5 Tsuji: Special Issue on Experimental Medicine, 19: 2121 (2001)
  • Non-Patent Document 6 Ueda: Bio Venture, 1: 32 (2001)
  • Non-Patent Document 7 Hohfeld et al .: Lancet, 366: 788-790 (2005)
  • Non-Patent Document 8 Kojima et al .: Nature, 402, 656-660 (1999)
  • Non-Patent Document 9 Howard et al: Science 273: 974-977 (1996)
  • Non-Patent Document 10 Wren et al .: Endocrinology 141: 4325-4328 (2000)
  • Non Patent Literature l l Nakazato et al .: Nature 409: 194-198 (2001)
  • Non-Patent Document 12 Shintani et al: Diabetes 50: 227-232 (2001)
  • Non-Patent Document 13 Lely et al .: Endocr. Rev. 25: 426-457 (2004)
  • Non-patent literature 14 Korbonits et al .: Front Neuroendocrino. 25: 27-68 (2004)
  • Non-patent literature 15 Red water, Samukawa: Latest medicine, 60: 1569-1573 (2005)
  • the present invention relates to providing a skin damage therapeutic agent, a skin regeneration promoting agent, a skin cell culturing method, and the like in the treatment of skin damage using a substance having a skin cell proliferating action.
  • the present inventors promote the growth of the fetus when a substance acting on GHS-Rla is administered to a pregnant mother, and the administered substance moves to the fetus and also to the amniotic fluid. I found out. Considering the function and role of substances that act on GHS-Rla in amniotic fluid, it was expected to show a proliferative effect on fetal skin cells.
  • the present inventors examined the action of a substance that acts on GHS-Rla on fetal skin cells. As a result, the presence of GHS-Rla in skin cells and the substance that acts on GHS-Rla It has been found that it acts on skin cells to promote intracellular calcium production, and that the substance exhibits a proliferation effect of skin cells.
  • the present invention relates to a skin regeneration promoter in the treatment of skin damage comprising a substance acting on GHS-Rla as an active ingredient, a promoter for forming a cultured skin cell sheet by culturing skin cells, and transplantation of cultured skin.
  • the present invention relates to an agent for promoting skin repair and treatment.
  • the present invention also provides a method for treating skin damage comprising administering a substance that acts on GHS-Rla, a method for promoting the formation of a cultured skin cell sheet by culturing skin cells, and at the time of transplanting cultured skin.
  • the present invention relates to a method for promoting skin repair and a method for treating the above-mentioned diseases by promoting the repair.
  • the present invention relates to a skin regeneration accelerator in the treatment of skin damage, a formation promoter of a cultured skin cell sheet by culturing skin cells, and promotion of skin repair during transplantation of cultured skin.
  • a skin injury therapeutic agent comprising as an active ingredient a substance that acts on a growth hormone secretagogue receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the substance has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the third amino acid residue from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue A peptide, and an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, and Z or appended in the amino acid sequence from the amino acid terminus to the fifth to 28th amino acids,
  • the third amino acid residue is a peptide selected from the group consisting of peptides which are modified amino acid residues in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof (above) 1)
  • the therapeutic agent described described.
  • a modified amino acid residue in which the substance has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a serine residue located at the third position of the amino terminal force is a fatty acid introduced into the hydroxyl group of the side chain of the residue.
  • the substance is a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the side chain hydroxyl group of the serine residue located third from the amino terminal is acylated with an n-otatanyl group.
  • a skin regeneration promoter comprising as an active ingredient a substance that acts on a growth hormone secretion promoting factor receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the substance has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the third amino acid residue from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue A peptide, and an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, and Z or appended in the amino acid sequence from the amino acid terminus to the fifth to 28th amino acids,
  • the third amino acid residue is a peptide selected from the group consisting of peptides which are modified amino acid residues in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof (above) 6)
  • the accelerator as described.
  • a modified amino acid residue in which the substance has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and a serine residue located at the third position of the amino terminal force is a fatty acid introduced into the hydroxyl group of the side chain of the residue.
  • the above substance is a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the side chain hydroxyl group of the serine residue located third from the amino terminal is acylated with an n-otatanyl group.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and Z or appended in the amino acid sequence from the fifth to the 28th amino acid from the amino terminal, and the amino terminal
  • the third amino acid residue is a peptide selected from the group consisting of peptides which are modified amino acid residues in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof (above) 11) The method described.
  • the substance has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and the serine residue located third from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the hydroxyl group of the side chain of the residue.
  • the substance has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the serine residue located third from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the hydroxyl group of the side chain of the residue.
  • a method for promoting skin regeneration comprising administering to a mammal in need of promoting skin regeneration, a substance that acts on a growth hormone secretion promoting factor receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the substance has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the serine residue located third from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the hydroxyl group of the side chain of the residue.
  • the method according to (22) above which is a peptide.
  • the above substance, wherein the substance has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the side chain hydroxyl group of the serine residue located third from the amino terminal is acylated with an n-otatanyl group (23) The method described.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and Z or appended in the amino acid sequence from the fifth to the 28th amino acid from the amino terminal, and the amino terminal
  • the third amino acid residue is a peptide selected from the group consisting of peptides which are modified amino acid residues in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue, or a pharmaceutically acceptable salt thereof (above) 26) Use as described.
  • the substance is a modified amino acid residue having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the serine residue located third from the amino terminal is a fatty acid introduced into the hydroxyl group of the side chain of the residue.
  • (31) Use of a substance that acts on a growth hormone secretion promoting factor receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient for producing a pharmaceutical composition for promoting skin regeneration.
  • (32) A peptide in which the substance has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the third amino acid residue from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue 1 to several amino acids in the amino acid sequence from the amino terminal to the 5th to 28th amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, deletion, substitution and Z or attachment Peptides selected from the group consisting of peptides having a carotened amino acid sequence, wherein the third amino acid residue from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the side chain of the amino acid residue, or a pharmaceutical thereof Use according to (31) above, which is a chemically acceptable salt.
  • the substance has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and the serine residue located third from the amino terminal is a modified amino acid residue in which a fatty acid is introduced into the hydroxyl group of the side chain of the residue.
  • a substance that acts on a growth hormone secretion promoting factor receptor has an action of proliferating skin cells, and a substance that acts on a growth hormone secretion promoting factor receptor when culturing the skin cells. It is possible to promptly use for treatment by adding to the cell to promote cell growth.
  • skin cells are cultured to produce sheet-like artificial skin, and skin repair treatment is performed by covering the skin damage surface, artificial skin sheets are supplied to patients more quickly using cultured skin cells. It becomes possible to do.
  • FIG. 1 is a diagram showing expression of GHS-Rla mRNA in fetal skin cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of darrelin on intracellular calcium elevation in cultured single fetal skin cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the action of darringin to promote the uptake of [] thymidine into fetal skin cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the action of darling and GHRP6 to promote fetal skin cell proliferation.
  • the medicament of the present invention can be used as a medicament for mammals (individuals) including humans.
  • substances that can be used in the present invention include growth hormone secretion promoting factor (GHS), which is a substance (ligand) that acts on growth hormone secretion promoting factor receptor (GHS-R).
  • GHS growth hormone secretion promoting factor
  • known peptide compounds and low molecular weight compounds for example, ghrelin, GHRP6, MK-0677, ipamorelin, etc.
  • the peptide compound darrelin is desired.
  • darrelin includes human-derived darrelin and other animal-derived darrelin and its derivatives such as rats, mice, pigs, and rabbits.
  • darrelin derived from an individual for each individual.
  • human-derived darrelin for humans.
  • Human-derived darellin consists of 28 amino acids, and is a peptide in which the side chain hydroxyl group of the third serine residue from the amino terminal is acylated with a fatty acid (n-taganol group) (SEQ ID NO: 1).
  • one or several amino acids are substituted, inserted, or deleted in the amino acid residues 5 to 28 from the amino terminal in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • Any peptide having an amino acid sequence and having an activity of increasing intracellular calcium ion concentration by binding to a growth hormone secretagogue receptor can be used.
  • the amino acid sequence of the derivative is desired to have 70%, preferably 80%, more preferably 90%, particularly preferably 95%, most preferably 97% homology compared to the natural amino acid sequence. .
  • Darrelin and its derivatives according to the present invention can be obtained by conventional methods. For example, it can be isolated from natural raw materials or can be produced by recombinant DNA technology and Z or chemical synthesis. Furthermore, when an amino acid residue needs to be modified (acylation), a modification reaction can be performed according to known means. For example, in a production method using recombinant DNA technology, a host cell transformed with an expression vector having DNA encoding the peptide of the present invention is cultured, and the target peptide is collected from the culture. By doing so, darrelin and a derivative thereof according to the present invention can be obtained. The host details By selecting a cell, a compound in which the target peptide is modified (acylated) in the cell can be obtained. Further, when the peptide is not modified (acylated), a modification reaction such as acylation can be performed according to known means if desired.
  • Examples of vectors into which genes are incorporated include E. coli vectors (pBR322, pUC18, pUC19, etc.), Bacillus subtilis vectors (pUB110, pTP5, pC194, etc.), yeast vectors (YEp type, YRp type, Yip type), Alternatively, any other force such as animal cell vectors (retrovirus, vaccinia virus, etc.) may be used as long as the target gene can be stably maintained in the host cell. it can.
  • the vector is introduced into a suitable host cell.
  • the method described in Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989) can be used as a method for incorporating a target gene into a plasmid or a method for introducing it into a host cell.
  • a promoter is connected upstream of the gene so as to function.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host cell used for expression of the target gene.
  • lac promoter, trp promoter, lpp promoter, ⁇ PL promoter, recA promoter, etc. can be used when the host cell to be transformed is of the genus Escherichia, and SPOl promoter, SP02 promoter, etc. if it is of the genus Bacillus.
  • yeast GAP promoter, PH05 promoter, ADH promoter, etc.
  • SV40-derived promoter, retrovirus-derived promoter, etc. can be used. .
  • a host cell is transformed using the vector containing the gene of interest obtained as described above.
  • Host cells include bacteria (eg, Escherichia genus, Bacillus genus, etc.), yeast (Saccharomyces genus, Pichia genus, Candida genus, etc.), animal cells ( CHO cells, COS cells, etc.) can be used.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and it is particularly preferable that the medium contains a carbon source, a nitrogen source, and the like necessary for the growth of the transformed cells to be cultured. Vitamins, growth promoting factors, serum, etc. can be added as desired.
  • the host cell In order to directly produce a fatty acid-modified (acylated) peptide, the host cell has a processing / protease activity capable of cleaving a precursor polypeptide of the peptide at an appropriate position. It is desirable to use cells having an activity capable of acylating serine residues. A host cell having such processing protease activity and serine acylating activity transforms the host cell with an expression vector containing cDNA encoding the precursor polypeptide, and the transformed cell has calcium-elevating activity or growth hormone. It is possible to select from confirming that the production of a fatty acid-modified peptide having secretion-promoting activity.
  • the peptide according to the present invention is separated and purified from the culture by a conventional method.
  • a protein denaturant eg, guanidine hydrochloride
  • the bacterial cells or cells are collected after culturing, suspended in a buffer solution containing a protein denaturant (eg, guanidine hydrochloride), and subjected to ultrasound. After crushing the cells or cells, centrifuge.
  • gel filtration, ultrafiltration, dialysis, SDS-PAGE various chromatographies are performed in consideration of the molecular weight, solubility, charge (isoelectric point), affinity, etc. of the target substance. Separation and purification methods such as chromatography can be appropriately combined.
  • GHS-Rla for example, darrelin
  • its derivatives can be chemically synthesized by a conventional method.
  • condensing amino acids with protecting groups by liquid phase method and Z or solid phase method, extending the peptide chain, removing all protecting groups with acid, and purifying the resulting crude product by the above purification method can be obtained.
  • the side chain of an amino acid at the target position can be selectively acylated with an acylating enzyme or a acyltransferase.
  • peptides according to the present invention can be easily produced according to known methods, for example, according to classical peptide synthesis methods. However, it can be easily produced according to a solid phase method.
  • a fragment containing a modified amino acid residue that can be produced using a method that combines recombinant DNA technology and chemical synthesis is produced by chemical synthesis, and other fragments that do not contain a modified amino acid residue are assembled. It can also be produced by a method using recombinant DNA technology and then fusing each fragment (see International Publication WO01 / 07475).
  • a pharmaceutically acceptable salt is preferable.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; and aluminum salt and ammonium salt. Is mentioned.
  • Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexamine, ⁇ , ⁇ '-di And salts with benzylethylenediamine and the like.
  • salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid. And salts with ⁇ -toluenesulfonic acid and the like.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like, and preferable examples of salts with acidic amino acids include aspartic acid, glutamic acid and the like. And the salt.
  • GHS-Rla receptor which is GHS-R
  • a known method can be used to measure intracellular calcium ion concentration.
  • FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular, which utilizes changes in fluorescence intensity of Fluo-4 AM (Molecular Probe) due to changes in calcium ion concentration. De vices
  • FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader
  • Fluo-4 AM Fluo-4 AM
  • a known method can be used to confirm whether the peptide has a calcium-elevating activity and has growth hormone secretion promoting factor activity in vitro and in vivo.
  • the growth hormone secreted into the cell culture medium can be measured by radioimmunoassay using an anti-growth hormone antibody.
  • the concentration of growth hormone in the serum after injecting a peptide having calcium-elevating activity into the peripheral vein of the animal may be measured.
  • J. Med. Chem., 43, pp. 4370-4376, 20000 can be referred to for the darrelin derivative and the preparation method thereof.
  • GHS-Rla The substance acting on GHS-Rla according to the present invention (for example, darelin) has been found to have a skin cell proliferating action, as specifically shown in the examples of the present specification, The number of skin cells can be significantly increased.
  • the substance acting on GHS-Rla according to the present invention is an agent for promoting skin regeneration in the treatment of skin damage (for example, wounds, abrasions, burns, etc.), skin cells (for example, epidermis, Accelerator for the formation of cultured skin cell sheets by culturing (dermis and skin), as well as burns, refractory skin ulcers, congenital epidermolysis bullosa, pressure ulcers, obesity scars, nevi, severe allergic skin diseases and hair loss etc. It can be used as an active ingredient in an agent for promoting and repairing skin repair during transplantation of cultured skin.
  • skin damage for example, wounds, abrasions, burns, etc.
  • skin cells for example, epidermis, Accelerator for the formation of cultured skin cell sheets by culturing (dermis and skin), as well as burns, refractory skin ulcers, congenital epidermolysis bullosa, pressure ulcers, obesity scars, nevi, severe
  • GHS-Rla a substance that acts on GHS-Rla according to the present invention
  • a method for treating skin damage for example, wounds, scratches, burns, etc.
  • skin cells for example, Epidermis, dermis and skin
  • methods for promoting the formation of cultured skin cell sheets as well as severe burns, refractory skin ulcers, congenital epidermolysis bullosa, pressure sores, obesity scars, nevi, allergic skin diseases
  • it can be used in a method for promoting skin repair at the time of transplantation of cultured skin in hair loss and the like, and a method for treating the above diseases by promoting the repair.
  • a substance that acts on GHS-Rla according to the present invention is used as a skin regeneration accelerator, skin cell (for example, epidermis, skin wound (for example, wound, abrasion, burn, etc.)).
  • skin cell for example, epidermis, skin wound (for example, wound, abrasion, burn, etc.
  • the agent of the present invention containing a substance that acts on GHS-Rla (for example, darelin) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient is a pharmacologically acceptable carrier or excipient. It can be used for individuals (eg, humans, mice, rats, rabbits, dogs, cats, rabbits, horses, pigs, monkeys, etc.) mixed with a bulking agent.
  • the drug of the present invention is administered to an individual undergoing skin regeneration treatment parenterally, for example, by intravenous, subcutaneous, or intramuscular injection in a single dose or divided into multiple doses.
  • nasal administration, pulmonary administration, and suppository administration are desirable when the individual is a human adult and is especially at home.
  • the dose of the drug is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose of use and the age, weight, individual type, symptom, nutritional status, concomitant drug, etc. of the individual to be administered.
  • a substance that acts on GHS—Rla eg, ghrelin
  • LOOmg range power S preferably 0.01 mg to 1 Omg is more desirable!
  • the above dose is preferably administered once to several times a day for 1 to 24 weeks, more preferably 1 to 12 weeks!
  • the pharmaceutically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used. Excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations; solvents in liquid preparations , Solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers, soothing agents, and the like.
  • preparation additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents, and sweeteners can be used.
  • Preferable examples of the excipient include lactose, sucrose, D-manntol, starch, crystalline cellulose, light anhydrous key acid and the like.
  • Preferable examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • binder Preferable examples include crystalline cellulose, sucrose, D-manntol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone and the like.
  • disintegrant Preferable examples include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like.
  • Preferable examples of the solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like.
  • solubilizer examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-manntol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate. And sodium quenate.
  • the suspending agent include interfaces such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate.
  • Activating agents for example, hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polybutylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylenoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, hydroxypropinoresenorelose and the like.
  • Preferable examples of the isotonic agent include sodium chloride salt, glycerin, D-mannthol and the like.
  • buffering agent examples include buffer solutions such as phosphate, acetate, carbonate, kenate and the like.
  • the soothing agent include benzyl alcohol.
  • Preferable examples of the preservative include, for example, paraoxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • antioxidant examples include sulfite, ascorbic acid and the like.
  • the pharmaceutical dosage form of the invention is preferably a dosage form suitable for parenteral administration.
  • the pharmaceutical dosage form suitable for parenteral administration is, for example, for intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, or intramuscular administration. Injections, infusions, suppositories, transdermal absorption agents, transmucosal absorption agents, inhalants, etc.
  • preparation forms such as transmucosal absorbent, inhalant, suppository and the like are also preferable.
  • These formulation forms are variously known to those skilled in the art, and those skilled in the art appropriately select a formulation form suitable for the desired administration route, and if necessary, one or more formulation additives available in the art. Can be used to produce a preparation in the form of a pharmaceutical composition.
  • a medicine in the form of an injection or a drip infusion is an appropriate buffer solution, sugar solution, isotonic agent, pH regulator, together with a substance that acts on the active ingredient GHS-Rla (for example, darelin),
  • GHS-Rla for example, darelin
  • Addents include sugars such as glucose, mannitol, xylitol, and ratatose, hydrophilic polymers such as polyethylene glycol, alcohols such as glycerol, amino acids such as glycine, and proteins such as serum albumin.
  • Salts such as NaCl and sodium quenate, acids such as acetic acid, tartaric acid and ascorbic acid, surfactants such as Tween 80, and reducing agents such as sodium sulfite can be used.
  • Such a preparation can be used as an injection or an infusion by dissolving by adding distilled water for injection or physiological saline at the time of use.
  • intranasal administration agents such as nasal drops and intranasal sprays are suitable, and inhalation agents are also suitable for transpulmonary administration.
  • the content of the active ingredient (eg, darrelin) in a single unit preparation is 0.OOlmg to: LOOmg, preferably 0. Olmg to: LOmg, and it is desirable to administer once or several times a day.
  • a substance that acts on GHS-Rla prepared by incubating the isolated skin cells in a culture solution and aseptically filtering or autoclaving in an incubation solution can be carried out by adding 0.1 ⁇ to 1 ⁇ , preferably 1 ⁇ to 10 ⁇ . That is, it is preferable to use a culture solution containing 0.000000001 mgZmL to 0.1 mgZmL of a substance that acts on GHS-Rla for the growth of skin cells. By performing this treatment, as shown in Example 4, it is possible to promote the proliferation of skin cells that hardly grow.
  • GHS-Rla mRNA was expressed in the skin of rat fetuses on gestation days 14, 15, and 19.
  • the expression level of GHS-Rla mRNA was high in fetal skin on days 14 and 15.
  • Wistar rats on the 17th day of pregnancy were laparotomized under anesthesia and the fetuses were removed.
  • a small piece of skin is collected from the fetus and treated with collagenase, papain digested and pipetted in a cold nontas solution.
  • a dispersion of fetal skin cells was obtained by mechanical separation by ting. From this dispersion, single cells were obtained and calcium imaging was performed when darrelin was added. Calcium imaging was performed using a calcium imaging device (IMACS, Hamamatsu Photonicus). That is, when excited at 340nmZ380nm, the ratio of excitation light at 510nm (Emission) was taken. Fura-2 was used as a calcium imaging agent.
  • IMACS calcium imaging device
  • Fura-2 was used as a calcium imaging agent.
  • darellin rat-derived darrelin (SEQ ID NO: 3) was used (same in the following examples).
  • FIG. 2 I, ⁇ , and III are powers taken at this time. Photos are omitted in this specification.
  • the solid line represents cells that responded to darrelin, and the broken line represents other cells that responded to desacyldarelin. Darrelin and desacyl ghrelin were added to separate cells.
  • rat fetal skin cell dispersion was collected from Wistar rats on the 17th day of pregnancy.
  • the dispersed cells were treated with MCDB153 HAA medium (F-Peptide Co., Ltd) containing 2% urine fetal serum, penicillin (lOOUZml), streptomycin (100 ⁇ g / ml), and epidermal growth factor EGF (5 ng / ml). , Yamagata, Japan) and seeded 5 ⁇ 10 5 cells Zwell in a 48-well multiwell plate covered with polyethyleneimine.
  • Example 4 Cell growth-promoting action of darrelin and GHRP6 in cultured fetal skin cells
  • ghrelin 0.05-500 pmolZmL (nM) or GHRP6 (0.05-50 pmolZmL (nM)
  • 2% urinary fetal serum penicillin (lOOUZml)
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • MC DB153HAA medium F-Peptide Co., Ltd., Yamagata, Japan
  • epidermal growth factor EGF 5 ng / ml
  • 4- cell Z-well was inoculated with medium without darrelin or GHRP6, to which 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) (10 / z M) was added and incubated for 24 hours
  • PrdU 5-bromo-2'-deoxyuridine
  • Figure 4 confirms that darrelin and GHRP6 have the effect of proliferating fetal skin cells because the amount of Brd U incorporation significantly increased when darrelin or GHRP6 was allowed to act on cultured fetal skin cells. .
  • the therapeutic agent for skin damage, the agent for promoting skin regeneration, the method for promoting the proliferation of cultured skin cells, and the method for promoting skin regeneration can be used in the pharmaceutical field and the medical field.

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Abstract

　新規な皮膚損傷治療剤、皮膚再生促進剤を提供するものである。成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする皮膚損傷治療剤又は皮膚再生促進剤。

Description

明 細 書
グレリン及びその誘導体又は GHS_Rlaに作用する物質を有効成分と する皮膚修復促進治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、成長ホルモン分泌促進因子レセプター (GHS -R: Growth hormone se cretagogue Receptor)に作用する物質の皮膚細胞増殖作用に関する。より具体的に は当該物質を有効成分とする皮膚損傷治療における皮膚損傷治療剤、皮膚再生促 進剤、皮膚細胞の培養方法等に関する。
背景技術
[0002] 皮膚は、長い皮膚移植の歴史を見るまでもなぐ 最も早くから移植治療が試みられ た組織である。さらに、今後の移植再生研究を見据えるとき、皮膚発生研究、 毛髪を 用いた再生研究などを通して、もっともアクセスしゃすぐ また発生 ·再生過程が十分 検証された組織と考えられる。 しかも、皮膚移植再生研究は、熱傷や先天性表皮水 疱症、 ある!/、は男性型脱毛など多彩な皮膚疾患への直接の応用も可能な研究領域 であり、皮膚損傷あるいは皮膚傷害において重要な役割を果たすことが期待される ( 非特許文献 1)。
[0003] 培養皮膚は、疾患、受傷の程度および移植面積などにより、必要とされる移植皮膚 は異なる。中等度までの熱傷などであれば培養表皮のみの移植が適応となり、皮膚 全層欠損の患者では真皮層までを組み込んだ培養皮膚が必要となる。また、糖尿病 患者などでの難治性皮膚潰瘍の治療には、生理活性物質の放出を期待した創傷被 覆剤的な培養皮膚の開発が望まれる (非特許文献 2)。
[0004] 現在、皮膚移植に用いられる培養皮膚シートには、グリーン (Green)らが開発した 方法による正常表皮角化細胞 (非特許文献 3)と、ベル (Bell)らが考案した皮膚等価 組織 (非特許文献 4)がある。グリーンらは、 3T3細胞を支持細胞として用いることで、 表皮角化細胞の分化を抑制し、十分な増殖を得ることに成功した。この方法は培養 中の表皮角化細胞が重層化するため、シート状の構造を呈し、生体に類似の培養細 胞構造体は、皮膚組織の代替物として臨床的有用性が明らかとなっている。また、ベ ルらは、真皮に相当する部分をコラーゲンなどの材料を用いて先に作製しておき、そ の上に表皮角化細胞を培養した。この方法では、人工的な組織構築のために 3次元 的に細胞を組み入れるための材料を用いて 、ることが重要で、コラーゲンゲルはこれ に適した材料であった (非特許文献 5)。
[0005] 細胞と細胞の足場が揃ったら、次に必要なものは細胞の増殖や分化を促すような 物質である（非特許文献 6)。 IGF、 TGF- β、 FGFなどの臨床応用にも、人体他部 位の細胞分ィ匕ゃ発生に異常を来たすとして警戒する向きもあり、安全性の高いこのよ うな活性を持つ物質の発見 *開発が望まれている。
[0006] また、損傷皮膚の移植又は再生医療にお!、て、培養した胎児皮膚細胞を損傷部 位に移植すると正常皮膚に分化'増殖し、皮膚修復能力を持つことから、今後の移 植-再生医療への応用が期待されている（非特許文献 7)が、胎児皮膚細胞の増殖 速度は遅 、ために増殖を促進させる技術の開発が望まれて 、る。
[0007] 一方、ダレリン (Ghrelin)は 1999年に胃力も発見されたホルモンであり、 28残基から なるアミノ酸配列を有し、当該配列の N末端から 3番目のアミノ酸が脂肪酸でァシル ィ匕された極めて珍しいィ匕学構造を有するペプチドである (非特許文献 8、特許文献 1 ；)。グレリンは成長ホルモン分泌促進因子レセプター la (Growth Hormone Secretagog ue- Receptor la: GHS— Rla) (非特許文献 9)に働き、下垂体からの成長ホルモン（ GH)の分泌を亢進させる内因性の脳 消化管ホルモンであることが示され (非特許文 献 8)、最近の研究では、ダレリンが食欲を亢進させること、皮下投与することにより体 重及び体脂肪が増加すること、及び心機能を改善する等などの作用を有することも 明らかにされている（非特許文献 10〜14)。
[0008] 更にダレリンは GH分泌促進作用や食欲亢進作用を持ち、 GHの作用を介して脂 肪を燃焼してエネルギーに変換する作用、あるいは GHのアナボリックな作用を発現 して筋肉を増強させる効果を、食欲亢進によってさらに有効に引き出せることが期待 されている (非特許文献 15)。
[0009] ダレリンは GHS— Rlaに対する内因性の GHSとして、ラットから初めて単離精製さ れた後、ラット以外の脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、 -ヮトリ、ゥナギ、ゥシ、ゥマ 、ヒッジ、力エル、 -ジマス、ィヌからも、類似した一次構造を有するダレリンのアミノ酸 ( I Z ^暴 2固） Hd)n¾VcI(iMS3¾¾H&A¾HH3cISld( 0UBinq-u)sSD ：
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(u漏 H)
[0100]
ZZCZC/900Zdf/X3d ε 6SC8S0/.00Z OAV (上記表記において、アミノ酸残基は一文字標記により表している。 )
[0011] 上記ペプチドは、 3位のセリン残基 (S)又はスレオニン残基 (T)の側鎖水酸基がォ クタン酸、デカン酸などの脂肪酸によりァシル化された特異的な構造を有するぺプチ ドであり、このような疎水性修飾構造を有する生理活性ペプチドは、ダレリン以外に生 体から単離された例はない。
[0012] また、本発明に係る GHS— Rlaに作用する物質としては、上記ペプチド化合物以 外に、ペプチド化合物である成長ホルモン放出ペプチド 2 (GHRP-2) (D-Ala-D- β Nal- Ala- Trp- D- Phe- Lvs- ΝΗ )及び GHRP- 6 (His- D- Trp- Ala- Trp- D- Phe- Lys- N
2
H ) (Muccioli.G et al.:J.Endocrino., 157,pp.99- 106(1998》並びにそれらの誘導体を
2
用いることができる。更に、低分子化合物である、 L-692,429 (MK-0751) , L-163,191 (MK-0677) (Patchett et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92, pp.7001— 7005 (1995) )、ィ パモレリン（ipamorelin, NN161)、タビモレリン（tabmorelin, NN703)、 CP- 424,391 (A nkerson M. et al.:Drug Discovery Today,4.pp.497- 506)等を用いることができる。
[0013] 本発明者らが知る限りでは、 GHS— Rlaが皮膚細胞で発現していること及びグレリ ンを含む GHS -Rlaに作用する物質が皮膚細胞に作用して皮膚細胞の増殖作用 を示すことに係る報告は未だ見出されていない。
[0014] 特許文献 1：国際公開 01Z07475号パンフレット
非特許文献 1：京都大学 21世紀 COEプログラム HP「融合的移植再生治療を目指す 国際拠点形成」 皮膚の移植再生に関する研究、 http：〃 www.kuhp.kyoto-u.ac.jp〃 coe/ memberl5.html
非特許文献 2：高村： Bioベンチャー, 1： 58 (2001)
非特許文献 3 : Rheinwald and Green : Cell, 6 : 331 (1975)
非特許文献 4 : Bell et al : Science, 211 : 1052 (1981)
非特許文献 5 :畠：実験医学増刊号， 19 : 2121 (2001)
非特許文献 6：上田： Bioベンチャー， 1： 32 (2001)
非特許文献 7 : Hohfeld et al.:Lancet, 366:788-790(2005)
非特許文献 8 : Kojima et al.:Nature,402, 656-660 (1999)
非特許文献 9 : Howard et al : Science 273: 974-977 (1996) 非特許文献 10 :Wren et al.： Endocrinology 141 : 4325-4328 (2000)
非特許文献 l l : Nakazato et al.: Nature 409:194-198 (2001)
非特許文献 12 : Shintani et al : Diabetes 50:227-232 (2001)
非特許文献 13 : Lely et al.： Endocr. Rev. 25:426-457(2004)
非特許文献 14 : Korbonits et al.： Front Neuroendocrino. 25 : 27-68 (2004) 非特許文献 15 :赤水、寒川：最新医学、 60: 1569-1573(2005)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明は、皮膚細胞の増殖作用を有する物質を用いた皮膚損傷治療における皮 膚損傷治療剤、皮膚再生促進剤、皮膚細胞の培養方法等の提供に関する。
課題を解決するための手段
[0016] 本発明者らは、 GHS— Rlaに作用する物質を妊娠母動物に投与すると胎児の成 長を促進させること、及び投与された当該物質は胎児に移行すると共に羊水にも移 行することを見出した。羊水中の GHS— Rlaに作用する物質の機能や役割を考える と、胎児の皮膚細胞の増殖作用を示すことが期待された。
[0017] そこで、本発明者らは胎児の皮膚細胞に対する GHS— Rlaに作用する物質の作 用を検討したところ、皮膚細胞に GHS— Rlaが存在すること、 GHS—Rlaに作用す る物質が皮膚細胞に作用して細胞内カルシウム産生を促進すること、及び当該物質 が皮膚細胞の増殖作用を示すことを見出した。
[0018] 即ち、本発明は GHS— Rlaに作用する物質を有効成分とする皮膚損傷の治療に おける皮膚再生促進剤、皮膚細胞の培養による培養皮膚細胞シートの形成促進剤、 並びに培養皮膚の移植時の皮膚の修復促進剤及び治療剤に関する。
[0019] また、本発明は GHS—Rlaに作用する物質を投与することからなる皮膚損傷の治 療方法、皮膚細胞の培養による培養皮膚細胞シートの形成を促進する方法、並びに 培養皮膚の移植時の皮膚の修復を促進する方法及び当該修復促進による上記疾 患の治療方法に関する。
[0020] 更に、本発明は皮膚損傷の治療における皮膚再生促進剤、皮膚細胞の培養によ る培養皮膚細胞シートの形成促進剤、並びに培養皮膚の移植時の皮膚の修復促進 剤及び治療剤を製造するための GHS— Rlaに作用する物質の使用に関する。 以上のことから、本発明は具体的には以下の事項に関する。
[0021] (1)成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質又はその薬学的に許容 される塩を有効成分とする皮膚損傷治療剤。
(2)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のァ ミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基である ペプチド、及び配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜28 番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロしたアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸残基の 側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択され たペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記（1)記載の治療剤。
(3)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力 3番目に位 置するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残 基であるペプチドである上記（2)記載の治療剤。
(4)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に位 置するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺ プチドである上記（3)記載の治療剤。
(5)前記有効成分を一単位製剤当たり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する上記（1)〜(4) の!、ずれかに記載の治療剤。
[0022] (6)成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質又はその薬学的に許容 される塩を有効成分とする皮膚再生促進剤。
(7)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のァ ミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基である ペプチド、及び配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜28 番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロしたアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸残基の 側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択され たペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記（6)記載の促進剤。 (8)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力 3番目に位 置するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残 基であるペプチドである上記（7)記載の促進剤。
(9)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に位 置するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺ プチドである上記（8)記載の促進剤。
(10)前記有効成分を一単位製剤当たり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する上記（6)〜（ 9)の 、ずれかに記載の促進剤。
[0023] (11)成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質又はその薬学的に許容 される塩を用いた培養皮膚細胞の増殖を促進する方法。
(12)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜2 8番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロしたアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸残基の 側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択され たペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記（11)記載の方法。
(13)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸 残基であるペプチドである上記（ 12)記載の方法。
(14)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されている ペプチドである上記（ 13)記載の方法。
(15)培養皮膚細胞の増殖を、前記有効成分を 0. 0000001mgZmL〜 0. lmg ZmL含有する培地中で行う上記（11)〜（14)のいずれかに記載の方法。
[0024] (16)皮膚損傷の治療を必要とする哺乳動物に、成長ホルモン分泌促進因子レセプ ターに作用する物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として投与すること からなる皮膚損傷の治療方法。 (17)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜2 8番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロしたアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸残基の 側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択され たペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記（16)記載の方法。
(18)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸 残基であるペプチドである上記（ 17)記載の方法。
(19)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されている ペプチドである上記（18)記載の方法。
(20)前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する上記（16)〜（19)の いずれかに記載の方法。
(21)皮膚再生の促進を必要とする哺乳動物に、成長ホルモン分泌促進因子レセプ ターに作用する物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として投与する皮膚 再生を促進する方法。
(22)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜2 8番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロしたアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸残基の 側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択され たペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記（21)記載の方法。
(23)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸 残基であるペプチドである上記（22)記載の方法。 (24)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されている ペプチドである上記（23)記載の方法。
(25)前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する上記（21)〜（24) のいずれかに記載の方法。
[0026] (26)皮膚損傷治療用医薬組成物を製造するための成長ホルモン分泌促進因子レ セプターに作用する物質又はその薬学的に許容される塩の有効成分としての使用。
(27)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜2 8番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロしたアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸残基の 側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択され たペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記（26)記載の使用。
(28)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸 残基であるペプチドである上記（27)記載の使用。
(29)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されている ペプチドである上記（28)記載の使用。
(30)皮膚損傷治療用医薬組成物が、一単位製剤当たり前記有効成分を 0. OOlmg 〜100mg含有する上記（26)〜（29)の 、ずれかに記載の使用。
[0027] (31)皮膚再生促進用医薬組成物を製造するための成長ホルモン分泌促進因子レ セプターに作用する物質又はその薬学的に許容される塩の有効成分としての使用。 (32)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜2 8番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付 カロしたアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸残基の 側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から選択され たペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記（31)記載の使用。
(33)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸 残基であるペプチドである上記（32)記載の使用。
(34)前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目に 位置するセリン残基の側鎖の水酸基が n オタタノィル基によりァシルイ匕されている ペプチドである上記（33)記載の使用。
(35)皮膚再生促進用医薬組成物が、一単位製剤当たり前記有効成分を 0. OOlmg 〜： LOOmg含有する組成物である上記（31)〜（34)のいずれかに記載の使用。 発明の効果
[0028] 本発明により、成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質が皮膚細胞 を増殖させる作用を持つことが明らかにされ、皮膚細胞を培養するときに成長ホルモ ン分泌促進因子レセプターに作用する物質を添加して細胞増殖を促進させることに より、速やかに治療に使用することが可能となる。即ち、皮膚細胞を培養してシート状 の人工皮膚を作製し、皮膚損傷面を覆うことによって皮膚の修復治療を行う際に、培 養皮膚細胞を用いて人工皮膚シートをより速やかに患者に供給することが可能となる 。更に、皮膚細胞を直接裂傷や創傷部位に移植し、成長ホルモン分泌促進因子レセ プターに作用する物質を移植部位に投与することにより治癒促進を図ることが可能と なる。
図面の簡単な説明
[0029] [図 1]胎児皮膚細胞における GHS—Rla mRNAの発現を示す図である。
[図 2]ダレリンの単一胎児培養皮膚細胞における細胞内カルシウム上昇作用を示す 図である。
[図 3]ダレリンの胎児皮膚細胞への [ ] チミジン取り込み促進作用を示す図である [図 4]ダレリンおよび GHRP6の胎児皮膚細胞増殖促進作用を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0030] 本発明の医薬はヒトを含む哺乳動物 (個体)の医薬として使用できる。本発明にお いて用いることができる物質としては、成長ホルモン分泌促進因子レセプター（GHS -R)に作用する物質 (リガンド)である成長ホルモン分泌促進因子 (GHS)を挙げる ことができる。 GHSとしては公知のペプチド化合物や低分子化合物（例えば、グレリ ン、 GHRP6、 MK— 0677及びィパモレリン等）を用いることができる力 特にべプチ ド化合物であるダレリンが望まし 、。
[0031] ダレリンとしては、上述したようにヒト由来ダレリンをはじめ、ラット、マウス、ブタ、ゥシ 等その他の動物由来のダレリン及びその誘導体を用いることができる。
[0032] 各々の個体に対して当該個体由来のダレリンを用いることが望ましぐ例えばヒトに 対してはヒト由来ダレリンを用いることが望ましい。ヒト由来ダレリンは 28個のアミノ酸 からなり、ァミノ末端から 3番目のセリン残基の側鎖の水酸基が脂肪酸 (n—才クタノィ ル基）によりァシルイ匕されたペプチドである（配列番号 1)。また、ダレリンの誘導体とし ては、例えば配列番号 1に記載されたアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目〜2 8番目のアミノ酸残基において 1個又は数個のアミノ酸が置換、挿入、又は欠失した アミノ酸配列を有し、且つ成長ホルモン分泌促進因子レセプター（GHS—R)に結合 することによって、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するぺプチ ドであれば使用することができる。誘導体のアミノ酸配列としては天然型のアミノ酸配 列と比較して 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 90%、特に好ましくは 95%、最も 好ましくは 97%の相同性を有することが望ま 、。他の動物由来のダレリン (配列番 号 2乃至 22)においても同様である。
[0033] 本発明に係るダレリン及びその誘導体は常法により得ることができる。例えば、天然 の原料力 単離することができるし、又は組換え DNA技術及び Z又は化学的合成 によって製造することができる。更にアミノ酸残基に修飾 (ァシル化）が必要な場合は 公知の手段に従って修飾反応を施すことができる。例えば組換え DNA技術を用い た製法にぉ 、ては、本願発明に係るペプチドをコードする DNAを有する発現べクタ 一により形質転換された宿主細胞を培養し、当該培養物から目的のペプチドを採取 することにより本発明に係るダレリン及びその誘導体を得ることもできる。当該宿主細 胞を選択することにより、当該細胞内において目的のペプチドに修飾 (ァシル化）がさ れたィ匕合物を得ることができる。また、当該ペプチドが修飾 (ァシル化）されていない 場合は、所望により公知の手段に従ってァシルイ匕等の修飾反応を行えばよい。
[0034] 遺伝子を組み込むベクターとしては、例えば大腸菌のベクター（pBR322、 pUC18 、 pUC19等）、枯草菌のベクター（pUB110、 pTP5、 pC194等）、酵母のベクター（ YEp型、 YRp型、 Yip型）、又は動物細胞のベクター（レトロウイルス、ワクシニアウイ ルス等)等が挙げられる力 その他のものであっても、宿主細胞内で安定に目的遺伝 子を保持できるものであれば、いずれをも用いることができる。当該ベクターは、適当 な宿主細胞に導入される。 目的の遺伝子をプラスミドに組み込む方法や宿主細胞へ の導入方法としては、例えば、 Molecular Cloning (Sambrook et al.， 1989)に記載さ れた方法が利用できる。
上記プラスミドにおいて目的のペプチド遺伝子を発現させるために、当該遺伝子の 上流にはプロモーターを機能するように接続させる。
[0035] 本願発明において用いられるプロモーターとしては、 目的遺伝子の発現に用いる 宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、形 質転換する宿主細胞がェシエリシァ（Escherichia)属の場合は lacプロモーター、 trp プロモーター， lppプロモーター、 λ PLプロモーター， recAプロモーター等を用いる ことができ、 Bacillus属の場合は SPOlプロモーター、 SP02プロモーター等を用い ることができ、酵母の場合は GAPプロモーター， PH05プロモーター、 ADHプロモ 一ター等を用いることができ、動物細胞の場合は、 SV40由来プロモーター、レトロゥ ィルス由来プロモーター等を用 、ることができる。
[0036] 上記のようにして得られた目的遺伝子を含有するベクターを用いて宿主細胞を形 質転換する。宿主細胞としては細菌（例えば、エシ リシァ（Escherichia)属、バチル ス（Bacillus)属等）、酵母（サッカロマイセス (Saccharomyces)属、ピキア（Pichia)属、 キャンディダ (Candida)属等）、動物細胞 (CHO細胞、 COS細胞等)等を用いること ができる。培養時の培地としては液体培地が適当であり、当該培地中には培養する 形質転換細胞の生育に必要な炭素源、窒素源等が含まれることが特に好ましい。所 望によりビタミン類、成長促進因子、血清などを添加することができる。 [0037] 脂肪酸修飾 (ァシル化)ペプチドを直接製造するためには、宿主細胞として、当該 ペプチドの前駆体ポリペプチドを適切な位置で切断できるプロセッシング ·プロテア ーゼ活性を有し、当該ペプチド中のセリン残基をァシルイ匕できる活性を有する細胞を 用いるのが望ましい。このようなプロセッシング ·プロテアーゼ活性及びセリンァシル 化活性を有する宿主細胞は、当該前駆体ポリペプチドをコードする cDNAを含む発 現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞がカルシウム上昇活性又は 成長ホルモン分泌促進活性を有する脂肪酸修飾ペプチドを産生することを確認する こと〖こより選抜できる。
[0038] 培養後、培養物から本発明に係るペプチドを常法により分離精製する。例えば、培 養菌体又は細胞から目的物質を抽出するには、培養後、菌体又は細胞を集め、これ をタンパク質変性剤 (塩酸グァ-ジンなど）を含む緩衝液に懸濁し、超音波などにより 菌体又は細胞を破砕した後、遠心分離を行う。次に上清から目的物質を精製するに は、目的物質の分子量、溶解度、荷電 (等電点）、親和性等を考慮して、ゲル濾過、 限外濾過、透析、 SDS-PAGE,各種クロマトグラフィーなどの分離精製方法を適宜 組み合わせて行うことができる。
[0039] 本発明に係る GHS— Rlaに作用する物質 (例えば、ダレリン)及びその誘導体は常 法により化学合成することができる。例えば、保護基の付いたアミノ酸を液相法及び Z又は固相法により縮合、ペプチド鎖を延長させ、酸で全保護基を除去し、得られた 粗生成物を上記の精製方法で精製することにより得られる。ァシル化酵素又はァシ ル基転移酵素で選択的に目的位置にあるアミノ酸の側鎖をァシルイ匕することもできる
[0040] またペプチドの製造法は従来既に種々の方法が知られており、本発明に係るぺプ チドの製造も公知の方法に従って容易に製造でき、例えば古典的なペプチド合成法 に従ってもょ 、し、固相法に従っても容易に製造できる。
[0041] また、組換え DNA技術と化学合成を併用した製法を用いてもよぐ修飾アミノ酸残 基を含むフラグメントをィ匕学合成により製造し、修飾アミノ酸残基を含まないその他の フラグメントを組換え DNA技術を用いて製造し、その後各々のフラグメントを融合さ せる方法でも製造することができる（国際公開 WO01/07475参照)。 [0042] 本願発明に用いることができる GHS—Rlaに作用する物質 (例えば、ダレリン)及 びその誘導体に係る塩としては薬学的に許容される塩が好ましぐ例えば無機塩基と の塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との 塩などが挙げられる。
[0043] 無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ 金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミ二 ゥム塩、アンモニゥム塩などが挙げられる。
[0044] 有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルァミン、トリェチルァミン、ピリ ジン、ピコリン、エタノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン、ジシクロへ キシルァミン、 Ν,Ν'-ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。
[0045] 無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸 などとの塩が挙げられる。
[0046] 有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、フマール 酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 ρ-トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
[0047] 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オル二チン などとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばァスパラギン 酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
[0048] 以上の塩の中でも特にナトリウム塩、カリウム塩が最も好ましい。
[0049] グレリンの生理作用については、 GHS—Rである GHS—Rla受容体に対するリガ ンド活性や上記刊行物に記載された生理作用を指標として誘導体を選抜することが 可能である。細胞内カルシウムイオン濃度の測定法は公知の方法が利用できるが、 例えば、カルシウムイオン濃度変化による Fluo— 4 AM (Molecular Probe社)の蛍 光強度の変化を利用した FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular De vices社)を用いることができる。また、カルシウム上昇活性を有するペプチド力 イン ビトロ（in vitro)及びイン ビボ（in vivo)で成長ホルモン分泌促進因子活性を有する か確認するためには、公知の方法を利用することができる。例えばイン ビトロでは、 成長ホルモンを分泌して GHS—Rの発現も確認されている脳下垂体細胞に添カロし て、細胞培養液中に分泌される成長ホルモンを、抗成長ホルモン抗体を用いたラジ オイムノアッセィによって測定することができる。イン ビボでの成長ホルモン分泌促 進活性を確認するためには、カルシウム上昇活性を有するペプチドを動物の末梢静 脈に注射した後の血清中の成長ホルモン濃度を測定すればよい。また、ダレリン誘 導体及びその調製方法については、例えば、 J. Med. Chem., 43, pp.4370-4376, 20 00を参照することができる。
[0050] 本発明に係る GHS- Rlaに作用する物質 (例えば、ダレリン）は、本明細書の実施例 に具体的に示すとおり、皮膚細胞の増殖作用を有することが見出され、特に胎児の 皮膚細胞数を顕著に増カロさせることができる。
[0051] 即ち、本発明に係る GHS— Rlaに作用する物質 (例えば、ダレリン）は、皮膚損傷（ 例えば、創傷、擦過傷および火傷等)の治療における皮膚再生促進剤、皮膚細胞（ 例えば、表皮、真皮及び皮膚)の培養による培養皮膚細胞シートの形成促進剤、並 びに熱傷、難治性皮膚潰瘍、先天性表皮水泡症、褥瘡、肥満性瘢痕、母斑、アレル ギー性皮膚疾患重症例及び脱毛等における培養皮膚の移植時の皮膚の修復促進 剤及び治療剤にお 、て有効成分として用いることができる。
[0052] また、本発明に係る GHS— Rlaに作用する物質 (例えば、ダレリン)を個体に投与 することにより、皮膚損傷 (例えば、創傷、擦過傷および火傷等)の治療方法、皮膚細 胞 (例えば、表皮、真皮及び皮膚)の培養による培養皮膚細胞シートの形成を促進 する方法、並びに熱傷、難治性皮膚潰瘍、先天性表皮水泡症、褥瘡、肥満性瘢痕、 母斑、アレルギー性皮膚疾患重症例及び脱毛等における培養皮膚の移植時の皮膚 の修復を促進する方法及び当該修復促進による上記疾患の治療方法に用いること ができる。
[0053] 更に、本発明に係る GHS— Rlaに作用する物質 (例えば、ダレリン)を、皮膚損傷（ 例えば、創傷、擦過傷および火傷等)の治療における皮膚再生促進剤、皮膚細胞（ 例えば、表皮、真皮及び皮膚)の培養による培養皮膚細胞シートの形成促進剤、並 びに熱傷、難治性皮膚潰瘍、先天性表皮水泡症、褥瘡、肥満性瘢痕、母斑、アレル ギー性皮膚疾患重症例及び脱毛等における培養皮膚の移植時の皮膚の修復促進 剤及び治療剤を製造する際に使用することができる。 [0054] GHS—Rlaに作用する物質 (例えば、ダレリン)又はそれらの薬理学的に許容しう る塩を有効成分として含む本発明の薬剤は、薬理学的に許容しうる担体、賦形剤、 増量剤などと混合して個体 (例えば、ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ゥシ、ゥ マ、ブタ、サル等）に対して用いることができる。
[0055] 本発明の薬剤は、皮膚再生治療中の個体に対して、非経口的に、例えば静脈内、 皮下、筋肉内への注射により、所定量を単回又は複数回に分けて投与することが好 ましいが、個体がヒト成人であり特に在宅治療の場合には経鼻投与、経肺投与、坐 剤投与が望ましい。
[0056] 本発明にお 、て薬剤の投与量は特に限定されず、使用目的や投与対象の個体の 年齢、体重、個体の種類、症状、栄養状態及び併用薬剤等に応じて適宜選択可能 であるが、単回又は複数回をヒト成人に投与する場合、 GHS— Rlaに作用する物質 (例えば、グレリン）を有効成分として 0. OOlmg〜： LOOmgの範囲力 S好ましく、 0. 01 mg〜 1 Omgがより望まし!/ヽ。
[0057] 投与期間としては、上記の投与量を 1日 1回〜数回、 1〜24週間の投与することが 好ましく、より好ましくは 1〜 12週間の投与が好まし!/、。
[0058] 薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機 担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤;液状製 剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配 合される。
[0059] また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用い ることちでさる。
[0060] 賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、 D-マン-トール、デンプン、結晶 セルロース、軽質無水ケィ酸などが挙げられる。
[0061] 滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシ ゥム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
[0062] 結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、 D-マン-トール、デキ ストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ ルピロリドンなどが挙げられる。 [0063] 崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボ キシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスタ ーチナトリウムなどが挙げられる。
[0064] 溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マ クロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
[0065] 溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコ ール、 D-マン-トール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレステロ ール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウムなどが挙げられる。
[0066] 懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸 ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ-ゥム、塩化べンゼ トニゥム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール 、ポリビュルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒド 口キシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース などの親水性高分子などが挙げられる。
[0067] 等張化剤の好適な例としては、例えば塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、 D-マン-トール などが挙げられる。
[0068] 緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの 緩衝液などが挙げられる。
[0069] 無痛化剤の好適な例としては、例えばべンジルアルコールなどが挙げられる。
[0070] 防腐剤の好適な例としては、例えばパラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノ一 ル、ベンジルアルコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙 げられる。
[0071] 抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、ァスコルビン酸などが挙げられる
[0072] 発明の医薬の製剤形態としては非経口投与に適する製剤形態が好ましぐ非経口 投与に適する製剤形態としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、又は 筋肉内投与用等の注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤又は吸入剤 などを挙げることができるが、上記注射剤の製剤形態が好ましぐ特に個体がヒト成人 であり在宅治療の場合には経粘膜吸収剤、吸入剤、坐剤等の製剤形態も好ましい。 これらの製剤形態は当業者に種々知られており、当業者は所望の投与経路に適す る製剤形態を適宜選択し、必要に応じて当業界で利用可能な 1又は 2以上の製剤用 添加物を用いて医薬用組成物の形態の製剤を製造することが可能である。
[0073] 例えば、注射剤又は点滴剤の形態の医薬は、有効成分である GHS— Rlaに作用 する物質 (例えば、ダレリン）と共に適切な緩衝液、糖溶液、等張化剤、 pH調節剤、 無痛化剤、防腐剤などの 1又は 2以上の製剤用添加物を注射用蒸留水に溶解して 滅菌（フィルター)濾過後にアンプルまたはバイアル詰めする力 滅菌濾過した溶液 を凍結乾燥して凍結乾燥製剤とすることにより調製し提供することができる。添加剤と しては、例えばグルコース、マン-トール、キシリトール、ラタトースなどの糖類、ポリエ チレングリコールなどの親水性ポリマー類、グリセロールなどのアルコール類、グリシ ンなどのアミノ酸類、血清アルブミンなどのタンパク類、 NaCl、クェン酸ナトリウムなど の塩類、酢酸、酒石酸、ァスコルビン酸などの酸類、ツイーン（Tween) 80などの界面 活性剤、亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などを使用することができる。このような製剤 は、用時に注射用蒸留水や生理食塩水などを添加して溶解することにより注射剤又 は点滴剤として使用できる。また、経粘膜投与には、点鼻剤や鼻腔内スプレー剤など の鼻腔内投与剤 (経鼻投与剤)等も好適であり、経肺投与には吸入剤等も好適であ る。
[0074] 一単位製剤中の有効成分（たとえばダレリン）の含量は 0. OOlmg〜： LOOmg、好ま しくは 0. Olmg〜： LOmgであり、 1日 1回ないし数回投与することが望ましい。
[0075] 単離した皮膚細胞の処理方法としては、単離した皮膚細胞を培養液中でインキュ ペートし、インキュベート液中に無菌濾過又はオートクレープ滅菌して調製した GHS —Rlaに作用する物質（例えば、グレリン）を 0. 1ηΜ〜1 μ Μ、好ましくは 1ηΜ〜10 ΟηΜを添加することにより行うことができる。すなわち、皮膚細胞の増殖を、前記 GH S— Rlaに作用する物質を 0. 0000001mgZmL〜0. lmgZmL含有する培養液 を用いるのが好ましい。この処理を行うことによって、実施例 4に示すように、本来は 増殖がほとんど進まない皮膚細胞の増殖を促進させることが可能となる。
実施例 [0076] 以下に実施例により本発明を具体的に示す。
[0077] [実施例 1] ラット胎児における GHS— Rla mRNA発現
妊娠 14、 15または 19日の Wistarラット胎児の皮膚組織から、トリゾール試薬 (Total RNA Trizol Reagent(Life Technologies, Inc., Gaithersburug, MD)) 用い、 Nakahara et al.:Biochem. Biophys. Res. Commun. 303: 751- 755(2003)に記載の方法により、 全 RNAを抽出した。全 RNA2 g力ら、ランダムプライマー逆転写により、 Superscrip t 3 preamplincation reagents (Life Technologies, Inc., Bethesda, MD)を用い飞ンング ルストランドの cDNAを合成した。得られた cDNAを GHS—Rlaに特異的なセンス プライマーおよびアンチセンスプライマーを用いて、 PCR法により増幅させた後（BD advantage TM 2 PCR Enzyme System (BD Science, CA)を使用）、 2%ァガロースゲ ルを用いて電気泳動した。なお、コントロール mRNAとして、細胞に安定して発現し ている GAPDHを用いた。 GHS— Rlaに特異的な PCRプライマーとして、
5 ' -GATACCTCTTTTCCAAGTCCTTCGAGCC-3 ' (配列番号 22)をセンス用に
5， - TTGAACACTGCCACCCGGTACTTCT- 3， （配列番号 23)をアンチセンス用 に用いた（nucleotides 842—869 and 1001—1025 in accession no. AB001982, GenBan k)。 GAPDHに特異的なプライマーとして、
5， -CGGCAAGTTCAACGGCACA-3， （配列番号 24)をセンス用に、
5， - AGACGCCAGTAGACTCCACGACA- 3， （配列番号 25)をアンチセンス用に 用いた（nucleotides 1002—1020 and 1125—1147 in accession no. AF106860, GenBan k) 0
結果を図 1に示す。
図 1から、妊娠 14、 15、 19日のラット胎児の皮膚に、 GHS— Rla mRNAが発現 していることが確認された。特に 14日および 15日の胎児皮膚において GHS— Rla mRNAの発現量が高かった。
[0078] [実施例 2]ダレリンの胎児培養皮膚細胞における細胞内カルシウム上昇作用
妊娠 17日の Wistar系ラットを麻酔下に開腹して胎児を摘出した。この胎児から、皮 膚の小片を採取し、冷ノヽンタス液内でコラゲナーゼ処理、パパイン消化およびピぺッ ティングによる機械的分離により、胎児皮膚細胞の分散液を得た。この分散液より、 単一細胞を取得してダレリンを添カ卩したときのカルシウムイメージングを行った。カル シゥムイメージングは、カルシウムイメージング装置（IMACS,浜松ホトニタス）を用い て行った。即ち、 340nmZ380nmで惹起（Excitation)したとき、 510nm (Emissio n)での励起光の比を取った。また、カルシウムイメージング剤として Fura— 2を用い た。ダレリンはラット由来ダレリン (配列番号 3)を用いた (以下の実施例も同じ)。
結果を図 2に示す。図 2中、 I、 Π、 IIIはこの時点で写真を撮影したものである力 本 明細書には写真は省略している。また、実線表記はダレリンに反応した細胞であり、 破線表記はデスァシルダレリンに反応した別の細胞である。ダレリンおよびデスァシ ルグレリンはそれぞれ別の細胞に添加した。
ラット胎児皮膚細胞にダレリン（1 X 10_6M)を作用させると、単一胎児皮膚細胞内 カルシウムの上昇が観察された。ダレリンが GHS— Rlaをもつ胎児皮膚細胞に作用 してラット胎児細胞内カルシウムを上昇させることが示された。
[0079] [実施例 3]ダレリンの培養胎児皮膚細胞におけるチミジン取り込み促進作用
妊娠 17日の Wistar系ラットより実施例 2と同様にして、ラット胎児皮膚細胞の分散液 を採取した。この分散細胞を、 2%ゥシ胎児血清、ペニシリン（lOOUZml)、ストレブ トマイシン（100 μ g/ml)、表皮増殖因子 EGF (5ng/ml)を含有した MCDB153 HAA培地（F- Peptide Co., Ltd., Yamagata, Japan)に懸濁し、ポリエチレンイミン被 覆の 48—穴マルチウエルプレートに、 5 X 105細胞 Zゥエルを播種した。これにグレリ ン（0. 5、 5および 50pmolZmL (nM) )、 [3H]—チミジン（2 CiZmL)を添カ卩し、 2 4時間又は 48時間インキュベートした。対照としてダレリンを含まな 、培養液を用いた 。インキュベート終了後、細胞を回収して放射能を測定した。
結果を図 3に示す（黒三角： 50pmolZmL、黒四角： 5pmolZmL、黒丸： 0. 5pmo l/ 白丸:対照)。
図 3から、胎児培養皮膚細胞にダレリンを作用させると、細胞への [¾]—チミジン の取り込みが増加したことから、ダレリンには胎児皮膚細胞を増殖させる作用があるこ とが確認された。
[0080] [実施例 4]ダレリンおよび GHRP6の培養胎児皮膚細胞における細胞増殖促進作用 妊娠 17日の Wistar系ラットより実施例 2と同様にして、胎児皮膚細胞の分散液を採 取した。この分散細胞を、グレリン（0. 05〜500pmolZmL (nM)又は GHRP6 (0. 05〜50pmolZmL (nM)と共に、 2%ゥシ胎児血清、ペニシリン（lOOUZml)、スト レプトマイシン（100 μ g/ml)および表皮増殖因子 EGF (5ng/ml)を含有した MC DB153HAA培地（F- Peptide Co., Ltd., Yamagata, Japan)に懸濁し、ポリエチレンィ ミン被覆の 96—穴マルチウエルプレートに、 3 X 104細胞 Zゥエルを播種した。対照 にはダレリンまたは GHRP6を含まない培地を用いた。これに 5—ブロモー 2'—デォ キシゥリジン (BrdU) (10 /z M)を添加し、 24時間インキュベートした。培養終了後、 P roliferation ELIbA Kit (Rocne Diagnostic GmbH. Manheim, Germany)を用 ヽ飞月台 ¾ 皮膚細胞への BrdU取り込み量を測定して皮膚細胞増殖作用を検討した。
結果を図 4に示す。
図 4から、培養胎児皮膚細胞にダレリンまたは GHRP6を作用させると、有意に Brd Uの取り込み量が増加したことから、ダレリンおよび GHRP6には胎児皮膚細胞を増 殖させる作用があることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明の皮膚損傷治療剤、皮膚再生促進剤、培養皮膚細胞の増殖促進方法、皮 膚再生促進方法は製薬分野、医療分野に利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] 成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質又はその薬学的に許容さ れる塩を有効成分とする皮膚損傷治療剤。
[2] 前記物質が、（1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び（2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目 〜28番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又 は付加したアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸 残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 1項記 載の治療剤。
[3] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力も 3番目に位置 するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基 であるペプチドである請求の範囲第 2項記載の治療剤。
[4] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力も 3番目に位置 するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺプ チドである請求の範囲第 3項記載の治療剤。
[5] 前記有効成分を一単位製剤あたり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する請求の範囲第 1 〜4項の 、ずれかに記載の治療剤。
[6] 成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質又はその薬学的に許容さ れる塩を有効成分とする皮膚再生促進剤。
[7] 前記物質が、（1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び（2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目 〜28番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又 は付加したアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸 残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 6項記 載の促進剤。
[8] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力も 3番目に位置 するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基 であるペプチドである請求の範囲第 7項記載の促進剤。
[9] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力も 3番目に位置 するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺプ チドである請求の範囲第 8項記載の促進剤。
[10] 前記有効成分を一単位製剤当たり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する請求の範囲第 6 〜9項の 、ずれかに記載の促進剤。
[11] 成長ホルモン分泌促進因子レセプターに作用する物質又はその薬学的に許容さ れる塩を有効成分として用いた培養皮膚細胞の増殖を促進する方法。
[12] 前記物質が、（1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び（2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目 〜28番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又 は付加したアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸 残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 11項 記載の方法。
[13] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力も 3番目に位置 するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基 であるペプチドである請求の範囲第 12項記載の方法。
[14] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目〖こ位置 するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺプ チドである請求の範囲第 13項記載の方法。
[15] 培養皮膚細胞の増殖を、前記有効成分を 0. 0000001mgZmL〜0. lmg/mL 含有する培養液中で行う請求の範囲第 11〜14項のいずれかに記載の方法。
[16] 皮膚損傷の治療を必要とする哺乳動物に、成長ホルモン分泌促進因子レセプター に作用する物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として投与することから なる皮膚損傷の治療方法。
[17] 前記物質が、（1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び（2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目 〜28番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又 は付加したアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸 残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 16項 記載の方法。
[18] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目〖こ位置 するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基 であるペプチドである請求の範囲第 17項記載の方法。
[19] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目〖こ位置 するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺプ チドである請求の範囲第 18項記載の方法。
[20] 前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する請求の範囲第 16〜19項 のいずれかに記載の方法。
[21] 皮膚再生の促進を必要とする哺乳動物に、成長ホルモン分泌促進因子レセプター に作用する物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として投与することから なる皮膚再生を促進する方法。
[22] 前記物質が、（1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び（2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目 〜28番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又 は付加したアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸 残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 21項 記載の方法。
[23] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力も 3番目に位置 するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基 であるペプチドである請求の範囲第 22項記載の方法。
[24] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目〖こ位置 するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺプ チドである請求の範囲第 23項記載の方法。
[25] 前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する請求の範囲第 21〜24項 のいずれかに記載の方法。
[26] 皮膚損傷治療用医薬組成物を製造するための成長ホルモン分泌促進因子レセプ ターに作用する物質又はその薬学的に許容される塩の有効成分としての使用。
[27] 前記物質が、（1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び（2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目 〜28番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又 は付加したアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸 残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 26項 記載の使用。
[28] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目〖こ位置 するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基 であるペプチドである請求の範囲第 27項記載の使用。
[29] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目〖こ位置 するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺプ チドである請求の範囲第 28項記載の使用。
[30] 皮膚損傷治療用医薬組成物が、一単位製剤当たり前記有効成分を 0. 001mg〜l
OOmg含有する組成物である請求の範囲第 26〜29項のいずれかに記載の使用。
[31] 皮膚再生促進用医薬組成物を製造するための成長ホルモン分泌促進因子レセプ ターに作用する物質又はその薬学的に許容される塩の有効成分としての使用。
[32] 前記物質が、（1)配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目の アミノ酸残基が当該アミノ酸残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であ るペプチド、及び（2)配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 5番目 〜28番目までのアミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び Z又 は付加したアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目のアミノ酸残基が当該アミノ酸 残基の側鎖に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基であるペプチドからなる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 31項 記載の使用。
[33] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端力も 3番目に位置 するセリン残基が当該残基の側鎖の水酸基に脂肪酸が導入された修飾アミノ酸残基 であるペプチドである請求の範囲第 32項記載の使用。
[34] 前記物質が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有し、ァミノ末端から 3番目〖こ位置 するセリン残基の側鎖の水酸基が n—オタタノィル基によりァシルイ匕されているぺプ チドである請求の範囲第 33項記載の使用。
[35] 皮膚再生促進用医薬組成物が、一単位製剤当たり前記有効成分を 0. 001mg〜l
OOmg含有する組成物である請求の範囲第 31〜34項のいずれかに記載の使用。
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