CN112789056A - 粘膜佐剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种对粘膜免疫原性高且安全性高的粘膜疫苗的制备有用的粘膜佐剂和含有它的粘膜疫苗组合物。由TGDK构成的粘膜佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及增强抗原的粘膜免疫诱导的粘膜佐剂。
背景技术
粘膜疫苗通过以经鼻等经粘膜的方式给予抗原而引起粘膜局部的免疫和全身性的免疫响应,由此对于病原体可以构建双重防线。另一方面,作为粘膜疫苗而被实用的疫苗是具有感染性的活疫苗或以具有粘膜亲和性的特殊的毒素为抗原的疫苗,其他的灭活抗原单独的给予不能诱导足够的免疫,需要佐剂等的组合。
作为用于以粘膜疫苗引起足够的免疫的方法,以往一直使用具有感染性的弱毒化的病原体。但是,弱毒活疫苗由于具有感染性,所以副反应强,例如经口活脊髓灰质炎疫苗的脊髓灰质炎疫苗相关麻痺是罕见但不可避免的副反应,据说是由于疫苗株的神经毒性复原而发病的。因此,在粘膜疫苗中也应该使用安全性高的灭活抗原,但是除特殊的毒素等抗原之外,经粘膜的给药很难赋予足够的免疫。为了改善这种情况考虑添加粘膜佐剂,霍乱毒素、毒素原性大肠杆菌的易热性毒素(LT)作为代表粘膜佐剂而被熟知(非专利文献1-2)。
但是,在过去的临床试验中由于LT的经鼻给药而引起面部神经麻痺(贝尔麻痺),认识到将毒素其本身作为佐剂使用在安全性方面存在问题。另外,其他双链RNA(polyI:C)(专利文献1)也具有粘膜佐剂活性,但是由于诱发炎症、细胞因子血症,所以还未实用。
最近在日本的经鼻给药流感疫苗的开发中,并不是市售的流感HA疫苗的抗原即分裂抗原,而是将免疫原性更高的灭活完整颗粒作为抗原进行临床试验(非专利文献3)。这是因为分裂抗原以经粘膜给药无法诱导足够的免疫响应,但是灭活完整颗粒抗原在皮下给药中特别是在幼儿中存在副反应的问题(给药部位的局部反应和发热),目前没在市场上流通。因此,期望以安全性高的分裂抗原达到与灭活完整颗粒抗原同等程度的免疫诱导。
四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子(TGDK)是与存在于粘膜的抗原摄入细胞即Microfold cell(M细胞)特异地结合的分子(非专利文献4)。因此,通过使TGDK与抗原等进行化学键合,可以将疫苗抗原有效地输送给M细胞,可以提高免疫响应。例如在专利文献2中公开了TGDK-CH2-CH2-NH2通过介由肽键或希夫碱等与肽、蛋白质、脂质、聚乙二醇类或糖结合,可以作为肠道免疫赋活剂使用。另外,在专利文献3中公开了Hub抗原与TGDK与胎球蛋白的共价结合物能成为HIV/AIDS的分子模拟粘膜疫苗。
然而,完全不知道TGDK分子本身具有粘膜佐剂活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2005-97267号公报
专利文献2:国际公开第2007/052641号
专利文献3:国际公开第2013/024859号
非专利文献
非专利文献1:Xu-Amano,J.,H.Kiyono,R.J.Jackson,H.F.Staats,K.Fujihashi,P.D.Burrows,C.O.Elson,S.Pillai,J.R.McGhee.1993.Helper T cell subsets forimmunoglobulin A responses:oral immunization with tetanus toxoid and choleratoxin as adjuvant selectively induces Th2 cells in mucosa associatedtissues.J.Exp.Med.1993;178(4):1309-20
非专利文献2:Takahashi,I.,M.Marinaro,H.Kiyono,R.J.Jackson,I.Nakagawa,K.Fujihashi,S.Hamada,J.D.Clements,K.L.Bost,J.R.McGhee.1996.Mechanisms formucosal immunogenicity and adjuvancy of Escherichia coli labileenterotoxin.J.Infect.Dis.1996;173(3):627-35
非专利文献3:Ainai A,Tamura S,Suzuki T,van Riet E,Ito R,Odagiri T,etal.Intranasal vaccination with an inactivated whole influenza virus vaccineinduces strong antibody responses in serum and nasal mucus of healthyadults.Human vaccines&immunotherapeutics.2013;9(9):1962-70.
非专利文献4:Misumi S,Masuyama M,Takamune N,et al.Targeted Delivery ofImmunogen to Primate M Cells with Tetragalloyl Lysine Dendrimer Journal ofImmunology,2009;182(10):6061-6070
发明内容
本发明涉及提供一种对粘膜免疫原性高且安全性高的粘膜疫苗的制备有用的粘膜佐剂和含有它的粘膜疫苗组合物。
本发明人等鉴于上述问题进行了研究,结果意外地发现:以往与疫苗抗原化学键合并用于将该抗原输送给M细胞的TGDK其本身具有佐剂活性,能够增强抗原的粘膜免疫诱导能力。
即,本发明涉及以下的1)~10)。
1)一种粘膜佐剂,由TGDK构成。
2)一种粘膜佐剂组合物,含有TGDK和药学上允许的载体。
3)一种粘膜疫苗组合物,含有1)的粘膜佐剂和免疫原。
4)根据3)的粘膜疫苗组合物,其中,免疫原为流感病毒的完整颗粒或分裂抗原。
5)一种3)或4)的粘膜疫苗组合物的制备方法,其特征在于,混合TGDK和免疫原。
6)一种TGDK,用于作为粘膜佐剂使用。
7)一种含有TGDK和免疫原的组合物,用于在粘膜疫苗疗法中使用。
8)一种TGDK的用途,用于制造粘膜佐剂。
9)一种含有TGDK和免疫原的组合物的用途,用于制造粘膜疫苗。
10)一种粘膜疫苗疗法,将含有TGDK和免疫原的组合物给予需要该组合物的对象。
根据本发明的粘膜佐剂,可以制备使用安全的灭活抗原的粘膜疫苗。可以提供例如像目前流通的流感HA疫苗那样、使用安全性更高的分裂抗原的粘膜疫苗,可以作为预防药对医药品产业做出很大的贡献。
附图说明
图1是分裂抗原给予组的A/California/07/2009株特异的IgG抗体效价。
图2是分裂抗原给予组的B/Texas/2/2013株特异的IgG抗体效价。
图3是灭活完整颗粒抗原给予组的A/California/07/2009株特异的IgG抗体效价。
图4是灭活完整颗粒抗原给予组的B/Texas/2/2013株特异的IgG抗体效价。
图5是B/Texas/2/2013株特异的IgG1和IgG2a抗体效价的各组中的几何平均值。
图6是A/California/07/2009株特异的IgG抗体效价。
图7是B/Texas/2/2013株特异的IgG抗体效价。
具体实施方式
在本发明中,“TGDK”是四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子的缩写,指的是N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟苯甲酰基)-赖氨酰]-N-(2-氨乙基)-赖氨酰胺。TGDK作为存在于粘膜的抗原摄入细胞即M细胞的靶分子而被熟知。
TGDK例如可以使用没食子酸和D-赖氨酸,使用四没食子酰基-D-三赖氨酰基二乙胺固相法来制造(参照上述非专利文献4)。
如后述实施例所示,相对于不添加TGDK的组,将混合流感疫苗株(分裂抗原/灭活完整颗粒抗原)与TGDK而制备的疫苗组合物以粘膜给予小鼠时诱导的与该抗原特异性结合的IgG的效价显著提高。另外将TGDK添加于分裂抗原而免疫诱导时,得到与只使用灭活完整颗粒抗原而诱导免疫时同等程度的IgG效价。而且,如果看IgG1和IgG2a的几何平均抗体效价(GMT),则对流感病毒的感染防御能力优异的IgG2a显著上升。
即,在粘膜给予免疫原(抗原)的情况下,TGDK具有提高抗体诱导能力的粘膜佐剂活性,因此,TGDK成为粘膜佐剂,另外,含有TGDK与药学上允许的载体的组合物能成为粘膜佐剂组合物。另外,TGDK可以用于制造粘膜佐剂或粘膜佐剂组合物。
在本发明中,“粘膜佐剂”是指在粘膜给予免疫原的情况下,使对于免疫原的免疫响应增加的物质。
这里,“粘膜给药”是指经由粘膜的给药方式,“粘膜”是指脊椎动物的消化器、呼吸器、泌尿生殖器、眼等特别是外通性的中腔器官的内壁。因此,作为这样的粘膜给药,可以举出例如鼻腔给药(经鼻给药)、口腔给药、阴道内给药、上呼吸道给药、肺泡给药、滴眼剂给药等,但是不限于此。
本发明的粘膜佐剂或粘膜佐剂组合物能够与免疫原组合而进行粘膜给药,给药可以与给予免疫原同时,也可以在给予免疫原之前或之后。
本发明的粘膜佐剂或粘膜佐剂组合物的给药量能够根据给药对象、给药方法、给药方式、抗原物质的种类而适当地决定。
本发明的粘膜佐剂能够与免疫原组合而制成粘膜疫苗组合物。本发明的粘膜疫苗组合物能够通过混合免疫原和TGDK而制备,可以进一步适当地添加药学上允许的载体而制成适当的制剂。在本发明的粘膜疫苗组合物中,TGDK并非形成与免疫原或其他成分化学键合的状态,而是以遊离的分子状态存在。
作为“免疫原”(抗原),可以举出经粘膜感染病原体(例如病毒或病原细菌等)或由该病原体精制的天然产物,或者通过基因重组等方法而人为制作的蛋白质、肽、多糖类,具体为完全病毒颗粒即病毒体、不完全病毒颗粒、病毒体构成颗粒、病毒非结构蛋白质、来自病原菌的蛋白质或糖蛋白质、感染防御抗原、中和反应的表位等,包含具有感染能力的物质与使感染能力丧失的(灭活抗原)物质。作为灭活抗原,可以举出例如通过物理(例如X射线照射、热、超声波)、化学(福尔马林、水银、醇、氯)等操作而灭活的抗原,但是不限于此。从安全性的观点出发,来自经粘膜感染病原体的免疫原优选为来自上述病毒或病原菌的灭活抗原。
作为病毒,可以举出例如水痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、流感病毒、腺病毒、疱疹病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒、风疹病毒等,优选为流感病毒或人免疫缺陷病毒,更优选为流感病毒。流感病毒可以使用完整颗粒病毒,但是在本发明中,可以使用将病毒的颗粒裂解并除去胞质鞘中的脂质而得的分裂抗原。
作为病原菌,可以举出百日咳杆菌、髄膜炎球菌、b型流感杆菌、肺炎球菌、结核杆菌、霍乱弧菌、白喉杆菌等。
作为粘膜疫苗组合物的剂型,可以举出例如液剂、悬浮剂、粉末剂等。
作为液剂,可以举出溶解于精制水、缓冲液等而得的液剂等。作为悬浮剂,可以举出与甲基纤维素、羟基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、酪蛋白等一起悬浮于精制水、缓冲液等而得的悬浮剂等。作为粉末剂,可以举出与甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素等一起充分混合而得的粉末剂等。
在这些制剂中可以根据需要添加通常使用的吸收促进剂、表面活性剂、保存剂、稳定化剂、防湿剂、保湿剂、溶解剂等。
应予说明,在本发明的粘膜疫苗组合物中,只要不损害该疫苗的免疫原性和安全性,则也可以含有除TGDK以外的佐剂。
本发明的粘膜疫苗组合物中含有的免疫原的量如果是足以产生抗原特异性IgG的量,则不特别限定,也可以斟酌与并用的TGDK的比率而适当地设定。例如,使用流感病毒的分裂抗原作为抗原时,只要在1次的给药用量即1~60μg HA(HA换算)的范围内含有即可,更优选为9~15μg HA(HA换算)。上述浓度是通过用一元放射免疫扩散试验法、HA含量法等WHO、国家标准规定的试验法测定HA蛋白质的浓度而得到的值。
另外,粘膜疫苗组合物中的TGDK的含量可以考虑抗体效价而适当地调整,但是只要在例如1次的给药用量即0.03~30μg的范围内含有即可,更优选为0.03~0.3μg。
本发明的疫苗组合物的给药路径不特别限定,可以是经口给药也可以是非经口给药(例如鼻腔给药、滴眼剂给药),例如通过向鼻腔内或口腔内滴加、喷雾或喷涂而给药。
本发明的佐剂组合物或疫苗组合物的给予对象可以举出人和除人以外的哺乳动物,优选为人。作为除人以外的哺乳动物,可以举出例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猪、牛、山羊、马、绵羊、狗、猫、猴子、猩猩、黑猩猩等。
实施例
以下,通过实施例来更详细地说明本发明,但是本发明不受这些例子限定。
实施例1
(1)将流感HA疫苗“生研”的A/H1N1亚型(A/California/07/2009株)和B/Yamagata系统(B/Texas/2/2013株)的各原液作为分裂抗原,以每10μL各株的血凝集素成为1μg的方式将各分裂抗原混合,而且以最终浓度成为0.03~30μg/10μL的方式添加TGDK。另外,作为对照,制备了不添加佐剂的给药液和以成为30μg/10μL的方式添加了作为TGDK对照的没食子酸而成的给药液(表1),采用没食子酸作为TGDK的对照是因为TGDK是将4分子的没食子酸(Gallic acid)结合于由3分子赖氨酸形成的骨架的伯胺而得的。另外,与分裂抗原同样地将A/H1N1亚型(A/California/07/2009株)和B/Yamagata系统(B/Texas/2/2013株)的灭活完整颗粒抗原以每10μL各株的血凝集素成为1μg的方式混合,而且以TGDK成为0.03或0.3μg、没食子酸成为30μg的方式制备各灭活完整颗粒抗原的给药液(表1)。
本实施例中使用的灭活完整颗粒抗原的制备如下所述。接种于12日龄的发育鸡蛋的绒毛尿囊膜腔内,培养2天后采取绒毛膜尿囊液。用过滤器将采取的绒毛膜尿囊液过滤并澄清化后,使其吸附于硫酸钡盐,用12%柠檬酸钠溶液洗脱并回收流感病毒。将回收的病毒进一步用超滤置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2),缓冲液置换后,通过用蔗糖密度梯度离心回收含有流感病毒的馏分来精制。在该精制流感病毒中以最终浓度成为0.05%的方式添加作为灭活剂的β丙内酯,通过4℃、24小时的反应将流感病毒的感染性灭活。该灭活反应后用超滤(MWCO:100000)将缓冲液置换为含有1w/w%蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.2),将其制成灭活完整颗粒疫苗。
(2)将如上所述制备的给药液(表1)间隔3周2次给予BALB/c小鼠(雌,5周龄)的单鼻5μL(合计10μL)(每组8只),从第二次给药起2周后采集全血。通过离心分离来制备血清,测定血清的与A/California/07/2009株和B/Texas/2/2013株特异性结合的IgG(TotalIgG)效价。另外,作为IgG亚类的IgG1和IgG2a的各效价是对于分裂抗原和灭活完整颗粒抗原的不添加佐剂的组和添加TGDK0.3μg的组的血清测定B/Texas/2/2013株特异的抗体效价。
(3)分裂抗原给予组(A~F)和不添加佐剂的灭活完整颗粒抗原给予组(G)的IgG效价如图1和2所示。通过每次给药在分裂抗原中添加0.03~30μg的TGDK,从而血中的抗原特异性IgG效价在所有菌株中均高于不添加佐剂的情况,与灭活完整颗粒抗原为同等程度。特别是对于A/California/07/2009株的IgG效价,添加有0.03~0.3μg的TGDK的组,对于B/Texas/2/2013株的IgG效价,添加有0.03~3μg的TGDK的组,均相对于不添加佐剂示出显著高的IgG效价(曼·惠特尼的U检验,p<0.05)。另外,将没食子酸添加于分裂抗原时,对于A/California/07/2009株的IgG效价与不添加佐剂为同等程度,对于B/Texas/2/2013株的IgG效价相对于不添加佐剂显著降低。虽说多酚具有抗氧化作用、激活免疫的效果,但是在本实施例中认为单分子的没食子酸没有提高抗体诱导的佐剂活性,将4分子的没食子酸结合于由3分子的赖氨酸形成的骨架的伯胺而得的TGDK的结构对发挥佐剂活性很重要。
接着,将灭活完整颗粒抗原给予组(H~J)的结果示于图3和4,可知与分裂抗原相同地,通过向灭活完整颗粒抗原给予0.03或0.3μg的TGDK,从而对于各株的IgG效价均提高,通过添加没食子酸,对于A/California/07/2009株的IgG效价与不添加佐剂的组为同等程度,对于B/Texas/2/2013株的IgG效价降低。因此,即使在灭活完整颗粒抗原中也能得到与分裂抗原同样的结果,但与分裂抗原相比,在灭活完整颗粒抗原中由TGDK的添加引起的IgG效价提高的效果较小。这是因为灭活完整颗粒抗原本身的免疫原性高,但是可以确认在免疫原性不同的两种抗原(分裂抗原和灭活完整颗粒抗原)中TGDK均发挥经鼻给药的佐剂活性。
另外,图5示出各组的IgG1和IgG2a的几何平均抗体效价(GMT),可知在分裂抗原和灭活完整颗粒抗原中由于TGDK的添加而IgG2a均显著上升。与由Th2型的响应而诱导的IgG1相比,由Th1型的响应而诱导的IgG2a对于流感病毒的感染防御能力优异,因此期待通过TGDK的添加而有效性进一步提高。
参考例1
(1)使用与实施例1同样的抗原,评价在表2的试验组中皮下给药的TGDK的佐剂活性。在本评价中,作为皮下给药的佐剂,加入有实际成果的Alm(Thermo Fisher Scientific公司制,Imject Alum)作为对照。
(2)将对于A/California/07/2009株的IgG效价示于图6,将对于B/Texas/2/2013株的IgG效价示于图7,对于各株,添加有TGDK的组与单独给予分裂抗原均为同等程度的IgG效价,未确认到佐剂活性。另一方面,在Alm和灭活完整颗粒给予组(WV)中,示出比单独给予分裂抗原高的IgG效价。应予说明,在皮下给药中,没食子酸的添加组在各株中均为与单独给予分裂抗原的组同等程度的IgG效价,没食子酸衍生物的TGDK和没食子酸在皮下给药中均不具有佐剂活性。
Claims (10)
1.一种粘膜佐剂,由四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK构成。
2.一种粘膜佐剂组合物,含有四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK和药学上允许的载体。
3.一种粘膜疫苗组合物,含有权利要求1所述的粘膜佐剂和免疫原。
4.根据权利要求3所述的粘膜疫苗组合物,其中,免疫原为流感病毒的完整颗粒或分裂抗原。
5.一种权利要求3或4所述的粘膜疫苗组合物的制备方法,其特征在于,混合四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK和免疫原。
6.一种四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK,用于作为粘膜佐剂使用。
7.一种含有四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK和免疫原的组合物,用于在粘膜疫苗疗法中使用。
8.一种四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK的用途,用于制造粘膜佐剂。
9.一种含有四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK和免疫原的组合物的用途,用于制造粘膜疫苗。
10.一种粘膜疫苗疗法,将含有四没食子酰基-D-赖氨酸树枝状大分子即TGDK和免疫原的组合物给予需要该组合物的对象。
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