CN103889449A - 分子模拟粘膜艾滋病疫苗 - Google Patents

分子模拟粘膜艾滋病疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN103889449A
CN103889449A CN201280039764.0A CN201280039764A CN103889449A CN 103889449 A CN103889449 A CN 103889449A CN 201280039764 A CN201280039764 A CN 201280039764A CN 103889449 A CN103889449 A CN 103889449A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hiv
tgdk
vaccine
antigen
fetuin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280039764.0A
Other languages
English (en)
Inventor
三隅将吾
庄司省三
高宗畅晓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kumamoto University NUC
LSIP LLC
Original Assignee
Kumamoto University NUC
LSIP LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kumamoto University NUC, LSIP LLC filed Critical Kumamoto University NUC
Publication of CN103889449A publication Critical patent/CN103889449A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A61K31/166—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide having the carbon of a carboxamide group directly attached to the aromatic ring, e.g. procainamide, procarbazine, metoclopramide, labetalol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6025—Nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明的课题在于提供一种艾滋病疫苗，其能够诱导粘膜免疫，能够防御因HIV感染造成的免疫系统缺陷，能够防止HIV因易突变性而导致的免疫逃逸，能够防止HIV的迅速感染。根据本发明，能够提供一种包含Hub抗原、N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺（TGDK）与胎球蛋白的复合体的艾滋病疫苗。

Description

分子模拟粘膜艾滋病疫苗
技术领域
本发明涉及用于粘膜免疫的分子模拟粘膜艾滋病疫苗。
背景技术
疫苗始于1796年詹纳的种痘，由巴斯德给出疫苗的概念，疫苗成为对于机体防御而言的必需品。虽然通过疫苗进行机体防御的一部分分子机理已经解明，但是不明之处仍旧很多。对于疫苗的副反应仍存在误解的方面，过去由于不适当的给药方法（例如，注射针的回收利用等），也存在新的感染症（例如C型肝炎等）增多的问题。另外，以美国为主导进行了HIV/AIDS疫苗的开发，但尚未实现成功开发。
另一方面，专利文献1记载了包含式1：TGDK-CH2-CH2-NH-R（式中，TGDK-CH2-CH2-NH表示2-[N-α,N-ε-双(N-α,N-ε-二没食子酰基赖氨酰基)赖氨酰基]氨基乙基氨基（2-[N-α,N-ε-bis(N-α,N-ε-digalloyllysinyl)lysinyl]aminoethylamino），R表示氢原子；经由肽键具有活性酯基的基团；经由肽键与SH基结合的基团；经由肽键结合的肽、蛋白质、脂质或糖；或者经由席夫碱结合的肽、蛋白质、脂质或糖。）所示的化合物的肠道免疫赋活剂。专利文献1记载了上述TGDK识别M细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2007/052641号公报（国际申请号PCT/JP2006/321720）
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题在于提供一种艾滋病疫苗，其能够诱导粘膜免疫，能够防御因HIV感染造成的免疫系统缺陷，能够防止HIV因易突变性而导致的免疫逃逸，能够防止HIV的迅速感染。
用于解决课题的方法
本发明的发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果，首先发现了与HIV Env gp120外膜糖蛋白在结构分子生物学上同源的人蛋白质（胎球蛋白；Fetuin（Sigma公司制）。这被认为是在HIV侵入人体时，用于逃过人体的免疫系统网络的对人的分子模拟蛋白质（Molecular Mimicry Protein）。本发明的发明人等利用该蛋白质，合成Hub抗原、N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺（TGDK）与胎球蛋白（Fetuin）的共价结合体，由此成功开发出了HIV/AIDS的分子模拟粘膜疫苗。
即，根据本发明，提供一种包含Hub抗原、N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺（TGDK）与胎球蛋白（Fetuin）的共价结合体的艾滋病疫苗。
优选本发明的艾滋病疫苗为皮下给药和／或口服、以及经鼻给药。发明的效果
本发明的艾滋病疫苗具有如下技术效果：能够诱导粘膜免疫，能够防御因HIV感染造成的免疫系统缺陷，能够防止HIV因易突变性而导致的免疫逃逸，能够防止HIV的迅速感染。
附图说明
图1（图1A和图1B）表示X-Protein（胎球蛋白：Fetuin）的鉴定。
图2表示X-protein（胎球蛋白：Fetuin）的序列。
图3表示SIVgp120与X-protein（胎球蛋白：Fetuin）的氨基酸序列的比对。
图4表示X-protein（胎球蛋白：Fetuin）与HIV Env三聚体结构的比较，gp120的立体结构上与X-protein（胎球蛋白：Fetuin）相同的部分（moiety）用黄色表示。
图5表示X-protein（胎球蛋白：Fetuin）序列的UPA类似结构。
图6表示抗gp140抗体效价的测定结果。
具体实施方式
下面，进一步详细地说明本发明。
本发明涉及包含Hub抗原、N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺（TGDK）与胎球蛋白（Fetuin）的共价结合体的艾滋病疫苗。
本发明中使用的Hub抗原是指，以HGEO-200NP（油化产业株式会社制）的活性酯骨架为核，使HGEO-200PA（油化产业株式会社制）少量过剩地反应，HGEO-200PA分子形成Hub（放射状，车轮），在分子的表面具有大量伯胺的甘油聚乙二醇聚合物。
N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺（TGDK）为公知化合物，其合成方法记载于例如上述专利文献1（国际公开WO2007/052641号公报）等中。
胎球蛋白（Fetuin）是在肝脏合成并被分泌到血液中的蛋白质。胎球蛋白（Fetuin）是血流中广范围的输送蛋白的输送与利用所中介的一种结合蛋白。人胎球蛋白（Fetuin）与α2-HS-糖蛋白（AHSG）、α2-HS、A2HS、AHS、HSGA和胎球蛋白（Fetuin）-A的意思相同。
Hub抗原、N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺（TGDK）与胎球蛋白（Fetuin）的共价结合体的合成方法并没有特别不同的限定。作为一例，能够按照后述的实施例中记载的程序合成，但并不特别限定于该方法。根据后述的实施例的方法，首先，使TGDK与活化聚乙二醇（PNP4（10））反应，合成TGDK的活性酯（PNP-TGDK）。接着，使该PNP-TGDK与Hub-antigen反应，得到Hub-TGDK-PNP。最后，通过使Fetuin与该Hub-TGDK-PNP反应，能够合成Hub-TGDK-Fetuin的共价结合体。
在本发明的艾滋病疫苗中，既可以直接使用Hub-TGDK-Fetuin所示的复合体，或者也可以与药学上可接受的载体一起制成适当的制剂。作为载体，可以使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂等。制剂的形态没有特别限定，可以制成液剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂等任意的形态。
作为赋形剂，可以使用例如乳糖、蔗糖或葡萄糖等糖类；马铃薯淀粉或小麦淀粉等淀粉类；结晶纤维素等纤维素类；无水磷酸氢钙或碳酸钙等无机盐类等、聚乙二醇类等。作为结合剂，可以使用例如结晶纤维素、支链淀粉、阿拉伯胶、藻酸钠或聚乙烯吡咯烷酮等多功能性聚乙二醇类等。作为崩解剂，可以使用例如羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉或藻酸钠等聚乙二醇类等。作为润滑剂，可以使用例如硬脂酸镁、滑石粉、硬化油等。作为纳米颗粒化剂，可以使用胆固醇支链淀粉、多功能性聚乙二醇类等（日本油脂KK）。
本发明的艾滋病疫苗的给药途径没有特别限定，既可以为口服给药也可以为非口服给药（例如皮下给药、直肠给药、肌肉内给药、鼻腔给药和静脉内给药等），优选为皮下给药和／或口服以及经鼻给药。
本发明的艾滋病疫苗的制剂中所含的有效成分（Hub-TGDK-Fetuin所示的共价结合体）的量能够根据给药对象或患者的年龄、体重、症状等适当设定，可以设为例如1μg～1000mg／kg／次，优选设为10μg～100mg／kg／次。
本发明的艾滋病疫苗也可以与佐剂一起给药。作为佐剂，只要是通过在疫苗（抗原）给药之前预先给药而能够增强免疫应答的物质，则可以使用任意物质。在杀菌微生物这样的具有抗原性的物质以外，还可以是alum（氢氧化铝·钾等）或矿物油这样的非抗原性的物质。Freund在1947年发现将抗原水溶液与等量的油（矿物油85%，表面活性剂15%）混合，以乳剂的状态注射时，抗体的产生量增大。这被称为弗氏不完全佐剂incomplete Freund's adjuvant（IFA），在其中加入结核菌的菌体成分的为完全佐剂complete F's.a.（CFA）。此外，氢氧化铝、磷酸铝等无机酸盐显示佐剂效果。另外，细菌内毒素、特别是革兰氏阴性菌的脂多糖类能够显著促进抗体产生，有效成分为lipid A。本发明中能够使用上述物质作为佐剂。佐剂的给药途径没有特别限定，既可以为口服给药，也可以为非口服给药。
接着，说明本发明的艾滋病疫苗的特征。
（1）粘膜免疫的诱导
TGDK（四没食子酰基D-赖氨酸，Tetragalloyl D-Lysine）衍生物作为UAE-1（C型凝集素，C-type lectin）的竞争性抑制剂被发现，本发明的发明人等成功进行了TGDK的固相合成、液相合成，作为粘膜疫苗必需的M细胞靶向分子创制出了TGDK（Misumi et al.,J.Immunol.182,6061-6070（2009））。即，TGDK以M细胞为靶向，在粘膜固有层被胞吞转运，与表达CD161的NK细胞（自然杀伤细胞，natural killercell）以及介导固有免疫系统和适应性免疫系统的NKT（自然杀伤性T细胞，natural killer-T cell）结合，使免疫系统活化。另外，与TGDK共价结合的疫苗不论抗原的种类，以皮下注射也能够诱导全身免疫并且稍后能够诱导粘膜免疫。
（2）对于由HIV感染造成的免疫系统缺陷的防御
在HIV感染免疫中枢细胞时，利用免疫中枢细胞的受体（趋化因子受体）CCR5和CXCR4作为第二受体。本发明着眼于该第二受体的特异立体结构部位。通过形成第二受体的第二胞外环ECL-2与ECL-1的S-S键，由11个氨基酸残基构建的拱状结构显示特异的立体结构，被称为UPA结构。如果形成该UPA结构的S-S键发生还原、开裂，拱状结构崩解，则HIV就不再能够感染。HIV利用的第二受体的分子中，该UPA结构是最重要的部分（Moiety）。为了诱导针对UPA结构的特异性抗体，合成模拟UPA结构的环状肽，创制出环状抗原疫苗。由该疫苗免疫的猴子的粘膜免疫组织防止由SHIV感染所致的免疫组织破坏而造成的免疫系统缺陷，显著抑制了病毒的感染（Misumi et al.,J.Virol.75,11614-11620（2001）,J.Biol.Chem.278,32335-32343（2003））。在本发明中，通过诱导针对HIV的第二受体的特殊立体结构的特异性抗体，能够防御免疫系统缺陷。
（3）防止HIV因易突变性而导致的免疫逃逸
HIV形成自己的外膜糖蛋白（Spike蛋白质）的三聚体，吸附并侵入细胞。就HIV因易突变性而导致的免疫逃逸而言，据认为是病毒基因的1个碱基突变关系到1个氨基酸残基突变，基于氨基酸突变，反映到由于病毒外膜糖蛋白的氢键减少而造成的立体结构的“摇摆”，以特异性适应的方式在机体内进化诱导的高亲和性中和抗体变得无法识别该“摇摆”结构，因此，抗体不与突变抗原发生反应，而无法去除病毒。为了防止该病毒的免疫逃逸，以基因化学的方式想出了如下的使三聚体形成变得容易的方法。在HIV Env蛋白质的Ecto-domain的基因中导入2个氨基酸残基突变（K514E、K524E），使其不受到酶的处理（processing），使三聚体形成变得容易。此外，经由镍插入天然（native）蛋白质能够结合的位点。此外，糖链修饰位点保持原状。反映因病毒的突变造成的结构分子的“摇摆”的结构分子的构建如下进行。将由病毒的突变造成的结构分子的“摇摆”作为因极性溶剂二甲基甲酰胺水溶液中的氢键减少造成的分子结构的“摇摆”而掌握，将病毒的外膜糖蛋白在极性溶剂二甲基甲酰胺水溶液中以浓度（水浓度0%～50%）依赖性的方式进行处理的同时产生的“摇摆”结构，与活化Hub（放射状甘油-聚乙二醇（glycerol-polyethylene glycol））-TGDK抗原共价结合而制备。由该抗原诱导的抗体与病毒的株没有关系，中和了各种各样的病毒。
（4）防止HIV的迅速感染
一般而言，如果用疫苗（伪病原性抗原）对人进行免疫，则人在2～3周内获得免疫（1次免疫反应）。免疫反应静止，形成记忆免疫，当真正的病原性抗原侵入时，立即发生反应，免疫以12～24小时的极快速度再度活化（2次免疫反应），免疫系统与病原性抗原作斗争并将其排除，而恢复健康。但是，在HIV的情况下，在该2次免疫反应的时间即12～24小时期间，HIV潜入免疫中枢细胞的基因中，并整合在基因中，完成感染。整合在基因中的HIV的基因无法取出并排除。由于HIV感染了免疫中枢细胞，所以HIV一面破坏免疫中枢细胞一面不断增殖，最终打败免疫系统，人就会艾滋病发病。因此，绝对不能允许HIV的侵入。为了防止该HIV的迅速感染，如果在初次感染的部位即粘膜中引起交叉免疫诱导现象，随时准备着中和活性抗体或者与抗原结合的抗体，并借助于固有免疫系统、补体系统，就能够将其排除，此外还需要想办法维持杀伤性T细胞。为了实现上述目的，需要引起交叉免疫现象的方法。在本发明中，使本来的HIV Env糖蛋白抗原与Hub-TGDK抗原结合，进而，使其与引起交叉免疫诱导的伴随（escort）抗原共价结合，制备了多价共价结合抗原。以该多价共价结合抗原进行基础免疫，然后，在记忆免疫下，以与疫苗的本来的HIV Env糖蛋白抗原以外的多价抗原具有在结构生物学上相同的部分（Moiety）的抗原，在粘膜构建了能够诱导与HIV Env糖蛋白反应的抗体的交叉免疫体制。本发明中，能够在猴子中构建引起交叉免疫诱导现象的免疫体制，作为交叉免疫诱导抗原，发现了机体成分胎球蛋白（Fetuin）。成功开发出了以病毒蛋白质抗原进行基础免疫，代替病毒糖蛋白抗原而能够以胎球蛋白（Fetuin）使抗HIV Env抗体产生的交叉免疫诱导疫苗。确立了完全击退HIV在粘膜局部的侵入的突破性的疫苗方法。
通过以下的实施例更具体地说明本发明，但本发明不受实施例限定。
实施例
实施例1：对于用于机体防御的分子模拟粘膜疫苗-HIV的外膜糖蛋白（HIV Envgp120）的结构生物学的分子模拟机体成分（MolecularMimicry Moiety）的鉴定
实施例1-1：分子模拟机体成分（Molecular Mimicry Moiety）的鉴定
本发明的发明人以前制作出了以粘膜M细胞为靶向的TGDK（Misumi et al.,J.Immunol.182,6061-6070（2009）），而且创制出了诱导针对HIV co-receptor、CCR5和CXCR4的特殊立体结构（UPA）的抗体的环状肽抗原（Misumi et al.,J.Virol.75,11614-11620（2001）,J.Biol.Chem.278,32335-32343（2003））。通过该诱导出的抗体，能够防止HIV对免疫系统造成的缺陷。此外，本发明的发明人为了应对HIV的易变性，为了得到即使HIV发生突变，即，即使抗原略微变化，反应结合特异性也很宽的抗体，制作出使用的抗原的单体和三聚体，通过氢键减少预测由HIV突变造成的结构的“摇摆”，对应由HIV突变造成的免疫逃逸。作为用于容易形成SIVmac239Env蛋白质的三聚体的方案，改变gp130蛋白质的C末端侧的Ecto-domain的2个氨基酸残基，使之不易受到机体的蛋白质分解酶的作用。另外，在C末端插入产生Ni结合肽的基因，其他部分维持与天然（native）的Env蛋白质同样的受到糖链修饰的结构。
将该SIVmac239的Env改变基因导入猴子Vero细胞，构建了生成SIVmac239Env gp140的单体-三聚体的体系。在HIV/AIDS的粘膜免疫疫苗创制的研究（Misumi et al.,J.Immunol.182,6061-6070（2009））时，在使用猴子的免疫实验中发现了如下交叉免疫诱导现象。对猴子制作出与Hub抗原（甘油-聚乙二醇，glycerol-polyethylene glycol）共价结合了TGDK（粘膜M细胞靶向剂）、UPA（Undecapeptidyl arch ofCCR5，免疫破坏防止抗体诱导抗原）、CpGODN（B细胞活化剂）以及SIVmac239Env（gp140蛋白质）抗原以及X-Protein（胎球蛋白：Fetuin）而得到的疫苗并使用，发生基础免疫后的免疫应答，之后免疫应答静止，在抗gp140抗体效价降低的时候（约1.5年后），用没有gp140抗原的疫苗进行免疫，则尽管没有gp140抗原，抗gp140抗体仍旧被诱导，该抗血清中和了SIV-HIV以及其亚种群。发现了引起该交叉免疫诱导现象的抗原分子，对该抗原进行电泳分析和MALDI-TOF/MS/MS分析，结果鉴定其为Fetuin（图1A和图1B）。
另外，将Fetuin单独进行皮下注射，在同一猴子中确认了抗gp140抗体的产生。该蛋白质为遍在蛋白质（ubiquitous protein），具有与SIVmac239Env gp140的单体-三聚体在结构生物学上相同的部分（identical part）、同源的部分（homologous part）、相同的部分（moiety），是极为独特的糖蛋白分子，是不仅限于与SIVEnv，而且与HIV Env也具有同样特征的抗原。将该分子命名为HIV分子模拟蛋白质（HIVMolecular Mimicry Protein）。
实施例1-2：HIV分子模拟蛋白质（HIV Molecular Mimicry Protein）的特征
（1）氨基酸的序列和化学修饰部位
HIV分子模拟蛋白质的氨基酸序列如图2所示。HIV分子模拟蛋白质是存在N-,O-糖基化位点（N-,O-glycosylation site）、磷酸化位点（phosphorylation site）并具有6个S-S桥、2个自由（free）的SH基的蛋白质。
（2）HIV分子模拟蛋白质和HIV Env的氨基酸序列的比较
HIV分子模拟蛋白质和HIV Env的氨基酸序列如图3所示。存在受到糖链加成可能性的部分（moiety）用方框表示。
（3）HIV分子模拟蛋白质的立体结构与HIV Env三聚体结构的比较
HIV分子模拟蛋白质的立体结构与HIV Env三聚体结构的比较结果如图4所示。立体结构上相同的部分（moiety）用黄色表示。如图4所示，判断出HIV分子模拟蛋白质的立体结构与HIV Env三聚体结构之间存在相同的部分（moiety）。
（4）HIV分子模拟蛋白质由S-S桥形成的立体结构的特征
HIV分子模拟蛋白质的S-S桥的部位如图5所示。6处S-S桥中，2处形成了夹着10～11个氨基酸残基的拱形（arch），可知这2处拱形（arch）结构与HIV-1的第二受体（co-receptor）CCR5和CXCR4的第二胞外环（ECL-2）的Undecapeptidyl arch（UPA结构，Misumi et al.,J.Virol.75,11614-11620（2001）,J.Biol.Chem.278,32335-32343（2003））相同。
（5）HIV分子模拟蛋白质的特征总结
HIV分子模拟蛋白质的立体结构是与HIV Env三聚体结构极为相同的结构，且兼具有HIV-1的co-receptor CCR5和CXCR4的UPA结构，可知是具有极为独特的结构的机体成分。
实施例2：HIV/AIDS的分子模拟粘膜疫苗（Molecular Mimicry MucosalVaccine,MMMV）的制备法
实施例2-1：TGDK的化学结构式
TGDK的化学名：N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺
（N2,N6-bis[N2,N6-bis（3,4,5-trihydroxybenzoyl）-L-lysyl]-N-(2-aminoethyl)-L-lysine amide，TGDK）
Gal：没食子酰基（Galloyl group）（三羟基苯甲酰基，Trihydroxybenzoylgroup）
Figure BDA0000466010500000091
实施例2－2：TGDK的精制（MS谱图上为均质，用该操作除去盐。）
取12μmole的TGDK，在其中添加DMF（脱水）（500μl），添加醚（脱水）（1500μl），以15000rpm离心1分钟。沉淀中添加100%NMM（脱水）（600μl），超声波处理1－2秒，以15000rpm离心1分钟。在沉淀中添加100%TFA（100μl），在其上清中添加醚（脱水）（900μl），以15000rpm离心1分钟。在沉淀中添加DMF（脱水）（600μl），加入100%NMM（脱水）（100～300μl）。如下确认该溶液的pH。取1μl该溶液，在其中加入水4μl，测定pH（pH8～9）。由此，得到精制TGDKDMF溶液（TGDK12微摩尔，弱碱）。
实施例2-3：Hub-TGDK-Fetuin的合成概要
将活化聚乙二醇（polyethylene glycol）（活化PEG，PTE-100NP，油化产业株式会社制）简称为PNP4（10），PNP表示活性酯。
（1）PNP-TGDK的合成
在PNP4（10）（PTE-100NP，18μmole，180mg（总PNP18×4×0.9＝64.8μmole）（180mg）中添加DMF（脱水）（900μl），添加精制TGDK（12μmole）（300～600μl），在室温反应3小时，如上所述测定反应液中的pH。即，取反应液1μl，在其中加入水4μl，确认pH（pH8～9）。由此，得到PNP-TGDK溶液（1.5ml，残存PNP:18×3.6＝64.8－12＝52.8μmole）（193mg）。
（2）Hub-TGDK-Fetuin的合成
在Hub-antigen（A8-49，1μmole168mg，NH249μmole）中添加DMF（脱水）（22ml），添加PNP-TGDK（12μmole）（1.5ml）（残存PNP52.8－49＝3.8μmole）。通过取1μl反应液，加入水4μl，如上所述确认pH（pH7.6～8.4）（193mg）。将其在室温放置12小时使其反应，反应结束后的pH如上述记载测定并确认（pH7.3～8）。由此得到Hub-TGDK-PNP（残存量3.8μmole）（23ml）。
在其中，快速滴加Fetuin50mg（0.9μmole）/23mlPBS（－），pH7.4～7.8（数分）。在室温搅拌1夜，如下进行透析（Mw cut3500）。
1：对于PBS（－），2升×3次、24小时
2：对于精制水，2升×3次、24小时
3：对于2次水，2升×1次、12小时
将其冻结干燥，得到冻结干燥粉末（约130mg，Hub-TGDK-Fetuin粉末）。
实施例2-4：灭菌的方法
由于确认了70%EtOH灭菌、凝胶化，所以按照常规方法，将凝胶用搅拌器边搅拌边在灭菌下匀浆。
实施例3：将HIV/AIDS分子模拟粘膜疫苗对猴子给药
（1）实验材料和方法：
食蟹猴6只（对照3只，免疫组3只），使用♀、体重：约3.5～4.5kg，将疫苗5mg（Hub-TGDK-Fetuin，实质Fetuin量约1mg）／猴子1只／1ml PBS（－）在两腹股沟部进行皮下注射，每2周制备血清。（2）抗体效价的测定
抗gp140抗体效价按照现有的方法，以ELISA法测定。
（3）结果和考察
抗体效价的测定的结果如图6所示。
在疫苗给药组3只中，皮下注射后，从2周后，确认到抗gp140抗体效价的上升，在4周达到最大，在8周降低至最大值的约40～50%，然后一直维持该抗体效价，8周时的抗血清防止了HIV-1和SIVmac239的感染。此外，猴子＃5中也确认到了抗UPA抗体活性。
（实施例的总结）
（1）通过Hub-TGDK-Fetuin疫苗的1次皮下注射免疫，能够诱导与HIV-1Env和SIVmac239Env蛋白质反应的抗体。
（2）在猴子#5的抗血清中，确认到与HIV-1的第二受体CCR5的特殊立体结构（UPA）反应的抗体的诱导，发现了Fetuin由S-S键所形成的部分（Moiety）与CCR5的UPA非常好地匹配，Fetuin能够诱导出针对CCR5的特殊立体结构的抗体这样突破性的结果。
（3）由此，通过在粘膜诱导出交叉免疫现象，能够防止HIV的粘膜的感染。
（4）用Hub-TGDK-UPA-CpGODN-gp140-Fetuin的疫苗进行免疫，抗gp140抗体从血中消失后，通过以没有gp140的Hub-TGDK-UPA-CpGODN-Fetuin进行的皮下注射加强，能够产生出抗gp140抗体。同样的结果通过Fetuin单独皮下注射加强能够得到确认。
（5）用Hub-TGDK-Fetuin疫苗对猴子进行免疫，确认了与gp140抗原反应的抗体、即抗gp140抗体的产生。
（6）通过具有与HIV Env外膜糖蛋白在结构分子生物学上分子模拟部分（Molecular Mimicry Moiety）的抗原，在初次感染的部位构建交叉免疫诱导现象，则能够事先完全防止感染。完成了超越詹纳的种痘的疫苗。

Claims (2)

1.一种艾滋病疫苗，其特征在于：
其包含Hub抗原、N2,N6-双[N2,N6-双(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-L-赖氨酰基]-N-(2-氨基乙基)-L-赖氨酰胺（TGDK）与胎球蛋白的共价结合体。
2.如权利要求1所述的艾滋病疫苗，其特征在于：
所述艾滋病疫苗是皮下给药和／或口服以及经鼻给药的疫苗。
CN201280039764.0A 2011-08-15 2012-08-15 分子模拟粘膜艾滋病疫苗 Pending CN103889449A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-177385 2011-08-15
JP2011177385 2011-08-15
PCT/JP2012/070724 WO2013024859A1 (ja) 2011-08-15 2012-08-15 分子擬態粘膜エイズワクチン

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103889449A true CN103889449A (zh) 2014-06-25

Family

ID=47715176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280039764.0A Pending CN103889449A (zh) 2011-08-15 2012-08-15 分子模拟粘膜艾滋病疫苗

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20150024001A1 (zh)
EP (1) EP2745844A4 (zh)
JP (1) JP6023928B2 (zh)
KR (1) KR20140076550A (zh)
CN (1) CN103889449A (zh)
CA (1) CA2845545A1 (zh)
WO (1) WO2013024859A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10334479B2 (en) 2015-05-11 2019-06-25 Industrial Technology Research Institute Traffic steering method and heterogeneous radio access network system applying the same
JP2020050605A (ja) 2018-09-26 2020-04-02 デンカ生研株式会社 粘膜アジュバント
AU2022250020A1 (en) 2021-03-30 2023-10-19 Denka Company Limited Influenza vaccine for intranasal administration

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001233773A (ja) * 2000-02-22 2001-08-28 Toko Yakuhin Kogyo Kk 抗ウイルス剤
WO2007052641A1 (ja) * 2005-11-01 2007-05-10 Kumamoto University 腸管免疫賦活剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060116325A1 (en) * 2001-02-15 2006-06-01 Oleg Chertov Methods and compositions for inhibiting hiv-coreceptor interactions
US20030044400A1 (en) * 2001-05-22 2003-03-06 Jenny Yu Composition and method for treating cells
JP5428017B2 (ja) * 2007-03-23 2014-02-26 国立大学法人 熊本大学 ワクチン剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001233773A (ja) * 2000-02-22 2001-08-28 Toko Yakuhin Kogyo Kk 抗ウイルス剤
WO2007052641A1 (ja) * 2005-11-01 2007-05-10 Kumamoto University 腸管免疫賦活剤

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MISUMI ET AL.: "Targeted Delivery of Immunogen to Primate M Cells with Tetragalloyl Lysine Dendrimer", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》, vol. 182, 31 December 2009 (2009-12-31) *
SEDDIKI ET AL.: "Effect of mannosylated derivatives on HTV-1 infection of macrophages and lymphocytes", 《GLYCOBTOLOGY》, vol. 7, no. 8, 31 December 1997 (1997-12-31), XP055143767 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2013024859A1 (ja) 2015-03-05
WO2013024859A1 (ja) 2013-02-21
US20150024001A1 (en) 2015-01-22
CA2845545A1 (en) 2013-02-21
KR20140076550A (ko) 2014-06-20
JP6023928B2 (ja) 2016-11-09
EP2745844A1 (en) 2014-06-25
EP2745844A4 (en) 2015-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI227242B (en) Peptide composition for prevention and treatment of HIV infection and immune disorders
CN103002909B (zh) 包含含有至少一个cxxc基序的多肽和异源抗原的药物组合物及其用途
JPH01502119A (ja) ヒト免疫不全レトロウイルス（ウイルスｈｉｖ）に対して誘導された抗体により認識できるペプチド、及び前記ウイルスの或る種に起因する感染の診断、場合によってはエイズに対するワクチン接種における該ペプチドの使用
JPH01500432A (ja) Ａｉｄｓおよびａｒｃのウィルス原因物質に対して免疫化するための組成物および方法
US8936789B2 (en) Immunoenhancer-linked oligomeric HIV envelope peptides
JP2001502658A (ja) 非樹状中心骨格ペプチド担体
SK12402001A3 (sk) Peptidy HIV, antigény, zloženie vakcín, súprava na imunologickú skúšku a spôsob detekcie protilátok vyvolaných HIV
NL8701950A (nl) Monoclonale antilichamen en peptiden, geschikt voor de behandeling en diagnose van hiv infecties.
CN103889449A (zh) 分子模拟粘膜艾滋病疫苗
US9775895B2 (en) HIV therapeutics and methods of making and using same
CA2716340A1 (en) Immunogenic influenza composition
JP2018531256A (ja) デングウイルスワクチンおよび診断のための方法および組成物
CN103189386B (zh) 重组人类免疫缺陷病毒（hiv）包膜抗原蛋白和含其的疫苗
CA2338983A1 (en) Prevention and treatment of viral disease
Lynch et al. Advances in HTLV-1 peptide vaccines and therapeutics
ES2307640T3 (es) Vacunad de adn codificantes de proteinas accesorias del vih.
ES2202321T3 (es) Peptidos para uso en la vacunacion de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la inmunodeficiencia humana.
Iglesias et al. Broader cross-reactivity after conjugation of V3 based multiple antigen peptides to HBsAg
Levy et al. Synthetic peptide-based vaccines and antiviral agents including HIV/AIDS as a model system
JPH06510025A (ja) Ｈｉｖ−１に対するｔ細胞活性化の誘導に用いられるペプチド
TW201412771A (zh) 分子擬態黏膜ａｉｄｓ疫苗
MXPA04007646A (es) Formulaciones inmunogenicas de epitodes peptidicos y procesos para la preparacion de las mismas.
CA2548483A1 (en) Induction of antiviral neutralizing antibodies in humans and animals
Mirsaliotis et al. Conformation-specific antibodies targeting the trimer-of-hairpins motif of the human T-cell leukemia virus type 1 transmembrane glycoprotein recognize the viral envelope but fail to neutralize viral entry
EP1442124B1 (fr) ANTIGENE POLYPEPTIDIQUE FORMANT UNE STRUCTURE MIMANT L'ETAT INTERMEDIAIRE DE gp41

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140625