WO2007052641A1

WO2007052641A1 - 腸管免疫賦活剤

Info

Publication number: WO2007052641A1
Application number: PCT/JP2006/321720
Authority: WO
Inventors: Shozo Shoji; Shogo Misumi; Daisuke Nakayama
Original assignee: Kumamoto University
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2007-05-10
Also published as: JP5114713B2; JPWO2007052641A1

Abstract

　本発明の目的は、パイエル板のＭ細胞を識別することによって腸管免疫を賦活化することができる新規な腸管免疫賦活剤を提供することである。本発明によれば、下記式１で示される化合物からなる腸管免疫賦活剤が提供される。式１：TGDK-CH2-CH2-NH-R （式中、TGDK-CH2-CH2-NHは、2-[N-α, N-ε-bis(N-α, N-ε-digalloyllysinyl)lysinyl]aminoethylamino基を示し、Rは、水素原子；ペプチド結合を介して活性エステル基を有する基；ペプチド結合を介してＳＨ基と結合する基；ペプチド結合を介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖：あるいはシッフベースを介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖を示す。）

Description

明細書

腸管免疫賦活剤

技術分野

[0001] 本発明は、腸管免疫賦活剤に関する。より詳細には、本発明は、ノィエル板の M 細胞を識別することによって腸管免疫を賦活ィ匕することができる腸管免疫賦活剤に関する。

背景技術

[0002] 腸管免疫系は、からだの中で最も大きな免疫装置である。この腸管免疫系には大きな特徴がある。食品のように安全なものと、病原細菌のように病原性のあるものを識別し、判別し、食品は取込まれ、病原細菌は排除されている。腸管免疫系を構成しているのは、（1)パイエル板、（2)小腸上皮細胞とそこに存在する腸管固有リンパ球、 (3) 粘膜固有層とそこに存在する粘膜固有リンパ球であり、その数は全免疫系細胞の約 60%で、経口的に体内に入る抗原が非常に多いため、それに対応すると考えられる

[0003] 腸管腔内に侵入した抗原 (病原性細菌）は、パイエル板の M細胞を通って体内に取り込まれ、パイエル板のなかで一般的な免疫応答が起こり、 IgAが産生され、病原性細菌は排除される。また、抗原タンパク質等が、消化されず、腸管上皮細胞の間隙を通って、あるいは腸管上皮細胞内に取りこまれる形で体内に入り、このような抗原が腸管免疫系と接し、全身的な免疫応答が誘導され、 IgG、 IgEが産生されると食物ァレルギ一が発症することになるが、腸管粘膜を介して取込まれたタンパク質に対してァレルギ一反応を起こさせな、仕組みが経口免疫寛容である。経口免疫寛容が崩壊 · 破綻すると容易に食物アレルギーが発症すると考えられる。ノィエル板の M細胞が食物中のアレルゲンを取込み、パイエル板のなかで一般的な免疫応答が引き起こされると、 IgAが産生され、 IgAがアレルゲンと結合し、中和され、排除されると同時にァレルギ一の原因である IgE、 IgGの産生がおさえられ、食物アレルギーが抑制されると考えられる。

[0004] アレルギーは免疫反応が過敏になったときに起きる疾病である力 1965年においてこのアレルギーの発症頻度は、学童では約 1%と報告されているが、約 27年後の 1992 年の調査ではその罹患率は約 40倍に増え、 40%を越えている。 2000年では、約 2人に 1人が何らかの形でアレルギーを持ち合わせている。アレルギーの発症には遺伝以外にも食生活の洋風化、都市環境の変化、大気汚染、ストレスの増加など、われわれの身の周りの変化もアレルギー増加の大きな原因といわれているので、これに対する対策が急務である。

[0005] スギ花粉症は日本の代表的なアレルギー疾患の一つで、花粉の中のある種のタンパク質がアレルギー反応を引き起こすことが突き止められた。このタンパク質をマウスに食べさせると明らかにアレルギー発症が抑制されることが分力つた。おそらぐァレルギー誘因性タンパク質に結合してヽるレクチン (複合多糖体)を介してパイエル板の M細胞を通って体内に取り込まれ、パイエル板のなかで一般的な免疫応答による I gAの産生、この免疫反応が全身免疫として拡大され、アレルゲンが取り除かれたと考えられる。

[0006] また、経口ワクチンの大成功例として、ポリオの生ワクチンがある。弱毒化されたポリォウィルスを経口投与するとパイエル板の M細胞を通って体内に取り込まれ、粘膜免疫が活性化し、免疫応答が引き起こされ、全身免疫として拡大し、ポリオウイルスの侵入を防いでいる。ここにおいても、 M細胞が極めて重要な働きを司っている。

[0007] 腸管免疫機構が食品のように安全なものと、病原性細菌のように病原性のあるものを識別、判別できる能力を有する細胞は M細胞であり、病原性細菌は M細胞を介して、生体内に取込まれ生体の免疫系が発動して、排除していると考えられる。病原性細菌の M細胞にターゲットする分子は病原性細菌の表面に存在する複合糖タンパク質の表面に結合して、るレクチン部分でる。その部分の分子をミミックした分子が D-リジンの 4分子の縮合体の 4個の 1級ァミンに gallic acidが酸アミド結合したものであろうと考えられている（Hamashin et al. Bioorg.Med. Chem.,l l(2003)4991- 4997)。

[0008] 非特許文献 1 : Hamashinet al. Bioorg.Med. Chem., 11(2003)4991- 4997

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] M細胞を標的とする分子センサーをィ匕学合成できれば、この M細胞標的分子センサーを疾病の原因になっている抗原に化学結合させ、経口的に投与することにより、この抗原は M細胞を識別して腸管免疫反応の誘導し、疾病を抑えられる可能性がある。これにより、アレルギー性疾患の抑制、自己免疫病の抑制、 HIV-1の飲むワクチンの開発、いろいろな疾病に対する予防ワクチンの開発に寄与できると考えられる。即ち、本発明は、パイエル板の M細胞を識別することによって腸管免疫を賦活ィ匕することができる新規な腸管免疫賦活剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、 2- [N- α , N- ε -ビス (Ν- α , Ν- ε -ジガロイノレリシ-ノレ)リシ-ノレ]アミノエチルァミン (TGDK-CH -CH -ΝΗ )の新規な製造方法を提供することを解決すべき

2 2 2

課題とした。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、、ろ、ろな抗原と容易に反応する官能基を導入した新たなコア一化合物として、 2-[Ν- α , Ν- ε -ビス (Ν- α , Ν- ε -ジガロイルリシ-ル)リシ-ル]アミノエチルァミン (TGDK,Mr.l053)の化学合成を行うことに成功した。 TGDKが M細胞を識別することが培養細胞系を用いて、明確になったので、本化合物を、 M細胞識別シグナル分子、 M cell Discriminating Sign al Molecule (McDS,マクドス）と名付けた。さらに、現在、 McDSをァカゲサルの空腸に投与し、空腸の M細胞を識別していることを確認中である。 McDSは ethylamino基を有するため、活性エステル架橋法及びチォエーテル架橋法、シフベース架橋法等を介して、すべての抗原に結合させることが可能となった。本発明はこれらの知見に基づ、て完成したものである。

[0011] 即ち、本発明によれば、下記式 1で示される化合物からなる腸管免疫賦活剤が提供される。

式 1 :TGDK- CH - CH -NH-R

2 2

(式中、 TGDK— CH -CH— NH—は、 2— [N— α , N— ε— bis(N— α , Ν— ε -digalloyllvsinyl)ly

2 2

sinylaminoethylamino基を示し、 Rは、水素原子；ペプチド結合を介して活性エステル基を有する基；ペプチド結合を介して SH基と結合する基；ペプチド結合を介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖:あるいはシッフベースを介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖を示す。 ) [0012] 好ましくは、本発明の腸管免疫賦活剤は、自己免疫疾患、家族性アミロイドポリ-ュ一口パチー（FAP)等の難治性疾患、アレルギー疾患、食物アレルギー、又は自己タンパク質の立体構造変異に起因する疾患の予防及び Z又は治療のために使用される。

[0013] 好ましくは、本発明の腸管免疫賦活剤は、パイエル板の M (マイクロホールド)細胞を識別することによって腸管免疫を賦活ィ匕する。

[0014] 本発明の別の側面によれば、（a) 2-[Ν- α , Ν- ε -bis(N- α , Ν- ε -ジフルォレ -ルメチルォキシカルボ-ルリシ-ル)リシ-ル]-アミノエチルァミノトリチル榭脂（4Fmoc-4 DK-NH- Resin)をピペリジン中で処理することによって 2-[Ν- α , N- ε -(ジリシ-ル)リシェル]アミノエチルァミノトリチル榭脂（4DK- NH- Resin)を製造する工程；

(b) 2-[N- a , N- ε -(ジリシ-ル)リシ-ル]アミノエチルァミノトリチル榭脂（4DK- NH- R esin)にトリメトキシベンゾイルク口ライドを反応させて、 2- [N- α , N- ε - bis(N- α , Ν- ε -ジ -3,4,5-トリメトキシベンゾィルリシ-ル)リシ-ル]-アミノエチルァミノトリチル榭脂（4 MTBDK-NH- Resin)を製造する工程；及び

(c) 2-[N- a , Ν- ε - bis(N- α , Ν- ε -ジ- 3,4,5-トリメトキシベンゾィルリシ-ル)リシ- ル]-アミノエチルァミノトリチル榭脂（4MTBDK-NH-Resin)に三臭化ホウ素を反応させて、 2- [N- α , N- ε -ビス - α , Ν- ε -ジガロイルリシ-ル)リシ-ル]アミノエチルァミン（TGDK- CH - CH - ΝΗ )を製造する工程を含む、 2- [Ν- α , Ν- ε -ビス (N- a , Ν-

2 2 2

ε -ジガロイルリシ-ル)リシ-ル]アミノエチルァミン（TGDK-CH - CH - ΝΗ )を製造す

2 2 2 る方法が提供される。

発明を実施するための最良の形態

[0015] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明の腸管免疫賦活剤は、下記式 1で示される化合物からなることを特徴とする式 1 : TGDK- CH - CH -NH-R

2 2

sinyl]aminoethylamino基を示し、 Rは、水素原子；ペプチド結合を介して活性エステル基を有する基；ペプチド結合を介して SH基と結合する基；ペプチド結合を介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖:あるいはシッフベースを介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖を示す。 )

[0016] 式 1 : TGDK- CH - CH -NH-Rにおいて Rが水素原子である化合物である、 2- [N- a ,

2 2

N- ε - bis(N- α , Ν- ε -digalloyllysinyl)lysinvl]aminoethylamine (TGDK- CH - CH - N

2 2

H )は、本明細書の実施例 1に記載の通り、 4Fmoc- 4DK- NH- Resinを脱保護（脱 Fmo

2

c)し、 Tnmethoxybenzoyl chloride u'MBし)で Tnmethoxy Benzoylィ匕行い、らに二臭化ホウ素で脱 metoxyィ匕することにより合成することができる。

[0017] 具体的には、先ず、 2- [N- α , N- ε - bis(N- α , Ν- ε -difluorenylmethyloxycarbonyll ysinyl)lysinyl]- aminoethylaminotritylresin (4Fmoc—4DK—NH— Resin)【こ 20%ピペリンン (脱水 DMF中）を添カ卩し、室温で超音波処理することによって、 Fmocを除去することができる。

[0018] 次!、で、得られた 2— [N— α , N- ε -(dilysinyl)lysinyl]aminoethylaminotritylresin (4DK -NH-Resin)を脱水 DMF (ジメチルホルムアミド）で洗浄し (超音波処理）する。洗浄した 4DK- NH- Resinに、脱水 DMF及び TEAを添カ卩し、さらに Trimethoxybenzoyl chlorid eを添カ卩し、反応混合物を 40°Cで撹拌することによって、 Trimethoxy Benzoyl化を行う。得られた 4MTBDK-NH- Resinを、 1%トリェチルァミン（TEA)を含む脱水 DMFで洗浄して過剰の TMBCを除去し、さらに、脱水 DMFで 5回洗浄して、 TEAを除去し、洗浄済みの 4MTBDK-NH- Resinを調製することができる。

[0019] 次いで、 4MTBDK- NH- Resinに、三臭化ホウ素のジクロロメタン溶液を撹拌しながら添加し、添加終了後、ドライヤーで加温しながら、 DMF及び塩化メチレンを除く。反応混合物に水を撹拌しながら加える。反応混合物を遠心分離し、榭脂層と上清を分離し、それぞれ凍結乾燥する。榭脂層を「Ppt Resin」とし、上清を「凍結乾燥上清 S」とする。「Ppt Resin」を脱水 DMFに懸濁し、榭脂を分離し、さら〖こ、榭脂に脱水 DMFをカロえ、合わせて抽出液とする。この抽出液にトリェチルァミン溶液を加え、アルカリ性にし、生じた沈殿を除き、上清にエーテルをカ卩え、生じた沈殿を風乾し、脱水 DMFを加え、不溶性沈殿を除き、さらに、エーテルをカ卩えて生じた沈殿を試料 (TGDK-CH -CH -

2 2

NH )とすることができる。また、「凍結乾燥上清 S」には脱イオン水をカ卩え、トリェチル

2

ァミンでアルカリ性にし、凍結乾燥する。得られた乾燥品に脱水 DMFをカ卩え、不溶性残渣を除き、可溶性画分にエーテルを滴下し、生じた沈殿を試料とすることができる。（TGDK- CH -CH -NH )

2 2 2

[0020] また、式 1： TGDK- CH - CH - NH- Rにお!/、て、 Rがペプチド結合を介して活性エス

2 2

テル基を有する基；ペプチド結合を介して SH基と結合する基；ペプチド結合を介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖:あるいはシッフベースを介して結合しているペプチド、タンパク質、脂質又は糖を示す化合物は、式 1 : TGDK_CH -CH -

2 2

NH-Rにおいて Rが水素原子である化合物に対して、それぞれに対応する化合物（ぺプチド、タンパク質、脂質、ポリエチレングリコール類又は糖などを含む）を反応させること〖こより合成することができる。

[0021] Rがペプチド結合を介して活性エステル基を有する基としては、スクシンィミジル、 p

-ニトロフエノール等が挙げられる。

[0022] Rがシッフベースを介して結合するペプチド、タンパク質、脂質、ポリエチレングリコール類又は糖である場合には、ダルタールアルデヒドを介してペプチド ·タンパク質、ァミノ脂質、ァミノ糖類、アミノ基をもったポリエチレングリコール類、アルデヒドをもった化合物を反応させることができる。

[0023] また、上記したような式 1： TGDK- CH - CH - NH- Rで示される化合物は、 TGDK-C

2 2

H -CH -NHに、多価性試薬 (市販品、多機能性ポリエチレングリコール類、日本油

2 2 2

脂 KK, 2006.、 p. 10〜15)、 '二価性試薬、 Hetero- bifonctional reagents,ァミノ基と S H基との架橋反応が可能な異反応性二価性試薬 (市販品、同仁化学研究所 2005、 p . 234-236)を反応させること〖こよって作成することもできる。

[0024] 上記したような各種の Rを、 TGDK-CH - CH - NHに結合させる方法としては、例え

2 2 2

ば、 TGDK-CH -CH -NHの DMF溶液に二価性試薬及び異反応性二価性試薬の D

2 2 2

MF溶液を N- methylmorphorlneアルカリで反応させ、生理的緩衝液で数十倍に希釈し、生理的条件下で、生理活性ペプチド、タンパク質のアミノ基、 SH基と反応させる方法を挙げることができる。

[0025] 式 1 : TGDK- CH - CH -NH-Rにおいて Rが水素原子である化合物である、 2- [N- a ,

2 2

N- ε - bis(N- α , Ν- ε -digalloyllysinyl)lysinvl]aminoethylamine (TGDK-CH - CH - N

2 2

H )は、上記した通り、ペプチド結合又はシッフベースなどを介して、ペプチド、タンパク質、脂質、ポリエチレングリコール類又は糖と結合することにより、腸管免疫賦活剤として使用することができる。

[0026] 本発明で用いることができるペプチド、タンパク質、脂質、ポリエチレングリコール類又は糖としては、抗原となり得るものであれば特に限定されず、任意のものを使用することがでさる。

[0027] 本発明の免疫賦活剤のために用いることができる抗原としては、腫瘍抗原、病原体抗原およびアレルゲン抗原などを挙げることができる力これらに限定されるものではない。ここで言う病原体抗原とは、病原体に特有の抗原を意味し、ウィルス、細菌、寄生生物または菌類力も得られる抗原である。

[0028] 病原体の具体例としては、コレラ菌、毒素原性大腸菌、ロタウィルス、クロストリジゥム 'ディフイシレ、赤痢菌、サルモネラ'チフィ、パラインフルエンザウイルス、インフルェンザウィルス、ストレプトコッカス'ミュータンス、熱帯熱マラリア原虫、黄色ブドウ球菌、狂犬病ウィルスおよびェプスタイン-バーウィルスなどが挙げられる力これらに限定されるものではない。また、アレルゲン抗原としては、ハプテン、または花粉、ほこり、カビ、胞子、鱗屑、昆虫および食品由来の抗原などを挙げることができる。

[0029] 本発明の免疫賦活剤においては、式 1で示される化合物は、薬学的に許容される担体と一緒に適当な製剤にすることができる。担体として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤などを用いることができる。また、酸ィ匕防止剤のような添加剤を配合してもよい

。製剤の形態は特に限定されず、液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シ口ップ剤等の任意の形態とすることができる。

[0030] 賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖又はブドウ糖等の糖類;バレイショデンプン又はコムギデンプン等のデンプン類、；結晶セルロース等のセルロース類；無水リン酸水素カルシウム又は炭酸カルシウム等の無機塩類等、ポリエチレングリコール類等を使用することができる。結合剤としては、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、又はポリビュルピロリドン等、多機能性ポリエチレングリコ一ル類等を使用することができる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセル口ース、カノレボキシメチノレセノレロースカノレシゥム、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピルスターチ、又はアルギン酸ナトリウム等、ポリエチレングリコール類等を使用することができる。潤沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などを使用することができる。ナノ粒子化剤としてはコレステロールプルラン、多機能性ポリエチレングリコール類等（日本油脂 KK)を使用することができる。

[0031] 本発明の免疫賦活剤は、特に腸管免疫を賦活する腸管免疫賦活剤として好適に使用できる。

[0032] 本発明の免疫賦活剤の投与経路は特に限定されず、経口投与でも非経口投与（例えば、直腸投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔投与および静脈内投与など)でもよいが、好ましくは経口投与である。

[0033] 本発明の免疫賦活剤の製剤中に含まれる式 1で示される化合物の量は、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等に応じて適宜設定することができるが、例えば、 l ^u g 〜1000mgZkgZ回、好ましくは 10 μ g〜100mg/kg/回とすることができる。

[0034] 本発明の免疫賦活剤は、アジュバントと一緒に投与してもよい。アジュバントとしては、ワクチン (抗原)の投与に先立って投与しておくことにより免疫応答を増強できる物質であれば、任意の物質を使用することができる。殺菌微生物のように抗原性をもつもののほか， alum (硫酸アルミニウム 'カリウムなど）や鉱物油のように非抗原性のものでもよい。 Freundは 1947年抗原水溶液を等量の油（鉱物油 85%,界面活性剤 15% )と混ぜ，乳剤の状態で注射すると抗体の産生量が増大することを見出した。これは不完全フロインドアジュバント incomplete Freund's adjuvant (IFA)と呼ばれ，これに結核菌の菌体成分をカ卩えたものが完全アジュバント complete F's. a. (CFA)である。このほか、水酸ィ匕アルミニウム，リン酸アルミニウムなどの鉱酸塩はアジュバント効果を示す。また、細菌内毒素、特にグラム陰性菌のリポ多糖類は抗体産生を著明に促進することができ、有効成分は lipid Aにある。本発明では、上記したものをアジュバントとして使用することができる。アジュバントの投与経路は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。

[0035] 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する力本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例

[0036] 実施例 1： TGDK- CH - CH - NHの化学合成 (材料）

3,4,5-Trimethoxy Benzoyl Chloride(TMBC)は東京化成から購入し、 2- [Ν- α , Ν- ε - bis(N- α , Ν- ε -difluorenylmethyloxycarbonyllysinyl)lysinyl]-aminoethylaminotrit yl resin (略記名 4Fmoc-4DK-NH- Resin)は渡辺化学より購入した。 Disuccinimidyl su berate(DSS)は PIERCE社、 fluoroisothiocyanate(FITC)は和光純薬、 Tetramethylrhoda mine— 5— (and— 6)— isothiocyanate(TRITCノ— conjugateddonkey anti-mouse Ig (H+L an tibodyは Jackson ImmunoResearch(U.S.A)力ら入手した。

[0037] (方法）

(l) 4Fmoc- 4DK- NH- Resinの脱保護による 4DK- NH- Resinの調製

2- [N- α , N- ε - bis(N- α , N- ε -difluorenylmethyloxycarbonyllysinyl)lysinyl]-amin oethylaminotrityl resin (4Fmoc—4DK—NH—Resin、 lg、 0.5m mole Fmoc/g resin)に、 2 0%ピぺリジン (脱水 DMF中） (20 ml)を添加し、室温で 20分間、超音波処理 (各 5秒）し、 Fmocを完全に除いた。上記の操作を 2回繰り返して、 2-[Ν- α , N- ε -(dilysinyl)ly sinyllaminoethylaminotritylresin (略記名 4DK— NH— Resin)を得た。

[0038] [化 1]

2- [N- , N- ε -bis (N- a , N - ε -dif luorenylraethyloxycarbonyllysinyl) lysinyl] - aminoethylaminotrityl resin (4Fmoc-4DK—NH- Resin)

化 2] 2 [N α， N™ ε -(dilysinyl) lysinyl] aminoethylaminotrityl resin ( DK-NH- Resin)

[0040] (2) 4DK- NH- Resinの Trimethoxy Benzoyl化による 4MTBDK-NH- Resinの調製

4DK- NH- Resinを脱水 DMF(15 ml)を用いて 6回洗浄した（超音波処理、各 5sec)。各行程では、遠心分離した。洗浄した 4DK-NH- Resinに、脱水 DMF (5 ml)及び TEA (7 mmole) (1 ml)を添カ卩し、さらに脱水 DMF(1 ml)中に Trimethoxybenzoyl chloride 1 mmole(TMBC、 230 mg)を含む溶液を、 0.1mlずつ上下に激しく撹拌しながら添カロした。 Resinの反応混合物（全量 10 ml)を 40°Cで 120分間撹拌した。得られた 4MTBDK- NH- Resinを、 1%TEAを含む脱水 DMF(15 ml)で 5回洗浄して TMBCを除去した。さらに、脱水 DMF(15 ml)で 5回洗浄して、 TEAを除去して、洗浄済みの 4MTBDK- NH- Re sinを調製した。

[0041] [化 3] 2 [N , N- ε - bis (N- , N- ε - di-3, 4, 5-trimethoxybenzoyllysinyl) lysinyl] - aminoethylaminotrityl resin (略記名 4MTBDK腿 Resin)

[0042] (3) 4MTBDK- NH- Resinの脱メトキシ化による TGDK- CH - CH - NHの合成

2 2 2

lOOmgの 4MTBDK- NH- Resin (500 Lの DMF中）に、三臭化ホウ素（BBr3、 lmol/ Linジクロロメタン） 10ml(DMF容積の 20当量容積)を激しく撹拌しながら約 1〜2分かけて添加した。激しく発煙、発熱する。途中で反応の色が赤褐色から白く変わり、さらに褐色になる。添加終了後、ドライヤーで加温しながら、 DMF及び塩化メチレンを除いた。固化し、赤褐色に着色した。水 10mlを撹拌しながら加える。発煙、発泡する。反応混合物を 3500rpmで 5分間遠心分離し、榭脂層と上清を分離し、それぞれ凍結乾燥した。榭脂層を「Ppt Resin」とし、上清を「凍結乾燥上清 S」とした。

[0043] (i)「PptResin」から TGDK- CH - CH - NHの精製

2 2 2

「Ppt Resin」100mgを脱水 DMFlOOO /z Lに懸濁し、榭脂を分離し、さらに、榭脂に脱水 DMFlOOO /z Lカ卩え、合わせて抽出液とした。この抽出液にトリェチルァミン溶液を加え、アルカリ性にし、生じた沈殿を除き、上清にエーテル 20mlをカ卩えた。生じた沈殿を風乾し、脱水 DMF500 /Z Lをカ卩え、不溶性沈殿を除き、さらに、エーテル 10mlを加えて生じた沈殿を試料とした。 MS分析を行い、純度不良の場合、脱水 DMFに溶解し、不純物を除き、エーテル沈殿を行い、この操作を数回して精製した。

[0044] (ii)「凍結乾燥上清 S」力ら TGDK- CH - CH - NHの精製

2 2 2

100mg4MTBDK- NH- Resinから得られた「凍結乾燥上清 S」に脱イオン水 5.0 mlを加え、トリェチルァミン 0.6mlでアルカリ性にし、凍結乾燥した。得られた乾燥品に脱水 D MFlOOO /z Lを加え、不溶性残渣を除き、可溶性画分にエーテル 15mlを滴下し、生じた沈殿を試料とした。 MS分析を行い、純度不良の場合、脱水 DMFに溶解し、不純物を除き、エーテル沈殿を行い、この操作を数回して精製した。

[0045] 「Ppt ResinJ及び「凍結乾燥上清 S」力の合わせた収率は 80%で、 4Fmoc-4DK-N H- Resin (0.5m molof Fmoc/lgresin)から、 MS分析上均質な TGDK- CH - CH - NH (

2 2 2 lOOmg)が得られた。上記の方法で得られた 2-[N- α , Ν- ε -bis(N- α , N- ε - digalloy llysinyl)lysinyl]aminoethylamine (TGDK-CH - CH - NH )の MALDI TOF MSで求めた

2 2 2

質量数は 1053.38であった。 TGDK- CH - CH - NH (McDS)の MALDI TOF MSを図 1

2 2 2

に示す。

[0046] [化 4]

2- [N- , N ε bis (N ct , N ε - digalloyllysinyl) lysinyl] aminoethylamine (TGDK CH₂ CH₂ N¾、 McDS)

(4) TGDK-SS (活性エステル）の合成

Disuccinimidyl suberate(DSS)(60 μ mol,36.8 mg)を脱水 DMF300 μ Lに溶力し、 n— me thylmorphorine(50 μ L)を滴下し、 TGDK- CH - CH - NHの DMF solution(500 μ L, 10

2 2 2

μ mol)をカ卩え、室温で 60分反応させた。反応後、 Trifluoroacetic acid (TFA.20 μ L滴下し ,ρΗを中性にした後、 dichloromethane 7mlで 1回、さらに 3.5mlで 2回、過剰の DSS を抽出して除いた。残渣に脱水 DMF500 /Z Lを加え、溶解し、エーテル 5mlを滴下して生じる沈殿を脱水 DMFlOO /z Lに溶解して試料とした。試料の純度は MS分析して求めた。収率は約 50%で 5 μ molである。なお、純度が不良の場合、 DMFに溶力し、不溶物を除き、エーテルで沈殿し、 DMFに再溶解して用いた。

[化 5]

{2- [N a , N ε bis (N- , N ε -digalloyllysmyl) lysinylj aminoethylamine} succinimidyl suberate (TGDK- SS, 活性エステル McDS)

実施例 2： TGDK-FITCの M細胞へのターゲット

(方法） (l) TGDKの蛍光ラベル化

TGDKは、以下の方法により Fluoroisothiocyanate(FITC)を用いて、蛍光ラベル化した。 TGDK- CH -CH -NH及び FITCを DMFに別々に溶力し、混合し、トリェチルアミ

2 2 2

ンを少量加え、室温で 60分作用させ、エーテルを加え、生じた沈殿を MS分析して純度を確認して試料とした。

[0050] (2) M細胞は、 CACO-2細胞に Raji B細胞培養液で形質転換して用いた。具体的には、 CACO- 2細胞は 10,000 cells/well ( Lab- Tek Chamber Slide System, Nunc社製）で 21日間培養し (週二回培地交換)、その後 RajiB細胞培養上清と CACO-2細胞用培地を 1:1で混合した培地でさらに 3日間培養した。

[0051] (3)共焦点顕微鏡を用いた TGDKの M-cell標的の確認

細胞を PBS (-)で洗浄後、 TGDK- FITC (10 uM)とポリオウイルス（ヒト経口生ワクチンの 1/10量）をカ卩え、 30分間室温にてインキュベーションした。その後 PBS (-)洗浄し、ポリオウィルス検出マウス抗体 (抗 Poliovirus単クローン抗体）を処理後、室温で 30分ィンキュベーシヨンした。さらに PBS (-)洗浄し、 TRITC標識抗マウス抗体（TRITC- conjug ated donkey anti- mouseIgG(H+L) ant¾ody)を処理後、室温で 30分インキュベーション後、 PBS (-)洗浄 · 1%パラホルムアルデヒドにて固定化後 mounting mediumにてマウントした後、共焦点顕微鏡にて観察した。

[0052] (結果）

図 2には M細胞の顕微鏡図を示し、 a:小腸絨毛組織; b:パイレルパッチ; c:バイレルパッチの M細胞を表している。 CACO-2細胞が Raji B細胞培養液で形質転換し、 M細胞様に変化（図 3a)し、 Poliovirusのターゲットが認められた（図 3b)ことから、この M細胞様細胞は M細胞と同定できる。次に、蛍光抗体法で TGDK-FITCの M細胞へのターゲットを調べた結果、図 3cに示すように、 TGDKは M細胞に、ターゲットしていることが明らかになった。さらに、図 3dに示すように、 Poliovirusの M細胞へのターゲットしている同じ M細胞に TGDKがターゲットしていること力両蛍光色素の Merge (重なり合い)から明確に確認された。以上の結果から、 TGDK分子は M細胞ターゲット分子として著効であり、腸管免疫賦活剤として、有用であることが示された。

産業上の利用可能性 [0053] 本発明の腸管免疫賦活剤は、パイエル板の M細胞を識別することによって腸管免疫を賦活ィ匕することができる。本発明の腸管免疫賦活剤は、例えば、（1)飲むワクチンの基剤、（2)自己免疫病予防'治療ワクチン基剤、（3)アレルギー予防'治療ヮクチン基剤、（4)食物アレルギー予防'治療ワクチン基剤、並びに（5) FAP、プリオン病等、自己タンパク質の立体構造変異に起因する疾病の予防 ·治療用ワクチンの産生基剤として有用である。

図面の簡単な説明

[0054] [図 1]図 1は、 TGDK- CH - CH - NHの MALDI TOF MSを示す。 TGDK- CH - CH - N

2 2 2 2 2

Hの質量数は 1053.38で、実測値 1053.03 (安定同位体を含む質量数)及び理論値 1

2

052.40 (安定同位体を含まない質量数)と良く一致した。

[図 2]図 2は、小腸の絨毛組織、パイレルパッチ、 M細胞を示す。

[図 3]図 3は、共焦点顕微鏡を用いて TGDKの M-cellへのターゲッティングを確認した結果を示す。

Claims

請求の範囲

[1] 下記式 1で示される化合物力なる腸管免疫賦活剤。

式 1 : TGDK- CH -CH -NH-R

2 2

[2] 自己免疫疾患、家族性アミロイドポリ-ユーロバチ一（FAP)、アレルギー疾患、食物アレルギー、又は自己タンパク質の立体構造変異に起因する疾患の予防及び Z又は治療のために使用される、請求項 1に記載の腸管免疫賦活剤。

[3] パイエル板の M (マイクロホールド)細胞を識別することによって腸管免疫を賦活化する、請求項 1又は 2に記載の腸管免疫賦活剤。

[4] (a) (4Fmoc-4DK-NH- Resin)をピペリジン中で処理することによって 2- [Ν- α , N- ε - (ジリシ-ル)リシ-ル]アミノエチルァミノトリチル榭脂（4DK- NH- Resin)を製造するェ程；

(b) 2- [N- α , N- ε -(ジリシ-ル)リシ-ル]アミノエチルァミノトリチル榭脂（4DK- NH- R esin)にトリメトキシベンゾイルク口ライドを反応させて、 2- [N- α , N- ε - bis(N- α , Ν- ε -ジ -3,4,5-トリメトキシベンゾィルリシ-ル)リシ-ル]-アミノエチルァミノトリチル榭脂（4 MTBDK-NH- Resin)を製造する工程；及び

2 2 2

ε -ジガロイルリシ-ル)リシ-ル]アミノエチルァミン（TGDK- CH - CH - NH )を製造す

2 2 2 る方法。