WO2007037133A1 - Plk3に作用する化合物の評価方法 - Google Patents

Plk3に作用する化合物の評価方法 Download PDF

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WO2007037133A1
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Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating a compound using PLK3 as an objective.
  • PLK Poly-ike-kinase
  • PLK1 regenerates various substrates, thereby accelerating body maturation (35-1701, 1996 Nat Cel Biol, pp. 3-421 2001 (Science, pp. 273-1377 1996), staining The division of the body (p. 59, 2001) The end of mitosis (Mol Cell pp. 1-371, 1 cleaving (Proc Natl Acad Sci USA pp. 99-8672, 2002) plays an important role.
  • PLK1 and PLK3 function in the G2 / M phase of the cell cycle and are considered to have different common capabilities.
  • the present invention clarifies what has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and enables the evaluation of compounds using the substrate.
  • a compound that makes PLK3 a drug discovery by using Thuinomerase II or the above-mentioned reno-oxidation site as well as its reno-oxidation site or the 1342 th Th.
  • the present invention Comparing the enzymatic activity of PLK3 in the absence of the compound.
  • the amino is preferable.
  • any one of the heptagons having the amino acid sequence described in the above-mentioned heptite 2 is used.
  • the compound evaluation method of the present invention comprises the steps of contacting a test compound with cells expressing PLK3 acting on PLK3, the step of measuring, the expression level, and the expression level without contacting the test compound And a step of comparing the two.
  • a scramble can be a singular linking or evaluation showing an antitumor effect on cancer cells having activated Ras.
  • a PLK3 inhibitor selected by any of the above-described methods for evaluating a compound is also included in the present invention.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is characterized by being an evaluation product of the above-mentioned compound or a PLK3 activator.
  • Ras- MAPK Hasue High antitumor effect on activated cancer cells or cancer tissues More PLK3-specific activity measurement is possible.
  • the PLK3 activity / regulative heptite of the present invention is preferably a peptide consisting of the sequences of SEQ ID NOS: 3 to 13. Such a peptide can be used to measure PLK3-specific activity.
  • Thuinomerer As a specific substrate of PLK3 by the present inventors, Thuinomerer was used. Therefore, according to the present invention, it is possible to evaluate the compound that acts on PLK3 and PLK3 and thohuinomerase ⁇ ⁇ (such as screeninok). It is possible to evaluate the compound by using the peptide to the part of Merase II ⁇ . Become. Furthermore, Thuinomerase II ⁇ -to has been used as a substrate for PLK3, so it is also useful as a Knol for research through PLK3 and PLK3.
  • 01 examines the expression distribution of PLK1 and PLK3 in the cell cycle.
  • 0 2 shows the result of normal expression in PLK and PLK3 recombinants or E. coli.
  • 0 3 represents PLK1 and PLK3 using Thuinomerase II as a substrate Verified to detect topoinomerase II ⁇
  • Fig. 7 shows the results of confirming that anti-Topoiroma immunoprecipitation was performed using cells in which PLK3 was forcibly expressed and anti-Flag antibody was used to perform Westanoflonotinoc.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of comparison of the ability to oxidize using cells into which PLK3 that has lost its kinase activity has been introduced.
  • 0 9 shows the PLK result in 293T cells introduced with anti-senos PLK3.
  • FIG. 10 shows the results of confirming the expression and reno-oxidation in 293T cells introduced with ananotisno PLK3.
  • 0 1 1 is the same as 0 1 0 and shows the result of a 250 kDa tanohak using a front.
  • FIG. 12 shows the results of confirming the expression of nomerase II c in 293T cells stably expressing annoticenos PLK3.
  • 0 1 3 shows the results of confirming cell growth when treated with 293T cells and 293T aminonos introduced with annotisseno PLK3 0
  • Figure 14 shows cells treated with 293T cells and 293T rosphorino treated with antisense PLK3
  • Figure 15 shows the results of confirmation of proliferation.
  • Figure 15 shows the activity of PLK3 on 293T cells treated with ICRF-193.
  • Fig. 20 shows the results of detecting the number of cells in the subGl phase in the cell cycle in excess of PLK3 PLK3 K91M mutant or cassase 9
  • Fig. 21 shows the result of confirming the morphological change of cells treated with nocotanol PLK3 PLK3 K91M Mutant or nocotanol-treated and the ratio of histone oxide H3 is measured.
  • 0 23 shows the result of overexpression of PLK3 PLK3 K91M mutant and PBD.
  • 0 24 shows the results of measuring cells (colony forming ability) in which PLK3 or PLK3 K91M mutant was overexpressed.
  • 0 25 shows the morphology of cells co-expressing activated Ras (V12) and PLK3.
  • the gene according to the present invention is PLK3 (Accession No NM_004073.
  • the species from which the PLK3 gene is derived is particularly limited. Examples include Hiranoto, Inu or Usaki. Therefore, it is preferable that it is a human gene.
  • the equivalent of the gene may be substitution, deletion, addition or insertion of one or more bases.
  • this gene is coated with PLK3 Tanohaku r Cloning A Laboratory Manual 2nd edition Connor spudge 9), 9 47-9 62 and 11 45-11 61 More specifically, 2 OxSS can be given at 50 ° C after performing the high-frequency detection in Example 0XSSC.
  • 2 OxSSC 50 as a low strinone enonoe in the production process for the selection of strono. It is possible to select from C to about 02XSSC 50 ° C of high stream. Furthermore, it is possible to raise the high stringinoenono from room temperature of about 22 ° C under the washing rhinoenoeno condition.
  • those having a physiological function equivalent to that of the tanohaceous substance that is a transcription product of the PLK3 gene according to the present invention include those having one or more bases or insertions.
  • it is not tanned or homologous, and it is preferably 50% or more, preferably 70, more preferably 80% or more, more preferably 90 1 92 93 94 95 96 97 98, 99% or more).
  • Topoinomerase IIa (Accession No. No. 2) according to the present invention, the species from which the gene is derived is particularly limited, and examples include monkey mouse lanotoinu and usaki. It is preferable that a human gene is a human gene because it is an intermediate subject to administration.
  • the Thuinomerase ⁇ gene according to the present invention has one or more base substitutions or deletions if it has this function. Loss
  • the topoycete that is a transcription product of the gene according to the present invention includes those having a substitution, deletion, addition or insertion of a base having a physiological function equivalent to that of the tanohae.
  • the sequence of this material is not particularly limited, or is homologous or more than 50% or more, more preferably 80% or more. More than 80% (example is 9 1 9 2 9 3 9 4 9 5 9 6 9 7) is particularly preferred.
  • two-meromerase ⁇ is phosphorylated by PLK3 as a substrate of PLK3 by the 342nd threonino or PLK3.
  • P for heftito containing the 1342th threonino.
  • the number of amino acids in such heftitos can be selected in particular, or it is more preferable that the amino acids are more than 2 amino acids, and more than 10 amino acids.
  • test compound is PLK3, and the kind of drug discovery is not particularly limited.
  • Tenyo compound Compound Tanohaku Hefito etc. Single compound Expression products of child life cell extracts Cell extracts Cell culture tops / Sheep organism extracts Plant extracts Prokaryotic cell extracts Eukaryotic single cell extracts Extracts can be listed. The above-mentioned examination examination departments will come up as needed. Examples of knowledge include radiation knowledge and fluorescence knowledge.
  • Enzyme reaction i is the reaction condition of the reno-oxidation reaction of PLK3 linoleate using topoinomerase II as a substrate.
  • phosphoric acid buffer / night Tris-HCl buffer, etc. is adjusted to 80 to 80, preferably 70 to 80, and the temperature is preferably 25 to 45 ° C, and the reaction may be allowed to proceed.
  • ⁇ time should be set appropriately, or preferably 20-40 minutes. It is also necessary to include soot in the lino-oxidized solution / nighttime. It is possible to easily detect the progress of the reno-oxidation reaction in a detectable state.
  • the enzyme activity of PLK3 is relatively low in the presence of the test compound. If the enzyme activity is significantly low in the presence of the test compound, the test compound is concerned. Is PLK3 is there.
  • the reaction conditions for such a reno-oxidation reaction are not limited to allow the reaction to proceed. Conditions for re-oxidation reaction well known to those skilled in the art, specifically, for example, linoic acid buffer / night tris salt pH as a buffer solution.
  • the reaction may be allowed to proceed by adjusting the temperature from 60 to 80, preferably from 70 to 80, and setting the temperature to 25 to 45 ° C and 0 ° C. Also, gC12, mercaptoethanol, EGTA, etc.
  • the reaction time may be set appropriately for 0 to 60 minutes, preferably 20 to 40 minutes.
  • [ ⁇ - 33 ⁇ ] ⁇ [ ⁇ - 32 ⁇ ] ⁇ Hino is an example of knowledge that ATP can be easily detected by detecting the progress of the reno-oxidation reaction.
  • the radioisotope is known, it is possible to detect and quantitate the chemical reaction detected by taking a heptagon as a substrate and detecting it with a nono-chino-nono counter.
  • test compound has a function to inhibit the enzyme reaction of PLK3, the enzyme activity of PLK3 in the presence of the test compound is relatively low. If the enzyme activity is present or low in the presence of the test compound, the test compound is PLK3 will judge. On the other hand, if the enzyme activity is significantly high, Make it.
  • the cells expressing PLK3 and topoinomerase II are not limited in their kind as long as they express merase II ⁇ or may be a cell line for testing.
  • the method can be used as a method for forcibly expressing Inomerase IIa by genetic engineering?
  • a nucleic acid consisting of a pup or a part thereof is prepared by cloning into an expression vector containing a suitable promoter and introducing the cloned into the host cell.
  • those that can be used as the expression hector are not particularly limited.
  • Examples include ag, pcDNA3 1 pBlueBacHis2 pCI-neo pcDNAI pMClneo, pXT HisB pCR2 1 pETl 1; L gtl 1 or pCR3 1.
  • a part of the introduced nucleic acid or introduced expression hector is introduced into the Shukuo cell.
  • a cell it can be either a cell, an insect cell, a plant cell, or a microorganism, which is usually used for gene expression. Concrete 0S1 C0S7 CHO NIH / 3T3 293 Raj i CV11 C1271 MRC-5 C is listed as Sf9.
  • whether or not the expression hector is introduced into Shukuo cells is not particularly limited.
  • the enonocarnoum method DEAE-textlano method Rifofekyuno can be mentioned.
  • the expression of the introduced gene may be transient (transien and stable).
  • the phosphorylation of the soybean produced by the contact between the cell in the previous step and the test compound is detected.
  • the reno-oxidation is not particularly limited as a method for detecting such reno-oxidation. It can be detected by a known method, or it can be detected by immunoprecipitation of the toinomerase ⁇ after reno-oxidation reaction. Thoinomerase II lynooxidation.
  • test compound functions as a PLK3 inhibitor when it has the function of inhibiting the enzyme reaction of the test compound or PLK3, that is, the enzyme activity of PLK3 or conotrol in the presence of the test compound. If it is high, the test compound is judged to have PLK3 activity.
  • a fourth embodiment of the method for evaluating a compound of the present invention comprises a step of bringing a test compound into contact with a cell, which is a method for evaluating a compound that exhibits a tumor effect and has an active I "generated Ras and acts on PLK3, and the PLK3 The expression level of PLK3 in a cell not contacted with the expression level and the test compound.
  • a hector with a knocked nucleic acid into a host cell as an expression hector, for example pCMV-Tag pcDNA3 1 pBlueBacHis2 pCI lneo, pXTl pSG5 pEFl / V5-HisB pCR2 1 pETl l e gtl l or p.
  • the nucleic acid comprising the gene or a part thereof is introduced into the introduced cell.
  • Such host cells are usually particularly limited in gene expression Animal cells, insect cells Plant cells Microorganisms Well, specifically, for example, C0S1 C0S7, CHO NIH / 3T3 293 MRC-5 CPAE HeLa 293T or Sf9 Can be raised.
  • known methods are not particularly limited, and examples thereof include an electrophorelane carnomium linoleate method, a DEAE-hofecgnono method, and a gene gun.
  • the introduced (transient) expression may be stable.
  • the PLK3 expressing cell can be obtained by the method described above. Next, the test compound is contacted with the above-mentioned cell.
  • the contact method is not particularly limited, and is well known to those skilled in the art. Specifically, examples include the addition of a test compound in a cell culture medium or buffer, or contact in a solution. There are no particular restrictions, and it is possible to select various conditions such as solution temperature, pH, and contact time.
  • the compound obtained by the method for evaluating a compound of the present invention is moved in other ways, it is also possible to formulate and administer the substance by a method other than directly administering the substance itself to the person *.
  • a method other than directly administering the substance itself For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, or water or other pharmaceutically acceptable / night fungi in parenteral form of injections.
  • examples include pharmacologically acceptable bodies, specifically sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, ⁇ turbidizer, flavoring agent, excipient, vehicle, antiseptic, binder, etc. It may be possible to mix them in a unit dosage form. It can be used and formulated according to normal pharmaceutical practice.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, sugar sugar and isotonic / night, for example D-noritol D-manonose D-manonito, and appropriate solubilizers such as alcohol.
  • Anoleconole for example, pro-Hillenocricol, Horie Chilenocrico, for example, Polynorhetate 80 (TM) HC0-50
  • hennor alcohol may be used as a solubilizer.
  • a buffer such as sodium acetate buffer to a soothing agent, may be combined with flocaino-nor alcohol phenol and an antioxidant.
  • flocaino-nor alcohol phenol and an antioxidant may be used as a solubilizer.
  • administration to a subject can be performed by a person skilled in the art by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, transbronchial, intramuscular, or transdermally or orally.
  • the dose may vary depending on the weight and age of the person and the administration method, and an appropriate dose can be selected as appropriate.
  • the DNA may be subjected to hector treatment for genetic engineering. Do the dosage and administration method vary depending on the body of the person in the field? Those skilled in the art can select as appropriate.
  • the dosage of the compound varies depending on the symptoms. About 0 1 to 10 mg per day is preferred, more preferably about 10 to 20 mg.
  • the single dose When administered parenterally, the single dose is subject to administration. Villous epithelium, uterine cervix, cervix, ureteral, ureteral, urinary, penile, testicular, fetal, Wilms, cutaneous, transblastoma, osteosarcoma, Eynochoma, soft tissue sarcoma, neurodegenerative disease, and other neurodegenerative diseases.
  • PLK3 activity is obtained using the peptide for measuring PLK3 activity of the present invention as a substrate.
  • the heptito of the present invention for measuring PLK3 activity has thuinomerase and at least 2 amino acids.
  • the number of amino acids is not particularly limited, or it is preferably 3 amino acids or more, more preferably 10 amino acids or more, and at least the following heftito or PLK3 substrate and PLK1 LK3 specific It has been confirmed that it can be used as a suitable substrate. If it contains 8 amino acids corresponding to 1339 to Aspl346 (may contain one or more amino acids), it will be a good substrate for PLK3.
  • the heptito (T) indicates Thhoinomerase ⁇ ⁇ Thrl342.
  • PLK1 is expressed independently of the period although it is expressed or increased in the G2 / M period. In other words, it has been confirmed whether it is expressed in the PLK.
  • Human fetal kidney 293T was used as a cell for PLK expression. Culture was performed using Dulbecco's modidium (GIBC0) containing fetal clot (FBS Moregate Bio Tech). Using FuGENE6 transfection rea ular Biochemicals), the expression vector is transferred to 293T cells.
  • GIBC0 Dulbecco's modidium
  • FBS Moregate Bio Tech fetal clot
  • FuGENE6 transfection rea ular Biochemicals the expression vector is transferred to 293T cells.
  • amino acids from the -5th position to the + 4th position are substituted with Ala in order.
  • PLK3 is a topoinome in the above transformed cells.
  • Flag-PLK3 can be detected. In other words, it has been confirmed that PLK3 interacts with I-cells and that PLK3 or topoinomerase II functions are exerted.
  • transformed cells in which PLK1 or PLK3 has been introduced into 293T cells were used with Westinoff Mouth noinoc using Inomerase II a Thrl342 antibody.
  • the cells were 293T cells into which annoticenos PLK3 had been introduced.
  • the anti-topoinome anti-lino-oxidized Thuinomerase II T1342 antibody was used for the same cells. It was confirmed that the ratio of reno-oxidized topo was decreased in the cells.
  • the transfected cells are about 250 kDa Hanoto or anti-topoinomerase II. Since any of the antibodies ase ⁇ ⁇ ⁇ 1342 was detected, it was considered to be Hanoto II ⁇ .
  • G418 (29 S # 12 cells that stably culture the transgene by culturing for 1600 ⁇ g / m) was prepared from cells into which annotenos PLK3 had been introduced. PLK3 expression in the cells was compared with 293T expression. As shown in Fig. 12, the expression of Merkase II ⁇ was significantly increased by suppressing the expression of PLK3. These changes in PLK3 and topoi expression reflect the cancer cell phenotype.
  • Fig. 25 Remarkably many cells that co-expressed (V12) and PLK3 as shown in Fig. 5
  • PLK3 is used as a drug discovery drug or a disease involving PLK3 (eg, cancer or neurodegenerative disease).

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Abstract

トポイソメラーゼIIαがPLK3の基質であり、そのリン酸化部位が1342番目のThrであることが明らかになった。すなわち、トポイソメラーゼIIα又は前述のリン酸化部位を含むペプチドを基質として使用することにより、PLK3を創薬標的とした化合物の評価等（例えば、スクリーニング）を行うことが可能である。また、PLK3の過剰発現や活性化により活性化Rasを有する癌細胞の形態変化が見られたことに基づき、PLK3活性化剤の評価方法やPLK3活性化剤を提供する。

Description

明 細 書
PLK3に作用する化合物の評価方法 技 術 分 野
本発明は PLK3を檸的とした化合物の評価方法に関する。 背 景 技 術
PLK (Polo-l ike-kinase)は 細胞周期に関与するセリノ スレ り 哺乳類ては PLK1〜PLK4の 4種類か知られている。
PLK1は様々な基質をリ ノ酸化することにより、 中 、体の成熟 ( 35卷 1701頁 1996年 Nat Cel l Biol 第 3卷 421頁 2001 移行 （Science、 第 273卷 1377頁 1996年） 、 染色分体の分裂 59頁、 2001年） 有糸分裂の終了 （Mol Cell 第 1卷 371頁 1 裂 （Proc Natl Acad Sci USA 第 99卷 8672頁、 2002年） のよ 重要な役割を果たしている。 また、 PLK1と癌との関連について は PLK1の発現と非小細胞肺癌の予後との間に相関かあるとの報 4卷 543頁 1997年） や、 扁平上皮癌との関連を示す報告 （Can 1794頁 1999年） かある。 また NIH3T3細胞に PLK1を導入した た表現型を示すことも知られている （Biochem Biophys Res 397頁 1997年） 。 番目の Serをリノ酸化し p53を活 化するという報告 （J Biol 36194頁 2001年 非特許文献 3 ) や、 PLK3を過剰発現させる 細胞におけるァホトーノスを誘導するという報告かある （J B 卷、 16843頁、 2005年 非特許文献 4 ) 。
PLK1と PLK3はいすれも細胞周期の G2/M期に機能する て共通 能は相違すると考えられている。
【非特許文献 1】 Oncogene 第 23卷 2658項 2004年 【非特許文献 2】 J Biol Chem 、 第 276卷、 43305頁 200 【非特許文献 3】 J Biol Chem 、 第 276卷 36194頁 200 【非特許文献 4】 J Biol Chem 第 280卷 16843頁 200 発 明 の 開 示
しかしなから PLK3の機能に関してはまた不明な点か多く、 いても明らかにはなっていないのか現状てあった。 従って PLK たァノセィ系の構築も困難てあるのか実隋てあつた。
本発明は 上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたもの を明らかにし 当該基質を使用した化合物の評価を可能とする 本発明者らは 上記目的を達成すへく鋭實研究を重ねた結果 II か PLK3の基質てあり そのリノ酸化部位か 1342番目の Th すとともに トホイノメラーゼ IIひ又は前述のリノ酸化部位を として使用することにより PLK3を創薬椁的とした化合物の評 リーニンク） を行うことか可能てあることを見出し 本発明を 化合物非存在下における PLK3の酵素活性とを比較する工程と、 する。
ここて 本発明の化合物の評価方法においては 前記アミノ ることか好ましい。
また 本発明の化合物の評価方法においては 前記へプチト 2に記載のアミノ酸配列を有するへプチ卜のいすれか一つてあ さらに 本発明の化合物の評価方/去は PLK3に作用する化合 て PLK3及ひトホイノメラーゼ IIひか発現している細胞に被検 工程と 当該トホイノメラーゼ II c のリ ノ酸化を検出する工程 レヘルと被検化合物を接触させなかった細胞における トホイノメ 酸化のレヘルを比較する工程と を含むことを特徴とする。
また 本発明の化合物の評価方法は、 PLK3に作用する化合物 PLK3か発現している細胞に被検化合物を接触させる工程と 測定する工程と 当該発現量と、 被検化合物を接触させなかっ の発現量を比較する工程と を含むことを特徴とする。 かかる よれは、 活性化 Rasを有する癌細胞に対して抗腫瘍効果を示す化 一ニンク又は評価か可能となる。
また 上述の化合物の評価方法のいすれかによつて選択され PLK3阻害剤も本発明に含まれる。
さらに 本発明の化合物の評価方法は 上述の化合物の評価 物か PLK3活 化剤てあることを特徴とする。 Ras- MAPKハスウェ 活性化されている癌細胞又は癌組織に対して抗腫瘍効果か高い より PLK3特異的な活性測定か可能となる。
また 本発明の PLK3活性/則定用へプチトは 配列番号 3〜1 3 配列からなるへフチトてあることか好ましい。 かかるへプチト り、 PLK3特異的な活性測定か可能となる。
本発明者らにより PLK3の特異的な基質としてトホイノメラー た。 従って 本発明により PLK3及ひトホイノメラーゼ Π αを PLK3に作用する化合物の評価 （スクリーニノク等） か可能とな メラーセ II αの部分へプチトを基質として使用することによつ る化合物の評価か可能となる。 さらに トホイノメラ一ゼ II α トは PLK3の基質として使用てきることから、 PLK3や PLK3を介 研究用のノールとしても利用価値かある。
また PLK3の活性化により、 Ras- ΜΑΡΚハスウェイにおける Ras る癌細胞の形態異常か生しることか確認されていることから PLK PLK3の発現誘導により Rasか活性化された癌細胞に対する抗腫瘍 すなわち PLK3活 化剤か抗腫瘍効果を有する。
0面の簡単な説明
0 1は、 PLK1及ひ PLK3の細胞周期における発現分布を検討 あ 。
0 2は PLK及ひ PLK3の組換え体か大腸菌て正常に発現して 結果を示す 0てある。
0 3は、 トホイノメラーゼ IIひを基質とした PLK1及ひ PLK3 トポイノメラーゼ IIひを検出することかてきることを確認した ο
図 7は PLK3を強制発現させた細胞を用いて抗トポイノメラ 免疫沈降を行い、 抗 Flag抗体てウェスタノフロノティノクを行 ることかてきることを確認した結果を示す 0てある。
0 8は キナーゼ活性を失った PLK3を導入した細胞を用いて ノ酸化能を比較した結果を示す図てある。
0 9は アンチセノス PLK3を導入した 293T細胞における PLK 結果を示す 0てある。
0 1 0は ァノチセノス PLK3を導入した 293T細胞におけるト の発現とリノ酸化を確認した結果を示す図てある。
0 1 1は 0 1 0と同しフロノ トを用いて 250kDaのタノハク た結果を示す 0てある。
0 1 2は、ァノチセノス PLK3を安定発現する 293T細胞におけ ノメラーゼ II c の発現を確認した結果を示す図てある。
0 1 3は ァノチセノス PLK3を導入した 293T細胞及ひ 293T ァマイノノ処理した場合の細胞増殖を確認した結果を示す 0て 図 1 4は アンチセンス PLK3を導入した 293T細胞及ひ 293T ロスホリノ処理した場合の細胞増殖を確認した結果を示す図て 0 1 5は ICRF-193処理をした 293T細胞について PLK3の活 示す 0てある。
0 1 6は ICRF - 193処理をした 293T細胞についてトホイノメ 図 2 0は PLK3 PLK3 K91M 変異体又はカスハーゼ 9を過剰 いて細胞周期における subGl期の細胞数を検出した結果を示す図 図 2 1は、ノコタノール処理した細胞の形態変化を確認した結 0 2 2は PLK3 PLK3 K91M 変異体又はノコタノール処理し 酸化ヒス トン H3の割合を測定した結果を示す 0てある。
0 2 3は、 PLK3 PLK3 K91M変異体及ひ PBDを過剰発現させ した結果を示す 0てある。
0 2 4は PLK3又は PLK3 K91M変異体を過剰発現させた細胞 (コロニー形成能） を測定した結果を示す 0てある。
0 2 5は 活性型 Ras (V12)と PLK3 を共発現した細胞の形態 果を示す図てある。 発明 を実施するための最良の形態
以下、 本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先す 本発明にかかる用語について説明する。
本発明にかかる遺伝子は PLK3 (Accession No NM_004073 。 PLK3遺伝子の由来となる生物種は特に限定されす 例 は ヒ ラノ ト、 ィヌ又はゥサキか挙けられる。 中ても 評価される ヒ トてあることからヒ ト遺伝子てあることか好ましい。
また 本発明に係る前記の遺伝子には、 当該遺伝子と同等の のてあれは 1又は 2以上の塩基の置換 欠失 付加又は挿入かあ る。 ここて、 当該遺伝子としては、 PLK3タノハク質をコートする r Cloning A Laboratory Manual 第 2版 コーノレ卜スプジ 9) 、 9 47-9 62及ひ 11 45-11 61に記載されたハイフリタイセ一 互にハイフリタイスすることを啻味する。 より具体的には 例 0XSSCてハイフリタイセ一ノョ ノを行った後に 50°Cにて 2 OxSS 挙けられる。 ス ト リ ノノヱノノー選択のため 冼净工程におけ 低ストリノンエノノーとしての約 2 OxSSC 50。Cから、 高ストリ の約 02XSSC 50°Cまて選択することかてきる。 さらに 洗净 リ ノノエノノー条件の室温 約 22°Cから 高ス ト リ ノノエノノ 上昇させることかてきる。
また 本発明に係る PLK3遺伝子の転写産物てあるタノハク質 質と同等の生理機能を有するものてあれは 1又は 2以上の塩基 又は挿入かあるものも含まれる。 ここて このようなタノハク されないか 相同性か 50%以上てあることか好ましく 70 より好ましく 80%以上てあることかさらに好ましく 90 1 92 93 94 95 96 97 98、 99 %以上） 好ましい。
また 本発明にかかるトポィノメラ一ゼ II a (Accession No 号 2) についても 遺伝子の由来となる生物種は特に限定され サル マウス ラノ ト ィヌ又はゥサキか挙けられる。 中ても の投与対象かヒ トてあることからヒ ト遺伝子てあることか好ま また、 本発明に係る トホイノメラーゼ Πα遺伝子には 当該 機能を有するものてあれは 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失 さらに、 本発明に係る前記の遺伝子の転写産物てある トポイ ハク質には 当該タノハク質と同等の生理機能を有するものて の塩基の置換 欠失 付加又は挿入かあるものも含まれる。 こ 質の配列は特に制限されないか、 相同性か 5 0 %以上てあるこ %以上てあることかより好ましく 8 0 %以上てあることかさ %以上 （例 は 9 1 9 2 9 3 9 4 9 5 9 6 9 7 ) てあることか特に好ましい。
本発明において トホイノメラーゼ Π αは PLK3の基質として 342番目のスレオニノか PLK3によってリン酸化されることを本発 る。 すなわち 1342番目のスレオニノを含むへフチトてあれは P 用することかてきる。 このようなへフチトのアミノ酸数は特に アミノ酸数を選択することかてきるか 2アミノ酸以上てある ァミノ酸以上てあることかより好ましく、 1 0ァミノ酸以上て ましい。
また 本発明にかかる 「被検化合物」 は PLK3を創薬の桴的と その種類は特に制限はなく 具体的には 例 は 天妖化合物 化合物 タノハク質 へフチト等の単一化合物 並ひに 化合 伝子ライフラリーの発現産物 細胞抽出物 細胞培養上凊 発 /羊生物抽出物 植物抽出物 原核細胞抽出物 真核単細胞抽出 抽出物等を挙けることかてきる。 上記被検試科は 要に応して ことかてきる。 椁識としては 例えは 放射椁識 蛍光檸識等 る。 また 上記被検試料に加えて、 これらの被検試枓を複数種/ 。 酵素反 i はトポイノメラーゼ IIひを基質とした PLK3のリ ノ酸 るリノ酸化反応の反応条件としては 反応か進行する条件てあ リノ酸化反応の条件として当業者に周知の条件て行うことかて は 例 は 緩衝/夜としてリ ノ酸緩衝/夜 トリ ス塩酸緩衝液等 〜8 0 好ましくは 7 0〜8 0に調整し 温度を 25〜45°C、 好ましく し 反応を進行させれはよい。 また 反 液中には 要に し カプトエタノール、 EGTA等を^加することかてき これらの濃 選択すれはよい。 反) ΪΓ時間についても適宜設定すれはよいか、 好ましくは 20〜40分間 反応を行 はよい。 また リ ノ酸化 溶/夜中に ΑΤΡを含むことか 要てある。 ΑΤΡは検出可能な状態に より リノ酸化反応の進行を容易に検出することか可能となる。 こ て 例えは [ γ _33Ρ]ΑΤΡ [ γ -32Ρ]ΑΤΡ ヒォチノ又は蛍光色素 性同位体椁識した場合には トホイノメラーセ II αに取り込ま ノオクラフィーゃノノチレーノョノカウノターて検出することに の検出及ひ定量か可能となる。 また ヒォチノ桴識を利用する を使用した検出手段を採ることにより、 放射性同位体を使用せ 検出及ひ定量か可能となる。
次に 酵素反応における PLK3の酵素活性と 被検化合物非存 酵素活性とを比較する。
被検化合物か PLK3の酵素反応を阻害する機能を有する場合には り被検化合物存在下における PLK3の酵素活性か相対的に低くなる 在下て酵素活性か有啻に低い場合には 当該被検化合物は PLK3 ある。 かかるリ ノ酸化反応の反応条件としては、 反応か進行す 制限はなく、 リノ酸化反 の条件として当業者に周知の条件て 具体的には 例えは 緩衝液としてリノ酸緩衝/夜 トリス塩 pHを 6 0〜8 0 好ましくは 7 0〜8 0に調整し 温度を 25〜45°C 0°Cに設定し 反応を進行させれはよい。 また 反応/夜中には gC12、 メルカフ トエタノール、 EGTA等を 加することかてき 好適な値を選択すれはよい。 反応時間についても適宜設定すれは 0〜60分間、 好ましくは 20〜40分間 反 ^を行 はよい。 また、 リ として水溶/夜中に ATPを含むことか必要てある。 ATPは検出可能 くことにより リ ノ酸化反 の進行を容易に検出することか可能と 桴識として 例 は [ γ -33Ρ] ΑΤΡ [ γ -32Ρ]ΑΤΡ ヒォチノ又は る。 放射性同位体檸識した場合には、 基質てあるへプチ卜に取り 一トラノオクラフィーゃノノチレ一ノョノカウンターて検出す 化反応の検出及ひ定量か可能となる。 また ヒォチノ檸識を利 ヒノノを使用した検出手段を採ることにより 放射性同位体を 反応の検出及ひ定量か可能となる。
次に 酵素反^における PLK3の酵素活性と、 被検化合物非存 酵素活性とを比較する。
被検化合物か PLK3の酵素反応を阻害する機能を有する場合に り被検化合物存在下における PLK3の酵素活性か相対的に低くなる 在下て酵素活 か有 fに低い場合には 当該被検化合物は PLK3 判断てきる。 一方 当該酵素活性か有啻に高い場合には 当該 せる。
PLK3及ひトポイノメラーゼ IIひか発現している細胞としては、 メラーゼ II αか発現していれはその種類は限定されす 生体組 てもよく、 ライン化された試験用の細胞てあってもよい。 また メラーセ II αを遺伝子工学的に強制発現させた細胞てあっても イノメラーゼ II aを遺伝子工学的に強制発現させる方法として 方法を用いれはよいか、 具体的には 例 は PLK3並ひにトホイ 伝子又はその一部からなる核酸をそれそれ好適なプロモーター ノトを含む発現ヘクターにクローニノクし クローニノクされ ターを宿王細胞に導入することにより調製する。 ここて、 前記 発現ヘクターとして利用可能なものてあれは特に限定されない ag、 pcDNA3 1 pBlueBacHis2 pCI-neo pcDNAI pMClneo、 pXT HisB pCR2 1 pETl l ； L gtl l又は pCR3 1か挙けられる。 次に、 一部からなる核酸か導入された発現ヘクターを宿王細胞に導入 胞としては 遺伝子の発現に通常使用されるものてあれは特に 胞、 昆虫細胞 植物細胞 微生物のいずれてあってもよく 具体 0S1 C0S7 CHO NIH/3T3 293 Raj i CV11 C1271 MRC-5 C は Sf9か挙けられる。 また 発現ヘクターを宿王細胞に導入する の方/去てあれは特に限定されないか 具体的には 例 は、 エ ノ リノ酸カルノウム法 DEAE-テキストラノ法 リホフエクンョ か挙けられる。 また 導入した遺伝子の発現は一過性 (transien もよく 安定的 （stable) な発現てあってもよい。 以上に述へ 次に、 前工程の細胞と被検化合物との接触によって生したト のリ ノ酸化を検出する。
PLK3は リノ酸化反 の基質として細胞内の ATPを利用して αをリノ酸化する。 本工程においては かかるリ ノ酸化を検出 方法としては特に限定されす公知の方/去により検出すれはよい えは リノ酸化反 をさせた後のトホイノメラーゼ Π αをトホ 体て免疫沈降させ 得られたトホイノメラーゼ IIひのリ ノ酸化 確認する方法か挙けられる。
次に 前工程て検出されたトホイノメラーセ II ctのリノ酸化 合物を接触させなかった細胞におけるトホイノメラーセ Π αの 比較する。 すなわち 被検化合物を作用させた細胞における PLK ールと比較をし 活 の強弱を認定する。
被検化合物か PLK3の酵素反応を阻害する機能を有する場合に り被検化合物存在下における PLK3の酵素活性かコノトロールと すなわち、 当該被検化合物は PLK3阻害剤として機能すると判断 酵素活性か有啻に高い場合には 当該被検化合物は PLK3活 を ると判断てきる。
本発明の化合物の評価方法の第 4の態様は 活 I"生化 Rasを有す 腫瘍効果を示し且つ PLK3に作用する化合物の評価方法てあって る細胞に被検化合物を接触させる工程と 当該 PLK3の発現量を 該発現量と 被検化合物を接触させなかった細胞における PLK3 工程と、 を含むことを特徴とする。 ノクされた核酸を有するヘクターを宿主細胞に導入することに て 前記ヘクターとしては 発現へクタ一として利用可能なも されないか、 例 は pCMV - Tag pcDNA3 1 pBlueBacHis2 pCI lneo、 pXTl pSG5 pEFl/V5-HisB pCR2 1 pETl l え gtl l又は p 。 次に 前記遺伝子又はその一部からなる核酸か導入された発 胞に導入する。 かかる宿王細胞としては 遺伝子の発現に通常 れは特に限定されす 動物細胞、 昆虫細胞 植物細胞 微生物 よく 具体的には 例えは、 C0S1 C0S7、 CHO NIH/3T3 293 MRC-5 CPAE HeLa 293T又は Sf9か挙けられる。 また 発現 に導入する方法としては 公知の方法てあれは特に限定されな 例えは エレク トロホレーンヨ ン リノ酸カルノウム法 DEAE- ホフェクノョノ法又は遺伝子銃か挙けられる。 また 導入した (transient) の発現てあってもよく 安定的 （stable) な発 以上に述へた方法により PLK3か発現した細胞を得ることかてき 次に 上述した細胞に被検化合物を接触させる。
接触させる方法としては特に制限はなく 当業者に周知の方 いか 具体的には 例 は 細胞の培養液若しくは緩衝液中又 被験化合物を^加すること溶液中ての接触を挙けることかてき ても特に制限はなく 溶液の温度及ひ pH、 接触時間等の諸条件 を選択することかてきる。
次に 前工程の細胞と被検化合物との接触によつて生した PLK 検出する。 先す 当該接触によって生した PLK3の発現量の変化 エイ上の Rasか活 化している細胞において PLK3を強制発現さ 細胞の形態変化か誘引され その結果、 細胞か^遊することを は PLK3の活 化や発現誘導により 癌細胞か足場依存性を失う o
( 2 ) 化合物の評価方法によって得られた化合物
上述した本発明の化合物の評価方法の第 1〜第 4の態様によ 評価することにより PLK3阻害剤または活性化剤としての機能 クリーニンクし 得ることかてきる。 こうして得られた化合物
0
このような化合物としては その性状は特に制限はなく、 例 有機化合物 機化合物 タンハク質 ヘプチト等の単一化合 ノス RNAi又はリホサイムか挙けられる。
本発明の化合物の評価方法て得られた化合物をヒ トゃ他の動 する場合には、 これらの物質自体を直接 *者に投与する以外に 法により製剤化して投与を行うことも可能てある。 例えは した錠剤 カプセル剤 エリキノル剤 マイクロカプセル剤と いは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る/夜との 菌性 注射剤の形て非経口的に使用てきる。 例 は、 薬理学上許容さ 体 具体的には 滅菌水や生理食塩水 植物油 乳化剤、 ^濁 定剤 香味剤 賦形剤 へヒクル 防腐剤、 結合剤等と適宜組 認められた製薬実施に要求される単位用量形態て混和すること ことか考えられる。 用いて通常の製剤実施に従って処方することかてきる。
注射用の水溶液としては 例 は生理食塩水、 フ トウ糖やそ 等張/夜 例えは D-ノルヒ トール D-マノノース D-マノニトー か挙けられ、 適当な溶解補助剤 例えはアルコール、 具体的に ァノレコーノレ 例 はプロヒレノクリコール ホリエチレノクリコ 界面活性剤 例えはポリノルへート 80 (TM) HC0 - 50と併用して
/由 /夜としてはコマ油 大豆油かあけられ 溶解補助剤として ヘンノルアルコールと併用してもよい。 また 緩衝剤、 例 酢酸ナトリウム緩衝液 to痛化剤 例 は、 塩酸フロカイノ ノルアルコール フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 通常 適当なアンプルに充填させる。
崈者への投与は 例 は 動脈内注射 静脈内任射 皮下注 内的 経気管支的 筋内的 経皮的 または経口的に当業者に いうる。 投与量は、 崈者の体重や年齢、 投与方法なとにより変 あれは適当な投与量を適宜選択することか可能てある。 また 当 りコートされうるものてあれは 当該 DNAを遺伝子冶瘁用ヘクタ 冶療を行うことも考 られる。 投与量、 投与方法は ¾者の体 により変動するか 当業者てあれは適宜選択することか可能てあ 化合物の投与量は 症状により差異はあるか、 経口投与の場 体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0 1から lOOmg 好ま mg より好ましくは約 1 0から 20mgてあると考えられる。
非経口的に投与する場合は その 1回の投与量は投与対象 絨毛上皮かん、 子宮体かん 子宮頸かん 腎盂 尿管かん 膀 陰茎かん 睾丸かん 胎児性かん ウィルムスかん 皮膚か 経芽細胞腫 骨肉腫 ユーイノク腫 軟部肉腫 アルノハイマ 病等の神経変性疾¾なとか挙けられる。
( 3 ) PLK3活性測定用へフチト
本発明の PLK3活性測定用へプチトを基質として PLK3の活性を る。 本発明の PLK3活性測定用へプチトは トホイノメラーゼ ΙΙ 且つ少なく とも 2アミノ酸を有する。 また アミノ酸数は PLK は特に制限はないか 3アミノ酸以上てあることか好ましく ることかより好ましく 1 0アミノ酸 上てあることかさらに は少なくとも下記のへフチトか PLK3の基質となり また PLK1の LK3特異的な基質として使用可能てあることを確認しており ま 1339〜Aspl346に相当する 8アミノ酸（ 1又は 2以上のァミノ酸 入かあつてもよい） か含まれていれは PLK3の良好な基質になり なお ヘプチト中 （T) はトホイノメラーセ Π αの Thrl342を示
SDFDEK (T) DDEDFV (配列番号 3 )
SAFDEK (τ) DDEDFV (配列番号 4 )
SDADEK (Τ) DDEDFV (配列番号 5 )
SDFAEK (τ) DDEDFV (配列番号 6 )
SDFDAK (Τ) DDEDFV (配列番号 7 )
SDFDEA (Τ) DDEDFV (配列番号 8 )
SDFDEK (Τ) ADEDFV (配列番号 9 ) (実施例）
以下、 実施例に基ついて本発明をより具体的に説明するか 施例に限定されるものてはない。
(PLK 1及ひ PLK3の細胞周期における発現分布の確認）
同調培養した HeLa S3細胞における PLK1及ひ PLK3の発現を確認 LK3の細胞周期における発現分布を確認した。
図 1に示すとおり、 PLK1は G2/M期て発現か増加しているのに 期には依存せず発現していることか確認てきた。 すなわち PLK おいて発現かォーハーラノブしていることか確認てきた。
(PLK及ひ合成へプチトの調製）
ヒ ト PLK1及ひ PLK3遺伝子をヒ ト精巣から PCRにより増幅し pB に導入した。 タノハク質の発現と精製のため PLK1及ひ PLK3の c ター （Amersham Pharmacia社） にクローニンクした。 発現ヘクタ 入し、 0 ImMの lsopropyl- jS -D (-) - thiogalactopyranoside (IPTG 時間の条件の下 glutathione S-transferase (GST) 融合 PLKの ST - PLKは glutathione - Sepharose 4B (Amersham Pharmacia社） ssion proteaseを用レヽて溶出させた。 また、 Topoisomerasell ひ EN社製を使用し、 基質へプチトは定法により合成した後 HPLC (in vitro kinase assay)
基質タノハク質を PLK1又は PLK3と 50 μ M ATPと 10 μ Ci [ γ -3 ol , Amersham Biotechnology) を含む R緩衝/夜 (20mM Tris-HCl, , 4 5mM 2-mercaptoethanol lmM EGTA) 中て 30。C 30分間イ ラノブし メノフレンを 2M NaClて 3回、 1%H3P04を含む 2M NaCl 液体ノンチレーノョ ノカウンターて放射活性を/則定した。
(PLK発現細胞の調製）
PLK1及ひ PLK3を哺乳動物細胞て発現させるため、 それそれの c tratagene社） ヘクターにクローニンクした。 また キナーゼ活 製するため Quick Change site-directed mutagenesis kit (S いて 91番目のリノノをメチォニノに 185番目のァスハラキノ した。
PLKの発現に使用する細胞としてヒ ト胎児腎臓 293Tを用いた。 胎児血凊 (FBS Moregate Bio Tech社） を含む Dulbecco' s modi dium (GIBC0社） を用いて培養した。 FuGENE6 transfection rea ular Biochemicals社） を用いて 発現ヘクターを 293T細胞にト しノ o
(免疫沈降）
免疫沈降に使用するため 発現ヘクターを導入した 293T細胞を Hepes pH7 4 250mM NaCl 0 2% NP40 5mM EDTA 10% glycerol itor mix) に懸濁し 水上て 30分間静置した。 次に、 可溶化か終 30分間遠'し、分離し 細胞抽出液を得た。 得られた細胞抽出液を抗 つき 40 μ 1 抗 FLAG M2 Affinity Gel Freezer-Safe (SIGMA社） 、 3 μ 1 抗 Topoisomerasellひ抗体） を加 て水上て 60分間静置し garoseを加 て 4°Cて 2時間混和した。 /昆和の終了した溶液は抽出 aemml i SDS sample bufferて agaroseヒース刀、ら溶出し 7こ。 (へプチト基質を用いた PLK3の基質特異性の検討）
表 1に示すように 種々の分子の部分へプチトを合成して基 及ひ PLK3によるリノ酸化を検討した。 Cdc25C Serl98を基質とし LK3の活性を 100として 各種基質の相対的な活性を測定した。
(表 1 )
Figure imgf000020_0002
その結果、 トホイノメラーゼ Π αの Thrl342を含むヘプチトか P して機能していることか明らかとなった。
次に トホイノメラーゼ Il ctか PLK3の特異的な基質となり う 表 2に記載のへプチトを合成して PLK1及ひ PLK3のリノ酸化能 ひ PLK3は大腸菌て発現させた組換え体を使用した。 0 2に示すと LK3の発現を CBB (Coomassie Bri lliant Blue)染色及ひ PLK 1 と P を用いたウェスタノフロノティノクにより確認した。 次にリノ c25C Serl98を基質とした場合の PLK1及ひ PLK3の活性を 100とし 的な活性を/則定した。 ヘプチト中 中央の 「T」 はトホイノメラ を示す。 また 合成したヘプチトは、 トホイノメラーゼ IIひの T
-5位から +4位のアミノ酸を順に Alaに置換したものてある。
(表 2 )
Figure imgf000020_0001
Topo l l D1344A SDFDEKTDAEDFV < 10 900
Topo l l D1345A SDFDEKTDDADFV < 10 1000
Topo l l D1346A SDFDEKTDDEAFV < 10 1600
Topo l l D1343FA SDFDEKTFDEDFV 270 3700
表 2に示すとおり トホイノメラーゼ Π αの Thrl342を含む 特異的な基質として機能していることか確認することかてきた。
また PLK3かへプチトのみならすトポイノメラーセ Π αを特 とを確認するため 組換えトポィノメラーゼ IIひを基質として のリノ酸化能を検討した。 0 3に示すとおり、 トホイノメラー てのみリノ酸化されることか確認てきた。 また 抗トポイノメ いたウェスタノフロノティノクを行った結果 PLK3によってリ イノメラーセ IIひか検出され、 トポィノメラーセ の T1342か P てあることか確認することかてきた。
実施例 2
(細胞における PLK3の基質特異性の検 ft)
次に 細胞内においても トホイノメラーゼ II αか PLK3の特異 かを検討するため 下記の試験を行った。 PLK3を導入した 293Τ 酸化トポィノメラーセ IIひ T1342抗体を用いてウェスタノフロノ 0 4に示すとおり PLK3の過剰発現により トホイノメラーセ I 導されていることか確認することかてきた。
次に キナーゼ活 を失った PLK3 (K91M又は D185Aのアミノ酸 93Τ細胞に導入した形質転換細胞を作製し、 野生型 PLK3とリノ酸
0 8に示すとおり 前記の形質転換細胞ては PLK3はトポイノメ とおり Flag-PLK3を検出することかてきた。 すなわち PLK3と Iひか細胞内て相互作用しており PLK3かトポイノメラーゼ IIひ 能を発揮していることを確認することかてきた。
次に PLK1又は PLK3を 293T細胞に導入した形質転換細胞を用 ィノメラーゼ II a Thrl342抗体によりウェスタノフ口ノティノク
0 5に示すとおり PLK3の過剰発現により PLK1の場合と比較 ゼ IIひか強く リノ酸化されていることを確 ISすることかてきた。
実施例 3
(アンチセンス PLK3を導入した細胞を用いた PLK3の基質特異性 293T細胞は 10%牛胎児血凊 （FBS Moregate Bio Tech社） を odified Eagle ' s medium (GIBC0社) を用いて培養した。 FuGEN eagent (Roche Molecular Biochemicals社） を用いて 発現ヘ トラノスフヱクノョノした。 アンチセンス PLK3を導入した 293T 細胞に PEF-anti-sense PLK3を導入した。
0 9に示すとおり ァノチセノス PLK3を導入した 293T細胞て されたことを確認てきた。 一方 同細胞について抗トポイノメ 抗リノ酸化トホイノメラーセ IIひ T1342抗体を使用してウェスタ ところ 0 1 0に示すとおり、 トホイノメラ一セ Π αの発現か ルにおけるトポィノメラーゼ IIひに対するリノ酸化トホイノメ 比へ アンチセノス PLK3を導入した細胞においてリノ酸化トポ 割合の減少か確認された。 また 0 1 1に示すように コント 入した細胞ては 約 250kDaのハノトか 抗トポイノメラーゼ IIひ ラーゼ Π α Τ1342抗体のいすれても検出されたため このハノト II αてあることか考 られた。
また ァノチセノス PLK3を導入した細胞を G418 (1600 μ g/m 間培養し 導入遺伝子を安定発現 （stable expression) する 29 S#12細胞） を調製した。 その細胞における PLK3の発現と、 293T 発現とを比較した。 図 1 2に示すとおり PLK3の発現を抑制し メラーゼ II αの発現か顕著に増加した。 このような PLK3と トポイ 発現の変化は癌細胞の表現系を反映している。
また 293Τ細胞及ひ AS#12細胞 （それそれ 1 5xl03個） を アト lamycin) ゃスタウロスホリノ (staurosporine) のような細胞毒 2時間処理 生存率を MTTァノセィにより測定した。 MTTァノセィ ノタ化学社） を用いて測定した。 0 1 4に示すとおり pan- kin るスタウロスホリノ処理した場合 293T細胞及ひ AS#12細胞の細 れなかった。 一方 0 1 3に示すとおり、 トホイノメラーゼ ΙΙ α リアマイノン処理した場合 AS#12細胞の生存率は 293Τ細胞の 2 れは、 トホイノメラーゼ Π α阻害剤に対する抵抗性か トホイ ノブレキュレーンョノに依存していることを示している。
実施例 4
(トホイノメラーセ Π α阻害剤 ICRF-193による PLK3の活性の変 トポイノメラーゼ 阻害剤てあり 細胞周期の G2脱連環チヱ decatenation checkpoint) 試薬てある ICRF- 193て処理をした 29 LK3の活性かとう変化をするかを確認するため 下記の試験を行 沈殿物と基質てあるひ一カゼイノを、 50 μ Μ ΑΤΡと 10 μ ( ι [ γ -33P] Amersham Biotechnology社）を含む R,緩衝液 (20mM Tris-HCl, pH7 M 2-mercaptoethanol, lmM EGTA) 中て 30°C 30分間ィノキュ^ ^ 反応を終えたタノハク質は SDS - PAGEにより展開し、 オートラノ 析を行った。
0 1 5に示すとおり 時間の経過に伴って PLK3の活性か上昇 てきた。 この間 PLK3のタノハク質の総量に変化は舰かったこ 環チェノクホイノトにおいても活性化されていることか確認て ノメラーゼ Π αのタノハク質量についても検討したところ、 0 1 時間の経過に伴ってタウノレキュレートされていた。 この現象 阻害剤 （Proteasome inhibitor) MG132によって抑制されること ら ICRF - 193処理により トポイノメラーゼ ΙΙ αの分解か促進 きた。
また 0 1 5及ひ 1 6より、 PLK3の活性化に伴ってトポイノ ノレキュレーンヨ ン又は分解か生しることか確認てきた。
次に、 G2チェノクポイントにおける PLK3の役割を検証するた K3を導入した 293T細胞に 導入の 2 4時間後 2 μ Μ ICRF-193を 時間後に細胞を回収して FACS解析を行った。 FACS解析は次のよう フローサイ トメ トリーに使用する試枓を PBSて洗净し 70%エタノ — 20°Cて固定した。 固定を終 た細胞は PBSて一度洗浄し RNase ropidium iodide (10 μ gZml)により染色した。 解析は FACSCal ib son社） により行い 細胞周期は CellQuestにより解析した。 実施例 5
(PLK3の導入による細胞の形態変化）
PLK3の導入によって DNAラターの形成を伴うァホトーノスの誘 告 （J Biol (¾6111 ， 第2 7 6卷 4 3 3 0 5頁 2 0 0 1年） LK3の過剰発現によつて細胞の形態変化を伴うアポトーノスか誘 検討した。 PLK3は EGFPと共に 293T細胞に導入した。 0 1 9に示 入した細胞は球形を示した。 一方 K91Mの変異を導入してキナ K3を導入した細胞ては形態の変化は見られなかった。 このこと は PLK3のキナーゼ活 に依存していることか確認てきた。 しか 促進する遺伝子として知られるカスハーゼ 9 (caspase9) を導 形態とは異なっていた。
次に PLK3によってァホトーノスか誘導されていることを確 析を行った。 また ポンティフコノトロールとして カスハー 導入した細胞を用いた。 0 2 0に示すとおり カスハーゼ 9ては トーノスの誘導か確認されたか PLK3ては確 ISされなかつた。 次に、 カスハーセ 9及ひ PLK3導入の際の細胞の形態の相違か 確認するため 下記の試験を行った。 細胞周期力 M期て停止して 球形の形態を呈するため ノコタノール (Nocodazole)処理した た細胞の形態とを比較した。 0 2 1に示すとおり、 ノコタノー K3を導入した細胞と比較して球形にはならなかった。
また、細胞周期の M期て増殖を停止していることを示すマーカ ストン H3の割合を測定した。 0 2 2に示すとおり ノコタノー おり、 PLK3を過剰発現すると細胞の増殖か阻害されることか確 ナーゼ活性を失った K91M変異体の過剰発現ても細胞の増殖阻害 次に PLK3を過剰発現させた細胞を 6418 (1600 1111)を含 養し その間の細胞のコロニー数をカウノトした図2 4に示す 性依存的に細胞の増殖阻害か確^てきた。
実施例 7
(PLK3及ひ Ras (V12)の過剰発現 （共発現） による細胞の形態の 過剰発現により細胞の形態変化をもたらすことか知られている
LK3と共に強制発現させ、 細胞の形態を観察した。 図 2 5に示す (V12)と PLK3を共発現した細胞ては/孚遊する細胞か顕著に多く観
、 PLK3のキナーゼ活性依存的に浮遊細胞の数か増加することか すなわち Rasか活性化している癌細胞に PLK3を過剰発現する ーセ活 を活性化することかてきれは PLK3による形態変化を介 待されることか確認てきた。 産 業 上 の 利 用 可 能 性
以上説明したように PLK3の特異的な基質としてトポィノメ れた。 PLK3及ひトホイノメラーゼ Π αを用いることにより PLK の評価 （スクリーニノク等） か可能となる。 また トポイノメ プチトを基質として使用することによつても、 PLK3に作用する となる。 すなわち 本発明により、 PLK3を創薬檸的としたスクリ なり PLK3か関与する疾崈 （例えは 癌や神経変性疾崈） の冶

Claims

Figure imgf000027_0001
1 PLK3に作用する化合物の評価方法てあって PLK3、 トホイノメラーゼ IIひ及ひ被検化合物の存在下て酵素
該酵素反応における PLK3の酵素活 と 被検化合物非存在下 活性とを比較する工程と、 を含む 化合物の評価方法。 2 PLK3に作用する化合物の評価方法のてあって
PLK3 被検化合物及ひスレオニノを含み且つァミノ酸数か 2 の存在下て酵素反応をさせる工程と 該酵素反応における PLK3の酵素活性と 被検化合物非存在下 活性とを比較する工程と を含む 化合物の評価方法。
3 前記アミノ酸数か 2〜 2 0てある、 請求項 2に記載の化 4 前記へフチトか 配列番号 3〜1 2に記載のアミノ酸配 のレ、すれか一ってある 請求項 2に記載の化合物の評価方法。
5 PLK3に作用する化合物の評価方法てあつて
PLK3及ひトホイノメラーセ IIひか発現している細胞に被検化 程と 該トホイノメラーセ のリノ酸化を検出する工程と 該リノ酸化のレヘルと被検化合物を接触させなかった細胞に ーゼ Π αのリノ酸化のレヘルを比較する工程と を含む 化合 物の評価方法。
8 前記化合物か PLK3活性化剤てある、 請求項 1〜6のいす 合物の評価方法。
9 リノ酸化を受けるスレオニノ及ひ該スレオニノの C末端に ノ酸を含み、 且つ アミノ酸数か 1 0〜 1 5てある PLK3活性
1 0 配列番号 3〜 1 3に記載のアミノ酸配列を有するヘプ 性/則定用へプチト。
1 1 配列番号 3〜1 3に記載のアミノ酸配列からなるヘプ 性/則定用へプチト。
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