WO2007032160A1 - 高血圧症の検査用マーカー遺伝子 - Google Patents

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WO2007032160A1
WO2007032160A1 PCT/JP2006/315498 JP2006315498W WO2007032160A1 WO 2007032160 A1 WO2007032160 A1 WO 2007032160A1 JP 2006315498 W JP2006315498 W JP 2006315498W WO 2007032160 A1 WO2007032160 A1 WO 2007032160A1
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hypertension
marker gene
dna
present
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Hidetoshi Inoko
Akira Oka
Keisuke Yatsu
Nobuhisa Mizuki
Satoshi Umemura
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Tokai University
Yokohama City University
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/321—Arterial hypertension

Definitions

  • the present invention relates to an essential hypertension susceptibility gene newly identified by a gene mapping method using a microsatellite genetic polymorphism marker, and a use thereof.
  • Hypertension is a major cause of cerebrovascular, coronary artery disease and renal failure. Kearney et al. Have 972 million patients with hypertension, 26.4% of adults in 2000, and are expected to increase to 1,560 million, 29.2% in 2025. Various types of drugs have been developed, but it is possible to reliably reduce the prevalence of hypertension. Hypertension is a major risk factor and the third leading cause of death is an important global issue.
  • the current general cardiovascular disease is mainly due to the high prevalence of hypertension. For human public health, more emphasis must be placed on the prevention, detection and treatment of hypertension. In particular, a personal health service strategy is needed. Personal health services are likely to have significant benefits in terms of cost efficiency as well as great potential to reduce the burden of hypertension. The most advanced personal health service is the prevention, detection and treatment of each individual's genotype strength hypertension. However, in order to use each individual's genotype, first of all, the hypertension susceptibility gene must be identified.
  • the genetic background of hypertension is the most common multifactorial disease, accounting for 30-70% of the causes of trait variation.
  • the risk rate for sibling recurrence for hypertension is reported to be 2-3.
  • the previously reported genomic screens lack statistical significance.
  • There are many reports today that describe the results of genome-wide screening for genes that control hypertension see Table 1 below). Most of them, however, reported many chromosomal regions that suggested evidence of linkage, but clearly did not follow Mendelian inheritance, making linkage analysis difficult to apply to hypertension. That is, until today There are no reports on large-scale genome-wide correlation analysis for blood pressure disorders.
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • the number of alleles is generally only two, and some SNPs that exist within about 5 kb of the disease-related gene force to be mapped Therefore, in order to perform genome mapping using SNPs as genetic polymorphism markers, it is necessary to set and analyze a huge number of SNPs as markers. Therefore, it is currently applied only to narrow areas that have been narrowed down to some extent.
  • microsatellite genetic polymorphism markers are characterized by showing a correlation even if they are located at some distance from the gene to be mapped with a large number of alleles. If the number of genetic polymorphism markers is set too large As in the case of SNPs, analysis is difficult in terms of time and labor, and if the number of settings is too small, the marker interval becomes too large, and there is a risk of overlooking disease-related genes.
  • the present inventors have developed a gene mapping method using a microsatellite genetic polymorphism marker set at an interval of about 50 kb to 150 kb on average, and by using this method, a disease-related gene or genetic We found that human phenotype-related genes with genetic factors can be identified with high efficiency and low cost (Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Zhu, X. et al., Nat Genet 37, 177-181 (2005)
  • Non-Patent Document 2 Caulfield, M. et al., Lancet 361, 2118-2123 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Rao, D.C. et al., Am J Hypertens, 16, 148-150 (2003)
  • Non-Patent Document 4 Kardia, S ⁇ . R. et al., Am J Hypertens, 16, 154-157 (2003)
  • Non-Patent Document 5 Thiel, B.A. et al., Am J Hypertens, 16, 151-153 (2003)
  • Non-Patent Document 6 Ranade, K. et al., Am J Hypertens, 16, 158-162 (2003)
  • Non-Patent Document 7 Harrap, S.B., et al., Physiol Genomics, 8, 99-105 (2002)
  • Non-Patent Document 8 Atwood, D. et al., Genet Epidemiol, 20, 373-382 (2001)
  • Non-Patent Document 9 Rice, T. et al., Circulation, 102, 1956-1963 (2000)
  • Patent Document 1 WO01Z79482
  • the present invention is more cost effective than the conventional SNPs correlation analysis method.
  • HP hypertension
  • EH essential hypertension
  • a new HP The purpose is to identify susceptibility genes.
  • the present invention collects data on the pathogenesis and pathogenesis of HP based on information on the identified HP susceptibility gene and HP-related protein that is the expression product of the gene, and performs appropriate screening. In the end, the goal is to link to effective preventive Z treatment for HP.
  • HP susceptibility genes newly identified by the present invention are HUMUT617, D2S0226i, D17S0287i, D17S0351i, D19S0134i, D2S0208i, D13S0183 i, D4S0818i, D2S0949i, D20S885, D10S0517i, D10S017i, D10S017i , D17S790, D18S0390i, G09023, D4S0370i.
  • the present inventors conducted a correlation analysis between SNPs and HP present in the genomic DNA sequences of these newly identified genes, and for the first time found a statistically significant correlation.
  • the present invention relates to the human genomic DNA sequence HUMUT617, D2S0226 i, D17S0287i, D17S0351i, D19S0134i, D2S0208i, D13S0183i, D4S0818i, D2S0949i, D20S885, D10S0517i, D17S03
  • a continuous DNA partial sequence containing at least one base exhibiting a single nucleotide polymorphism present in a gene containing D17S790, D18S 03901, G09023, D4S0370i, or a complementary strand strength of the DNA partial sequence Provide a marker gene.
  • the present invention provides a test method and test kit for HP using the marker gene.
  • the hypertension test marker gene identified in the present invention is used in a hypertension test method and a hypertension test kit based on the correlation between the polymorphism and hypertension. can do.
  • screening using a polypeptide encoded by the marker gene of the present invention makes it possible to identify the agonist and Z or antagonist of the polypeptide, and the agonist and Z or antagonist are those of hypertension. Can act as a diagnostic, prophylactic and Z or therapeutic agent.
  • FIG. 1 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 2 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 3 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 4 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 5 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 6 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 7 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 8 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 9 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 10 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 11 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 12 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 13 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 14 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 15 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 16 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 17 is a table showing information on the names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 18 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 19 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
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  • FIG. 31 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 32 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
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  • FIG. 34 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 35 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 36 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 37 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 38 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 39 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • FIG. 40 is a table showing information on names and Genbank registration numbers of microsatellite markers used in the present invention.
  • the gene mapping method used in the present invention is the method described in Patent Document 1. Specifically, a forward primer and a reverse primer corresponding to each DNA sequence of a continuous DNA sequence containing an MS genetic polymorphism marker set at a predetermined interval, preferably about lOOkb, on the human genome are used.
  • the DNA sequence sample is amplified by polymerase chain reaction (PCR), and DNA sequence fragments containing a microsatellite genetic polymorphism marker, which is an amplification product, are electrophoresed on a gel with high resolution such as a DNA sequencer. Includes measurement and analysis.
  • MS genetic polymorphism that was positive by the primary (first phase) screening using the forward primer and reverse primer corresponding to the MS genetic polymorphism marker set genome-wide.
  • multi-phase screening in which secondary (phase 2) screening using different sample populations is performed on the markers, and further up to tertiary (phase 3) screening, MS genetic polymorphism that shows false positives is adopted. Die markers can be dramatically reduced without undue correction.
  • the complement region or the locus can be specified in more detail using another gene mapping method.
  • analysis using SNPs is effective.
  • the SNPs polymorphism frequencies in the candidate region where the target gene is likely to exist are compared between the patient population and the healthy population by, for example, correlation analysis, and the linkage disequilibrium detected by haplotype analysis SNP markers can be detected by linkage disequilibrium analysis.
  • the newly established MS marker of 18,977 was used to identify HP susceptibility genes, and the pooled DNA method already reported as a cost-effective screening method was adopted.
  • the genome correlation analysis performed was performed by the three-phase screening method including the three main steps as described above. (1) Three-phase genome screening to reduce type 1 error rate, (2) Confirmation of pooled correlations by individual dienotyping for positive MS loci, (3) Screened populations and additional events To the group In particular, the identification of the precise SNP markers around the candidate region by individual dienotyping.
  • SNPs are known to exist on the SMOC2, XRCC5, CROP, KCNJ16, ZNF358, CHST10, SORCS2, LPIN1, TACC2, XCR1 and GRM7 genes, and on unknown genes. It contains what exists. These SNPs showed statistically significant differences in allele frequency between HP affected and healthy individuals. Therefore, a continuous DNA partial sequence containing at least one base exhibiting a single nucleotide polymorphism existing in these gene regions, or a complementary strand of the DNA partial sequence can be used as a marker gene for hypertension test.
  • these marker genes can be used for genetic testing related to HP.
  • a PCR method with a forward primer and a reverse primer set so as to sandwich a base showing a single nucleotide polymorphism.
  • a forward primer used for the test there are 5 sequences of the marker gene DNA sequence including the bases showing the single nucleotide polymorphism mapped on the human genome, 3 sequences from the end, and a sequence extending in the end direction. Primers having the same base sequence and having a length of 15 to 100 bases, preferably 15 to 25 bases, more preferably 18 to 22 bases can be mentioned.
  • the reverse primer is a primer having a base sequence complementary to the sequence extending from the 3 ′ end of the marker gene DNA sequence to the 5 ′ end, and 15 to 100 bases, preferably 15 Those having a length of -25 bases, more preferably 18-22 bases, can be used.
  • the sequence is compared with the sequence of a healthy subject. It is also possible to examine the presence or absence of a genetic predisposition to HP.
  • the probe used here may be the marker gene itself of the present invention, but a continuous DNA sequence containing a base showing a single nucleotide polymorphism present in the gene of interest, or its complementary strand, or their It may be a sequence that hybridizes.
  • a probe having a length of 15 to 100 bases, preferably 15 to 25 bases, more preferably 18 to 22 bases can be used.
  • the translation regions encoded by them can be determined.
  • the amino acid sequence of the protein to be identified can be specified. Since proteins having these amino acid sequences are likely to be involved in the pathogenesis or pathogenesis of HP, preventing or treating HP by promoting or inhibiting the function of these proteins. Is possible.
  • the present invention also relates to a screening method using the protein, and the screening method can identify a substance that promotes or inhibits the function of the protein, that is, an agonist or an antagonist.
  • a substance that promotes or inhibits the function of the protein that is, an agonist or an antagonist.
  • the term “antagonist” as used herein includes biologically related substances such as antibodies or fragments thereof, antisense oligonucleotides, and the like, not just chemical small molecules. These agonists or antagonists are effective as HP diagnosis, prevention and Z or treatment.
  • the above protein is prepared by preparing a vector containing a DNA sequence containing at least the translation region of the marker gene identified in the present invention, and transforming an appropriate host cell with the vector. It is also possible to produce cells.
  • MS sequences with repeat units of 2, 3, 4, 5 or 6 bases can be run from golden Path Oct. 2000 to NCBI build 30 using the Apollo program applicable to Sputnik. Detected with version 4 of the human genome draft sequence at. PCR primers for amplifying these repeats under a single reaction condition were automatically designed by the Discover program applicable to PrimerExpress. In addition, to prevent differential amplification, these PCR primers were made free of SNP in the sequence (Sham et al, 2002).
  • the average interval between MS markers is the authentic chromatin region of the human genome.
  • the diagnostic criteria for the HP group are: gender: male, age of onset: 30-59 years old, blood pressure (mmHg): hypertension (SBP) ⁇ 160mmHg and Z or diastolic blood pressure (DBP) ⁇ 100mmHg, body mass index (B Ml) ( kg / m 2 ): ⁇ 25, and family history (parents or siblings).
  • Diagnosis criteria for healthy individuals with normal blood pressure as a control are: gender: male, age of onset: ⁇ 50 years, blood pressure (mmHg): hypertension (SBP) ⁇ 120mmHg and diastolic blood pressure (DBP) ⁇ 80mmHg V, N, B, BMI (kg / m 2 ): ⁇ 25, and no family history (parents or siblings).
  • mmHg hypertension
  • DBP diastolic blood pressure
  • the pooled DNA method for microsatellite typing was based on the protocol of Collins et al. (2000) with minor modifications. DNA was extracted using QIAamp DNA blood kit (QIAGEN) under standardized conditions to prevent DNA quality fluctuations. A 0.8% agarose gel electrophoresis was then performed to check for DNA degradation and Z or RNA contamination. The DNA concentration was then determined through three consecutive measurements using PicoGreen fluorescence assay (Molecular Probes) with optical density measurements to check for protein contamination. Standardized pipetting and aliquoting of DNA samples was performed automatically using Biomek 2000 and Multimek 96 (Beckman). A pooled DNA template for 2 x 18,977 micro-satellite typing was prepared immediately after DNA quantification.
  • microsatellite marker was tested by the DNA pool method for repeated polymorphisms using 200 healthy Japanese.
  • Our criteria for MS selection are: 1) 2 nucleotide repeats repeated 10 times or more, and 3, 4 and 5 nucleotide repeats repeated 5 times or more; and 2) Polymorphic MS 30% or more It must have a heterozygosity of 85% or more in order to eliminate unstable and highly mutated microsatellite.
  • Our laboratory currently has a complete set of 27,037 markers.
  • the rest of the genome is heterochromatin, mostly restricted to centromeres and telomeres, and repeated It is believed to be rich in sequence and not contain the expressed gene.
  • This 150 kb spacing is sufficient to force the 100 kb gene spacing estimated to be the general length of LD due to the disease susceptibility location of two adjacent microsatellites across the entire genome. It seems that you can bar.
  • the Pritchard method was employed for detection of stratification in case and control populations. To calculate the P-value, we have adopted two types of Fisher exact test, 2 X 2 contingency table for each individual allele, 2 X m contingency table for each position, and m is observed in the population The number of marker alleles made.
  • the Malkov chain / Monte Carlo simulation method was used to perform the Fisher's accuracy test on the 2 X m contingency table. These analyzes were performed using the software package, MCFishman.
  • Three-stage screening aims to reproduce the results in three independent sample populations sequentially. Before starting these screens, use Pritchard's method to confirm that there is no significant stratification in either case or control, using the strength of each of 1-22 and X chromosomes, especially 23 selected MS (Sufficient to perform such an analysis successfully). Achieving this study is important to prevent so-called “sham correlations” that are caused by population statistics, especially for late-onset diseases such as essential hypertension, and whose appropriate controls are difficult to correct. So various institutions participated in the study and collected as many healthy volunteers as possible (age> 50).
  • Table 4 below was redesigned to increase PCR efficiency for 7 of the 54 markers that were positively associated with hypertension in all three screening stages in the present invention. PCR primers are shown.
  • the 19 loci identified in the present invention were observed in chromosomes 2, 3, 4, 6, 10, 13, 17, 18, 19, and 20 (Table 5). The observed and predicted frequencies of each genotype for the 19 markers in cases and controls followed the Hardy-Weinberg equation (data not shown). Considering the range of LD, the susceptibility gene for hypertension was estimated to be in the region of 100-150 kb before and after each marker.
  • LIPIN1 is a candidate gene for human repository mouth physique characterized by loss of body fat, fatty liver, hypertriglyceridemia, and insulin resistance. To date, there has been no report that LIPIN1 is a candidate gene for essential hypertension. The function of LIPIN1 has been reported that lipin expression is important for metabolic homeostasis. LIPIN1 is of great interest for essential hypertension or metabolic syndrome.
  • 6p27 has been reported by Caulfield, M. et al. Our marker is in SMOC2 (NM —022138). The description of SMOC2 has been reported as a modular extracellular calcium binding protein and also as a calcium channel. There are no reports suggesting that SMOC2 is related to blood pressure. In addition to SMOC2, other genes on 6p27 may contribute to HP. Considering that they are involved in calcium channels, the potential for candidates is high.
  • D17S0287i in 17q21.33 is known to be contained in the CROP gene.

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Abstract

　高効率かつ低コストのマイクロサテライトを用いたマッピング方法により高血圧症感受性遺伝子を同定した。約１００ｋｂの間隔で設定したマイクロサテライト多型マーカーを用いて、高血圧に関するケース・コントロール相関解析を実施し、候補領域を絞り込んだ後、ＳＮＰをマーカーとする相関解析及び連鎖解析を実施することにより、ヒトゲノムＤＮＡ配列の特定のＳＮＰｓを含む新たな高血圧症感受性遺伝子を同定した。

Description

明 細 書
高血圧症の検査用マーカー遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、マイクロサテライト遺伝多型マーカーを用いた遺伝子マッピング方法に よって新たに同定された本態性高血圧症感受性遺伝子、及びその用途に関する。 背景技術
[0002] 高血圧症は、脳血管、冠状動脈疾患及び腎不全の主要な原因である。 Kearney等 は、高血圧症の患者数は 97,200万人であり、 2000年において成人の 26.4%にのぼり、 2025年には 15億 6千万人、 29.2%にまで増加すると予測している。様々なタイプの薬 剤が開発されて 、るが、高血圧症の罹患率を確実に減少させることはできて ヽな 、。 高血圧症が主要な危険因子であり、第 3の死亡原因であることは全世界的な重要問 題となっている。現在の一般的な循環器疾患は高血圧症の高い罹患率が主因となつ ている。人類の公衆衛生のためには、高血圧症の予防、検出及び治療により一層の 重点を置かなければならな 、。特にパーソナルな健康サービス戦略が必要とされる。 パーソナルな健康サービスは、高血圧症による負荷を軽減する大きな可能性と同時 に、コスト効率の点でも大きな効果を得る可能性が高い。最も高度なパーソナル健康 サービスは、各個人の遺伝子タイプ力 高血圧症を予防、検出及び治療することで ある。しかし、各個人の遺伝子タイプを利用するためには、まず第一に、高血圧症感 受性遺伝子を明らかにしなければならない。
[0003] 高血圧症の遺伝背景は、最もありふれた多因子疾患であり、形質変異の原因の 30- 70%を占めるとしている。また、高血圧症の同胞再発危険率え sは 2— 3と報告されて いる。しかし、高血圧症原因遺伝子の一つ一つは累積された再発危険率より低ぐよ つて、これまでに報告されているゲノムスクリーンは統計的有意性を欠いている。今日 、高血圧症を制御する遺伝子のための、ゲノムワイドスクリーニングの結果を記載した 多くの報告がある（下記の表 1を参照のこと)。しかし、その大部分は、連鎖の証拠を 示唆する多くの染色体領域を報告しているものの、明らかにメンデル遺伝には従わ ず、連鎖解析を高血圧症に適用することは困難であった。即ち、今日まで、本態性高 血圧症に関する大規模なゲノムワイドの相関解析に関する報告ない。
[表 1]
非特許文献 C Ri Tl 9taae e aasincuc,..
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新たな疾患関連遺伝子等を同定する方法としては、ヒトゲノム DNA配列に存在す る一塩基多型 (SNPs)を示す塩基と疾患との相関を調べる手法が注目されて 、る。し 力しながら、 SNPsはゲノム上の一塩基置換であることから対立遺伝子数は一般に 2個 のみであり、マッピングすべき疾患関連遺伝子力 約 5kb以内に存在する一部の SNP sし力 4目関を示さな 、ため、 SNPsを遺伝多型マーカーとしてゲノムマッピングを行うに は膨大な数の SNPsをマーカーとして設定して解析する必要がある。従って、ある程度 絞られた狭い領域にしか適用されていないのが現状である。一方、マイクロサテライト の遺伝多型マーカーは対立遺伝子数が多ぐマッピングすべき遺伝子からある程度 離れた位置にあっても相関を示すという特徴がある力 該遺伝多型マーカーの設定 数を多くしすぎると、 SNPsの場合と同様に時間及び労力の点で解析が困難であり、 設定数が少なすぎるとマーカー間隔が大きくなりすぎ、疾患関連遺伝子を見落とす 危険性があるという問題があった。
[0005] 本発明者等は、平均で約 50kb〜150kbの間隔で設定されたマイクロサテライトの 遺伝多型マーカーを用いる遺伝子マッピング方法を開発し、その方法を用いることに より、疾患関連遺伝子又は遺伝的要因を持つヒト表現型の関連遺伝子の存在領域を 高効率かつ低コストで同定できることを見出した (特許文献 1)。
[0006] 非特許文献 1 : Zhu, X.等， Nat Genet 37, 177-181 (2005)
非特許文献 2 : Caulfield, M.等， Lancet 361, 2118-2123 (2003)
非特許文献 3 : Rao, D.C.等， Am J Hypertens, 16, 148-150 (2003)
非特許文献 4 : Kardia, S丄. R.等， Am J Hypertens, 16, 154-157 (2003)
非特許文献 5 : Thiel, B.A.等， Am J Hypertens, 16, 151-153 (2003)
非特許文献 6 : Ranade, K.等， Am J Hypertens, 16, 158-162 (2003)
非特許文献 7 : Harrap, S.B.等， Physiol Genomics, 8, 99-105 (2002)
非特許文献 8 :Atwood,し D.等， Genet Epidemiol, 20, 373-382 (2001)
非特許文献 9 : Rice, T.等， Circulation, 102, 1956-1963 (2000)
特許文献 1： WO01Z79482号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] よって、本発明は、従来の SNPs相関解析の手法に比較してコスト効率が良ぐなお かつ疾患感受性遺伝子を漏れなく同定できるマイクロサテライトマーカーによる精密 なマッピング方法を多因子疾患である高血圧症 (HP) (本態性高血圧症 (EH)を含 む）に初めて適用することにより、新たな HP感受性遺伝子を同定することを目的とす る。さらに本発明は、同定された HP感受性遺伝子や当該遺伝子の発現産物である HP関連タンパク質等の情報に基づ 、て、 HPの病因や発症機序に関するデータを 収集し、適切なスクリーニングを実施することにより、最終的には HPの有効な予防 Z 治療に結びつけることを目的としている。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明では、マイクロサテライト（以下「MS」とする）を用いた遺伝子マッピング方法 を用いることにより、従来は HPとの関連性が知られていな力つた新たな HP感受性遺 伝子を同定した。
本発明によって新たに同定された HP感受性遺伝子は、ヒトゲノム DNA配列におけ る HUMUT617, D2S0226i, D17S0287i, D17S0351i, D19S0134i, D2S0208i, D13S0183 i, D4S0818i, D2S0949i, D20S885, D10S0517i, D17S0231i, D3S0865i, D3S1129i, D3 S0046i, D17S790, D18S0390i, G09023, D4S0370iを含む。本発明者等は、これらの 新たに同定された遺伝子のゲノム DNA配列内に存在する SNPsと HPとの相関解析 を実施し、統計的に有意な相関を初めて見出した。
[0009] 従って、第 1の態様として、本発明は、ヒトゲノム DNA配列の HUMUT617, D2S0226 i, D17S0287i, D17S0351i, D19S0134i, D2S0208i, D13S0183i, D4S0818i, D2S0949i, D20S885, D10S0517i, D17S0231i, D3S0865i, D3S1129i, D3S0046i, D17S790, D18S 03901, G09023, D4S0370iを含む遺伝子に存在する一塩基多型を示す少なくとも一 つの塩基を含む連続した DNA部分配列、又は当該 DNA部分配列の相補鎖力 な る、本態性高血圧症検査用マーカー遺伝子を提供する。
第 2の態様として、本発明は、前記マーカー遺伝子を用いた HPの検査方法及び検 查キットを提供する。
発明の効果
[0010] 本発明で同定された高血圧症検査用マーカー遺伝子は、その多型性と高血圧症 との相関関係に基づ 、て、高血圧症の検査方法及び高血圧症の検査キットに使用 することができる。
また、本発明のマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いたスクリー ユングにより、当該ポリペプチドのァゴニスト及び Z又はアンタゴ-ストを同定すること が可能であり、当該ァゴニスト及び Z又はアンタゴニストは高血圧症の診断、予防及 び Z又は治療薬として作用し得る。
図面の簡単な説明
[図 1]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 2]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 3]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 4]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 5]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 6]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 7]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 8]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 9]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 10]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 11]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。 [図 12]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 13]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 14]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 15]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 16]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 17]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 18]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 19]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 20]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 21]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 22]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 23]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 24]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 25]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。 [図 26]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 27]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 28]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 29]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 30]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 31]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 32]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 33]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 34]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 35]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 36]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 37]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 38]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
[図 39]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。 [図 40]本発明で使用したマイクロサテライトマーカーの名称及び Genbank登録番号に 関する情報を示す表である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明で使用する遺伝子マッピング方法は、前記特許文献 1に記載された方法で ある。具体的には、ヒトゲノム上に、所定の間隔、好ましくは約 lOOkbの間隔で設定さ れた MS遺伝多型マーカーを含有する連続 DNA配列の各 DNA配列に対応する、 フォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、該 DNA配列試料をポリメラー ゼ連鎖反応 (PCR)で増幅し、 DNAシークェンサ一などの分解能が高 、ゲルで電気 泳動を行 ヽ、増幅産物であるマイクロサテライト遺伝多型マーカー含有 DNA配列断 片を測定、解析することを含む。
[0013] ゲノムワイドに設定した MS遺伝多型マーカーに対応するフォワードプライマーとリ バースプライマーを使用して 1次 (第 1相)スクリーニングを行い、該 1次スクリーニング によって陽性を示した MS遺伝多型マーカー対して、異なったサンプル集団を用い た 2次 (第 2相)スクリーニングを行い、さらに 3次 (第 3相)スクリーニングまで行うという 多相スクリーニングを採用することにより、偽陽性を示す MS遺伝多型マーカーを無 理な補正無しに劇的に減らすことが出来る。
[0014] MSを用いた多相スクリーニングにより標的遺伝子の位置を絞り込んだ後、別の遺 伝子マッピング法を用いて、さらに詳細に侯補領域又は遺伝子座を特定することが できる。このためには、例えば、 SNPsを用いる解析が有効である。具体的には、標的 遺伝子が存在すると思われる候補領域の SNPsの多型頻度を、例えば、相関解析等 により患者集団と健常者集団等で比較し、ハプロタイプ解析により検出された連鎖不 平衡にある SNPマーカーを連鎖不平衡解析により検出することができる。
[0015] 本発明にお 、ては、 HP感受性遺伝子を同定するために、新たに設定した 18,977 の MSマーカーを使用し、コスト効率の良いスクリーニング方法として既に報告されて いるプールド DNA法を採用した。実施したゲノム相関解析は、上記したように 3つの 主要な工程を含む 3相スクリーニング法により実施した。即ち、（1)第 1種誤差率を減 少させるための 3相ゲノムスクリーニング、 (2)陽性 MS座位に関する個別のジエノタイ ビングによるプールした相関の確認、（3)スクリーニングした集団及び付カ卩的集団に おける、候補領域周辺での緻密な SNPsマーカーに関する個別のジエノタイピングに よる同定である。
[0016] 全ゲノム相関解析により、第 2、 3、 4、 6、 10、 13、 17、 18、 19及び 20番染色体に おいて、 HUMUT617, D2S0226i, D17S0287i, D17S0351i, D19S0134i, D2S0208i, Dl 3S0183i, D4S0818i, D2S0949i, D20S885, D10S0517i, D17S0231i, D3S0865i, D3S11 29i, D3S0046i, D17S790, D18S0390i, G09023, D4S0370iの SNPsとの新たな相関が 見出された。
[0017] 上記の SNPsは、 SMOC2、 XRCC5、 CROP, KCNJ16、 ZNF358、 CHST10、 SORCS2 、 LPIN1、 TACC2、 XCR1及び GRM7の各遺伝子上に存在することが知られているも のと、未知の遺伝子上に存在するものとを含んでいる。これらの SNPsでは、 HP罹患 者及び健常者との間で、アレル頻度に統計的に有意な相違が認められた。従って、 これらの遺伝子領域に存在する一塩基多型を示す少なくとも一つの塩基を含む連続 した DNA部分配列、又は当該 DNA部分配列の相補鎖は、高血圧症検査用マーカ 一遺伝子として利用できる。
[0018] 即ち、これらのマーカー遺伝子は、 HPに関する遺伝子検査に使用することができ る。
例えば、一塩基多型を示す塩基を挟むように設定したフォワードプライマー及びリ バースプライマーにより、一塩基多型を示す塩基を含む連続 DNA配列を、例えば P CR法を用いて増幅し、得られた DNA断片のヌクレオチド配列を決定し、同様に決定 した健常者のヌクレオチド配列と比較することにより、 HPに対する遺伝子的素因の有 無を検査することができる。
[0019] 検査に使用されるフォワードプライマーとしては、ヒトゲノム上にマッピングされた上 記一塩基多型を示す塩基を含むマーカー遺伝子の DNA配列の 5，末端部から 3，末 端方向に延びる配列と同じ塩基配列を有するプライマーであって、 15〜100塩基、好 ましくは 15〜25塩基、さらに好ましくは 18〜22塩基の長さのものが挙げられる。リバ一 スプライマーとしては、マーカー遺伝子の DNA配列の 3 '末端部カゝら 5 '末端方向に 延びる配列と相補的な塩基配列を有するプライマーであって、 15〜100塩基、好まし くは 15〜25塩基、さらに好ましくは 18〜22塩基の長さのものが使用できる。 [0020] また、本発明のマーカー遺伝子をプローブとして被験者からの DNAサンプルをス クリーニングし、得られた被験者 DNAのヌクレオチド配列を決定した後、当該配列を 健常者の配列と比較することによつても、 HPに対する遺伝的素因の有無を調べるこ とがでさる。
[0021] ここで使用するプローブは、本発明のマーカー遺伝子そのものでもよいが、当該マ 一力一遺伝子に存在する一塩基多型を示す塩基を含む連続 DNA配列又はその相 補鎖、あるいはそれらのハイブリダィズする配列であってもよい。好ましくは、 15〜100 塩基、好ましくは 15〜25塩基、さらに好ましくは 18〜22塩基の長さのプローブが使用 できる。
[0022] 一方、本発明で新たに相関が見出された遺伝子に基づいて、 HP感受性遺伝子の 全長塩基配列を決定することにより、それらがコードする翻訳領域を決定でき、該遺 伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を特定することができる。それらのアミノ酸配 列を持つ蛋白質は、 HPの病因又は発症機序に関与している可能性が高いため、そ れらの蛋白質の機能を促進又は阻害することにより、 HPを予防又は治療することが できる。
従って、本発明は、当該蛋白質を用いたスクリーニング方法にも関し、当該スクリー ニング方法により、当該蛋白質の機能を促進又は阻害する物質、即ちァゴニスト又は アンタゴニストを同定することができる。ここでいうアンタゴニストとは、化学的小分子 のみではなぐ抗体又はその断片、アンチセンスオリゴヌクレオチドといった生体関連 物質も包含する。これらのァゴニスト又はアンタゴ-ストは、 HPの診断、予防及び Z 又は治療薬として有効である。
[0023] 上記の蛋白質は、本発明で同定されたマーカー遺伝子の少なくとも翻訳領域を含 有する DNA配列を含むベクターを調製し、当該ベクターにより適当な宿主細胞を形 質転換することにより、当該形質転換細胞に生産させることも可能である。
実施例
[0024] マイクロサテライト（MS)検出及び PCRプライマーデザイン：
2、 3、 4、 5又は 6塩基の反復単位を有する MS配列を、 Sputnikに適用可能なアポ 口プログラム (Apollo program)を用いて、 golden Path Oct. 2000から NCBI build 30ま でのヒトゲノムのドラフト配列のバージョン 4で検出した。これらの反復を単一の反応条 件下で増幅するための PCRプライマーは、 PrimerExpressに適用可能な Discover pro gramにより自動的に設計した。また、ディファレンシャル増幅を防止するために、これ らの PCRプライマーが配列中に SNPを含まないようにした (Sham et al, 2002)。
本発明では、下記の表 2に示すような合計 18,977の多型性 MSマーカーを設定した
[表 2] マイクロサテライトの平均間隔
染色体番号 マーカー数 平均間隔 (kb)
1 ,516 145.8
1 ,847 1 18.4
1 ,422 126.3
1 ,1 57 148.9
1 ,1 73 138.8
1 ,204 127.8
1 ,266 1 12.8
830 158.6
838 148.7
907 134.4
916 132.1
684 174.3
609 168.7
571 167.7
458 197.2
508 157.4
495 143.2
539 127.1
358 160.4
430 130.4
260 162.5
228 195.6
756 68.7
5 10386.3
合計 18,977 145.9
MSマーカーの平均間隔は、ヒトゲノムの真正染色質領
域において計算した。
MSマ一力一は、 NGBI build 35上にマッピングした。
本実施例には、合計 425名（第 1相： 95、第 2相： 131、第 3相： 199)の HP罹患患者、 合計 467名（第 1相： 103、第 2相： 132、第 3相： 232)の正常血圧の健常者が参加した。 し力し、 DNAの量及び質の点で、すべてのサンプルを採用できなかった。患者はす ベて日本人であり、 日本の様々な地域 (旭川、東京、神奈川、滋賀、大阪、京都）の 出身である。本態性高血圧の診断は、 日本高血圧学会の 2000年のガイドラインに従 つて行った。 HP群の診断基準は、性別:男性、発症年齢 : 30-59歳、血圧 (mmHg) :最 高血圧（SBP)≥160mmHg及び Z又は最低血圧（DBP)≥100mmHg、肥満度指数（B Ml) (kg/m2) :≤25,及び家族履歴 (親又は兄弟姉妹)である。コントロールとしての正 常血圧の健常個体の診断基準は、性別:男性、発症年齢：≥50歳、血圧 (mmHg) :最 高血圧（SBP)≤120mmHgかつ最低血圧（DBP)≤80mmHgかつ高血圧治療を受けて V、な 、こと、肥満度指数 (BMI) (kg/m2)：≤ 25、及び家族履歴 (親又は兄弟姉妹)が無 いことである。我々は、この分析に DNAサンプルを使用した全ての罹患及び健常者 からインフォームドコンセントを得た。我々の実験手法の許諾は、各大学及びセンタ 一の関連する倫理委員会によって得た。医学的情報及び血液サンプルに付随する 全ての個人特定情報は、注意深く廃棄し、各募集機関において匿名の特定情報に 置換した。
プールド DNA及び遺伝子タイピング：
マイクロサテライトタイピングのためのプールド DNA法は、 Collins等 (2000)のプロトコ ールを基礎として、わずかな修正を加えて実施した。 DNAは、 QIAamp DNA blood ki t (QIAGEN)を用いて、 DNA質の変動を防止するために標準化された条件下で抽出 した。次いで、 DNA分解及び Z又は RNA混入をチェックするために、 0.8%ァガロース ゲル電気泳動を行った。次に、タンパク質混入をチェックするための光学密度の測定 で、 PicoGreen蛍光アツセィ（Molecular Probes)を用いた 3回の連続した測定を通して DNA濃度を決定した。 DNAサンプルの標準化されたピペッティング及びァリコートを、 Biomek 2000及び Multimek 96 (Beckman)を用いて自動的に実施した。 2 X 18,977マ イク口サテライトタイピングのためのプール化 DNAテンプレートを、 DNA定量化後、即 座に調製した。プール化 DNAの質は、 6個のマイクロサテライトマーカーを用いて個 体とプールィ匕したタイピング結果との間のアレル分布を比較することによって確認し た。最初の試験の後、プライマーを除く全ての成分を含む 18,977PCR反応混合物を 調製し、次いで、 96ゥエルの反応プレートにァリコートし、使用するまで保存した。 PCR 反応後のマイクロサテライトプール化タイピング及び個々の遺伝子タイピングの手法 は、 ABI3700及び 3730DNAアナライザー（Applied Biosystems)を用いた標準的なプ ロトコールに従って実施した。規格ィ匕した調製物は、実験を通してプール化 DNAタイ ビングのために再現性及び正確性が維持されるようにした。ピーク位置及び高さなど の種々の情報は、クロマトグラフ ABI fasファイルのマルチピークパターンから、 Applie d Biosystemsによって開発された、 PickPeak及び Multipeaksプログラムによって手動 で抽出した。統計的な有意性を維持するポジティブマーカーのほとんどは、同じケー ス及びコントロールのセットを用いた個別タイピングによって確認された。
マーカー情報の詳細はすでに報告されている（Tamiya,G.等，投稿済)。マイクロサ テライトマーカーは、 200人の健常日本人を用いて、繰り返し多型について DNAプー ルド法で実験した。 MS選択のための我々の基準は、 1) 2ヌクレオチド繰り返しが 10回 以上繰り返されること、及び 3、 4及び 5ヌクレオチドの繰り返しが 5回以上繰り返される こと;及び 2)多型 MSが 30%以上のへテロ接合性をもつこと、ただし、不安定で高度に 変異したマイクロサテライトを排除するために、 85%以上のへテロ接合性を持たない ことである。また我々は、 differential増幅を防止するために、配列内に SNPsを含まな い PCRプライマーを選択した。現在我々の研究室では、 27,037マーカーの全セットを 確立している。この研究では、平均 146kb間隔を持つ 18,977マーカーを第 1のセットと して使用した。最近の多くのデータから蓄積された知見に基づいて、疾患感受性 SNP sと近接するマイクロサテライトアレルとの間の LDの平均長は lOOkb以上である。従つ て、 200kb密度でのゲノムのマイクロサテライトをベースとするマップは、全ゲノム相関 解析を信頼できるものにするであろう。 LDパターンは、アレル頻度、変異及び組み換 えなどのいくつかの要因によって、ヒトゲノムの異なる領域の間で変化するが、全ゲノ ムに渡る遺伝子マーカーの平均間隔を使用することは、ゲノムワイドの LDマップが入 手できるようになる前のゲノムワイド相関解析における現実的な解決策である。したが つて、我々のゲノムワイド解析の第 1段階は、ヒトゲノム (3Gb)の真正染色体領域 (〜9 0%)をカバーするのに十分なマイクロサテライトマーカー（〉18000マイクロサテライト； 1 50kb毎に 1つのマイクロサテライト）を収集することである（3 X 109kb X 0.9/150kb = l 8,000) oゲノムの残りの部分は、殆どが主にセントロメァ及びテロメァに制限されるへ テロクロマチンであり、繰り返し配列に富み、発現された遺伝子を含まないと考えられ る。この 150kbの間隔は、全ゲノムに渡り 2つの近接するマイクロサテライトによる疾患 感受性位置のために、 LDの一般的長さと推定される 100kbの遺伝子間隔を十分に力 バーできると考えられる。
[0029] 統計解析：
ケース及びコントロール集団における層化の検出のために Pritchard法を採用した。 P値を計算するために、我々は 2つのタイプのフィッシャー正確確率試験を採用し、各 個体のアレルに対する 2 X 2分割表、各位置に対する 2 X m分割表であり、 mは、集団 で観察されたマーカーアレルの数である。 2 X m分割表につ!、てのフィッシャーの正 確性試験を実行するために、 Malkov chain/Monte Carloシミュレーション法を採用し た。これらの分析は、ソフトウェアパッケージ、 MCFishmanを用いて実施した。
[0030] 結果：
3段階スクリーニング：プールド DNAタイピング
ゲノムワイドスキャン (表 3)において、高血圧感受性とされる 50マーカーを同定した 。第 1のスクリーニング（ケース及びコントロールは各々 95個体）〖こより、 18,977マーカ 一を 1,160マーカーに絞り、第 2のスクリーニング（各 120個体）〖こより、 284マーカーに 絞り込んだ、第 3のスクリーニング (各 170個体）により、抽出した 54マーカーに減縮し た。 3段階スクリーニングは、タイプ I誤差力も生ずる多くの擬陽性を排除するために 実施した (26)。確かに、プール化 DNAのアレル頻度は推定であり、次いで真のアレル 頻度を確認するために、個別タイピングによりプールドタイピングをする。実験及び人 為的誤差を排除するために、これらのマーカーは種々の条件により置換される（ポリメ ラーゼ連鎖反応 (PCR)、アナライザー、酵素など)。
[0031] [表 3]
0032
Figure imgf000016_0001
労力を削減するために採用した。 3段階スクリーニングは、 3つの独立したサンプル集 団における結果を順次再現することを目的とする。これらのスクリーニングを開始する 前に、 1〜22及び X染色体の各々力 特に選択した 23の MSを用いて、 Pritchard' s methodにより、ケース又はコントロールのいずれかにおける有意な層化が無いことを 確認した (このような分析を成功裏に実施するために十分である)。この試験の達成 は、特に本態性高血圧症などの発祥の遅い疾患についての集団統計によって生じ、 その適切なコントロールの補正が困難な、いわゆる「見せかけの相関」を防止するた めに重要である。それで、種々の機関がこの研究に参加し、できる限り年齢の高い健 常ボランティアを集めた (年齢 > 50)。
[0033] 以下の表 4は、本発明において 3段階のスクリーニング全てで高血圧症との関連性 がポジティブであった 54マーカーのうち 7つの MSマーカーについて、 PCR効率を向 上させるために再設計された PCRプライマーを示す。
[0034] [表 4] 個別タイピングのために再設計されたマイクロサテライトのプライマ一
プライマ一配列 アンプリコン
登録 ID 5'
染色 ユニット リビー卜数
3'プライマ一配列 サっ
D17S0351 i FAM TGAGTTATGTAAGAGGGAGTTGGTTT (配列番号: 1 ) 260 ATAG 12
GCCTGCATAATTGAATAAGTGAGTTT (配列番号: 2)
D13S0183i FAM CAAAAGTGAATTTAGMAGATGGGTAGA (配列番号: 3) 290 TATC 13
GCGAGAGAGACATGCATTAMTTTA (配列番号 4)
D4S0818i FAM TTT6TCTGTGGTGCAAGGTTAGG (配列番号 :5) 158 TTCT 22
CACAMTGGTGCTGATCMTTGA (配列番号: 6)
D20S885 FAM TTGTGCGCAGGTTATTTCAGTCAG (配列番号: 7) 187 TG 17
CGGAAAGAAGGTAAGTGTCGATCTA (配列番号 :8)
D3S0865i FAM GGTGAAAGGAGGGCAGAA66 (配列番号 :9) 212 GATA 12
TTAAGTTTGTGTGGTATTATGATGTGTGTC (配列番号: 10)
D3S0046i FAM GTGGGTGAGAGAGCTAGAGTCTTGTCAG (配列番号 :11) 260 ttct 9
GCATATGAACATAAATGGATGTAATAGTGGAAA (配列番号: 12)
D4S0370i FAM CCTGCGAAGCTAAGCACAMTTATM (配列番号: 13) 92 TG 15
TGATTTAGCCAGTTGGGTTAGGTTTA (配列番号 :14)
[0035] 個別 (Individual)タイピング
プールドタイピングの結果は推定であった。合計 770個体 (ケース 385対コントロール 385)を 54マーカーについて遺伝子タイピングして分析した。高血圧症に対するゲノム ワイドの相関解析により、最終的に 19の位置を同定した (表 3)。 19のマーカーは、 2x 2解析により全て有意（p〈0.05)であった力 そのうち 3つのマーカーは 2xm解析におい ても p〈0.05のレベルであった。さらに、全てのォッズ比は 2未満、 0.13〜1.8の範囲で あった。
[0036] 本発明で特定された 19の遺伝子座位は、第 2、 3、 4、 6、 10、 13、 17、 18、 19及 び 20の染色体に観察された（表 5)。ケース及びコントロールにおける 19マーカーに っ ヽて各遺伝子タイプの観察された及び予測された頻度は、ハーディ—ワインベル グ等式 (Hardy-Weinberg equation)に従った（データは示さず）。 LDの範囲を考慮す ると、高血圧症に対する感受性遺伝子は、各マーカーから前後 100〜150kbの領域に あると見積もられた。
[0037] [表 5]
Figure imgf000019_0001
上記のように、本態性高血圧症に寄与する 19の位置が同定された。これらについて のケース コントロール解析の結果を以下の表 6に示す。
[表 6]
Figure imgf000020_0001
上記の 19の座位のうち、以下の SNPsポジティブマーカーについて、その両側 100k bセグメントを集中的に実験した。 5kb毎に均等に SNPsを配置し、新たな集団でケース •コントロールスタディを行った。それぞれ相関解析で p値 0.05以下の SNPを各ロー力 スで複数同定している。
[0040] (l) D2S0949i
2p25.1は、 Zhu, X.等によって混合マッピングを用いて報告されている。彼らは、示 唆的であることは報告した力 染色体 2p25.1上のどの領域と連鎖しているかは特定し ていない。この一致は、 2p25.1が EHの未知の候補遺伝子を含むことを示唆している。 我々のマーカーは、 LIPN1 (NM145693.1)内にある。 LIPIN1は、体脂肪の喪失、脂肪 肝、高トリグリセリド血症、及びインスリン耐性を特徴とするヒトのリポジスト口フィの候補 遺伝子である。これまでに、 LIPIN1が本態性高血圧症の候補遺伝子であることを報 告した例はない。 LIPIN1の機能は、 lipin発現が代謝ホメォスタシスに重要であると報 告されている。 LIPIN1は、本態性高血圧症又は代謝シンドロームにとって極めて興味 深い。
[0041] (2) HUMUT617
6p27は、 Caulfield, M.等によって報告されている。我々のマーカーは、 SMOC2 (NM —022138)内にある。 SMOC2の記述は、モジュラー細胞外カルシウム結合タンパク質 として、またカルシウムチャンネルとしても報告されている。 SMOC2が血圧に関係する ことを示唆する報告はな 、。 SMOC2以外にも 6p27上の他の遺伝子が HPに寄与して いる可能性がある力 カルシウムチャンネルに関与することを考えると、候補の可能 '性は高い。
[0042] (3) D17S0287i
17q21.33にある D17S0287iは、 CROP遺伝子に含まれることが知られている。
他の 17位置は、主要なゲノムワイド研究及び候補アプローチによって示唆された報 告はない。従って、疾患感受性遺伝子を確認するための長期間及び努力が必要とさ れるであろう。しかし、この研究の結果は、本態性高血圧症の未知の生理学的メカ- ズム又は個々の遺伝子タイプに対する新たな医薬の発見に結びつく可能性がある。 将来は、 SNPタイピングを実施して、マイクロサテライトによって同定したこれら 19の狭 い領域力 疾患感受性変異を抽出する必要がある。

Claims

請求の範囲
[I] ヒトゲノム DNA配列の HUMUT617, D2S0226i, D17S0287i, D17S0351i, D19S0134i, D2S0208i, D13S0183i, D4S0818i, D2S0949i, D20S885, D10S0517i, D17S0231i, D3S 0865i, D3S1129i, D3S0046i, D17S790, D18S0390i, G09023, D4S0370iを含む遺伝子 に存在する一塩基多型を示す少なくとも一つの塩基を含む連続した DNA部分配列 、又は当該 DNA部分配列の相補鎖力もなる、高血圧症検査用マーカー遺伝子。
[2] 50〜1500bpの長さを有する、請求項 1に記載のマーカー遺伝子。
[3] 100〜1000bpの長さを有する、請求項 2に記載のマーカー遺伝子。
[4] 請求項 1から 3のいずれか一項に記載のマーカー遺伝子に対応する DNA部分配列 を被験者から採取し、当該 DNA部分配列の塩基配列を決定し、当該塩基配列を健 常者から得た該当塩基配列と比較することを含む、高血圧症の検査方法。
[5] 請求項 1から 3のいずれか一項に記載のマーカー遺伝子、あるいはそのプライマーを 含む高血圧症の検査キット。
[6] 請求項 1から 3の!、ずれか一項に記載のマーカー遺伝子の DNA配列を含むベクタ
[7] 請求項 6に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
[8] 請求項 1から 3のいずれか一項に記載のマーカー遺伝子によってコードされるポリべ プチド。
[9] 請求項 7に記載の宿主細胞を発現に適切な条件でインキュベートすることを含む、請 求項 8に記載のポリペプチドの製造方法。
[10] 請求項 8に記載のポリペプチドを用いるスクリーニング方法。
[II] 請求項 10に記載のスクリーニング方法で得られるァゴニスト及び Z又はアンタゴニス
[12] 請求項 11に記載のァゴ-スト及び Z又はアンタゴニストを含む高血圧症の診断、予 防及び Z又は治療薬。
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