WO2007049737A1 - エプスタイン-バールウイルス感染細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性t細胞エピトープペプチド及びその用途 - Google Patents

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WO2007049737A1
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barr virus
cell
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Kiyotaka Kuzushima
Yoshinori Ito
Ayako Okamura
Yoshiki Akatsuka
Yasuo Morishima
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Medical And Biological Laboratories Co., Ltd.
Aichi Prefecture
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a cytotoxic T cell epitope peptide specific to Epstein-Barr virus, a vaccine for treating or preventing Epstein-Barr virus infection and the virus-positive cancer using the peptide, Epstein-Barr It relates to a passive immunotherapeutic agent against viruses.
  • Epstein-Barr virus (herpes gamma virus, which is latent in memory B cells for a long time, sometimes referred to as EBV) is associated with many malignant tumors. Examples include Burkitt's lymphoma (BL), Hodgkin's disease (HD), nasopharyngeal carcinoma (NPC), or post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD) (Non-patent Document 1). In latent infection, the expression of virus-derived proteins is suppressed. All EBV-positive malignant cells display one of the following three potential types and are distinguished from each other by the pattern of expressed EBV antigen (Non-Patent Document 2).
  • BL Burkitt's lymphoma
  • HD Hodgkin's disease
  • NPC nasopharyngeal carcinoma
  • PTLD post-transplant lymphoproliferative disease
  • All EBV-positive malignant cells display one of the following three potential types and are distinguished from each other by the pattern of expressed EBV antigen
  • Latent infection mode 1 In Burkitt lymphoma, only EBV nuclear antigen ( ⁇ ) 1 is expressed.
  • Latent infection mode 2 In Hodgkin's disease and nasopharyngeal carcinoma, latent membrane protein 1 (hereinafter referred to as LMP1), LMP2, And EBNA1 is expressed.
  • Latent infection mode 3 In post-transplant lymphoproliferative disease, the latent protein of EBV, ie, EBNA1, 2, 3A, 3B, 3C, leader protein, LMP1 and LMP2 are all expressed.
  • EBV-specific cytotoxic T cells (hereinafter sometimes referred to as CTL) are used.
  • Immunotherapy has been proven to be effective in the prevention and treatment of EBV-related lymphoproliferative diseases after hematopoietic stem cell transplantation and organ transplantation (Non-Patent Documents 3 to 7).
  • Malignant tumors associated with EBV such as Hodgkin's disease (Non-patent document 8), nasopharyngeal cancer (Non-patent document 9), etc.
  • the application of a similar strategy to is reported to be effective in some patients.
  • the CTLs activated by the lymphoblast cell line (hereinafter referred to as LCL) used in these studies mainly target EBNA3A, EBNA3B and EBNA3C, and these antigens. Is expressed in malignant tumors such as Hodgkin's disease and nasopharyngeal cancer.
  • Some CTLs activated by LCL may recognize LMP2-derived peptides and contribute to the immunotherapy effect of patients (Non-patent Documents 8 and 9).
  • T cells targeting the LMP1 peptide are very rare, and reflect the low and frequency of LMP1 peptide-specific CTL precursor cells (Non-patent Document 10).
  • Non-Patent Document 11 To selectively activate T cells specific for subdominant EBV antigens, Lin et al. Immunize NPC patients with monocyte-derived rodent cells (DCs) pulsed with LMP2-derived peptides. (Non-Patent Document 11). In addition, several methods have been reported to activate LMP1-specific CTL. Khanna et al. First reported the induction of CTLs using HLA-A2-restricted LMP1 epitopes and antigen-presenting cells (APC) pulsed with the peptides (Non-patent Document 10).
  • Non-Patent Documents 12 and 13 Gottschalk et al. Reported induction of polyclonal LMP1-specific CTLs using DCs infected with recombinant adenovirus expressing non-toxic, truncated NMP mutated LMP1 (non- Patent Document 14).
  • Non-patent Document 1 One category of malignant tumors associated with EBV is EBV infection in NK / T cells.
  • Chronic active EBV infection (CAEBV) is a disease in which EBV mainly infects NK / T cells, causing life-threatening lymphocyte proliferation (Non-Patent Document 15).
  • EBV-positive NK / T cell malignancies express EBNA1 and LMP1 as potential CTL targets (Non-Patent Documents 15 to 17).
  • LMP1 is a transmembrane oncoprotein that promotes cell survival through up-regulation of anti-apoptotic genes (Non-patent Document 2).
  • LMP1 expression is essential for the growth of human B lymphocytes and is necessary for the growth of EBV-infected human mononuclear cells (Non-patent Document 2).
  • Carcinogenic in general cell lymphoma It is known to induce transformation.
  • the expression of LMP1 may be important for the proliferation ability of EBV-infected NK cells (Non-patent Document 18).
  • NK / T cells can process LM P1 to produce HLA-restricted epitopes.
  • Non-patent Document 19 EBNA1 is required for the maintenance and replication of viral plasmids in EBV-transformed cells.
  • EBNA1 is an attractive target for immunotherapy because it is expressed in all tumors where EBV is associated.
  • CD8 + CTL response is preferentially directed to the latent infectious antigens EBNA3A, 3B and 3C, and EBNA1 is not recognized by CTL and cannot be detected immunologically.
  • Non-Patent Documents 20 to 23 It has been found that the glycinealanine repeat sequence (GAr) in EBNA1 prevents antigen processing for CTL recognition (Non-patent Document 24).
  • GAr glycinealanine repeat sequence
  • Non-patent Document 27 The presence of GAr has been found to interfere with proteasome processing, which is the main catalytic mechanism for producing MHC class I epitopes. Furthermore, it has been clarified that translation of EBNA1 mRNA with exactly the same domain force is prevented (Non-patent Document 27).
  • antigen-presenting cells into which the Epstein-Barr virus antigen (Epitope) mRNA has been introduced are considered to be an appropriate method for inducing Epstein-Barr virus-specific CTLs.
  • identification of a CTL epitope peptide specific to Epstein-Barr virus has been required.
  • Non-patent literature l Babcock GJ., Et al., Immunity, 13,497-506 (2000)
  • Non-Patent Document 2 Rickinson AB., Et al., In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology (ed Fourth Edition), Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2575—2628 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Rooney , CM., Et al., Lancet, 345, 9-13 (1995)
  • Non-Patent Document 4 Heslop, HE., Et al., Nat Med., 2, 551-555 (1996)
  • Non-Patent Document 5 Rooney, CM., Et al., Blood, 92, 1549-1555 (1998)
  • Non-Patent Document 6 Khanna, R “et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 10391-10396 (1999)
  • Non-Patent Document 7 Comoli, P., et al "Blood, 99, 2592-2598 (2002)
  • Non-Patent Document 8 Bollard, CM., Et al "J Exp Med, 200, 1623-1633 (2004)
  • Non-Patent Document 9 Straathof, KC, et al., Blood 105, 1898-1904 (2005)
  • Non-Patent Document 10 Khanna, R., et al., Eur J Immunol, 28, 451-458 (1998)
  • Non-Patent Document ll Lin, CL "et al., Cancer Res., 62, 6952-6958 (2002)
  • Non-Patent Document 12 Duraiswamy, J., et al "Blood, 101, 3150-3156 (2003)
  • Non-patent document 13 Duraiswamy, J., et al., Cancer Res., 64, 1483-1489 (2004)
  • Non-patent document 14 Gottschalk, S "et al” Blood, 101, 1905-1912 (2003)
  • Non-Patent Document 15 Kimura, H., et al., Blood, 98, 280-286 (2001)
  • Non-Patent Document 16 Nagata, H., et al "Blood, 97, 708-713 (2001)
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  • Non-patent literature 18 Demachi, A., et al., Microbiol Immunol, 47, 543-52 (2003)
  • Non-patent literature 19 Kieff E., et al., In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology (ed Fourth Edition), Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2511-2574 (2001)
  • Non-Patent Document 20 Khanna R., et al., J Exp Med., 176, 169-176 (1992)
  • Non-Patent Document 21 Murray RJ., Et al "J Exp Med., 176, 157-168 (1992)
  • Non-Patent Document 22 Steven NM., Et al "J Exp Med., 184, 1801-1813 (1996)
  • Non-Patent Document 23 Callan MF., Et al "J Exp Med., 187, 1395-1402 (1998)
  • Non-Patent Document 24 Levitskaya J., et al., Nature, 375, 685-688 (1995)
  • Non-Patent Document 25 Blake N., et al., Immunity, 7, 791-802 (1997)
  • Non-Patent Document 26 Levitskaya J “et al” Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12616-12621 (1 997)
  • Non-Patent Document 27 Yin Y “et al” Science, 301, 1371-1374 (2003)
  • Non-Patent Document 28 Khanna R., et al., Virology, 214, 633-637 (1995)
  • Non-Patent Document 29 Leen A., et al "J Virol, 75, 8649-8659 (2001)
  • Non-Patent Document 30 Paludan C, et al "J Immunol, 169, 1593-1603 (2002)
  • Non-Patent Document 31 Voo KS., Et al., Cancer Res., 62, 7195-7199 (2002)
  • Non-Patent Document 32 Kruger S., et al., J Immunother, 26, 212-221 (2003)
  • Non-Patent Document 33 Lee SP "et al., J Exp Med., 199, 1409-1420 (2004)
  • Non-Patent Document 34 Tellam J “et al” J Exp Med., 199, 1421-1431 (2004)
  • Non-Patent Document 35 Voo KS., Et al., J Exp Med., 199, 459-470 (2004)
  • Non-Patent Document 36 Kuzushima, K., et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999)
  • Non-Patent Document 37 Kagami, Y., et al., Br J Haematol, 103, 669-677 (1998)
  • Non-patent document 38 Akatsuka, Y., et al., Tissue Antigens, 59, 502-511 (2002)
  • Non-patent document 39 Kondo, E “et al” J Immunol, 169, 2164-2171 (2002)
  • Non-Patent Document 40 Dauer, M., et al., J Immunol, 170, 4069-4076 (2003)
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to detect cytotoxic T cell epitope peptide specific for Ebstein-Barr virus, and Epstein-Barr virus infection using the peptide.
  • Vaccine to treat or prevent, Kopstein- It is an object of the present invention to provide a passive immunotherapeutic agent for barr virus and a method for quantifying cytotoxic ⁇ cells specific to Epstein-Barr virus.
  • the present inventors introduced mRNAs of LMP1 and EBNA1, which are Epstein-Barr virus-related proteins, into antigen-presenting cells, and the antigen-presenting cells are transformed into Ebstein-Barr virus.
  • mRNAs of LMP1 and EBNA1 which are Epstein-Barr virus-related proteins
  • EBNA1 Epstein-Barr virus-related proteins
  • the present inventors have succeeded in identifying a CTL epitope peptide specific for Epstein-Barr virus, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides the following (1) to (16).
  • the cytotoxic T cell epitope peptide specific to Epstein-Barr virus comprises at least one amino acid sequence selected from the group force consisting of SEQ ID NOs: 1 to 3 as described in (1) Peptides.
  • a peptide having an amino acid sequence ability in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted and Z or added in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, and Epstein-Barr virus The peptide according to (1), which has a function capable of inducing specific cytotoxic T cells.
  • HLA-A * 0206 molecule, HLA-Cw * 0303 molecule or HLA-Cw * 0304 molecule-restricted antigenic peptide HLA-A * 0206 molecule, HLA-Cw * 0303 molecule or HLA-Cw * 0304 It has a function capable of inducing cytotoxic T cells having a T cell receptor capable of specifically recognizing cells presenting a complex with a molecule on the cell surface.
  • (1) to (3 ) of! The peptide according to any one of the above.
  • a vaccine for treating or preventing Epstein-Barr virus infection comprising the peptide according to any one of (1) to (4) as an active ingredient.
  • a vaccine for treating or preventing Epstein-Barr virus infection comprising the nucleic acid according to (5) as an active ingredient.
  • a vaccine for treating or preventing Epstein-Barr virus infection comprising, as an active ingredient, an antigen-presenting cell in which the peptide according to any one of (1) to (4) is presented on HLA.
  • Epstein-Barr virus-specific cytotoxicity T obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes with an antigen-presenting cell obtained by presenting the peptide according to any one of (1) to (4) or the peptide on HLA A passive immunotherapeutic agent against Epstein-Barr virus containing cells as active ingredients.
  • a method for inducing cytotoxic T cells which comprises inducing cytotoxic T cells using the peptide according to any one of (1) to (4).
  • Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cells are stimulated by stimulating peripheral blood lymphocytes with the peptide according to any one of (1) to (4) or an antigen-presenting cell obtained by presenting the peptide on HLA.
  • Cytological force produced by cytotoxic T cells obtained by stimulating peripheral blood with the peptide according to any one of (1) to (4) to obtain cytotoxic T cells specific to the virus A method for quantifying cytotoxic T cells specific to Epstein-Barr virus, characterized by measuring in and Z or chemokine and Z or cell surface molecules.
  • a major histocompatibility complex-tetramer is prepared from the peptide according to any one of (1) to (4), and the major histocompatibility complex-tetramer is allowed to react with peripheral blood. And a method for quantifying cytotoxic T cells specific to Epstein-Barr virus in the peripheral blood.
  • FIG. 1 shows the introduction of ⁇ LMPlmRNA into rod cells or CD40-B cells, the expression of ⁇ LMP1, and the induction of CTL.
  • A A graph showing the results of praying for expression of A LMP1 by flow cytometry after introducing A LMP1-mRNA into rod cells (DC) and CD40-B cells (CD40-B). Dotted lines indicate cells that have been introduced with the gene and solid lines indicate cells into which A L MP1 has been introduced.
  • B Peripheral blood-derived CD8 + T cells were transduced with A LMPl-mRNA, stimulated three times with irradiated antigen-presenting cells, and ⁇ LMPl-mRNA was introduced.
  • FIG. 3 shows the results of stimulation of CTL clone H7 and measurement of IFN y production by the ELISPOT method. 1,000 H7 cells were added per well.
  • FIG. 2 shows LMP1 epitope peptide recognized by CTL clone H7.
  • A A series of A LMPl-mRNAs with the C-terminal trimmed were generated by in vitro transcription. Start of each mRNA As a codon, methionine at amino acid position 44 was used. CD40-B cells into which each AL MPl-mRNA with the C-terminal shaved was introduced were used as antigen-presenting cells in ELISPOT assembly. The mRNA fragment indicated by a white frame was recognized by H7 cells. The mRNA fragment indicated by a black frame was not recognized by H7 cells.
  • B A series of C-terminal and N-terminal fragments were amplified by PCR and introduced into the pcDNA3.1 (+) vector.
  • the amino acid sequence encoded by the introduced DNA is shown. Recognition of H7 cells to A0206-293T cells into which each plasmid was introduced was measured by ELISPOT method (1,000 H7 cells per well), and classified into the following two patterns according to the number of IFN y spots. (+) Number of IFN y spots 50 or more; (-) Number of IFN ⁇ spots less than 10.
  • C A graph showing the number of ⁇ -spots of ⁇ 7 cells stimulated by ⁇ 0206-293 ⁇ cells into which each gene has been introduced. Each bar represents the number of spots per 1,000 cells.
  • D ELISPOT measurement results using AO 206-293T cells pulsed with various concentrations of synthetic peptides. Data show the number of spots per 500 H7 cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of examining the importance of ip-LMP7 in LMP1 epitope processing.
  • A Control siRNA, ip-LMP2 siRNA or ip-LMP7 siRNA was introduced into autologous LCL cells using retrovirus. Cells were sorted with puromycin for 14 days and Western blot analysis was performed: ip-LMP2 (upper panel); ip-LMP7 (lower panel).
  • B It is a figure which shows the result of the ELISPOT measurement using the self LCL which suppressed the expression of ip-LMP2 or the ip-LMP7 gene. The production of IFN y spots on H7 was evaluated. Each bar represents the number of spots per 5,000 H7 cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the cytotoxic activity of LMP1-specific CTL clone H7.
  • A A graph showing the results of 16-hour CTL assay using cells that share their own A * 0206 as target cells and LCL cells that are completely mismatched with HLA.
  • B A shows the results of 4-hour CTL assay using LCL1 or LGFP-introduced LCL as target cells. Each bar represents the average of 3 well cytotoxic activity.
  • FIG. 5 CTL specifically lyses EBV-positive NK cell lines.
  • A It is a figure which shows the result of having measured the cytotoxic activity with respect to the EBV positive NK cell line of H7 CTL clone for 16 hours by CTL assay.
  • 2 HLA-A * 0206 positive NK cell lines (SNK-6 and SNK-10) and 1 HLA- Data for A * 0206 negative NK cell line (HANK-1) are indicated by ⁇ , ⁇ , and mouth, respectively.
  • Cytotoxic activity measured by CTL assembly for 4 hours using SNK-6 cells pulsed with 100 ⁇ M epitope peptide is shown by ⁇ .
  • B It is a figure which shows the result of 16-hour CTL assembly using HLA-A * 0206 (O) and A * 2402 (*) gene transfer H ANK-1 cell.
  • FIG. 6 shows EBNA1 expression in cells transformed with full-length EBNAl mRNA transcribed in vitro.
  • FIG. 7 is a view showing the presence of anti-EBNA1-T cells in a culture solution using rod cells into which EBNAl_mRNA has been introduced.
  • Healthy donor CD8 + T cells were stimulated with autologous rod cells transformed with EBNAl mRNA transcribed in vitro.
  • polyclonal CD8 + T cells were cloned from two positive media by limiting dilution.
  • ELISP OT assay examined whether established clones B5 and C6 were recognized by their own CD40-B cells transformed with EBNAl-mRNA and their own LCL. 5,000 CTLs were sown by each well. One representative data from two experiments is shown.
  • FIG. 8 shows the results of identification of HLA molecules presented in the EBNA1-specific CTL clone.
  • A Diagram showing that HLA-B * 3501 molecule functions as a constrained molecule for CTL clone C6.
  • B It is a figure which shows that HLA-Cw * 0303 and Cw * 0304 function as a restraint molecule
  • Autologous and allogeneic LCL were used as antigen-presenting cells for B5 or C6 clones to produce IFN ⁇ spots. Each LCL, were cultured for 20 h with CTL (5xl0 3). Each bar represents the average number of spots in two wells.
  • FIG. 9 shows the results of identification of overlapping peptides recognized by EBNA1-specific CTL clones.
  • FIG. 10A-B shows the results of identification of the optimal EBNA1 antigen peptide recognized by EBNA1-specific CTL clones.
  • A A diagram showing the amino acid sequences of overlapping peptides recognized by clone C6 restricted to HLA-B * 3501. The known epitope HPVGEADYFEY (SEQ ID NO: 28) is shown in bold and underlined. The number below the sequence indicates the amino acid number in the EBNA1 protein.
  • B Two consecutive and overlapping peptide amino acid sequences recognized by clone B5 and the optimal epitope sequence. Sequences that overlap between the # 38 and # 39 peptides are indicated by an underline. The arrows indicate the primary and auxiliary anchors for HLA-Cw * 0303 fixation as predicted by the program SYFPEITHI. The number below the sequence indicates the number of the amino acid position in the EBNA1 protein.
  • FIG. 10C shows the results of titer measurement of a synthetic peptide derived from EBNA1.
  • Autologous CD40-B cells were synthesized with synthetic peptides 507-526 (# 39 20 residues), 507-517 (11 residues), 50 8-517 (10 residues), and 509-517 (9 residues). Incubated for 1 hour with 10-fold serial dilutions. Subsequently, CTL clone B5 (200 cells / well) was added and cultured for 20 hours. Each symbol represents the average number of spots observed at 2 tools.
  • FIG. 11 shows specific binding of HLA-Cw * 0303 and Cw * 0304 tetramers to the B5 CTL clone.
  • HLA-Cw * 0303-restricted EBNA1-specific CTL clone B5 is PE labeled HLA-Cw * 0303-FVYGGSKTSL (SEQ ID NO: 3), HLA-Cw * 0303-VFVYGGSKTSL (SEQ ID NO: 2) or HLA- Cw * 0304—FVYGGSKTSL (SEQ ID NO: 3) stained with tetramer complex and FITC-labeled anti-CD8 antibody, and analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 12 shows in vitro growth inhibition of EBNA1-specific CTL clones to HCL-matched LCL.
  • Target LCL (2 X 10 4 ) is cultured with EBNA1-specific CTL clone (1 X 10 4 ) or medium only (negative control) in 3 wells of a round-bottom 96-well plate for 4 weeks Later, cell growth was assessed. It was confirmed by the expression of CD19 that the proliferated cells were LCL.
  • One representative data from two experiments is shown.
  • the present invention relates to a T cell epitope peptide having a function capable of specifically inducing cytotoxic T cells to Epstein-Barr virus. Accordingly, the present invention provides cytotoxic T cell epitope peptides specific for Epstein-Barr virus.
  • the epitope peptide may be referred to herein as “epitope peptide” or simply “peptide of the present invention”.
  • peptide refers to a molecular chain of linear amino acids having physiological activity and bound to each other by peptide bonds between oc-terminated amino groups and carboxyl groups of adjacent amino acid residues. means. Peptides can be of various lengths, not just those of a specific length. Therefore, the peptides of the present invention include so-called “oligopeptides” and “polypeptides”. In some cases, it may be in an uncharged or salt form, and may be modified by glycosylation, amidation, phosphorylation, carboxylation, phosphorylation, or the like.
  • the CTL epitope peptide specific to the Epstein-Barr virus of the present invention comprises 8 to 11 amino acids having each binding motif of the target HLA molecule in the amino acid sequence of the Epstein-Barr virus-related protein.
  • CTL epitope against the software that can search for the epitope peptide Candidate peptides can be selected.
  • the Epstein-Barr virus-related protein can include EBNA1, 2, 3A, 3B, 3C, LMP1, LMP2, or leader protein, and more preferably EBNA1 or LMP1. I can do it.
  • the amino acid sequence and DNA sequence of EBNA1 are shown in SEQ ID NOs: 36 and 37, and the amino acid sequence and DNA sequence of LMP1 lacking the N-terminus are shown in SEQ ID NOs: 34 and 35.
  • HLA class I molecules mainly include HLA-A, HLA-B, and HLA-C, and the epitope peptide presented by binding to these consists of 8 to 11 amino acids.
  • the second, ninth or tenth amino acid from the N-terminal side of the epitope peptide is the most important amino acid for binding to the HLA molecule and is called the anchor motif. This anchor motif Different types of HLA molecules have been reported.
  • a peptide that binds to the HLA-A2 molecule is a peptide in which Leu is placed at the second position from the N-terminus, and Leu or Val is placed at the 9th or 10th position, and 9-10 Peptides consisting of amino acid residues are best known (Sudo T., et al., J. Immunol, 155, 4749-4756 (1995)).
  • a peptide that binds to HLA-A24 which is common in Asian races including Japanese, either Tyr, Phe, Met, or Trp is located at the second position from the N-terminus.
  • a peptide library consisting of about 20 amino acids covering the entire Epstein-Barr virus-related protein is synthesized.
  • a library is constructed so that about 10 (for example, 7,8,9,10,11,12,13) amino acids of about 20 amino acids overlap with the preceding and subsequent peptide sequences. As a result, the entire protein can be searched comprehensively.
  • the epotope candidate peptide selected by the above-mentioned method does not necessarily become a CTL epitope, but can only become an Epstein-Barr virus-specific CTL epitope after the following examination.
  • the following is a description of the method for determining an epitope peptide.
  • the present invention is not limited to these methods.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells isolated from people with a history of Epstein-Barr virus infection, or T cells isolated from PBMC in an appropriate medium, 0.1 to 2 X 10 6 / mL Float at concentration. Add 1 x 10 5 / mL of Epstein-Barr virus-infected cells, which have been isolated and cultured in advance, and incubate them at 37 ° C for 7 days in a 5% carbon dioxide (CO) constant temperature bath. Epstein-Barr virus after 7 days in culture
  • CO carbon dioxide
  • Infected cells and interleukin 2 are added, and then CTL is induced by repeated weekly stimulation with Epstein-Barr virus-infected cells and IL-2. Induction in this way Whether the CTL is specific for the epitope candidate peptide can be determined by the MHC—tetramer method, elicitor atsey, chromium release atsey, and intracellular site force-in staining method. Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M.
  • PBMCs isolated from a person with a history of Epstein-Barr virus infection are suspended in an appropriate medium at a cell concentration of 0.1 to 2 X 10 6 / mL, and 0.01 to 100 g of any one of the Epeptope candidate peptides is added to this. Bare at a concentration of / mL. Cultivate at 37 ° C in a 5% CO constant temperature bath.
  • CTL is induced by repeating stimulation with the peptide and IL-2 once a week or once every two weeks. Whether the CTL induced in this way are specific for the epitope candidate peptide can be examined by MHC-tetramer method, elicitor assay, chromium release assay, intracellular site force-in staining method, etc. judge.
  • PBMCs isolated from people with a history of Epstein-Barr virus infection are suspended in an appropriate medium at a cell concentration of 0.1 to 2 X 10 6 / mL, and an appropriate number of peptide libraries synthesized (for example, 10 types) are suspended. Get the pooled items. Incubate at 37 ° C in a 5% CO constant temperature bath
  • CTL is induced by repeating stimulation with the pool peptide and IL-2 once a week or once every two weeks. Whether the CTL induced in this way is specific for the epitope peptide is determined by Elispot Atsey, Crom Release Atsay, intracellular site force-in staining method, and the like. For pooled peptides that showed good results, it is possible to select peptides with CTL-inducing ability by repeating the above experiment with one peptide added at a time. The reacted peptide is shortened in order, and the basic peptide is obtained as the epitope peptide of the present invention. In general, epitopic peptides can ultimately be shortened to 8-11 amino acids.
  • peptide of the present invention include a peptide comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the peptide of the present invention may be a peptide containing the amino acid region described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3. That is, as a preferred embodiment of the peptide of the present invention, a cytotoxic T cell epitope peptide specific for Epstein-Barr virus has at least one amino acid sequence selected from the group force consisting of SEQ ID NOs: 1-3. It is a peptide containing.
  • the epitope peptide of the present invention may be a modified form of the above peptide as long as it does not substantially modify physiological activity and immune activity and has no harmful activity when administered. Good.
  • the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and Z or added.
  • a peptide having the same function as the peptide described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 before modification can be exemplified.
  • the "equivalent function” includes, for example, (1) a function capable of inducing a cytotoxic Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cell, (2) a major human histocompatibility antigen, etc., particularly HLA- A cytotoxic T cell with a T cell receptor that can specifically recognize cells presenting on the cell surface a complex with A * 02 06 molecule, or HLA-Cw * 0303 molecule or HLA-Cw * 0304 molecule Examples include a function capable of inducing (CTL).
  • CTL inducing
  • Whether or not a modified peptide has the above-described function can be evaluated by, for example, the method described in Examples below or a method obtained by appropriately modifying the method.
  • the peptides of the present invention include both those modified from the naturally occurring state !, and those that have been modified. Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, phosphatidylinositol covalent bond , Crosslinking, cyclization, disulfide bond formation, methylation, demethylation, covalent bridge formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, -carboxylation
  • the peptide of the present invention may have an additional amino acid sequence at the N-terminus or C-terminus.
  • the peptide of the present invention can be used in the form of a complex to which saccharides, polyethylene glycol, lipids and the like are added, a derivative with a radioisotope, or a polymer.
  • the amino acids in the present invention include so-called “amino acid analogs”. Examples of the amino acid analog include N-acylated products, 0-acylated products, esterified products, acid amidated products, and alkylated products of various amino acids.
  • the complex of the peptide of the present invention and the HLA molecule is recognized by a CTL having a TCR capable of specifically recognizing a cell presenting the complex on the cell surface
  • the N-terminus or free amino group of the peptide of the invention may be bound to the formyl group, acetyl group, t-butoxycarbonyl (t-Boc) group, etc.
  • a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, a benzyl group or the like may be bonded to the carboxyl group.
  • the peptide of the present invention may be subjected to various modifications that can facilitate introduction into a living body.
  • various modifications that can be easily introduced into the living body are PT (Protein Transduction), Inca, and ⁇ .
  • the PT domain of HIV is a peptide composed of the 49th to 57th amino acids of the Tat protein (Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg ArgZ SEQ ID NO: 38). It has been reported that it can be easily introduced into cells by adding it before or after the protein or peptide sequence (Ryu J., Mol Cells., 16, 385-391 (2003), Kim DT). ., J Immunol, 159: 1666-1668 (1997).
  • MHC class I molecules Most antigens presented via MHC class I molecules are degraded by cytoplasmic proteasomes, then transferred to TAP (transporter in antigen processing), and associate with TAP in the rough endoplasmic reticulum. It is bound to a complex of MHC class I molecules and / 3 2-microglobulin and transported to the cell surface via the Golgi apparatus by exocytosis. Effective antigen presentation can be achieved by fusing HSP (heart shock prtein) 70, HSP90, or gp96, which are chaperones acting in a series of these antigen presentation pathways, with the target peptide or protein.
  • HSP human shock prtein
  • the peptide of the present invention can be prepared by various conventional peptide synthesis methods.
  • organic chemical synthesis methods such as solid phase peptide synthesis methods, or nucleic acids encoding peptides can be prepared and prepared using recombinant DNA technology.
  • synthesis using a commercially available chemical synthesizer for example, a peptide synthesizer from Applied Systems is also possible.
  • the peptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method according to its amino acid sequence, and the method includes peptide synthesis methods by a normal liquid phase method and a solid phase method. Is done. More specifically, the peptide synthesis method is based on amino acid sequence information V, and each amino acid is synthesized sequentially one by one to extend the chain, followed by a stepwise gelation method and several amino acids. Including the fragment 'condensation method in which fragments are synthesized in advance and then each fragment is coupled, any method may be used to synthesize the peptides of the present invention.
  • the condensation method used in such a peptide synthesis method can also be performed according to various methods. Specific examples thereof include an azide method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, an oxidation-reduction method, a DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, and a Woodward method.
  • Solvents that can be used in these various methods can also be selected from commonly used solvents. Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), hexaphosphoroamide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • ethyl acetate and mixed solvents thereof.
  • amino acids that do not participate in the reaction and carboxyl groups in the peptide are generally esterified, for example, lower alkyl esters such as methyl esters, ethyl esters, and tertiary butyl esters, such as benzyl esters.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -methoxybenzyl ester it can be protected as ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -methoxybenzyl ester, trobenzyl ester aralkyl ester or the like.
  • an amino acid having a functional group in the side chain for example, a hydroxyl group of Tyr may be protected with a acetyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary butyl group, or the like. Even strong protection is not essential.
  • Arg's guazino group includes nitro group, tosyl group, 2-methoxybenzenesulfol group, methicylene-2-sulfol group, benzyloxycarbonyl group, isobornoxycarbonyl group, adamantyl group. It can also be protected with an appropriate protecting group such as an oxycarbonyl group.
  • the peptide of the present invention that can be obtained as described above can be obtained by a conventional method, for example, ion exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC). Purification can be appropriately performed according to a method widely used in the field of peptide chemistry such as countercurrent distribution.
  • the peptide of the present invention can also be obtained by a genetic engineering technique in which a DNA nucleic acid molecule encoding the peptide of the present invention is synthesized, introduced into an appropriate expression vector, and then expressed in a host cell.
  • a nucleic acid encoding the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 is synthesized.
  • the method includes chemical synthesis means such as phosphate triester method and phosphate amidite method [Letsinger, RL “et al., J. Am. Chem. Soc, 89, 4801 (1967); Letsing er, RL., et al., J. Am. Chem.
  • DNA synthesis can be performed by chemical synthesis using the phosphoramidite method or triester method, and can also be performed on a commercially available automated polynucleotide synthesizer. Chemical synthesis by either annealing the strands together under appropriate conditions, or adding a complementary strand using DNA polymerase with an appropriate primer sequence It can also be obtained from the single-stranded product.
  • the peptides of the present invention include peptides functionally equivalent to the epitopic peptide (SEQ ID NOs: 1 to 3) identified by the present inventors.
  • amino acid sequences are mutated in the amino acid sequence of the epitope peptide (SEQ ID NOs: 1 to 3) identified by the present inventors, whether artificially or naturally generated.
  • a peptide having the amino acid sequence and functionally equivalent to the peptide is included in the peptide of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated (substitution, insertion, deletion, etc.) in the above mutants is not limited as long as the function of the peptide of the present invention is maintained, but is usually within 5 amino acids and is preferable. It is preferably within 4 amino acids, more preferably within 3 amino acids, and even more preferably 1-2 amino acids.
  • the modification is, for example, addition of an amino acid residue to the end of the peptide described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3, the number of added amino acids is included in the peptide of the present invention.
  • the type of amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid before modification are preserved (amino acids similar to the amino acid before modification).
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A ⁇ V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T, ⁇ ), a sulfur atom-containing side Amino acids with chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with salt-containing side chains (R, K, ⁇ ), aromatic Examples include amino acids (H, F, Y, W) having a containing side chain (the parentheses indicate single letter amino acids).
  • a peptide having an amino acid sequence modified by deletion or addition of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence and substitution by Z or another amino acid can maintain its biological function (activity) (Mark, DF et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 5662-5666 (1984), Zoller, MJ & Smith, M. Nucleic Acids Research, 10, 6487 -6500 (1982), Wang, A. et al., Science, 224, 1431-1433 (1984), D albadie— McFarland, G. et al ”Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79, 6409— 6413 (1982)).
  • Peptides in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of the peptide of the present invention include fusion peptides containing these peptides.
  • the fusion peptide is a fusion of the peptide of the present invention and another peptide.
  • a polynucleotide encoding a peptide of the present invention for example, the peptides described in SEQ ID NOs: 1 to 3
  • a polynucleotide encoding another peptide are linked so that the frames match. Any method known to those skilled in the art can be used as long as it is introduced into an expression vector and expressed in a host.
  • peptides to be subjected to fusion with the peptide of the present invention are suitable for various purposes such as isolation and purification of the peptide or applied research in addition to the purpose of CTL induction. It can be selected as appropriate.
  • FLAG Hopp, TP et al., BioTechnology, 6, 1204- 1210 (1988)
  • 6 X His consisting of 6 His (histidine) residues, 10 X His, influenza agglutinin (HA), human c -myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, a-tubulin fragment, B-tag, Protein C fragment, etc.
  • a fusion peptide can be prepared by fusing a commercially available polynucleotide encoding these peptides or peptides with a polynucleotide encoding the peptide of the present invention and expressing the fusion polynucleotide thus prepared. it can.
  • a protease cleavage site peptide sequence such as FactorXa, enterokinase or thrombin can be inserted at the fusion site.
  • a protease cleavage site peptide sequence such as FactorXa, enterokinase or thrombin
  • the peptide of interest of the present invention is included in the peptide fusion as necessary.
  • Other regions can be cleaved and removed with corresponding proteases such as FactorXa, enterokinase or thrombin, and are useful.
  • the present invention includes a peptide encoded by a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide encoding the peptide described in SEQ ID NOs: 1 to 3 of the present invention, and described in SEQ ID NOs: 1-3. Peptides that are functionally equivalent to peptides are included.
  • hybridization conditions include low stringency conditions.
  • Low stringency conditions refer to washing after hybridization.
  • the conditions are 42 ° C, 0.1 X SSC and 0.1% SDS, and preferably the conditions are 50 ° C, 0.1 X SSC and 0.1% SDS.
  • More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions. Highly stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C, 5 X SSC and 0.1% SDS.
  • the peptide functionally equivalent to the peptide described in SEQ ID NOs: 1 to 3 encoded by the polynucleotide isolated by the above-described hybridization technique or gene amplification technique is usually an amino acid and the peptide. There is usually a high homology in the sequence.
  • the peptides of the present invention also include peptides that are functionally equivalent to the peptides set forth in SEQ ID NOs: 1-3 and have high homology with the amino acid sequences of the peptides. High homology usually means at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% (eg 96%) at the amino acid level. 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the algorithm described in the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 726-730 (198 3) may be used.
  • the peptide of the present invention can be prepared as a recombinant peptide or a natural peptide by methods known to those skilled in the art.
  • a recombinant peptide for example, a transformant obtained by incorporating a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into an appropriate expression vector and introducing it into an appropriate host cell is recovered and extracted. Then, the column is subjected to chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, etc., or affinity chromatography in which an antibody against the peptide of the present invention is immobilized on the column, or these columns are further treated. It is possible to purify and prepare by combining several.
  • Host cell as a recombinant peptide fused with a purification tag (eg, histidine tag)
  • a purification tag eg, histidine tag
  • the expressed fusion peptide is purified using a commercially available purification column corresponding to the fused tag (nickel column in the case of histidine tag). can do.
  • an antibody that binds to the peptide of the present invention is bound to a tissue or cell extract expressing a peptide of the present invention by a method well known to those skilled in the art. It can be isolated by purifying with a tea column.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • nucleic acid or vector encoding the peptide of the present invention is also included in the present invention.
  • the nucleic acid (polynucleotide) of the present invention may be in any form as long as it can encode the peptide of the present invention. That is, it does not matter whether it is a cDNA synthesized from mRNA, a force that is genomic DNA, or a chemically synthesized DNA. In addition, a polynucleotide having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode the peptide of the present invention.
  • the nucleic acid (polynucleotide) of the present invention can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be appropriately produced using a commercially available nucleic acid synthesizer. The base sequence of the prepared polynucleotide can be confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide termination method.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention is important for producing the peptide of the present invention in a host using, for example, a gene recombination technique.
  • the codon usage of the amino acid codon differs between hosts, so it is desirable to change the codon of the amino acid so that it matches the codon usage of the host to be produced.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention can be used as a vaccine and can be transported as a bare nucleic acid or by using an appropriate virus or bacterial vector (Berzofsky JA., Et al.
  • Suitable bacterial vectors include bacteria of the genus Salmonella.
  • suitable virus vectors include retrovirus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, lentivirus vectors, vaccinia vectors, etc.
  • suitable vaccinia vectors 1 An example is a modified vaccine-ankara vector.
  • a vector capable of expressing the peptide of the present invention can be exemplified.
  • the vector is usually a vector carrying a DNA construct having a structure in which the nucleic acid of the present invention is operably linked downstream of a promoter.
  • the vector is generally a plasmid or a viral vector.
  • a vector having a desired DNA can be appropriately produced by a general genetic engineering technique.
  • various commercially available expression vectors can be used.
  • the vector of the present invention is also useful for retaining the polynucleotide of the present invention or expressing the peptide of the present invention in a host cell.
  • Nucleic acid of the present invention polynucleotide
  • the vector is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA.
  • Escherichia coli is used as a host, a pBluescript vector ( Stratagene, etc.) is preferred, but various vectors that are available for sale can be used.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a peptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an organism.
  • pBEST vector manufactured by Promega
  • E. coli for in vitro expression.
  • PET vector manufactured by Invitrogen
  • pME18S-FL3 vector GeneBank Accession No. ABO 09864 for cultured cells
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988) for living organisms
  • the nucleic acid of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for peptide expression include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), insect cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells ( Examples: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • Vectors can be introduced into host cells by, for example, calcium phosphate precipitation, electric pulse perforation (Current protocol in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, bee tion 9.1-9.9), It can be carried out by a known method such as a lipofusion method (GIBCO-BRL) or a microinjection method.
  • GEBCO-BRL lipofusion method
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the peptide of interest. These signals may be endogenous to the peptide of interest or heterologous! /.
  • the medium is recovered in the above production method.
  • the peptide of the present invention is produced intracellularly, the cell is first lysed and then the peptide is recovered.
  • the nucleic acid of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, a retrovirus method, a ribosome method, a cationic ribosome method. And a method of introducing it into a living body by an adenovirus method or the like. Thereby, immunotherapy can be performed.
  • the vector used include, but are not limited to, a retroviral vector and the like.
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to conventional methods (Molecular Cloning, 5.61-5.63). In vivo administration can be ex vivo or in vivo.
  • the peptide of the present invention can be used as a peptide vaccine in active immunotherapy. That is, a vaccine comprising the CTL epitope peptide of the present invention is administered to a healthy person, and CTL specific for Ebstein-Barr virus is propagated in the body to prevent or treat the disease. Can be useful. Only one type of epitope peptide can be used, or two or more types of peptides can be combined and mixed according to the intended use of the vaccine.
  • the present invention provides a vaccine for treating or preventing Epstein-Barr virus infection and virus-positive cancer comprising the peptide of the present invention or the nucleic acid of the present invention as an active ingredient.
  • the “vaccine” of the present invention can also be expressed as “active immunotherapeutic agent”, “immunotherapeutic agent”, and “Ebstein-Barr virus related disease therapeutic agent”.
  • the “therapeutic agent” can also be expressed as “medicine”, “pharmaceutical composition”, “therapeutic drug”, and the like.
  • the antigen-presenting cell on which the CTL epitope peptide of the present invention is presented can be used as a vaccine in active immunotherapy.
  • Epitope peptide pulse antigen-presenting cells in which antigen-presenting cells and CTL epitope peptide are mixed for 30 minutes to 1 hour in an appropriate culture medium
  • Antigen-presenting cells include, for example, rod cells, B cells, macrophages, certain T cells, etc., and are cells expressing HLA to which the peptide can bind on their surfaces, L means having the ability to stimulate.
  • Artificial antigen-presenting cells that have an antigen-presenting ability are, for example, a lipid bilayer, a stick made of plastic or latex, a ternary complex of HLA, CTL epitope peptide, and 13 2-microglobulin.
  • Costimulatory molecules such as CD80, CD83, and CD86, or acts agonistically on CD28, a T cell ligand that binds to costimulatory molecules (Oelke M., et al., Nat Med., 9, 619-624 (2003), W alter S., et al "J Immunol, 171, 4974-4978 (2003), Oosten LE., Et al "Blood, 104, 224-226 (2004)) o
  • a preferred embodiment of the present invention provides a vaccine comprising an antigen-presenting cell obtained by presenting the peptide of the present invention on HLA as an active ingredient.
  • the nucleic acid of the present invention can be used for DNA vaccines, recombinant virus vector vaccines, and the like in active immunotherapy.
  • it is desirable to change the nucleic acid sequence of the CTL epitope peptide to codon usage suitable for the host producing the recombinant vaccine or the recombinant virus vaccine (Casimiro, DR, et al "J. Virol, 77 , 6305-6313 (2003), Berzofsky JA, et al "J Clin Invest., 114, 450-462 (2004)) 0
  • a vaccine comprising the peptide of the present invention or an antigen-presenting cell on which the peptide of the present invention is presented can be prepared using a method known in the art.
  • a viable vaccine there is a drug such as an injection or a solid containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the peptide of the present invention can be used for the preparation of a passive immunotherapeutic agent against Epstein-Barr virus.
  • CTL peculiar to Epstein-Barr virus obtained as described below can be suspended in human albumin-containing PBS or the like and used as a passive immunotherapy for Epstein-Barr virus.
  • Epstai in passive immunotherapy CTLs specific for HCV virus can be obtained by the following preparation method, and can be purified and used to increase the purity of CTLs.
  • PBMC is reacted with an appropriate concentration of Epstein-Barr virus specific epitope peptide tetramer reagent.
  • Epstein-Barr virus-specific CTL conjugated with an epitope peptide-tetramer reagent is stained with a labeled dye, so isolate only the stained CTL using a cell sorter or microscope.
  • CTL specific for Ebstein-Barr virus isolated in this way loses its proliferation ability when treated with T-cell stimulants such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, X irradiation or mitomycin.
  • T-cell stimulants such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, X irradiation or mitomycin.
  • the number of cells required for passive immunotherapy is ensured by stimulating proliferation with the antigen-presenting cells.
  • Epstein-Barr virus-specific epitope peptide monomer and Z or epitope peptide-tetramer reagent are immobilized on a sterile plate and PBMC is cultured on the immobilized plate.
  • PBMC is cultured on the immobilized plate.
  • Epeptope peptide monomer immobilized on the plate and Epstein-Barr virus specific CTL bound to Z or Epeptope peptide-tetramer After washing out the cells, only the antigen-specific CTL remaining on the plate is suspended in fresh medium.
  • Epstein-Barr virus-specific CTLs isolated in this way are antigen-provided antigens that have lost their proliferative potential by treatment with T-cell stimulants such as anti-CD3 antibodies, PHA, or IL-2, or treatment with X irradiation or mitomycin. Stimulate growth with the indicated cells to ensure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • T-cell stimulants such as anti-CD3 antibodies, PHA, or IL-2
  • X irradiation or mitomycin Stimulate growth with the indicated cells to ensure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • the antibody that works agonistically against CD28 is immobilized on a sterile plate, and PBMC is cultured on the immobilized plate. After 2 days, add IL-2 to the medium and incubate at 37 ° C for 7-10 days in a 5% CO thermostat. Cultured fine The cysts are collected and cultured on a new immobilized plate. By repeating this operation, CTLs with the number of cells necessary for passive immunotherapy are secured.
  • PBMC has the ability to directly stimulate T cells with the CTL epitope peptide of the present invention
  • CTL epitope peptide and IL-2
  • epitope peptide monomer and the epitope peptide-tetramer using the peptide of the present invention are known methods (US Patent Number 5,635,363, Inventors: JD Altman, MG Mc Heyzer- Williams, Mark M. Davis, Compositions and methods for the detection, quantation and purification of antigen-specific T cells, French Application Number FR 9911133, Inventor: M. Bonneville, et al., Means for detecting and for purifying CD8 + T-lymphocyte populations specific for peptides presented in the HLA context).
  • MHC monomer which is a complex of HLA class I molecule purified from a recombinant host for protein expression, j8 2 microglobulin, and CTL epitope peptide of the present invention, is formed in a buffer.
  • a piotin binding site is added to the C-terminus of the recombinant HLA class I molecule in advance, and piotin is added to this site after the formation of the epitope peptide-monomer.
  • Epitope peptide tetramer can be prepared by mixing commercially available dye-labeled streptavidin and piotin modified pitope peptide monomer at a molar ratio of 1: 4.
  • the Epstein-Barr virus-specific epitope peptide-tetramer reagent is reacted with CTL induced by the CTL preparation method to label the epitope peptide-tetramer.
  • the antibody against the labeled dye can be separated using a magnetically labeled secondary antibody.
  • magnetically labeled secondary antibodies and magnetic cell separators are available from, for example, Dynal and Miltenyi Biotec GmbH.
  • the Epstein-Barr virus-specific CTL isolated in this manner is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., to secure the number of cells necessary for passive immunotherapy.
  • Epstein-Barr virus-specific CTLs can be purified by utilizing the site-in force released by the Epstein-Barr virus-specific CTLs.
  • the site force-in released from the CTL is supplemented with a specific antibody on the cell surface, stained with a site-force-in-specific labeled antibody, and then magnetically labeled. After staining with the labeled substance-specific antibody, it can be purified using a magnetically labeled cell separator.
  • Epstein-Barr virus-specific CTL isolated in this way can be stimulated and proliferated with anti-CD3 antibodies, PHA, IL-2 and other T cell stimulating agents to ensure the number of cells required for passive immunotherapy. .
  • CTL Cell surface proteins (eg, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.) whose expression is enhanced by stimulation with specific peptides have been reported on the cell surface of specific CTLs (Betts MR., Et al, J Immunol Methods. , 281, 65—78 (2003), Trimble LA., Et al, J Virol, 7 4, 7320-7330 (2000)).
  • CTL can be purified using a magnetic separation apparatus or the like.
  • CTL can be purified in the same manner by magnetically labeling such an anti-IgG antibody against the specific antibody.
  • these antibodies can be coated on a culture plastic plate, and PBMCs that have been stimulated can be cultured using this plate, and the cell population that does not bind to the plate can be washed and washed to allow specific CT L Can also be purified.
  • the Epstein-Barr virus-specific CTL isolated in this way is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., to secure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • the present invention provides a passive immunotherapeutic agent (immunotherapeutic agent) against Epstein-Barr virus, which contains cytotoxic T cells (CTL) obtained and purified as described above as an active ingredient. provide.
  • cytotoxic T cells CTL
  • the “passive immunotherapeutic agent” of the present invention can also be expressed as “immunotherapeutic agent”, “Ebstein-Barr virus related disease therapeutic agent”, or “CTL inducer”.
  • Preferred embodiments of the passive immunotherapeutic agent of the present invention include Ebstein-Barr virus-specific cytotoxicity obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes with the peptide of the present invention or antigen-presenting cells presenting the peptide on HLA. It is a passive immunotherapeutic agent for Ebstein-Barr virus containing sex T cells as an active ingredient.
  • the major histocompatibility antigen complex and the Z or major histocompatibility antigen complex-tetramer prepared from the peptide of the present invention are reacted with peripheral blood lymphocytes to react with the major tissue.
  • a cytotoxic T cell obtained by forming a conjugate of a cytotoxic T cell bound to a compatible antigen complex and / or a major histocompatibility complex-tetramer and isolating it from the conjugate is an active ingredient. It is a passive immunotherapeutic agent for Epstein-Barr virus.
  • the drug of the present invention (such as the vaccine or passive immunotherapeutic agent of the present invention) is mixed with a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or the like, and orally or parenterally as a pharmaceutical composition.
  • a physiologically acceptable carrier such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions can be used.
  • parenterals dosage forms such as injections, infusions, external medicines, or suppositories can be selected. Examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections. Examples of the medicine for external use include nasal administration agents and ointments.
  • the preparation technique of the above-mentioned dosage form so as to include the drug of the present invention as the main component is known.
  • a tablet for oral administration can be produced by adding an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, and the like to the drug of the present invention, mixing, and compressing and shaping.
  • antigen-presenting cells on which the peptide of the present invention is presented are pharmaceutically acceptable excipients compatible with the peptide or the activity of the cells, such as water, saline, dextro It can be used as a mixture with ethanol, ethanol, glycerol, DMSO (dimethyl sulphoxide), other adjuvants, or combinations thereof.
  • auxiliary agents such as albumin, wetting agent and emulsifier may be added as necessary.
  • disintegrant charcoal Acid calcium, carboxymethyl cellulose calcium and the like are generally used.
  • binder gum arabic, carboxymethylcellulose, or polyvinylpyrrolidone is used.
  • talc magnesium stearate and the like are known.
  • the tablet containing the drug of the present invention can be subjected to a known coating for masking or enteric preparation.
  • a coating agent ethyl cellulose, polyoxyethylene glycol or the like can be used.
  • an injection can be obtained by dissolving the agent of the present invention as a main component together with an appropriate dispersant, or dissolving or dispersing in a dispersion medium.
  • aqueous solvent distilled water, physiological saline, Ringer's solution, or the like is used as a dispersion medium.
  • oil-based solvents various vegetable oils such as propylene glycol are used as dispersion media.
  • a preservative such as paraben can be added as necessary.
  • a known isotonic agent such as sodium chloride or glucose can be added.
  • a soothing agent such as salt benzalcoum can be added.
  • an external preparation can be obtained by making the agent of the present invention into a solid, liquid, or semi-solid composition.
  • a solid or liquid composition it can be set as an external preparation by setting it as the composition similar to what was described previously.
  • a semi-solid composition can be prepared by adding a thickener to an appropriate solvent as required.
  • the solvent water, ethyl alcohol, polyethylene glycol, or the like can be used.
  • the thickener bentonite, polybutyl alcohol, acrylic acid, methacrylic acid, polyvinylpyrrolidone, or the like is generally used.
  • a preservative such as salt benzalkonium.
  • a suppository can also be obtained by combining an oily base material such as cacao butter or an aqueous gel base material such as cellulose derivative as a carrier.
  • the peptide of the present invention can be formulated in a neutral or salt form.
  • pharmaceutically acceptable salts include inorganic salts such as hydrochloric acid and phosphoric acid, or acetic acid and tartaric acid.
  • Organic acids such as
  • a method of administering a vector incorporating a nucleic acid can be mentioned.
  • the above-mentioned vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes vinores vectors, vaccinia winores betaters, retro winores betaters, and lentivirus vectors. Can be invested well.
  • the drug of the present invention into a phospholipid vesicle such as a ribosome and administer the vesicle.
  • a phospholipid vesicle such as a ribosome
  • administer the vesicle For example, the endoplasmic reticulum holding the peptide or vector of the present invention is introduced into a predetermined cell by the ribofusion method.
  • the obtained cells are administered systemically, for example, intravenously or intraarterially.
  • the drug of the present invention can be administered by parenteral administration or oral administration.
  • parenteral administration includes nasal administration, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection and other suppositories, and suppositories.
  • parenteral administration it can be prepared as a mixture with excipients such as starch, mannitol, latatose, magnesium stearate and cellulose.
  • the vaccine of the present invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • the dose to be administered depends on the subject to be treated and the immune system, and the required dose is determined by the judgment of the clinician. In general, the appropriate dose is 1 to 100 mg for the peptide of the present invention (epitorp peptide) and 10 6 to 10 9 for the epitope peptide pulsed cells per patient.
  • the dosing interval can be set according to the subject and purpose.
  • Epstein-Barr virus-related diseases that are expected to be prevented or treated by the agent of the present invention include, for example, Burkitt lymphoma (BL), Hodgkin's disease (HD), nasopharyngeal cancer (NPC), or Mention of malignant tumors such as post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD).
  • BL Burkitt lymphoma
  • HD Hodgkin's disease
  • NPC nasopharyngeal cancer
  • PTLD post-transplant lymphoproliferative disease
  • the animal that can be inoculated with the drug (vaccine or the like) of the present invention is not particularly limited as long as it has an immune system and can infect Epstein-Barr virus, but is preferably a human. .
  • the present invention provides a method for inducing (activating) cytotoxic T cells, characterized by inducing cytotoxic T cells using the peptide of the present invention.
  • a preferred embodiment of the induction method of the present invention includes a peptide of the present invention (for example, HLA-A24
  • the present invention relates to a method for inducing Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cells (CTLs) by contacting peripheral blood mononuclear cells in a medium containing plasma.
  • CTLs Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cells
  • Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cells induced by the above-described method can be a component of a passive immunotherapeutic agent for Epstein-Barr virus. Therefore, it is possible to produce a passive immunotherapeutic agent by inducing Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cells by the above-described method and obtaining the T cells.
  • the present invention provides a method for producing a passive immunotherapeutic agent using the Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cell induction method of the present invention.
  • a preferred embodiment of the present production method is that the peptide of the present invention or an antigen-presenting cell presenting the peptide on HLA is stimulated with peripheral blood lymphocytes to produce Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T cells. It is a method including the process of acquiring.
  • the major histocompatibility antigen complex prepared from the peptide of the present invention and / or the major histocompatibility antigen complex-tetramer reacts with peripheral blood lymphocytes. Cytotoxicity obtained by forming a conjugate in which cytotoxic T cells are bound to the major histocompatibility complex and Z or major histocompatibility complex-tetramer and isolating the conjugate.
  • a method for producing a passive immunotherapeutic agent for Epstein-Barr virus comprising the step of obtaining T cells.
  • the above-described production method may include, as necessary, "a step of mixing a pharmaceutically acceptable carrier with the obtained cytotoxic T cells”. ,.
  • the MHC-tetramer reagent prepared using the peptide of the present invention can be used not only for quantification of specific CTLs but also in combination with intracellular cytoforce-in-producing cell quantification methods and specific antibodies against cell surface proteins. It is possible to determine the specific CTL differentiation stage and functionality at the same time.
  • the present invention is further specific to Epstein-Barr virus utilizing the peptides of the present invention.
  • CTLs specific to Epstein-Barr virus people with reduced immune capacity due to any cause, patients with congenital immunodeficiency, or bone marrow transplantation, hematopoietic stem cell transplantation, cord blood transplantation, solid organ
  • CTL epitope peptide The quantification of CTL specific to Epstein-Barr virus is not necessarily limited to these methods, for example, by the following three methods using the peptide of the present invention (CTL epitope peptide).
  • CTL specific for Epstein-Barr virus in peripheral blood can be quantified using an MHC-tetramer reagent prepared using the CTL epitope peptide of the present invention.
  • the quantification can be performed, for example, as follows. Peripheral blood or PBMC is reacted with an appropriate concentration of epitope peptide-tetramer reagent. Since CTL bound to the epitope peptide tetramer reagent is stained with a labeled dye, it is counted using a flow cytometer, a microscope or the like. When reacting with an epitope peptide-tetramer reagent, the Epstein-Barr virus reacts with an anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody, etc. labeled with a different dye from the epitope peptide-tetramer reagent.
  • a specific CTL T cell subset can be determined simultaneously.
  • Site force such as I FNI (interferon gamma), TNF (tumor necrosis factor), interleukin, etc. produced by CTL by stimulating PBMC with the CTL epitope peptide of the present invention
  • a specific method is shown by taking Y as an example.
  • PBMCs are suspended in a suitable medium at a cell concentration of approximately 2 ⁇ 10 6 / mL, and the CTL epitope peptide of the present invention is encapsulated. Furthermore, intracellular protein transport inhibitors (for example, Brefeldin A and Mo nensin etc.) and incubate at 37 ° C for 5-16 hours in a 5% CO constant temperature bath. After culture, T cell
  • each antibody (anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody) or Z or epitope peptide-tetramer reagent, fix the cells, perform membrane permeabilization, and react with the dye-labeled anti-IFN antibody. Analyze using a flow cytometer, etc.
  • PBMCs are suspended in a suitable medium at a cell concentration of approximately 2 ⁇ 10 6 / mL, and the CTL epitope peptide of the present invention is encapsulated. Incubate for 24-48 hours at 37 ° C in a 5% CO constant temperature bath. After incubation
  • the supernatant is collected, and the concentration of IFN contained therein is determined using a commercially available ELISA kit (eg, H ⁇ from MBL).
  • a commercially available ELISA kit eg, H ⁇ from MBL.
  • Quantification is performed using cell surface protein specific antibodies.
  • Specific CTL has been reported to be a cell surface protein whose expression is enhanced on the cell surface by stimulation of a specific peptide (eg, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.).
  • a specific peptide eg, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.
  • the CTL bound to the labeled antibody is stained with the labeled dye, so it can be counted using a flow cytometer, microscope, etc.
  • Specific to Epstein-Barr virus by reacting with anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody, etc. labeled with a dye different from the labeled antibody simultaneously or sequentially when reacting with the labeled antibody CTL T cell subsets can be determined simultaneously.
  • a preferred embodiment of the quantification method of the present invention is that the peripheral blood is stimulated with the peptide of the present invention, cytotoxic T cells specific to the virus are obtained, and the cytodynamic force produced by the cytotoxic T cells and
  • the present invention relates to a method for quantifying cytotoxic ⁇ cells specific to Epstein-Barr virus, characterized by measuring Z or chemokine and Z or cell surface molecules.
  • the MHC-tetramer (or monomer or multimer) reagent can be used for the quantification of specific CTLs as described above.
  • the MHC-tetramer reagent is prepared from the peptide of the present invention, and the MHC-tetramer reagent is reacted with peripheral blood, which is specific to Epstein-Barr virus in the peripheral blood.
  • the present invention relates to a method for quantifying cytotoxic T cells. In the above method, a peripheral blood sample obtained and isolated in advance can be used.
  • the present inventors first induced a CTL clone specific for LMP1 among EBV-related proteins and identified an epitope derived from LMP1.
  • LCL infected with EBV was prepared by a known method (Kuzushima, K., et al., Blood, 94, 30
  • ML-glutamine 50 U / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin and 50 ⁇ g / mL force
  • the cells were cultured in RPMI1640 (Sigma Chemical Co., St. Lois, MO, USA) supplemented with namycin.
  • NK cell lines carrying EBV, SNK-6 (Nagata, H., et al., Blood, 97, 708-713 (20 01)) and SNK-10 (Zhang, Y “et al. , Br J Haematol, 121, 805-814 (2003)) was donated by Dr. Shimizu (Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan), a NK cell line carrying another EBV, HANK-1. (Kagami, Y., et al., Br J Haematol, 103, 669-677 (1998)) was donated by Dr. Kagami (Aichi Cancer Center Hospital, Nagoya, Japan).
  • the cells were cultured by a method known to those skilled in the art (Nagata, H., Blood, 97, 708-713 (2001)).
  • HEK-293T cells American Type Culture Collection, Manassas, USA
  • Phoenix—GALV cells Akatsuka, Y., et al., Tissue Antigens, 59, 502—511 (2002)
  • the introduction of the retrovirus of the HLA gene was carried out by a known method (Kondo, E., et al. , JI mmunol., 169, 2164-2171 (2002)) 0
  • rod-shaped cells were prepared by a known method (Romani N, et al., J Exp Med. 1994; 180: 8 3-93, Sallusto F, et al "J Exp Med. 1994; 179: 1109-1118, Dauer M, et al "J Immun ol. 2003; 170: 4069-4076) o CD8 + T cells using PBMCs force et al. CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) Separated and stored at 135 ° C.
  • Non-adherent cells were removed by gentle pipetting, and adherent cells were removed with 50 ng / mL granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, Osteogenetics, Wuerzburg, Germany) and lOng / mL IL-4 ( The cells were cultured in a DC medium containing Osteogenetics). On day 2 and day 4, half of the medium was replaced with fresh DC medium containing GM-CSF and IL-4. On day 6, rodent cells were collected and electoporation was performed to introduce mRNA.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 lOng / mL IL-4
  • CD-40B B cells activated by CD40 stimulation
  • 3T3NIH / human CD40 ligand cells also donated by Dr. Freeman of Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA. (Kondo, E., et al. J Immunol, 169, 2164-2171 (200 2)) o
  • the present inventors In order to produce antigen-presenting cells that express the deletion mutant ALMP1, the present inventors also generated the deletion mutant A L MP1 mRNA using pcDNA / ALMP1 plasmid force and in vitro transcription system.
  • pcDNA3.1 (+) Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA
  • pcDNA / ⁇ LMP1 Hindlll and EcoRI restriction enzyme recognition sites
  • a cleaved fragment was prepared by PCR using pcDNA / ⁇ LMP1 as a template and inserted into pcDNA3.1 (+).
  • each pair of complementary nucleotide oligonucleotides was annealed and inserted into pcDNA3.1 (+) cut with restriction enzymes.
  • cDNA of A LMP1 and fluorescent protein EGFP was transferred to a retroviral vector called pMSCVpuro (BD Biosciences Clontech, Palo Alto (CA), USA) Insertion was carried out to prepare pMSCVpuro / ⁇ LMP1 and pMSCVpuro / EGFP.
  • pMSCVpuro BD Biosciences Clontech, Palo Alto (CA), USA
  • Insertion was carried out to prepare pMSCVpuro / ⁇ LMP1 and pMSCVpuro / EGFP.
  • a short hairpin RNA (shRNA) interfering retroviral vector was constructed using RNAi-Ready pSIREN-RetroQ vector (BD Biosciences Clontech).
  • a fragment containing a T7 promoter region and a region encoding ⁇ LMP1 was prepared by PCR using pcDNA / ⁇ LMP1 as a template.
  • the amplified DNA was used as a template for in vitro transcription of 5'-capped mRNA. 5.
  • In vitro transcription of -capped mRNA was performed using the mM ESSAGE mMACHINE kit (Ambion, Austin, TX, USA).
  • 3A polyA end was added using polyA polymerase (Ambion) and purified by RNeasy kit (QIAG EN, Tokyo, Japan).
  • Intracellular staining of the LMP1 antigen was performed by a known method (Gottschalk, S., et al., Blood, 101, 1905-1912 (2003)), except for slight changes.
  • Cells transfected with the Elect Mouth Position were fixed in PBS with 4% paraformaldehyde at room temperature for 10 minutes. After washing with PBS, the cells were permeabilized with IC Perm (BioSource International, California Port, Calif.) And monoclonal antibody (CS 1) that recognizes the C-terminus of LMP-1 at 4 ° C for 30 minutes. -4, DAKO Cytomation, Glostrup, Denmark). After washing with PBS, cells are fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled anti-mouse IgG (H + L) (Immunotech, Marseille (France), stained for 30 minutes at 4 ° C.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • CD8 + T cells were thawed and washed, then 10% human serum, 2 mM L-glutamine, 5 OU / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 50 ⁇ g / mL kanamycin, 25 ng / mL IL-7 (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) and 5 ng / mL IL-12 (R & D Systems) in RPMI 1640 medium 2 mL in a 5% CO Caro humidified incubator.
  • the proliferating wells were divided into three parts, each of which was used as an effector cell, and each of these CD40-B was self-transfected with ⁇ LMPl-mRNA or EGFP-mRNA. Used for cell CTL assay.
  • the radiometric count per minute of CD40-B cells transfected with LMP1-mRNA exceeds three times the standard deviation of the average radiometric count per minute of CD40-B cells transfected with EGFP-mRNA.
  • the well was recorded as positive. Positive wells were transferred to flasks and grown by known methods (Kuzushima, K., et al., Blood, 98, 1872-1881 (2001)).
  • ELISPOT was performed by a known method (Kuzushima, K., et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999), Kondo, E “et al., J Immunol, 169, 2164-2171 (2002) , Kuzus hima, K., et al., Blood, 98, 1872-1881 (2001))
  • CD8 + T cells were isolated from anti-human interferon gamma (IFN y) monoclonal antibody (Pierce Biotechnology, Philadelphia ( PA)) in Multiwell-HA plates (MAHA S4510; Millipore, Billerica, MA, USA) with various stimulators.
  • IFN y anti-human interferon gamma
  • MAHA S4510 Millipore, Billerica, MA, USA
  • HLA-A * 0206 positive or negative LCL cells 100,000 cells per well
  • Lipofectamin 2000 Invitrogen
  • HEK-expressing HLA-A * 0206 293T cells 50,000 cells per A0206-295TX1
  • To perform the peptide titration assay several concentrations of synthetic peptide (Greiner, Frickenhausen, Germany) were pulsed into A0206-295T cells for 1 hour at room temperature.
  • ⁇ 7 a ⁇ cell clone named ⁇ 7 was established from the Norek CTL line. ⁇ 7 lysed its own CD40-B cells transfected with A LMPl-mRNA but did not lyse CD40-B cells transfected with EGFP-mRNA (data not shown). Examination of the blood donor gene type (HLA) revealed HLA-A * 0206, A * 2402, B * 0702, B * 4801, Cw * 0304, and Cw * 0702. . To identify HLA molecules that display CTL epitopes, each HLA gene was introduced using a retroviral vector and LCL completely mismatched with HLA was used. H7 is cultured with LCL introduced with HLA-A * 0206 In addition, IFN- ⁇ spots were created, indicating that HLA_A * 0206 is a molecule that displays epitopes (Fig. 1C).
  • HLA-A * 0206-restricted LMP1-derived epitopes have been reported so far.
  • H7 did not create an IFN-y spot with the peptide YLLEMLWRL (SEQ ID NO: 25) (data not shown), and therefore an epitope recognized by H7 was identified.
  • A0206-293T cells introduced with plasmids are easier to prepare than CD40-B cells and mRNA
  • plasmids containing A LMPl-mRNA with the C-terminal side removed were introduced in the following studies.
  • A0206-293T cells prepared were used.
  • antigenicity was lost when the C-terminal truncation spanned between amino acid residues 77 and 88 (data not shown) .
  • the reason for the discrepancy with the data using CD40-B cells is unknown.
  • LMP1 with C-terminal trimmed at amino acid residue 88 was used.
  • Amino acid residue 64-71 may constitute the shortest epitope of H7.
  • Expression vector N-terminal methionine force encoded by one start codon Substitutes for isoleucine at position 63, binding to MHC And may meet the structural need for H7 recognition.
  • the synthesized 8-amino acid peptide (amino acid residues 64-7 1: IIILIIFI, SEQ ID NO: 18) and 9 amino acid peptide (amino acid residues 63-71: IIIILIIFI, SEQ ID NO: 1) were pulsed into A0206-293T cells, and the reactivity of H7 was examined by ELISPOT assay.
  • FIG. 2D only the 9 amino acid peptide was recognized by H7, indicating that the shortest epitope also initiates an isoleucine force at position 63.
  • H7 recognized CD40-B introduced with full-length ⁇ LMP1-mRNA (Fig. 2A). It did not recognize A0206-293T cells introduced with a plasmid expressing the same sequence.
  • A0206-293T cells mainly express the standard proteanome! /, But CD40-B and LCL cells have predominant immune proteasomes (Frisan, T., et al "Int J Cancer, 88: 881-888, Morel, S., et al., Immunity 200 0; 12: 107-117) .Standard proteasomes have an important role in the antigen processing pathway, and cells are Upon exposure to ⁇ , newly synthesized immune proteasomes such as low molecular weight protein 2 (ip-LMP2) and low molecular weight protein 7 (ip-LMP7) are constructed by induction of the ⁇ subunit. The proteasome activity varies both quantitatively and qualitatively.
  • ip-LMP2 low molecular weight protein 2
  • ip-LMP7 low molecular weight protein 7
  • ip-LMP7 and ip-LMP2 are transmembrane proteins (eg, EBV-LMP2 (Lautscham, G., et al., J Virol, 77: 2757-2761 (2003)), MAGE-3 (Levitskaya, J “et al "Nature 375: 685-6 88 (1995)) is known as an indispensable molecule for epitope production, and these two were used as siRNA targets.
  • siRNA targets were selected. That is, for ip-LMP2, AA We selected GUGAAGGAGGUCAGGUAUA (SEQ ID NO: 26), ip-LMP7! / AGAUUAAC CCUUACCUGCUTT (SEQ ID NO: 27).
  • the shRNA construct contains a TTCAAGAGA-loop separating sense and antisense sequences followed by a 5T termination signal. These constructs were synthesized as two complementary DNA oligonucleotides, annealed, and inserted between the vector's BamHI and EcoRI restriction enzyme recognition sites. Furthermore, a negative control siRNA (BD Biosciences Clon tech) was inserted into the same vector and used as a control. The cloned gene was sequenced to confirm its identity.
  • ip-LMP2 and ip-LMP7 were determined by a known method (Schwarz, K., et al., J Immunol, 165, 7 68-778 (2000), Tajima, K., et al "Int J Cancer, 110 , 403-412 (2004)), that is, the evaluation by the Western blotting method.
  • the expression of ip-LMP7 or ip-LMP2 was significantly decreased in LCL cells into which the corresponding shRNA-vector was introduced.
  • the effect of gene suppression on LMP1 epitope production by gene suppression was evaluated by ELISPOT Atsay.
  • the production of IFN- ⁇ spots by H7 clones was significantly reduced when stimulated with LCL that suppressed the expression of ip-LMP7. Suppression of the expression of ip-LMP2 had little effect (Fig. 3B). ).
  • Example 7 Measurement of cytotoxic activity of LMP1-specific CTL clone against LCL cells
  • the CTL assembly was performed according to the following process. Target cells were labeled washed with 1.5 hours Ci chrome 37 ° C (51 Cr), and mixed with CTL in 96-well plates so that the ratio of the indicated E Fuekuta one and purpose. After culturing at 37 ° C for 4 or 16 hours, the radioactivity of the supernatant was counted with a ⁇ -counter. The specific 51 Cr release rate was calculated as follows. : 100x (experimental release-spontaneous release) / (maximum release-minimum release)
  • H7 cannot effectively lyse HLA-A0206 positive LCL cells after 4 hours of incubation (data not shown). It was shown to lyse allogeneic LCL cells positive for LA-A0206 (FIG. 4A). This suggests that LMP1 expression in LCL for cell lysis via H7 is inadequate in CTL assembly at 4 hours.
  • EBV LMP1 is expressed in LCL cells together with other proteins as latent infection mode III, and is expressed in NK / T cells as latent infection mode II (Zhang, Y., et al., Br J Haematol, 121, 805— 8 14 (2003)) o Therefore, EBV-positive NK cell lines (Nagata, H., et al "Blood 2001; 97: 708-713, Zhang, Y” et. al., Br J Haematol, 121, 805-814 (2003), Kagami, Y “et al” Br J Haematol, 103, 669-677 (1998)).
  • H7 cells have the ability to dissolve one HLA-A * 0206 positive strain (SNK-10).
  • Another cell SNK-6
  • HLA_A * 0206 negative strain (HANK-1 ) Did not dissolve.
  • HANK-1 cells introduced with HLA-A * 0206 were specifically lysed by H7 cells (FIG. 5B). Since SNK-6 cells pulsed with the epitope peptide were specifically lysed by H7 (Fig. 5A), it is possible that the SNK-6 cells were mutated by the LMP1 epitope.
  • the inventors sequenced genomic DNA that binds to the LMP1 epitope. As a result, it became clear that all three EBV-positive NK cell lines carry the same mutation that does not affect amino acid residues 55-80 (data not shown).
  • the present inventors next induced CTL clones specific to EBNA1 among EBV-related proteins, and identified EBNA1-derived epitopes.
  • CD40 activated B cells were produced from the blood donor PBMC based on known methods (Schultze J, et al "J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997), Kondo E, et al., J Immunol, 169, 2164-2171 (2002)) 0 Briefly, PBMCs were irradiated with radiation and transformed with CD40L. NIH3T3 cells (hereinafter referred to as t_CD40L). Dana in Boston—sponsored by Dr.
  • LCL retaining EBV can be separated from PBMC using B95-8 cell culture supernatant based on known methods (Kuzushima K, et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999)). Was prepared. The cells were cultured in RPMI 1640 medium (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) containing 10% urine fetal serum, 2 mM L-glutamine, 50 U / mL penicillin, 50 g / mL streptomycin and 50 ⁇ g / mL kanamycin. .
  • rod-shaped cells were prepared by a known method (Romani N, et al., J Exp Med., 180, 83-9 3 (1994), Sallusto F, et al., J Exp Med., 179, 1109-1118 (1994), Marine M, et al "JI mmunol., 170, 4069-4076 (2003).)
  • CD8 + T cells PBMCs force et al.
  • CD8 MicroBeads Mo tenyi Biotec, Bergisch Gladbach ( Germany ”and stored at –135 ° C
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • human serum MP Biomedicals, Aurora, OH
  • 2 mM L-glutamine 50 U / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 50 ⁇ g / It was suspended in 4 mL of RPMI1640 medium (DC medium) containing mL of kanamycin, and incubated at 37 ° C for 2 hours in one plate of a 6 well plate.
  • DC medium RPMI1640 medium
  • Non-adherent cells were removed by gentle pipetting, and adherent cells were removed with 50 ng / mL granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, Osteogenetics, Wuerzburg, Germany) and lOng / mL IL-4 ( The cells were cultured in a DC medium containing Osteogenetics). Day 2 and Day 4 The medium was replaced with fresh DC medium containing GM-CSF and IL-4. On day 6, rodent cells were collected and electoporation was performed to introduce mRNA.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • the inventors produced full-length EBNA1 mRNA with a poly A chain from pcDNA / E BNA1 plasmid using an in vitro transcription system.
  • pcDNA / EBNAl vector was first constructed. Using the RNeasy Kit (Qiagen, Hilden (Germany), all RNA was extracted from the LCL transformed with B95.8 described above to obtain a sequence encoding EBNA1.
  • the amino acid sequence and DNA sequence of EBNA1 are represented by SEQ ID NO: : Shown in 36 and 37. Then, after reverse transcription, EBNA1 cDNA was amplified by PCR using the following specific primers.
  • EBNA1 The full-length EBNA1 fragment was inserted into pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carl sba rod A) using Hindlll and EcoRI sites to construct pcDNA / EBNAl. Sequencing was performed to confirm that EBNA1 was introduced.
  • the obtained plasmid DNA was linearized using mMESSAGE and mMACH INE kit (Ambion, Austin, TX) and transcribed in vitro.
  • the polyA chain at the 3 ′ end was attached to EBNA1 mRNA using polymide polymerase (Ambion), and then purified using the RNeasy kit. Purified mRNA was confirmed using a Reliant RNA gel system (Cambrex, Rockland (ME)).
  • EBNAlmRNA was introduced into rod-shaped cells and CD40-B cells by electoporation.
  • it was washed twice with serum-free RPMI 1640 and suspended to a final concentration of 2.5 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • ECM830 Electro Square Porator
  • the conditions were set to 450 V and 500 ⁇ S for rod cells and 350 V and 350 ⁇ S for CD40-B cells.
  • EBNA1 staining was performed in the following steps, and the expression of EBNA1 in the cells was confirmed.
  • CD40-B cells introduced with EBNA1 mRNA were collected and fixed in phosphate buffered saline (PBS) containing 4% paraformaldehyde at room temperature for 10 minutes. After washing with PBS, the cells were permeabilized with PBS containing 0.5% Tween-20 at 4 ° C for 30 min, and anti-EBNA1 Usagi polyclonal antibody (provided by Dr. Tatsuya Tsurumi, Aichi Cancer Center Research Institute, Nagoya, Japan) ).
  • the EBNA1-specific CTL clone was induced by the following steps.
  • CD8 + T cells Thaw the stored CD8 + T cells and add 10% human serum, 2 mM L-glutamine, 50 U / mL pericillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, and 50 ⁇ g / mL kanamycin (referred to as CTL medium). And 5 ng / mL IL-7 (R & D Systems, Minneapolis, MN) and 5 ng / mL IL-12 (R & D systems) 5 ng / mL in 200 ⁇ L RPMI1640 medium with 5% CO concentration. Bottom, wet
  • T cells were cultured in an incubator. On days 8, 16, and 23, T cells were stimulated by rod-like cells introduced with EBNA1-mRNA and irradiated with y rays. One day after each restimulation, IL-2 (Yoshio Shiono, Osaka, Japan) was added to a final concentration of 20 U / mL. To establish T cell clones, polyclonal CTL limiting dilution was performed (Kuzushima K, et al., Blood. 2001; 98: 1872-1881).
  • ELISPOT was performed by a known method (Kuzushima K, et al., Blood, 101, 1460 -1468 (2003)) o CD8 + T cells were treated with anti-human interferon ⁇ (IFN y) monoclonal antibody (Pierce Biotechnology, They were cultured with various stimulators in the wells of Multiscreen-HA plates (Millipore, Billerica (MA)) coated with Philadelphia (PA).
  • IFN y anti-human interferon ⁇
  • MA Multiscreen-HA plates
  • PA Philadelphia
  • A CD40-B cells with or without EBNA1 mRNA introduced, and CD40 B cells with or without
  • B autologous or allogeneic LCL (1 x 10 5 cells / will) I asked each well.
  • Synthetic peptides at various concentrations were added to autologous CD40-B cells for 1 hour at room temperature.
  • EBNA1-specific CTL was present in 32 cells out of 36 cells (data not shown).
  • CTL clones B5 and C6 were established by the limiting dilution method. Clones were grown with anti-CD3 monoclonal antibody, irradiated feeder cells and IL-2. These clones recognized ECLAl-mRNA-introduced CD40-B cells and the ability to recognize LCL Autologous CD40B cells without EBNAl-mRNA and allogeneic LCL that did not match HLA did not recognize (Fig. 7).
  • HLA-A * 2402 Blood donors were genetically classified as HLA-A * 2402, A * 3101, B * 1507, B * 3501, and Cw * 0303.
  • a panel of LCLs partially matched by HLA was used to stimulate clones B5 or C6 to produce IFN y.
  • allogeneic LCL force CTL clone C6 expressing HLA_B * 3501 (FIG. 8A).
  • LCL clone C5 (Fig. 8B) with HLA-Cw * 0304 or HLA-Cw * 0303.
  • HLA-B * 3501 is a putative limiting factor for clone C6 recognition
  • HLA-Cw * 0303 and HLA-Cw * 0304 act as limiting factors for clone B5! Show that! /
  • clones B5 and C6 were stimulated in autologous CD40-B cells with a set of peptides with 20 amino acids.
  • the peptides used in the present invention were purchased from Bio-Synthesis, Inc. Lewisville, TX. Since the primary structure of GAr is likely to include ⁇ C class I epitope, the present inventors removed this part as an epitope source.
  • the amino acid set (total 56 peptides) covers the complete EBNA1 protein sequence excluding the GAr domain with a 13 residue overlap!
  • VYGGSKTSL (509-517) (SEQ ID NO: 22), FVYGGSKTSL (508-517) (SEQ ID NO: 3), and VFVYGGSKTSL (50 7-517 ) (SEQ ID NO: 2) was synthesized.
  • HLA— Cw * 0303 and Cw * 0304 cDNA clones are primer C03F (5'— AACCAT No .: 32) and C03R (5'-AAGGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGG-3 ', SEQ ID NO: 33) Using primers to increase the sequence encoding the extracellular domain of HLA-Cw * 0303 and Cw * 0304 heavy chain by PCR Used as a template for
  • C03F contains several base substitutions designed to optimize protein expression with E. coli BL21 (DE3) pLysS.
  • the PCR product was cleaved with Ncol and BamHI and incorporated into a vector.
  • This vector contains a BirA biotinylation site at the 3 'end of the HLA sequence.
  • HLA-Cw * 0303 and Cw * 0304 molecules were incorporated in vitro with 13 2-microglobulin and peptides FVYGGS KTSL (SEQ ID NO: 3) or VFVYGGSKTSL (SEQ ID NO: 2). Soluble complexes purified by gel filtration were biotinylated with BirA enzyme (vidity LCC, Denver (CO)).
  • Tetramers labeled with phycoerythrin were prepared by mixing these biotinylated complexes with PE labeled streptavidin (Molecular Probes, Carlsbad, California).
  • Tetramer staining was performed as follows. CTL clones (2xl0 5 ) were stained for 15 minutes at 4 ° C with FITC-labeled anti-CD8 monoclonal antibody (Caltag, Burlingame, Calif.) And incubated with 20 g / mL tetramer. Stained cells were fixed with 0.5% paraformaldehyde and analyzed by flow cytometry.
  • the final increase in LCL was evaluated by microscopic observation and confirmed by the expression of CD 19 by flow cytometry.
  • a cytotoxic T cell epitope peptide specific to Epstein-Barr virus was successfully identified.
  • the peptide has a function capable of efficiently inducing cytotoxic T cells (CTL) specific to Epstein-Barr virus. Therefore, the peptide and a nucleic acid encoding the peptide are useful as a vaccine (active immunotherapeutic agent) for treating or preventing Epstein-Barr virus infection and virus-positive cancer.
  • the epotope peptide provided in the present invention can induce Epstein-Barr virus-specific CTL in vivo and retain immunity against Epstein-Barr virus infection by using it as a vaccine.
  • In vitro and biological samples such as peripheral blood can be induced and proliferated by artificially inducing and propagating Epstein-Barr virus-specific CTL safely and efficiently without infecting Epstein-Barr virus. Can be used for therapy. In addition, it can be used for diagnosis of immunity against Epstein-Barr virus, and is an effective treatment for Epstein-Barr virus infection. Provide therapy and diagnostic methods.
  • CTL induced by these epotope peptides of the present invention has a function of specifically lysing Epstein-Barr virus-infected cells and inhibiting the growth of the cells, and passive immunity. It is very useful as a component of a therapeutic agent.
  • CTL specific to Epstein-Barr virus can be quantified by using the epitope peptide. Knowing whether the CTL specific for Epstein-Barr virus is present in the peripheral blood of patients with or without illness can be attributed to the appropriate use of antiviral and anti-immune agents. This is important information for management.

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Abstract

　本発明者らは、EBV関連蛋白質であるLMP1およびEBNA1のmRNAを抗原提示細胞に導入し、該細胞がEBVに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを明らかにした。また、該細胞傷害性Ｔ細胞は、HLA-A*0206分子、HLA-Cw*0303分子またはHLA-Cw*0304分子に提示されているエピトープペプチドを認識し、さらにEBVが感染しているB細胞の成長を阻害し、EBVが感染しているNKリンパ腫またはNK細胞を溶解することを明らかにした。

Description

明 細 書
ェプスタイン-バールウィルス感染細胞を特異的に攻撃する細胞傷害性 T 細胞ェピトープペプチド及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープ ペプチド、該ペプチドを用いたェプスタイン-バールウィルスの感染および同ウィルス 陽性の癌を治療又は予防するワクチン、ェプスタイン-バールウィルスに対する受動 免疫療法剤に関する。
背景技術
[0002] ェプスタイン-バールウィルス（記憶 B細胞に長期間潜伏するへルぺス γウィルス、 以下 EBVと標記することもある）は、多くの悪性腫瘍に関連している。例えば、バーキ ットリンパ腫 (BL)、ホジキン病（HD)、鼻咽頭癌 (NPC)、または移植後リンパ増殖性 疾患 (PTLD)などである（非特許文献 1)。潜伏感染では、ウィルス由来のタンパク質 の発現は抑制されている。全ての EBV陽性の悪性細胞は、以下の 3つの潜在タイプ のうち一つを示し、発現された EBV抗原のパターンによって互いに区別される（非特 許文献 2)。
潜伏感染様式 1 :バーキットリンパ腫では、 EBVの核抗原 (ΕΒΝΑ) 1だけが発現される 潜伏感染様式 2：ホジキン病や鼻咽頭癌では、潜在膜蛋白 1 (以後 LMP1と標記する） 、 LMP2、および EBNA1が発現される。
潜伏感染様式 3 :移植後リンパ増殖性疾患では、 EBVの潜在蛋白即ち EBNA1、 2、 3A 、 3B、 3C、 leader protein, LMP1および LMP2が全て発現される。
[0003] EBV関連悪性腫瘍の免疫治療方法に対する関心は増え続けており、インビトロで 活性化された EBV特異的な細胞傷害性 T細胞（以後 CTLと標記することもある）を用 Vヽた養子免疫療法は、造血幹細胞移植や臓器移植後における EBV関連リンパ増殖 性疾患の予防や治療に効果があることが証明されている (非特許文献 3〜7)。ホジキ ン病 (非特許文献 8)、鼻咽頭癌 (非特許文献 9)等の EBVが関連して 、る悪性腫瘍 への同様の戦略の応用は、何人かの患者で有効であることが報告されている。し力し ながら、それらの研究で使用された、リンパ芽球細胞株 (以後 LCLと標記する）によつ て活性化された CTLは主に EBNA3A、 EBNA3Bや EBNA3Cを標的としており、これら の抗原はホジキン病や鼻咽頭癌のような悪性腫瘍では発現されて ヽな 、。 LCLに活 性ィ匕された CTLの一部は LMP2由来のペプチドを認識し、患者の免疫治療効果に貢 献した可能性がある（非特許文献 8, 9)。しかし、 LMP1ペプチドを標的とする T細胞 は非常にまれであり、それは LMP1ペプチド特異的な CTL先駆細胞の低 、頻度を反 映している（非特許文献 10)。サブドミナントな EBV抗原に特異的な T細胞を選択的 に活性ィ匕させるために、 Linらは LMP2由来ペプチドでパルスされた単球由来の榭状 細胞 (DC)を利用して NPC患者を免疫した (非特許文献 11)。また、 LMP1特異的な C TLを活性化するためにいくつかの方法が報告されている。 Khannaらは HLA-A2拘束 性の LMP1ェピトープと、該ペプチドでパルスした抗原提示細胞 (APC)を用いた CTL の誘導について最初に報告している（非特許文献 10)。また、彼らは複数の LMP1ェ ピトープをコードする複製能力のないアデノウイルスや組み換えワクシニアウィルスを 利用して、 HLA-A2トランスジヱニックマウスを免疫することに成功し、 LMP1遺伝子導 入細胞の成長を阻害できたことを報告している（非特許文献 12, 13)。 Gottschalkら は、 N末端を切断された毒性のな 、変種 LMP1を発現して 、る組み換えアデノウィル スを感染させた DCを利用して、ポリクローナルな LMP1特異的 CTLの誘導を報告して いる (非特許文献 14)。
[0004] EBVが関連している悪性腫瘍の一つのカテゴリ一として、 NK/T細胞における EBV 感染が挙げられる（非特許文献 1)。慢性活動性 EBV感染 (CAEBV)も EBVが主に NK /T細胞に感染し、生命に危険を及ぼすリンパ球増殖を引き起こす疾患である（非特 許文献 15)。 EBV陽性の NK/T細胞悪性腫瘍は潜在的な CTLの標的として EBNA1と LMP1を発現して 、る（非特許文献 15〜 17)。
[0005] LMP1は抗アポトーシス遺伝子のアップレギュレーションを通じて細胞の生存を促進 する膜貫通癌蛋白質である（非特許文献 2)。 LMP1の発現はヒト Bリンパ球の成長変 化に不可欠であり、 EBVが感染したヒト単核細胞の増殖に必要である（非特許文献 2 ) o LMP1はまた、マウス細胞株 BALB/c3T3や B細胞リンパ腫一般において癌原性の 形質転換を誘導することが知られている。さら〖こ、 LMP1の発現は EBV感染 NK細胞の 増殖能に重要である可能性がある（非特許文献 18)。し力しながら、 NK/T細胞が LM P1を処理して、 HLA拘束性のェピトープを産生できることは証明されていない。
[0006] 一方、 EBNA1は、 EBV-形質転換細胞におけるウィルスプラスミドの維持と複製に 必要である（非特許文献 19)。 EBNA1は EBVが関連している全ての腫瘍で発現され ることから、免疫治療のための魅力的な標的である。し力しながら、 CD8+CTLの応答 は潜伏感染抗原のうち EBNA3A,3Bおよび 3Cに優先的に向けられ、 EBNA1は CTLに 認識されず、免疫学的には検出できな 、ものと信じられて 、た (非特許文献 20〜23 )。 EBNA1中のグリシンァラニン反復配列（GAr)は CTL認識のための抗原処理を妨 げることがわかっている（非特許文献 24)。この GArの存在は、 MHCクラス Iェピトープ を産生する主要な触媒機構である、プロテアソームによる処理を妨げることが判明し ている（非特許文献 25、 26)。さらに、全く同じドメイン力 EBNA1 mRNAの翻訳を妨 げることが明らかとなっている (非特許文献 27)。
[0007] EBV特異的な CD4+T細胞の応答が調べられ、 EBNA1特異的 CD4+T細胞応答は主 にヘルパー T細胞タイプ 1で見られ、直接的に EBVが感染した細胞を認識することが わかった。数個の MHCクラス II拘束性の EBNA1ェピトープが同定され (非特許文献 2 8〜32)、これらのことから、 EBNA1特異的 CD4+T細胞が生体内で腫瘍の成長制御 の役割を担っている可能性が示唆された。また、最近の研究では、驚くべきことに、 E BNA1特異的 CD8+CTLが、 EBVが感染して 、るリンパ芽球様細胞（LCLs)を穏やか に溶解し、生体内での LCLの成長を抑制されることが示されている（非特許文献 33 〜35)。しかしながら、 CD8+CTLを活性化させる、 EBNA1ェピトープについてはこれ まで少数が同定されたのみである。
[0008] 極少数の前駆細胞から CTLを誘導させる試みが、腫瘍関連抗原を標的にした免疫 治療を望んでいる臨床医や免疫学者により行われてきた。特定の抗原をコードし、ィ ンビトロにお ヽて転写された mRNAを導入した抗原提示細胞は、癌関連抗原または 免疫寛容を超えて自己抗原に特異的な CTLを誘導する性質を持つ (非特許文献 36 〜40)。上記の手法には、以下の利点がある。
1)ベクターの主要な配列に対する免疫性の完全な欠失 2) in vitroでの転写による再現性の高い収率
3)エレクト口ポレーシヨンを利用した遺伝子導入の効率が高いこと
[0009] すなわち、ェプスタイン-バールウィルス抗原（ェピトープ）の mRNAが導入された抗 原提示細胞は、ェプスタイン-バールウィルス特異的な CTLを誘導する上で適切な方 法だと考えられる。上記の方法を実現するために、ェプスタイン-バールウィルスに特 異的な CTLェピトープペプチドの同定が求められてきた。
[0010] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
非特許文献 l:Babcock GJ., et al., Immunity, 13,497-506 (2000)
非特許文献 2:Rickinson AB., et al., In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology (ed Fourth Edition), Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2575—2628 (2001) 非特許文献 3:Rooney, CM., et al., Lancet, 345, 9-13 (1995)
非特許文献 4:Heslop, HE., et al., Nat Med., 2, 551-555 (1996)
非特許文献 5:Rooney, CM., et al., Blood, 92, 1549-1555 (1998)
非特許文献 6:Khanna, R" et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96, 10391-10396 (1999 )
非特許文献 7:Comoli, P., et al" Blood, 99, 2592- 2598 (2002)
非特許文献 8: Bollard, CM., et al" J Exp Med, 200, 1623-1633 (2004)
非特許文献 9:Straathof, KC, et al., Blood 105, 1898-1904 (2005)
非特許文献 10:Khanna, R.， et al., Eur J Immunol, 28, 451-458 (1998)
非特許文献 ll:Lin, CL" et al., Cancer Res., 62, 6952-6958 (2002)
非特許文献 12:Duraiswamy, J., et al" Blood, 101, 3150-3156 (2003)
非特許文献 13:Duraiswamy, J., et al., Cancer Res., 64, 1483-1489 (2004) 非特許文献 14:Gottschalk, S" et al" Blood, 101, 1905-1912 (2003)
非特許文献 15:Kimura, H.， et al., Blood, 98, 280-286 (2001)
非特許文献 16:Nagata, H.， et al" Blood, 97, 708-713 (2001)
非特許文献 17: Zhang, Y" et al., Br J Haematol, 121, 805-814 (2003)
非特許文献 18:Demachi, A., et al., Microbiol Immunol, 47, 543-52 (2003) 非特許文献 19:Kieff E.， et al., In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology (ed Fourth Edition) , Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2511—2574 (2001) 非特許文献 20:Khanna R.， et al., J Exp Med., 176, 169-176 (1992)
非特許文献 21: Murray RJ.， et al" J Exp Med., 176, 157-168 (1992)
非特許文献 22: Steven NM., et al" J Exp Med., 184, 1801-1813 (1996)
非特許文献 23:Callan MF., et al" J Exp Med., 187, 1395-1402 (1998)
非特許文献 24:Levitskaya J., et al., Nature, 375, 685-688 (1995)
非特許文献 25: Blake N.， et al., Immunity, 7, 791-802 (1997)
非特許文献 26:Levitskaya J" et al" Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12616-12621 (1 997)
非特許文献 27: Yin Y" et al" Science, 301, 1371-1374 (2003)
非特許文献 28:Khanna R.， et al., Virology, 214, 633-637 (1995)
非特許文献 29:Leen A., et al" J Virol, 75, 8649-8659 (2001)
非特許文献 30:Paludan C, et al" J Immunol, 169, 1593-1603 (2002)
非特許文献 31:Voo KS., et al., Cancer Res., 62, 7195-7199 (2002)
非特許文献 32:Kruger S.， et al., J Immunother, 26, 212-221 (2003)
非特許文献 33: Lee SP" et al., J Exp Med., 199, 1409-1420 (2004)
非特許文献 34:Tellam J" et al" J Exp Med., 199, 1421-1431 (2004)
非特許文献 35:Voo KS., et al., J Exp Med., 199, 459-470 (2004)
非特許文献 36:Kuzushima, K., et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999)
非特許文献 37:Kagami, Y.， et al., Br J Haematol, 103, 669-677 (1998)
非特許文献 38:Akatsuka, Y.， et al., Tissue Antigens, 59, 502-511 (2002) 非特許文献 39:Kondo, E" et al" J Immunol, 169, 2164-2171 (2002)
非特許文献 40:Dauer, M., et al., J Immunol, 170, 4069-4076 (2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、エブスタイン- バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド、該ペプチドを用い たェプスタイン-バールウィルスの感染を治療又は予防するワクチン、工プスタイン- バールウィルスに対する受動免疫療法剤、およびェプスタイン-バールウィルスに特 異的な細胞傷害性 τ細胞の定量方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、ェプスタイン-バールウィルス関連 蛋白質である LMP1および EBNA1の mRNAを抗原提示細胞に導入し、該抗原提示細 胞がェブスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)を誘導する 能力があるかを検討した。
[0013] その結果、ェプスタイン-バールウィルス関連蛋白質を発現させた抗原提示細胞は 、健常人由来の CTLを刺激し、該 CTLは EBVが感染している B細胞の成長を阻害し、 EBVが感染している NKリンパ腫または NK細胞を溶解することが明ら力となった。さら に、該 CTLは、 HLA- A*0206分子、 HLA- Cw*0303分子または HLA- Cw*0304分子に 提示されているェピトープペプチドを認識することが明ら力となった。
[0014] 即ち、本発明者らは、ェプスタイン-バールウィルスに特異的な CTLェピトープぺプ チドを同定することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。
[0015] 本発明は、より具体的には以下の（1)〜（16)を提供するものである。
(1) ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド
(2) ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド が配列番号： 1〜3からなる群力も選択される少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むもの である、（1)に記載のペプチド。
(3) 配列番号： 1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数の アミノ酸が置換、欠失、挿入及び Z又は付加されたアミノ酸配列力 なるペプチドで あって、ェプスタイン-バールウィルス特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し得る機能 を有することを特徴とする、（1)に記載のペプチド。
(4) HLA-A*0206分子、 HLA-Cw*0303分子または HLA-Cw*0304分子の拘束性抗 原ペプチドであって、 HLA-A*0206分子、 HLA-Cw*0303分子または HLA-Cw*0304 分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうる T細胞レセプター を有する細胞傷害性 T細胞を誘導し得る機能を有することを特徴とする、 (1)〜 (3) の！、ずれかに記載のペプチド。
(5) (1)〜（4)のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
(6) (1)〜（4)のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、ェプスタイン- バールウィルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
(7) (5)に記載の核酸を有効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスの感染 を治療又は予防するためのワクチン。
(8) (1)〜 (4)の 、ずれかに記載のペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞を有 効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスの感染を治療又は予防するための ワクチン。
(9) (1)〜 (4)のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した 抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるェプスタイン-バールウィルス 特異的な細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスに 対する受動免疫療法剤。
(10) (1)〜 (4)の 、ずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複 合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応 させ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テト ラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得 られる細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスに対 する受動免疫療法剤。
(11) (1)〜 (4)のいずれかに記載のペプチドを用いて細胞傷害性 T細胞を誘導す ることを特徴とする、細胞傷害性 T細胞の誘導方法。
(12) (1)〜 (4)のいずれかに記載のペプチドと末梢血単核球を、血漿を含む培地 中で接触させることにより、ェプスタイン-バールウィルス特異的細胞傷害性 T細胞を 誘導する、（11)に記載の誘導方法。
(13) (1)〜 (4)のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した 抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激してェプスタイン-バールウィルス特異的 な細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む、ェプスタイン-バールウィルスに対する 受動免疫療法剤の製造方法。 (14) (1)〜 (4)の 、ずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複 合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応 させ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テト ラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得 られる細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む、ェプスタイン-バールウィルスに対 する受動免疫療法剤の製造方法。
(15) (1)〜 (4)のいずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウィルスに特 異的な細胞傷害性 T細胞を取得し、細胞傷害性 T細胞が産生するサイト力イン及び Z又はケモカイン及び Z又は細胞表面分子を測定することを特徴とする、ェプスタイ ン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞の定量方法。
(16) (1)〜 (4)の 、ずれかに記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テ トラマーを調製し、主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させるこ とを特徴とする、該末梢血中のェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞の定量方法。
図面の簡単な説明
[図 1]榭状細胞または CD40- B細胞への Δ LMPlmRNAの導入、および Δ LMP1の発 現、 CTLの誘導を示す図である。 A:榭状細胞（DC)および CD40-B細胞（CD40-B) において、 A LMP1- mRNAを導入した後、フローサイトメトリーで A LMP1の発現を解 祈した結果を示す図である。点線が遺伝子を導入しな力つた細胞を示し、実線は A L MP1を導入した細胞を示す。 B :末梢血由来 CD8+T細胞を、 A LMPl-mRNA導入し、 放射線を当てた自己の抗原提示細胞で 3回刺激した後、 Δ LMPl-mRNA導入ある ヽ は非遺伝子導入 CD40-B細胞を抗原提示細胞として用いた ELISPOTアツセィを行つ た結果を示す図である。データは CD8+T細胞 500個あたりのスポットの数を示す。 C : HLA完全ミスマッチの LCL細胞に、ドナー由来の各 HLA遺伝子を導入した 6種類の 抗原提示細胞を作成した。 CTLクローン H7を刺激し、 IFN yの産生を ELISPOT法で 測定した結果を示す図である。 1ゥエル当たり 1,000個の H7細胞を入れた。
[図 2]CTLクローン H7が認識する LMP1ェピトープペプチドを示す図である。 A: C-端 末を削った一連の A LMPl-mRNAを、インビトロ転写で作製した。各 mRNAのスタート コドンとして、アミノ酸位置 44番にあるメチォニンを利用した。 C-端末を削った各 A L MPl-mRNAを導入した CD40-B細胞を、 ELISPOTアツセィにおける抗原提示細胞とし て使用した。白枠で示された mRNA断片は H7細胞に認識された力 黒枠で示された mRNA断片は H7細胞に認識されな力つた。 B：一連の C-端末および N-端末を削った 断片は PCRによって増幅されて、 pcDNA3.1(+)ベクターに導入された。導入した DNA によりコードされるアミノ酸配列が示されて 、る。各プラスミドを導入した A0206-293T 細胞に対する、 H7細胞の認識を ELISPOT法（ゥエル当たりの H7細胞 1 ,000個)により 測定し、 IFN yのスポット数によって以下の二つのパターンに分類した。（+)IFN yスポ ット数 50以上； (-)IFN γスポット数 10未満。 C：各遺伝子を導入した Α0206-293Τ細胞 により刺激された Η7細胞の、 Ν γスポット数を示す図である。各バーは Η7細胞 1,00 0個あたりのスポットの数を表す。 D：様々な濃度の合成のペプチドでパルスされた AO 206-293T細胞を用いて、 ELISPOT測定を行った結果を示す図である。データは H7 細胞 500個あたりのスポットの数を示す。
[図 3]LMP1ェピトープ処理における ip- LMP7の重要性を検討した結果を示す図であ る。 A：コントロール siRNA、 ip-LMP2 siRNAまたは ip- LMP7siRNAを、レトロウイルスを 用いて、自己の LCL細胞に導入した。細胞を 14日間プロマイシンで選別し、ゥエスタ ーンブロット解析を行った： ip- LMP2(上側のパネル）； ip- LMP7(下側パネル)。 B： ip- L MP2や ip-LMP7遺伝子の発現を抑制した自己の LCLを用いた ELISPOT測定の結果 を示す図である。 H7の IFN yスポットの産生を評価した。各バーは H7細胞 5,000個あ たりのスポット数を表す。
[図 4]LMP1特異的 CTLクローン H7の細胞傷害活性を示す図である。 A:標的細胞とし て自己の A*0206を共有する細胞と、完全に HLAがミスマッチしている LCL細胞を用 いた、 16時間 CTLアツセィの結果を示す図である。 B : A LMP1あるいは EGFPを導入 した LCLを標的細胞にした 4時間 CTLアツセィの結果を示す図である。各バーは 3ゥ エルの細胞傷害活性の平均を示す。
[図 5]CTLは EBV陽性 NK細胞株を特異的に溶解する。 A: H7 CTLクローンの EBV陽 性 NK細胞株に対する細胞傷害活性を、 16時間 CTLアツセィで計測した結果を示す 図である。 2つの HLA-A*0206陽性 NK細胞株（SNK-6と SNK-10)、及び 1つの HLA- A*0206陰性 NK細胞株（HANK- 1)のデータをそれぞれ、〇、△及び口で示す。 100η Mのェピトープペプチドをパルスした SNK-6細胞を使った 4時間 CTLアツセィで測定 された細胞傷害活性を、參で示す。 B : HLA-A*0206(O)と A*2402(*)遺伝子導入 H ANK- 1細胞を用いた、 16時間 CTLアツセィの結果を示す図である。
[図 6]インビトロで転写された全長 EBNAl mRNAにより形質転換された細胞中での EB NA1の発現を示す図である。 A:インビトロで転写された全長 EBNAl mRNAを、 EBNA 1-cDNAプラスミドから作成した。 EBNAl mRNAをェチジゥムブロマイドで染色し、そ の後ゲル電気泳動によって確認した。 B： EBNAl-mRNAを導入した CD40-B細胞に おける EBNA1タンパク質の発現を示す図である。 CD40-B細胞に全長 EBNAl mRNA をエレクト口ポレーシヨンによって導入し、 EBNA1タンパク質の細胞内染色を行い、フ ローサイトメトリーで確認した。
[図 7]EBNAl_mRNAを導入した榭状細胞を用いた培養液中における抗 EBNA1— T細 胞の存在を示す図である。健康なドナー力もの CD8+T細胞を、インビトロで転写され た EBNAl mRNAで形質転換した自己の榭状細胞で刺激した。一週間間隔で三回刺 激した後、限界希釈法によって 2つの陽性となった培地から、ポリクローナルな CD8+ T細胞をクローン化した。次に、確立したクローンの B5と C6が、 EBNAl-mRNAで形質 転換した自己の CD40-B細胞、及び自己の LCLによって認識されるかどうかを ELISP OTアツセィによって検討した。 5,000個の CTLが各ゥエルに蒔かれた。 2つの実験のう ち代表的な 1つのデータを示した。
[図 8]EBNA1特異的 CTLクローンに提示されている HLA分子の同定の結果を示す図 である。 A: CTLクローン C6に対する拘束分子として、 HLA-B*3501分子が機能するこ とを示す図である。 B : CTLクローン B5対する拘束分子として、 HLA-Cw*0303と Cw*0 304が機能することを示す図である。 自己及び同種の LCLを、 B5または C6クローンが I FN γスポットを生産するための抗原提示細胞として使用した。各 LCLを、 CTL(5xl03) と共に 20時間培養した。各バーは 2つのゥエルにおけるスポットの平均数を表わす。
[図 9]EBNA1特異的 CTLクローンによって認識されるオーバーラップしたペプチドの 同定の結果を示す図である。 GArドメインを除 、た EBNA1タンパク質の全てのァミノ 酸配列を網羅する、オーバーラップする 20残基のペプチドのセット（各 10 g/ml)で、 自己の CD40- B細胞 (lxlO5/ゥエル)をパルスし、 5xl02の CTLクローン B5若しくは C6と 共培養した。 IFN yを産生するスポットを、 ELISPOTアツセィで測定した。
[図 10A-B]EBNA1特異的 CTLクローンによって認識される最適の EBNA1抗原べプチ ドの同定の結果を示す図である。 A: HLA-B*3501拘束性のクローン C6によって認識 される、オーバーラップするペプチドのアミノ酸配列を示す図である。既知のェピトー プ HPVGEADYFEY (配列番号： 28)を、太字とアンダーラインで示す。配列の下の数 字は EBNA1タンパク質におけるアミノ酸の番号を示す。 B :クローン B5によって認識さ れる 2つの連続した、オーバーラップするペプチドアミノ酸配列および最適のェピトー プ配列を示す図である。 #38と #39ペプチドの間でオーバーラップする配列を、アンダ 一ラインで示す。矢印はプログラム SYFPEITHIによって予測された HLA- Cw*0303が 固定するための第一かつ補助のアンカーを示す。配列の下の数字は EBNA1タンパク 質におけるアミノ酸位置の数字を示す。
[図 10C]EBNA1から誘導された合成のペプチドの力価測定の結果を示す図である。 自己の CD40-B細胞を、合成ペプチド 507-526 (#39 20残基）、 507-517 (11残基）、 50 8-517 (10残基）、および 509-517 (9残基)の 10倍ごとの連続希釈液と、 1時間インキュ ペートした。次いで CTLクローン B5 (200細胞/ゥエル）を加えて、 20時間培養した。各 記号は 2ゥヱルでの観察されたスポットの平均の数を示す。
[図 11]HLA- Cw*0303と Cw*0304のテトラマーの、 B5 CTLクローンへの特異的結合を 示す図である。 HLA- Cw*0303-拘束性の EBNA1特異的 CTLクローン B5は、 PE標識 した HLA-Cw*0303- FVYGGSKTSL (配列番号： 3)、 HLA-Cw*0303- VFVYGGSKTSL (配列番号： 2)若しくは HLA-Cw*0304— FVYGGSKTSL (配列番号： 3)テトラマー複 合体及び FITC標識した抗 CD8抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
[図 12]EBNA1特異的 CTLクローンの、 HLAがー致する LCLへのインビトロでの増殖阻 害を示す図である。標的となる LCL(2 X 104)を、丸底 96ゥエルのプレートの三つのゥェ ルにおいて、 EBNA1特異的 CTLクローン (1 X 104)または培地のみ (陰性コントロール） と培養し、 4週間後に細胞の成長を評価した。増殖した細胞が LCLであることは、 CD1 9の発現で確認した。 2つの実験のうちの代表的な 1つのデータを示す。
発明を実施するための最良の形態 [0017] 本発明は、ェプスタイン-バールウィルスに特異的に細胞傷害性 T細胞を誘導し得 る機能を有する T細胞ェピトープペプチドに関する。従って本発明は、ェプスタイン- バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチドを提供する。該ェピ トープペプチドは、本明細書において「ェピトープペプチド」、あるいは単に「本発明 のペプチド」と記載する場合がある。
[0018] 本発明において「ペプチド」とは、生理活性を有し、隣接するアミノ酸残基の oc—了 ミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した線状のアミノ酸の分 子鎖を意味する。ペプチドは特定長のものを意味するものではなぐ種々の長さであ り得る。従って、本発明のペプチドには、所謂「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」も含 まれる。また、無電荷又は塩の形態であってもよぐ場合によっては、グリコシル化、ァ ミド化、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸ィ匕等により修飾されていてもよい。
[0019] 以下に、ェピトープの候補ペプチドの選択方法についてその一例を記載する。
1.コンピュータを用 ヽた解析
本発明のェプスタイン-バールウィルスに特異的な CTLェピトープペプチドは、ェプ スタイン-バールウィルス関連タンパク質のアミノ酸配列について、 目的とする HLA分 子の各結合モチーフを有する 8〜11個のアミノ酸よりなるェピトープペプチドを検索し 得る、インターネット上に公開されている複数のソフトウェア（Pingping G., et al.， Nucl eic Acids Res. , 31 , 3621-3624(2003))に照合して CTLェピトープの候補ペプチドを選 択する事ができる。本発明において、ェプスタイン-バールウィルス関連タンパク質と しては、 EBNA1、 2、 3A、 3B、 3C、 LMP1、 LMP2、または leader protein等を挙げること ができ、より好ましくは、 EBNA1または LMP1を挙げることが出来る。 EBNA1のアミノ酸 配列および DNA配列を配列番号: 36および 37に、 N末端が欠損した LMP1のアミノ酸 配列および DNA配列を配列番号： 34および 35に示す。
[0020] 2.アンカーモチーフを用いた検討
HLAクラス I分子は、主として HLA-A、 HLA-B、 HLA-Cがあり、これらに結合して提 示されるェピトープペプチドは、 8〜11個のアミノ酸からなる。ェピトープペプチドの N 末端側から 2番目と、 9あるいは 10番目のアミノ酸は HLA分子との結合に対して最も重 要なアミノ酸であり、アンカーモチーフと呼ばれている。このアンカーモチーフは、各 々の HLA分子の種類によって異なることが報告されている。例えば、 HLA-A2分子に 結合するペプチドとしては、 N末端より 2番目の位置に Leuが配置され、 9あるいは 10 番目の位置に Leu又は Valが配置されたペプチドであって、 9〜10個のアミノ酸残基か らなるペプチドが最も良く知られている（Sudo T., et al., J. Immunol, 155, 4749-4756 (1995))。また、 日本人を含むアジアの人種に多い HLA-A24に結合するペプチドとし ては、 N末端より 2番目の位置に Tyr、 Phe、 Met又は Trpのいずれかが配置され、 9あ るいは 10番目の位置に Leu、 Ile、 Trp又は Pheのいずれかが配置されたペプチドであ つて、 9〜10個のアミノ酸からなるペプチドが最もよく知られている（Kondo A., J. Immu nol., 155, 4307-4312 (1995))。蛋白質のアミノ酸配列中力 このアンカーモチーフを 有する配列を検索し、 CTLェピトープの候補ペプチドを選択する事ができる。
[0021] 3.ペプチドライブラリーの作製
ェプスタイン-バールウィルス関連タンパク質の蛋白質全体を網羅する 20個前後の アミノ酸よりなるペプチドライブラリーを合成する。 20個前後のアミノ酸のうち、前後 10 個程度 (例えば、 7,8,9,10,11, 12,13個）のアミノ酸は、前後のペプチド配列と重複する ようにライブラリーを作製する。これによつて、蛋白質全体を網羅的に検索する事がで きる。
[0022] なお、前述の方法にて選択されたェピトープ候補ペプチドは必ずしも CTLェピトー プになり得る訳ではなぐ以下に示す検討を経て初めてェプスタイン-バールウィルス 特異的 CTLェピトープになり得る。以下に、ェピトープペプチドの決定方法について 記載する力 これらの方法に限定されるものではない。
[0023] (1)ェピトープペプチド決定方法 1
ェプスタイン-バールウィルス感染歴がある人から分離した末梢血単核球 (peripher al blood mononuclear cells ;PBMC)、あるいは PBMCから分離した T細胞を適切な培 地に 0.1〜2 X 106/mLの細胞濃度で浮遊させる。これに同じ人力 あらかじめ分離培 養しておいたェプスタイン-バールウィルス感染細胞 1 X 105/mLを加え、 5%炭酸ガス（ CO )恒温槽にて 37°Cで 7日間培養する。培養 7日後にェプスタイン-バールウィルス
2
感染細胞とインターロイキン 2 (IL-2)を添カ卩し、以後、ェプスタイン-バールウィルス感 染細胞と IL-2による刺激を毎週繰返すことにより CTLを誘導する。このようにして誘導 した CTLがェピトープ候補ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、 MHC— テトラマー法、エリスポットアツセィ、クロムリリースアツセィ、細胞内サイト力イン染色法 で半 [J疋する (し urrent Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M . Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, 6.19 ELISPO T Assay to Detect Cytokine— Secreting Murine and Human Cells, 6.24 Detection of I ntracellular Cytokines by Flow Cytometry, published by John Wiley & Sons, Inc.)。
[0024] (2)ェピトープペプチド決定方法 2
ェプスタイン-バールウィルス感染歴がある人から分離した PBMCを適切な培地に 0. 1〜2 X 106/mLの細胞濃度で浮遊させ、これにェピトープ候補ペプチドの任意の 1種 を 0.01〜100 g/mLの濃度でカ卩える。 5%CO恒温槽にて 37°Cで培養し、 2日後に IL
2
-2を添加する。以後、前記ペプチドと IL-2による刺激を週に 1度あるいは 2週間に 1度 繰返すことにより CTLを誘導する。このようにして誘導した CTLがェピトープ候補ぺプ チドに対して特異性があるかどうかの検討は、 MHC—テトラマー法、エリスポットアツ セィ、クロムリリースアツセィ、細胞内サイト力イン染色法等で判定する。
[0025] (3)ェピトープペプチド決定方法 3
ェプスタイン-バールウィルス感染歴がある人から分離した PBMCを適切な培地に 0. 1〜2 X 106/mLの細胞濃度で浮遊させ、これに合成したペプチドライブラリーを適当 な数 (例えば 10種類ずつ）にプールした物をカ卩える。 5%CO恒温槽にて 37°Cで培養し
2
、 2日後に IL-2を添加する。以後、プールペプチドと IL-2による刺激を週に 1度あるい は 2週間に 1度繰返すことにより、 CTLを誘導する。このようにして誘導した CTLがェピ トープ候補ペプチドに対して特異性があるかどうかの検討は、エリスポットアツセィ、ク ロムリリースアツセィ、細胞内サイト力イン染色法等で判定する。良好な結果を示した プールペプチドに対しては、 1種類ずつペプチドを加えて上記実験を繰返せば、 CT L誘導能を有するペプチドを選択する事が可能である。反応したペプチドにつ!/、て順 次短くし、基幹のペプチドを得て本発明のェピトープペプチドとする。一般的に、ェピ トープペプチドは最終的に 8〜11個のアミノ酸までに短くすることができる。
[0026] 本発明のペプチドとして具体的には、配列番号： 1〜3のいずれかに記載の塩基配 列からなるペプチドを例示することができる。 [0027] また本発明のペプチドは、配列番号： 1〜3のいずれかに記載のアミノ酸領域を含 むペプチドであってもよい。即ち、本発明のペプチドの好ましい態様としては、ェプス タイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチドが配列番号 : 1〜3からなる群力も選択される少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むペプチドである。
[0028] さらに、本発明のェピトープペプチドは、生理活性及び免疫活性を実質的に改変 せず、投与した場合に有害な活性を有するものでない限り、上記のペプチドの改変 体であってもよい。
[0029] 即ち本発明の好ましい態様としては、配列番号： 1〜3のいずれかに記載のアミノ酸 配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び Z又は付加された アミノ酸配列からなるペプチドであって、改変前の配列番号： 1〜3のいずれかに記載 のペプチドと同等の機能を有するペプチドを挙げることができる。
[0030] 上記「同等の機能」としては、例えば、（1)ェプスタイン-バールウィルス特異的な細 胞傷害性 T細胞を誘導し得る機能、（2)ヒト主要組織適合性抗原等、特に HLA-A*02 06分子、または HLA-Cw*0303分子または HLA-Cw*0304分子との複合体を細胞表 面に提示する細胞を特異的に認識しうる T細胞レセプターを有する細胞傷害性 T細 胞 (CTL)を誘導し得る機能、等を挙げることができる。
[0031] 改変されたペプチドが、上記の機能を有するか否かは、例えば、後述の実施例に 記載の方法、あるいは該方法を適宜改変した方法によって、評価することが可能であ る。
[0032] 本発明のペプチドは、天然に存在する状態から修飾されて!、な ヽもの、及び修飾さ れているものの双方を含む。修飾としては、ァセチル化、ァシル化、 ADP-リボシルイ匕 、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド 誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール の共有結合、架橋、環化、ジスルフイド結合の形成、メチル化、脱メチル化、共有架 橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、 -カルボキシル化
Y
、グリコシル化、 GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化 、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノィル化、硫酸ィ匕 、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移 RNA媒介付加、ュビキチンィ匕 等が含まれる。また、本発明のペプチドは、 N末端又は C末端に付加的アミノ酸配列 が介在するものであってもよい。また、本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコ ール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体、あるいは重合 体等の形態として用いることができる。また、本発明におけるアミノ酸には、所謂「アミ ノ酸アナログ」が含まれる。該アミノ酸アナログとしては、例えば、種々のアミノ酸の N- ァシル化物、 0-ァシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げら れる。
[0033] また、本発明のペプチドと該 HLA分子との複合体が、該複合体を細胞表面に提示 する細胞を特異的に認識しうる TCRを有する CTLによって認識されるものである限り、 本発明のペプチドの N末端や遊離のァミノ基には、ホルミル基、ァセチル基、 t-ブトキ シカルボニル (t-Boc)基等が結合していてもよぐ本発明のペプチドの C末端や遊離 のカルボキシル基には、メチル基、ェチル基、 t-ブチル基、ベンジル基等が結合して いてもよい。
[0034] また、本発明のペプチドは、生体内への導入を容易にしうる各種修飾を施されたも のであってもよい。生体内への導入を容易にしうる各種修飾の例としては、 PT (Protei n Transduction) ·インカ、 ^ ^名である。 HIV (human immunodeficiency virus)の PTドメ インは、 Tatタンパク質の 49〜57番目のアミノ酸（Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg A rgZ配列番号: 38)で構成されたペプチドで、このペプチド配列を目的とするタンパク 質あるいはペプチド配列の前後、又はいずれかに付加することで、容易に細胞内に 導入できることが報告されている（Ryu J., Mol Cells., 16, 385-391 (2003), Kim DT.， J Immunol, 159:1666-1668 (1997》。
[0035] MHCクラス I分子を介して提示されるほとんどの抗原は、細胞質内のプロテアソーム により分解された後、 TAP (transporter in antigen processing)へと移送され、粗面小 胞体内において TAPに会合している MHCクラス I分子と /3 2-ミクログロブリンの複合体 と結合し、ゴルジ装置を経てェクソサイト一シスにより細胞表面へと運搬される。これら 一連の抗原提示経路にて作用するシャペロンである HSP (heart shock prtein) 70や H SP90、又は gp96と目的とするペプチドやタンパク質を融合させることで、効果的な抗 原提示がなされることが報告されており（Basu S., Immunity., 14, 303-313 (2001))、 本発明のペプチドに上記 PTドメインまたはシャペロンを融合させたタンパクは本発明 の一態様を成す。
[0036] また、本発明のペプチドは、従来の各種のペプチド合成方法によって調製され得る 。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコード する核酸を調製し、組換え DNA技術を用いて調製することも可能である。また、市販 の化学合成装置 (例えば、アプライドバイォシステムズ社のペプチド合成装置）による 合成も可能である。
[0037] 即ち本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により 製造することが可能であり、該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド 合成法が包含される。該ペプチド合成法は、より詳しくはアミノ酸配列の情報に基づ V、て、各アミノ酸を 1個ずつ逐次合成させて鎖を延長して 、くステップワイズェロンゲ ーシヨン法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントを カップリング反応させるフラグメント'コンデンセーシヨン法を包含し、本発明のぺプチ ドの合成は、いずれの方法を用いてもよい。
[0038] このようなペプチド合成法にて用いられる縮合法も、各種方法に従って行うことがで きる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステ ル法、酸化還元法、 DPPA (ジフヱ-ルホスホリルアジド）法、ウッドワード法等を例示 できる。
[0039] これら各種方法に利用できる溶媒もまた、一般的に使用されるものを適宜利用する ことができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキ シド（DMSO)、 へキサホスホロアミド、ジォキサン、テトラヒドロフラン（THF)、酢酸ェチ ル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。なお、上記ペプチド合成反応に 際して、反応に関与しないアミノ酸及びペプチドにおけるカルボキシル基は、一般に はエステル化により、例えばメチルエステル、ェチルエステル、第三級ブチルエステ ル等の低級アルキルエステル、例えばべンジルエステル、 Ρ—メトキシベンジルエステ ル、 トロべンジルエステルァラルキルエステル等として保護することができる。ま た、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えば Tyrの水酸基は、ァセチル基、ベンジル 基、ベンジルォキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずし も力かる保護は必須ではない。また、例えば、 Argのグァ-ジノ基は、ニトロ基、トシル 基、 2—メトキシベンゼンスルホ-ル基、メチシレンー2—スルホ-ル基、ベンジルォキ シカルボニル基、イソボル-ルォキシカルボ-ル基、ァダマンチルォキシカルボ-ル 基等の適当な保護基により保護することも可能である。
[0040] 上記のようにして得ることが可能な本発明のペプチドは、通常の方法に従って、例 えばイオン交換榭脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、ァフィユティー クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)、向流分配法等のペプチド化 学の分野で汎用されている方法に従って、適宜、精製を行うことができる。
[0041] 本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードする DNA核酸分子を合成し、適当 な発現ベクターへ導入した後、宿主細胞内において発現させる遺伝子工学的手法 によっても取得することができる。
[0042] 一例を示せば、まず配列番号： 1〜3のいずれかに記載されたアミノ酸配列をコード する核酸を合成する。該方法としては、リン酸トリエステル法ゃリン酸アミダイト法など の化学合成手段〔Letsinger, RL" et al., J. Am.Chem. Soc, 89, 4801 (1967) ; Letsing er, RL., et al., J. Am.Chem. Soc, 91, 3350—3355 (1969) ;Merrifield, R. B., et al., Sc ience, 150, 178-185 (1968) ; Beaucage, SL and Caruthers, MH., Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981) ; McBride, LJ and Caruthers, MH., Tetrahedron Lett., 24, 24 5 (1983)〕及びそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、 DNAの合成 は、ホスホルアミダイト法又はトリエステル法による化学合成により行うこともでき、巿販 されている自動ポリヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補 鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、又は適当なプライマ 一配列と共に DNAポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一 本鎖生成物から得ることもできる。
[0043] 本発明のペプチドには、上述のように、本発明者らによって同定されたェピトープ ペプチド (配列番号： 1〜3)と機能的に同等なペプチドが含まれる。
[0044] あるペプチドと機能的に同等なペプチドを調製するための、当業者によく知られた 方法としては、例えばペプチド中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が挙げられる 。具体的には当業者であれば部位特異的変異誘発法 (Hashimoto-Gotoh, T. et al, Gene, 152, 271-275 (1995)、 Zoller, MJ, and Smith, M. Methods EnzymoL 100, 468 -500 (1983)、 Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456 (1984)、 Kramer W, and Fritz HJ., Methods. EnzymoL, 154, 350-367 (1987)、 Kunkel.TA., Proc Natl Acad Sci USA., 82, 488—492 (1985)、 Kunkel, Methods EnzymoL, 85, 2763-2766 (19 88))などを用いて、配列番号： 1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列に適宜変異を 導入することにより、該ペプチドと機能的に同等なペプチドを調製することができる。 また、ペプチド中のアミノ酸の変異は自然に生じることもある。このように、人工的か自 然に生じたもの力を問わず、本発明者らにより同定されたェピトープペプチド (配列 番号： 1〜3)のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が変異したアミノ酸 配列を有し、該ペプチドと機能的に同等なペプチドは、本発明のペプチドに含まれる
[0045] 上述のようなアミノ酸の変更（改変）目的は、例えば、
1. HLAとの親和性を高める為の変更（Rosenberg SA., et al., Nat Med., 4, 321-327 ( 1998)、 Berzofsky JA" et al" Nat Rev Immunol, 1, 209-219 (2001))、
2. TCRの認識性を向上させるための変更（Fong L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A ., 98, 8809-8814 (2001), Rivoltini L" et al" Cancer Res., 59, 301-306 (1999))、
3.血清中のペプチド分解酵素等による代謝を回避する為の変更 (Berzofsky JA., et al" Nat Rev Immunol, 1, 209-219 (2001), Parmiani G" et al" J Natl Cancer Inst., 9
4. 805-818 (2002), Brinckerhoff LH.， et al" Int J Cancer., 83, 326-334 (1999) )等 が挙げられる。
[0046] 上記変異体における、変異 (置換、挿入、欠失等)するアミノ酸数は、本発明のぺプ チドの有する機能が保持される限り制限はないが、通常 5アミノ酸以内であり、好まし くは 4アミノ酸以内であり、より好ましくは 3アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 1〜2ァ ミノ酸である。また、上記改変が、例えば、配列番号： 1〜3のいずれかに記載のぺプ チドの末端へのアミノ酸残基の付加である場合には、付加されるアミノ酸数は本発明 のペプチドの有する機能が保持される限り制限はないが、通常、 20アミノ酸以内であ り、好ましくは 10アミノ酸以内であり、より好ましくは 5アミノ酸以内であり、さらに好まし くは 3アミノ酸以内であり、最も好ましくは 1〜2アミノ酸である。 [0047] 変異するアミノ酸残基の種類としては、改変前のアミノ酸の性質が保存されている 他のアミノ酸 (改変前のアミノ酸と類似のアミノ酸）に変異されることが望ましい。例え ばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水 性アミノ酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 Aゝ V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有す るアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩 基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y 、 W)を挙げることができる (括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す)。
[0048] あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他 のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドがその生物学 的機能（活性）を維持し得ることはすでに知られている（Mark, D. F. et al, Proc. Natl . Acad. Sci. USA., 81, 5662-5666 (1984)、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids R esearch, 10, 6487-6500 (1982)、 Wang, A. et al., Science, 224, 1431-1433 (1984)、 D albadie— McFarland, G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79, 6409—6413 (1982))。
[0049] 本発明のペプチドのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたペプチドに は、これらペプチドを含む融合ペプチドが含まれる。融合ペプチドは、本発明のぺプ チドと他のペプチドとが融合したものである。融合ペプチドを作製する方法は、本発 明のペプチド（例えば、配列番号： 1〜3に記載のペプチド）をコードするポリヌクレオ チドと他のペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結して これを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよぐ当業者に公知の手法を用 いることがでさる。
[0050] 本発明のペプチドとの融合に付される他のペプチドは、 CTLの誘導目的以外にも、 例えば、該ペプチドの単離'精製、あるいは応用研究等の種々の目的に応じて、適 宜選択することができる。例えば FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology, 6, 1204- 1210 (1988))、 6個の His (ヒスチジン）残基からなる 6 X His、 10 X His,インフルエンザ 凝集素（HA)、ヒト c- mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV- tag 、 E- tag、 SV40T抗原の断片、 lck tag, a -tubulinの断片、 B- tag、 Protein Cの断片等 の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のペプチドとの融合に付さ れる他のタンパク質としては、例えば、 GST (ダルタチオン S—トランスフェラーゼ）、 HA (インフルエンザ凝集素）、ィムノグロブリン定常領域、 /3—ガラタトシダーゼ、 MBP (マルトース結合タンパク質)等が挙げられる。市販されて ヽるこれらペプチド又はべ プチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド と融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合 ペプチドを調製することができる。
[0051] また、本発明のペプチドの融合体を作製する場合、融合箇所に FactorXa,ェンテロ キナーゼまたはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位ペプチド配列を挿入すること もできる。このような場合、上記 GST、 MBP,あるいは FLAGタグのような精製用タグを 付加させたペプチド融合体として発現させ、精製した後、必要に応じてペプチド融合 体のうち、本発明の目的のペプチド以外の領域を、対応する FactorXa,ェンテロキナ ーゼまたはトロンビンのようなプロテアーゼなどにより切断、除去することも可能であり 、有用である。
[0052] また、あるペプチドと機能的に同等なペプチドを調製する当業者によく知られた他 の方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（SambrookJ et al.， Molecular Cloning 2 nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, (1989))を利用する方法が挙げら れる。即ち、当業者であれば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくは その一部をもとに、種々の生物由来（例えば、ェプスタイン-バールウィルス由来）の ポリヌクレオチド試料、あるいは人工的に合成されたペプチドライブラリ一等から、こ れと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、該ポリヌクレオチド力 本発明のぺプ チドと機能的に同等なペプチドを単離することも通常行いうることである。
[0053] 本発明には、本発明の配列番号： 1〜3に記載のペプチドをコードするポリヌクレオ チドとハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるペプチドであって、配 列番号： 1〜3に記載のペプチドと機能的に同等なペプチドが含まれる。
[0054] 配列番号： 1〜3に記載のペプチドと機能的に同等なペプチドをコードするポリヌク レオチドを単離するためのノ、イブリダィゼーシヨンの条件は、当業者であれば適宜選 択することができる。ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、低ストリンジェン トな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダィゼーシヨン後の洗 浄において、例えば 42°C、 0.1 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 0.1 X SSC、 0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば 65°C、 5 X SSC及び 0.1%SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い 相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダィゼー シヨンのストリンジエンシーに影響を及ぼす要素としては温度や塩濃度など複数の要 素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジ ンシーを実現することが可能である。
[0055] また、ハイブリダィゼーシヨンにかえて、遺伝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley&Sons sectionり. 1-6.4)を用いて、本発明者のペプチド（配列番号： 1〜3)をコードするポリヌクレオチド の一部を基にプライマーを設計し、本発明者らにより同定されたペプチドをコードす るポリヌクレオチドと相同性の高!、ポリヌクレオチド断片を単離し、該ポリヌクレオチド を基に本発明者らにより同定されたペプチドと機能的に同等なペプチドを取得するこ とも可能である。
[0056] 上述のハイブリダィゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離されるポリヌクレオ チドがコードする、配列番号： 1〜3に記載のペプチドと機能的に同等なペプチドは、 通常、該ペプチドとアミノ酸配列において、通常高い相同性を有する。本発明のぺプ チドには、配列番号： 1〜3に記載のペプチドと機能的に同等であり、かつ該ペプチド のアミノ酸配列と高い相同性を有するペプチドも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸 レベルにおいて、通常、少なくとも 50%以上の同一性、好ましくは 75%以上の同一性 、さらに好ましくは 85%以上の同一性、さらに好ましくは 95%以上（例えば、 96%以上、 97%以上、 98%以上、 99%以上）の同一性を指す。ペプチドの相同性を決定するには、 文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 726-730 (198 3))に記載のアルゴリズムに従えばよい。
[0057] アミノ酸配列の同一性は、例えば、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:58 73-5877 (1993》によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、 BLAST Xと呼ばれるプログラムが開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215: 403-410 (1 990))。 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば、 sc ore = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合に は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手 法は公知である (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0058] 本発明のペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えペプチドとして、また 天然のペプチドとして調製することが可能である。組み換えペプチドであれば、例え ば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込 み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、 イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のペプチドに 対する抗体をカラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけることにより、ま たは、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可 能である。
[0059] 精製用タグ (例えばヒスチジンタグ)を融合させた組み換えペプチドとして宿主細胞
(例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた融合ぺプ チドは、市販の、融合したタグに対応した精製カラム (ヒスチジンタグの場合ニッケル カラム)を用いて精製することができる。
[0060] 天然のペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば本発明のペプチドを発現 して 、る組織や細胞の抽出物に対し、本発明のペプチドに結合する抗体が結合した ァフィユティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポ リクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよ 、。
[0061] 本発明のペプチドをコードする上記核酸もしくはベクターもまた、本発明に含まれる
[0062] 本発明の核酸 (ポリヌクレオチド）は、本発明のペプチドをコードし得るものであれば いかなる形態でもよい。即ち、 mRNAから合成された cDNAである力、ゲノム DNAであ る力、化学合成 DNAであるかなどを問わない。また、本発明のペプチドをコードしうる 限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる [0063] 本発明の核酸 (ポリヌクレオチド）は、当業者に公知の方法により取得することがで きる。例えば、市販の核酸合成装置を用いて、適宜作製することができる。作製した ポリヌクレオチドの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデォキシヌクレオチドチ イ ンターミネーシヨン法等により確認することができる。
[0064] 本発明のペプチドをコードする核酸は、例えば、遺伝子組換え技術を用いて、本発 明のペプチドを宿主内で産生させる為に重要である。この場合、宿主間でアミノ酸コ ドンの使用頻度（codon usage)が異なる為、産生させる宿主の codon usageに適合す るようアミノ酸のコドンを変更することが望ましい。本発明のペプチドをコードする核酸 は、ワクチンとしても利用可能で、むき出しの核酸として移送することもできるし、また は適切なウィルスもしくは細菌ベクターを用いて移送することもできる（Berzofsky JA., et al, J Clin Invest., 114, 450-462 (2004), Berzofsky JA" et al, J Clin Invest., 113 , 1515-1525 (2004)) o適切な細菌ベクターとしては、サルモネラ属亜種の細菌べクタ 一を挙げることができる。適切なウィルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、ァ デノウィルスベクター、センダイウィルスベクター、レンチウィルスベクター、ワクシニア ベクター等を例示することができる。適切なワクシニアベクターの 1例は、改変ワクシ ニァ ·アンカラベクターである。
[0065] 本発明の核酸の好ましい態様としては、本発明のペプチドを発現し得るベクターを 例示することができる。該ベクターは、通常、プロモーターの下流に本発明の核酸が 機能的に連結された構造の DNA構築物を担持するベクターである。該ベクターとして は、通常、プラスミドもしくはウィルスベクター等が一般的である。
[0066] 当業者にお!ヽては、所望の DNAを有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術に よって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々の発現ベクターを利用 することができる。
[0067] 本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のポリヌクレオチドを保持したり、 本発明のペプチドを発現させるためにも有用である。本発明の核酸 (ポリヌクレオチド
)は、通常、適当なベクターへ担持 (挿入)され、宿主細胞へ導入される。該ベクター としては、挿入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿 主に大腸菌を用いるのであれば、クロー-ング用ベクターとして pBluescriptベクター（ Stratagene社製)などが好まし 、が、巿販の種々のベクターを利用することができる。 本発明のペプチドを生産する目的としてベクターを用いる場合には、特に発現べクタ 一が有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個 体内でペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管 内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であれば pETベクター（Invit rogen社製）、培養細胞であれば pME18S- FL3ベクター（GenBank Accession No. ABO 09864)、生物個体であれば pME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などを 例示することができる。ベクターへの本発明の核酸の挿入は、常法により、例えば、 制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。
[0068] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。ペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞 (例:ストレプトコッ カス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフィ ラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK2 93、 Bowesメラノーマ細胞)及び植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベ クタ一導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法 (Current protoc ols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, bee tion 9.1-9.9)、リポフエクシヨン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法など の公知の方法で行うことが可能である。
[0069] 宿主細胞において発現させたペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または 細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のペプチドに組み込 むことができる。これらのシグナルは目的のペプチドに対して内因性であっても、異種 シグナルであってもよ！/、。
[0070] 上記製造方法におけるペプチドの回収は、本発明のペプチドが培地に分泌される 場合は、培地を回収する。本発明のペプチドが細胞内に産生される場合は、その細 胞をまず溶解し、その後にペプチドを回収する。
[0071] 組換え細胞培養物力 本発明のペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ-ゥ ム又はエタノール沈殿、酸抽出、ァ-オン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホス ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ-ティーク 口マトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィ 一を含めた公知の方法を用いることができる。
[0072] また、動物の生体内で本発明のポリヌクレオチド (核酸)を発現させる方法としては、 本発明の核酸を適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リボソーム法 、カチォニックリボソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。これにより、免疫療法を行うことが可能である。用いられるベクターとし ては、例えば、レトロウイルスベクターなどが挙げられる力 これらに制限されない。ベ クタ一への本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うこ とが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63)。生体内への投与は、 ex vivo法であ っ飞 ¾、 in vivo法であってもよ ヽ。
[0073] 本発明のペプチド（ェプスタイン-バールウィルス特異的 CTLェピトープペプチド） は、能動免疫療法においてペプチドワクチンとして用いることができる。即ち、本発明 の CTLェピトープペプチドを含んでなるワクチンを健常人ある 、は患者に投与し、ェ ブスタイン-バールウィルスに特異的な CTLを体内で増殖させ、疾患に対する予防あ るいは治療に役立てることができる。使用するェピトープペプチドは 1種のみの使用 であっても、あるいはワクチンの使用目的に応じて 2種以上のペプチドを組み合わせ 、混合して使用することもできる。
[0074] 従って本発明は、本発明のペプチドもしくは本発明の核酸を有効成分として含む、 ェプスタイン-バールウィルスの感染および同ウィルス陽性の癌を治療又は予防する ためのワクチンを提供する。
[0075] なお、本発明の「ワクチン」は、「能動免疫療法剤」、「免疫治療剤」、「エブスタイン- バールウィルス関連疾患治療剤」と表現することも可能である。また、本発明におい て「治療剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
[0076] さらに、本発明の CTLェピトープペプチドが提示された抗原提示細胞は、能動免疫 療法にお 、てワクチンとして用いることができる。 CTLェピトープペプチドが提示され た抗原提示細胞とは、
1. 適当な培養液中で、抗原提示細胞と CTLェピトープペプチドを 30分から 1時間 混合したェピトープペプチドパルス抗原提示細胞、 2. CTLェピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細 胞に CTLェピトープペプチドを提示された細胞、
3. 人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞、等を意味する。
[0077] 抗原提示細胞とは、例えば、榭状細胞、 B細胞、マクロファージ、ある種の T細胞等 を示すが、該ペプチドが結合し得る HLAをその表面上に発現する細胞であって、 CT L刺激能を有するものを意味する。人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原 提示細胞とは、例えば脂質 2重膜やブラスティックあるいはラテックス等のビーズに HL Aと CTLェピトープペプチドと 13 2-ミクログロブリンとの 3者複合体を固定し、 CTLを刺 激し得る CD80、 CD83、 CD86等の共刺激分子を固定するか、もしくは、共刺激分子と 結合する T細胞側のリガンドである CD28に対してァゴニスティックに作用する抗体等 を固定することで作製可能である（Oelke M., et al., Nat Med., 9, 619-624 (2003), W alter S., et al" J Immunol, 171, 4974-4978 (2003), Oosten LE., et al" Blood, 104, 224-226 (2004)) o
従って本発明の好ま 、態様としては、本発明のペプチドを HLAに提示した抗原 提示細胞を有効成分とするワクチンを提供する。
[0078] 本発明の核酸は、能動免疫療法において DNAワクチンや組換えウィルスベクター ワクチン等に用いる事ができる。この場合、 CTLェピトープペプチドの核酸配列は、 組換えワクチンや、組換えウィルスワクチンを産生させる宿主に適合した codon usage に変更する事が望ましい（Casimiro, D.R., et al" J. Virol, 77, 6305-6313 (2003), Be rzofsky JA, et al" J Clin Invest., 114, 450-462 (2004)) 0
[0079] 本発明のペプチド、又は本発明のペプチドが提示された抗原提示細胞を含んでな るワクチンは、当分野において公知の方法を用いて調製することができる。例えば、 力かるワクチンの一例としては、本発明のペプチドを有効成分として含有する注射剤 又は固形剤等の薬剤が挙げられる。
[0080] 本発明のペプチドは、ェプスタイン-バールウィルスに対する受動免疫治療剤の調 製に用いることができる。下記のようにして得られたェプスタイン-バールウィルスに特 異的な CTLはヒトアルブミン含有 PBS等に懸濁させて、ェプスタイン-バールウィルス に対する受動免疫療法剤とすることができる。受動免疫療法剤に含まれるェプスタイ ン-バールウィルスに特異的な CTLは、以下のような調製方法によって得ることができ 、 CTLの純度を高める為に精製して用いる事も可能である。
以下に CTLの調製方法の具体例を記載するが、必ずしもこれらの方法に制限され ない。
[0081] (a) CTL調製方法 1
PBMCと、適当な濃度のェプスタイン-バールウィルス特異的ェピトープペプチド テトラマー試薬を反応させる。ェピトープペプチド—テトラマー試薬と結合したェプス タイン-バールウィルス特異的 CTLは標識色素により染色されるので、セルソーター、 顕微鏡などを用いて染色された CTLのみを単離する。このようにして単離されたエブ スタイン-バールウィルスに特異的な CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL- 2等の T細胞刺 激薬剤や、 X照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細 胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0082] (b) CTL調製方法 2
ェプスタイン-バールウィルス特異的ェピトープペプチド モノマー及び Z又はェピ トープペプチドーテトラマー試薬を無菌プレートなどに固相化し、 PBMCを固相化プ レートで培養する。プレートに固相化されたェピトープペプチド モノマー及び Z又 はェピトープペプチドーテトラマーに結合したェプスタイン-バールウィルス特異的 C TLを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレ ート上に残った抗原特異的 CTLだけを新しい培地に懸濁する。このようにして単離さ れたェプスタイン-バールウィルス特異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2等の T細 胞刺激薬剤や、 X照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提 示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0083] (c) CTL調製方法 3
ェプスタイン-バールウィルス特異的ェピトープペプチド モノマー及び Z又はェピ トープペプチドーテトラマー試薬と、 CD80、 CD83、 CD86等の共刺激分子か、もしくは 、共刺激分子と結合する T細胞側のリガンドである CD28に対してァゴニスティックに作 用する抗体等を無菌プレートなどに固相化し、 PBMCを固相化プレートで培養する。 2 日後に IL-2を培地に添加し 5%CO恒温槽にて 37°Cで 7〜10日培養する。培養した細 胞を回収し新たな固相化プレート上で培養を続ける。この操作を繰り返す事で受動 免疫療法に必要な細胞数の CTLを確保する。
[0084] (d) CTL調製方法 4
PBMCある 、は T細胞を本発明の CTLェピトープペプチドで直接刺激する力 該ぺ プチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、又は人工的に作 製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。刺激によって誘導された CTLを 5%CO恒温槽にて 37°Cで 7〜10日培養する。 CTLェピトープペプチドと IL-2、
2
又は抗原提示細胞と IL-2による刺激を週に 1度繰り返す事で受動免疫療法に必要な 細胞数の CTLを確保する。
[0085] なお、本発明のペプチド（ェプスタイン-バールウィルス特異的 CTLェピトープぺプ チド）を使用したェピトープペプチド モノマー及びェピトープペプチドーテトラマー は、公知の方法（US Patent Number 5,635,363, Inventors： J. D. Altman, M. G. Mc Heyzer- Williams , Mark M. Davis, Compositions and methods for the detection, qua ntitation and purification of antigen-specific T cells, French Application Number FR 9911133, Inventor： M. Bonneville, et al., Means for detecting and for purifying CD8 + T- lymphocyte populations specific for peptides presented in the HLA context)に より調製することができる。タンパク質発現用の遺伝子組換え宿主から精製した HLA クラス I分子、 j8 2 ミクログロブリン及び本発明の CTLェピトープペプチドの複合体で ある、 MHC モノマーをバッファー内で形成させる。組換え HLAクラス I分子の C末端 には予めピオチン結合部位を付加しておき、ェピトープペプチド—モノマー形成後こ の部位にピオチンを付加する。市販の色素標識されたストレプトアビジンとピオチン 化工ピトープペプチド モノマーをモル比 1 : 4で混合することによってェピトープぺプ チドーテトラマーを作製することができる。
[0086] また、 CTL調製方法にぉ 、て、特異的 CTLの割合が低 、場合は、随時以下の方法 を用いる事で CTLを高純度で回収する事が可能である。
[0087] (a)ェピトープペプチドーテトラマー試薬による精製
ェプスタイン-バールウィルス特異的ェピトープペプチドーテトラマー試薬と、 CTL 調製方法にて誘導された CTLを反応させ、ェピトープペプチドーテトラマーを標識し ている標識色素に対する抗体等を磁気標識した 2次抗体を用いて分離する事が可能 である。このような磁気標識した 2次抗体と、磁気細胞分離装置は例えば、 Dynal社や Miltenyi Biotec GmbH社から入手可能である。このようにして単離されたェプスタイン -バールウィルス特異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL- 2等の T細胞刺激薬剤で刺激 増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0088] (b)分泌されるサイト力インによる精製
ェプスタイン-バールウィルス特異的 CTLが、放出するサイト力イン等を利用して、ェ プスタイン-バールウィルスに特異的な CTLを精製する事ができる。例えば、 Miltenyi Biotec GmbH社力 入手可能なキットを用いる事で、 CTLから放出されるサイト力イン を細胞表面で特異抗体により補足し、サイト力イン特異的な標識抗体で染色し、続い て磁気標識した標識物質特異的な抗体で染色後、磁気標識細胞分離装置を用いて 精製する事も可能である。このようにして単離されたェプスタイン-バールウィルス特 異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2等の T細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免 疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0089] (c)細胞表面蛋白質特異的抗体を用いた精製
特異的 CTLの細胞表面では、特異的なペプチドの刺激により発現が増強する細胞 表面蛋白質（例えば CD107a、 CD107b、 CD63、 CD69など）が報告されている（Betts MR., et al, J Immunol Methods., 281, 65—78 (2003), Trimble LA., et al, J Virol, 7 4, 7320-7330 (2000))。このような蛋白質の特異抗体を磁気標識する事で、磁気分離 装置等を用いて CTLを精製する事が可能である。また、このような特異抗体に対する 抗 IgG抗体等を磁気標識する事でも同様に CTLの精製が可能である。あるいは、これ ら抗体を培養用のプラスティックプレートにコートし、このプレートを用いて刺激をカロえ た PBMCを培養し、プレートに結合しな力つた細胞集団を洗 、流す事で特異的な CT Lを精製することも可能である。このようにして単離されたェプスタイン-バールウイル ス特異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2等の T細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受 動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0090] 本発明は、上述のようにして取得 ·精製された細胞傷害性 T細胞 (CTL)を有効成分 として含む、ェプスタイン-バールウィルスに対する受動免疫療法剤 (免疫治療剤）を 提供する。
なお、本発明の「受動免疫療法剤」は、「免疫治療剤」、「エブスタイン-バールウイ ルス関連疾患治療剤」、又は「CTL誘導剤」と表現することも可能である。
本発明の受動免疫療法剤の好ましい態様としては、本発明のペプチド、もしくは該 ペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるェ ブスタイン-バールウィルス特異的な細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、エブ スタイン-バールウィルスに対する受動免疫療法剤である。
[0091] また、別の態様としては、本発明のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複 合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応 させ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テト ラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得 られる細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスに対 する受動免疫療法剤である。
[0092] 本発明の薬剤 (本発明のワクチンもしくは受動免疫療法剤等）は、生理学的に許容 される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは 非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル 剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注 射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤に は、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用 薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明 の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
[0093] 例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、及び滑 沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。
[0094] 例えば、本発明のペプチドが提示された抗原提示細胞は、製薬上許容され、該ぺ プチド又は該細胞の活性と相容性を有する賦形剤、例えば、水、食塩水、デキストロ ース、エタノール、グリセロール、 DMSO (dimethyl sulphoxide)、及びその他のアジュ バント等、又はこれらの組み合わせと混合して用いることができる。さらに、必要に応 じて、アルブミン、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。崩壊剤としては、炭 酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般的に用いられる。結 合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドン が用いられる。滑沢剤としては、タルクゃステアリン酸マグネシウム等が公知である。
[0095] 本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコー ティングを施すことができる。コーティング剤には、ェチルセルロースやポリオキシェ チレングリコール等を用いることができる。
[0096] また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒 に溶解、あるいは分散させること〖こより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶 剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生 理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油ゃプ ロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存 剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩ィ匕ナトリウムゃブドウ糖等の公知の 等張化剤をカ卩えることができる。更に、塩ィ匕ベンザルコ-ゥムゃ塩酸プロ力インのよう な無痛化剤を添加することができる。
[0097] また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外 用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたもの と同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当 な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、ェチル アルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、 一般にベントナイト、ポリビュルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビ -ルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の保存剤 を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロー ス誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
[0098] また、本発明のペプチドは、中性又は塩の形態で処方することができ、例えば、薬 学上許容され得る塩としては、塩酸、リン酸などの無機塩、又は、酢酸、酒石酸など の有機酸が挙げられる。
[0099] 本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により 直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる 。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ヘル ぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、レトロウイノレスベタター、レンチウ ィルスべクタ一等が挙げられ、これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投 与することができる。
[0100] また、本発明の薬剤をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投 与することも可能である。例えば、本発明のペプチドもしくはベクターを保持させた小 胞体をリボフヱクシヨン法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例え ば静脈内、動脈内等に全身投与する。
[0101] 本発明の薬剤は、非経口投与及び経口投与により投与することができるが、該薬剤 がペプチドを主成分とする場合には、一般的に非経口投与が好ましい。非経口投与 としては経鼻投与や皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等の注射剤、座薬等がある 。また、経口投与としては、スターチ、マン-トール、ラタトース、ステアリン酸マグネシ ゥム、セルロース等の賦形剤との混合物として調製することができる。
[0102] 本発明のワクチンは、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免 疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により決定される。通常、適当な投 与量は、患者一人当たり、本発明のペプチド（ェピトープペプチド）では l〜100mg、 ェピトープペプチドパルス細胞では 106〜109個の含有量とする。また、投与間隔は、 対象、目的により設定することができる。
[0103] また本発明の薬剤によって予防もしくは治療効果が期待されるェプスタイン-バー ルウイルス関連疾患としては、例えば、バーキットリンパ腫 (BL)、ホジキン病（HD)、 鼻咽頭癌 (NPC)、または移植後リンパ増殖性疾患 (PTLD)等の悪性腫瘍を挙げるこ とがでさる。
[0104] 本発明の薬剤（ワクチン等）が接種可能な動物としては、免疫系を有し、かつェプス タイン-バールウィルスに感染し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくは、 ヒトである。
[0105] さらに本発明は、本発明のペプチドを用いて、細胞傷害性 T細胞を誘導することを 特徴とする、細胞傷害性 T細胞の誘導 (活性化)方法を提供する。
[0106] 本発明の誘導方法の好ま 、態様としては、本発明のペプチド (例えば、 HLA-A24 等拘束性抗原ペプチド)と、末梢血単核球を血漿を含む培地中で接触させることによ り、ェプスタイン-バールウィルス特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)を誘導する方法 に関する。
[0107] また、上記方法によって誘導されたェプスタイン-バールウィルス特異的 CTLを検出 及び定量する方法もまた本発明に含まれる。
[0108] また、上述の方法によって誘導されたェプスタイン-バールウィルス特異的な細胞 傷害性 T細胞は、ェプスタイン-バールウィルスに対する受動免疫療法剤の成分とな り得る。従って、上述の方法によってェプスタイン-バールウィルス特異的な細胞傷害 性 T細胞を誘導し、該 T細胞を取得することによって、受動免疫療法剤を製造するこ とが可能である。
[0109] 本発明は、本発明のェプスタイン-バールウィルス特異的な細胞傷害性 T細胞の誘 導方法を用いた受動免疫療法剤の製造方法を提供する。
[0110] 本製造方法の好ま 、態様としては、本発明のペプチドもしくは該ペプチドを HLA に提示した抗原提示細胞によって末梢血リンパ球を刺激してェプスタイン-バールゥ ィルス特異的な細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む方法である。
[0111] また好まし 、別の態様にぉ 、ては、本発明のペプチドから調製した主要組織適合 性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球 とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合 体-テトラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離 して得られる細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む、ェプスタイン-バールウイル スに対する受動免疫療法剤の製造方法である。
[0112] 上記製造方法には、上述の工程に加えて、必要に応じて、「取得される細胞傷害性 T細胞へ薬学的に許容される担体を混合する工程」を含んで 、てもよ 、。
[0113] さらに本発明のペプチドを用い作製した、 MHC—テトラマー試薬は、特異的な CTL の定量だけでなく細胞内サイト力イン産生細胞定量法や細胞表面蛋白質に対する特 異抗体と組み合わせることで、特異的 CTLの分ィ匕段階や機能性も同時に判定する事 が可能である。
本発明はさらに、本発明のペプチドを利用したェプスタイン-バールウィルスに特異 的な細胞傷害性 T細胞の定量 (検出 ·測定)方法を提供する。
[0114] ェプスタイン-バールウィルスに特異的な CTLが、ハイリスクの患者 (何らかの原因 により免疫能が低下した人、先天性免疫不全症患者、又は骨髄移植、造血幹細胞 移植、臍帯血移植、固形臓器移植を受けて拒絶予防のために免疫抑制剤の投与を 受けている患者、慢性ウィルス感染症患者、エイズ患者、高齢者、幼小児、妊婦等） の末梢血に存在するカゝ否かを知ることは、抗ウィルス剤や免疫抑制剤の適正な使用 を含め、これらの感染症管理の上で重要な情報である。ェプスタイン-バールウィルス に特異的な CTLの定量は、例えば、本発明のペプチド (CTLェピトープペプチド)を 用いた以下の 3つの方法によって行うことができる力 必ずしもこれらの方法に制限さ れない。
[0115] (a)定量方法 1
本発明の CTLェピトープペプチドを使用して作製した MHC—テトラマー試薬を用 ヽ て、末梢血中のェプスタイン-バールウィルスに特異的な CTLを定量することができる 。定量は、例えば、以下のようにして実施することができる。末梢血あるいは PBMCを 、適当な濃度のェピトープペプチドーテトラマー試薬と反応させる。該ェピトープぺプ チドーテトラマー試薬と結合した CTLは標識色素により染色されるので、フローサイト メーター、顕微鏡等を用いてカウントする。ェピトープペプチド—テトラマー試薬と反 応させる時に、ェピトープペプチドーテトラマー試薬と異なる色素で標識された抗 CD 3抗体、抗 CD4抗体、抗 CD8抗体等を反応させる事で、ェプスタイン-バールウィルス に特異的な CTLの T細胞サブセットも同時に判定できる。
[0116] (b)定量方法 2
PBMCを本発明の CTLェピトープペプチドで刺激することによって CTLが産生する I FNI (interferon gamma)、 TNF (tumor necrosis factor)、インターロイキン等のサイト力
Y
イン及び Z又はケモカインを定量する方法である。以下に IFN
Yを例にとり具体的に方 法を示す。
[0117] b— 1 サイト力イン定量による方法 1 (細胞内 IFN産生細胞定量）
Y
PBMCを適当な培地におよそ 2 X 106/mLの細胞濃度で浮遊させ、本発明の CTLェ ピトープペプチドをカ卩える。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤（例えば、 Brefeldin Aや Mo nensin等）をカ卩え、 5%CO恒温槽にて 37°Cで 5〜16時間培養する。培養後、 T細胞マ
2
一力一抗体 (抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗 CD8抗体)あるいは Zまたは、ェピトープ ペプチドーテトラマー試薬と反応させ、細胞を固定後、膜透過処理を行い、色素標識 抗 IFN抗体を反応させる。フローサイトメーター等を用いて解析し、全細胞中、 T細胞
Y
中あるいはェピトープペプチドーテトラマー陽性細胞中の IFN陽性細胞率を定量す
Y
る。
[0118] b- 2 サイト力イン定量による方法 2 (エリスポットアツセィ）
抗 IFN抗体を固相化した 96穴 MultiScreen- HAプレート (Millipore社)に PBMCをまく γ
。ェピトープペプチドを各穴に入れ 37°Cの 5%CO恒温槽培養器にて 20時間培養する
2
。翌日、プレートを洗浄し、抗 IFN抗体、ペルォキシダーゼ標識抗 IgG抗体の順で反
Y
応させる。さらにペルォキシダーゼの基質をカ卩え、発色により IFNスポットを可視化し
Y
、実体顕微鏡でカウントする。
[0119] b— 3 サイト力イン定量による方法 3 (培養上清中に分泌された IFNを定量する方法
Y
)
PBMCを適当な培地におよそ 2 X 106/mLの細胞濃度で浮遊させ、本発明の CTLェ ピトープペプチドをカ卩える。 5%CO恒温槽にて 37°Cで 24〜48時間培養する。培養後、
2
上清を回収し、その中に含まれる IFN濃度を市販の ELISAキット（例えば MBL社の H γ
UMAN IFN gamma ELISA)を使用して定量する。
[0120] (c)定量方法 3
細胞表面蛋白質特異的抗体を用いて定量を行う。特異的 CTLは、特異的なぺプチ ドの刺激により細胞表面に発現が増強する細胞表面蛋白質 (例えば CD107a、 CD10 7b、 CD63、 CD69など）が報告されている。このような蛋白質を特異的に認識する標識 抗体と、ペプチド刺激した PBMC等を混合する事で、標識抗体と結合した CTLは標識 色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。標 識抗体と反応させる時に、同時にあるいは、順番に、標識抗体と異なる色素で標識さ れた抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗 CD8抗体等を反応させる事で、ェプスタイン-バー ルウイルスに特異的な CTLの T細胞サブセットも同時に判定できる。
[0121] 本発明の定量方法の好ましい態様として、具体的には、上述の（a)〜（c)の定量方 法を挙げることができる。
従って本発明の定量方法の好ま ヽ態様は、本発明のペプチドで末梢血を刺激し 、該ウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞を取得し、細胞傷害性 T細胞が産生する サイト力イン及び Z又はケモカイン及び Z又は細胞表面分子を測定することを特徴と する、ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 τ細胞の定量方法に関す る。
[0122] また、 MHC—テトラマー（またはモノマーもしくは多量体)試薬は、前述のように特異 的な CTLの分離精製特異的な CTLの定量だけでなぐ特異的な CTLの定量に用い る事ができ、別の態様としては、本発明のペプチドから MHC—テトラマー試薬を調製 し、 MHC—テトラマー試薬と末梢血とを反応させることを特徴とする、該末梢血中の ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞の定量方法に関する。 上記方法にぉ 、ては、被検者力 予め取得 ·単離された末梢血試料を用いることが できる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0123] 以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され るものではない。
[0124] 〔実施例 1〕細胞株および榭状細胞の調製
本発明者らは、まず EBV関連タンパク質のうち、 LMP1に特異的な CTLクローンの誘 導を行い、 LMP1由来のェピトープの同定を行った。
LMP1由来のェピトープの同定に関連する実験（実施例 1〜8)に用いられた、細胞 株および榭状細胞の調製方法について以下に示す。
[0125] 愛知県がんセンター (日本)の倫理審査委員会によって承認された研究デザインと 目的は、すべてのドナーに十分に説明され、インフォームド 'コンセントを得た。
[0126] EBVが感染した LCLを、公知の方法で作製し（Kuzushima, K., et al.， Blood, 94, 30
94-3100 (1999))、 10%ゥシ胎仔血清 (PAA Laboratories, Pasching、オーストリア)、 2m
M L-グルタミン、 50U/mLのペニシリン、 50 μ g/mLストレプトマイシンと 50 μ g/mLの力 ナマイシンを加えた RPMI1640(Sigma Chemical Co.,米国 St. Lois, MO)で培養した。
[0127] EBVを保持している NK細胞株、 SNK- 6 (Nagata, H., et al.， Blood, 97, 708-713 (20 01))と SNK- 10 (Zhang, Y" et al., Br J Haematol, 121, 805-814 (2003))は清水博士（ 東京医科歯科大学、東京、 日本)カゝら供与された。別の EBVを保持している NK細胞 株である HANK- 1 (Kagami, Y.， et al., Br J Haematol, 103, 669-677 (1998))は鏡味 博士 (愛知県がんセンター病院、名古屋、 日本)力 供与された。この 3つの細胞株は 当業者に公知の方法で培養した（Nagata, H., Blood, 97, 708-713 (2001))。
[0128] HEK-293T細胞 (American Type Culture Collection,米国マナッサス (ヴァージ -ァ） )と Phoenix— GALV細胞（Akatsuka, Y., et al., Tissue Antigens, 59, 502—511 (2002)) ( Kiem博士、フレッドハッチンソン癌研究センター、および Nolan博士、スタンフォード大 学、米国スタンフォード、カリフォルニア力も供与された)を、公知の方法で培養した。 HLA遺伝子のレトロウイルスへの導入は、公知の方法で行った（Kondo, E., et al., J I mmunol., 169, 2164-2171 (2002)) 0
[0129] また、榭状細胞を公知の方法で調製した（Romani N, et al., J Exp Med. 1994;180:8 3-93, Sallusto F, et al" J Exp Med. 1994;179:1109-1118, Dauer M, et al" J Immun ol. 2003;170:4069-4076) o CD8+T細胞を、 PBMCs力ら CD8 MicroBeads(Miltenyi Bio tec、ベルギッシュグラートバハ (ドイツ))を用いて分離し、— 135°Cで保存した。
[0130] CD8を除 、た PBMCを、 5%のヒトの血清 (MP Biomedicals, Aurora, OH)と 2mMの L— グルタミン、 50U/mLのペニシリン、 50 μ g/mLのストレプトマイシン、 50 μ g/mLのカナ マイシンを含む 4mLの RPMI1640培地 (DC培地)に懸濁し、 6ゥエルプレートの一つの プレート中で 37°C、 2時間インキュベートした。
[0131] 非接着性細胞を穏やかにピペッティングすることで取り除き、接着細胞を 50ng/mL の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM- CSF、 Osteogenetics、 Wuerzburg、ド イツ)と lOng/mL IL- 4(Osteogenetics)を含む DC培地で培養した。 2日目と 4日目〖こ、半 分の培地を、 GM-CSFと IL-4を含んでいる新鮮な DC培地に交換した。 6日目に、榭 状細胞を集め、 mRNAを導入するため、エレクト口ポレーシヨンを行なった。
[0132] CD40刺激で活性化された B細胞 (CD- 40B)を、米国ボストン、 MAにある Dana-Farb er癌研究所の Freeman博士力も供与された 3T3NIH/ヒト CD40リガンド細胞を利用して 、公知の方法に従って作成した（Kondo, E., et al.J Immunol, 169, 2164-2171 (200 2)) o
[0133] 〔実施例 2〕欠失変異体 Δ LMP1 mRNAの作成
欠失変異体 ALMP1を発現して ヽる抗原提示細胞を作製するために、本発明者ら は、 pcDNA/ A LMPlプラスミド力もインビトロ転写システムを用いて、欠失変異体 A L MP1 mRNAを産生した。
[0134] N末から 43アミノ酸を削った欠失変異体 A LMPl (Gottschalk, S., Blood, 101, 1905 -1912 (2003))を作製する為に、 EBV株 B95- 8(NCBI accession no.V01555)の cDNAを テンプレート、 5し AAGCTTGCCACCATGAGTGACTGGACTGGA- 3' (配列番号： 23 )をセンスプライマー、 5 '—TTGAATTCTTAGTC ATAGTAGCTTAGCTGA-3 ' (配列 番号： 24)をアンチセンスプライマーとして、 PCRを行った。欠失変異体 A LMP1のアミ ノ酸配列および DNA配列を、配列番号: 34および 35に示す。出来上がった DNA断片 を、 Hindlllと EcoRI制限酵素認識部位を使って、 pcDNA3.1(+) (Invitrogen,米国カー ルスバッド (CA))に挿入した（pcDNA/ Δ LMP1)。 Δ LMP1力 更に N末端及び C末端 のアミノ酸を削った欠失変異体を作るために、切断断片を pcDNA/ Δ LMP1をテンプ レートとして PCRで作製し、 pcDNA3.1(+)に挿入した。幾つかの短い LMP1ペプチド断 片をコードするプラスミドを構築するために、各相補的塩基配列オリゴヌクレオチドの ペアをァニールし、制限酵素で切断した pcDNA3.1(+)に挿入した。
[0135] A LMP1と蛍光蛋白 EGFP(Kondo, E., et al, J Immunol, 169, 2164-2171 (2002)) の cDNAを pMSCVpuroというレトロウイルスベクター (BD Biosciences Clontech、米国 パロアルト (CA))に挿入し、 pMSCVpuro/ Δ LMP1及び pMSCVpuro/EGFPを作製した 。ショートヘアピン RNA(shRNA)干渉レトロウイルスベクターを、 RNAi- Ready pSIREN- RetroQベクター (BD Biosciences Clontech)を用いて構築した。
[0136] レトロウイルス生産細胞を確立するために、 pMSCVpuro/ Δ LMP1、 pMSCVpuro/EG FPと RNAi- Ready pSIREN- RetroQ系の様々なベクターを Lipofectamine2000(Invitrog en)を利用して PT67細胞 (BD Biosciences Clontech)の中に組み込んだ。 LCL細胞を、 8mg/L polybrene(Sigma Chemical Co.)を含むレトロウイルス培養上清で感染させ、 1 時間 32°C、 1000xgで遠心分離し、 2日間 37°Cで培養した。その後、この LCL細胞を、 プロマイシン 0.8 μ g/mLの存在下で更に 14日間培養した。 EGFPと LMP1の発現をフ ローサイトメトリーで解析した。
[0137] 〔実施例 3〕欠失変異体 Δ LMP1 mRNAの細胞への導入および、細胞における Δ LMP 1の発現確認
T7プロモータ領域と Δ LMP1をコードする領域を含む断片を、 pcDNA/ Δ LMP1をテ ンプレートとして PCRで作製した。増幅された DNAは、 5 ' -capped mRNAのインビトロ 転写の際のテンプレートとして利用された。 5，-capped mRNAのインビトロ転写を、 mM ESSAGE mMACHINEキット（Ambion,米国 Austin, TX)を用いて行った。
[0138] 次に、 polyAポリメラーゼ (Ambion)を用い 3' polyA末端を追加し、 RNeasyキット (QIAG EN、 日本、東京)によって精製した。
[0139] エレクト口ポレーシヨンに先立ち、榭状細胞と CD40-B細胞を、無血清の RPMI1640 を用いて二回洗浄し、最終的に 2.5 X 107細胞/ mLとなるように調整した。 40 Lの RP Ml 1640培地中で 20 gの mRNAと混合した後に、 2mmのセルの中に入れ Electro Squ are Porator ECM830(ハーバード Apparatus、ホリストン (MA))を用いてエレクト口ポレー シヨンを行った。条件設定は榭状細胞に対しては 450V、 500 S、 CD40-B細胞に対し ては 350V、 350 μ Sに設定した。
[0140] エレクト口ポレーシヨンの後、榭状細胞の場合は IL-4と GM- CSFを追加した DC培地 の中で 3時間培養し、成熟させるために TNF- a (PeproTech,米国 Rocky Hill, NJ)、 IL -1 β (PeproTech)と PGE (Cavman Chemical,米国 Ann Arbor, MI)を加えた。 CD40— B
2
細胞を、直ちに放射線照射した NIH/3T3-ヒト CD40リガンド細胞の上に播いて、 36-4 8時間後抗原提示細胞として使用した。
[0141] LMP1抗原の細胞内染色はわずかな変更以外、公知の方法により行われた（Gottsc halk, S.， et al.， Blood, 101, 1905-1912 (2003))。エレクト口ポレーシヨンで遺伝子導 入された細胞^^め、 10分間室温で、 4%パラホルムアルデヒドをカ卩えた PBS中で固定 した。 PBSで洗浄してから、細胞は IC Perm (BioSource International,キヤマリ口、米 国カリフォルニア州)で膜透過処理され、 30分間 4°Cで LMP-1の C末端を認識するモノ クローン抗体 (CS 1-4、 DAKO Cytomation、 Glostrup、デンマーク)と反応させた。 PBS で洗浄した後、細胞はフルォレセインイソチオシァネート (FITC)標識抗マウス IgG(H+ L)(Immunotech、マルセイユ (フランス》で 30分間 4°C染色した。染色した細胞を、 Cell
QUESTソフトウェア (BD Biosciences,米国サンノゼ、カリフォルニア州)を使用した FA し SCallibur(BD Biosciencesバこよつ 分^ Γし 7こ。
[0142] フローサイトメトリーで Δ LMP1の発現を解析した結果、榭状細胞と CD40-B細胞の 両方の 70%以上が A LMP1陽性であることが明らかとなった（図 1A)。エレクト口ポレー シヨン後 36-48時間で、生存細胞は 8割以上であった (データは示さな！/、)。
これらの細胞を、抗原提示細胞として、血清反応陽性献血者 5人から LMP1特異的 な T細胞の誘導を試みた。
[0143] 〔実施例 4〕 A LMPl mRNAを導入した榭状細胞を用いた、 A LMP1特異的 CTLクロー ンの誘導
次に、 Δ LMP1特異的 CTLクローンの誘導を以下の工程により行った。
[0144] 保存された CD8+T細胞を、解凍し洗浄してから、 10%ヒト血清、 2mM L-グルタミン、 5 OU/mLペニシリン、 50 μ g/mLストレプトマイシン、 50 μ g/mLカナマイシン、 25ng/mL I L-7(R&D Systems,ミネアポリス (米国ミネソタ州》と 5ng/mL IL- 12(R&D Systems)をカロ えた RPMI1640倍地 2mLにおいて、 5%COカロ湿インキュベーターの中で、 33Gyの放
2
射線を当てた自己の Δ LMPl-mRNA導入榭状細胞と共培養した。 8日目と 15日目に 、 Δ LMPl-mRNAを導入し γ -放射線を照射した榭状細胞及び CD40-B細胞で、 Τ細 胞を再び刺激した。各刺激の 1日後に、 IL-2(塩野義、大阪、 日本)を 20U/mLの濃度 になるように加えた。 T細胞クローンを確立するために、公知の方法で（Kuzushima, K ., et al., Blood, 98, 1872-1881 (2001))、 96穴丸底ゥエルのを用いてポリクローン CTL の限界希釈法を実施した。
[0145] 2週間の培養後、増殖しているゥエルを 3つに分けて、その中の一部ずつをエフエタ ター細胞として、それぞれ Δ LMPl-mRNAや EGFP-mRNAを導入した自己の CD40-B 細胞の CTLアツセィに用いた。 LMP1- mRNAを導入した CD40- B細胞の一分あたりの 放射カウントが、 EGFP-mRNAを導入した CD40-B細胞の一分あたりの放射カウントの 平均の標準偏差の三倍を超えた場合に、そのゥエルを陽性として記録した。陽性ゥェ ルをフラスコに移して、公知の方法によって増殖させた（Kuzushima, K., et al., Blood , 98, 1872-1881 (2001))。 [0146] Δ LMPl-mRNAを導入し γ -放射線を照射した榭状細胞及び CD40-B細胞につ!ヽ て 3回の刺激の後、 Τ細胞株の特異性を調べる為に ELISPOTアツセィを行った。
ELISPOTアツセィは、公知の方法によって実施した（Kuzushima, K., et al., Blood, 94, 3094-3100 (1999), Kondo, E" et al., J Immunol, 169, 2164-2171 (2002), Kuzus hima, K., et al., Blood, 98, 1872-1881(2001))。 CD8+T細胞を、抗ヒトインターフエ口 ン γ (IFN y )モノクローン抗体 (Pierce Biotechnology,フィラデルフィア (PA))でコーティ ングされた Multiscreen- HAプレート (MAHA S4510; Millipore,米国ビルリカ (MA州》の ゥエルの中で、様々な刺激因子と共に培養した。
[0147] 刺激因子として、 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)を用いてプラスミドを導入した HLA- A*0206陽性あるいは陰性 LCL細胞（1ゥエル当たりに 10万細胞）、又は HLA-A*0206 を発現する HEK-293T細胞 (A0206-295TX1ゥ ル当たり 5万細胞)を、 T細胞をカ卩える 48時間前に各ゥエルに播いた。ペプチドタイトレーシヨンアツセィを行うために、いくつ かの濃度の合成ペプチド (Greiner, Frickenhausen, Germany)を 1時間室温で A0206- 295T細胞にパルスした。抗ゥサギ IFN γポリクローナル抗体 (Pierce Biotechnology)で プローブした後、ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ IgG抗体と反応させて (Genzyme、米 国ケンブリッジ、 MA州)スポットを視覚化し、プレートを洗浄し乾燥させた。 IFN yのス ポットを、実体顕微鏡を用いて計測した。
[0148] 上記の結果、 5人のドナーのうちの 1人由来のポリクローナルな T細胞は、 A LMP1- mRNAを導入した自己の CD40-B細胞に反応して、特異的に IFN- γを分泌したが、 非変異導入 CD40-B細胞に対しては IFN- γを分泌しないことが明ら力となった（図 1B
) ο
[0149] ノ レク CTL株から、限界希釈法を用いて、 Η7と名前を付けた Τ細胞クローンを確立 した。 Η7は A LMPl-mRNAを導入した自己の CD40-B細胞を溶解したが、 EGFP-mR NAを導入した CD40-B細胞を溶解しな力つた (データは示さな 、）。血液ドナーの遺 伝子型（HLA)を調べた所、 HLA-A*0206、 A*2402、 B*0702、 B*4801、 Cw*0304、お よび Cw*0702であることが明らかになった。 CTLェピトープを提示する HLA分子を特 定するために、レトロウイルスベクターを用いて各 HLA遺伝子を導入し、完全に HLA をミスマッチした LCLが利用された。 H7は HLA-A*0206を導入した LCLと培養したとき に、 IFN- γスポットを作ったので、 HLA_A*0206がェピトープを提示する分子であるこ とを示している（図 1C)。
[0150] 〔実施例 5〕 LMP1ェピトープの同定
HLA-A2スーパータイプに存在するペプチド YLLEMLWRL (配列番号： 25)を除き、 HLA-A*0206拘束性の LMP1由来ェピトープはこれまでに報告されて ヽな 、。 H7は ペプチド YLLEMLWRL (配列番号： 25)で IFN- yスポットを作らなかった（データは示 さない）こと力ら、 H7が認識するェピトープの同定を行った。
C末端側を削ったいくつかの Δ LMP1- mRNAをエレクト口ポレーシヨンで自己の CD4 0-B細胞に導入し、 H7に認識されるかどうかを ELISPOTアツセィで検討した。
図 2Aに示されるように、抗原性はアミノ酸残基 70と 77の間の C-末端トランケーシヨン で失われたことから、ェピトープの C-末端はアミノ酸残基 71と 77の間に位置すること が明らかとなった。
[0151] プラスミドを導入した A0206- 293T細胞のほうが CD40- B細胞および mRNAより調製 が簡便であることから、以降の検討においては、 C末端側を削った A LMPl-mRNAを 含んだプラスミドが導入された A0206-293T細胞を用いた。 A0206-293T細胞を抗原 提示細胞として用いた際には、 C-末端トランケーシヨンがアミノ酸残基 77と 88の間に 及んだときに、抗原性が失われた (データは示していない)。 CD40-B細胞を使ったデ ータとの不一致の理由は不明である。ここでは、アミノ酸残基 88で C-端末を削った L MP1を使用した。 N-末端側に更に削除を加えた一連のプラスミドを用意し、分析した (図 2B)。最も短い刺激断片はアミノ酸残基 64-83と特定された。 N-末端と C-末端を 正確に特定する為に、更に近辺のトランケーシヨンを行った。
[0152] 図 2Cに示されているように、アミノ酸残基 64- 71 (IIILIIFI、配列番号： 18)をコードす るプラスミドが最も強い抗原性を示したが、アミノ酸残基 64か 71を削除すると抗原性は 完全に失われた。
[0153] アミノ酸残基 64-71は H7の最短ェピトープを構成する可能性がある力 発現べクタ 一のスタートコドンによってコードされる N-末端のメチォニン力 63位におけるイソロイ シンの代用となり、 MHC結合と H7認識のための構造的な必要性を満たしている可能 性がある。この点を明確にするために、合成した 8アミノ酸ペプチド (アミノ酸残基 64-7 1： IIILIIFI、配列番号： 18)と 9アミノ酸ペプチド（アミノ酸残基 63-71： IIIILIIFI、配列番 号： 1)を A0206-293T細胞にパルスし、 H7の反応性を ELISPOTアツセィで検討した。 その結果、図 2Dで示されるように、 9アミノ酸ペプチドだけが H7によって認識され、最 短のェピトープは位置 63のイソロイシン力も始まることが示された。
[0154] 〔実施例 6〕免疫プロテアソームサブユニット ip- LMP7の LMP1 63- 71ェピトープの産 生における重要性につ 、ての検討
LMP1導入細胞の抗原処理に関して、 ELISPOTアツセィで 2つの不一致が観察され た。
(1) H7は全長 Δ LMP1- mRNAを導入した CD40-Bを認識した（図 2A)力 同じ配列を 発現しているプラスミドを導入した A0206-293T細胞を認識しなかった。
(2) H7はアミノ酸残基 44 77をコードするトランケートされた Δ LMPl-mRNAを導入し た CD40-Bを認識した（図 2A)が、同じ配列を発現しているプラスミドを導入した A0206 - 293T細胞を認識しなかった。
[0155] ここで本発明者らは、抗原処理機構の違いが LMP1ェピトープ産生における不一致 の原因であるという仮説を立てた。 A0206-293T細胞では主に標準プロテアノームが 発現して!/、るが、 CD40-B細胞と LCL細胞の場合は免疫プロテアゾームが優勢である (Frisan, T., et al" Int J Cancer, 2000; 88: 881-888, Morel, S., et al., Immunity 200 0; 12: 107-117)。標準プロテアゾームは抗原処理経路に重要な役割を持ち、細胞は 免疫反応中に IFN- γに晒されると、低分子重蛋白 2(ip-LMP2)や低分子重蛋白 7(ip- LMP7)のような新しく合成されたの免疫プロテアゾーム βサブユニットの誘導により、 免疫プロテアゾームが構築され、プロテアゾーム活性は量的にも質的にも変化する。
[0156] 免疫プロテアゾームの効果がェピトープ処理に必要であるかどうかを調べるために 、免疫プロテアゾームのサブユニットの発現が抑制されている LCL細胞を用いた。 ip- LMP7と ip- LMP2は、膜貫通タンパク質（例えば、 EBV-LMP2 (Lautscham, G., et al., J Virol, 77: 2757-2761(2003)) , MAGE- 3 (Levitskaya, J" et al" Nature 375: 685-6 88 (1995))のェピトープ産生に関して不可欠な分子として知られているので、この二 つを siRNAの標的として利用した。
[0157] 本発明においては、以下の siRNA標的を選択した。即ち、 ip-LMP2については、 AA GUGAAGGAGGUCAGGUAUA (配列番号： 26)、 ip- LMP7につ!/ヽては AGAUUAAC CCUUACCUGCUTT (配列番号： 27)を選択した。
shRNA構造物は、その後に 5T終止シグナルが続ぐセンスとアンチセンス配列を分 かつ TTCAAGAGA-ループを含んでいる。これらの構造物は、 2つの相補的 DNAオリ ゴヌクレオチドとして合成され、ァニールされ、ベクターの BamHIと EcoRI制限酵素認 識部位の間に挿入された。更に、ネガティブコントロール siRNA(BD Biosciences Clon tech)が同じベクターに挿入され、コントロールとして使われた。クローン化された遺伝 子は配列を解析してその同一性を確認した。
ip- LMP2と ip- LMP7の発現を、公知の方法（Schwarz, K., et al., J Immunol, 165, 7 68-778(2000), Tajima, K., et al" Int J Cancer, 110, 403-412 (2004))、すなわちゥェ スターンブロッテイング法により評価を行った。
[0158] その結果、図 3Aに示すように、対応する shRNA-ベクターを導入した LCL細胞では 、 ip-LMP7あるいは ip-LMP2の発現は有意に減少していた。遺伝子抑制による LMP1 ェピトープ産生における遺伝子抑制の効果は、 ELISPOTアツセィで評価した。興味 深いことに、 H7クローンによる IFN- γのスポットの産生は ip- LMP7を発現抑制した LC Lで刺激したときには有意に減少した力 ip-LMP2の発現抑制はほとんど効果を示さ なかった（図 3B)。
上記の結果より、 LMP1ェピトープの処理と提示には、 ip-LMP7が不可欠であること が明らかとなった。
[0159] 〔実施例 7〕 LMP1特異的 CTLクローンの LCL細胞に対して細胞傷害性活性の測定 次に、 H7の LCLに対する傷害活性を調べた。 CTLアツセィは以下の工程により行つ た。標的細胞を 37°Cで 1.5時間 Ciクロム (51Cr)でラベルし洗浄して、指示されたェ フエクタ一と目的の割合になるように 96穴プレート中で CTLと混合した。 37°Cで 4時間 または 16時間培養した後に、上清の放射活性を γ計測器で数えた。特異的51 Cr放出 の割合は次のように計算した。： 100x(実験的な放出-自然発生的な放出)/ (最大放出 -最小放出）
[0160] 標準的な CTLアツセィにより、 H7は 4時間のインキュベーションでは HLA-A0206陽 性 LCL細胞を効果的に溶解できない（データは示さない）力 16時間後に自己及び H LA-A0206陽性の同種 LCL細胞を溶解することが示された（図 4A)。このことは、 H7を 介した細胞溶解のための LCLにおける LMP1の発現が、 4時間での CTLアツセィにお いては、不十分であることを示唆している。
そこで、図 4Bに示すように、標的細胞として A LMP1を強制発現させた LCLで実験 を行ったところ、 H7は 4時間 CTLアツセィで Δ LMP1を発現させた LCLを特異的に溶 解したが、 EGFPを発現させた LCLは溶解しなかった。
[0161] 〔実施例 8〕 EBVが感染した NK細胞株に対する LMP1特異的 CTLクローンの細胞傷害 性活性の検討
EBV LMP1は他の蛋白と共に潜伏感染様式 IIIとして LCL細胞に発現され、潜伏感 染様式 IIとして NK/T細胞に発現される（Zhang, Y., et al., Br J Haematol, 121, 805—8 14 (2003)) oそこで、 EBV潜伏感染様式 II型の悪性腫瘍の代表として、 EBV陽性 NK 細胞株（Nagata, H., et al" Blood 2001; 97: 708—713, Zhang, Y" et al., Br J Haemat ol, 121, 805-814 (2003), Kagami, Y" et al" Br J Haematol, 103, 669-677 (1998))に 対する H7細胞の傷害活性を検討した。検討した LMP1を発現して 、る 3つの NK細胞 株の内、 2つは HLA-A*0206陽性であった。図 5Aに示したように、 H7細胞は一つの H LA-A*0206陽性株（SNK-10)を溶解した力 他の細胞（SNK-6)、あるいは HLA_A*0 206陰性株（HANK-1)は溶解しなかった。 HLA-A*0206を導入した HANK-1細胞は H 7細胞によって特異的に溶解された（図 5B)。ェピトープペプチドでパルスされた SNK -6細胞は H7によって特異的に溶解された（図 5A)ため、 SNK-6細胞は LMP1ェピトー プによって突然変異を生じた可能性が考えられる。さらに、本発明者らは LMP1ェピト ープに結合するゲノム DNAをシークェンスした。その結果、 3つの EBV陽性 NK細胞 株のすべてがアミノ酸残基 55- 80に影響を与えない同一の突然変異を保有して 、る ことが明ら力となった (データは示さない)。
[0162] 〔実施例 9〕細胞株および榭状細胞の調製
本発明者らは、次に EBV関連タンパク質のうち、 EBNA1に特異的な CTLクローンの 誘導を行い、 EBNA1由来のェピトープの同定を行った。
EBNA1由来のェピトープの同定に関連する実験（実施例 9〜16)において用いられ た、細胞株および榭状細胞の調製方法につ!、て以下に示す。 [0163] 愛知県がんセンター (日本)の倫理審査委員会によって承認された研究デザインと 目的は、すべての献血者に対して十分に説明され、インフォームド 'コンセントを得た
CD40で活性化された B細胞 (CD40-B)は公知の方法に基づ!/、て、献血者の PBMC から産生された（Schultze Jし, et al" J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997), Kondo E, et al., J Immunol, 169, 2164-2171 (2002)) 0簡単に述べると、 PBMCを、放射線照 射され CD40Lで形質転換した NIH3T3細胞（以下 t_CD40Lと記載する。 Bostonにある Dana— Farber Cancer Instituteの Dr. uordon Freeman力ら淀供され 7こ のである)と、 リコンビナント IL- 4(Genzyme, Cambridge, MA)、およびシクロスポリン A (Sandoz, Base 1, Switzerland)と共に培養液中で培養した。増殖した CD40-Bに、週に 2回刺激を加え た。
EBVを保持した LCLは、公知の方法（Kuzushima K, et al., Blood, 94, 3094-3100 ( 1999))に基づき、 B95-8細胞培養上清を用いて、 PBMCを分ィ匕させることによって調 製した。そして、 10%ゥシ胎仔血清、 2mM L-グルタミン、 50U/mLのペニシリン、 50 g /mLストレプトマイシンと 50 μ g/mLのカナマイシンを含む RPMI1640培地 (シグマケミカ ル社、セントルイス、 MO)中で培養した。
[0164] また、榭状細胞を公知の方法で調製した（Romani N, et al., J Exp Med., 180, 83-9 3 (1994) , Sallusto F, et al., J Exp Med., 179, 1109-1118 (1994), Dauer M, et al" J I mmunol., 170, 4069-4076 (2003))。 CD8+T細胞を、 PBMCs力ら CD8 MicroBeads(Mil tenyi Biotec、ベルギッシュグラートバハ (ドイツ》を用いて分離し、—135°Cで保存した
[0165] CD8を除 、た PBMCを、 5%のヒトの血清 (MP Biomedicals, Aurora, OH)と 2mMの L— グルタミン、 50U/mLのペニシリン、 50 μ g/mLのストレプトマイシン、 50 μ g/mLのカナ マイシンを含む 4mLの RPMI1640培地 (DC培地)に懸濁し、 6ゥエルプレートの一つの プレート中で 37°C、 2時間インキュベートした。
[0166] 非接着性細胞を穏やかにピペッティングすることで取り除き、接着細胞を 50ng/mL の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM- CSF、 Osteogenetics、 Wuerzburg、ド イツ)と lOng/mL IL- 4(Osteogenetics)を含む DC培地で培養した。 2日目と 4日目〖こ、半 分の培地を、 GM-CSFと IL-4を含んでいる新鮮な DC培地に交換した。 6日目に、榭 状細胞を集め、 mRNAを導入するため、エレクト口ポレーシヨンを行なった。
[0167] 〔実施例 10〕全長 EBNA1 mRNAの作成
EBNA1を発現している抗原提示細胞を作製するために、本発明者らは、 pcDNA/E BNA1プラスミドからインビトロ転写システムを用いて、ポリ A鎖を持つ全長 EBNA1 mR NAを産生した。
インビトロで転写された EBNA1 mRNAを作製するために、まず pcDNA/EBNAlベタ ターを構築した。 RNeasy Kit(Qiagen、 Hilden (ドイツ》を用いて、上記の B95.8で形質 転換した LCLから全ての RNAの抽出し、 EBNA1をコードする配列を得た。 EBNA1の アミノ酸配列および DNA配列を配列番号: 36および 37に示す。そして、逆転写の後に 、以下の特異的プライマーを用いた PCR法によって EBNA1 cDNAを増幅した。
フォワードプライマー
5 -AAGCTTGCCACCATGTCTGACGAGGGGCCAGGTACAG (配列番号： 28) リバースプライマー
5し GAATTCTCACTCCTGCCCTTCCTCACCCTC (配列番号： 29)
[0168] 全長の EBNA1断片を、 Hindlllと EcoRIサイトを用いて pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carl sba榭状細胞 A)に挿入し、 pcDNA/EBNAlを構築した。 EBNA1が導入されたことを確 認するために、配列決定を行った。得られたプラスミド DNAを、 mMESSAGEと mMACH INEキット (Ambion, Austin, TX)を用いて線状化し、インビトロで転写した。ポリ Αポリメ ラーゼ (Ambion)を用いて、 3'末端のポリ A鎖を EBNA1 mRNAに付カ卩した後、 RNeasyキ ットを用いて精製した。精製した mRNAを ReliantRNAゲルシステム (Cambrex、ロックラ ンド (ME))を使用して確認した。
[0169] Capped-mRNAの収量は低いことが明ら力となった力 これはおそらく GCを多く含む 配列からなる GAr領域が原因であり、反応温度の変化や反応混合物に一本鎖結合タ ンパク質をカ卩えても、収量の問題は完全には解決できなかった (データは示さな 、)。 しかしながら、 mRNAの量は十分であり、ゲル上でも単一のバンドとして観察された（ 図 6A)。
[0170] 〔実施例 11〕全長 EBNA1 mRNAの細胞への導入および、細胞における EBNA1の発 現確認
次に、榭状細胞と CD40- B細胞に、エレクト口ポレーシヨンによって全長 EBNAlmRN Aを導入した。まず、無血清の RPMI1640を用いて二度洗浄し、最終濃度が 2.5 X 107 細胞/ mLとなるように懸濁した。 40 μ Lの RPMI1640培地中で 20 μ gの mRNAと混合し た後に、 2mmのセルの中に入れ Electro Square Porator ECM830(ノヽーバード Apparat us、ホリストン (MA))を用いてエレクト口ポレーシヨンを行った。条件設定は榭状細胞に 対しては 450V、 500 μ S、 CD40-B細胞に対しては 350V、 350 μ Sに設定した。
[0171] エレクト口ポレーシヨンの後、榭状細胞の場合は IL-4と GM- CSFを追加した DC培地 の中で 3時間培養し、成熟させるために TNF- a (PeproTech,米国 Rocky Hill, NJ)、 IL -1 β (PeproTech)と PGE (Cavman Chemical,米国 Ann Arbor, MI)を加えた。 CD40— B
2
細胞を、放射線照射した NIH/3T3-ヒト CD40リガンド細胞の上に直ちに播いて、 36-4 8時間後抗原提示細胞として使用した。
[0172] 次に、以下の工程で EBNA1の染色を行い、細胞内における EBNA1の発現を確認し た。 EBNA1 mRNAを導入した CD40-B細胞を集め、 10分間室温で 4%のパラホルムァ ルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)に定着させた。 PBSで洗浄した後に、細 胞を 30分間 4°Cで 0.5%の Tween-20を含む PBSで浸透化し、抗 EBNA1ゥサギポリクロー ナル抗体 (鶴見達也博士から提供、愛知がんセンター研究所、名古屋、 日本)と反応 させた。 PBSで洗浄した後に、細胞を FITC標識したャギの抗ゥサギ IgG(Beckman Cou Iter, Fullerton (カリフォルニア》で 30分間 4°C染色した。染色した細胞は、 CellQUEST ソフトウェア (BD Biosciences)を用い、 FACSCallibur(BD Biosciences,サンノゼ (カリフ オル-ァ》で分析した。
[0173] 上記の結果、 EBNA1の発現は、平均蛍光強度は低いように見えた力 ほとんどの C D40-B細胞の上に検出された（図 6B)。榭状細胞は、ドナーの PBMCsから得られた細 胞数が限られていたために、本分析では利用できなかった。
[0174] 〔実施例 12〕 EBNA1 mRNAを導入した榭状細胞を用いた、 EBNA1特異的 CTLクロー ンの誘導
健康なドナーの単核球由来の榭状細胞に、全長 EBNA1 mRNAをエレクト口ポレー シヨンによって導入し、炎症性サイト力インの混合物の添加することにより、榭状細胞 の成熟化を誘導した。
EBNA1特異的 CTLクローンの誘導は以下の工程により行った。
保存されていた CD8+T細胞を解凍し、 10%ヒト血清、 2mM L-グルタミン、 50U/mLぺ -シリン、 50 μ g/mLストレプトマイシン、および 50 μ g/mLカナマイシン (CTL培地とい う)を含み、さらに 5ng/mL IL— 7(R&D Systems, Minneapolis, MN)と 5ng/mL IL— 12 (R& D systems) 5ng/mLを加えた 200 μ Lの RPMI1640倍地中で、 5%CO濃度の下、湿潤
2
インキュベーターで培養した。 8、 16、および 23日目に、 EBNA1- mRNAを導入し、 y 線を照射した榭状細胞によって、 T細胞を刺激した。各再刺激の 1日後に、最終的に 20U/mLの濃度になるように、 IL- 2(塩野義、大阪、 日本)を加えた。 T細胞クローンを 確立するため、ポリクローナルな CTLの限界希釈法を実施した（Kuzushima K, et al.， Blood. 2001;98:1872-1881)。
[0175] 多クローンの CD8+T細胞を、ガンマ線などを照射された 1 X 105の PBMCs(33Gy)、お よび 2 X 104LCLs(55Gy)に、 CD3(30ng/mLゝ Ortho Biotech,ブリッジウォーター、ニュ 一ジャージー)特異的なモノクロナール抗体 (mAb)を含む CTL培地を入れた、丸底の 96ゥエルのプレートの 1ゥエルに 1細胞となるように蒔いた。翌日、 IL-2を各ゥエル (50U /mL)に加えた。 2週間の培養後、良好に増殖しているゥエルを二つに分け、 ELISPOT アツセィで自己の EBNA1 mRNAで形質転換した CD40-B細胞、または自己の LCLに 対するエフェクターとして使用した。
[0176] 刺激を三回行った後に、各微量培養液の一定量について、 EBNAlmRNAを導入し た自己の CD40-B細胞と接触させ、 ELISPOTアツセィで特異的に IFN yを分泌する能 力をテストした。
ELISPOTアツセィは、公知の方法で行った（Kuzushima K, et al.， Blood, 101, 1460 -1468 (2003) ) o CD8+T細胞を、抗ヒトインターフェロン γ (IFN y )モノクローナル抗体 ( ピアス Biotechnology、フィラデルフィア (PA))でコーティングされた Multiscreen- HAプ レート (Millipore、ビルリカ (MA))のゥエル中で各種刺激因子と共に培養した。刺激因 子として、（A)自己の EBNA1 mRNAを導入した CD40-B細胞若しくは導入しなかった C D40の B細胞と、 (B)自己若しくは同種の LCL(1 X 105の細胞/ウィル)を各ゥエルに蒔い た。（以下に説明するペプチドタイトレーシヨンとォバーラッピングアツセィにおいては 、濃度をふった合成ペプチドを室温で 1時間、自己の CD40-B細胞に加えた。 )
[0177] その後、抗ヒ HFN γゥサギポリクローナル抗体 (ピアス Biotechnology)と反応させた 後、ペルォキシダーゼでラベルした抗ゥサギの免疫グロブリン抗体 (ゲンザィム、ケン ブリッジ、 MA)と基質を加えて反応後、プレートを洗浄し乾燥させた。 IFN yスポットは 実体顕微鏡の下で数えた。
[0178] 上記の結果、 36のゥヱルのうち、 32ゥヱルの細胞中に EBNA1特異的 CTLが存在し た (データ示さず)。 CTLクローン B5と C6を限界希釈法により樹立した。クローンは抗 CD3モノクローナル抗体、照射されたフィーダ一細胞および IL-2と供に増殖させた。 これらのクローンは、 EBNAl-mRNAを導入した自己の CD40-B細胞と LCLを認識す る力 EBNAl-mRNAを導入しなかった自己 CD40B細胞や HLAが不一致の同種 LCL は認識しな力つた（図 7)。
[0179] 〔実施例 13〕抗原を提示している HLA分子の同定
献血者は HLA-A*2402、 A*3101、 B*1507、 B*3501、および Cw*0303として遺伝学 的に分類された。抗原を提示している HLA分子を同定するため、 HLAが部分的に一 致している LCLのパネルを、クローン B5若しくは C6を刺激して IFN yを生産するため に用いた。 自己の LCLに加えて、 HLA_B*3501を発現している同種 LCL力 CTLクロ ーン C6によって認識された（図 8A)。そして、 HLA-Cw*0304または、 HLA- Cw*0303 を持つ LCL力 クローン B5 (図 8B)によって認識された。このことは、 HLA- B*3501がク ローン C6認識のための推定上の制限因子であり、一方、 HLA-Cw*0303と HLA-Cw* 0304はクローン B5の制限因子として働!ヽて 、ることを示して!/、る。
[0180] 〔実施例 14〕 EBNA1抗原ペプチドの識別
ェピトープ領域を特定するために、クローン B5および C6を、 20個のアミノ酸を持つ ペプチドのセットと共に自己の CD40-B細胞において刺激した。本発明に使用された ペプチドは、 Bio-Synthesis, Inc. Lewisville, TX.から購入した。 GArの一次構造は ΜΗ Cクラス Iェピトープを含みそうにな 、ことから、本発明者らはェピトープソースとしてこ の部分を除いた。アミノ酸セット (合計 56のペプチド)は 13残基のオーバーラップによつ て、 GArドメイン除く完全な EBNA1タンパク質配列をカバーして!/、る。
[0181] 上記の結果、ペプチド #24はクローン C6によって認識された（図 9)。 HLA-B*3501拘 束性のェピトープに関し、 HPVGEADYFEY (配列番号: 30)という配列が以前に報告 されている（Blake N, et al., Immunity. 1997;7:791-802) 0
[0182] このェピトープ配列はペプチド #24(402-421)の中央に位置していることから（図 10A )、本発明者らは、クローン C6が、 HPVGEADYFEY (配列番号： 30)をェピトープぺプ チドとして認識して 、るだろうと考えた。
[0183] クローン B5の場合では、 2つの重複するペプチド #38(500-519)と #39(507-526)が、 認識され（図 9)、これらは図 10Bでアンダーラインを引いた 13アミノ酸配列 VFVYGGS KTSLYN (配列番号： 31)を共有している。 HLA-Cw*0303に結合する最適のェピトー プを予測するために、プログラム SYFPEITHIを用いた (http：〃 www.syfteithi.de/ Ram mensee H, et al., Immunogenetics. 1999;50:213- 219)。そして、プログラム SYFPEITH Iによる予測に基づき、ェピトープとなりうる候補のペプチド、 VYGGSKTSL(509-517) ( 配列番号： 22)、 FVYGGSKTSL(508- 517) (配列番号： 3)、および VFVYGGSKTSL(50 7-517) (配列番号： 2)を合成した。
[0184] C-末端にあるアンカーのロイシンとェピトープの三番目の部分にある補助的アンカ 一のパリンとチロシンはプログラムで予測されていたことから、発明者らは llmer(VFV YGGSKTSL、配列番号： 2)と 10mer (FVYGGSKTSL、配列番号： 3) (図 10B)について 調べた。
[0185] ペプチドをカ卩えた標的細胞の Half Maximal Recognitionはそれぞれ 5-1 OnMの 10残 基ペプチドと 1-5ηΜの 11残基ペプチドで得られた（図 10C)。 9残基 (VYGGSKTSL、 配列番号： 22)ははるかに高 、濃度にお!、ても認識されな力つた。
[0186] ペプチド希釈アツセィによってもクローン B5(図 10C)の最適なェピトープの長さは明 らかにならな力つたことから、本発明者らは、同じ疑問を解決するのに構造面からの アプローチを用いることに決めた。このために、本発明者らは 10残基ペプチド FVYGG SKTSL (配列番号： 3)若しくは 1 lmer VFVYGGSKTSL (配列番号： 2)を導入し、蛍光 ラベルしたテトラマーを作製した。
[0187] テトラマーの作製と染色は以下の工程により行った。
HLA— Cw*0303と Cw*0304の cDNAクローンは、プライマーである C03F(5'— AACCAT 番号： 32)及び C03R(5'- AAGGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGG- 3'、配列 番号： 33)プライマーを用いて、 HLA-Cw*0303と Cw*0304の重鎖の細胞外ドメインを コードする配列を PCRで増やすためのテンプレート (铸型）として使用された。
[0188] C03Fは E.coli BL21(DE3)pLysSでタンパク質発現を最適化するように設計された数 個の塩基の置換を含んでいる。 PCR産物は、 Ncolと BamHIとで切断され、ベクターに 組み込まれた。このベクターは、 HLA配列の 3'末端に BirA biotinylationサイトを含ん でいる。
[0189] 組換え HLA- Cw*0303と Cw*0304の分子は 13 2-ミクログロブリンとペプチド FVYGGS KTSL (配列番号： 3)若しくは VFVYGGSKTSL (配列番号： 2)と共にインビトロで組み 込まれた。ゲル濾過で精製された可溶性複合体は、 BirA酵素 (vidity LCC、デンバー (CO》を用いてピオチンィ匕された。
[0190] フィコエリスリン (PE)をラベルされたテトラマーは、 PEでラベルされたストレプトァビジ ン (Molecular Probes, Carlsbad (カリフォルニア》にこれらのビォチン化複合体を混合 して作製した。
[0191] テトラマーでの染色は以下の通りに行われた。 CTLクローン (2xl05)を、 15分間 4°Cで FITCラベルした抗 CD8モノクローナル抗体 (Caltag、バーリンゲーム (カリフォルニア》 と、 20 g/mLのテトラマーでインキュベートして染色した。二度洗浄した後、染色した 細胞を、 0.5%のパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーにより分析した。
[0192] 上記の分析の結果、図 11に示されるように、これらのテトラマーは特異的に CTLクロ ーン B5に結合した。しかしながら、 10残基ペプチドを導入したテトラマーは B5クローン に対して、 11残基ペプチドを導入したものより高い親和力を示し、このことは 10残基べ プチド FVYGGSKTSL (配列番号： 3)が CTLのための最小の、そして、最適のェピトー プであること示唆している。さらに、クローン B5は、結果が図 8Aのデータと同様に、 10 残基を組み込んだ HLA-Cw*0304テトラマーに強く結合した。
[0193] 〔実施例 16〕 EBNA1特異的 CTLsの EBVが感染した B細胞への成長抑制効果の検討 クローンの B5と C6は、クロムリリースアツセィにおいては、自己の LCLを溶解しなか つた (データは示さない)。ここで、これらの EBNA1特異的 CTLが、 EBNA1を発現して いる LCLの長期的成長と生存に影響を及ぼす力否かを検討した。 [0194] 拘束性 HLA分子の存在下若しくは非存在下において、 自己及び同種の LCLが、反 応する CTLの存在下若しくは非存在下において 96ゥヱルプレートに蒔かれた。
[0195] 成長抑制アツセィは、公知の方法を多少修正して実施した（Lee SP, et al.， J Exp M ed.， 199, 1409-1420 (2004)) 0標的となる LCL細胞は 2 X 104細胞/ゥエルの濃度で 3 ゥエルずつ丸底の 96ゥエルのプレートに蒔いた。 EBNA1特異的 CTLクローン (1 X 104 の細胞/ゥエル)若しくはコントロールとしての CTL培地を標的細胞の培地にカ卩えた。 すべての培地を週ごとに半分を替えることによって維持し、 PE-cyanin5でラベルされ た抗 CD19と、 PEによってラベルされた抗 CD8モノクローナル抗体 (Beckman Coulter) で染色し、フローサイトメトリーによる分析で B細胞の特性を確認した。さらに、培養液 は 4週間後に LCLがどれだけ増えたかを確認した。
最終的に LCLがどれだけ増えたかを、顕微鏡観察によって評価し、フローサイトメト リー〖こよる CD 19の発現で確認した。
[0196] 図 12に示されるように、両方の CTLクローンは明確に自己の LCLだけではなぐ拘 束性 HLAを持つ同種の LCLについて増殖を抑制した。このことは、 CTLクローンが潜 伏タイプ IIIである EBV-陽性細胞の成長を阻害する能力を持つことを示唆している。 産業上の利用可能性
[0197] 本発明により、ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトー プペプチドを同定することに成功した。該ペプチドは、ェプスタイン-バールウィルス に特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)を効率的に誘導し得る機能を有する。従って該 ペプチド及び該ペプチドをコードする核酸は、ェプスタイン-バールウィルスの感染お よび同ウィルス陽性の癌を治療又は予防するためのワクチン (能動免疫療法剤）とし て有用である。本発明で提供されるェピトープペプチドは、ワクチンとして用いる事で 、ェプスタイン-バールウィルス特異的 CTLを生体内で誘導し、ェプスタイン-バール ウィルス感染に対して免疫力を保持させることができる。生体外にお!/、て末梢血等の 生体試料に対してもェプスタイン-バールウィルスを感染させる事無く、安全かつ効 率的にェプスタイン-バールウィルス特異的 CTLを人為的に誘導増殖させ細胞免疫 療法に用いる事ができる。さらに、ェプスタイン-バールウィルスに対する免疫力の有 無の診断に用いる事ができ、ェプスタイン-バールウィルス感染症に対して有効な治 療法と診断方法を提供する。
[0198] また、本発明のこれらのェピトープペプチドによって誘導される CTLは、ェプスタイ ン-バールウィルス感染細胞を特異的に溶解し、かつ該細胞の成長を阻害する機能 を有し、受動免疫療法剤の成分として非常に有用である。
[0199] さらに、該ェピトープペプチドを用いることにより、ェプスタイン-バールウィルスに特 異的な CTLを定量することが可能である。ェプスタイン-バールウィルスに特異的な C TLが、ノ、ィリスクの患者の末梢血に存在する力否かを知ることは、抗ウィルス剤や免 疫抑制剤の適正な使用を含め、これらの感染症管理の上で重要な情報である。

Claims

請求の範囲
[1] ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド。
[2] ェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 Τ細胞ェピトープペプチドが 配列番号： 1〜3からなる群力も選択される少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むもので ある、請求項 1に記載のペプチド。
[3] 配列番号： 1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数のァミノ 酸が置換、欠失、挿入及び Ζ又は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであって
、エブスタイン-バールウィルス特異的な細胞傷害性 Τ細胞を誘導し得る機能を有す ることを特徴とする、請求項 1に記載のペプチド。
[4] HLA-A*0206分子、 HLA-Cw*0303分子または HLA-Cw*0304分子の拘束性抗原 ペプチドであって、 HLA-A*0206分子、 HLA-Cw*0303分子または HLA-Cw*0304分 子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうる T細胞レセプターを 有する細胞傷害性 T細胞を誘導し得る機能を有することを特徴とする、請求項 1〜3 の！、ずれかに記載のペプチド。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
[6] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、ェプスタイン-バ ールウィルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
[7] 請求項 5に記載の核酸を有効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスの感 染を治療又は予防するためのワクチン。
[8] 請求項 1〜4の ヽずれかに記載のペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞を有効 成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスの感染を治療又は予防するためのワク チン。
[9] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した抗 原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるェプスタイン-バールウィルス特 異的な細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスに対 する受動免疫療法剤。
[10] 請求項 1〜4の 、ずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合 体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応さ せ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テトラ マーに細胞傷害性 τ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得ら れる細胞傷害性 τ細胞を有効成分として含む、ェプスタイン-バールウィルスに対す る受動免疫療法剤。
請求項 1〜4の 、ずれかに記載のペプチドを用いて細胞傷害性 T細胞を誘導する ことを特徴とする、細胞傷害性 T細胞の誘導方法。
請求項 1〜4の ヽずれかに記載のペプチドと末梢血単核球を、血漿を含む培地中 で接触させることにより、ェプスタイン-バールウィルス特異的細胞傷害性 T細胞を誘 導する、請求項 11に記載の誘導方法。
請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した抗 原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激してェプスタイン-バールウィルス特異的な 細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む、ェプスタイン-バールウィルスに対する受 動免疫療法剤の製造方法。
請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合 体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応さ せ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テトラ マーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得ら れる細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む、ェプスタイン-バールウィルスに対す る受動免疫療法剤の製造方法。
請求項 1〜4の 、ずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウィルスに特異的 な細胞傷害性 T細胞を取得し、細胞傷害性 T細胞が産生するサイト力イン及び Z又 はケモカイン及び Z又は細胞表面分子を測定することを特徴とする、ェプスタイン- バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞の定量方法。
請求項 1〜4のいずれか〖こ記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テトラ マーを調製し、主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させること を特徴とする、該末梢血中のェプスタイン-バールウィルスに特異的な細胞傷害性 T
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