WO2007029664A1 - 乳酸の製造法 - Google Patents

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lactic acid
dna
microorganism
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Mikito Ito
Kimie Masuda
Hideo Mori
Makiko Kato
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism having an ability to produce lactic acid and a method for producing lactic acid using the microorganism.
  • Lactobacillus genus Lactococcus genus I acid bacteria, RhizoDUs filamentous fungi, Saccharomvces genus yeast, and Escherichia coli have been reported as microorganisms producing lactic acid.
  • Lactic acid has low optical purity (Non-patent Documents 1 and 2), filamentous fungi have many by-products such as glycerol and ethanol fumarate (Non-patent Documents 3 and 4), yeast It is known that even when a recombinant strain is used, a large amount of ethanol is produced as a by-product and the yield relative to the sugar consumption is low (Non-patent Document 5).
  • Non-patent Document 6 a method using a pyruvate formate lyase gene and a gene-deficient strain related to organic acid and ethanol by-products.
  • Non-patent Document 7 a method using a mutant of a phosphotransacetylase gene and a phosphoenolpyruvate ruboxylase gene is known (Non-patent Document 7), but all of them have low lactic acid productivity.
  • Escherichia coli 4-hydroxybenzoate polyprenyltransferase (hereinafter referred to as UbiA protein) and 2-octapureurphenol 2-octaprenyl-6-methoxyphenol; flavin reductase (hereinafter referred to as UbiB protein)
  • UbiA protein 2-hydroxybenzoate polyprenyltransferase
  • UbiB protein 2-octapureurphenol 2-octaprenyl-6-methoxyphenol
  • flavin reductase (hereinafter referred to as UbiB protein)
  • UbiA protein 2-octapureurphenol 2-octaprenyl-6-methoxyphenol
  • flavin reductase (hereinafter referred to as UbiB protein)
  • Acetic acid is a by-product in lactic acid fermentation and interferes with the purification and polymerization of lactic acid. Therefore, there is a demand for an inexpensive method for producing lactic acid with a small amount of acetic acid by-product.
  • Non-patent literature l Appl. Microbiol. BiotechnoL, 45, 307 (1996)
  • Non-Patent Document 2 Enzyme Microb. TechnoL, 26, 87 (2000)
  • Non-Patent Document 3 Appl. Biochem. BiotechnoL, 51, 57 (1995)
  • Non-Patent Document 4 J. Biosci. Bioeng., 97, 19 (2004)
  • Non-Patent Document 5 Appl. Environ. Microbiol, 71, 2789 (2005)
  • Non-Patent Document 6 Appl. Environ. Microbiol, 69, 399 (2003)
  • Non-Patent Document 7 Appl. Environ. Microbiol, 65, 1384 (1999)
  • Non-Patent Document 8 FEBS Letters, 307, 347 (1992)
  • Non-Patent Document 9 Science, 257, 771 (1992)
  • Non-Patent Document 11 J. BacterioL, 99, 450 (1969)
  • Non-Patent Document 12 Biochem. J., 117, 551 (1970)
  • Non-Patent Document 13 J BacterioL, 182, 5139 (2000)
  • An object of the present invention is to provide a microorganism having improved lactic acid productivity and a method for producing lactic acid using the microorganism.
  • the present invention relates to the following (1) to (8).
  • a protein whose gene has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or has a homology of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and 4-hydroxybenzoic acid
  • the microorganism according to (2) above which is a gene encoding a protein having acid polyprenyl transferase activity or 2-octaprenyl phenol 2-octappre-ru 6-methoxyphenol; flavin reductase activity.
  • the gene hybridizes under stringent conditions with a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the microorganism according to (2) above which is a gene encoding a protein having 4-hydroxybenzoate polyprenyl transferase activity or 2-octaprenyl phenol 2-octaprenyl-6-methoxyphenol; flavin reductase activity.
  • microorganism according to any one of the above (1) to (4), wherein the microorganism has an enhanced ability to produce lactic acid by a method selected from the following [1] to [5].
  • Microbial power ⁇ Erwinia berbicoia, Erwinia amvlovora, Erwinia carotovora, serratia ma rcescens.Serratia ficaria.Serratia fonticola, Serratia liquefaciens. , Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas dacunhae.
  • Pseud omonas fluorescens Pseudomonas svringae, Pseudomonas thazdinophilum, Acidithio bacillus ferrooxidans, Acinetobacter SO. ATCC 33305, Agrobacterium tumefaciens.
  • Bacillus halodurans Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradvrnizobium iaponicum Brucella melitensis, Burkholderia Dseudomalle i, Caulobacter crescentus, Chloroflexus aurantiacus, Clostridium acetobutvlicum, C lostridium botulinum, Clostridium difficile, Coxiella burnetii, Desulfitobacter iumhafh iduc, Geobactrey metalem, Geobacter metalem Legionella pneumophila, LeOtospira interrogans, Magnetococcus MC-1, Magnetospirillum magnetotacticum, Mannheimia haemolvtica, Mesorhizobium loti, Methylobacillus flagellatus, Methyloba cterium extorquens.Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra
  • a method for producing lactic acid wherein any one of the above-mentioned (1) to (7) is cultured in a medium, lactic acid is produced and accumulated in the culture, and lactic acid is collected from the culture.
  • the present invention can provide a microorganism having improved lactic acid productivity and a method for producing lactic acid using the microorganism.
  • microorganism of the present invention examples include 4-hydroxybenzoate polyprenyl transferase activity, or 2-octapureurphenol 2-octappre-ru 6-methoxyphenol; flavin reductase activity is reduced or lost, and lactic acid
  • the microorganism is not particularly limited as long as it has an ability to produce, for example, a gene encoding a protein having 4-hydroxybenzoate polyprenyltransferase activity (hereinafter also referred to as UbiA protein) on chromosome DNA, or 2-o Kutapreyulphenol 2-octaprenyl 6-methoxyphenol; lacks part or all of the gene encoding a protein with flavin reductase activity (hereinafter also referred to as UbiB protein) and has the ability to produce lactic acid Can list microorganisms.
  • UbiA protein 4-hydroxybenzoate polyprenyltransferase activity
  • UbiB protein 2-o Kutapreyulphenol 2-
  • a gene includes a structural gene and a region having a specific control function such as a promoter and an operator, and a part or all of the gene encoding UbiA protein or UbiB protein is deleted.
  • Microorganisms having chromosomal DNA have a base deletion in the base sequence of the gene on the chromosomal DNA, so (1) transcriptional control of the promoter or operator of the gene encoding UbiA protein or UbiB protein functions.
  • Microorganisms that do not express UbiA protein or UbiB protein (2) Microorganisms that do not express UbiA protein or UbiB protein, (2) Microorganisms in which frame shift occurs and UbiA protein or UbiB protein is not expressed as an active protein, and (3) Among genes encoding UbiA protein or UbiB protein Microorganisms in which a part or all of the gene is deficient can be mentioned, preferably (3) Microorganisms, more preferably in the gene encoding UbiA protein or UbiB protein A microorganism lacking all of the structural gene can be mentioned.
  • the absence of a part of the structural gene in the gene encoding UbiA protein or UbiB protein means that deletion of one base in the structural gene part is preferable, and preferably 5 to: LO base in the structural gene. More preferably, the deletion of 10 to 50 bases in the gene, and still more preferably 50 to: LOO bases in the gene can be mentioned.
  • Microorganisms with reduced hydroxybenzoate polyprenyltransferase activity or 2-octaprenylphenol 2-octapre-ru 6-methoxyphenol; flavin reductase activity include microorganisms with genes encoding wild-type UbiA protein or UbiB protein. In comparison, it is not particularly limited as long as it has a reduced activity, but generally 60% or less, preferably 40%, more preferably 20% or less, even more preferably 10% or less, particularly preferably. Microorganisms reduced to 5% or less can be mentioned.
  • the gene encoding the UbiA protein or the UbiB protein is a gene encoding a protein having 4-hydroxybenzoate polyprenyltransferase activity, or 2-octaprenylphenol 2 octaprel 6-methoxyphenol; flavin reductor
  • a gene encoding a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 Having a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more, and 4-hydroxybenzoate polyprenyltransferase Active or 2-octaprenylphenol 2-octaprenyl-6-meth
  • nucleotide having the specific base sequence or a part thereof is a polynucleotide that can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis and can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • the polynucleotide used as a probe include polynucleotides having at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • Polynucleotides used as primers include at least 10 bases. More preferably, a polynucleotide having 15 bases or more can be mentioned.
  • the above stringent conditions include a polynucleotide, preferably a DNA-immobilized filter and a probe, preferably a probe DNA, 50% formamide, 5 X SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM quench). Acid), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / 1 denatured salmon sperm D After incubating in a solution containing NA at 42 ° C and incubating, for example, it is preferable to wash the filter in 0.2 X SSC solution at about 65 ° C, but use lower, stringent conditions. You can also.
  • Stringent conditions can be changed by adjusting the concentration of formamide (the lower the concentration of formamide, the lower the stringent), and changing the salt concentration and temperature conditions.
  • Low stringent conditions include, for example, 6 X SSCE (20 X SSCE is 3 mol / 1 sodium chloride, 0.2 mol / l sodium dihydrogen phosphate, 0.02 mol / l EDTA, pH 7.4), Incubate at 37 ° C in a solution containing 0.5% SDS, 30% formamide, 100 ⁇ g / 1 denatured salmon sperm DNA, then 1 X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C Conditions for washing with the solution can be raised. Further, as a lower stringent condition, under the above-mentioned low stringent condition, washing is performed after carrying out a noblation and hybridization using a solution having a high salt concentration (for example, 5 X SSC). Conditions can be raised.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing the blocking reagent used to suppress the background of the hybridization experiment.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by changes in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • a gene that can be hybridized under the stringent conditions described above is represented by SEQ ID NO: 3 or 4 when calculated based on the above-described parameters using, for example, BLAST and FASTA described above. Examples thereof include genes having at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, further preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more homology with the base sequence.
  • the microorganism of the present invention is preferably a prokaryote, more preferably a bacterium.
  • fungi the genus Erwinia, Serratia, Salmonella, Escherichia, Proteus, Pseu domonas, Acidithiobacillus b, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Bordetella, Bradyrhizo Dium, Brucella, Chlobacter, Coflobacter Genus, Clostridium, Coxiella, Desulfitobacterium, Geobacter, Haemophil us 3 ⁇ 4 ⁇ Legionella Leptospira, Magnetococcus, Magnetospirillum, Mannhei miaoc, MesorhizoDium, Methylobacillus, Methylobacterium ⁇ , Mvcobacterium, Nisoc Genus, Pasteurella, Prochlorococcus, Rh odobacter, Rhodococcus, Rhodops
  • the microorganism of the present invention can be obtained by (1) a method in which part or all of the gene encoding UbiA protein or UbiB protein present on the chromosomal DNA of a microorganism capable of producing lactic acid is lost, or (2) chromosomal DNA. It can be produced by a method of imparting lactic acid productivity to a microorganism in which a part or all of the gene encoding UbiA protein or UbiB protein is deleted.
  • the microorganism having the ability to produce lactic acid is not particularly limited as long as it has the ability to produce lactic acid, and when the strain itself isolated from nature has the ability, the strain itself can be produced by a known method. Examples include microorganisms that have artificially imparted the ability to produce lactic acid.
  • the base sequence of the gene encoding the UbiA protein or UbiB protein of each microorganism is represented by SEQ ID NO: 3 or 4 by searching various DNA sequence databases using the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 in the query.
  • Identification of genes encoding UbiA or UbiB proteins by Southern or hybridization of chromosomal DNA of various microorganisms using all or part of a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence as a probe. Identification of genes encoding UbiA or UbiB proteins by PCR using chromosomal DNA of various microorganisms using primers obtained or designed based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • Chromosomal DNA subjected to Southern hybridization and PCR may be chromosomal DNA of any microorganism, preferably Erwinia, Serratia, Salmonella Eschericnia JS, Proteus, Pseudomonas, Acidithiobacnlus S, Acinetobacter JS , Agrobacterium, Bacillus, Bordetella, Bradyrhizobium, Bracella, BurKholderia, Caulobacter deer, Chloroflexus, Clostridium, Coxiella, Desulfitobacterium, Geobacter, Haemophilus, Legionella, Leptospircus, Magnet MagnetospirillumJS, Mannheimia, Mesorhizobium, Meth ylobacillus, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Nitrosomonas Genus, Nostoc genus, Pasteurella gen
  • Hybridization and PCR can be performed using conventional methods such as molecular Version 3, 3rd edition (2001), Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994), as well as many other standard textbooks.
  • Examples of a gene encoding UbiA protein or UbiB protein include a gene encoding a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, a gene having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, Shigella flexneri Examples include the ⁇ ⁇ ⁇ gene derived from 2a and the IgE gene (Genbank accession no. AE005674), the ubiA gene derived from aalmonella entenca, and the lE gene (Genbank accession no. NC004631).
  • a method for introducing a base deletion, substitution or addition into a gene on the chromosomal DNA of a microorganism a method utilizing homologous recombination can be mentioned.
  • a mutant gene introduced with a base deletion, substitution or addition is introduced with a base deletion or the like! /, Cannot replicate independently in a host cell !
  • a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligation with a plasmid DNA having a drug resistance gene can be mentioned.
  • a transformant in which the plasmid for homologous recombination is incorporated into the chromosomal DNA by homologous recombination using drug resistance as an indicator. select.
  • the obtained transformed strain does not contain the drug!
  • a strain in which the second homologous recombination has occurred on chromosome DNA can be obtained.
  • linear D containing a gene into which a base deletion, substitution or addition is to be introduced.
  • NA is taken into cells and homologous recombination occurs between the chromosomal DNA and the introduced linear DNA.
  • This method can be applied to any microorganism as long as it efficiently incorporates linear DNA.
  • Preferred microorganisms include the genus Escherichia, more preferably Escherichia coli, and more preferably a group of recombinant proteins derived from ⁇ phage ( Red recombination system) can be expressed, and can be raised.
  • pKD46 available from the Escherichia coligenetic stock center (Yale University, USA)
  • Escherichia coli JM101 stock examples include Escherichia coli JM101 stock.
  • any drug resistance gene can be used as long as it is a drug resistance gene that imparts drug resistance to a drug to which the host microorganism is sensitive.
  • examples of drug resistance genes include kanamycin resistance gene, chloramphee-chol resistance gene, gentamicin resistance gene. Examples thereof include genes, spectinomycin resistance genes, tetracycline resistance genes and ampicillin resistance genes.
  • a gene that can be used for negative selection refers to a gene that is lethal to the microorganism under certain culture conditions when the gene is expressed in a host microorganism.
  • a ⁇ gene derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus Appl. Environ. Microbiol, 59, 1361-1366 (1993)]
  • a gene derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia [Genomics, 72, 99-104 (2001)].
  • DNA that is homologous to DNA located at both ends of the above-described linear DNA and located outside both sides of the target region for substitution or deletion on chromosomal DNA is linear DNA. It is arranged in the same direction as that on the chromosomal DNA, and its length is preferably about 10 to 100 bp, more preferably about 20 to 50 bp, and further preferably about 30 to 40 bp.
  • the nucleotide sequence recognized by the yeast-derived Flp recombinase is not particularly limited as long as the protein recognizes and catalyzes homologous recombination, but is preferably a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 And a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added to the DNA, and a base sequence that recognizes Hp recombinase derived from yeast and catalyzes homologous recombination. Can give DNA.
  • To be homologous means that the linear DNA has homology to such an extent that homologous recombination occurs in a target region on the chromosomal DNA.
  • a homology of 0% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 100% can be raised.
  • the homology of the base sequence can be determined using a program such as BLAST or FASTA.
  • the linear DNA can be prepared by PCR.
  • the target linear DNA can be obtained by treatment with a restriction enzyme.
  • Examples of methods for introducing base deletions, substitutions or additions into the chromosomal DNA of microorganisms include the following methods 1 to 4.
  • Method 1 Introducing the linear DNA (a) or (d) above into the host microorganism and using drug resistance as an indicator A method for selecting a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination.
  • Method 2 By introducing the linear DNA of (b) above into the transformed strain obtained by Method 1 above and deleting the drug gene inserted into the chromosomal DNA by the method, A method of substituting or deleting a region of.
  • the linear DNA of (c) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • the linear DNA of (d) above is introduced into a host microorganism, and a transformant in which the linear DNA is inserted into chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index.
  • any method can be used as long as it introduces DNA into the microorganism.
  • a method using calcium ion. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-2483942
  • electo mouth position method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], etc. I can give you.
  • the above methods 2 to 4 are methods that do not leave a foreign gene such as a drug resistance gene and a gene that can be used for negative selection on the chromosomal DNA of the finally obtained transformant, use this method.
  • a foreign gene such as a drug resistance gene and a gene that can be used for negative selection
  • Microorganisms with substitutions or additions can be produced.
  • the mutant strain obtained by the above method has reduced or lost 4-hydroxybenzoate polyprenyl transferase activity, or 2-octapureurphenol 2-octaprenyl-6-methoxyphenol; flavin reductase activity, This can be confirmed, for example, by measuring and comparing the productivity of ubiquinone between the mutant strain and the original strain by a known method.
  • D-lactate dehydrogenase activity can be reduced by reducing or losing L-lactate dehydrogenase activity, and more preferably by enhancing D-lactate dehydrogenase activity.
  • productivity of lactic acid is high, and microorganisms can be created.
  • amino acid sequences of D-lactate dehydrogenase and L-lactate dehydrogenase and the base sequence of the gene that codes for the enzyme are known in many microorganisms, and can be easily obtained from various databases. Can be obtained.
  • microorganisms with reduced or lost activity of D-lactate dehydrogenase or L-lactate dehydrogenase are those enzymes present on chromosomal DNA according to the method described above using the obtained sequence information. It can be obtained by deleting part or all of the gene.
  • a microorganism with enhanced activity of D-lactate dehydrogenase or L-lactate dehydrogenase can be obtained by introducing these enzyme genes into the microorganism by a known method.
  • the gene may be integrated on the chromosomal DNA or added extrachromosomally. It exists as mid DNA!
  • the entire ORF of the D-lactate dehydrogenase gene of Escherichia is deleted and the L-lactate dehydrogenase gene, preferably MU ⁇
  • a method to incorporate the L-lactate dehydrogenase gene of lk onto the chromosomal DNA can be mentioned.
  • deviations of D-lactic acid and L-lactic acid can also be produced.
  • Lactic acid can be produced by culturing the microorganism of the present invention 2 in a medium, producing and accumulating lactic acid in the culture, and collecting the lactic acid from the culture.
  • the method of culturing the microorganism in the medium can be performed according to a usual method used for culturing the microorganism.
  • any medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and capable of efficiently cultivating the microorganism can also use the! it can.
  • the carbon source may be glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolyzate, acetic acid, propionic acid, etc. as long as the microorganism can assimilate.
  • Alcohols such as organic acids, ethanol, and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium salts, and other nitrogen-containing elements.
  • a compound, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. may be used. it can.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C.
  • the culture time is usually 5-7 days.
  • pH is 3.0-9 Hold at .0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • Lactic acid produced and accumulated in the culture can be collected by a normal method using activated carbon, ion exchange resin, or the like, or an electrodialysis method using an ion exchange membrane, or a method of hydrolysis by distillation after esterification. Extraction with an organic solvent, distillation under reduced pressure, crystallization, chromatography using high performance liquid chromatography and the like can be used.
  • Example 1 is shown below, but the present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1 is shown below, but the present invention is not limited to the following examples.
  • the chromosomal DNA of E. coH KM22 strain [Gene, 246, 321-330 (2000)] is a saddle type, and each 3 and 25 bases are hybridized to both ends of the kanamycin resistance gene on the KM22 strain chromosomal DNA.
  • PCR was carried out using the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 5 and 6 designed as described above as a primer set.
  • For PCR prepare 25 ⁇ l of the reaction solution containing 10 ng of the chromosomal DNA fragment and 20 pmol of each of the primer DNA using LA-Taq according to the instructions attached to LA-Taq, and incubate at 94 ° C for 2 minutes. A cycle of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 30 times, followed by incubation at 72 ° C for 10 minutes.
  • a DNA fragment for deletion of a gene encoding UbiA protein (hereinafter referred to as ⁇ gene) and a DNA fragment for deletion of a gene encoding UbiB protein (hereinafter referred to as ubiB gene ⁇ ⁇ ) were prepared as follows. . PCR was performed using the DNA fragment obtained above as a saddle type and using the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 9 and 10, or SEQ ID NOs: 11 and 12 as a primer set.
  • the DNA having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NOs: 9 and 11 has a nucleotide sequence consisting of 45 nucleotides having a homologous sequence near the 5′-terminal region of the ⁇ gene or the ⁇ gene on the 5′-terminal side, respectively. It has a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 on the 3 ′ end side.
  • DNA has a nucleotide sequence consisting of 45 nucleotides having a homologous sequence with the ⁇ gene on the 5 ′ end side or the vicinity of the 3 ′ end region of the gene, and the base represented by SEQ ID NO: 8 on the 3 ′ end side. It has a DNA of 25 bases that hybridizes to the sequence.
  • PCR was prepared using EX-Taq (Takara Bio Inc.) and a 50 ⁇ l reaction solution containing 10 ng of amplified DNA fragment and 1 DNA each of primer DNA according to the instructions attached to EX-Taq. After holding at 94 ° C for 1 minute, repeating the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute 30 times, then cooling at 4 ° C .
  • the transformed cells were treated with SO C medium [20 g / l Batatotryptone (Difco), 5 g / l Bacto Yeast Extraato (Difco), 0.5 g / l sodium chloride, 0.2 ml / l 5 mol / l NaOH , 10 ml / l lmol / 1 magnesium chloride, 10 ml / l lmol / 1 magnesium sulfate, 10 ml / l 2M glucose] at 30 ° C. for 3 hours. It was spread on an LB agar plate containing kanamycin and lOg / 1 glucose and incubated at 30 ° C.
  • SO C medium 20 g / l Batatotryptone (Difco), 5 g / l Bacto Yeast Extraato (Difco), 0.5 g / l sodium chloride, 0.2 ml / l 5 mol / l NaOH , 10
  • E. coH BW25113 A ubiA strain E. coH BW25113 A ubiB The strain was named.
  • n.d. indicates that measurement was not performed.
  • the E. soli BW25113 ⁇ ubiA and E. coli BW25113 ⁇ ubiB strains have higher D-lactic acid productivity than other ubiquinone biosynthetic gene-deficient strains and impurities during lactic acid purification. Thus, it was revealed that there is little by-product of acetic acid that inhibits the polymerization of lactic acid. The optical purity of D-lactic acid was 99% or more.
  • E. coH BW25113 A ubiA strain and E. ⁇ UBW25113 A ubiB strain were each inoculated into a test tube containing 5 ml of LB liquid medium containing lOg / 1 glucose and shaken at 37 ° C for 17 hours. Culture was performed to obtain a culture.
  • M9 liquid medium 5% glucose, 11.28 g / l M9 Minimal Salts (X5) (Difco)
  • X5 11.28 g / l M9 Minimal Salts (X5) (Difco)
  • casamino acid 1 00 ⁇ mol / 1 calcium chloride, 2 mM magnesium sulfate, 10 ⁇ g / ml iron sulfate
  • 1041 ⁇ 1 30% glucose 1041 22.56 g / l M9 Minimal Salts (X10) (Difco), 104 1 10% casamino acid, 2 1 lmol / 1 sulfate.
  • the E. coH BW25113 A ubiA strain and the E. coH BW25113 A ubiB strain have the ability to produce as much as lOOg / 1 D-lactic acid, but very little acetic acid is produced as a by-product. Met. The optical purity of D-lactic acid was 99% or more.
  • the sacB gene was obtained by PCR as a region of 400 bp upstream and 200 bp downstream of the coding region.
  • PCR was performed using the chromosome DNA of subtilis 168 strain (available from various public institutions) as a saddle type, and DNA having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NOs: 14 and 15 as a primer set.
  • the PCR was performed using LA-Taq, and prepared 25 1 reaction solutions containing 100 ng of chromosomal DNA and 20 pmol each of primer DNA according to the instructions attached to LA-Taq. , 94 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 20 seconds, 68 ° C for 1.5 minutes 30 cycles, then 72 ° C for 10 minutes I went there.
  • the amplified DNA fragment (sacB gene fragment) obtained by the PCR was purified using a PCR purification Kit and then dissolved in 50 1 water.
  • the PHSG399 plasmid (Takara Bio Inc.) is made into a saddle shape, PCR is performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 17 as a primer set, and the chloramphenicol resistance gene ( ⁇ gene) fragment is obtained. I got it.
  • LA-Taq was used to prepare 25 1 reaction solutions containing 40 ng of plasmid DNA and 20 pmol each of primer DNA according to the instructions attached to LA-Taq, and incubated at 94 ° C for 3 minutes. After repeating 30 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 20 seconds, and 68 ° C for 1.5 minutes, heat at 72 ° C for 10 minutes was performed under! / ⁇ ⁇ conditions.
  • the amplified DNA fragment (sat gene fragment) obtained by the above PCR was purified using Gel extraction Kit and then dissolved in 50 1 water.
  • PCR was carried out using the SE gene fragment and the ⁇ gene fragment obtained above as a saddle type and using the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 and 17 as a primer set.
  • the PCR was performed using LA-Taq according to the instructions attached to LA-Taq using 1 ⁇ l each of the sacB fragment and cat fragment obtained above and 25 ⁇ l of the reaction mixture containing 20 pmol of each primer DNA.
  • the amplified DNA fragment obtained by the PCR described above was purified using Gel extraction Kit, and then dissolved in 50 1 water.
  • the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 has a base sequence consisting of 43 bases having a homologous sequence near the 5 'terminal region of the ldhA gene on the 5' terminal side, and 3 ' It has DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 on the terminal side.
  • the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 is a nucleotide sequence consisting of 43 nucleotides complementary to the 3 'terminal region of the ldhA generator on the 5' terminal side. And has a DNA consisting of 25 bases that hybridizes to the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 on the 3 ′ end side.
  • PCR For PCR, use EX-Taq to prepare 50 1 reaction solution containing 10 ng of the truncated DNA fragment and each lOpmol of primer DNA according to the instructions attached to EX-Taq, at 94 ° C for 1 minute. After the incubation, a cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes was repeated 30 times, followed by cooling at 4 ° C.
  • both ends have a region homologous to the 43 bases of the gene, and the sac gene and the DNA fragment containing the gene (sacB gene + gene fragment) are amplified.
  • the DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis and then cut out from the gel and purified.
  • a competent cell of E. coH BW25113 strain carrying the pKD46 plasmid was prepared according to the method described in Example 1 and transformed using the DNA fragment lOOng obtained above. Transformation was performed in an 0.1 cm cuvette (manufactured by BioRad) with 1.8 KV and 25 ⁇ F conditions using electopore positioning.
  • the transformed cells were cultured in SOC medium at 30 ° C for 3 hours, and then the culture solution was spread on an LB agar plate containing 30 g / ml chloramphee-coal and cultured at 30 ° C.
  • the grown chloramphee-coal resistant strain was added to a SuLB agar medium [10 g / l batatotryptone (Difco), 5 g / l bacto yeast extratate (Difco), 10% sucrose, lml / 1 lmol / 1 NaOH) plates were selected and strains showing sucrose sensitivity were selected. Confirm that the gene on the chromosomal DNA of E. coH BW25113 has been disrupted, and show the E. coli BW25113 Ald hA :: cat-sacB strain. Named.
  • the B. subtilis IctE. Gene was converted to the chromosomal DNA of B. subtilis 168 strain, and the SEQ ID NO: It was obtained by PCR using DNA having the nucleotide sequence represented by 20 and 21 as a primer set.
  • the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 has a base sequence consisting of 45 bases upstream of the start codon of the gene at the 5 ′ end and a downstream region containing the start codon of the gene at the 3 ′ end It has a base sequence of 27 bases.
  • the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 has a base sequence consisting of 45 bases complementary to the downstream region of the gene stop codon at the 5 'end and IctE gene at the 3' end. It has a base sequence of 27 bases that is complementary to the upstream region containing the child stop codon.
  • PCR was prepared by using Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc.) and preparing a 50 ⁇ l reaction solution containing 100 ng of chromosomal DNA and each primer DNA lOpmol according to the instructions attached to the enzyme at 94 ° C. After 30 minutes of incubation at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 80 seconds, cool at 4 ° C! .
  • a competent cell of E. coH BW25113 AldhA :: cat-sacB strain carrying the pKD46 plasmid was prepared according to the method described in Example 1, and transformed using the DNA fragment lOOng obtained above. It was.
  • Transformation was performed by electroporation in a 0.1 cm cuvette (BioRad) under conditions of 1.8 KV and 25 ⁇ F.
  • the transformed cells were cultured in SOC medium at 30 ° C for 3 hours, and then the culture solution was spread on a SuLB agar plate and cultured at 30 ° C. It was confirmed that the E. coH BW2 5113 ⁇ IdhA was introduced into the ⁇ gene region on the chromosomal DNA of the E. coH BW25113 AldhA :: cat-sacB strain. :: Named lctE strain.
  • E. coH BW25113 A ldhA :: lctE strain was cultured in Ca-LB liquid medium at 30 ° C for 4 hours. After centrifuging 200 ⁇ 1 of the culture and removing the supernatant, A cell suspension was prepared by suspending in 100 ⁇ l of MC buffer (0.1 mol / 1 MgSO, 0.005 mol / l calcium chloride).
  • the E. coH BW25113 A ubiB AldhA :: lctE strain obtained in Example 4 was inoculated into a test tube containing 2 ml of LB liquid medium containing 20 g / l of glucose and incubated at 37 ° C for 24 hours. The culture was obtained by shaking culture.
  • the E. coli BW25113 A ubiB AldhA :: lctE strain did not produce D-lactic acid but produced only L-lactic acid. In other words, the ubm gene-deficient strain was found to produce lactic acid.
  • lactic acid can be produced efficiently.
  • SEQ ID NO: 5 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 Description of artificial sequence
  • SEQ ID NO: 14 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 15 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 16 Description of artificial sequence; synthetic DNA SEQ ID NO: 17 description of artificial sequence; synthetic DNA SEQ ID NO: 18 description of artificial sequence; synthetic DNA SEQ ID NO: 19 description of artificial sequence; synthetic DNA SEQ ID NO: 20 description of artificial sequence; synthetic DNA SEQ ID NO: 21 description of artificial sequence;

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Abstract

　本発明によれば、４－ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、もしくは２－オクタプレニルフェノール ２－オクタプレニル－６－メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物、特に４－ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質、または２－オクタプレニルフェノール ２－オクタプレニル－６－メトキシフェノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物、および該微生物を用いた乳酸の製造法が提供される。

Description

乳酸の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、乳酸を生産する能力を有する微生物、および該微生物を用いた乳酸の 製造法に関する。
背景技術
[0002] 乳酸を生産する微生物としては、 Lactobacillus属ゃ Lactococcus属などの率 I ,酸菌、 R hizoDUs属の糸状菌、 Saccharomvces属などの酵母、および大腸菌が報告されている 力 乳酸菌は複雑な栄養要求性を示し、乳酸の光学純度が低いこと (非特許文献 1 および 2)、糸状菌は、グリセロール、エタノールゃフマル酸などの副生物が多いこと（ 非特許文献 3および 4)、酵母は組換え菌株を用いた場合でも多量のエタノールが副 生し、糖消費量に対する収率が低 、こと (非特許文献 5)が知られて 、る。
[0003] 大腸菌を用いた乳酸の製造法としては、ピルべートホルメートリアーゼ遺伝子、およ び有機酸やエタノールの副生に関係する遺伝子の欠損株を用いる方法 (非特許文 献 6)、およびホスホトランスァセチラーゼ遺伝子およびホスホェノールピルビン酸力 ルボキシラーゼ遺伝子の変異株を用いる方法 (非特許文献 7)が知られて 、るが、 ヽ ずれも乳酸の生産性が低 、。
[0004] 大腸菌 (Escherichia coli)の 4 ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ（ 以下、 UbiA蛋白質という）および 2—ォクタプレユルフェノール 2—ォクタプレニルー 6—メトキシフエノール;フラビンレダクターゼ (以下、 UbiB蛋白質という）は、大腸菌に おいてュビキノン (ubiquinone)の生合成に関与している蛋白質であり、 UbiA蛋白質と UbiB蛋白質のアミノ酸配列および該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は既に 知られている（非特許文献 8および 9)。また、多くの微生物では、その染色体 DNAの 全塩基配列が明らかになつている (非特許文献 10)。
[0005] 大腸菌において、ュビキノン生合成遺伝子の変異株が 2.5g/Lの D-乳酸を蓄積する ことは知られて ヽる（非特許文献 11および 12)力 該変異株 (AN59株）は、 ubiE遣伝 子の変異株であり（非特許文献 13)、他のュビキノン生合成遺伝子産物の活性が低 下した株の乳酸の生産性、およびュビキノン生合成遺伝子変異株の酢酸の生成量 等は知られていない。
[0006] 酢酸は、乳酸発酵の際の副生物であり、乳酸の精製や重合ィ匕を妨害するため、酢 酸の副生量が少な 、、安価な乳酸の製造法が求められて 1、る。
非特許文献 l :Appl. Microbiol. BiotechnoL, 45, 307(1996)
非特許文献 2 : Enzyme Microb. TechnoL, 26, 87(2000)
非特許文献 3 :Appl. Biochem. BiotechnoL, 51, 57(1995)
非特許文献 4 : J. Biosci. Bioeng., 97, 19(2004)
非特許文献 5 :Appl. Environ. Microbiol, 71, 2789(2005)
非特許文献 6 :Appl. Environ. Microbiol, 69, 399(2003)
非特許文献 7 :Appl. Environ. Microbiol, 65, 1384(1999)
非特許文献 8 : FEBS Letters, 307, 347(1992)
非特許文献 9 : Science, 257, 771(1992)
特干文献 10： http :/ノ www.tigr.org/tdb/ mdb/ mdbcomplete.html
非特許文献 11 :J. BacterioL, 99, 450(1969)
非特許文献 12 : Biochem. J., 117, 551(1970)
非特許文献 13 : J BacterioL, 182, 5139(2000)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、乳酸の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた乳 酸の製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は、以下の（1)〜（8)に関する。
(1) 4-ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、もしくは 2—ォクタプ レニルフエノール 2 ォクタプレニル 6—メトキシフエノール；フラビンレダクターゼ 活性が低下または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物。
(2)微生物が 4ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋 白質、または 2—ォクタプレニルフエノール 2—ォクタプレニルー 6—メトキシフエノー ル;フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部 が欠損した染色体 DNAを有する、上記（1)の微生物。
(3)遺伝子が配列番号 1もしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、 または配列番号 1もしくは 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつ 4 -ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性または 2—ォクタプレニル フエノール 2—ォクタプレ-ルー 6—メトキシフエノール；フラビンレダクターゼ活性を 有する蛋白質をコードする遺伝子である、上記（2)の微生物。
(4)遺伝子が配列番号 3もしくは 4で表される塩基配列を有する遺伝子、または配列 番号 3もしくは 4で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ 4ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニル トランスフェラーゼ活性もしくは 2—ォクタプレニルフエノール 2—ォクタプレニルー 6 ーメトキシフエノール;フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 である、上記（2)の微生物。
(5)微生物が以下の [ 1]〜 [5]から選ばれる方法によって乳酸を生産する能力が強 化された微生物である、上記（1)〜 (4)の 、ずれか 1つの微生物。
[1]乳酸の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法
[2]乳酸の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法
[3]乳酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加させる方 法
[4]乳酸の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少な くとも 1つを弱化または遮断する方法
[5]野生型株に比べ、乳酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方 法
( 6 ) ¾ [生吻力 Erwiniafe、 erratia属、 salmonella属、 Escherichia Proteus ¼ Pseud omonas属、 Acidithiobacillus属、 Acinetobacter 、 Agrobacterium属、 Bacillus属、 Bor detella属、 BradyrhizoDium属、 Brucella属、 Burkholderia属、 Caulobacter Chlorofle xus属、 Clostridium J禹、 Coxiella属、 Desulfitobacterium厲、 Geobacter属、 Haemophilu 厲ヽ Le且 ionella属、 Le tospira属、 Ma¾netococcus.属、 Magnetospirillumj¾ Mannheim 属、 Mesorhizobium属、 Methylobacillus属、 Methylobacterium属、 Mycobacterium属 ゝ Neisseria j¾ Nitrosomonas J禹、 Nostoc厲、 Pasteureilafe、 Prochlorococcus属、 Rhod obacter Rhodococcus属、 Rhodopseudomonas晨、 Rickettsia属、 Shigella属、 Sinorhi zobium厲、 Sphingomonas属、 Streptomvces晨、 SvnechococcusJ禹、 Svnechocvstis属、 Viorio属、 Xylella晨、 Yersinia属、 Zvmomonas属またま Xanthomonas属に J禹する微生 物である、上記（1)〜（5)のいずれか 1つの微生物。
(7)微生物力 ^Erwinia berbicoia、 Erwinia amvlovora, Erwinia carotovora、 serratia ma rcescens. Serratia ficaria. Serratia fonticola、 Serratia liquefaciens. Salmonella enteri ca、 Salmonella enteritidis、 Salmonella paratyphu Salmonella typnu Salmonella dublin ゝ Salmonella tvphimurium, Escherichia coli、 Proteus rettgeri、 Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas dacunhae. Pseud omonas fluorescens, Pseudomonas svringae, Pseudomonas thazdinophilum, Acidithio bacillus ferrooxidans, Acinetobacter SO. ATCC 33305、 Agrobacterium tumefaciens. Bacillus halodurans、 Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradvrnizobium iaponicum. Brucella melitensis、 Burkholderia Dseudomalle i、 Caulobacter crescentus, Chloroflexus aurantiacus, Clostridium acetobutvlicum, C lostridium botulinum、 Clostridium difficile, Coxiella burnetii, Desulfitobacter iumhafh iense, Geobacter metallireducens、 Haemophilus ducreyi, Legionella pneumophila, L eOtospira interrogans, Magnetococcus MC- 1、 Magnetospirillum magnetotacticum、 Mannheimia haemolvtica, Mesorhizobium loti、 Methylobacillus flagellatus, Methyloba cterium extorquens. Mycobacterium bovis、 Mycobacterium leprae. Mycobacterium marinum、 Mycobacterium tuberculosis、 Neisseria gonorrhoeae. Neisseria meningitidi s、 Nitrosomonas europaea. Nostoc punctiforme. Pasteurella multocida、 Prochloroco ecus marinus Rhodobacter capsulatus. Rhodococcus sp. strain 124、 Rhodopseudom onas palustris. Rickettsia prowazekii. Shigella flexneri. sinorhizobium meliloti、 Sphin gomonas aromaticivorans、 Streptomvces avermitilis、 Streptomvces coelicolor. Svnec hococcus s^. WH8102、 Svnechocvstis s^. PCC6803、 Vibrio cholerae, Xvlella fastidi osa、 Xvlella fastidiosa、 Yersinia estis、 Zvmomonas mobilis、 Xanthomonas ovyzaeお よび Xanthomonas ^ ^llkカゝらなる群より選ばれる微生物である上記（1)〜（6)の 、 ずれか 1つの微生物。
(8)上記（1)〜（7)の 、ずれか 1つの微生物を培地に培養し、培養物中に乳酸を生 成、蓄積させ、該培養物から乳酸を採取する乳酸の製造法。
発明の効果
[0009] 本発明により、乳酸の生産性が向上した微生物、および該微生物を用いた乳酸の 製造法を提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 1.本発明の微生物
本発明の微生物としては、 4ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活 性、もしくは 2—ォクタプレユルフェノール 2—ォクタプレ-ルー 6—メトキシフエノール ；フラビンレダクターゼ活性が低下、または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を 有する微生物であれば特に限定されな 、が、例えば染色体 DNA上の 4ーヒドロキシ 安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質 (以下、 UbiA蛋白質と もいう）をコードする遺伝子、もしくは 2—ォクタプレユルフェノール 2—ォクタプレニル 6—メトキシフエノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質 (以下、 UbiB蛋白 質ともいう）をコードする遺伝子の一部または全部が欠損しており、かつ乳酸を生産 する能力を有する微生物をあげることができる。
[0011] なお、本明細書中では、遺伝子は構造遺伝子およびプロモーター、オペレーター などの特定の制御機能を有する領域を含んでおり、 UbiA蛋白質または UbiB蛋白質 をコードする遺伝子の一部または全部が欠損した染色体 DNAを有する微生物として は、染色体 DNA上の該遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失があるため、（1) UbiA蛋 白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターまたはオペレーターなど の転写制御が機能せず、 UbiA蛋白質または UbiB蛋白質を発現しない微生物、（2) フレームシフトが生じ、 UbiA蛋白質または UbiB蛋白質が活性ある蛋白質として発現し ない微生物、および（3) UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子中の構造 遺伝子の一部または全部が欠損している微生物、などをあげることができ、好ましくは (3)の微生物、より好ましくは UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子中の 構造遺伝子の全部が欠損している微生物をあげることができる。
[0012] UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子中の構造遺伝子の一部が欠損 しているとは、構造遺伝子部分の 1塩基の欠失でもよぐ好ましくは構造遺伝子中の 5 〜： LO塩基、より好ましくは該遺伝子中の 10〜50塩基、さらに好ましくは該遺伝子中 の 50〜： LOO塩基の欠失をあげることができる。
4 ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性または 2 ォクタプレニ ルフエノール 2—ォクタプレ-ルー 6—メトキシフエノール；フラビンレダクターゼ活性 が低下した微生物としては、野生型の UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺 伝子を有する微生物に比べ、その活性が低下している微生物であれば特に限定さ れないが、一般には 60%以下、好ましくは 40%、より好ましくは 20%以下、さらに好 ましくは 10%以下、特に好ましくは 5%以下に低下した微生物をあげることができる。
[0013] UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子は、 4—ヒドロキシ安息香酸ポリ プレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、または 2—オタ タプレ-ルフエノール 2 ォクタプレ-ル 6—メトキシフエノール；フラビンレダクタ一 ゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、例えば配 列番号 1または 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、配列 番号 1または 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と 80%以上、好ましくは 90% 以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以 上の相同性を有し、かつ 4ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性 、または 2—ォクタプレニルフエノール 2—ォクタプレニルー 6—メトキシフエノール；フ ラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、それぞれ配列番号 1ま たは 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子である配列番号 3 または 4で表される塩基配列を有する遺伝子、および配列番号 3もしくは 4で表される 塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズし、かつ 4 ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性ま たは 2 ォクタプレニルフエノール 2 ォクタプレニル 6—メトキシフエノール；フラ ビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をあげることができる。
[0014] アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods EnzymoL, 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLAST Nや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol, 215, 403(1990)]。 BLASTに基づ 、て BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例 えば Score = 100、 wordlength= 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによって アミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えば score=50、 wordlength=3と する。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフオル トパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 WW w. ncbi.nlm.nih.gov.)。
[0015] また、ここで 、う「ノヽイブリダィズする」とは、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチ ドまたは該ポリヌクレオチドの一部に遺伝子がノ、イブリダィズすることである。したがつ て、該特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはその一部は、ノーザンまたは サザンブロット解析のプローブとして用いることができ、また PCR解析のオリゴヌタレ ォチドプライマ一として使用できるポリヌクレオチドである。プローブとして用いられる ポリヌクレオチドとしては、少なくとも 100塩基以上、好ましくは 200塩基以上、より好 ましくは 500塩基以上のポリヌクレオチドをあげることができ、プライマーとして用いら れるポリヌクレオチドとしては、少なくとも 10塩基以上、好ましくは 15塩基以上のポリ ヌクレオチドをあげることができる。
[0016] ポリヌクレオチドのハイブリダィゼーシヨン実験の方法はよく知られており、例えば当 業者であれば本願明細書に従 、、ハイブリダィゼーシヨンの条件を決定することがで きる。該ハイブリダィゼーシヨンの条件は、モレキュラー 'クローユング第 2版、第 3版（ 2001年)、 Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press (1994)、 Imm unology methods manual, Academic press(Molecular)【し己載の他、多数の他の標準 的な教科書に従っておこなうことができる。
[0017] 上記のストリンジェントな条件とは、ポリヌクレオチド、好ましくは DN Aを固定化した フィルターとプローブ、好ましくはプローブ DNAとを 50%ホルムアミド、 5 X SSC (750m Mの塩化ナトリウム、 75mMのクェン酸ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6)、 5 Xデンハルト溶液、 10%の硫酸デキストラン、および 20 g/1の変性させたサケ精子 D NAを含む溶液中で 42°Cでー晚、インキュベートした後、例えば約 65°Cの 0.2 X SSC 溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好まし 、が、より低 、ストリンジェント条件を 用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整 (ホルム アミドの濃度を下げるほど低ストリンジヱントになる）、塩濃度および温度条件の変更 により可能である。低ストリンジェント条件としては、例ぇば6 X SSCE (20 X SSCEは、 3 mol/1の塩化ナトリウム、 0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、 0.02mol/lの EDTA、 pH7.4 )、 0.5%の SDS、 30%のホルムアミド、 100 μ g/1の変性させたサケ精子 DNAを含む溶 液中で、 37°Cでー晚インキュベートした後、 50°Cの 1 X SSC、 0.1%SDS溶液を用いて 洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、 上記した低ストリンジェント条件にぉ 、て、高塩濃度 (例えば 5 X SSC)の溶液を用いて ノ、イブリダィゼーシヨンを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
[0018] 上記した様々な条件は、ノ、イブリダィゼーシヨン実験のバックグラウンドを抑えるた めに用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。 上記したブロッキング試薬の添カ卩は、条件を適合させるために、ハイブリダィゼーショ ン条件の変更を伴ってもょ 、。
上記したストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズ可能な遺伝子としては、例えば上 記した BLASTや FASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づ 、て計算したときに、 配列番号 3または 4で表される塩基配列と少なくとも 90%以上、好ましくは 95%以上 、より好ましくは 97%以上、さらに好ましくは 98%以上、特に好ましくは 99%以上の 相同性を有する遺伝子をあげることができる。
[0019] 配列番号 3または 4で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ チドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする遺伝子力 4—ヒドロキシ安息香 酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、または 2—ォクタプレユルフェノール 2—オタ タプレニルー 6—メトキシフエノール；フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子であることは、例えば、遺伝子組換え法を用いて該遺伝子にコードされ る蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
[0020] また、本発明の微生物としては、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげるこ とがでさる。 糸田菌としては Erwinia属、 Serratia属、 Salmonella属、 Escherichia属、 Proteus属、 Pseu domonas 、 Acidithiobacillus厲、 Acinetobacter 、 Agrobacterium属、 Bacillus属、 Bo rdetella属、 Bradyrhizo Dium属、 Brucella属、 Burkholderia属、 Caulobacter Chlorofl 6xus属、 Clostridium属、 Coxiella属、 Desulfitobacterium属、 Geobacter属、 Haemophil us ¾^ Legionella Leptospira属、 Magnetococcus属、 Magnetospirillum 、 Mannhei mia晨、 MesorhizoDium属、 Methylobacillus属、 Methylobacterium厲、 Mvcobacterium 属、 Neisseria属、 Nitrosomonas厲、 Nostoc属、 Pasteurella属、 Prochlorococcus属、 Rh odobacter属、 Rhodococcus属、 Rhodopseudomonas属、 Rickettsia属、 Shigella属、 ¾ino rhizobiumJ¾、 Sphingomonas属、 StreptomvcesJ禹、 Svnechococcus属、 Svnechocvstis 満、 Vibrio属、 Xylella厲、 Yersinia属、 Zvmomonas属 たま XanthomonasJ禹【こ属する 微生物をあげることができる。
また、上己した J禹に属する糸田菌としては、 Erwinia berbicola、 Erwinia amvlovora, Erw mia carotovora, Serratia marcescens, Serratia ficaria, Serratia fonticola、 Serratia lia uefaciens. Salmonella enterica. Salmonella enteritidis、 Salmonella paratyphi, Salmone 11a tvphu Salmonella dublin. Salmonella tvohimurium、 Escherichia coli、 Proteus rettg eri、 Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseu domonas dacunhae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas svringae, Pseudomonas thazdinophilum, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acinetobacter s£. ATCC 33305、 Ag robacterium tumefaciens. Bacillus halodurans、 Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis. Bordetella pertussis. Bradvrhizo Dium iaponicum. Brucella melitensis ゝ Burkholderia pseudomallei. Caulobacter crescentus. Chloroflexus aurantiacus. Clo stridium acetobutvlicum, Clostridium botulinum, Clostridium difficile、 Coxiella burne tii^ Desulfitobacter iumhafhiense. Geobacter metallireducens、 Haemophilus ducreyi、 Legionella pneumophila. Leptospira interrogans、 Magnetococcus MC- 1、 Magnetospi rillum magnetotacticum, Mannheimia haemolvtica, Mesorhizobium loti、 Methvlobacill us flagellatus. Methvlobacterium extorquens. Mvcobacterium bovis、 Mvcobacterium leprae. Mvcobacterium marinum、 Mvcobacterium tuberculosis、 Neisseria gonorrhoea e、 Neisseria meningitidis Nitrosomonas euroOaea^ Nostoc punctiforme、 Pasteurella multocida、 Prochlorococcus marinus、 Rhodobacter capsulatus. Rhodococcus s^. stra in 124、 Rhodopseudomonas palustris, Rickettsia prowazekii. Shigella flexneri、 Sinorhi zobium meliloti、 Sphingomonas aromaticivorans、 Streptomvces avermitilis、 Streptom vces coelicolor. Svnechococcus s^. WH8102、 Svnechocvstis sp. PCC6803、 Vibrio c holerae、 Xvlella fastidiosa、 Xvlella fastidiosa、 Yersinia pestis. Zvmomonas mobilis、 X anthomonas owzaeおよび Xanthomonas capestrisなどをあげ、ること力 Sでき、より好まし くは E. £211をあげることができる。
2.本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、（1)乳酸を生産する能力を有する微生物の染色体 DNA上に 存在する UbiA蛋白質もしくは UbiB蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部を欠 損させる方法、または（2)染色体 DNA上の UbiA蛋白質もしくは UbiB蛋白質をコード する遺伝子の一部または全部が欠損した微生物に、乳酸の生産性を付与する方法 により製造することができる。
乳酸を生産する能力を有する微生物は、該能力を有する微生物であれば特に制 限されず、該微生物としては自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は 該株そのもの、公知の方法により乳酸を生産する能力を人為的に付与した微生物な どをあげることができる。
当該公知の方法としては、
(a)乳酸の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法、
(b)乳酸の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法、
(c)乳酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増カロさせる方 法、
(d)乳酸の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少な くとも 1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、乳酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法 などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることがで きる。 [0023] 上記 (a)の方法としては、ピルべートホルメートリアーゼ遺伝子による乳酸の生合成 制御を解除する方法 [Appl. Environ. Microbiol, 69, 399(2003)]、（c)の方法としては L 乳酸脱水素酵素をコードする DNAを染色体 DNA上に 6コピー導入する方法 [A ppl. Environ. Microbiol., 71, 2789(2005)]、（d)の方法としては、ホスホトランスァセチ ラーゼ遺伝子およびホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に変異を導 入する方法 [Appl. Environ. Microbiol, 65, 1384(1999)]などをあげることができる。
[0024] 染色体 DNA上の UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子の一部または 全部が欠損した微生物は、該微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制 限はないが、例えば下記した微生物の染色体 DNA上の UbiA蛋白質または UbiB蛋 白質をコードする遺伝子の塩基配列情報を利用して、微生物の染色体 DNA上にあ る UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付 加を導入する方法により取得することができる。各微生物が有する UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号 3または 4で表される塩基 配列をクエリーに用いた各種 DNA配列データベースの検索、配列番号 3または 4で 表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの全部または一部を プローブに用いた、各種微生物の染色体 DNAに対するサザンノ、イブリダィゼーショ ンにより UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子を同定、取得し、または配 列番号 3または 4で表される塩基配列に基づき設計したプライマーを用い、各種微生 物の染色体 DNAを铸型とした PCRにより UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードす る遺伝子を同定、取得した後、常法により該遺伝子の塩基配列を解析することにより 決定することができる。サザンノヽイブリダィゼーシヨンおよび PCRに供する染色体 DN Aは、いずれの微生物の染色体 DNAであってもよぐ好ましくは、 Erwinia属、 Serratia 晨、 Salmonella EschericniaJS, Proteus属、 Pseudomonas属、 Acidithiobacnlus S 、 AcinetobacterJS、 Agrobacterium属、 Bacillus属、 Bordetella属、 Bradyrhizobium属、 B rucella属、 BurKholderia属、 Caulobacter鹿、 Chloroflexus属、 Clostridium属、 Coxiella 属、 Desulfitobacterium属、 Geobacter属、 Haemophilus属、 Legionella属、 Leptospira 晨、 Magnetococcus属、 MagnetospirillumJS、 Mannheimia属、 Mesorhizobium属、 Meth ylobacillus厲、 Methylobacterium属、 Mycobacterium属、 Neisseria属、 Nitrosomonas 属、 Nostoc属、 Pasteurella属、 Prochlorococcus属、 Rhodobacter属、 Rhodococcus属、 Rhodopseudomonas晨、 Rickettsia属、 Shigella属、 Sinorhizobium厲、 Sphingomonas ゝ StreptomvcesJ¾、 Synechococcus J¾、 Svnechocvstis属、 Vibrio属、 Xylella J禹、 Yersini 属、 Zvmomonas属または Xanthomonas属に属する微生物、より好ましくは Erwinia ber bicola. erwinia amvlovora. Erwinia carotovora. Serratia marcescens. serratia ficaria ゝ Serratia fonticola、 Serratia liquefaciens. Salmonella ent erica. Salmonella enteritidis ゝ Salmonella paratyphi、 Salmonella typhi. Salmonella dubliru Salmonella tvphimurium ゝ Escherichia coli、 Proteus rettgeri^ Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens ゝ Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas dacunhae. Pseudomonas fluorescens. Pseu domonas svringae, Pseudomonas thazdinophilum, Acidithiobacillus ferrooxidans, Aci netobacter s^. ATCC 33305、 Agrobacterium tumefaciens. Bacillus halodurans, Bord etella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradvrhizobiu m iaponicum. Brucella melitensis、 Burkholderia pseudomallei, Caulobacter crescentu s、 Chloroflexus aurantiacus, Clostridium acetobutvlicum, Clostridium botulinum、 CI ostridium difficile, Coxiella burnetii, Desulfitobacter iumhafhiense, Geobacter metalli reducens, Haemophilus ducreyi, Legionella pneumophila, LeOtospira interrogans, M agnetococcus MC- 1、 Magnetospinllum magnetotacticum、 Mannheimia haemolvtica, Mesorhizobium loti、 Methvlobacillus flagellatus, Methvlobacterium extorauens, Mvc obacterium bovis、 Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum、 Mycobacterium tuberculosis、 Neisseria gonorrhoeae. Neisseria meningitidis、 Nitrosomonas europaea ゝ Nostoc Dunctiforme、 Pasteurella multocida、 Prochlorococcus marinus、 Rhodobacte r capsulatus. Rhodococcus s^. strain 124、 Rhodopseudomonas palustris. Rickettsia £ rowazekii. Shigella flexneri. Sinorhizobium menloti. Sphingomonas aromaticivorans、 Streptomvces avermitilis、 Streptomvces coelicolor. Synechococcus sp. WH8102、 Sv nechocystis sp. PCC6803、 Vibrio cholerae. Xvlella fastidiosa、 Xvlella fastidiosa、 Yer sinia pestis. Zymomonas mobilis、 Xanthomonas owzaeおよび Xanthomonas capestris の染色体 DNAをあげることができる。
ハイブリダィゼーシヨンおよび PCRは、常法たとえばモレキュラー 'クローニング第 2 版、第 3版（2001年）、 Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press ( 1994)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば配列番号 1また は 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子、配列番号 3または 4 で表される塩基配列を有する遺伝子、 Shigella flexneri 2a由来の ι^ίΔ遺伝子および i gE遺 feナ (Genbank accession no. AE005674)、 aalmonella entenca由来の ubiA遣 is 子および lE遺伝子（Genbank accession no. NC004631)などをあげることができる。
[0026] 微生物の染色体 DNA上の遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法 としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを 利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、 塩基の欠失等を導入した!/、宿主細胞内では自立複製できな!、薬剤耐性遺伝子を有 するプラスミド DNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあ げることができる。
[0027] 該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標に して相同組換えによって染色体 DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形 質転換株を選択する。得られた形質転換株を該薬剤を含有しな!ヽ培地で数時間〜 1 日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、 前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体 DN A上において 2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体 DNA 上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体
DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認する ことができる。
[0028] 上記方法により、染色体 DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を 導入することができる微生物としては、例えばェシエリヒア属に属する微生物をあげる ことができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換 えを利用した方法としては、直鎖 DNAを用いた方法をあげることができる。
[0029] 具体的には、塩基の欠失、置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖 D NAを細胞内に取り込ませ、染色体 DNAと導入した直鎖 DNAとの間で相同組換え を起こさせる方法である。本方法は、直鎖 DNAを効率よく取り込む微生物であれば、 いずれの微生物にも適用でき、好ましい微生物としてはェシエリヒア属、より好ましく はェシエリヒア'コリ、さらに好ましくは λファージ由来の組換えタンパク質群 (Red組 換え系）を発現して 、るェシエリヒア 'コリをあげることができる。
[0030] λ Red組換え系を発現しているェシエリヒア'コリとしては、 λ Red組換え系遺伝子 を有するプラスミド DNAである pKD46 [ェシエリヒア'コリジェネティックストックセンタ 一（米国エール大学)より入手可能]を保有するェシエリヒア'コリ JM101株等をあげる ことができる。
相同組換えに用いられる DNAとしては、
(a)薬剤耐性遺伝子の両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染 色体 DNA上の領域の両外側に存在する DNAまたは該 DNAと相同性がある DNA を有する直鎖 DNA、
(b)塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外 側に存在する DNA、または該 DNAと相同性がある DNAを直接連結した直鎖 DNA
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が連 結した DNAの両端に、塩基の欠失、置換もしくは付加の導入対象である染色体 DN A上の領域の両外側に存在する DNAまたは該 DNAと相同性がある DNAを有する 直鎖 DNA、
(d)上記 (a)の直鎖 DNAにお 、て、薬剤耐性遺伝子と染色体 DNA上の領域の両 外側に存在する DNAの間に、さらに酵母由来の Flp recombinase [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82, 5875 (1985)〕が認識する塩基配列を有する DNA、
をあげることができる。
[0031] 薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付 与する薬剤耐性遺伝子であれば、 ヽずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる 。宿主微生物にェシエリヒア'コリを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば 、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエ-コール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺 伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリ ン耐性遺伝子等をあげることができる。
[0032] ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を 発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のこ とをいい、該遺伝子としては例えば、バチルス属に属する微生物由来の^遺伝子〔 Appl. Environ. Microbiol, 59, 1361- 1366 (1993)〕、およびェシエリヒア属に属する微 生物由来の 遺伝子 [Genomics, 72, 99-104(2001)〕等をあげることができる。
[0033] 上記の直鎖 DNAの両末端に存在する、染色体 DNA上の置換または欠失の導入 対象となる領域の両外側に位置する DNAと相同性がある DNAは、直鎖 DNAにお いて、染色体 DNA上の方向と同じ方向に配置され、その長さは 10bp〜100bp程度が 好ましぐ 20bp〜50bp程度がより好ましぐ 30〜40bp程度がさらに好ましい。
酵母由来の Flp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組 換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号 13で 表される塩基配列を有する DNA、および該 DNAにお ヽて 1個〜数個の塩基が欠失 、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来の Hp recombinaseが認識し 、相同組換えを触媒する塩基配列を有する DNAをあげることができる。
[0034] 相同性があるとは、上記直鎖 DNAが、染色体 DNA上の目的とする領域において 、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、 8 0%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 100%の 相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定 することができる。
[0035] 上記直鎖 DNAは、 PCRにより作製することができる。また上記直鎖 DNAを含む D NAをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖 DNAを得ることも できる。
微生物の染色体 DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、 以下の方法 1〜4があげられる。
方法 1：上記 (a)または (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に 該直鎖 DNAが染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択す る方法。
方法 2：上記方法 1により取得された形質転換株に、上記 (b)の直鎖 DNAを導入し、 該方法により染色体 DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物 の染色体 DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法 3 :
[ 1 ]上記 (c)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体 DNA上の置換または欠失の対象領域の両外側に存在する DNAと相同 性を有する DNAを、染色体 DNA上における方向と同一の方向で連結した DNAを 合成し、上記 [1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、 上記 [2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬 剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体 D NA上から削除された株として選択する方法。
方法 4 :
[ 1 ]上記 (d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖 DNA が染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記 [ 1 ]で得られた形質転^ に Hp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入 し、該遺伝子を発現させた後、上記 [1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する 方法。
[0036] 上記方法で用いられる、直鎖 DNAを宿主微生物に導入する方法としては、該微生 物へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムィ オンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（ 特開昭 63- 2483942)、エレクト口ポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988) 〕等をあげることができる。
[0037] 方法 2または方法 3 [2]で用いられる直鎖 DNAにおいて、該 DNAの中央部付近に 、染色体 DNA上に挿入した 、任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖 DNAを用いること により、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体 DNA上 に挿入することができる。
上記方法 2〜4では、最終的に得られる形質転換株の染色体 DNA上には薬剤耐 性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子 を残さない方法であるため、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およ びネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法を繰り返すこ とにより、容易に染色体 DNA上の位置の異なる 2以上の領域に塩基の欠失、置換ま たは付加を有する微生物を製造することができる。
[0038] 上記方法により得られた変異株が、 4ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフエ ラーゼ活性、または 2—ォクタプレユルフェノール 2—ォクタプレニルー 6—メトキシフ ェノール；フラビンレダクターゼ活性が低下または喪失して 、ることは、例えば該変異 株とその元株のュビキノンの生産性を公知の方法で測定し、比較することにより確認 することができる。
[0039] また、本発明の微生物の D-乳酸脱水素酵素 (EC 1.1.1.28)活性を低下または喪失 させ、さらに好ましくは L-乳酸脱水素酵素 (EC 1.1.2.27)活性を強化することにより、 L -乳酸の生産性が高い微生物を造成することができ、逆に L-乳酸脱水素酵素活性を 低下または喪失させ、さらに好ましくは D-乳酸脱水素酵素活性を強化することにより 、 D-乳酸の生産性が高 、微生物を造成することもできる。
[0040] D-乳酸脱水素酵素、および L-乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列、および該酵素をコ ードする遺伝子の塩基配列は多くの微生物で知られており、各種データベースから 容易にその配列を取得することができる。
よって、 D-乳酸脱水素酵素、または L-乳酸脱水素酵素の活性が低下または喪失し た微生物は、取得される配列情報を利用して上記した方法に準じて染色体 DNA上に 存在するそれら酵素遺伝子の一部または全部を欠損させることにより取得することが できる。
[0041] また、 D-乳酸脱水素酵素、または L-乳酸脱水素酵素の活性が強化された微生物 は、それら酵素遺伝子を公知の方法で該微生物に導入することにより取得することが できる。該遺伝子は、染色体 DNA上に組み込まれていてもよいし、染色体外にプラス ミド DNAとして存在して!/、てもよ!/、。
Escherichia を微生物として、 L_乳酸の生産性が向上した微生物を造成する場 合、 Escherichia の D-乳酸脱水素酵素遺伝子の ORF全部を欠損させ、かつ L-乳 酸脱水素酵素遺伝子、好ましくは MU ^ lkの L-乳酸脱水素酵素遺伝子を染 色体 DNA上に組み込む方法をあげることができる。
3.本発明の微生物を用いた乳酸の製造法
本発明の方法では D-乳酸、および L-乳酸の 、ずれも生産することができる。
[0042] 上記 2の本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に乳酸を生成、蓄積させ、該 培養物から乳酸を採取することにより、乳酸を製造することができる。
該微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従 つて行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生 物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/ヽずれも用いること ができる。
[0043] 炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース 、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭 水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール 類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0044] 無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸 マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム 等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは 3.0〜9 .0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア等を用いて行う。
[0045] 培養物中に生成、蓄積した乳酸の採取は、活性炭やイオン交換榭脂などを用いる 通常の方法あるいは、イオン交換膜を用いた電気透析法、エステルイ匕後に蒸留して 加水分解する方法、有機溶媒による抽出法、減圧蒸留し結晶化させる方法、高速液 体クロマトグラフィー等を用いたクロマトグラフィー法により行うことができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 実施例 1
[0046] UbiA蛋白質または UbiB蛋白質をコードする遺伝子が欠損した株の造成
E. coH KM22株 [Gene, 246, 321-330 (2000)]の染色体 DNAを铸型とし、各々の 3， 末端の 25塩基が、 KM22株染色体 DNA上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハ イブリダィズするように設計してある配列番号 5および 6で表される塩基配列力 なる DNAをプライマーセットとして用い、 PCRを行った。 PCRは、 LA- Taqを用いて、染色 体 DNA断片 10ng、プライマー DNA各 20pmolを含む 25 μ 1の反応液を LA-Taqに添 付の指示書に従い調製し、 94°Cで 2分間保温後、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 20秒間、 68 °Cで 1分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温すると 、う条件で行つ た。
[0047] 次に、カナマイシン耐性遺伝子の 5，末端側上流に配列番号 7で表される塩基配列 、3'末端側下流に配列番号 8で表される塩基配列が付加した DNA断片を上記と同 様の方法で PCRにより増幅した。
UbiA蛋白質をコードする遺伝子（以下、 ιώίΔ遺伝子という）欠損用 DNA断片、およ び UbiB蛋白質をコードする遺伝子（以下、 ubiB遣伝子と ヽぅ）欠損用 DNA断片を以 下のように調製した。上記で取得した DNA断片を铸型とし、配列番号 9および 10、ま たは配列番号 11および 12で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとし て用い、 PCRを行った。配列番号 9および 11で表される塩基配列力 なる DNAは、 5 '末端側にそれぞれ ιώίΔ遺伝子、または ϋ Ε遺伝子の 5 '末端側領域付近との相同 配列を有する 45塩基からなる塩基配列を有し、 3'末端側に配列番号 7で表される塩 基配列からなる DNAを有して 、る。配列番号 10および 12で表される塩基配列を有 する DNAは、 5'末端側にそれぞれ ιώίΔ遺伝子、または 遺伝子の 3'末端側領域 付近と相同配列を有する 45塩基からなる塩基配列を有し、 3 '末端側に配列番号 8で 表される塩基配列にハイブリダィズする 25塩基力 なる DNAを有して 、る。
[0048] PCRは、 EX-Taq (タカラバイオ社製）を用いて、増幅 DNA断片 10ng、プライマー D NA各 lOpmolを含む 50 μ 1の反応液を EX- Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°C で 1分間保温後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間のサイクルを 30回繰り 返した後、 4°Cで保冷するという条件で行った。
両末端に各遺伝子の両末端の 45塩基と相同な領域を有するカナマイシン耐性遺 伝子 (km遺伝子）を含む DNA断片が増幅して ヽることを確認し、該 DNA断片をァ ガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルカゝら切り出して精製した。
[0049] 次に、 λ Red recombinaseを発現可能な pKD46プラスミドを保持する E. coH BW251 13株 [Proc. Natl. Acad. Sci., U S A., 97, 6640- 6645(2000)]のコンビテントセルを、 Ge ne, 246, 321-330 (2000)に記載の方法に従って調製し、 100ngの該 DNA断片を用い てそれぞれ形質転換を行った。形質転換は、 0.1cmのキュベット (BioRad社製)中で、 1 .8KV、 25 Fの条件で、エレクト口ポレーシヨンにより行った。形質転換した細胞を SO C培地 [20g/lバタトトリプトン（Difco社製）、 5g/lバクトイーストエキストラタト（Difco社製 )、 0.5g/l塩化ナトリウム、 0.2ml/lの 5mol/l NaOH、 10ml/lの lmol/1塩化マグネシウム 、 10ml/lの lmol/1硫酸マグネシウム、 10ml/lの 2Mグルコース]を用いて 30°Cで 3時間 培養した後、培養液を 50 μ g/mlのカナマイシンと lOg/1のグルコースを含む LB寒天プ レート上に塗布し、 30°Cでー晚培養した。
[0050] 生育してきた株は、それぞれ E. coH BW25113株の染色体 DNA上の Δ遺伝子、 または 遺伝子が欠損していることを確認し、それぞれ E. coH BW25113 A ubiA株 、 E. coH BW25113 A ubiB株と命名した。
実施例 2
[0051] ιώίΔ遺伝子または ϋΜΕ遺伝子欠損株を用いた乳酸の製造（1)
E. coH BW25113 A ubiA株、 E. £QUBW25113 A ubiB株、並びに対照として実施例 1 記載の方法に準じて造成した U E遺伝子欠損株 (E. coHBW25113 A ubiE)、 ubiG遣 伝子欠損株（E. coli BW25113 A ubiG)、 ubiH.遺伝子欠損株 (E. coli BW25113 A ubiH )、および E. coH BW25113株を、それぞれ 5mlの lOg/1のグルコースを含む LB液体培 地を入れた試験管に植菌し、 37°Cにて 17時間、振とう培養し培養物を得た。 60 1の 該培養物を、 6mlの 3%の炭酸カルシウムと 2%のカザミノ酸を含む M9液体培地（4% グルコース、 11.28g/l M9 Minimal Salts(X5) (Difco社製）、 100 μ mol/1塩化カルシゥ ム、 2mmol/l硫酸マグネシウム、 lO ^ g/ml硫酸鉄）が入った太型試験管に植菌し、 3 7°Cで 28時間振とう培養した。 28時間後の培養物を遠心分離し、その上清を 10から 30 倍に希釈してロシュ'ダイァグノスティックス社製の F- kit D- /L-乳酸、 F- kit酢酸およ び F-kitグルコースを用いて培養液中に蓄積した D-乳酸量および酢酸量を測定した 。結果を表 1に示す。
[0052] [表 1] 表 1
Figure imgf000022_0001
表 1中、 n. d.は測定しなかったことを表す。 表 1に示すように、 E. soli BW25113 Δ ubiA株と E. coliBW25113 Δ ubiB株は、他のュ ビキノン生合成遺伝子欠損株に比べ D-乳酸生産性が高ぐかつ乳酸の精製の際の 不純物となり、乳酸の重合ィ匕を阻害する酢酸の副生が少ないことが明らかになった。 また、 D-乳酸の光学純度は 99%以上であった。
実施例 3
[0053] Δ遺伝子または 遺伝子欠損株を用いた乳酸の製造（2)
E. coH BW25113 A ubiA株、 E. ^UBW25113 A ubiB株を、それぞれ 5mlの lOg/1のグ ルコースを含む LB液体培地を入れた試験管に植菌し、 37°Cにて 17時間、振とう培養 し培養物を得た。 55 μ 1の該培養物を、 5mlの 6%の炭酸カルシウムと 2%のカザミノ酸 を含む M9液体培地（5%グルコース、 11.28g/l M9 Minimal Salts(X5) (Difco社製）、 1 00 μ mol/1塩化カルシウム、 2mM硫酸マグネシウム、 10 μ g/ml硫酸鉄）が入った試 験管に植菌し、 37°Cで 25時間振とう培養した。 25時間後、培養物に 1041 μ 1の 30%グ ルコース、 104 1の 22.56g/l M9 Minimal Salts(X10)(Difco社製)、 104 1の 10%カザミノ 酸、 2 1の lmol/1硫酸マグネシウム、 1 μ 1の 10mg/ml硫酸鉄、 0.06gの炭酸カルシゥ ムを加えて培養を続け、培養 48時間目に培養物を回収した。培養物を遠心分離し、 その上清を 10から 1000倍に希釈してロシュ'ダイァグノスティックス社製の F-kit D-/L -乳酸、 F-kit酢酸および F-kitグルコースを用いて培養液中に蓄積した D-乳酸量、 酢酸量および残糖量を測定した。結果を表 2に示す。
[0054] [表 2]
表 2
Figure imgf000023_0001
表 2に示すように、 E. coH BW25113 A ubiA株および E. coH BW25113 A ubiB株は、 約 lOOg/1もの D-乳酸を生産する能力を有するが、酢酸の副生量は非常に低いもの であった。また、 D-乳酸の光学純度は 99%以上であった。
実施例 4
[0055] L-乳酸を生産する能力を有する微生物の造成
(1) D-乳酸脱水素酵素遺伝子が欠損した E. ^11の造成
クロラムフエ-コール而ォ性遺伝子 (^遺伝子)、および Bacillus ^l lk由来の levansu erase遣伝子（sacB遣伝子、 GenBank accession no. BG10388)を有する直鎖 DNAを 用いて、以下の方法により pKD46プラスミドを保持する E. coH BW25113株の染色体 D NA上の D-乳酸脱水素酵素遺伝子 (ldhA遣伝子)が欠損した株を作製した。
[0056] まず、 sacB遣伝子を、コーディング領域の上流 400bp、下流 200bpまでの領域として PCR法にて取得した。 PCRは、 subtilis 168株（各種公的機関より入手可能）の染 色体 DNAを铸型とし、配列番号 14および 15で表される塩基配列力もなる DNAをプラ イマ一セットとして行った。該 PCRは、 LA- Taqを用いて、染色体 DNA 100ng、プライ マー DNA各 20pmolを含む 25 1の反応液を LA- Taqに添付の指示書に従い調製し 、 94°Cで 3分間保温後、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 20秒間、 68°Cで 1.5分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温すると 、う条件で行った。
[0057] 上記 PCRで取得した増幅 DNA断片 (sacB遣伝子断片)を、 PCR purification Kitを 用いて精製した後、 50 1の水に溶解した。
次に PHSG399プラスミド (タカラバイオ社製)を铸型にし、配列番号 16および 17で 表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットとして用いて PCRを行 、、クロラム フエニコール耐性遺伝子 (^遺伝子)断片を取得した。
[0058] 該 PCRは、 LA- Taqを用いて、プラスミド DNA 40ng、プライマー DNA各 20pmolを 含む 25 1の反応液を LA-Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°Cで 3分間保温後、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 20秒間、 68°Cで 1.5分間のサイクルを 30回繰り返した後、 72°C で 10分間保温すると!/ヽぅ条件で行った。
上記 PCRで取得した増幅 DNA断片（sat遺伝子断片）を、 Gel extraction Kitを用い て精製した後、 50 1の水に溶解した。
[0059] 次に上記で取得した S E遺伝子断片と^遺伝子断片を铸型として、配列番号 14 および 17で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットに用いて PCRを行つ た。該 PCRは、 LA-Taqを用いて、上記で取得した sacB断片および cat断片をそれぞ れ 1 μ 1、プライマー DNA各 20pmolを含む 25 μ 1の反応液を LA- Taqに添付の指示書 に従い調製し、 94°Cで 3分間保温後、 94°Cで 15秒間、 55°Cで 20秒間、 68°Cで 3分間 のサイクルを 30回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温すると 、う条件で行った。
[0060] 上記 PCRで取得した増幅 DNA断片 遺伝子断片と 遺伝子断片が同一方 向で連結した DNA断片）を、 Gel extraction Kitを用いて精製した後、 50 1の水に溶 解した。
次に、該 DNA断片を铸型とし、配列番号 18および 19で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーセットとして用い、 PCRを行った。配列番号 18で表される塩基配 列からなる DNAは、 5 '末端側に ldhA遣伝子の 5 '末端側領域付近との相同配列を有 する 43塩基からなる塩基配列を有し、 3'末端側に配列番号 7で表される塩基配列か らなる DNAを有している。配列番号 19で表される塩基配列を有する DNAは、 5'末 端側に ldhA遣伝子の 3 '末端側領域付近と相補性を有する 43塩基からなる塩基配列 を有し、 3'末端側に配列番号 8で表される塩基配列にハイブリダィズする 25塩基から なる DNAを有している。
[0061] PCRは、 EX- Taqを用いて、铸型 DNA断片 10ng、プライマー DNA各 lOpmolを含 む 50 1の反応液を EX-Taqに添付の指示書に従い調製し、 94°Cで 1分間保温後、 94 °Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間のサイクルを 30回繰り返した後、 4°Cで保 冷するという条件で行った。
上記 PCRにより、両末端に 遺伝子の両末端の 43塩基と相同な領域を有し、 sac 旦遺伝子、 遺伝子を含む DNA断片 (sacB遣伝子 + 遺伝子断片）が増幅してい ることを確認し、該 DNA断片をァガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルカゝら切り出 して精製した。
[0062] 次に、 pKD46プラスミドを保持する E. coH BW25113株のコンビテントセルを実施例 1 に記載の方法に従って調製し、上記で得られた DNA断片 lOOngを用いて形質転換 を行った。形質転換は、 0.1cmのキュベット (BioRad社製)中で、 1.8KV、 25 μ Fの条件 で、エレクト口ポレーシヨンにより行った。
形質転換した細胞を SOC培地を用いて 30°Cで 3時間培養した後、培養液を 30 g/ mlのクロラムフエ-コールを含む LB寒天プレート上に塗布し、 30°Cでー晚培養した。 生育してきたクロラムフエ-コール耐性株を、 SuLB寒天培地〔10g/lバタトトリプトン（ Difco社製）、 5g/lバクトイーストエキストラタト（Difco社製）、 10%シユークロース、 lml/1 の lmol/1 NaOH)プレートにレプリカし、シユークロース感受性を示す株を選択した。ク 口ラムフエ-コール而す性、かつシユークロース感受性を示す株は、 E. coH BW25113株 の染色体 DNA上の 遺伝子が破壊されていることを確認し、 E. coliBW25113 A ld hA::cat- sacB株と命名した。
(2) L-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した微生物の造成
上記（1)で作製した E. coH BW25113 A ldhA::cat- sacB株の染色体 DNA上の！^ 遺伝子領域に ^ lk由来の L-乳酸脱水素酵素遺伝子 QsiE遺伝子)を導入し、 E. sellの 遺伝子のプロモーターの制御下に E遺伝子がある E. ^liを以下のように 造成した。
[0063] B. subtilisの IctE.遺伝子を、 B. subtilis 168株の染色体 DNAを铸型にし、配列番号 20および 21で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーセットとして用いた PCR により取得した。配列番号 20で表される塩基配列からなる DNAは、 5'末端側に 遺伝子の開始コドンの上流領域の 45塩基からなる塩基配列を有し、 3'末端側に 遺伝子の開始コドンを含む下流領域の 27塩基力もなる塩基配列を有している。配列 番号 21で表される塩基配列カゝらなる DNAは、 5'末端側に 遺伝子の終止コドン の下流領域と相補性を有する 45塩基からなる塩基配列を有し、 3'末端側に IctE遺伝 子の終止コドンを含む上流領域と相補性を有する 27塩基からなる塩基配列を有して いる。
[0064] PCRは、 Pyrobest DNA polymerase (タカラバイオ社製）を用いて、染色体 DNA 10 0ng、プライマー DNA各 lOpmolを含む 50 μ 1の反応液を酵素に添付の指示書に従い 調製し、 94°Cで 1分間保温後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 80秒間のサイ クルを 30回繰り返した後、 4°Cで保冷すると!/、う条件で行った。
上記 PCRにより、末端に IdhA遺伝子の上流あるいは下流の 45塩基と相同な領域を 有する IctE遺伝子断片が増幅して 、ることを確認し、該 DNA断片をァガロースゲル 電気泳動に供した後、ゲルカゝら切り出して精製した。
[0065] pKD46プラスミドを保持する E. coH BW25113 A ldhA::cat- sacB株のコンビテントセル を実施例 1に記載の方法に従って調製し、上記で取得した DNA断片 lOOngを用い て形質転換を行った。
形質転換は、 0.1cmのキュベット (BioRad社製)中で、 1.8KV、 25 μ Fの条件で、エレク トロポレーシヨンにより行った。形質転換した細胞を SOC培地を用いて 30°Cで 3時間 培養した後、培養液を SuLB寒天培地プレート上に塗布し、 30°Cでー晚培養した。生 育してきたシユークロース而性株は、 E. coH BW25113 A ldhA::cat- sacB株の染色体 DNA上の ιΔ遺伝子領域に E遺伝子が導入されていることを確認し、 E. coH BW2 5113 Δ IdhA: :lctE株と命名した。
(3) S遺伝子欠損株の造成
実施例 1で取得した E. coH BW25113 A ubiB株を 20mg/lのカナマイシンと lOg/1のグ ルコースを含む LB液体培地を用いてー晚、 30°Cにて培養して得られた培養液 0.5ml を、 1.4mlの新しい LB液体培地および 100 1の 0.1M塩化カルシウム溶液と混合した [0066] 30°Cにて 5〜6時間振とう培養した後、 400 μ 1の培養物を滅菌したチューブに移し、 2 μ 1の PIファージストックを添カ卩して、 37°Cにて 10分間保温した。該チューブに 50°C に保温したソフトァガー溶液（lOg/lバタトトリプトン、 5g/lバクトイーストエキストラタト、 5mM塩化カルシウム、 lml/1 lmol/1 NaOH、 3g/l 寒天） 3ml添加し、よく攪拌した後 に、 Ca— LB寒天培地プレート（lOg/1 バクトトリプトン、 5g/lバクトイーストエキストラク ト、 5mM塩化カルシウム、 lml/1 lmol/1 NaOH、 15g/l寒天、プレートの直径は 15cm) 上にまき、 37°Cで 7時間培養した。
[0067] 次に、スプレッダ一で細力べ砕くことによりソフトァガ一部分を回収し、 1500g、 4°Cで 1 0分間遠心分離した。得られた上清 1.5mlに対し 100 μ 1のクロ口ホルムを添カ卩し、 4°Cに て一晩おいた後、 15000gにて 2分間遠心分離し、得られた上清をファージストックとし て 4°Cで保存した。
E. coH BW25113 A ldhA::lctE株を Ca—LB液体培地で 30°C、 4時間培養して得られ た培養物の 200 μ 1を遠心分離して上清を除去した後、菌体を 100 μ 1の MCバッファー (0. lmol/1 MgSO、 0.005mol/l塩化カルシウム） に懸濁して菌体懸濁液を調製した。
4
[0068] 上記で取得した 100 μ 1のファージストックを菌体懸濁液に添カ卩して緩やかに混合し 、 37°Cで 10分間保温した後、 200 μ 1の lmol/1クェン酸ナトリウム溶液を添カ卩し、遠心 分離した後、上清を除去することにより菌体を洗浄した。該洗浄操作を更に 2回繰り 返した後、 2mlの LB液体培地に懸濁して 30°Cで 2時間培養した。
次に得られた培養物 100 μ 1を 30mg/lのカナマイシンと lOg/1のグルコースを含む LB 寒天培地に塗布し、 30°Cで培養した。カナマイシン耐性株は 遺伝子が欠損して いることを確認し、 E. coH BW25113 A ubiB A ldhA::lctE株と命名した。
実施例 5
[0069] L-乳酸の製造
実施例 4で取得した E. coH BW25113 A ubiB A ldhA::lctE株を、 20g/lのグルコース を含む 2mlの LB液体培地を入れた試験管に植菌し、 37°Cにて 24時間、振とう培養し 培養物を得た。 50 1の該培養物を、 5mlの 6%の炭酸カルシウムと 1%のカザミノ酸を 含む M9液体培地 [5%グルコース、 11.28g/l M9 minimal Salt( X 5) (Difco社製）、 100 μ mol/1塩ィ匕カルシウム、 2mmol/l硫酸マグネシウム、 10 g/1硫酸鉄]が入った試 験管に植菌し、 37°Cで 24時間振とう培養した。 24時間後の培養物を遠心分離し、そ の上清を 10から 100倍に希釈してロシュ'ダイァグノスティックス社製の F-kit D-/L-乳 酸および F-kit酢酸を用いて培養液中に蓄積した L-乳酸量、 D-乳酸量および酢酸 量を測定した。結果を表 3に示す。
[表 3]
表 3
Figure imgf000028_0001
表 3に示すように、 E. coli BW25113 A ubiB A ldhA::lctE株は D-乳酸を生産せずに L-乳酸のみを生産した。すなわち ubm遺伝子の欠損株は 乳酸も生産することがわ かった。
産業上の利用可能性
[0071] 本発明により、乳酸を効率よく製造することができる。
配列表フリーテキスト
[0072] 配列番号 5 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 7—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 8—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 9 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 10—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 11 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 12—人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 13 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 14 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 15 人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 16 人工配列の説明；合成 DNA 配列番号 17 人工配列の説明；合成 DNA 配列番号 18 人工配列の説明；合成 DNA 配列番号 19 人工配列の説明；合成 DNA 配列番号 20 人工配列の説明；合成 DNA 配列番号 21 人工配列の説明；合成 DNA

Claims

請求の範囲 [1] 4 ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性、もしくは 2—ォクタプレニ ルフエノール 2—ォクタプレ-ルー 6—メトキシフエノール；フラビンレダクターゼ活性 が低下または喪失しており、かつ乳酸を生産する能力を有する微生物。 [2] 微生物が 4ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質 、または 2—ォクタプレニルフエノール 2—ォクタプレニルー 6—メトキシフエノール；フ ラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠 損した染色体 DNAを有する、請求項 1記載の微生物。 [3] 遺伝子が配列番号 1もしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、ま たは配列番号 1もしくは 2で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有し、かつ 4 ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼ活性または 2—ォクタプレニルフ ェノール 2 ォクタプレニル 6—メトキシフエノール；フラビンレダクターゼ活性を有 する蛋白質をコードする遺伝子である、請求項 2記載の微生物。 [4] 遺伝子が配列番号 3もしくは 4で表される塩基配列を有する遺伝子、または配列番号 3もしくは 4で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ 4ーヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトラ ンスフェラーゼ活性もしくは 2 ォクタプレニルフエノール 2 ォクタプレニル 6—メ トキシフエノール;フラビンレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であ る、請求項 2記載の微生物。 [5] 微生物が以下の [1]〜[5]から選ばれる方法によって乳酸を生産する能力が強化さ れた微生物である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の微生物。
[1]乳酸の生合成を制御する機構の少なくとも 1つを緩和または解除する方法
[2]乳酸の生合成に関与する酵素の少なくとも 1つを発現強化する方法
[3]乳酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも 1つのコピー数を増加させる方 法
[4]乳酸の生合成経路から該有用物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少な くとも 1つを弱化または遮断する方法
[5]野生型株に比べ、乳酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方 法
[6] 微生物カ Erwinia属、 Serratia属、 SalmonellaJ¾、 Escherichia属、 Proteus属、 Pseudomo nas属、 Acidithiobacillusfe、 Acinetobacter厲、 Agrobacterium J¾、 Bacillus属、 Boraete 農、 Bradyrnizobium属、 Brucella属、 Burkholderia属、 Caulobacter Chloroflexus 満、 Clostridium属、 Coxiella属、 Desulfitobacterium属、 Geobacter属、 Haemophilus属 ゝ Legionella厲、 LeptospiraJfe. Ma etococcus属、 Magnetospinllum 、 Mannheimia 満、 Mesorhizobium属、 Methylobacillus属、 MethvlobacteriumJfe, Mycobacterium属、 Neisseria属、 Nitrosomonas属、 Nostoc属、 Pasteurella属、 ProchlorococcusJ¾、 Rhodo bacterj¾、 Rhodococcus属、 Rhodopseudomonas属、 Rickettsia J¾、 Shigella属、 Sinorhiz obium属、 Sphingomonas属、 Streptomvces属、 Svnechococcus属、 Svnechocvstis J¾、 V ibrio属、 Xylella属、 Yersinia属、 Zvmomonas厲 3:たま Xanthomonas属【こ属する微牛物 である、請求項 1〜5のいずれ力 1項に記載の微生物。
[7] 微牛物カ rwinia berbicola、 Erwinia amvlovora, Erwinia carotovora、 serratia marces cens, Serratia ficaria, Serratia fonticola、 Serratia liauefaciens. Salmonella ent erica, S almonella enteritidis、 Salmonella paratyphi. Salmonella typhi. Salmonella dublin, Sal monella tvphimurium, Escherichia coli、 Proteus rettgeri、 Pseudomonas putida, Pseu domonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas dacunhae, Pseudomo nas fluorescens, Pseudomonas svringae, Pseudomonas thazdinophilum, Acidithiobaci llus ferrooxidans, Acinetobacter SO. ATCC 33305、 Agrobacterium tumefaciens, Baci llus halodurans、 Bordetella bronchiseptica. Bordetella parapertussis. Bordetella pert ussis、 Bradvrhizobium iaponicum. Brucella melitensis、 Burkholderia pseudomallei, C aulobacter crescentus. Chloroflexus aurantiacus. Clostridium acetobutylicum、し lost ridium botulinum、 Clostridium difficile、 Coxiella burnetii、 Desulfitobacter iumhafhien se^ Geobacter metallireducens、 Haemophilus ducreyi、 Legionella pneumophila.し ept ospira interrogans. Magnetococcus MC- 1、 Magnetospirillum magnetotacticum. Man nheimia haemolvtica. Mesorhizobium loti、 Methylobacillus flagellatus. Methylobacter ium extorquens. Mycobacterium bovis、 Mycobacterium leprae. Mycobacterium mari num、 Mvcobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae. Neisseria meningitidis Ni trosomonas europaea. Nostoc。unctiforme、 Pasteurella multocida、 Prochlorococcus marinus、 Rhodobacter capsulatus. Rhodococcus sp. strain 124、 Rhodopseudomonas palustris、 Rickettsia prowazekii. Shigella flexnerL Sinorhizobium meliloti、 Sphingomo nas aromaticivorans、 Streptomvces avermitilis、 Streptomvces coelicolor. Svnechococ cus s£. WH8102、 Svnechocvstis s^. PCC6803、 Vibrio cholerae, Xvlella fastidiosa、 X vlella fastidiosa、 Yersinia pestis. Zvmomonas mobilis、 Xanthomonas owzaeおよび Xa nthomonas capestrisからなる群より撰ばれる微生物である請求項 1〜6のいずれか 1 項に記載の微生物。
請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中に乳酸を生 成、蓄積させ、該培養物から乳酸を採取する乳酸の製造法。
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