WO2007037133A9 - Plk3に作用する化合物の評価方法 - Google Patents

Plk3に作用する化合物の評価方法

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WO2007037133A9
WO2007037133A9 PCT/JP2006/318308 JP2006318308W WO2007037133A9 WO 2007037133 A9 WO2007037133 A9 WO 2007037133A9 JP 2006318308 W JP2006318308 W JP 2006318308W WO 2007037133 A9 WO2007037133 A9 WO 2007037133A9
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topoisomerase
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Masato Iida
Hideya Komatani
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Banyu Pharma Co Ltd
Masato Iida
Hideya Komatani
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/533—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isomerase
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating a compound targeting PLK3. ⁇ Background technology
  • PLK Poly-like-kinase
  • PLK4 is a serine / threonine kinase involved in the cell cycle, and four types of PLK1 to PLK4 are known in mammals.
  • PLK1 phosphorylates various substrates to centrosome maturation (J. Cell. Biol., 1st 35th, 17th, 1 1996, Nat. Cell. Biol., 3rd, 421) , 2001), transition to mitosis (Science, 273, 1377, 1996), chromosomal division (Cell ', 105, pp. 459, 2001), end of mitosis (Mol. Cell, 1st, 371, 1998), G2 / M phase progression, such as cytoplasmic cleavage (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99th, 8672, 2002) Plays an important role.
  • PLK3 is also known to be involved in G2 / M phase progression through phosphorylation of Cdc25C, which regulates the G2 / M transition by regulating the Cdc2 / cycl inB complex (Mu stapha 0ncogene, 23rd, 2658, 2004: Non-patent document 1).
  • Cdc25C phosphorylation of Cdc25C
  • Cdc2 / cycl inB complex Mo stapha 0ncogene, 23rd, 2658, 2004: Non-patent document 1
  • it has been suggested to be associated with checkpoints and apoptosis.
  • the kinase activity of PLK3 increases rapidly in an ATM kinase-dependent manner in response to DNA damage (J. Biol. Chem., 276, 43305, 2001: Non-patent literature). 2).
  • PLK3 physically interacts with P 53, causing P 53 20 Report that the second Ser is phosphorylated and ⁇ 3 is spoken (J. Biol. Chem., 276, 36194, 2001: Non-Patent Document 3) and by overexpressing PLK3, p53 + There is a report that induces apoptosis in / + cells (J. Biol. Chem., 280, 16843, 2005: Non-patent document 4). .
  • PLK1 and PLK3 are common in that they function in the cell cycle G2 / M phase, but their functions are thought to be different. '
  • Non-patent Document 4 J. Biol. Chem. V 280, 16843, disclosed in 2005
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and aims to clarify the substrate of PLK3 and to evaluate a compound using the substrate.
  • topoisomerase ⁇ is a substrate of PLK3 and that its phosphorylation site is the 1342th Thr
  • topoisomerase II ⁇ Alternatively, it has been found that by using a peptide containing the above-mentioned phosphorylation site as a substrate, it is possible to evaluate a compound (for example, screening) using PLK3 as a drug discovery target. completed.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on PLK3, comprising a step of performing an enzyme reaction in the presence of PLK3, topoisomerase ⁇ and a test compound, and an enzyme of PLK3 in the enzyme reaction. Comparing the activity with the enzyme activity of PLK3 in the absence of the test compound.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on PLK3, wherein the enzyme reaction is carried out in the presence of a peptide containing PLK3, a test compound and threonine and having 2 or more amino acids. Process, enzyme activity of PLK3 in the enzyme reaction, and test And a step of comparing the enzymatic activity of PLK3 in the absence of the compound.
  • the number of amino acids is preferably 2 to 20.
  • the peptide is preferably any one of peptides having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 3 to 12.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on PLK3, the step of contacting a test compound with a cell expressing PLK3 and topoisomerase II ⁇ , and a phosphorylation of said topoisomerase ⁇ . A step of detecting oxidation, and a step of comparing the level of phosphorylation with the level of phosphorylation of topoisomerase Il ct in cells not contacted with the test compound.
  • the compound evaluation method of the present invention is a method for evaluating a compound acting on PLK3.
  • a method for evaluating a compound it is possible to isolate, curb or evaluate a compound exhibiting antitumor efficacy against cancer cells having activated Ras.
  • PLK3 inhibitor characterized by being selected by any of the above-described iffi methods for evaluating compounds.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is characterized in that, in the above-described method for evaluating a compound, the compound is a PLK3 activator. It is possible to provide a drug with high antitumor effect on cancer cells or cancer tissues in which Ras is activated in the Ras-MAPK pathway.
  • the peptide for measuring PLK3 activity of the present invention comprises threonine that undergoes phosphorylation and aspartic acid adjacent to the C-terminus of the threonine, and has 10 to 15 amino acids. .
  • PLK3-specific activity can be measured.
  • the peptide for measuring PLK3 activity of the present invention is preferably a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 3 to 13. To use such peptides Therefore, PLK3-specific activity measurement becomes possible.
  • the peptide for measuring PLk3 activity of the present invention is preferably a peptide comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 3 to 13. By using a strong peptide, PLK3-specific activity can be measured.
  • toposomerase ⁇ as a specific substrate for PLK3. Therefore, according to the present invention, by using PLK3 and topoisomerase Il ct, it becomes possible to evaluate (screening etc.) a compound that acts on PLK3.
  • the use of a partial peptide of topoisomerase ⁇ as a substrate makes it possible to evaluate compounds that act on PLK3.
  • topoisomerase II ⁇ or this partial peptide can be used as a substrate for PLK3, it is also useful as a tool for studying intracellular signal transduction via PLK3 and PLK3.
  • FIG. 1 shows the results of examining the expression distribution of PLK1 and PLK3 in the cell cycle. ⁇
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of confirming that recombinants of PLK and PLK3 are normally expressed in E. coli.
  • FIG. 3 shows the results of detecting phosphorylation of PLK1 and PLK3 using topoisomerase II ⁇ as a substrate.
  • FIG. 4 shows the results of confirming that phosphorylation of topoisomerase II ⁇ is induced by overexpression of PLK3.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of comparison of the degree of phosphorylation of topoisomerase ⁇ due to overexpression of PLK1 or PLK3.
  • Figure 6 shows immunoprecipitation with anti-Flag antibody using cells forcibly expressing PLK3, and Western blotting with anti-phospho topoisomerase ⁇ ⁇ ⁇ 1342 antibody.
  • Figure 7 shows the results of confirming that topoisomerase II ⁇ can be detected.
  • Figure 7 shows that immunoprecipitation was performed with anti-topoisomerase II antibody using cells in which PLK3 was forcibly expressed, and Western blotting was performed with anti-Flag antibody. It is a figure which shows the result of having confirmed that PLK3 can be detected by performing teeing.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of comparison of phosphorylation ability with wild-type PLK3 using cells into which PLK3 that has lost its kinase activity has been introduced.
  • FIG. 9 shows the results of confirming the expression of PLK3 in 293T cells into which antisense PLK3 was introduced.
  • Figure 1.0 shows the results of confirming the expression and phosphorylation of toposomerase II in the 293T Itoda vesicle introduced with antisense PLK3.
  • ⁇ 11 is a diagram showing the result of detecting a 250 kDa protein shift using the same blot as in FIG.10. .
  • FIG. 12 shows the results of confirming the expression of PLK3 and toposomerase II ⁇ in 293T cells stably expressing antisense PLK3.
  • FIG. 13 shows the results of confirming cell proliferation when 293 ⁇ cells and 293 ⁇ cells introduced with antisense PLK3 were treated with adriamycin.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of confirming cell proliferation when 293 cells and 293 cells transfected with antisense PLK3 were treated with staurosporine.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of measuring the activity of PLK3 on 293 cells treated with ICRF-193.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of measuring the expression and activity of topoisomerase II ⁇ in 293 cells treated with ICRF-193.
  • Fig. 17 is a diagram showing the results of confirming the state of G2 arrest when 293 cells transfected with antisense PLK3 were treated with ICRF-193.
  • FIG. 18 shows the results of confirming the state of G2 arrest when 293T cells introduced with PLK3 or K91M mutant PLK3 were treated with ICRF-193.
  • FIG. 19 is a diagram showing the results of confirming the morphological changes of cells in which PLK3, PL 3 K91M mutant or caspase 9 was overexpressed.
  • FIG. 20 is a diagram showing the results of detecting the number of cells in the subGl phase in the cell cycle of cells overexpressing PLK3, PLK3 K91M mutant or caspase-9.
  • FIG. 21 shows the results of confirming the morphological changes of cells treated with nocodazole.
  • FIG. 22 is a graph showing the results of measuring the proportion of phosphorylated histone H3 in cells treated with PLK3, PLK3 K91 mutant or nocodazole.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of measuring the proliferation of cells overexpressing PLK3, PLK3 K91M mutant and PBD.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of measuring the long-term cell growth ability (Roloney-forming ability) of cells overexpressing PL 3 or PLK3 91M mutant.
  • Figure 2.5 shows the results of examining the morphology of cells co-expressing activated Ras (V12) and PLK3.
  • the gene according to the present invention is PLK3 (Accession No. NM-004073: SEQ ID NO: 1).
  • the species from which the PLK3 gene is derived is not particularly limited, and examples include humans, monkeys, mice, rats, dogs, and rabbits. Among them, a human gene is preferable because the administration target of the compound to be evaluated is human.
  • the gene according to the present invention includes a gene having substitution, deletion, addition or insertion of one or more bases as long as it has the same physiological function as the gene.
  • the sequence of the gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding PLK3 protein, but the homology is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, More preferably 80% or more, and 90% or more (for example, 9 1, 9 2, 9 3, 9 4, 9 5, 9 6, 9 7, 9 8, 9 9% or more) Is particularly preferred.
  • the gene according to the present invention includes a gene containing a nucleic acid that hybridizes with the gene under stringent conditions.
  • “hybridizes under stringent conditions” means that two nucleic acid fragments are Molecula. • r Cloning:. A Laboratory Manual , Second Edition, Konoredo, Supurinku ,, Nononoku (198 9), in hybridization one Deployment conditions described 9.47-9.62 and 11-45-11 6 1, phase , which means that they are highly pre-hyped to each other. More specifically, for example, the conditions include: 6. • 0XSSC hybridization at about 45 ° C, and 2. OxSSC washing at 50 ° C.
  • the salt concentration in the washing process can be selected, for example, from about 2.0xSSC at 50 ° C as low stringency to about 0.2XSS (:, 50 ° C as high stringency)
  • the temperature of the cleaning process can be increased from room temperature, about 22 ° C, under low stringency conditions, to about 65 ° C, under high stringency conditions.
  • a protein that is a transcription product of the PLK3 gene according to the present invention may have one, two or more base substitutions, deletions, additions or insertions as long as it has a physiological function equivalent to that of the PLK3 protein. included.
  • the sequence of such a protein is not particularly limited, but the homology is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, further preferably 80% or more, and 90% or more. (For example, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% or more) is particularly preferable.
  • the biological species from which the gene is derived is not particularly limited: for example, human, monkey, mouse, rat, Inu or Usagi. Among them, a human gene is preferable because the administration target of the compound to be evaluated is human.
  • the topoisomerase ⁇ gene includes a gene having substitution, deletion, addition or insertion of one or more bases as long as it has a physiological function equivalent to that of the gene.
  • the sequence of the gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding such a protein, but the homology is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and 80% or more. More preferably, it is 90% or more (for example, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% or more).
  • the topoisomerase ⁇ gene according to the present invention includes a gene containing a nucleic acid that hybridizes with the gene under stringent conditions.
  • the topoisomerase ⁇ protein which is a transcription product of the gene according to the present invention, has one or more base substitutions, deletions, additions, and the like as long as it has a physiological function equivalent to that of the protein. Or what has insertion is also included.
  • the sequence of the protein is not particularly limited, but the homology is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and more preferably 80% or more. Preferably, it is 90% or more (for example, 91, 92, 93, 94, '95, 96, 97, 98, 99% or more). .
  • poisomerase ⁇ has been identified as a substrate for PLK3, and the present inventors have found that the threonine at position 1342 is phosphorylated by PLK3. That is, any peptide containing the 1342th threonine can be used as a substrate for PLK3.
  • the number of amino acids in such a peptide is not particularly limited, and a desired amino acid number can be selected. However, it is preferably 2 amino acids or more, more preferably 5 amino acids or more, and 10 amino acids. It is even more preferable that this is the case.
  • test compound is not particularly limited as long as it is a molecule that targets PLK3 for drug discovery.
  • natural compounds organic compounds, inorganic compounds, proteins
  • Single compounds such as peptides, compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermentative microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts And eukaryotic single cell extract or animal cell extract.
  • the test sample can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label. In addition to the above test sample, a mixture of a plurality of these test samples is also included.
  • a first aspect of the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on PLK3, comprising a step of causing an enzyme reaction in the presence of PLK3, topoisomerase ⁇ and a test compound, A step of comparing the enzyme activity of PLK3 with the enzyme activity of PL K3 in the absence of the test compound.
  • an enzyme reaction is performed in the presence of PLK3, topoisomerase II and a test compound.
  • the enzyme reaction is a phosphorylation reaction of PLK3 using topoisomerase ⁇ as a substrate.
  • the reaction conditions for the phosphorylation reaction are not particularly limited as long as the reaction proceeds, and can be performed under conditions well known to those skilled in the art as the conditions for the phosphorylation reaction. For example, use phosphate buffer, Tris-HCl buffer, etc. as buffer solution.Adjust ⁇ to 6.0 to 8.0, preferably 7.0 to 8.0, and temperature to 25 to 45 °. C, preferably set at 30-40 ° C; the reaction may be allowed to proceed.
  • MgCl 2 , mercaptoethanol, EGTA, etc. can be appropriately added to the reaction solution as necessary, and these concentrations may be appropriately selected.
  • the reaction time may be set as appropriate. For example, the reaction may be performed for 10 to 60 minutes, preferably 20 to 40 minutes.
  • phosphorylation can be detected and quantified by detecting the label incorporated in topoisomerase II with autoradiography or scintillation counter.
  • a biotin label it is possible to detect and quantify phosphorylation without using radioisotopes by adopting detection means using avidin.
  • test compound When the test compound has a function of inhibiting the enzyme reaction of PLK3, this comparison results in a relatively low enzyme activity of PLK3 in the presence of the test compound. If the enzyme activity is significantly low in the presence of the test compound, it can be determined that the test compound has PLK3 inhibitory activity. On the other hand, when the enzyme activity is significantly high, it can be determined that the test compound has an activity to enhance the PLK3 activity.
  • a second aspect of the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on PLK3, and comprises an enzyme in the presence of a peptide containing PLK3, a test compound and threonine and having 2 or more amino acids. A step of reacting.
  • an enzymatic reaction is carried out in the presence of PLK3, a peptide and a test compound.
  • the enzyme reaction is a phosphorylation reaction of PLK3 using a peptide containing Thrl342 of topoisomerase ⁇ ⁇ as a substrate. is there.
  • the reaction conditions for the phosphorylation reaction are not particularly limited as long as the reaction proceeds, and can be carried out under conditions well known to those skilled in the art as the conditions for the phosphorylation reaction. Use phosphate buffer, Tris-HCl buffer, etc. as the buffer.
  • reaction time may be set as appropriate. For example, the reaction may be performed for 10 to 60 minutes, preferably for 2040 minutes.
  • ATP must be contained in the aqueous solution as a substrate for the phosphorylation reaction. By labeling ATP in a detectable state, the progress of the phosphorylation reaction can be easily detected.
  • Such labels for example, [ ⁇ - 33 ⁇ ] ⁇ , [ ⁇ - 32 ⁇ ] ⁇ , Ru include Piochin or fluorescent dyes.
  • the phosphorylation reaction can be detected and quantified by detecting the label incorporated into the peptide peptide with an autoradiography or scintillation counter.
  • the detection method using avidin can be used for detection and quantification of phosphorylation without using a radioisotope.
  • test compound When the test compound has a function of inhibiting the enzyme reaction of PLK3, this comparison results in a relatively low enzyme activity of PLK3 in the presence of the test compound. If the enzyme activity is significantly low in the presence of the test compound, it can be determined that the test compound has PLK3 inhibitory activity. On the other hand, when the enzyme activity is significantly high, it can be determined that the test compound has an activity to enhance the PLK3 activity.
  • a third aspect of the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on PLK3, comprising contacting a test compound with a cell expressing PLK3 and topoisomerase II ct, and topoisomerase II. Detecting the phosphorylation of chicks, and comparing the phosphorylation level with the level of phosphorylation of topoisomerase ⁇ in cells not contacted with the test compound.
  • test compounds are contacted with cells expressing PLK3 and topoisomerase II. '
  • the types of cells expressing PLK3 and topoisomerase II ct are not limited as long as PLK3, toboi.so, and merase II ⁇ are expressed. It may also be a test cell. Alternatively, cells in which PLK3 and small poisomerase II ct are forcibly expressed by genetic engineering may be used. As a method for forcibly expressing PLK3 and topoisomerase II by genetic engineering, methods known to those skilled in the art may be used. Specifically, for example, PLK3 and topoisomerase Il ct gene or a part thereof may be used.
  • the above nucleic acid is cloned into an expression vector containing a suitable promoter and transcriptional regulatory element, respectively, and a vector having a globulated nucleic acid is introduced into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be used as an expression vector.
  • pCMV-Tag pcDNA3.1, pBlueBacHis2, pCI-neo, pcDNAI, pMClneo, pXTl, pSG5, pEFl / V5-HisB, pCR2.1, pETll, gtll or pCR3.1.
  • an expression vector into which a nucleic acid comprising the gene or a part thereof has been introduced is introduced into a host cell.
  • the host cell is not particularly limited as long as it is usually used for gene expression, and may be any of animal cells, insect cells, plant cells, and microorganisms. For example, C0S1, C0S7, CH0, NIH / 3T3, 293, Raji, CV11, C1271, MRC-5, CPAE, HeLa, 293T, or Sf9.
  • any known method can be used, but there are no particular limitations, but specific examples include, e.g., the electroporation method, the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, and the lipofusion. Law or gene gun.
  • the expression of the introduced gene may be transient expression or stable expression.
  • test compound is brought into contact with the cells described above.
  • the contacting method is not particularly limited and may be carried out by methods well known to those skilled in the art. Specifically, for example, a test compound is added to a cell culture solution or buffer solution or to the cell extract. Mention may be made of contact in solution.
  • the contact condition is not particularly limited, and a suitable condition can be selected for various conditions such as the temperature of the solution, ⁇ , and contact time. Next, it detects the phosphorylation of topoisomerase ⁇ ⁇ ⁇ caused by the contact between the cell in the previous step and the test compound.
  • PLK3 phosphorylates toposomerase II ⁇ using intracellular cocoon as a substrate for phosphorylation.
  • phosphorylation may be detected.
  • the detection method is not particularly limited and may be detected by a known ⁇ method. Specifically, for example, toposomerase Il c after phosphorylation is immunoprecipitated with a toposomerase Il c antibody, A method of confirming phosphorylation of the obtained topoisomerase ⁇ with an anti-phosphorylated antibody can be mentioned. .
  • the level of phosphorylation of topoisomerase ⁇ detected in the previous step is compared with the level of phosphorylation of topoisomerase II in cells not contacted with the test compound.
  • the activity of PLK3 in cells treated with the test compound is compared with the control, and the strength of the activity is identified.
  • test compound has the ability to inhibit the enzymatic reactions PLK3 is lower written.
  • Ru! 3 LK3 of enzyme activity in the test compound the presence Ri by the comparison is compared to the control. That is, it can be determined that the test compound functions as a PLK3 inhibitor.
  • the enzyme activity is significantly high, it can be determined that the test compound has an activity to enhance PLK3 activity.
  • a fourth aspect of the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that exhibits an antitumor effect on cancer cells having activated Ras and acts on PLK3, and is used for cells expressing PUG.
  • test compound is brought into contact with cells expressing PLK3.
  • the type of cell is not limited as long as PLK3 is expressed, and it may be a cell derived from a living tissue, or may be a lined test cell. .
  • cells in which PLK3 is forcibly expressed by genetic engineering may be used.
  • a method for forced expression of PLK3 by genetic engineering a method known to those skilled in the art may be used. Specifically, for example, a suitable promoter and transcription each of a nucleic acid comprising PLK3 gene or a part thereof may be used.
  • Cloned into an expression vector containing regulatory elements • Prepare by introducing a vector with the encoded nucleic acid into the host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be used as a current vector, for example, pCMV-Tag, pcDNA3.1, pBlueBacHis2, pCI_neo, pcDNAI, pMC. pSG5, pEFl / V5-HisB, pCR2.1, pETll, gtll or pCR3.1.
  • an expression vector into which a nucleic acid comprising the gene or a part thereof has been introduced is introduced into a host cell.
  • host cells are not particularly limited as long as they are commonly used for gene expression, and may be any of animal cells, insect cells, plant cells, and microorganisms.
  • the method for introducing the expression vector into the host cell is not particularly limited as long as it is a known method, and specifically, for example, the electrical mouth position method, the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, the report method: Or a gene gun is mentioned.
  • the expression of the introduced gene may be transient or stable.
  • the contacting method is not particularly limited and may be carried out by methods well known to those skilled in the art. Specifically, for example, a test compound is added to a cell culture solution or buffer solution or to the cell extract. Mention may be made of contact in the sap.
  • the contact condition is not particularly limited, and a suitable condition can be selected for various conditions such as the temperature of the solution, ⁇ , and contact time.
  • the change in the expression level of PLK3 caused by the contact of the test cell with the test compound is detected.
  • the change in the expression level of PLK3 caused by the contact is measured.
  • the method for measuring the expression level is not particularly limited, and specific examples include Northern blotting for measuring the amount of intracellular mRNA and Western blotting for measuring the amount of protein.
  • the measured value obtained is compared with the expression level of PLK3 in a cell (control) not contacted with the test compound. As a result of comparison, if the expression of PLK3 is decreased by contact with the test compound, it can be confirmed that the compound functions as an inhibitor of PLK3. On the other hand, if the expression level is increased, it can be confirmed that the compound functions as an activator of PLK3.
  • the inventors have identified Ras-APK pass-through. ⁇ It has been found that in cells in which Ras on the ray is activated, the morphological change of the cell is induced by forced expression of PLK3, and as a result, the cell floats. This indicates that PLK3 activation and expression induction cause cancer cells to lose their anchorage dependence.
  • a compound having a function as a PLK3 inhibitor or activator By evaluating a large number of compounds according to the first to fourth aspects of the method E, a compound having a function as a PLK3 inhibitor or activator can be screened and obtained. it can.
  • the compounds thus obtained are also included in the present invention.
  • the properties of such compounds are not particularly limited. For example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, single compounds such as peptides, antibodies, antisenses, etc. , RNAi or ribozyme.
  • the compound obtained by the method for evaluating a compound of the present invention is used as an IS drug for other animals, in addition to directly administering these substances to patients, known pharmaceutical methods & It is also possible to prepare and administer by. For example, tablets, capsules, elixirs, microcassels as needed, or aseptic solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or suspensions, as appropriate It can be used parenterally in the form of a suspension injection.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle It may be formulated in combination with preservatives, binders, etc., and mixed in the unit dosage form generally required for accepted pharmaceutical practice.
  • Additives that can be mixed into tablets and force capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, gum tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, squid mono oil or cherry.
  • the above material can further contain a liquid carrier such as fats and oils.
  • a sterile composition for injection should be a vehicle such as distilled water for injection. • Can be used and formulated according to normal pharmaceutical practice.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as!)-Sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride.
  • Adjuvants such as alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol ', nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM)', may be used in combination with HC0-50.
  • Oily liquids include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizer. Further, a buffer such as phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent such as procaine hydrochloride, a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol, or antioxidant may be added.
  • the prepared injection is usually filled in a suitable ampoule. ...
  • intraarterial injection static!
  • intranasal, transbronchial, intramuscular, transdermal, target, or oral can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the dose varies depending on the patient's body and age, the administration method, etc., but a person skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA, it may be possible to incorporate the DNA into a gene therapy vector and perform gene therapy.
  • 'Dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the compound varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, it is generally about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg for an adult (with a body weight of 60 kg) More preferred is considered to be about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, and administration method.
  • target organ usually in adults (weight 60 kg)
  • a suitable disease for which the therapeutic effect of the compound according to the present invention is expected is a tumor, such as human solid cancer.
  • PLK3 activity can be measured using the peptide for measuring PLK3 activity of the present invention as a substrate.
  • the peptide for measuring PLK3 activity of the present invention contains Thrl342 of topoisomerase ⁇ and has at least two amino acids.
  • the number of amino acids is not particularly limited as long as PLK3 activity can be measured, but is preferably 3 amino acids or more, more preferably 5 amino acids or more, and further preferably 10 amino acids or more. preferable.
  • the inventors have confirmed that at least the following peptide is a substrate for PLK3 and cannot be a substrate for PLK1 and can be used as a PLK3-specific substrate, and at least .Asp 1339- We believe that it can be a good substrate for PLK3 if it contains 8 amino acids corresponding to Aspl346 (may have 1 or more amino acid substitutions, deletions or deletions).
  • (T) represents Thrl342 of topoisomerase ⁇ .
  • the peptide for measuring PLK3 activity of the present invention as a substrate, the activity of PLK3 can be measured, and the compound acting on PLK3 can be evaluated.
  • the peptide can also be used for basic research purposes. For example, it can be used as a useful tool for analyzing the mechanism of intracellular information transmission via PLK3. (Example)
  • the expression distribution of PLK3 in the cell cycle was confirmed by confirming the expression of PLK1 and PLK3 in synchronously cultured HeLa S3 cells.
  • Human PLK1 and PLK3 genes were amplified from human testis by PCR and introduced into pBluespript SKII (+).
  • PLK1 and PLK3 cDNAs were cloned into pGEX6P-l vector (Amersham Pharmacia) for protein expression and purification.
  • the expression vector was introduced into BL2.1 (DE3), and 0. Imthiol-isopropyl-] 3-D (-)-thiogalactopyranoside (IPTG) was used at 25 ° C for 12 hours and glutathione S- Expression of transferase (GST) fusion PLK was induced.
  • GST transferase
  • GST-PLK was adsorbed on glutathione-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia) and eluted using PreScision protease.
  • the Topoisomerasell ⁇ protein was manufactured by TopoG EN, and the substrate peptide was synthesized by a conventional method and purified by HPLC.
  • the substrate protein is PLK1 or PLK3, R buffer (20 mM Tris_HCl, pH 7.4, lOm gCl 2 ) containing 50 ⁇ M ATP and 10 ⁇ Ci [ ⁇ - 33 P] ATP (3000 Ci / iol! Amersham Biotechnology). 4. Incubated in 5 mM 2-mercaptoethanol, ImM EGTA for 30 minutes at 30 ° C. The phosphorylated peptide after the reaction was analyzed by autography after SDS-PAGE.
  • Piotinylated synthetic peptide is PLK1 or PLK3, R buffer (20 mM Tris-HCl, pH7.) Containing ATP and 10 ⁇ (: ⁇ [ ⁇ -3 3 P] ATP (3000 Ci / mmol; Amersham Biotechnology). (4, lOmM MgCl 2 , 4.5 mM 2-mercaptoethanoK ImM EGTA) Incubated for 60 minutes at 30 ° C. The reaction was stopped by adding 10 / z 1 of H 3 P0 4 . Encapsulated peptides are processed using SAM2 biocapture membrane (Promega). • wraps, 3 times the membrane with 2M NaCl, washed four times with 2M NaCl containing 1% H 3 P0 4,. Then the radioactivity was measured by a liquid scintillation counter.
  • Human fetal kidney 293T was used as a cell for PLK expression.
  • 293T cells were cultured using Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBC0) containing 10% fetal bovine serum (FBS: Moregate Bio Tech).
  • the expression vector was transfected into 293T cells using FuGENE6 transfection reagent. (Roche Molecular Biochemicals). '
  • 293T cells into which the expression vector has been introduced are suspended in an extraction buffer (50 mM Hepes ⁇ 7.4, 250 mM NaCl, 0.2% NP40, 5 mM EDTA, 10% glycerol, protease inhib tor mix). And left on ice for 30 minutes. Next, the solubilized solution was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes to obtain a cyst extract.
  • an extraction buffer 50 mM Hepes ⁇ 7.4, 250 mM NaCl, 0.2% NP40, 5 mM EDTA, 10% glycerol, protease inhib tor mix.
  • the cell extract used for Western plotting was prepared as follows. That is, the cells were solubilized with an extraction buffer, and the protein mass was measured using the BCA protein assay (PIERCE). Equal amounts of protein were separated by 7.5% SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. Western blotting results were detected using chemi luminescence plus (Amersham Pharmacia).
  • topoisomerase II ⁇ can be a specific substrate of PLK3
  • the peptides shown in Table 2 were synthesized and the phosphorylating ability of PLK1 and PLK3 was examined.
  • PLK1 and PLK3 used recombinants expressed in E. coli.
  • the expression of recombinant PLK1 and ⁇ .LK3 was confirmed by CBB (Coomassie Brilliant Blue) staining and Western blotting using PLKL and PLK3 antibodies.
  • the phosphorylation reaction was carried out, and the relative activities of various substrates were measured with the activity of PLKl and PLK3 as 100 when Cdc25C Serl98 was used as the substrate.
  • the central “T” indicates Thrl342 of topoisomerase ⁇ .
  • the synthesized peptide has Thrl342 of topoisomerase ⁇ as 0th position.
  • the amino acid at the -5th position to the + 4th position is substituted with Ala in this order.
  • topoisomerase II ⁇ can be a specific substrate of PLK3 in cells.
  • Western blotting was performed on 293 ⁇ cells into which PLK3 had been introduced using an anti-phosphorylated topoisomerase II ⁇ 1342 antibody. As shown in FIG. 4, it was confirmed that phosphorylation of topoisomerase ⁇ . ⁇ was induced by overexpression of PLK3.
  • a transformed cell was prepared by introducing PLK3. (Having an amino acid substitution of K91M or D185A) that lost kinase activity into 293 ⁇ cells, and its phosphorylation ability was compared with that of wild-type PLK3. 'As shown in FIG. 8, PLK3 could not phosphorylate topoisomerase II ⁇ in the transformed cells. This indicates that PLK3 phosphorylates T1342 of topoisomerase ⁇ .
  • immunoprecipitation was carried out with an anti-Flag antibody using a transformed cell in which Flag-PLK3 was introduced into 293 ⁇ cells, followed by western plotting with an anti-phosphorylated topoisomerase II antibody 1342. As shown in FIG. 6, phosphorylated topoisomerase II was detected. On the other hand, immunoprecipitation was performed with the anti-topoisomerase ⁇ antibody using the transformed cells, followed by Western plotting with the Flag antibody. Shown in Figure 7 As a result, Flag-PLK3 was detected. That is, it was confirmed that PLK3 and topoisomerase II interact with each other in cells, and that PLK3 exerts physiological functions and functions using topoisomerase II ⁇ as a substrate.
  • 293T cells were cultured using Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBC0) containing 10% half-fetal serum (FBS: Moregate Biotech). The expression vector was transferred to 293T cells using FuGENE6 transfection r eagpnt (Roche Molecular Biochemicals). In order to prepare 293T cells into which antisense PLK3 was introduced, PEF-anti-sense PLK3 was introduced into the cells.
  • topoisomerase II in the cells into which the control vector was introduced, a band of about 250 kDa was detected with both anti-topoisomerase II ⁇ antibody and anti-phosphate human poisomerase II T1342 antibody. Phosphorylated topoisomerase II ⁇ could not be detected in cells whose expression was suppressed. Therefore, it was confirmed that Thrl342 of topoisomerase ⁇ is a physical target of PLK3. It has been reported that topoisomerase II is always subject to degradation by ubiquitination and is detected on the higher molecular weight side than the original molecular weight (Nature Structural & Molecular Biology, 1 2nd page, 5 8 9 pages, 2 0 0 5 years).
  • 293T cell clones (AS # 12 cells) expressing stable expression (transgene) were cultured for 2 weeks in a medium containing G418 (1600; ug / ml) after introduction of antisense PLK3.
  • G418 1600; ug / ml
  • toboisomerase II ⁇ expression was significantly increased in cells in which PLK3 expression was suppressed.
  • Such changes in the expression of PLK3 and topoisomerase II ⁇ reflect the voice system of cancer cells.
  • topoisomerase ⁇ inhibitor 13 treated with adriamycin, a topoisomerase ⁇ inhibitor: the overall survival rate of AS # 12 cells was about twice that of 293 ⁇ cells. This indicates that resistance to topoisomerase II ⁇ inhibitors is dependent on topoisomerase ⁇ upregulation.
  • 0.5 iM ICRF-193 was added to a culture solution of 293T cells in which PLK3-introduced plasmid was transiently expressed, and the cells were collected after 0, 10, 30 and 60 minutes.
  • the cells were suspended in extraction buffer (50 mM Hepes pH 7.4, 250 mM NaCl, 0.2% NP40, 5 mM EDTA, 10% glycerol, protease inhibitor mix) and left on ice for 30 minutes. 60 min to give, on ice by centrifugal separation of the solubilized cell extract, the antibody (Cell 10 6 per 2.mu. 1 anti PLK3 monoclonal antibody: Pharmingen Co.) and incubated.
  • extraction buffer 50 mM Hepes pH 7.4, 250 mM NaCl, 0.2% NP40, 5 mM EDTA, 10% glycerol, protease inhibitor mix
  • FACS analysis was performed. FACS analysis was performed as follows. First, samples used for single-site measurements were washed with PBS and fixed in 70% ethanol for 24 hours at -20 ° C. The fixed cells were washed once with PBS, treated with RNase, and then stained with Propidium iodide dO gZtnl). Analysis was performed by FACSCal ibur (Becton Dickinson), and the cell cycle was analyzed by CellQuest.
  • ICRF-193 caused cell cycle arrest (G2 arrest) by GRF in the control system in which only the vector was introduced.
  • G2 arrest was avoided.
  • Fig. 17 when G2 arrest occurred due to the addition of 1 ⁇ ICRF-193, the G2 fraction increased in cells introduced with wild-type PLK3, but the K91M mutation lost its kinase activity. The same phenomenon did not occur in the body. Therefore, like G2 checkpoint regulators such as Mytl and Weel, PLK3 was also confirmed to be a molecule that functions in the G2 checkpoint mechanism.
  • PBD is an abbreviation for Polo Box Domain and refers to a domain stored in the PLK family. In PLK3 it is located at amino acids 315-646. Fig. 2 3 It was confirmed that cell proliferation was inhibited when PLK3 was overexpressed. On the other hand, inhibition of cell proliferation was confirmed even by overexpression of the k91M mutant, which loses the kionase activity.
  • toposomerase II ⁇ was identified as a specific substrate for PLK3.
  • PLK3 and topoisomerase II c it becomes possible to evaluate compounds that act on PLK3 (screening, etc.).
  • the use of a partial peptide of topoisomerase ⁇ as a substrate makes it possible to evaluate compounds that act on PLK3. That is, according to the present invention, screening using PLK3 as a drug discovery target becomes possible, and development of therapeutic agents, diagnostic agents, and the like for diseases involving PLK3 (for example, cancer and neurodegenerative diseases) becomes possible.
  • topoisomerase I I ⁇ or this partial peptide can be used as a substrate for PLK3, it is also useful as a tool for studying intracellular signal transduction via PLK3 and PLK3.

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Abstract

トポイソメラーゼIIαがPLK3の基質であり、そのリン酸化部位が1342番目のThrであることが明らかになった。すなわち、トポイソメラーゼIIα又は前述のリン酸化部位を含むペプチドを基質として使用することにより、PLK3を創薬標的とした化合物の評価等（例えば、スクリーニング）を行うことが可能である。また、PLK3の過剰発現や活性化により活性化Rasを有する癌細胞の形態変化が見られたことに基づき、PLK3活性化剤の評価方法やPLK3活性化剤を提供する。

Description

明 細 書 PLK3に作用する化合物の評価方法 技 術 分 野
本発明は、 PLK3を標的とした化合物の評価方法に関する。 · 背 景 技 術
PLK (Polo- like- kinase)は、細胞周期に関与するセリン ·スレオニンキナーゼであ り、 哺乳類では PLK1〜PLK4の 4種類が知られている。
PLK1は様々な基質をリン酸化することにより、 中心体の成熟 （J. Cell. Biol.、 第 1 35卷、 17り1頁、 1996年； Nat. Cell. Biol.、 第 3卷、 421頁、 2001年) 、 有糸分裂への 移行 （Science 第 273巻、 1377頁、 1996年） 、 染色分体の分裂 （Cell'、 第 105卷、 4 59頁、 2001年） 、 有糸 裂の終了 （Mol. Cel l、 第 1卷、 371頁、 1998年） 、 細胞質分 裂 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 第 99卷、 8672頁、 2002年） のような G2/M期の進行に 重要な役割を果たしている。 また、 PLK1と癌との関連についても報告があり、 例え ば、 PLK1の発現と非小細胞肺癌の予後との間に相関があるとの報告 （Oncogene 第 1 4巻、 543頁、 1997年） や、 扁平上皮癌との関連を示す報告 （Cancer Res.、 第 59卷、 1794頁、 1999年) がある。 また、 NIH3T3細胞に PLK1を導入した場合には形質転換し た表現型を示すことも知られている （Biochem. Biophys. Res. Commun.、 第 234卷、 397頁、 1997年） 。
一方、 PLK3もまた Cdc2/cycl inB複合体を調節することにより G2/Mの移行を調節す る Cdc25Cのリン酸化を通じて G2/M期の進行に関与していることが知られている （Mu staphaら、 0ncogene、 第 23卷、 2658項、 2004年：非特許文献 1 ) 。 また、 細胞周期 の進行に関与するのみならず、 チェックポイントやアポトーシスとの関連について も示唆されている。 さらに、 PLK3のキナ一ゼ活性は、 DNAダメージに反応して ATMキ ナーゼ依存的に急速に上がるという報告もある （J. Biol. Chem.、 第 276卷、 43305 頁、 2001年：非特許文献 2 ) 。 その他、 PLK3が P53と物理的に相互作用して P53の 20 番目の Serをリン酸化し、 ρδ3を话性ィ するという報告 （J. Biol. Chem.、 第 276卷、 36194頁、 2001年：非特許文献 3 ) や、 PLK3を過剰発現させることにより、 p53+/+ 細胞におけるアポトー.シスを誘導するという報告がある （J. Biol. Chem.、 第 280 卷、 16843頁、 2005年：非特許文献 4 ) 。 .
PLK1と PLK3はいずれも細胞周期め G2/M期に機能する点で共通しているが、 その機 能は相違すると考えられている。 '
【非特許文献 1】 Oncogene, 第 23卷、 2658項、 2004年 ·
【非特許文献 2】 J. Biol. Chem.、 第 276卷、 43305頁、 2001年
, 【非特許文献 3】 J. Biol. Chem.、 第 276卷、 36194頁、 2001年
【非特許文献 4】 J. Biol. Chem. v 第 280卷、 16843頁、 2005年 発 明 の 開 示
しかしながら、 PLK3の機能に関してはまだ不明な点が多く、 その基質特異性につ いても明らかにはなっていないのが現状であった。 従って、 PLK3を創薬の標的とし たアツセィ系の構築も困難であるのが実情であつた。
本発明は、 上記従来技術の有する課題に鑑みてなさ'れたものであり、 PLK3の基質 を明らかにし、 当該基質を使用した化合物の評価を可能とすることを目的とする。 本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 トポイソメラーゼ Π αが PLK3の基質であり、 そのリン酸化部位が 1342番目の Thrであることを見出 すとともに、 トポイソメラーゼ II α又は前述のリン酸化部位を含むペプチドを基質 として使用することにより、 PLK3を創薬標的とした化合物の評価等 （例えば、 スク リ一ユング） を行うことが可能であることを見出し、 本発明を完成した。
すなわち、本発明の化合物の評価方法は、 PLK3に作用する化合物の評価方法であつ て、 PLK3、 トポイソメラーゼ Π α及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる工程 と、 当該酵素反応における PLK3の酵素活性と、 被検化合物非存在下における PLK3 の酵素活性とを比較する工程と、 を含むことを特徴とする。
また、本発明の化合物の評価方法は、 PLK3に作用する化合物の評価方法であって、 PLK3、 被検化合物及びスレオニンを含み且つアミノ酸数が 2以上であるべプチドの 存在下で酵素反応をさせる工程と、 当該酵素反応における PLK3の酵素活性と、被検 ■ 化合物非存在下における PLK3の酵素活性とを比較する工程と、を含むことを特徴と
■ する。 ' ''
、 ここで、 本発明の化合物の評価方法においては、 前記アミノ酸数が 2〜2 0であ , ることが好ましい。
また、 本発明の化合物の評価方法においては、 前記ペプチドが、 配列番号 3〜1 2に記載のアミノ酸配列を有するぺプチドのいずれか一つであることが好ましい。 さらに、 本発明の化合物の評価方法は、 PLK3に作用する化合物の評価方法であつ て、 PLK3及びトポイソメラーゼ II αが発現している細胞に被検化合物を接触させる 工程と、 当該トポイソメラーゼ Π αのリン酸化を検出する工程と、 当該リン酸化の レベルと被検化合物を接触させなかった細胞におけるトポイソメラーゼ Il ctのリン 酸化のレベルを比較する工程と、 を含むことを特徴とする。
また、 本発明の化合物の評価方法は、 PLK3に作用する化合物の評価方法であって . 、 PLK3が発現している細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該 PLK3の発現量を 測定する工程と、 当該発現量と、 被検化合物を接触させなかった細胞'における PLK3 の発現量を比較する工程と、 を含むことを特徴とする。 かかる化合物の評価方法に よれば、活性化 Rasを有する癌細胞に対して抗腫瘍効桌を示す化合物の単離、 スグリ 一ユング又は評価が可能とな 0。
また、 上述の化合物の評 iffi方法のいずれかによつて選択されたことを特徴とする PLK3阻害剤も本発明に含まれる。
さらに、 本発明の化合物の評価方法は、 上述の化合物の評価方法において、 化合 物が PLK3活性化剤であることを特徴とする。 Ras - MAPKパスウェイにおける Rasが 活性化されている癌細胞又は癌組織に対して抗腫瘍効果が高レ、薬剤の提供が可能と なる。
また、本発明の PLK3活性測定用ぺプチドは、 リン酸化を受けるスレオニン及び当 該スレオニンの C末端に隣接するァスパラギン酸を含み、 且つ、 アミノ酸数が 1 0 〜1 5であることを特徴とする。 力かるペプチドを使用することにより、 PLK3特異 的な活性測定が可能となる。
さらに、本発明の PLK3活性測定用ぺプチドは、 配列番号 3〜 1 3に記載のァミノ 酸配列を有するぺプチドであることが好ましい。 かかるぺプチドを使用することに . より、 PLK3特異的な活性測定が可能となる。
また、本発明の PLk3活性測定用ぺプチドは、配列番号 3〜 1 3に記載のァミノ.酸 、 配列からなるペプチドであることが好ましい。 力かるペプチドを使用することによ . り、 PLK3特異的な活性測定が可能となる。
本発明者らにより、 PLK3の特異的な基質としてトポィソメラーゼ Π αが同定され た。 従って、 本発明により、 PLK3及ぴトポイソメラーゼ Il ctを用いることにより、 PLK3に作用する化合物の評価 （スクリーニング等） が可能となる。 また、 トポイソ メラーゼ Π αの部分べプチドを基質.として使用することによつても、 PLK3に作用す る化合物の評価が可能となる。 さらに、 トポイソメラーゼ II α又はこの部分べプチ ドは PLK3の基質として使用できることから、 PLK3や PLK3を介した細胞内情報伝達 研究用のツールとしても利用価値がある。
また、 PLK3の活性化により、 Ras- ΑΡΚパスウェイにおける Rasが活性化されてい る癌細胞の形態異常が生じることが確認されていることから、 PLK3を活性化したり、 PLK3の発現誘導により Rasが活性化された癌細胞に対する抗腫瘍効果が期待できる。 すなわち、 PLK3活性化剤が抗腫瘍効果を有する。 図面の簡単な説明
図 1は、 PLK1及ぴ PLK3の細胞周期における発現分布を検討した結果を示す図で ある。 ■
図 2は、 PLK及び PLK3の組換え体が大腸菌で正常に発現していることを確認した 結果を示す図である。
図 3は、 トポイソメラーゼ II αを基質とした PLK1及び PLK3のリン酸化を検出し た結果を示す図である。
図 4は、 PLK3の過剰発現により トポイソメラーゼ II αのリン酸化が誘導されてい ることを確認した結果を示す図である。
図 5は、 PLK1又は PLK3の過剰発現により トポイソメラーゼ Π αのリン酸化の程 度を比較した結果を示す図である。
図 6は、 PLK3を強制発現させた細胞を用いて抗 Flag抗体により免疫沈降を行レ、、 抗リン酸化トポイソメラーゼ Π α Τ1342抗体でウェスタンブロッティングを行って トポイソメラーゼ II αを検出することができること.を確認した結果を示す図である 図 7は、 PLK3を強制発現させた細胞を用いて抗トポイソメラーゼ IIひ抗体により 免疫沈降を行い、 抗 Flag抗体でウェスタンブロッテイングを行って PLK3を検出す ることができることを確認した結果を示す図である。
図 8は、 キナーゼ活性を失った PLK3を導入した細胞を用いて、 野生型 PLK3とリ ン酸化能を比較した結果を示す図である。
図 9は、アンチセンス PLK3を導入した 293T細胞における PLK3の発現を確認した 結果を示す図である。
図 1 .0は、 アンチセンス PLK3を導入した 293T糸田胞におけるトポィソメラーゼ II ひの発現とリン酸化を確認した結果を示す図である。
园 1 1は、図 1 0と同じブロットを用いて 250kDaのタンパク質のシフトを検出し た結果を示す図である。 .
図 1 2は、アンチセンス PLK3を安定発現する 293T細胞における PLK3及びトポィ ソメラーゼ II αの発現を確認した結果を示す図である。
図 1 3は、アンチセンス PLK3を導入した 293Τ細胞及び 293Τ細胞についてァドリ アマイシン処理した場合の細胞增殖を確認した結果を示す図である。
図 1 4は、アンチセンス PLK3を導入した 293Τ細胞及び 293Τ細胞についてスタウ 口スポリン処理した場合の細胞增殖を確認した結果を示す図である。
図 1 5は、 ICRF-193処理をした 293Τ細胞について PLK3の活性を測定した結果を 示す図である。
図 1 6は、 ICRF-193処理をした 293Τ細胞についてトポイソメラーゼ II αの発現 と活性を測定した結果を示す図である。
図 1 7は、 アンチセンス PLK3を導入した 293Τ細胞を ICRF- 193処理した場合の G2 arrestの様子を確認した結果を示す図である。
図 1 8は、 PLK3又は K91M変異体 PLK3を導入した 293T細胞を ICRF- 193処理した 場合の G2 arrestの様子を確認した結果を示す図である。
図 1 9は、 PLK3、 PL 3 K91M 変異体又はカスパーゼ 9を過剰発現させた細胞の形 態変化を確認した結果を示す図である。 図' 2 0は、 PLK3、 PLK3 K91M 変異体又はカスパーゼ 9を過剰発現させた細胞につ いて細胞周期における subGl期の細胞数を検出した結果を示す図である。
図 2 1は、ノコダゾール処理した細胞の形態変化を確認した結果を示す図である。 図 2 2は、 PLK3、 PLK3 K91 変異体又はノコダゾール処理した細胞についてリン 酸化ヒス トン H3の割合を測定した結果を示す図である。
図 2 3は、 PLK3、 PLK3 K91M変異体及び PBDを過剰発現させた細胞の増殖を測定 した結果を示す図である。
図 2 4は、 PL 3又ほ PLK3 91M変異体を過剰発現させた細胞の長期の細胞増殖能 (ロロニー形成能） を測定した結果を示す図である。
図 2 .5は、 活性型 Ras (V12)と PLK3を共発現した細胞の形態について検討した結 果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、 本発明にかかる用語について説明する。
本発明にかかる遺伝子は、 PLK3 (Accession No. NM— 004073：配列番号 1 ) である 。 PLK3遺伝子の由来となる生 種は特に限定されず、 例えば、 ヒ ト、 サル、 マウス 、 ラット、 ィヌ又はゥサギが挙げられる。 中でも、 評価される化合物の投与対象が ヒ トであることからヒ ト遺伝子であることが好ましい。
また、 本発明に係る前記の遺伝子には、 当該遺伝子と同 ·の生理機能を有するも のであれば 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 付加又は挿入がある遺伝子も含まれ る。 ここで、 当該遺伝子としては、 PLK3タンパク質をコードする遺伝子であればそ の配列は特に制限されないが、 相同性が 5 0 %以上であることが好ましく、 7 0 % 以上であることがより好ましく、 8 0 %以上であることがさらに好ましく、 9 0 % 以上 （例えば、 9 1 、 9 2、 9 3、 9 4、 9 5 、 9 6 、 9 7 、 9 8 、 9 9 %以上） であることが特に好ましい。
また、 本発明に係る前記の遺伝子には、 当該遺伝子とストリンジェン卜な条件下 でハイブリダィズする核酸を含む遺伝子も含まれる。 ここで、 本発明において 「ス トリンジヱン卜な条件でハイブリダィズする」 とは、 二つの核酸断片が、 Molecula • r Cloning： A Laboratory Manual、 第 2版、 コーノレド、スプリンク、、ノヽーノくー (198 9) 、 9.47-9.62及び 11· 45-11.61に記載されたハイブリダイゼ一ション条件下で、相 、 互にハイプリダイズすることを意味する。 より具体的には、 例えば、 約 45°Cにて 6. • 0XSSCでハイブリダィゼーシヨンを行った後に、 50°Cにて 2. OxSSCで洗浄する条件が 挙げられる。 ス トリンジヱンシー選択のため、 洗浄工程における塩濃度を、 例えば 低ストリンジエンシーとしての約 2.0xSSC、 50°Cから、 高ストリンジエンシーとして の約 0.2XSS (：、 50°Cまで選択することができる。 さらに、 洗浄工程の温度を低スト リンジエンシー条件め室温、 約 22°Cから、 高ス トリンジエンシー条件の約 65°Cまで 上昇させることができる。
また、 本発明に係る PLK3遺伝子の転写産物であるタンパク質には、 PLK3タンパク 質と同等の生理機能を有するものであれば 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 付加 又 挿入があるものも含まれる。 ここで、 このようなタンパク質の配列は特に制限 されないが、 相同性が 50%以上であることが好ましく、 70%以上であることが より好ましく、 80%以上であることがさらに好ましく、 90%以上 （例えば、 9 1、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99%以上） であることが特に 好ましい。
また、 本発明にかかるトポィソメラ一ゼ IIひ (Accession No. N _001067：配列番 号 2) についても、 遺伝子の由来となる生物種は特に限定されず： 例えば、 ヒ ト、 サル、 マウス、 ラット、 ィヌ又はゥサギが挙げられる。 中でも、 評価される化合物 の投与対象がヒ トであることからヒ ト遺伝子であることが好ましい。
また、 本発明に係るトポイソメラーゼ Πα遺伝子には、 当該遺伝子と同等の生理 機能を有するものであれば 1又は 2以上の塩基の置換、 欠失、 付加又は挿入がある 遺伝子も含まれる。 ここで、 当該遺伝子としては、 かかるタンパク質をコードする 遺伝子であればその配列は特に制限されないが、 相同性が 50%以上であることが 好ましく、 70%以上であることがより好ましく、 80%以上であることがさらに 好ましく、 90%以上 （例えば、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 9 8、 99%以上） であることが特に好ましい。
また、 本発明に係るトポイソメラ一ゼ Πα遺伝子には、 当該遺伝子とス トリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする核酸を含む遺伝子も含まれる。 さらに、 本発明に係る前記の遺伝子の転写産物であるトポイソメラーゼ Π αタン パク質には、 当該タンパク質と同等の生理機能を有するものであれば 1又は 2以上 、 の塩基の置換、 欠失、 付加又は挿入があるものも含まれる。 ここで、 当該タンパク . 質の配列は特に制限ざれないが、 相同性が 5 0 %以上であることが好ましく、 7 0 %以上であることがより好ましく、 ' 8 0 %以上であることがさらに好ましく、 9 0 %以上 （例えば、 9 1、 9 2、 9 3、 9 4、' 9 5、 9 6、 9 7、 9 8、 9 9 %以上 ) であることが特に好ましい。 .
本発明において、 ポイソメラーゼ Π αは、 PLK3の基質として同定されており、 1 342番目のスレオニンが PLK3によって,リン酸化されることを本発明者らは見出してい る。 すなわち、 1342番目のスレオニンを含むペプチドであれば PLK3の基質として利 用することができる。 このようなペプチドのアミノ酸数は特に制限されず、 所望の アミ.ノ酸数を選択することができるが、 2アミノ酸以上であることが好ましく、 5 アミノ酸以上であることがより好ましく、 1 0アミノ酸以上であることがさらに好 ましい。
また、 本発明にかかる 「被検化合物」 は、 PLK3を創薬の標的とする分子であれば その種類は特に制限はなく、 具体的には、 例えば、 天然化合物、 有機化合物、 無機 化合物、 タンパク質、 ペプチド等の単一化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺 伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海 洋生物抽出物、 植物抽出物、 原核細胞抽出物、 真核単細胞抽出物若しくは動物細胞 抽出物等を挙げることができる。 上記被検試料は必要に応じて適宜標識して用いる ことができる。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識等を挙げることができ る。 また、 上記被検試料に加えて、 これらの被検試料を複数種混合した混合物も含 まれる。
( 1 ) 化合物の評価方法
本発明の化合物の評価方法の第 1の態様は、 PLK3に作用する化合物の評価方法で あって、 PLK3、 トポイソメラーゼ Π α及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる 工程と、 当該酵素反応における PLK3の酵素活性と、 被検化合物非存在下における PL K3の酵素活性とを比較する工程と、 を含むことを特徴とする。
先ず、 PLK3、 トポイソメラーゼ IIひ及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる . 。 酵素反応はトポイソメラーゼ Π αを基質とした PLK3のリン酸化反応である。 かか るリン酸化反応の反 条件としては、 反応が進行する条件であれば特に制限はなく 、 、 リン酸化反応の条件として当業者に周知の条件で行うことができる.が、 具体的に は、 例えば、 緩衝液としてリン酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液等を使用し、 · ρΗを 6. 0 〜8. 0、 好ましくは 7. 0〜8. 0に調整し、 温度を 25〜45°C、 好ましくは 30〜40°Cに設定 し； 反応を進行させればよい。 また、 反応液中には、 必要に応じて適宜 MgCl2、 メル カプトエタノール、 EGTA等を添加することができ、 これらの濃度も適宜好適な値を 選択すればよい。 反応時間についても適宜設定すればよいが、 例えば、 10〜60分間 、 好ましくは 20〜40分間、 反応を行えばよい。 また、 リン酸化反応の基質として水 溶液中に ATPを含むことが必要である。 ATPは検出可能な状態に標識しておくことに よりリン酸化反応の進行を容易に検出することが可能となる。 このような標識とし て、 例えば、 [ γ -33Ρ]ΑΤΡ、· [ γ - 32Ρ]ΑΤΡ、 ピオチン又は蛍光色素が挙げられる。 放射 性同位体標識した場合には、 トポイソメラーゼ IIひに取り込まれた標識をオートラ ジオグラフィーやシンチレーションカウンターで検出することにより'リン酸化反応 の検出及び定量が可能となる。 また、 ピオチン標識を利用する場合には、 アビジン を使用した検出手段を採ることにより、 放射性同位体を使用せずにリン酸化反応の 検出及び定量が可能となる。 '
次に、 酵素反応における PLK3の酵素活性と、 被検化合物非存在下における PLK3の 酵素活性とを比較する。
被検化合物が PLK3の酵素反応を阻害する機能を有する場合には、 かかる比較によ り被検化合物存在下における PLK3の酵素活性が相対的に低くなる。 被検化合物の存 在下で酵素活性が有意に低い場合には、 当該被検化合物は PLK3阻害活性を有すると 判断できる。 一方、 当該酵素活性が有意に高い場合には、 当該被検化合物は PLK3活 性を増強する活性を有すると判断できる。
本発明の化合物の評価方法の第 2の態様は、 PLK3に作用する化合物の評価方法で あって、 PLK3、 被検化合物及びスレオニンを含み且つアミノ酸数が 2以上であるべ プチドの存在下で酵素反応をさせる工程を含む。
先ず、 PLK3、 ペプチド及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる。 酵素反応は トポイソメラーゼ Π αの Thrl342を含むぺプチドを基質とした PLK3のリン酸化反応で ある。 かかるリン酸化反応の反応条件としては、 反応が進行する条件であれば特に 制限はなく、 リン酸化反応の条件として当業者に周知の条件で行うことができるが 、 、 具体的には、 例えば、 緩衝液としてリン酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液等を使用し
. 、 11を6. 0〜8. 0、 好ましくは 7. 0〜8. 0に調整し、 温度を 25〜45°C、 好ましぐは 30〜4 0°Cに設定し、 反応を進行させればよい。 また、 反応液中には、 必要に応じて適宜 M gC12、 メルカプトエタノール、 EGTA等を添加することができ、 これらの濃度も適宜 好適な値を選択すればよい。 反応時間についても適宜設定すればよいが、 例えば、 1 0〜60分間、 好ましくは 20 40分間、 .反応を行えばよい。 また、 リン酸化反応の基質 として水溶液中に ATPを含むことが必要である。 ATPは検出可能な状態に標識してお くことによりリン酸化反応の進行を容易に検出することが可能.となる。 このような 標識として、 例えば、 [ γ -33Ρ]ΑΤΡ、 [ γ - 32Ρ]ΑΤΡ、 ピオチン又は蛍光色素が挙げられ る。.放射性同位体標識した場合には、 基質であるペプチドに取り込まれた標識をォ 一トラジオグラフィーやシンチレーションカウンターで検出することによりリン酸 化反応の検出及び定量が可能となる。 また、 ピオチン標識を利用する i轟合にほ、 ァ ビジンを使用した検出手段を採ることにより、 放射性同位体を使用せずにリン酸化 反応の検出及び定量が可能となる。
次に、 酵素反応における PLK3の酵素活性と、 被検化合物非存在下における PLK3の 酵素活性とを比較する。
被検化合物が PLK3の酵素反応を阻害する機能を有する場合には、 かかる比較によ り被検化合物存在下における PLK3の酵素活性が相対的に低くなる。 被検化合物の存 在下で酵素活性が有意に低い場合には、 当該被検化合物は PLK3阻害活性を有すると 判断できる。 一方、 当該酵素活性が有意に高い場合には、 当該被検化合物は PLK3活 性を増強する活性を有すると判断できる。
本発明の化合物の評価方法の第 3の態様は、 PLK3に作用する化合物の評価方法で あって、 PLK3及びトポイソメラーゼ II ctが発現している細胞に被検化合物を接触さ せる工程と、 トポイソメラーゼ IIひのリン酸化を検出する工程と、 リン酸化のレべ ルと被検化合物を接触させなかった細胞におけるトポイソメラーゼ ΙΙ αのリン酸化 のレベルを比較する工程とを含む。
先ず、 PLK3及びトポイソメラーゼ IIひが発現している細胞に被検化合物を接触さ ' せる。
PLK3及びトポイソメラーゼ II ctが発現している細胞としては、 PLK3及びトボイ.ソ 、 メラーゼ II αが発現していればその種類は限定されず、 生体組織由来の細胞であつ てもよく、 ライン化きれた試験用の細胞であってもよい。 また、 PLK3及び小ポイソ メラーゼ II ctを遺伝子工学的に強制発現させた細胞であってもよい。 PLK3及びトポ イソメラーゼ IIひを遺伝子工学的に強制発現させる方法としては、 当業者に公知の 方法を用いればよいが、 具体的には、 例えば、 PLK3並びにトポイソメラーゼ Il ct遺 伝子又はその一部からなる核酸をそれぞれ好適なプロモーター及び転写調節エレメ ン を含む発現ベクターにクローニングし、 グロ一ユングされた核酸を有するべク ターを宿主細胞に導入することにより調製する。 ここで、 前記ベクターとしては、 発現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定されないが、 例えば、 pCMV-T ag、 pcDNA3. 1、 pBlueBacHis2、 pCI- neo、 pcDNAI, pMClneo, pXTl、 pSG5、 pEFl/V5- HisB、 pCR2. 1、 pETl l、 え gtl l又は pCR3. 1が挙げられる。 次に、 前記遺伝子又はその 一部からなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。 'かかる宿主細 胞としては、 遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、 動物細 胞、 昆虫細胞.、 植物細胞、 微生物のいずれであつてもよく、 具体的には、 例えば、 C 0S1、 C0S7、 CH0、 NIH/3T3、 293、 Raji、 CV11、 C1271、 MRC- 5、 CPAE、 HeLa、 293T又 は Sf9が挙げられる。 また、 発現べクタ を宿主細胞に導入する方法としては、 公知 の方法であれば.特に限定きれないが、 具体的には、 例えば、 エレク ト口ポレーショ ン、 リン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 リポフエクシヨン法又は遺伝子銃 が挙げられる。 また、 導入した遺伝子の発現は一過性 （transient) の発現であって もよく、 安定的 （stable) な発現であってもよい。 以上に述べた方法により、 PLK3 及びトポイソメラーゼ II αが発現した細胞を得ることができる。
次に、 上述した細胞に被検化合物を接触させる。
接触させる方法としては特に制限はなく、 当業者に周知の方法によって行えばよ いが、 具体的には、 例えば、 細胞の培養液若しくは緩衝液中又は当該細胞抽出液に 被験化合物を添加すること溶液中での接触を挙げることができる。 接触の条件とし ても特に制限はなく、 溶液の温度及び ρΗ、 接触時間等の諸条件について好適な条件 を選択することができる。 ^に、 前工程の細胞と被検化合物との接触によって生じたトポイソメラ一ゼ Π α のリン酸化を検出す'る。
PLK3は、 リン酸化反応の基質として細胞内の ΑΤΡを利用してトポィソメラーゼ II αをリン酸化する。 本工程においては、 かかるリン酸化を検出すればよい。 検出の 方法としては特に限定されず公知の ^法により検出すればよいが、 具体的には、 例 えば、 リン酸化反応をさせた後のトポィソメラーゼ Il c をトポィソメラーゼ Il c抗 体で免疫沈降させ、 得られたトポイソメラーゼ Π αのリン酸化を抗リン酸化抗体で 確認する方法が挙げられる。 .
次に、 前工程で検出されたトポイソメラーゼ Π αのリン酸化のレベルと、 被検化 合物を接触させなかった細胞におけるトポイソメラーゼ IIひの.リン酸化のレベルを 比較する。 すなわち、 被検化合物を作用させた細胞における PLK3の活性をコント口 —ルと比較をし、 活性の強弱を認定する。
被検化合物が PLK3の酵素反応を阻害する機能を有する場合には、 かか.る比較によ り被検化合物存在下における!3 LK3の酵素活性がコントロールと比較して低くなる。 すなわち、 当該被検化合物は PLK3阻害剤として機能すると判断できる。 一方、 当該 酵素活性が有意に高い場合には、 当該被検化合物は PLK3活性を増強する活性を有す ると判断できる。
本発明の化合物の評価方法の第 4の態様は、活性化 Rasを有する癌細胞に対して抗 腫瘍効果を示し且つ PLK3に作用する化合物の評価方法であつで、 PUGが発現してい る細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該 PLK3の発現量を測定する工程と、 当 該発現量と、 被検化合物を接触させなかった細胞における PLK3の発現量を比較する 工程と、 を含むことを特徴とする。
先ず、 PLK3が発現している細胞に被検化合物を接触させる。
PLK3が発現している細胞としては、 PLK3が発現していればその種類は限定されず 、 生体組織由来の細胞であってもよく、 ライン化された試験用の細胞であってもよ レ、。 また、 PLK3を遺伝子工学的に強制発現させた細胞であってもよい。 PLK3を遺伝 子工学的に強制発現させる方法としては、 当業者に公知の方法を用いればよいが、 具体的には、 例えば、 PLK3遺伝子又はその一部からなる核酸をそれぞれ好適なプロ モーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、 クロー- • ングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより調製する。 ここ で、 前記ベクターと'しては、 ¾現ベクターとして利用可能なものであれば特に限定 ' されないが、 例えば、 pCMV-Tag, pcDNA3. 1、 pBlueBacHis2、 pCI_neo、 pcDNAI、 pMC . lneo、 pXTl、 pSG5、 pEFl/V5- HisB、 pCR2. 1、 pETl l、 え gtl l又は pCR3. 1が挙げられる 。 次に、 前記遺伝子又はその一部がらなる核酸が導入された発現ベクターを宿主細 胞に導入する。 かかる宿主細胞としては、 遺伝子の発現に通常使用されるものであ れば特に限定されず、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞、 微生物のいずれであっても よく、 具体的には、 例えば、 C0S1、 C0S7、 CH0、 NIH/3T3、 293、 aj i , CV11、 C1271 、 M C-5, CPAE、 HeLa、 293T又は Sf9が挙げられる。 また、 発現ベクターを宿主細胞 に導入する方法としては、 公知の方法であれば特に限定されないが、 具体的には、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨン、 リン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 リ ポ: ェクシヨン法又は遺伝子銃が挙げられる。 また、 導入した遺伝子の発現は一過 性 (transient) の発現であってもよく、 安定的 （stable) な発現であってもよレヽ。 以上に述べた方法により、 PLK3が発現した細胞を得ることができる。
次に、 上述した細胞 ίこ被検化合物を接触させる。
接触させる方法としては特に制限はなく、 当業者に周知の方法によって行えばよ いが、 具体的には、 例えば、 細胞の培養液若しくは緩衝液中又は当該細胞抽出液に 被験化合物を添加すること獰液中での接触を挙げることができる。 接触の条件とし ても特に制限はなく、 溶液の温度及び ρΗ、 接触時間等の諸条件について好適な条件 を選択することができる。
次に、 前工程の細胞と被検化合物との接触によって生じた PLK3の発現量の変化を 検出する。 先ず、 当該接触によって生じた PLK3の発現量の変化を測定する。 発現量 の測定方法は特に限定されないが、 具体的には、 例えば、 細胞内の mRNA量を測定す るノーザンブロッティングや、 タンパク質量の測定するウェスタンブロッティング が挙げられる。 次に、 得られた測定値と、 被検化合物を接触させていない細胞 （コ ントロール） における PLK3の発現量を比較する。 比較した結果、 被検化合物の接触 によって PLK3の発現が減少していれば、 当該化合物は PLK3の阻害剤として機能する ことが確認できる。 一方、 発現量が増加していれば、 当該化合物は PLK3の活性化剤 として機能することが確認できる。 本発明において、 発明者らは、 Ras - APKパスゥ ■ エイ上の Rasが活性化している細胞において、 PLK3を強制発現させることにより当該 細胞の形態変化が誘 され、 その結果、 細胞が浮遊することを見出している。 これ 、 は、 PLK3の活性化や発現誘導により、 癌細胞が足場依存性を失うことを示している ( 2 ) 化合物の評価方法によって得られた化合物
上述した本発明の化合物の評 E方法の第 1'〜第 4の態様によって多数の化合物を 評価することにより、 PLK3阻害剤または活性化剤としての機能を有する化合物をス クリーニングし、 得ることができる。 こうして得られた化合物も本発明に含まれる このような化合物としては、 その性状は特に制限はなく、 例えば、 天然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチド等の単一化合物、 抗体、 アンチセ ンス、 RNAi又はリボザィムが挙げられる。
本発明の化合物の評価方法で得られた化合物をヒ トゃ他の動物の IS薬.として使用 する場合には、 これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方 &により製剤化して投与を行うことも可能である。 例えば、 必要に応じて糖衣を施 した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカヅセル剤として経口的に、 ある いは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の 注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 薬理学上許容される担体若しくは媒 体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安 定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤等と適宜組み合わせて、 一般に ' 認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化する ことが考えられる。
錠剤、 力プセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セルロー スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステ アリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサッカリンのような甘味 剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。 調剤単 位形態がカプセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含 有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを • 用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む ' 等張液、 例えば!)-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナトリ ウム , が挙げられ、 適当な溶 補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリ アルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール'、 非イオン性 界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM) '、 HC0 - 50と併用してもよレ、。
油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤とじて安息香酸ベンジル 、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリゥム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロカイン、 安定剤、.例えばベン ジルアルコ ル、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された注射液は 通常、 適当なアンプルに充填させる。 .. .
萆者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静！^内注射、 皮下注射などのほか、 鼻腔 内的、.経気管支的、 筋内的、 経皮,的、 または経口的に当業者に公知の方法により行 いうる。 投与量は、 患者の体童や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者で あれば ¾当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 当該化合物が DNAによ りコードされうるものであれば、 当該 DNAを遺伝子治^用ベクターに組込み、遺伝子 治療を行うことも考えられる。'投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状など により変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。
化合物の投与量は、 症状により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人 （ 体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましくは約 1. 0から 50 mg、 より好ましくは約 1. 0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回の投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人 （体重 60kgとして） に おいては、 通常、 1日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好まし くは約 0. 1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。 本発明に係る化合物の治療効果が期待される好適な疾病の一例として腫瘍が挙げ られ、 例えばヒ トの固形がん等が挙げられる。 ヒ 卜の固形がんとしては、 例えば、 脳がん、 頭頸部がん、 食道がん、 甲状腺がん、 小細胞がん、 非小細胞がん、 乳がん 、 胃がん、 胆のう '胆管がん、 肝がん、 膝がん、 結腸がん、 直腸がん、 卵巣がん、 ' 絨毛上皮がん、 子宮体がん、 子宮頸がん、 腎盂 '尿管がん、 膀胱がん、 前立腺がん ノ、 陰茎がん、 睾丸がん、 胎児性がん、 ウィルムスがん、 皮膚がん、 悪性黒色腫、 神 、 経芽細胞腫、 骨肉腫、 ユーイング腫、 軟部肉腫.； アルツハイマー病、 パーキンソン 病等の神経変性疾患などが挙げられる。
( 3 ) PLK3活性測定用ペプチド .
本発明の PLK3活性測定用べプチドを基質として PLK3の活性を測定することができ る。 本発明の PLK3活性測定用ペプチドは、 トポイソメラーゼ ΙΓ αの Thrl342を含み、 且つ少なくとも 2ア ノ酸を有する。 また、 アミノ酸数は、 PLK3活性を測定できれ ば特に制限はないが、 3ァミノ酸以上であることが好ましく、 5ァミノ酸以上であ ることがより好ましく、 1 0アミノ酸以上であることがさらに好ましい。 発明者ら は少なくとも下記のぺプチドが PLK3の基質となり、 また、 PLK1の基質とはなり得ず P LK3特異的な基質として使用可能であることを確認しており、 また、 少なくとも .Asp 1339〜Aspl346に相当する 8アミノ酸（ 1又は 2以上のアミノ酸の置換、欠失又は揷 があってもよい） が含まれていれば PLK3の良好な基質になりうると'考えている。 なお、 ペプチド中 （T) はトポイソメラーゼ Π αの Thrl342を示す。
SDFDEK (T) DDEDFV (配列番号 3 )
SAFDEK (T) DDEDFV (配列番号 4 )
SDADEK (Τ) DDEDFV (配列番号 5 )
SDFAEK (Τ) DDEDFV (配列番号 6 )
SDFDAK (Τ) DDEDFV (配列番号 7 )
SDFDEA (Τ) DDEDFV (配列番号 8 )
SDFDEK (Τ) ADEDFV (配列番号 9 )
SDFDEK (Τ) DAEDFV (配列番号 1 0 )
SDFDEK (Τ) DDADFV (配列番号 1 1 )
SDFDEK (Τ) DDEAFV (配列番号 1 2 )
本発明の PLK3活性測定用ぺプチドを基質として使用することにより、 PLK3の活性 測定が可能となり、 PLK3に作用する化合物の評価が可能となる。 また、 当該べプチ ドを基礎研究目的に使用することも可能であり、 例えば、 PLK3を介した細胞内情報 伝達のメカニズムの解析に有用なツールとして使用することができる。 (実施例)
以下、 実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、 本発明は、 以下の.実 、 施例に限定されるものではない。
(PLK1及び PLK3の細胞周期における発現分布の確認）
同調培養した HeLa S3細胞における PLK1及び PLK3の発現を確認することにより、 P LK3の細胞周期における発現分布を確認した。
図 1に示すとおり、 PLK1は G2/M期で発現が増加しているのに対し、 PLK3は細胞周 期には依存せず発現していることが確認できた。 すなわち、 PLK1と PLK3は G2/M期に おいて発現がオーバ一ラップしていることが確認できた.。
(PLK及び合成ペプチドの調製）
ヒ ト PLK1及び PLK3遺伝子をヒ ト精巣から PCRにより増幅し、 pBluespript SKII (+) に導入した。 タンパグ質の発現と精製のため、 PLK1及び PLK3の cDNAを pGEX6P-lべク ター （Amersham Pharmacia社） にクローユングした。 発現ベクターを BL2.1 (DE3)に導 入し、 0. ImMの isopropyl- ]3 - D (-) - thiogalactopyranoside (IPTG)を用いて 25°Cで 12 時閗の条件の下、 glutathione S-transferase (GST) 融合 PLKの発現を誘導した。 G ST - PLKは glutathione - Sepharose 4B (Amersham Pharmacia社) に吸着させ、 PreSci ssion proteaseを用いて溶出きせた。 また、 Topoisomerasell αタンパク質は TopoG EN社製を使用し、 基質べプチドは定法により合成した後、 HPLCで精製した。
(in vitro kinase assayノ
基質タンパク質を、 PLK1又は PLK3と、 50 μ M ATPと 10 μ Ci [ γ - 33P] ATP (3000Ci/隱 ol ! Amersham Biotechnology) を含む R緩衝液 （20mM Tris_HCl, pH7. 4、 lOm gCl2 、 4. 5mM 2-mercaptoethanol, ImM EGTA) 中で、 30°C、 30分間インキュベートした。 反応後のリン酸化べプチドは SDS-PAGEを行った後ォートラジォグラフィ一にて解析 した。
また、 ピオチン化した合成ペプチドは、 PLK1又は PLK3と、 ATPと 10 μ (:ί [ γ - 33P] ATP (3000Ci/mmol ; Amersham Biotechnology) を含む R緩衝液 （20mM Tris-HCl, pH7. 4、 lOmM MgCl2、 4. 5mM 2-mercaptoethanoK ImM EGTA) 中で、 30°C、 60分間ィ ンキュペートした。 反応は、 10 /z 1の H3P04を添加することにより停止させた。 ビォチ ン化したぺプチドは SAM2ビォチンキヤプチャ一メンブレン （Promega社） を用いてト • ラップし、 メンブレンを 2M NaClで 3回、 1%H3P04を含む 2M NaClで 4回洗浄した後、 . 液体シンチレーシヨンカウンターで放射活性を測定した。
、 （PLK発現細胞の調製）
. PLK1及び PLK3を哺轧動物細胞で発現させるため、 それぞれの cDNAを pCMVTag2B (S tratagene社） ベクターにクローニシグした。 また、 キナーゼ活性を失った PLK3を調 ，—るにめ、 Quick Change site-directed mutagenesi s kit (Stratagene¾； を用 いて、 91番目のリジンをメチォニンに、 185番目のァスパラギン酸をァラニンに置換 した。 '， .
PLKの発現に使用する細胞としてヒ ト胎児腎臓 293Tを用いた。 293T細胞は、 10%牛 胎児血清 (FBS： Moregate Bio Tech社） を含む Dulbecco ' s modified Eagle ' s me dium (GIBC0社） を用レヽて培養した。 FuGENE6 transfection reagent. (Roche Molec ular Biochemicals社） を用いて、発現ベクターを 293T細胞にトランスフエクシヨン ■ した。 '
(免疫沈降）
免疫沈降に使用するため、発現ベクターを導入した 293T細胞を抽出緩衝液（50mM Hepes ρΗ7· 4、 250mM NaCl、 0. 2% NP40、 5mM EDTA、 10% glycerol , protease inhib i tor mix) に懸濁し、 氷上で 30分間静置した。 次に、 可溶化が終了した溶液を 4°Cで 30分間遠心分離し、 栩胞抽出液を得た。 得られた細胞抽出液を抗体 （106個の細胞に つぎ 40 1 抗 FLAG M2 Affinity Gel Freezer-Safe (SIGMA社) 、 107個の細胞につき 3 1 抗 Topoisomerasell a抗体） を加えて氷上で 60分間静置し、 続いて proteinA a garoseを加えて 4°Cで 2時間混和した。混和の終了した溶液は抽出緩衝液で洗浄し、 L aemml i SDS sample bufferで agaroseビーズ り浴出しに。
(ウェスタンブロッテイング）
ウェスタンプロッティングに用いる細胞抽出液は下記のように調製した。 すなわ ち、 細胞を抽出緩衝液で可溶化し、 BCA protein assay (PIERCE社） を用いてタンパ ク質量を測定した。 等量のタンパク質を 7. 5% SDS-PAGEにて分離し、 PVDF membran eに転写した。 ウェスタンブロッテイングの結果は chemi luminescence plus (Amers ham Pharmacia社） を用いて検出した。
実施例 1 ( o プチド基質を用いた PLK3の基質特異性の検討）
表 1に示すように'、 種々の分子の部分ペプチドを合成して基質として用い、 PLK1 及び PLK3によるリン酸化を検討した。 Cdc25C Serl98を基質どした場合の PLKl及び P LK3の活性を 100とし T、 各種基質の相対的な活性を測定した。
(表 1 )
Figure imgf000020_0001
その結果、 トポィソメラ一ゼ Il c の Thrl342を含むぺプチドが PLK3特異的な基質と して機能していることが明らかとなった。
次に、 トポイソメラーゼ II αが PLK3の特異的な基質となりうるかを確認するため 、 表 2に記載のペプチドを合成して PLK1及び PLK3のリン酸化能を検討した。 PLK1及 び PLK3は大腸菌で発現させた組換え体を使用した。図 2に示すとおり組換え PLK1と Ρ . LK3の発現を CBB (Coomassie Bri lliant Blue)染色及び PLK lと PLK3それぞれの抗体 を用いたウェスタンブロッテイングにより確認した。.次にリン酸化反応を行レ、、 Cd c25C Serl98を基質とした場合の PLKl及び PLK3の活性を 100として、 各種基質の相対 的な活性を測定した。 ペプチド中、 中央の 「T」 はトポイソメラーゼ Π αの Thrl342 を示す。 また、 合成したペプチドは、 トポイソメラーゼ Π αの Thrl342を 0位として
、 -5位から +4位のァミノ酸を順に Alaに置換したものである。
(表 2 )
ペプチド 配列 PLKlによる PLK3による 配列番号
リン酸化 リン酸化
Cdc25C S198 DELMEFSLKDQE 100 100 14
Topo I I WT SDFDEKTDDEDFV ぐ 10 3700 3
SAFDEKTDDEDFV < 10 3100 4
Topo I I D1338A SDADEKTDDEDFV < 10 3500 5
Topo I I D1339A SDFAEKTDDEDFV < 10 2600 6
Topo 1 1 D1340A SDFDAKTDDEDFV < 10 1200 7
Topo 1 1 D1341A SDFDEATDDEDFV < 10 3400 8
Topo 1 1 D1343A SDFDEKTADEDFV ぐ 10 2500 9 ΤορόΙ 1 D1344A SDFDEKTDAEDFV <10 900 10
Topol l D1345A SDFDEKTDDADFV く 10 1000 11
Topol l D1346A SDFDEKTDDEAFV <10 1600 12
Topol l D1343FA SDFDEKTFDEDFV 270 3700 13
' 表 2に示すとおり、 トポイソメラーゼ Π αの Thrl342を含むペプチドは て PLK3 特異的な基質として機能していることが確認することができた。
また、 PLK3がぺプチドのみならずトポイソメラーゼ II αを特異的な基質とするこ ' とを確認するため、 組換えトポイソメラーゼ ΙΙ αを基質として用いて PLK1及び PLK3 のリン酸化能を検討した。 図 3に示すとおり、' トポイソメラーゼ Π αは PLK3によつ てのみリン酸化されることが確認できた。 また.、 抗トポイソメラーゼ II α抗体を用 いたウェスタンブロッテイングを行った結果、 PLK3によってリン酸化を受けたトポ イソメラーゼ II αが検出され、 トポイソメラーゼ Π αの T1342が PLK3の特異的な基質 であることが確認することができた。
. 実施例.2
(細胞における PLK3の基質特異性の検討）
次に、 細胞内においてもトポイソメラーゼ II αが PLK3の特異的な基質となりうる 'かを検討するため、 下記の試験を行った。 PLK3を導入した 293Τ細胞について抗リン 酸化トポイソメラーゼ II α Τ1342抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。 図 4に示すとおり、 PLK3の過剰発現により トポイソメラーゼ Ι.Γαのリン酸化が誘 導されていることが確認することができた。
次に、 キナーゼ活性を失った PLK3. (K91M又は D185Aのアミノ酸置換を有する） を 2 93Τ細胞に導入した形質転換細胞を作製し、 野生型 PLK3とリン酸化能を比較した。 '図 8に示すとおり、 前記の形質転換細胞では PLK3はトポイソメラーゼ II αをリン 酸化することができなかった。 このことは、 PLK3がトポイソメラーゼ Π αの T1342 をリン酸化していることを示すものであった。
また、 Flag-PLK3を 293Τ細胞に導入した形質転換細胞を用いて抗 Flag抗体により免 疫沈降を行った後、抗リン酸化トポイソメラーゼ II « Τ1342抗体でウェスタンプロッ ティングを行った。 図 6に示すとおり、 リン酸化トポイソメラーゼ IIひを検出する ことができた。 一方、 同形質転換細胞を用いて抗トポイソメラーゼ Π α抗体により 免疫沈降を行った後、 Flag抗体でウェスタンプロッティングを行った。 図 7に示す と り、 Flag- PLK3を検出することができた。 すなわち、 PLK3と トポイソメラ一ゼ I Iひが細胞内で相互作用しており、 PLK3がトポイソメラーゼ II αを基質として生理機 、 能を発揮していることを確認することができた。
次に、 PLK1又は PLK3を 293Τ細胞に導入した形質転換細胞を用い、 抗リン酸化トポ イソメラーゼ II a Thrl342抗体によりウェスタンブロッテイングを行った。
図 5に示すとおり、 PLK3の過剰発現により PLK1の場^^と比較してトポイソメラー ゼ Il ctが強く リン酸化されていることを確認することができた。
実施例 3
(アンチセンス PLK3を導入した細胞を用いた PLK3の基質特異性の検討)
293T細胞は、 10%半胎児血清 （FBS ： Moregate .Bio Tech社） を含む Dulbecco' s m odified Eagle' s medium (GIBC0社） を用いて培養した。 FuGENE6 transfection r eagpnt (Roche Molecular Biochemicals社) を用いて、 発現ベクターを 293T細胞に ■ .トランスフエクシヨンした。 ア チセンス PLK3を導入した 293T細胞を調製するため 、 細胞に PEF-anti- sense PLK3を導入した。
図 9に示すとおり、 アンチセンス PLK3を導入した 293T細胞では PLK3の発現が抑制 されたことを確認できた。 一方、 同細胞について抗トポイソメラーゼ Π α抗体又は 抗リン酸化トポィソメラーゼ Π α Τ1342抗体を使用してウェスタンブロットを行った ところ、 図 1 0に示すとおり、 トポイソ.メラ一ゼ II αの発現が上昇し、 コントロー ルにおけるトポィソメラーゼ II αに対するリン酸化トポィソメラーゼ IIひの割合に 比べ、 アンチセンス PLK3を導入した細胞においてリン酸化トポイソメラーゼ IIひの 割合の減少が確認された。 また、 図 1 1に示すように、 コントロールベクターを導 入した細胞では、 約 250kDaのバンドが、 抗トポイソメラーゼ II α抗体及び抗リン酸 ィヒトポイソメラ一ゼ IIひ T1342抗体のいずれでも検出された力 PLK3の発現を抑制し た細胞ではリン酸化されたトポイソメラーゼ II αを検出できなかった。 従って、 ト ポイソメラーゼ Π αの Thrl342が PLK3の物理的な標的であることが確認できた。 トポ イソメラーゼ IIひはュビキチン化による分解を常に受けており本来の分子量より高 分子側に検出されることが報告されている （Nature Structural & Molecular Biol ogy、 第 1 2卷、 5 8 9頁、 2 0 0 5年） 。 コントロールベクターを導入した細胞で は、 約 250kDaのバンドが、 抗トポイソメラーゼ ΙΙ α抗体及び抗リン酸化トポイソメ ■ ラ一ゼ II αΤ1342抗体のいずれでも検出されたため、.このバンドがトポイソメラーゼ
Παであることが考えられた。
、 また、 アンチセンス PLK3を導入した細胞を、 G418(1600;ug/ml)を含む培地で 2週 間培養し、 導入遺伝子^安定発現 （stable expression) する 293T細胞クローン （A S#12細胞） を調製した。 その細月.包における PLK3の発現と、 293T細胞における PLK3の 発現とを比較した。 図 1 2に示すとおり、 PLK3の発現を抑制した細胞ではトボイソ メラーゼ II αの発現が顕著に増加した。 このような PLK3と トポイソメラーゼ II αの 発現の変化は癌細胞の声現系を反映している。
また、 293Τ細胞及び AS#12細胞 （それぞれ 1.5xl03個） を、 アドリアマイシン （adr iamycin) ゃスタウロスポリン （staurosporine) .のような細胞毒性を有する薬剤で7 2時間処理、 生存率を MTTアツセィにより測定した。 MTTアツセィの結果は WST-8 (キ シダ化学社） を用いて測定した。 図 1 4に示すとおり、 pan-kinase inhibitorであ るスダゥロスポリン処理した場合、 293T細胞及ぴ AS#12細胞の細胞増殖に違いは見ら れなかった。 一方、 図 1 3に示すとおり、 トポイソメラーゼ Πα阻害剤であるアド リァマイシン処理した：^合、 AS#12細胞の生存率は 293Τ細胞の 2倍程度であった。 こ れは、 トポイソメラーゼ II α阻害剤に対する抵抗性が、 トポイソメラ一ゼ Παのァ ップレギュレーションに依存していることを示している。
実施例 4
(トポイソメラーゼ Πα阻害剤 ICRF-193による PLK3の活性の変化）
トポイソメラーゼ II a阻害剤であり、細胞周期の G2脱連環チェックポイント （G2 decatenation checkpoint) 試薬である ICRF-193で処理をした 293T細胞において、 P LK3の活性がどう変化をするかを確認するため、 下記の試験を行つた。
まず、 PLK3を導入したプラスミ ドを一過性に発現をさせた 293T細胞の培養液に 0. 5 iM ICRF- 193を加え、 0、 10、 30及び 60分後に細胞を回収した。 細胞を抽出緩衝液 (50mM Hepes pH7.4、 250mM NaCl、 0.2% NP40、 5mM EDTA、 10% glycerol, proteas e inhibitor mix) に懸濁し、 氷上で 30分間静置した。 可溶化された細胞抽出液を遠 心分離により得、 氷上で 60分、 抗体 （細胞 106個あたり 2μ 1の抗 PLK3モノクローナル 抗体： Pharmingen社） とインキュベートした。 続いて、 プロテイン Gァガ口一スを加 えて 4°Cで 2時間反応させた。 得られた試料は細胞抽出液で 3回洗浄した。 得られた 沈廏物と基質である c 一カゼインを、 50 M ATPと 10 // Ci [ y -33 P]ATP (3000Ci/mmol ; Amersham Biotechnology社）を含む R緩衝液（20mM Tris-HCl, pH7. 4, lOmM MgCl2, 4..5m 、 M 2-mercaptoethanol, ImM EGTA) 中で 30°C、 30分聞インキュベートした。 リン酸化 . 反応を終えたタンパク は SDS- PAGEにより展開し、 オートラジオグラフィ にて解 析を行った。
図 1 5に示すとおり、 時間の経過に伴って PLK3の活性が上昇していることが確認 できた。 この間、 PLK3のタンパク質の総量に変化は無かったことから、 PLK3は脱連 環チェックポイントにおいても活性化されていることが確認できた。 また、 トポィ ソメラーゼ II αのタンパク質量についても検討したところ、 図 1 6に示すとおり、 時間の経過に伴ってダウンレギュレートされていた。 この現象は、 プロテアソーム 阻害剤 （Proteasome inhibitor) MG132によって抑制されることも確認されたことか ら、、 ICRF-193処理により、 トポイソメラーゼ IIひの分解が促進されることが確認で きた。 . . .
また、 図 1 5及び 1 6より、 PLK3の活性化に伴ってトポイソメラーゼ II αのダウ ンレギュレーション又は分解が生じることが確認できた。
次に、 G2チェックポイントにおける PLK3の役割を検証するため、 アンチセンス PL K3を導入した 293T細胞に、 導 Λの 2 4時間後 2 ICRF - 193を添加し、 さらに 2 4 時間後に細胞を回収して FACS解析を行った。 FACS解析は次のように行った。 まず、 ブ口一サイ トメ トリ一に使用する試料を PBSで洗浄し、 70%ェタノール中で 24時間、 — 20°Cで固定した。 固定を終えた細胞は PBSで一度洗浄し、 RNase処理を行った後、 P ropidium iodide dO gZtnl)により染色した。 解析は FACSCal ibur (Becton Dickin son社） により行い、 細胞周期は CellQuestにより解析した。
図 1 6に示すとおり、 べクターのみ導入したコント口ールでは ICRF- 193により G2 における細胞周期の停止 （G2 arrest) が生じたが、 アンチセンス PLK3を導入した場 合ではアンチセンス PLK3量依存的に G2 arrestが回避された。 また、 図 1 7に示すと おり、 1 μ Μ ICRF- 193の添加により G2 arrestが生じた際、野生型 PLK3を導入した細 胞では G2画分が増加したが、 キナーゼ活性を失った K91M変異体では同じ現象は生じ なかった。 従って、 Mytlや Weelのような G2 チェックポイント制御因子のように、 P LK3も G2チヱックボイント機構で機能する分子であることが確認できた。 施例 5
(PLK3の導入による^胞の形態変化）
PLK3の導入によつて DNAラダーの形成を伴うアポトーシスの誘導が見られるとの報 告 （J. Biol. Chem. , 第 2 7 6卷、 4 3 3 0 5頁、 2 0 0 1年） があることから、 Ρ LK3の過剰発現によって細胞の形態変化を伴うアポトーシスが誘導されるかどうかを 検討した。 PLK3は EGFPと共に 293Τ細胞に導入した。 図 1 9に示すとおり、 PLK3を導 入した細胞は球形を示した。 一方、 K91Mの変異を導入してキナ一ゼ活性を失った PL K3を導入した細胞でほ形態の変化は見られなかった。. このことは、 細胞の形態変化 は PLK3のキナーゼ活性に依存していることが確認できた。 し力 し、 アポトーシスを 促進する遺伝子として知られるカスパーゼ 9 (caspase9) を導入した場合の細胞の 形態とは異なっていた。 .
7 に、 PLK3によってアポトーシスが誘導されていることを確認するため、 FACS解 析を行った。 また、 ポジティブコントローノレとして、 カスパーゼ 9 (caspase9) を 導入した細胞を用いた。 図 2 0に示すとおり、 カスパーゼ 9では subGlが増加しアポ トーシスの誘導が確認されたが、 PLK3では確認されなかった。
次に、 カスバ ゼ 9及び PLK3導入の際の細胞の形態の相違が何を原因とするかを 確認するため、 下記の試験を柠つた。 細胞周期力 期で停止している場合には細胞は 球形の形態を呈するため、 ノコダゾール. (Nocodazole)処理した細胞と PLK3を導入し た細胞の形態とを比較した。 図 2 1に示すとおり、 ノコダゾール処理した細胞は PL K3を導入した細胞と比較して球形にはならなかった。
また、細胞周期の M期で増殖を停止していることを示すマーカ一であるリン酸化ヒ ストン H3の割合を測定した。 図 2 2に示すとおり、 ノコダゾール処理した場合と比 較して PLK3を導入した細胞では顕著に低いことが確認された。
実施例 6
(PLK3の過剰発現による増殖阻害）
PLK3の過剰発現が増殖阻害の原因となるか否かを確認するため、 MTTアツセィを行 つた。 PLK3の他、 PLK3 K91M変異体及び PBDを過剰発現させた細胞についても検討を 行った。 ここで、 PBDは、 Polo Box Domainの略であり、 PLKフアミリーにおいて保存 されているドメインをいう。 PLK3ではアミノ酸 315- 646に位置する。 図 2 3に示すと おり、 PLK3を過剰発現すると細胞の 殖が阻害されることが確認できた。 一方、 キ ■ ナーゼ活性を失つだ k91M変異体の過剰発現でも細胞の増殖阻害が確認された。
、 . 次に、 PLK3を過剰発現させた細胞を、 G^S deOO gZml)を含む培溶液で 2週間培 養し、 その間の細胞のコロニー数をカウントした図 2 4に示すとおり、 キナ一ゼ活 性依存的に細胞の増殖阻害が確謬できた。
実施例 7
(PLK3及び Ras (V12)の過剰発現 （共発現） による細胞の形態の変化）
過剰発現により細^の形態変化をもたらすことが知られている活性型 Ras (VI 2)を P LK3と共に強制発現させ、 細胞の形態を観察した。 図 2 5に示すとおり.、 活性型 Ras
2.
(V12)と PLK3を共発現した細胞では浮遊す 5る細胞が顕著に多く観察された。すなわち 、 PLK3のキナーゼ活性依存的に浮遊細胞の数が増加することが確認できた。
すなわち、 Rasが活性化している癌細胞に PLK3を過剰発現することや、 PLK3のキナ ーゼ活性を活性化することがでぎれば PLK3による形態変化を介した抗腫瘍効果が期 待されることが確認できた。 ' 産業上の利用可能性
以上説明したように、 PLK3の特異的な基質としてトポィソメラーゼ I I αが同定さ れた。 PLK3及びトポイソメラーゼ I I c を用いることにより、 PLK3に作用する化合物 の評価 （スク リーニング等） が可能となる。 また、 トポイソメラーゼ Π αの部分べ プチドを基質として使用することによつても、 PLK3に作用する化合物の評価が可能 となる。 すなわち、 本発明により、 PLK3を創薬標的としたスクリーニングが可能と なり、 PLK3が関与する疾患 （例えば、 癌や神経変性疾患） の治療薬，診断薬等の開 発が可能となる。
さらに、 トポイソメラ一ゼ I I α又はこの部分べプチドは PLK3の基質として使用で きることから、 PLK3や PLK3を介した細胞内情報伝達研究用のツールとしても利用価 値がある

Claims

Figure imgf000027_0001
1 . PLK3に作用する化合物の評価方法であって、
PLK3、 トポィソメラ一ゼ II α及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる工程と
ェα ιι
主冃
、
該酵素反応における PLK3の酵素活性と、 被検化合物非存在下における PLK3の酵素 活性とを比較する工程と、.を含む、 化合物の評価方法。
2 . PLK3に作用する化合物の評価方法のであって、
■ PLK3.、 被検化合物及びスレオニンを含み且つアミノ酸数が 2以上であるペプチド の存在下で酵素反応をさせる工程と、
該酵素反応における PLK3の酵素活性と、 被検化合物非存在下における PLK3の酵素 活性とを比較する工程と、 を含む、 化合物の評価方法。 囲
3 . 前記アミノ酸数が 2〜 2 0である、 請求項 2に記載の化合物の評価方法。
4 . 前記ペプチドが、 配列番号 3〜1 2に記載のアミノ酸配列を有するペプチド のいずれか一つである、 請求項 2に記載の化合物の評価方法。
5 . PLK3に作用する化合物め評価方法であって、
PLK3及びトポィソメラーゼ IIひが発現している細胞に被検化合物を接触させるェ 程と、
該トポイソメラーゼ II ctのリン酸化を検出する工程と、
該リン酸化のレベルと被検化合物を接触させなかった細胞におけるトポイソメラ ーゼ IIひのリン酸化のレベルを比較する工程と、 を含む、 化合物の評価方法。
6 . PLK3に作用する化合物の評価方法であって、
PLK3が発現している細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該 PLK3の発現量を測定する工程と、
該発現量と、 被検化合物を接触させなかった細胞における PLK3の発現量を比較す る工程と、 を含む、活性化 Rasを有する癌細胞に対して抗腫瘍効果を示す化合物の評 価方法。
7 . 前記化合物が PLK3阻害剤である、 請求項 1〜6のいずれか一項に記載の化合 ■ 物の'評価方法。
8. 前記化合物が LK3活性化剤である、 請求項 1〜6のいずれか一項に記載の化 、 合物の評価方法。
.
9. リン酸化を受けるスレオニン及び該スレオニンの C末端に隣接するァスパラギ ン酸を含み、 且つ、 アミノ酸数が 10〜1 5である、 PLK3活性測定用ペプチド。
10. 配列番号 3〜 1 3に記載のアミノ酸配列を有するペプチドである、 PLK3活 性測定用ペプチド。'
1 1. 配列番号 3〜1 3に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、 PLK3活 性測定用べプチド。
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