WO2007028804A1 - Fermentative herstellung nichtflüchtiger mikrobieller stoffwechselprodukte in fester form - Google Patents

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WO2007028804A1
WO2007028804A1 PCT/EP2006/066057 EP2006066057W WO2007028804A1 WO 2007028804 A1 WO2007028804 A1 WO 2007028804A1 EP 2006066057 W EP2006066057 W EP 2006066057W WO 2007028804 A1 WO2007028804 A1 WO 2007028804A1
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liquid medium
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Stephan Freyer
Markus Lohscheidt
Oskar Zelder
Matthias Boy
Edzard Scholten
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Definitions

  • the present invention relates to the fermentative production of nonvolatile microbial metabolites in solid form by grinding, liquefaction and saccharification of starch sources selected from cereal grains and the use of the thus obtained sugar-containing liquid medium for fermentation.
  • nonvolatile microbial metabolites e.g. Amino acids, vitamins and carotenoids by microbial fermentation are well known. Depending on the different process conditions different carbon sources are used. These range from pure sucrose via beet and sugar cane molasses, so-called “high-test molasses", to glucose from starch hydrolysates For the biotechnological production of L-lysine, moreover, acetic acid and ethanol are used as large-scale co-substrates (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysines, Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-112).
  • starch An important source of carbon for the microorganism-mediated fermentative production of nonvolatile microbial metabolites is starch. This must first be liquefied and saccharified in upstream reaction steps before it can be used as a carbon source in a fermentation.
  • the starch is made from a natural starch source such as potatoes, cassava, cereals, e.g. Wheat, maize, barley, rye, triticale or rice usually obtained in pre-purified form and then enzymatically liquefied and saccharified, to then be used in the actual fermentation for the production of the desired metabolic products.
  • non-pretreated starch sources for the production of carbon sources for the fermentative production of nonvolatile microbial metabolites is described Service.
  • starch sources are first crushed by grinding.
  • the millbase is then subjected to liquefaction and saccharification. Since this millbase naturally contains not only starch but also a number of non-starchy constituents which adversely affect the fermentation, these constituents are usually separated off before the fermentation.
  • Removal can be either directly after milling (WO 02/277252, JP 2001-072701, JP 56-169594, CN 12181 11), after liquefaction (WO 02/277252, CN 1173541) or following saccharification (CN 1266102 Beukema et al .: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res Neth (1983), 6, NL8302229). In all variants, however, a largely pure starch hydrolyzate is used in the fermentation.
  • More recent techniques are particularly concerned with improved methods which, prior to fermentation, involve purification e.g. liquefied and saccharified starch solutions (JP 57159500) and of fermentation media from renewable resources (EP 1205557).
  • purification e.g. liquefied and saccharified starch solutions (JP 57159500) and of fermentation media from renewable resources (EP 1205557).
  • unprocessed starch sources are known to be widely used in the fermentative production of bioethanol.
  • dry milling The process of dry milling, liquefaction and addition of starch sources, known as “dry milling”, is technically established on a large scale, and corresponding process descriptions can be found, for example, in “The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries ", Jaques et al. (Ed.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, and McAloon et al., “Determining the cost of producing ethanol from starch and lignocellulosic feedstocks", NREL / TP-580-28989, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
  • the oxygen supply of the microorganisms used especially if they have a high oxygen demand, a limiting factor.
  • a viscosity increasing with increasing solids concentration leads to a reduced oxygen transfer rate.
  • surface-active substances are introduced into the fermentation medium with the solids, these influence the coalescing tendency of the gas bubbles.
  • the resulting bubble size in turn significantly influences the oxygen transfer (Mersmann, A. et al .: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).
  • JP 2001/275693 describes a process for the fermentative production of amino acids, in which the starch source used is peeled cassava nodules which have been ground dry. For carrying out the process, however, it is necessary to set a particle size of the ground material of ⁇ 150 ⁇ m.
  • cassava should be relatively unproblematic for dry-milling compared to other starch sources, in particular cereals or cereal grains. While the dried cassava root starch content is typically at least 80% by weight (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of cassava, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 20 (4), 1978, John Wiley and Sons , Inc., Table 1, page 558), the dry starch content compared to cereals is significantly lower, usually below 70 wt .-%, eg corn at about 68% by weight and wheat at about 65% by weight (Jaques et al., The Alcohol Textbook, supra).
  • the glucose solution obtained after liquefaction and saccharification when using dry-milled cassava contains comparatively little impurities and, in particular, little solids.
  • These foreign constituents, and especially the non-starchy solids prove to be problematic when using cereal grains as a source of starch since their share in these starch sources is significantly higher than in cassava. Due to the increased amount of impurities namely, the viscosity of the reaction mixture is substantially increased.
  • Cassava starch should be relatively easy to process. Although it has a higher viscosity at the swelling temperature compared to corn starch, the viscosity decreases more rapidly with increasing cassava temperature than, for example, corn starch (Menezes, TJB, Saccharification of Cassava for Ethyl Alcohol Production, Process Biochemistry, 1978) , Page 24, right column). In addition, the swelling and gelatinization temperatures of cassava starch are lower than those of corn starch, such as corn, making them more amenable to bacterial ⁇ -amylase than cereal starches (Menezes, T.J.B, de, supra).
  • cassava over starch sources from cereals is its low cellulose content and low phytate content.
  • Cellulose and hemicellulose can be converted into furfurals, especially under acidic saccharification conditions. the (Jaques et al., The Alcohol Textbook, supra; Menezes, TJB, de, supra), which in turn may have an inhibiting effect on the microorganisms used in the fermentation.
  • Phytate also inhibits the microorganisms used for the fermentation.
  • cassava as a source of starch in a dry-milling process
  • cassava-based process is nevertheless complex, unoptimized, and therefore not widely used.
  • the use of grain as a source of starch in a dry-milling process for the production of fine chemicals such as nonvolatile microbial metabolites has not previously been reported.
  • WO2005 / 116228 describes for the first time a sugar-based fermentation process for the microbial production of fine chemicals, in which a meal of cereal grains or other dry grain crops or seeds is used as the starch source, without the non-starchy components being removed before the fermentation. Substantial removal of the volatiles from the fermentation broth to obtain a solid containing the fermentation product is not described.
  • the process should allow easy processing of the fermentation mixture, in particular by means of a drying process.
  • it should be characterized by easy handling of the media used and in particular to avoid expensive pre- or purification steps, such as the separation of solid non-starchy ingredients before fermentation.
  • the invention thus provides a process for producing at least one non-volatile microbial metabolite in solid form by sugar-based microbial fermentation, wherein a microorganism strain producing the desired metabolite (s) is produced using a sugar-containing liquid medium has a monosaccharide content of more than 20% by weight, based on the total weight of the liquid medium, and then substantially removes the volatile constituents of the fermentation broth, the sugar-containing liquid medium being prepared by:
  • starch dry grain crops or seeds are particularly suitable which, when dried, have at least 40% by weight and preferably at least 50% by weight starch portion. These are found in many of today's large scale crops such as corn, wheat, oats, barley, rye, triticale, rice and various types of millet, e.g. Sorghum and MiIo.
  • the starch source is selected from maize, rye, triticale and wheat grains.
  • the process according to the invention can also be carried out with analogous starch sources, such as, for example, a mixture of various starchy crops or seeds.
  • the sugars contained in the sugar-containing liquid medium produced according to the invention are essentially monosaccharides such as hexoses and pentoses, for example glucose, fructose, mannose, galactose, sorbose, xylose, arabinose and ribose, in particular glucose.
  • monosaccharides other than glucose can vary depending on the starch source used and the non-starch-containing constituents contained in it and can be influenced by the process control, for example by breaking down cellulosic components by adding cellulases.
  • the monosaccharides of the sugar-containing liquid medium a proportion of glucose of at least 60 wt .-%, preferably at least 70 wt .-% and particularly preferably at least 80 wt .-%, based on the total amount of sugar contained in the sugar-containing liquid medium.
  • the glucose content is in the range of 75 to 99 wt .-%, in particular from 80 to 97 wt .-% and especially from 85 to 95 wt .-%, based on the total amount of sugar contained in the sugar-containing liquid medium.
  • the concentration of monosaccharides, especially the glucose concentration, in the liquid medium produced according to the invention is frequently at least 25% by weight, preferably at least 30% by weight, more preferably at least 35% by weight, especially at least 40% by weight, e.g. 25 to 55 wt .-%, in particular 30 to 52 wt .-%, particularly preferably 35 to 50 wt .-% and especially 40 to 48 wt .-%, based on the total weight of the liquid medium.
  • the sugar-containing liquid medium with which the microorganism strain producing the desired metabolites contains at least a part, preferably at least 20% by weight, in particular at least 50% by weight, especially at least 90% by weight and especially at least 99% by weight % of the non-starchy solids contained in the ground cereal grains, according to the degree of milling.
  • the proportion of non-starchy solid constituents in the sugar-containing liquid medium is preferably at least 10% by weight and in particular at least 25% by weight, e.g. 25 to 75 wt .-% and especially 30 to 60 wt .-%.
  • the particular starch source is ground with or without the addition of liquid, eg water, preferably without the addition of liquid. It can also be a dry grinding combined with a subsequent wet grinding.
  • liquid eg water
  • hammer mills, rotor mills or roll mills are typically used;
  • agitating mixers, stirred ball mills, circulation mills, disk mills, annular chamber mills, vibrating mills or planetary mills are suitable. In principle, other mills come into consideration.
  • the amount of liquid required for wet milling can be determined by the skilled person in routine experiments. Usually it is adjusted so that the content of dry matter in the range of 10 to 20 wt .-% is.
  • the millbase obtained during grinding, especially in dry grinding, in step a1) flour particles, ie particulate components having a particle size in the range of 100 to 630 ⁇ m in a proportion of 30 to 100 wt. -%, preferably 40 to 95 wt .-% and particularly preferably 50 to 90 wt .-%.
  • the millbase obtained preferably contains 50% by weight of flour particles having a particle size of more than 100 ⁇ m.
  • at least 95% by weight of the ground flour particles have a particle size of less than 2 mm.
  • the measurement of the grain size is carried out by sieve analysis using a vibration analyzer.
  • a small grain size is basically advantageous for achieving a high product yield.
  • too small a particle size can lead to problems, in particular due to lump formation / agglomeration, during mashing of the ground material during liquefaction or during workup, for example during the drying of the solids after the fermentation step.
  • flours are characterized by the degree of grinding or by the type of flour, and these correlate with one another in such a way that the index of the flour type increases as the degree of pulverization increases.
  • the degree of milling corresponds to the amount by weight of the flour obtained, based on 100 parts by weight of the millbase used. While first pure, finest flour, eg from the interior of the grain, is obtained during grinding, the proportion of crude fiber and shell content in the flour increases during further grinding, ie as the degree of pulverization increases, the proportion of starch being reduced.
  • the Ausmahlungsgrad is therefore also reflected in the so-called flour type, which is used as a numerical value for the classification of flours, in particular of cereal flours, and based on the ash content of the flour (so-called ash scale).
  • the flour type or the type number indicates the amount of ash (minerals) in mg, which remains when burning 100 g flour powder substance.
  • a higher type number means a higher degree of milling since the kernel of the cereal grain contains about 0.4% by weight, while the shell contains about 5% ash by weight.
  • the cereal flours are therefore predominantly composed of the comminuted flour body, ie the starch constituent of the cereal grains; at higher degrees of milling, the cereal flours also contain the shredded, protein-containing aleurone layer of the cereal grains; in the case of meal, the constituents of the proteinaceous and fatty seedling as well as the raw fiber and ash-containing seed shells.
  • Flours having a high degree of milling or a high type number are generally preferred for the purposes according to the invention. If grain is used as a source of strength, preferably the grind whole unpeeled grains and further processed, optionally after prior mechanical separation of germ and husks.
  • step a2) at least a portion of the millbase, preferably at least 40% by weight, in particular at least 50% by weight and very particularly preferably at least 55% by weight in the course of liquefaction, but preferably before saccharification into the reactor.
  • the amount of millbase added does not exceed 90% by weight, in particular 85% by weight and particularly preferably 80% by weight, based on the total amount of millbase used.
  • the subset of millbase added in the course of liquefaction is fed to the reactor under conditions such as exist in liquefaction.
  • the addition may be discontinuous, i.
  • Essential to the invention is that at the beginning of the liquefaction only a portion of the ground material, preferably not more than 60 wt .-%, in particular not more than 50 wt .-% and particularly preferably not more than 45 wt .-% of the ground material in the reactor is located and the remainder of the ground material is added during the liquefaction.
  • the millbase may be in the form of a powder, i. without the addition of water, or as a suspension in an aqueous liquid, e.g. Fresh water, recycled process water, e.g. from the fermentation or the work-up, are added.
  • the liquefaction may also be continuous, e.g. in a multi-stage reaction cascade.
  • the liquefaction in step a2) takes place in the presence of at least one starch-liquefying enzyme, which is preferably selected from ⁇ -amylases.
  • starch-liquefying enzyme which is preferably selected from ⁇ -amylases.
  • Other active and stable starch liquefying enzymes under the reaction conditions are also useful.
  • the ⁇ -amylase (or the starch-liquefying enzyme used) can be initially introduced into the reaction vessel or added during the course of step a2). Vorzugswei- se is added to a subset of the ⁇ -amylase required in step a2) at the beginning of step a2), or this subset is introduced into the reactor.
  • the total amount of ⁇ -amylase is usually in the range of 0.002 to 3.0 wt .-%, preferably from 0.01 to 1, 5 wt .-% and particularly preferably from 0.02 to 0.5 wt .-%, based on the total amount of starch source used.
  • the liquefaction can be carried out above or below the gelation temperature.
  • the liquefaction in step a2) preferably takes place at least temporarily above the gelation temperature of the starch used (so-called cooking process).
  • a temperature in the range of 70 to 165 ° C, preferably selected from 80 to 125 ° C and particularly preferably from 85 to 1 15 ° C, wherein the temperature is preferably at least 5 ° C and more preferably at least 10 ° C above the gelation temperature is.
  • step a2) is preferably carried out at least temporarily at a pH in the weakly acidic range, preferably between 4.0 and 7.0, more preferably from 5.0 to 6.5, wherein usually before or at the beginning of step a2) the pH adjustment is made; This pH is preferably controlled during the liquefaction and optionally adjusted.
  • the adjustment of the pH is preferably carried out with dilute mineral acids such as H2SO4 or H3PO4 or with dilute alkali solutions such as aqueous sodium hydroxide solution (NaOH) or potassium hydroxide solution (KOH) or with alkaline earth solutions such as aqueous calcium hydroxide.
  • step a2) of the process according to the invention is carried out in such a way that initially a subset of at most 60% by weight, preferably at most 50% by weight and particularly preferably at most 45% by weight, for example 10 to 60% by weight. %, in particular 15 to 50 Gew. -% and particularly prefers 20 to 45 Gew. -%, related to the total quantity of the ground material, in an aqueous liquid, eg fresh water, recycled process water, eg from the fermentation or the workup, or in a mixture of these liquids is suspended and then the liquefaction is carried out.
  • the liquid used for the preparation of the suspension of the millbase can be pre-tempered to a slightly elevated temperature, for example in the range from 40 to 60.degree.
  • the liquid used for the preparation of the suspension of the millbase will not exceed 30 ° C and in particular room temperature, ie 15 to 28 ° C have.
  • the at least one starch-liquefying enzyme preferably an ⁇ -amylase, is then added to this suspension.
  • an ⁇ -amylase advantageously only a partial amount of the ⁇ -amylase is added, for example from 10 to 70% by weight and in particular from 20 to 65% by weight, based on the ⁇ -amylase used in total in step a) .
  • the amount of ⁇ -amylase added at this time depends on the activity of the respective ⁇ -amylase with respect to the starch source used under the reaction conditions, and is usually in the range of 0.0004 to 2.0% by weight, preferably 0.001 to 1, 0 wt .-% and particularly preferably from 0.02 to 0.3 wt .-%, based on the total amount of the starch source used.
  • the aliquot of the ⁇ -amylase may be mixed with the liquid used prior to preparation of the suspension.
  • the partial amount of ⁇ -amylase is preferably before the beginning of the heating to the temperature used for liquefaction, in particular at room temperature or only slightly elevated temperature, e.g. in the range of 20 to 30 ° C, added to the suspension.
  • the amounts of ⁇ -amylase and millbase will be selected so that the viscosity during the saccharification process, in particular the gelation process, is sufficiently reduced in order to allow effective mixing of the suspension, for example by means of stirring.
  • the viscosity of the reaction mixture is preferably not more than 20 Pas, more preferably not more than 10 Pas and most preferably not more than 5 Pas.
  • the measurement of the viscosity is usually carried out with a Haake viscometer type Roto Visko RV20 with measuring system M5 and measuring device MVDIN at a temperature of 50 ° C and a shear rate of 200 S " 1 .
  • the thus prepared suspension is then preferably heated to a temperature above the gelling temperature of the starch used.
  • a temperature in the range of 70 to 165 ° C, preferably selected from 80 to 125 ° C and particularly preferably from 85 to 115 ° C, wherein the temperature is preferably at least 5 ° C and particularly preferably at least 10 ° C. above the gelation temperature.
  • subsets of the millbase for example in portions, in amounts of 2 to 20% by weight and in particular 5 to 10% by weight, based on the total millbase used, are added to the suspension of the millbase .
  • the subset of the ground material is added in the course of the liquefaction in at least 2, preferably at least 4 and more preferably at least 6 partial portions of the reaction mixture.
  • the addition of the subset of the ground material not used in the preparation of the suspension can be carried out continuously during the liquefaction.
  • the temperature should be kept at the addition advantageously above the gelation temperature of the starch.
  • the addition of the millbase is preferably carried out in such a way that the viscosity of the reaction mixture during the addition, or during the liquefaction, is not more than 20 Pas, particularly preferably not more than 10 Pas and very particularly preferably not more than 5 Pas.
  • the reaction mixture is usually still for a time, e.g. 30 to 60 minutes or longer, if necessary, maintained at the temperature set above the gelation temperature of the starch, wherein the starch constituents of the ground material are overcooked.
  • the reaction mixture is then typically heated to a slightly lower temperature above the gelling temperature, e.g. 75 to 90 ° C, cooled before a further portion of ⁇ -amylase, preferably the main amount is added.
  • the amount of ⁇ -amylase added at this time is preferably 0.002 to 2.0% by weight, more preferably 0.01 to 1.0% by weight, and most particularly preferably from 0.02 to 0.4 wt .-%, based on the total amount of the starch source used.
  • the reaction mixture is kept at the set temperature or optionally further heated until the starch detection with iodine or optionally another test for the detection of starch is negative or at least substantially negative.
  • one or more further aliquots of ⁇ -amylase e.g. in the range of 0.001 to 0.5 wt .-% and preferably 0.002 to 0.2 wt .-%, based on the total amount of the starch source used, are added to the reaction mixture.
  • the liquefied medium can be completely saccharified in a special saccharification tank before it is fed to the fermentation step b).
  • the dextrins contained in the liquid medium for example in the range from 10 to 90% by weight and in particular in the Range of 20 to 80 wt .-%, based on the total weight of the dextrins (or the original starch), saccharified and the resulting sugar-containing liquid medium used in the fermentation.
  • a further saccharification can then take place in situ.
  • the saccharification can furthermore be carried out directly in the fermenter (in situ) with the elimination of a separate saccharification tank.
  • a reduced or partial fermentation in the fermenter results in reduced investment costs.
  • a higher glucose concentration in batch (batch) may optionally be introduced by delayed release of the glucose without any inhibition or metabolism change of the microorganisms used.
  • too high a glucose concentration results in e.g. for the formation of organic acids (acetate), while Saccharomyces cerevisae in this case e.g. switched to fermentation, although in aerated fermenters sufficient oxygen is present (Crabtree effect).
  • a delayed release of glucose can be adjusted by regulating the glucoamylase concentration. As a result, the aforementioned effects can be suppressed and it can be submitted to more substrate, so that the resulting from the supplied feed stream dilution can be reduced.
  • the liquefied starch solution is usually adjusted to the temperature optimum of the saccharifying enzyme or slightly below it, e.g. cooled or tempered at 50 to 70 ° C, preferably 60 to 65 ° C and then treated with glucoamylase.
  • the liquefied starch solution is usually brought to fermentation temperature, ie. H. 32 to 37 ° C, cool before feeding them to the fermenter.
  • the glucoamylase (or at least one saccharifying enzyme) for saccharification is in this case added directly to the fermentation broth.
  • the saccharification of the liquefied starch according to step a2) takes place here parallel to the metabolism of the sugar by the microorganisms.
  • the pH of the liquid medium is adjusted to a value in the optimum range of action of the glucoamylase used, preferably in the range from 3.5 to 6.0; more preferably from 4.0 to 5.5 and most preferably from 4.0 to 5.0.
  • the saccharification takes place in a special saccharification tank.
  • the liquefied starch solution is heated to an optimum temperature for the enzyme or slightly below it and the pH is adjusted in the manner described above to an optimum value for the enzyme.
  • the glucoamylase is usually added to the dextrin-containing liquid medium in an amount of 0.001 to 5.0% by weight, preferably 0.005 to 3.0% by weight, and more preferably 0.01 to 1.0% by weight the total amount of starch source used, added.
  • the dextrin-containing suspension is preferably maintained for a period of time, e.g. Maintained at the set temperature for 2 to 72 hours or longer, if necessary, especially for 5 to 48 hours, with the dextrins being saccharified to monosaccharides.
  • the progress of saccharification may be carried out by methods known to those skilled in the art, e.g. HPLC, enzyme assays or glucose test strips. Saccharification is complete when the concentration of monosaccharides no longer increases or decreases significantly.
  • the millbase is added in the presence of the at least one ⁇ -amylase and the at least one glucoamylase in step a2) such that the viscosity of the liquid medium is not more than 20 Pas, preferably not more than 10 Pas and more preferably not more than 5 Pas ,
  • the viscosity control it has proved to be advantageous if at least 25% by weight, preferably at least 35% by weight and particularly preferably at least 50% by weight, of the total amount of millbase added at a temperature above the gelatinizing temperature of the Regrind contained starch can be added.
  • the control of the viscosity can be further influenced by adding the at least one starch-liquefying enzyme, preferably an ⁇ -amylase, or / and the at least one saccharifying enzyme, preferably a glucoamylase, even in portions.
  • the sugar-containing liquid medium having a monosaccharide content, in particular a glucose content, of preferably more than 25% by weight, for example more than 30% by weight or more than 35% by weight.
  • a monosaccharide content in particular a glucose content
  • 40 wt .-% for example> 25 to 55 wt .-%, in particular> 30 to 52 wt .-%, particularly preferably> 35 to 50 wt .-% and especially> 40 to 48 wt .-%, based on the total weight of the liquid medium to produce.
  • the total solids content in the liquid medium is then typically 30 to 70 wt .-%, often 35 to 65 wt .-%, in particular 40 to 60 wt .-%.
  • concentration of monosaccharides or glucose and the solids content depend in a manner known per se on the ratio of the millbase used in the liquefaction and the amount of liquid and on the starch content of the millbase.
  • ⁇ -amylases enzyme class EC 3.2.1.1
  • ⁇ -amylases obtained from Bacillus lichenformis or Bacillus staerothermophilus, and especially those which can be liquefied by dry-milling
  • the suitable for liquefying ⁇ -amylases are also commercially available, for example from Novozy- mes under the name Termamyl 120 L, type L; or from Genencor under the name Spezyme. It is also possible to use a combination of different ⁇ -amylases for liquefaction.
  • glucoamylases enzymes suitable for the saccharification of dextrins
  • glucoamylases enzyme class EC 3.2.1.3
  • glucoamylases derived from Aspergilus and especially those used for saccharification of dry-milling derived materials in the production of bioethanol are suitable.
  • the suitable enzymes for gluceting are also commercially available, for example from Novozzymes under the name Dextrozyme GA; or from Genencor under the name Optidex. It may also be a combination of various saccharifying enzymes, e.g. various glucoamylases are used.
  • the concentration of Ca 2+ ions can be adjusted to an enzyme-specific optimum value. Suitable concentration levels can be determined by one skilled in the art in routine experimentation. If, for example, termamyl is used as ⁇ -amylase, it is advantageous to set a Ca 2+ concentration of, for example, 50 to 100 ppm, preferably 60 to 80 ppm and more preferably about 70 ppm in the liquid medium.
  • the whole starch source ie the whole grain
  • this also includes the non-starch starchy solid components of the starch source. This often requires the entry of a non-negligible proportion of phytate from the grain crop.
  • at least one phytase is advantageously added to the liquid medium in step a2) before the sugar-containing liquid medium is fed to the fermentation step.
  • the addition of the phytase can be done before, during or after liquefaction or saccharification, provided that it has the required heat stability.
  • Phytases can be used any phytases, as far as their activity is limited under the reaction conditions in each case at most insignificant.
  • Phytases are preferably at a temperature stability (T50)> 50 ° C and particularly preferably of> 60 0 C.
  • the amount of phytase is usually 1 to 10,000 units / kg of starch source, and more preferably 10 to 2,000 units / kg of starch source.
  • enzymes for example pullulanases, cellulases, hemicellulases, glucanases, xylanases, glucosidases or proteases, may also be added to the reaction mixture during the preparation of the sugar-containing liquid medium.
  • the addition of these enzymes can positively affect the viscosity, i. reduce (e.g., by cleavage of longer chain glucans and / or (arabino) xylans), causing the release of metabolizable glucosides and the release of (residual) starch.
  • proteases has analogous positive effects, with additional amino acids as growth factors for the fermentation can be released.
  • the sugar-containing liquid medium is used for the fermentative production of a nonvolatile microbial metabolite.
  • the sugar-containing liquid medium produced in steps a1) and a2) is fed to a fermentation.
  • the nonvolatile microbial metabolites are produced by the microorganisms.
  • the fermentation process can generally be carried out in the usual manner known to those skilled in the art.
  • the volume ratio of supplied sugar-containing liquid medium to the initially introduced and the microorganism-containing liquid medium is generally in the range of about 1:10 to 10: 1, preferably in the range of about 1: 2 to 2: 1, for example at about 1: 2 or about 2: 1 and especially at about 1: 1.
  • the sugar content in the fermentation broth can be regulated.
  • the feed rate will be adjusted so that the monosaccharide content in the fermentation broth is in the range of> 0 wt% to about 5 wt%; however, the fermentation can also be carried out at significantly higher monosaccharide contents in the fermentation broth, for example about 5 to 20% by weight and in particular 10 to 20% by weight.
  • the sugar-containing liquid medium obtained in step a) may optionally be sterilized prior to the fermentation, optionally containing present interfering microorganisms, e.g. were introduced by the millbase (contaminants), by a suitable method, typically kills by a thermal process.
  • the broth is usually heated to temperatures above 80 ° C.
  • the killing or lysis of the cells can take place immediately before the fermentation.
  • the entire sugar-containing liquid medium of lysis or killing is supplied.
  • a preferred embodiment of the invention relates to a process wherein the liquid medium obtained in step a) (or steps a1) and a2)) is directly, i. without prior sterilization, fed to fermentation or at least partially in situ saccharification is performed.
  • Fermentation results in a liquid medium which, in addition to the desired nonvolatile microbial metabolite and water, results in substantially insoluble solids, eg the biomass produced during the fermentation, the non-metabolized components of the saccharified starch solution and in particular the non-starchy solid components of the starch source, such as For example, fibers, as well as the components dissolved in the fermentation broth (soluble constituents), for example, unused buffer and nutrient salts and unreacted monosaccharides (ie unrecovered sugars) contains.
  • substantially insoluble solids eg the biomass produced during the fermentation, the non-metabolized components of the saccharified starch solution and in particular the non-starchy solid components of the starch source, such as For example, fibers, as well as the components dissolved in the fermentation broth (soluble constituents), for example, unused buffer and nutrient salts and unreacted monosaccharides (ie unrecovered sugars) contains.
  • This liquid medium is also referred to below as a fermentation broth, the term fermentation broth also encompassing the (sugar-containing) liquid medium in which a partial or incomplete fermentative conversion of the sugars contained therein, ie a partial or incomplete microbial metabolism of the monosaccharides, has occurred ,
  • the volatile constituents of the fermentation medium are removed. In this way, a solid is obtained which contains the nonvolatile product of value together with the insoluble constituents of the fermentation broth and optionally the components present dissolved in the fermentation broth.
  • non-volatile microbial metabolites are understood to mean compounds which generally can not be removed from the fermentation broth without decomposition by distillation.
  • These compounds generally have a boiling point above the boiling point of water, often above 150 ° C and especially above 200 ° C at atmospheric pressure. They are usually compounds that are solid under normal conditions (298 K, 101, 3 kPa). However, it is also possible to use the process according to the invention for the preparation of nonvolatile microbial metabolites which have a melting point below the boiling point of water or / and an oily consistency at normal pressure. In this case, a control of the maximum temperatures during the workup, in particular during the drying is usually required.
  • these compounds can also be prepared by formulating them in quasi-solid form (pseudo-solid form) on adsorbents.
  • Suitable adsorbents for this purpose are, for example, activated carbons, aluminum oxides, silica gels, silicic acid, clay, carbon blacks, zeolites, inorganic alkali metal and alkaline earth metal salts such as sodium, potassium, magnesium and calcium hydroxides, carbonates, silicates, sulfates, phosphates, in particular magnesium and calcium salts, for example Mg (OH) 2, MgCO 3 , MgSiO 4 , CaSO 4 , CaCO 3 , alkaline earth metal oxides, for example MgO and CaO, other inorganic phosphates and sulfates, for example ZnSO 4 , salts of organic acids, in particular their Alkali and alkaline earth metal salts and especially their sodium and KaIi- umsalze, eg sodium and potassium acetate, formate, -hydrogenformiate and - citrate, and higher molecular weight organic carriers such as carbohydrates, for example sugar, optionally modified starches
  • Examples of compounds which can be advantageously prepared in this way by the process according to the invention are ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ - Linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid, furthermore propionic acid, lactic acid, propanediol, butanol and acetone.
  • These compounds in pseudo-free formulation are understood in the context of the present invention as nonvolatile microbial metabolites in solid form.
  • non-volatile microbial metabolites in the following includes in particular organic, optionally 1 or more, for. B. 1, 2, 3 or 4 hydroxyl-bearing mono-, di- and tricarboxylic acids having preferably 3 to 10 carbon atoms, e.g. Tartaric, itaconic, succinic, propionic, lactic, 3-hydroxypropionic, fumaric, maleic, 2,5-furandicarboxylic, glutaric, levulinic, gluconic, aconitic and diaminopimelic acids, citric acid; proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, e.g.
  • Lysine glutamate, methionine, phenylalanine, aspartic acid, tryptophan and threonine; Purine and pyrimidine bases; Nucleosides and nucleotides, e.g. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and adenosine 5'-monophosphate (AMP); lipids; saturated and unsaturated fatty acids preferably having 10 to 22 carbon atoms, e.g.
  • ⁇ -linolenic acid dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid; Diols having preferably 3 to 8 C atoms, e.g. Propanediol and butanediol; higher alcohols having 3 or more, e.g. 3, 4, 5 or 6 OH groups, e.g. Glycerin, sorbitol, manitol, xylitol and arabinitol; long-chain alcohols having at least 4 C atoms, e.g. with 4 to 22 C atoms, e.g.
  • butanol Carbohydrates, e.g. Hyaluronic acid and trehalose; aromatic compounds, e.g. aromatic amines, vanillin and indigo; Vitamins and provitamins, e.g. Ascorbic acid, vitamin B, vitamin B12 and riboflavin, cofactors and so-called nutraceuticals; Proteins, e.g.
  • Enzymes such as amylases, pectinases, acidic, hybrid or neutral cellulases, esterases such as lipases, pancreases, proteases, xylanases and oxidoreductases such as laccase, catalase and peroxidase, glucanases, phytases; Carotenoids, e.g. Lycopene, ⁇ -carotene, astaxanthin, zeaxanthin and canthaxanthin; Ketones having preferably 3 to 10 C atoms and optionally 1 or more hydroxyl groups, e.g. Acetone and acetoin; Lactones, e.g.
  • y -butyrolactone cyclodextrins
  • biopolymers e.g. Polyhydroxyacetate
  • polyester e.g. Polylactide, polysaccharides, polyisoprenoids, polyamides; as well as precursors and derivatives of the aforementioned compounds.
  • Other compounds of interest as nonvolatile microbial metabolites are described by Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for the occurrence of normal enzyme activity. These compounds may be organic or inorganic; the cofactor molecules of the invention are preferably orga- cally. Examples of such molecules are NAD and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP); The precursor of these cofactors is niacin.
  • the term “nutraceutical” encompasses food additives that promote health in plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and certain lipids, e.g. Polyunsaturated fatty acids.
  • the metabolites produced under enzymes amino acids, vitamins, disaccharides, aliphatic mono- and dicarboxylic acids having 3 to 10 carbon atoms, aliphatic hydroxycarboxylic acids having 3 to 10 carbon atoms, ketones having 3 to 10 carbon atoms, alkanols with 4 to 10 carbon atoms and alkanediols having 3 to 10 and in particular 3 to 8 carbon atoms selected.
  • the compounds prepared by fermentative route according to the invention are each obtained in the enantiomeric form produced by the microorganisms used (if different enantiomers exist).
  • the amino acids usually the respective L enantiomer.
  • microorganisms used in the fermentation depend in a manner known per se on the respective microbial metabolites, as explained in detail below. They may be of natural origin or genetically modified. Examples of suitable microorganisms and fermentation processes are given in the following Table A:
  • Preferred embodiments of the method according to the invention relate to the production of enzymes such as phytases, xylanases, glucanases; Amino acids such as lysine, methionine, threonine; Vitamins such as pantothenic acid and riboflavin, precursors and secondary products thereof, and the preparation of the abovementioned mono-, di- and tricarboxylic acids, in particular aliphatic mono- and dicarboxylic acids having 3 to 10 carbon atoms such as propionic acid, fumaric acid and succinic acid, aliphatic hydroxycarboxylic acids with 3 to 10 carbon atoms such as lactic acid; of the abovementioned long-chain alkanols, in particular alkanols having 4 to 10 C atoms, such as butanol; of the abovementioned diols, in particular alkanediols having 3 to 10 and in particular 3 to 8 C atoms, such as propanedi
  • the microorganisms used in the fermentation are therefore selected from natural or recombinant microorganisms which produce at least one of the following metabolic products: enzymes such as phytase, xylanase, glucanase; Amino acids such as lysine, threonine and methionine; Vitamins such as pantothenic acid and riboflavin; Precursors and / or derivatives thereof; Disaccharides such as trehalose; aliphatic mono- and dicarboxylic acids having 3 to 10 C atoms, such as propionic acid, fumaric acid and succinic acid; aliphatic hydroxycarboxylic acids having 3 to 10 C atoms, such as lactic acid; Ketones with 3 to 10 carbon atoms, such as acetone; Alkanols having 4 to 10 C atoms, such as butanol; and alkanediols having 3 to 8 C atoms, such as propane
  • enzymes such
  • the microorganisms are selected from the genera Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus and Clostridium, especially among strains of Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger or Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbschreibii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionica bacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutlicum,
  • the metabolite produced by the microorganisms in the fermentation is lysine.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources e.g. in Pfefferle et al., supra. and US 3,708,395.
  • fed-batch mode of operation preferred is the fed-batch mode of operation.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is methionine.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources e.g. in WO 03/087386 and WO 03/100072.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is tartaric acid.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources e.g. in WO 01/021772.
  • the metabolite produced by the microorganisms in the fermentation is riboflavin.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources e.g. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1 186664 and Fujioka, K .: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is fumaric acid.
  • analogous conditions and procedures can be used as described for other carbon sources, eg in Rhodes et al., Production of Fumaric Acid in 20-L Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1), 9 -15.
  • the metabolic product produced by the microorganisms in the fermentation is a phytase.
  • analogous conditions and procedures can be used here, as have been described for other carbon sources, for example in WO 98/55599.
  • a sterilization step is preferably carried out.
  • the sterilization step can be carried out thermally, chemically or mechanically or by a combination of these measures.
  • the thermal sterilization can be carried out in the manner described above.
  • the fermentation broth will usually be treated with acids or alkalis in a manner that will kill the microorganisms.
  • the mechanical sterilization is usually done by the entry of shear forces. Such methods are known in the art.
  • the process according to the invention advantageously comprises the following three successive process steps a), b) and c):
  • the sugar-containing liquid medium having a monosaccharide content of more than 20 wt .-% according to the steps a1) and a2), wherein the sugar-containing liquid medium also comprises non-starchy solid components of the starch source;
  • the sugar-containing liquid medium obtained in step a) with which the microorganism strain producing the desired metabolic products is cultured in step b) contains at least part or the total amount, but generally at least 90% by weight and especially about 100% by weight.
  • % of the non-starchy solids contained in the ground cereal grains according to the degree of milling.
  • the proportion of non-starchy solid constituents in the sugar-containing liquid preferably at least 10% by weight and in particular at least 25% by weight, for example from 25 to 75% by weight and especially from 30 to 60% by weight.
  • a part, e.g. 5 to 80% by weight and especially 30 to 70% by weight of the non-starch-containing solid, i. insoluble constituents are separated from the fermentation broth.
  • Such separation is typically accomplished by conventional methods of solid-liquid separation, e.g. by centrifugation or filtration.
  • a pre-separation will be carried out to remove coarser solid particles containing no or low levels of nonvolatile microbial metabolite.
  • conventional methods known to those skilled in the art e.g. be applied using coarse mesh screens, nets, perforated plates, or the like.
  • a separation of coarse solid particles can also take place in a centrifugal separator.
  • the at least one non-volatile metabolite in solid form is obtained essentially without prior separation of solid constituents together with all the solid constituents from the fermentation broth.
  • the substantial removal of the volatile constituents of the fermentation broth takes place.
  • a solid or at least semi-solid residue remains, which can optionally be converted by the addition of solids in a solid product.
  • the volatile constituents of the fermentation broth are advantageously up to a residual moisture content in the range of 0.2 to 20 wt .-%, preferably 1 to 15 wt .-%, particularly preferably 2 to 10 wt .-% and most particularly preferred 5 to 10 wt .-%, based on the determined by drying total weight of the solid Remove ingredients from the fermentation broth.
  • the residual moisture content can be determined by customary methods known to the person skilled in the art, for example by means of thermogravimetry (Hemminger et al., Methods of Thermal Analysis, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989).
  • the liquid portions of the fermentation broth which in addition to the volatiles usually also contain dissolved non-volatile constituents, are removed from the undissolved constituents, i. the desired metabolite as well as biomass and the non-starchy solid components of the starch source.
  • the removal of the liquid components is then carried out by conventional methods of solid-liquid separation, such as filtration, centrifugation, etc.
  • the recovery of the nonvolatile metabolite (s) in solid form from the fermentation broth in step c) may be carried out in one, two or more stages, if appropriate after the aforesaid preliminary separation, in particular in a one- or two-stage procedure.
  • at least one, in particular the final stage for obtaining the metabolite in solid form will comprise a drying step.
  • the volatile constituents of the fermentation broth are removed until the desired residual moisture content has been reached.
  • the fermentation broth if appropriate after the aforesaid preliminary separation, will first be concentrated, for example by means of (micro-, ultra-) filtration or thermally by evaporation of a part of the volatile constituents.
  • the proportion of volatiles removed in this step is generally from 10 to 80% by weight and in particular from 20 to 70% by weight, based on the total weight of the fermentation broth volatiles.
  • the removal of the volatile constituents of the liquid medium takes place essentially without prior depletion or even isolation of the desired product.
  • the non-volatile metabolite is substantially not removed along with the volatiles of the liquid medium, but remains with at least a portion, usually the majority, and most preferably the total amount of other solid components from the fermentation broth in the residue thus obtained.
  • proportions of the desired non-volatile microbial metabolite generally not more than 20% by weight, for example, preferably also small amounts, can be used according to the invention.
  • the desired non-volatile microbial metabolite remains at least 90% by weight, in particular at least 95% by weight, especially 99% by weight and especially about 100% by weight, in each case based on the total dry weight of the Metabolism product, as a solid in admixture with the obtained after removal of the volatiles or the totality of the solid components of the fermentation medium.
  • the properties of the dried metabolite present together with the solid constituents of the fermentation can be targeted with regard to various parameters such as active ingredient content, particle size, particle shape, tendency to dust, hygroscopicity, stability, in particular storage stability , Color, odor, flow behavior, tendency to agglomerate, electrostatic charge, light and temperature sensitivity, mechanical stability and re-dispersibility in a conventional manner be assembled.
  • formulation auxiliaries such as carrier and coating materials, binders and other additives
  • formulation aids include e.g. Binders, support materials, powdering / flow aids, colorants, biocides, dispersants, antifoams, viscosity regulators, acids, alkalis, antioxidants, enzyme stabilizers, enzyme inhibitors, adsorbates, fats, fatty acids, oils or mixtures thereof.
  • formulation auxiliaries are advantageously used in particular when using formulation and drying processes such as spray drying, fluidized bed drying and freeze drying as drying aids.
  • binders are carbohydrates, especially sugars such as mono-, di-, oligo- and polysaccharides, e.g. Dextrins, trehalose, glucose, glucose syrup, maltose, sucrose, fructose and lactose; colloidal substances such as animal proteins, e.g. Gelatin, casein, especially sodium caseinate, vegetable proteins, e.g. Soy protein, pea protein, bean protein, lupine, zein, wheat protein, corn protein and rice protein, synthetic polymers, e.g. Polyethylene glycol, polyvinyl alcohol and in particular the Kollidon brands of Fa. BASF, optionally modified biopolymers, e.g.
  • sugars such as mono-, di-, oligo- and polysaccharides, e.g. Dextrins, trehalose, glucose, glucose syrup, maltose, sucrose, fructose and lactose
  • colloidal substances such as animal proteins, e.g. Gelatin, case
  • Liginin, chitin, chitosan, polylactide and modified starches e.g. Octenyl succinate anhydride (OSA); Gums, e.g. Gum acacia; Cellulose derivatives, e.g. Methylcellulose, ethylcellulose, (hydroxyethyl) methylcellulose (HEMC), (hydroxypropyl) methylcellulose (HPMC), carboxymethylcellulose (CMC); Flours, e.g. Cornmeal, wheat flour, rye flour, barley flour and rice flour.
  • OSA Octenyl succinate anhydride
  • Gums e.g. Gum acacia
  • Cellulose derivatives e.g. Methylcellulose, ethylcellulose, (hydroxyethyl) methylcellulose (HEMC), (hydroxypropyl) methylcellulose (HPMC), carboxymethylcellulose (CMC)
  • Flours e.g. Cornmeal, wheat flour, rye
  • carrier materials are carbohydrates, in particular the sugars mentioned above as binders and starches, for example from corn, rice, potato, wheat and cassava; modified starches, eg octenyl succinate anhydride; Cellulose and microcrystalline cellulose; inorganic minerals or loam, eg clay, coal, kieselguhr, silicic acid, tallow and kaolin; Gries, for example wheat semolina, bran, for example wheat bran, the flours mentioned as binders; Salts, such as metal salts, in particular alkali metal and alkaline earth metal salts of organic acids, for example Mg, Ca, Zn, Na, K citrate, acetate, formate and hydrogenformates, inorganic salts, for example Mg, Ca, Zn, Na, K sulfates, carbonates, silicates or phosphates; Alkaline earth metal oxides such as CaO and MgO; inorganic buffering agents such as alkali metal hydrogenphosphates, especially sodium
  • powdering agents are kieselguhr, silicic acid, e.g. the Sipernat brands of Degussa; Clay, coal, talc and kaolin; the starches, modified starches, inorganic salts, organic acid salts and buffering agents mentioned above as carrier materials; Cellulose and microcrystalline cellulose.
  • examples are color pigments such as TiO 2, carotenoids and their derivatives, vitamin B2, capsanthin, lutein, cryptoxanthin, canthaxanthin, astaxanthin, tartrazine, sunset yellow FCF, indigotine, biochar, bixin, iron oxide;
  • Biocides such as sodium benzoate, sorbic acid, (earth) alkali metal sorbates such as sodium sorbate, potassium sorbate and calcium sorbate, ethyl 4-hydroxybenzoate, alkali metal bisulfites such as sodium bisulfite and sodium metabisulfite, formic acid, formates and in particular alkali metal formates such as sodium formate, formaldehyde, sodium nitrate, acetates and especially (earth) alkali metal acetates such as Sodium and potassium acetate, acetic acid, lactic acid, propionic acid, dispersing agents and viscosity regulating agents such as alginates, lecithin, 1,2-
  • the proportion of the aforementioned additives and optionally other additives such as coating materials can vary greatly depending on the specific requirements of the respective metabolite and depending on the properties of the additives used, and. in the range of 0.1 to 80 wt .-% and in particular in the range of 1 to 30 wt .-%, each based on the total weight of the finished formulated product or mixture.
  • formulation auxiliaries may take place before, during or after the work-up of the fermentation broth (also referred to as product formulation or solid design) and in particular during the drying.
  • An addition of formulation auxiliaries prior to working up the fermentation broth or the metabolic product may be particularly advantageous in order to improve the processability of the substances or products to be worked up.
  • Formulation aids can be added to both the solid-formated metabolite and a solution or suspension containing it, e.g. after completion of fermentation directly to the fermentation broth or to a solution or suspension obtained in the course of the workup prior to the final drying step.
  • the excipients may e.g. be mixed in a suspension of the microbial metabolite; such suspension may also be applied to a carrier material, e.g. by spraying or mixing.
  • the addition of formulation adjuvants during drying may be e.g. play a role when a metabolic product containing solution or suspension is sprayed.
  • addition of formulation auxiliaries e.g. when applying coatings or coatings / coating layers to dried particles. Both after drying and after a possible coating step further aids can be added to the product.
  • the removal of the volatile constituents from the fermentation broth is carried out in a manner known per se by customary processes for the separation of solid phases from liquid phases, including filtration processes and processes for evaporating volatile constituents of the liquid phases.
  • processes which may also include steps for the coarse purification of the valuable substances as well as steps for the preparation, are described, for example, in Belter, P.A., Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition on CD-ROM, Wiley-VCH.
  • apparatuses, auxiliaries or general and special embodiments are further in EP 1038 527, EP 0648 076, EP 835613, EP 0219 276, EP 0394 022 , EP 0547 422, EP 1088 486, WO 98/55599, EP 0758 018 and WO 92/12645.
  • the nonvolatile microbial metabolite if it is dissolved in the liquid phase, is converted from the liquid phase into the solid phase , eg by crystallization or precipitation. Subsequently, the nonvolatile solid components including the metabolite are separated from the liquid components by a conventional solid-liquid separation method, e.g. by centrifugation, decanting or filtration. Similarly, one can also separate oily metabolites, wherein the respective oily fermentation products by addition of adsorbents, e.g. Silica, silica gels, loam, clay and activated carbon, converted into a solid form.
  • adsorbents e.g. Silica, silica gels, loam, clay and activated carbon
  • the precipitation of the microbial metabolites can be carried out in a manner known per se (see, for example, J.W. Mullin: Crystallization, 3rd ed., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993).
  • the precipitation can be effected, for example, by adding a further solvent, adding salts and varying the temperature.
  • the resulting precipitate, along with the remaining solid constituents, can be separated from the broth by the conventional solids separation techniques described herein.
  • crystallization of microbial metabolites can also be carried out in the usual way.
  • Typical crystallization processes are, for example, in Janeic, SJ, Grootscholten, PA, Industrial Crystallization, New York, Academic, 1984; AW Bam-forth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965; G. Matz: crystallization, 2nd ed., Springer Verlag, Berlin 1969; J. Nyvlt: Industrial Crystallization - State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982; SJ Janeic ' , PAM Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984; O. Sohnel, J.
  • Crystallization can be initiated, for example, by cooling, evaporation, vacuum crystallization (adiabatic cooling), reaction crystallization or salting out.
  • the crystallization can be carried out, for example, in stirred and unstirred vessels, in the direct contact process, in evaporation crystallizers (RK Multer, Chem Eng.
  • Typical filtration methods are e.g. cake and depth filtration (eg described in A. Rushton, AS Ward, RG Holdich: Solid - Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp. 177ff., KJ Ives, in A. Rushton (ed.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series E No. 88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp. 90ff.) And cross-flow filtration, in particular microfiltration for the separation of solids> 0.1 ⁇ m (for example, described in J. Altmann, S. Ripperger, J. Membrane Sci. 124 (1997) 1 19-128.).
  • the separation of the solid from the liquid phase may be followed by a drying step which is carried out in the usual way.
  • Typical processes for drying are, for example, in O. Krischer, W. KITA: The Scientific Principles of Drying Technology, 3rd ed., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; RB Keey: Drying: Principles and Practices, Pergamon Press, Oxford 1972; K. Kröll: Dryer and Drying Process, 2nd ed., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; Williams-Gardener, A .: Industrial Drying, Houston, GuIf, 1977; K. Kröll, W.
  • drying processes include methods for convection drying, eg in a drying oven, tunnel dryers, belt dryers, disc dryers, jet dryers, fluidized bed dryers, ventilated and rotary drum dryers, spray dryers, current dryers, cyclone dryers, mixer dryers, paste mill dryers, milling dryers, ring dryers, shaft dryers, Rotary tube dryer, carousel dryer.
  • contact drying eg paddle dryer; Vacuum or freeze drying, conical driers, slot dryers, disc dryers, thin-layer contact dryers, roller dryers, toughened dryers, plate dryers, spiral-feed dryers, double-cone dryers; or heat radiation (infrared, eg infrared rotary tube dryers) or dielectric energy (microwaves) for drying.
  • heat radiation infrared, eg infrared rotary tube dryers
  • microwaves dielectric energy
  • the separated liquid phase can be recycled as process water.
  • the proportion of liquid phase not returned to the process can be concentrated in a multi-stage evaporation to a syrup. If, prior to decanting, the desired metabolite has not been transferred from the liquid to the solid phase, then the resulting syrup also contains the metabolic product.
  • the syrup usually has a content of dry matter in the range of 10 to 90 wt .-%, preferably 20 to 80 wt .-% and particularly preferably 25 to 65 wt .-% to.
  • This syrup is mixed with the solids separated on decantation and then dried. The drying may e.g. take place by means of drum dryer, spray dryer or paddle dryer, preferably a drum dryer is used.
  • the drying is preferably carried out in such a way that the solid obtained has a content of residual moisture of not more than 30% by weight, preferably not more than 20% by weight, more preferably not more than 10% by weight and very particularly preferably not more than 5% by weight. %, based on the total dry weight of the resulting solid.
  • the volatile constituents are removed by evaporation, if appropriate after a previously described preliminary separation step of solid constituents.
  • the evaporation can be done in a conventional manner.
  • suitable methods for evaporating volatile constituents are spray drying, fluidized bed drying or agglomeration, freeze drying, current and contact dryers and extrusion drying.
  • a combination of the aforementioned methods with molding methods such as extrusion, pelletizing or prilling can be made. Beii these latter method are preferably partially or largely pre-dried metabolic product-containing mixtures used.
  • the devolatilization of the fermentation broth comprises a spray drying process or a fluidized bed drying process, including fluid bed granulation.
  • the fermentation broth if appropriate after a preliminary separation to remove coarse solid particles which contain no or only small amounts of non-volatile microbial metabolite, is fed to one or more spray or fluidized-bed drying apparatuses.
  • the transport or the supply of the solids-loaded fermentation broth is expediently carried out by means of conventional transfusion.
  • Port devices for solids-containing liquids eg pumps such as eccentric screw pumps (eg from Delasco PCM) or high-pressure pumps (eg from LEWA Herbert Ott GmbH).
  • Spray-drying devices it is possible to use all conventional spray-drying apparatuses known in the art, such as e.g. described in the literature cited above, in particular nozzle towers, especially with pressure nozzles, and disk towers; Spray-dryers with integrated fluidized bed and fluidized-bed spray granulators are preferably used in the embodiment described below using fluidized-bed drying.
  • the solid-laden fermentation broth is dried in cocurrent or countercurrent, preferably in countercurrent.
  • the fermentation broth is advantageously introduced into the head of a vertically oriented spray tower through a nozzle or via a rotating disk and simultaneously atomized during the gas stream used for drying, e.g. Air or nitrogen, in the upper or lower part of the spray tower is introduced into this.
  • the volatile constituents of the fermentation broth are discharged via the lower outlet or the head of the spray tower, while the non-volatile or solid constituents including the desired microbial metabolite can be discharged as a substantially dry powder below or taken from the spray tower and sent for further processing.
  • the desired residual moisture of the products need not already be achieved in this one drying step, but can be adjusted in a subsequent further drying step.
  • a fluidized bed drying are connected to the spray drying.
  • the exhaust air of the spray tower and / or the fluidized bed is advantageously freed from entrained particles or dust by means of cyclone and / or filter and collected for further processing; the volatiles may then optionally be added e.g. collected in a condensing unit and used further, e.g. as recycled process water.
  • the internal diameters and / or outlet openings used spray nozzles should be selected so that the tendency to clog or Verb clink ckung is kept as low as possible or eliminated.
  • a reasonable size of Outlet openings or the inside diameter is usually at least 0.4 mm, preferably at least 1 mm and usually, depending on the properties of the fermentation broth and the substances contained therein, the pressure and the desired throughput, in the range of 0.6 to 5 mm.
  • the gas stream used for drying usually has a temperature above the boiling point of the aqueous fermentation broth at the desired pressure, e.g. in the range of 110 to 300 ° C, in particular from 120 to 250 ° C and especially 130 to 220 ° C.
  • Heating the aqueous fermentation medium to a temperature below its boiling point, e.g. in the range of 25 to 85 ° C and especially from 30 to 70 ° C, is also possible to assist the drying process.
  • the fermentation broth prior to introduction into the spray tower, may be supplemented with an optionally preheated, e.g. to a temperature in the range of 30 to 90 ° C, gas flow, e.g. Air or nitrogen, are mixed.
  • gas flow e.g. Air or nitrogen
  • the heat stability or boiling point of the respective desired microbial metabolite must always be taken into account.
  • the temperature of the dry matter z.T. can be significantly lower than the temperature of the supplied gas stream, as long as not all volatiles have been evaporated.
  • the temperature of the dry material is also influenced by the setting of the residence time.
  • the drying process can therefore be carried out, at least temporarily, with supply air temperatures which are in the range of the boiling point of the metabolites to be dried or above.
  • the suitable temperature conditions can be determined by the skilled person by means of routine experiments.
  • the drying is carried out in a vertically oriented spray tower, which flows in cocurrent or countercurrent, preferably in the genstrom is operated by.
  • the upper or lower region of the spray tower is passed to the intended for drying hot gas stream, preferably air.
  • the resulting powder is removed at the lower end or at the top of the spray tower. If desired, this can be connected to a fluidized bed drying.
  • the mean particle size of the resulting powders is determined decisively by the degree of atomization achieved upon introduction of the solids loaded fermentation broth into the spray tower.
  • the degree of atomization in turn depends on the applied pressure at the spray nozzles or the rotational speed of the rotating disk.
  • the pressure applied to the spray nozzles is usually in the range of 5 to 200 bar, for example at about 10 to 100 bar and in particular at about 20 to 60 bar, above atmospheric pressure.
  • the rotational speed of the rotating disk is usually in the range of 5,000 to 30,000 rpm.
  • the throughput rate of the gas stream introduced for drying is very much dependent on the throughput of the liquid medium.
  • liquid medium for example in the range of 10 to 1000 l / h
  • a higher throughput eg in the range of 1000 to 50,000 l / h
  • a higher throughput usually in the range of 10,000 to 10,000,000 m 3 / h.
  • conventional spray drying equipment known in the art may be used. These reduce or prevent agglomeration of the primary powder particles formed in the spray tower, so that the properties of the powder taken from the spray tower can be influenced in a targeted manner, e.g. in terms of particle sizes, in terms of an improved degree of dryness, improved flowability and / or better redispersibility in solvents such as water.
  • conventional spraying aids mention may be made of the above-mentioned formulation auxiliaries. These are used in the amounts commonly used, e.g. in the range of 0.1 to 50 wt .-%, in particular 0.1 to 30 wt .-% and especially 0.1 to 10% by weight, based on the total dry weight of the non-volatile solid constituents of the fermentation broth used.
  • the removal of the volatile constituents of the fermentation broth is carried out using fluidized-bed drying processes.
  • fluidized-bed drying devices it is possible to use all conventional fluidized-bed dryers known in the art, in particular fluid-bed-type spray dryers and fluidized-bed spray granulators, e.g. The companies Allgaier, DMR, Glatt, Heinen, Wegtlin, Niro and Waldner are used.
  • Fluidized bed dryers can be operated continuously or batchwise. In continuous operation, the residence time in the dryer is several minutes to several hours. The apparatus is therefore also suitable for long-term drying, e.g. over a period of about 1 h to 15 h suitable. If a narrow residence time distribution is desired, the fluidized bed can be cascaded by baffles or the product flow can be approximated by meandering internals of an ideal piston flow. In particular, larger dryers are placed in several drying zones, e.g. 2 to 10 and in particular 2 to 5, which are operated at different gas velocity and temperature. The last zone can then be used as a cooling zone; In this case, usually a supply air temperature in the range of 10 to 40 ° C is set.
  • the filters for exhaust gas purification can be integrated into the fluidized-bed dryer.
  • the residence time is also between several minutes and hours. These apparatuses are also suitable for long-term drying.
  • Fluidized bed dryers can be vibrated, with the vibration transporting the product at low gas velocities (ie below the minimum fluid velocity). ons speed) and low layer height and can prevent clumping.
  • a pulsed gas supply can be used to reduce the consumption of drying gas.
  • the moist material is turbulently mixed in the upwardly directed, hot gas stream and thereby dries at high heat and mass transfer coefficients.
  • the required gas velocity depends essentially on the particle size and density. For example, for particles with diameters of several hundred microns, gas blanket velocities in the range of 1 to 10 m / s may be required.
  • a perforated floor perforated sheet, conidur sheet, woven or sintered metal floors) prevents the solid from falling into the hot gas space.
  • the heat is either supplied only via the drying gas or heat exchangers (tube bundles or plates) are additionally introduced into the fluidized bed (Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991, Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995).
  • drying using a fluidized bed apparatus or a mixer e.g. be made so as to present an adsorbent in the fluidized bed apparatus or mixer and mixed or fluidized.
  • the fermentation broth with the oily metabolic products is sprayed onto the adsorbent.
  • the volatile constituents of the fermentation broth can then be evaporated by introducing energy into the mixer or are evaporated by the heated air stream in the fluidized bed.
  • the removal of the volatile constituents of the fermentation broth is carried out using freeze-drying methods.
  • the solid-containing fermentation broth is completely frozen and the frozen volatiles are evaporated from the solid state, i. sublimated (Georg-Wilhelm Oetjen, freeze-drying, VCH 1997).
  • lyophilizers all conventional freeze dryers known in the art, e.g. the companies Klein Vakuumtechnik and Christ, are used.
  • the removal of the volatile constituents of the fermentation broth is carried out using current dryers.
  • the solids-containing fermentation broth is introduced into the lower part of a vertically standing fermentation broth. given pipe.
  • the drying gas drives the resulting particles upwards with gas empty tube velocities of 10 to 20 m / s.
  • the task of the solids-containing fermentation broth is carried out with screws, centrifugal wheels or by pneumatic entry.
  • the particles are separated at the top of the drying tube by means of a cyclone and, if the desired degree of drying has not yet been reached, can be returned to the drying tube or passed into a downstream fluidized bed (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991 Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995).
  • the removal of the volatile constituents of the fermentation broth is carried out using contact dryers.
  • This type of dryer is particularly suitable for drying pasty media.
  • the use of contact dryers is also advantageous for media wherein the solids are already in particulate form.
  • the solids-containing fermentation broth is added to the heating surfaces of the dryer, via which the energy input takes place.
  • the volatile constituents of the fermentation broth evaporate (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991, Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995).
  • a variety of different types of contact dryers exist and are used, see the examples above. These are well known to those skilled in the art as: thin film contact dryers, e.g.
  • drum dryer e.g. the company Gouda
  • paddle dryer e.g. BTC-Technology and Drais
  • contact band dryers e.g. Kunz and Merk
  • rotating tube bundle dryers e.g. the company Vetter.
  • Stabilizers or binders such as polyvinyl alcohol and gelatin are mixed in a suspension of the microbial metabolite, e.g. in a stirred tank or in front of a static mixer.
  • a suspension may also be applied to a carrier material, e.g. by spraying or mixing in a mixer or in a fluidized bed.
  • formulation auxiliaries are added during drying, relates to the powdering of moist droplets containing the metabolic product (cf EP 0648 076 and EP 835613) Metabolism product-containing suspension is sprayed, the droplets for stabilization with powdering agent, such as silica, starch or one of the aforementioned powder or flow aid, powdered and then optionally dried, for example in a fluidized bed.
  • powdering agent such as silica, starch or one of the aforementioned powder or flow aid
  • formulation adjuvants are added after drying, e.g. the application of coatings or coatings / coating layers on dried particles.
  • flow aids for improving the flow properties e.g. Silica, starches or the other previously mentioned flow aids may be added.
  • the product in question is advantageously adsorbed on an adsorbent (see examples above).
  • an adsorbent for example, one usually proceeds by adding the relevant adsorbent to the fermentation broth at or after the end of the fermentation.
  • the addition of the adsorbent can be carried out after prior concentration of the fermentation broth.
  • hydrophobic and hydrophilic adsorbents can be used. In the former case, the adsorbents are separated together with the adsorbed metabolite in the same way as the solid constituents together with these from the volatile constituents of the fermentation broth.
  • adsorbents present in dissolved or suspended form are not discharged by the work-up with the adsorbed products.
  • this may e.g. be achieved by choosing a sufficiently small pore size of the filter.
  • Preferred hydrophobic or hydrophilic adsorbents are the adsorbents mentioned above in connection with the preparation of non-volatile microbial metabolites in pseudo-form, in particular kieselguhr, silicic acid, sugars and the abovementioned inorganic and organic alkali metal and alkaline earth metal salts.
  • the product formulation is the shaping by mechanical action, for example by means of extrusion, pelleting or so-called PrN-ling.
  • the metabolic product or the substance mixture containing it which is preferably dried, predried and / or mixed with formulation auxiliaries, is usually pressed through a die or a sieve.
  • the promotion of the product to the die is usually carried out by one or more screws, a muller or other mechanical, eg rotating or longitudinal nal moving, components.
  • the strands arising after passing through the matrix or the sieve can be separated mechanically, for example with a knife, or, if appropriate, disintegrate by themselves into smaller particles.
  • Shaping processes for product formulation that work without matrices are, for example, the compaction and granulation in mixers, for example the so-called "high-shear granulation".
  • the abovementioned molding processes are advantageously used if, by evaporation of a metabolic product-containing suspension and / or by addition of formulation auxiliaries, e.g. Support materials such as starch and adhesive materials such as lignin or polyvinyl alcohol, to such a directly a material is available, which is highly viscous, doughy or granular and thus can be used directly in one of these methods. Otherwise, the required high-viscosity or doughy consistency may also be obtained prior to extrusion, pelleting, compaction, granulation (for example high-shear granulation) or prilling by drying or predrying the metabolic product-containing suspension, e.g.
  • formulation auxiliaries e.g. Support materials such as starch and adhesive materials such as lignin or polyvinyl alcohol
  • the fermentation broth by means of the drying methods described above, are preferably adjusted by means of spray drying.
  • the product thus obtained is mixed with customary formulation auxiliaries known to the skilled worker for this purpose and fed to an extrusion, pelleting, compaction, granulation or prilling.
  • customary formulation auxiliaries known to the skilled worker for this purpose and fed to an extrusion, pelleting, compaction, granulation or prilling.
  • These methods can also be operated so that at least one ingredient of the metabolic product-containing substance mixture is melted before the forming step and solidifies again after the shaping step.
  • Such an embodiment generally requires the addition of customary auxiliaries known to the person skilled in the art for this purpose.
  • the products obtained in this case typically have particle sizes in the range of 500 .mu.m to 0.05 m. By crushing methods such as grinding, optionally in combination with screening, can be obtained from this, if desired, smaller particle sizes.
  • the particles obtained by the shaping formulation processes described can be dried to the desired residual moisture content by the drying methods described above.
  • All metabolic products obtained in one of the above-described ways in solid form or substance mixtures containing them, for example particles, granules and extrudates, can be coated with a coating or a coating, ie coated with at least one further substance layer. Coating takes place, for example, in mixers or fluidized beds in which the particles to be coated are fluidized or "fluidized” and then coated with the coating material or coating material. be sprayed.
  • the coating material can be dry, for example as a powder, or in the form of a solution, dispersion, emulsion or suspension in a solvent, for example water, organic solvents and mixtures thereof, in particular in water. If present, the solvent is removed by evaporation during or after spraying onto the particles.
  • coating materials such as fats can also be applied as melts.
  • Coating materials which can be sprayed on as aqueous dispersion or suspension are e.g. in WO 03/059087.
  • These include, in particular, polyolefins such as polyethylene, polypropylene, polyethylene waxes, waxes, salts such as (earth) alkali metal sulphates, chlorides and carbonates, e.g. Sodium sulfate, magnesium sulfate, calcium sulfate, sodium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, sodium carbonate, magnesium carbonate and calcium carbonate; Acronals, e.g. Butyl acrylate-methyl acrylate copolymer, the styrofan brands from BASF, e.g.
  • the solids content of the coating material is typically in the range from 0.1 to 30% by weight, in particular in the range from 0.2 to 15% by weight and especially in the range from 0.4 to 5% by weight. , in each case based on the total weight of the formulated end product.
  • Coating materials that can be sprayed on as solutions are e.g. Polyethylene glycols, cellulose derivatives such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and ethylcellulose, polyvinyl alcohol, proteins such as gelatin, salts such as (alkaline) alkali metal sulfates, chlorides and carbonates, e.g. Sodium sulfate, magnesium sulfate, calcium sulfate, sodium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, sodium carbonate, magnesium carbonate and calcium carbonate; Carbohydrates such as sugars, e.g. Glucose, lactose, fructose, sucrose and trehalose; Strengths and modified strengths.
  • Polyethylene glycols e.g. Polyethylene glycols, cellulose derivatives such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and ethylcellulose, polyvinyl alcohol, proteins such as gelatin, salts such as (alkaline) alkali metal sulf
  • the solids content of the coating material is typically in the range from 0.1 to 30% by weight, in particular in the range from 0.2 to 15% by weight and especially in the range from 0.4 to 10% by weight. , in each case based on the total weight of the formulated end product.
  • Coating materials which can be sprayed on as a melt are described, for example, in DE 199 29 257 and WO 92/12645. These include in particular polyethylene glycols, synthetic fats and waxes, for example Polygenous WE ® from. BASF, natural fats such as animal fats, for example beeswax, and vegetable fats such as Candelila- wax, fatty acids, for example animal waxes, tallow fatty acid, palmitic acid, stearic acid , triglycerides, Edenor products, Vegeole products, Montanesterwachse such Luwax e ® Fa. BASF.
  • polyethylene glycols synthetic fats and waxes
  • synthetic fats and waxes for example Polygenous WE ® from. BASF
  • natural fats such as animal fats, for example beeswax
  • vegetable fats such as Candelila- wax
  • fatty acids for example animal waxes, tallow fatty acid, palmitic acid
  • the solids content of the coating material is typically in the range from 1 to 30% by weight, in particular in the range from 2 to 25% by weight and especially in the range from 3 to 20% by weight, based in each case on the total weight of the formulated end product.
  • Coating materials which can be used as dry coating powders are e.g. Polyethylene glycols, cellulose and cellulose derivatives such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and ethylcellulose, polyvinyl alcohol, proteins such as gelatin, salts such as (earth) alkali metal sulphates, chlorides and carbonates, e.g. Sodium sulfate, magnesium sulfate, calcium sulfate, sodium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, sodium carbonate, magnesium carbonate and calcium carbonate; Carbohydrates such as sugars, e.g.
  • the bonding of the powder to be applied as coating with the products to be coated can be carried out with the substances which can be sprayed on as solutions or as melts.
  • the spraying of these solutions or melts can be carried out alternately to the introduction of the powder or in parallel.
  • the product to be coated is fluidized in a fluidized bed or a mixer.
  • the powder is then, preferably continuously, fed into the fluidized bed or the mixer for coating.
  • the solution or melt is added to the process space during powder addition.
  • the solution may e.g. supplied via a nozzle or preferably by a nozzle (for example, single-fluid or two-fluid nozzle) are sprayed into the process space.
  • a nozzle for example, single-fluid or two-fluid nozzle
  • the feed point of the powder and the position of the nozzle in the process space are spatially separated from each other, so that the solution or melt predominantly hits the product to be coated and not the powder to be applied.
  • the desired nonvolatile microbial metabolite along with the solid components of the fermentation broth may be similar to the biofuel by-product (referred to therein as "Distiller's Dried Grains with Solubles” (DDGS) and marketed as such)
  • DDGS Disposer's Dried Grains with Solubles
  • a substantially complete or only partial separation of the liquid constituents of the fermentation broth from the solids can take place
  • the proteinaceous by-product obtained can be used both before and after further processing or processing steps as a feed or feed additive for feeding animals, preferably farm animals, particularly preferably cattle, pigs and poultry, very particularly preferably cattle.
  • the entire broth i. including the non-volatile microbial metabolite and the other insoluble or solid constituents, partially concentrated (evaporated) in a single or usually multi-stage evaporation and the solids then being separated from the remaining liquid (liquid phase), e.g. with a decanter.
  • first of all the desired metabolite e.g. by crystallization or precipitation, from the liquid phase to the solid form, so that it is recovered together with the other solids.
  • the solids separated out here generally have a dry matter content in the range from 10 to 80% by weight, preferably 15 to 60% by weight and more preferably 20 to 50% by weight, and may optionally be mixed with conventional, e.g. the drying process described above.
  • the finished formulation obtained by further processing advantageously has a content of at least about 90% by weight of dry substance, so that the risk of spoilage on storage is reduced.
  • the separated liquid phase can be recycled as process water.
  • the proportion of liquid phase not returned to the process can be concentrated in a multistage evaporation to a syrup. If, prior to decanting, the desired metabolite has not been transferred from the liquid to the solid phase, then the resulting syrup also contains the metabolic product.
  • the syrup usually has a content of dry matter in the range of 10 to 90 wt .-%, preferably 20 to 80 wt .-% and particularly preferably 25 to 65 wt .-% to.
  • This syrup is mixed with the solids separated on decantation and then dried. The drying can be done for example by means of drum dryer, spray dryer or paddle dryer, preferably a drum dryer is used.
  • the drying is preferably carried out in such a way that the solid obtained has a content of residual moisture of not more than 30% by weight, preferably not more than 20% by weight, more preferably not more than 10% by weight and very particularly preferably not more than 5% by weight. based on the total dry weight of the resulting solid.
  • the liquid phase separated in this alternative embodiment can be recycled as process water, but also the volatile constituents optionally trapped in the other embodiments described above after their condensation.
  • These recycled parts of the liquid or volatile phase can advantageously be used, for example, wholly or partly in the preparation of the sugar-containing liquid after step a) or used for preparing buffer or nutrient salt solutions for use in the fermentation.
  • the proportion of recirculated process water when preparing the suspension for starch liquefaction is therefore limited to a maximum of 75 wt .-%, preferably at most 60 wt .-% and particularly preferably at most 50 wt .-%.
  • the mean particle sizes of the resulting solids can be varied within a wide range, e.g. from relatively small particles in the range of about 1 to 100 ⁇ m, over average particle sizes in the range of 100 to several hundred ⁇ m, to relatively large particles of about at least 500 ⁇ m or about 1 mm and larger up to several mm, eg up to 10 mm.
  • the mean particle size is usually in the range of 50 to 1000 .mu.m.
  • the average particle size is often in the range of 200 to 5000 ⁇ m.
  • the term "average particle size” here refers to the average value of the maximum particle lengths for the individual particles in the case of non-spherical particles or to the average value of the diameter of spherical or approximately spherical particles When carrying out the process according to the invention, the particle size distributions customary in spray drying are obtained.
  • Another object of the invention is a method as described above, characterized in that (i) the sugar-containing liquid medium obtained in step a2) containing the non-starch-containing solid components of the starch source selected from cereal grains, withdraws a subset of not more than 50% by weight and fermentation with the remainder to produce a first non-volatile metabolite (A ) in solid form; and
  • the separation of the non-starch-containing solid constituents according to (ii) is carried out such that the solids content of the remaining portion of the sugar-containing liquid medium is at most 50% by weight, preferably at most 30% by weight, particularly preferably at most 10% by weight. % and most preferably at most 5 wt .-% is.
  • microorganisms for which certain minimum requirements must be met, e.g. in terms of oxygen transfer rate.
  • microorganisms used in the separate fermentation according to (ii) e.g. Bacillus species, preferably Bacillus subtilis.
  • the compounds produced by such microorganisms in the separate fermentation are in particular among vitamins, cofactors and nutraceuticals, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides, lipids, saturated and unsaturated fatty acids, aromatic compounds, proteins, carotenoids, especially with vitamins, Cofactors and nutraceuticals, proteins and carotenoids and especially selected from riboflavin and calcium pantothenate.
  • a preferred embodiment of this procedure relates to the parallel production of the same metabolites (A) and (B) in two separate fermentations. This is advantageous in particular if different purity requirements are to be set for different applications of the same metabolic product.
  • the cleaning effort in the workup of the metabolite the scope of which requires a higher purity, for example as a food additive, can be reduced.
  • the metabolite B produced by the microorganisms in the fermentation is riboflavin.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources e.g. in WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1 186664 and Fujioka, K .: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
  • part of the sugar-containing liquid medium obtained after step a) is taken off and, according to (ii), by customary methods, e.g. Centrifuge or filtration, completely or partially freed from the solids.
  • the sugar-containing liquid medium obtained therefrom, substantially completely or partially freed from the solids is, according to (ii), subjected to a fermentation to produce a metabolite B, e.g. Riboflavin, fed.
  • the solid stream separated according to (ii) is advantageously returned to the stream of the sugar-containing liquid medium of the large-volume fermentation.
  • the riboflavin-containing fermentation broth produced in this manner according to (ii) can be worked up by analogous conditions and procedures as described for other carbon sources, eg in DE 4037441, EP 464582, EP 438767 and DE 3819745.
  • the separation of the present in crystalline riboflavin preferably by decantation. Other types of solids separation, eg filtration, are also possible.
  • the riboflavin is dried, preferably by means of spray and fluidized bed dryers.
  • the riboflavin-containing fermentation mixture produced according to (ii) can be worked up by analogous conditions and procedures, as described, for example, in EP 1048668 and EP 730034.
  • the fermentation broth is centrifuged here and the remaining solids-containing fraction is centrifuged with a ner mineral acid treated.
  • the riboflavin formed is filtered from the aqueous acidic medium, optionally washed and then dried.
  • the metabolic product B produced by the microorganisms in the fermentation is pantothenic acid.
  • analogous conditions and procedures as described for other carbon sources e.g. in WO 01/021772.
  • the sugar-containing liquid medium which has been pre-purified according to (ii) and is preferably freed from the solids is fed to a fermentation according to (ii) for the production of pantothenic acid.
  • the reduced viscosity compared to the solids-containing liquid medium is particularly advantageous.
  • the separated solids stream is preferably returned to the stream of sugar-containing liquid medium of the large-volume fermentation.
  • pantothenic acid-containing fermentation broth produced according to (ii) may be worked up in analogous conditions and procedures as described for other carbon sources, e.g. in EP 1050219 and WO 01/83799. After pasteurizing the whole fermentation broth, the remaining solids are removed, e.g. separated by centrifugation or filtration. The clarification of the solids separation is partially evaporated, optionally mixed with calcium chloride and dried, in particular spray-dried.
  • the separated solids are obtained in the context of the parallel-operated, large-volume fermentation process together with the particular desired nonvolatile microbial metabolite (A).
  • whole or ground cereal grains preferably corn, wheat, barley, millet, triticale and / or rye may be added to the product formulation.
  • Another object of the invention are solid formulations non-volatile substance change products, which are obtainable by the method described herein.
  • These formulations usually contain in addition to the at least one non-volatile metabolite (constituent A) of the fermentation, biomass from the fermentation (constituent B) and parts or the total amount of the non-starch-containing solid constituents of the starch source (component C).
  • mixtures according to the invention optionally contain the above-mentioned formulation aids such as binders, support materials, powdering / flow aids, colorants, biocides, dispersants, antifoaming agents, viscosity regulators, acids, alkalis, antioxidants, enzyme stabilizers, enzyme inhibitors, adsorbates, fats, fatty acids, oils and like.
  • formulation aids such as binders, support materials, powdering / flow aids, colorants, biocides, dispersants, antifoaming agents, viscosity regulators, acids, alkalis, antioxidants, enzyme stabilizers, enzyme inhibitors, adsorbates, fats, fatty acids, oils and like.
  • the amount of metabolite typically makes up more than 10% by weight, e.g. B.> 10 to 80 wt .-%, in particular 20 to 60 wt .-%, based on the total amount of the components A, B and C from. Based on the total weight of the formulation, the amount of metabolic product is typically 0.5 to 80 wt .-%, in particular 1 to 60 wt .-%, based on the total weight of the formulation.
  • the amount of biomass from the fermentation producing the nonvolatile metabolite is typically from 1 to 50% by weight, in particular from 10 to 40% by weight, based on the total amount of constituents A, B and C, or from 0.5 to 50 wt .-%, in particular 2 to 40 wt .-%, based on the total weight of the formulation.
  • the amount of non-starchy solid constituents of the starch source from the fermentation broth is generally at least 1% by weight and in particular from 5 to 50% by weight, based on the total amount of constituents A, B and C, or at least 0, 5 wt .-%, in particular at least 2 wt .-%, for example in the range of 2 to 50 wt .-%, in particular 5 to 40 wt .-%, based on the total weight of the formulation.
  • the amount of formulation auxiliaries will generally be up to 400% by weight, based on the total weight of components A, B and C, and is often in the range from 0 to 100% by weight, based on the total amount of constituents A, B and C, or in the range of 0 to 80 and in particular 1 to 30 wt .-%, based on the total weight of the formulation.
  • the formulations according to the invention are in solid form and are typically in the form of powders, granules, pellets, extrudates, compactates or agglomerates.
  • the formulations according to the invention typically comprise dietary fibers, which result firstly from the solid constituents of the starch source and which are also used as extenders / carriers in the preparation of the formulations of the invention.
  • fiber within the meaning of the invention, reference is made to the report of the American Association of Cereal Chemists (AACC) of Cereal Foods World (CFW), 46 (3), "The Definition of Dietary Fiber ", 2001, pp. 112-129, especially pp. 12, 113 and 118.
  • the content of fiber is usually at least 1 wt .-%, in particular at least 5 wt .-%, especially at least 10 wt .-% and is often in the range of 1 to 60 wt .-%, in particular 5 to 50 wt. -%, and especially in the range of 10 to 40 wt .-%, each based on the total weight of the formulation.
  • Fiber content is generally determined by a standard method of the AACC (American Association of Cereal Chemists, 2000. Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists, 10th ed., Method 32-25, Total dietary fiber determined as neutral sugar residues). uronic acid residues, and Klason lignin (Uppsala method), The Association, St. Paul, MN).
  • the mixtures according to the invention have a high protein content, which substantially corresponds to biomass B. Further proportions of the protein content can also originate from the starch source used.
  • the protein content is typically in the range of 20 to 70% by weight, based on the total weight of the formulation.
  • the intrinsic content of protein (especially component B) and fiber (especially component C) is useful for various formulation methods, e.g. in the case of oily metabolites, in particular with regard to drying steps used here advantageous.
  • the formulations according to the invention advantageously contain one or more essential amino acids, in particular at least one amino acid selected from lysine, methionine, threonine and tryptophan.
  • the essential amino acids in particular those mentioned, if present, are generally present in each case in an amount which is increased compared to a conventional DDGS by-product obtained in a fermentative bioethanol production, in particular by a factor of at least 1.5.
  • the formulation generally has a content of lysine of at least 1% by weight, in particular in the range of 1 to 10% by weight and especially in the range of 1 to 5% by weight.
  • % a content of methionine of at least 0.8 wt .-%, in particular in the range of 0.8 to 10 wt .-% and especially in the range of 0.8 to 5 wt .-%, a GE at least 1, 5 wt .-%, in particular in the range of 1, 5 to 10 wt .-% and especially in the range of 1, 5 to 5 wt .-% and / or a content of tryptophan of at least 0 to threonine , 4 wt .-%, in particular in the range of 0.4 to 10 wt .-% and especially in the range of 0.4 to 5 wt .-%, each based on the total dry weight of the formulation on.
  • the formulations of the invention usually contain a small amount of water, often in the range of 0 to 25 wt .-%, in particular in the range of 0.5 to 15 wt .-%, especially in the range of 1 to 10 wt .-% and completely especially in the range from 1 to 5% by weight of water, in each case based on the total weight of the formulation.
  • the formulations of the invention are for use in animal or human nutrition, e.g. as such or as an additive or supplement, also in the form of premixes suitable.
  • the amino acids e.g. Lysine, glutamate, methionine, phenylalanine, threonine or tryptophan
  • Vitamins e.g. Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin Be, or Vitamin B12
  • Carotenoids e.g. Astaxanthin or cantaxanthin
  • Sugar e.g. trehalose
  • organic acids e.g. Fumaric acid, included.
  • formulations according to the invention are also suitable for use in the textile, leather, pulp and paper industries.
  • formulations which contain as metabolites enzymes such as amylases, pectinases and / or acid, hybrid or neutral cellulases; in the field of leather in particular those containing enzymes such as lipases, pancreases or proteases; and in the pulp and paper industry in particular those containing enzymes such as amylases, xylanases, cellulases, pectinases, lipases, esterases, proteases, oxidoreductases, e.g. Laccase, catalase and peroxidase.
  • the millbases used in the following were produced as follows. Whole corn kernels were completely ground using a rotor mill. Under use Different beaters, grinding tracks and screen installations were achieved three different subtleties. A sieve analysis of the material to be ground using a laboratory vibrating sieve (vibration analysis machine: Retsch Vibrotronic type VE1, sieving time 5 min, amplitude: 1.5 mm) gave the results listed in Table 1.
  • the reaction mixture was held at this temperature for about 100 minutes. Subsequently, a further 2.4 g of Termamyl 120 L were added and the temperature was maintained for about 100 minutes. The progress of liquefaction was monitored during the iodine-starch reaction time course. The temperature was finally raised to 100 ° C and the reaction mixture boiled for a further 20 min. To There was no strength to prove at that time. The reactor was cooled to 35 ° C.
  • the reaction mixture obtained from 11.1 a) was heated to 61 ° C. with constant stirring. Stirring was continued throughout the experiment. After adjusting the pH to 4.3 with H2SO4, 10.8 g (9.15 ml) of dextrozyme GA (Novozymes A / S) was added. The temperature was maintained for about 3 hours, following the progress of the reaction with glucose test bars (S-Glucotest from Boehringer). The results are shown in Table 2 below. Subsequently, the reaction mixture was heated to 80 ° C and then cooled. There were about 1 180 g of liquid product having a density of about 1, 2 kg / l and a determined by means of infrared dryer dry matter content of about 53.7 wt .-%. The content of dry matter (without water-soluble ingredients) was about 14 wt .-% after washing with water. The proportion of glucose in the reaction mixture determined by HPLC was 380 g / l (see Table 2, Sample No. 7).
  • a dry milled corn meal sample is liquefied in accordance with 11.1 a).
  • the negative for starch tested mixture is then brought to 61 ° C for the following saccharification reaction.
  • the pH is adjusted to 4.3 by addition of 50% sulfuric acid. In the course of the reaction, the pH is kept at this value.
  • the temperature is kept at 61 ° C.
  • the reaction is allowed to proceed for one hour.
  • To inactivate the enzyme the mixture is heated to 85 ° C.
  • the hot mixture is filled into sterile containers and stored after cooling at 4 ° C. A final concentration of glucose of 420 g / l was achieved.
  • the addition of further flour is begun.
  • the mash is added with 0.13 ml CaCb stock solution to maintain the Ca 2+ concentration at 70 ppm.
  • the temperature is constant at 85 ° C. Wait at least 10 minutes to ensure a complete reaction before adding another portion (40 g flour and 0.1 ml CaCb stock solution).
  • 1.1 ml of Termamyl are added; then add another portions (40 g flour and 0.1 ml CaCb stock solution). It is achieved a content of dry matter of 55 wt .-%.
  • the temperature is raised to 100 ° C and the mash is boiled for 10 min.
  • the mixture tested negative for starch is then brought to 61 ° C for the following saccharification reaction.
  • the pH is adjusted to 4.3 by addition of 50% sulfuric acid. In the course of the reaction, the pH is kept at this value.
  • the temperature is kept at 61 ° C.
  • the reaction is allowed to proceed for one hour.
  • To inactivate the enzyme the mixture is heated to 85 ° C.
  • the hot mixture is filled into sterile containers and stored after cooling at 4 ° C. A final glucose concentration of 370 g / l was achieved.
  • a modified strain of Corynebacterium glutamicum was used, which was described under the name ATCC13032 lysC fbr in WO 05/059144.
  • Example 11.1 Two maize meal hydrolysates obtained according to Example 11.1 were used in shake flask experiments using Corynebacterium glutamicum (flasks 4-9). In addition, a wheat flour hydrolyzate prepared analogously to Example 11.1 (flasks 1-3) was used in parallel.
  • compositions of the piston media 1 to 9 are listed in Table 5.
  • lysine was produced in comparable amounts on the order of about 30 to 40 g / L, corresponding to the yield achieved in a standard fermentation with glucose broth.
  • a lysine-containing broth having a solids content of about 20 wt .-% obtained from a maize meal suspension analogously to Example 1 a and 1 b
  • a peristaltic pump type: ISM444, Ismatec
  • the spray pressure was 4 bar.
  • Sipernat S22 were added.
  • the inlet temperature was 95 ° C to 100 ° C.
  • the delivery rate of the pump was adjusted so that the temperature of the product was not substantially below 50 ° C.
  • the walls of the spray tower were moderately coated with lysine during spray drying.
  • the dry powder obtained is optically fine and readily flowable. There were obtained 23 g of dry powder.
  • the pH of the suspension obtained was about 7. This was added to about 950 g in a Lödigemischer presented corn starch (Roquette) and mixed at about 100-350 rpm.
  • the floury, moist dough-like product taken from the mixer with a temperature of about 30 ° C. was then fed to a DOME extruder (Fuji Paudal Co.). Ltd.) and extruded at a temperature of less than 30 ° C.
  • DOME extruder Fluji Paudal Co.). Ltd.
  • the product obtained in the extrusion was dried in a fluid bed dryer from BUCHI for 120 minutes at a product temperature of less than 60 ° C. There were obtained 600 g of granules.
  • Aeromatic MP-1 from Niro Aeromatic, hole surface of the perforated bottom: 12% (12% FF)
  • 500 g of Na 2 SO 4 were initially charged and heated to a temperature of 50 ° C.
  • 998 g of a lysine-containing broth having a solids content of about 20% by weight obtained from a maize meal suspension analogous to example 1a and 1b
  • the spraying pressure was 1.5 bar and the spraying operation was continued after the addition of 278 g and the addition of a further 320 g of the lysine-containing broth (corresponding to a proportion of 10) or 20% by weight of sprayed fermentation solid, based on the total solids in the fluidized bed apparatus), in each case for intermediate drying and sampling (50 g each)
  • the feed quantity was set in the range of about 45 to 60 m 3 / h and during drying The temperature of
  • 240 g of a lysine-containing broth having a solids content of about 20% by weight were introduced into a 500 ml round-bottomed flask and then placed on a rotary evaporator under slightly reduced pressure (880 to 920 mbar).
  • the bath temperature was 140-145 ° C. After about 40 minutes.
  • the coating formed on the piston wall was mechanically comminuted and the drying continued and after a further 40 min. a renewed comminution made. The drying was then continued and occasionally interrupted to further crush the residue.
  • the total drying time was 2.5 h.
  • the granules obtained are dark brown and good flowable.
  • the residual moisture of the granules was 3%. Only small amounts of granules adhered to the bulb wall.
  • the samples are then incubated at 200 rpm and 30 ° C. in a humidified shaking cabinet (85% relative humidity) for 48 hours.
  • the concentration of lysine in the media is determined by HPLC. In all cases, approximately equal amounts of lysine were produced.
  • the lysine-containing fermentation broths thus obtained were processed according to Example 1 c.2) to form an extrudate.
  • a corn flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask experiments using Corynebacterium glutamicum (ATCC13032 lysC fbr ) (flasks 1 + 2).
  • a wheat flour hydrolyzate prepared analogously to Example II.3 (flasks 3 + 4) and rye flour hydrolyzate (flasks 5 + 6) were used in parallel.
  • compositions of the piston media 1 to 6 are listed in Table 8.
  • lysine was produced in comparable amounts on the order of about 10 to 12 g / l, corresponding to the yield achieved in a standard fermentation with glucose broth.
  • the lysine-containing fermentation broths thus obtained were processed according to Example 1 c.1) to form a flowable powder.
  • a corn flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask experiments (flasks 1-3). Bacillus PA824 was used as the panthothenate-producing strain (detailed description in WO 02/061108).
  • a wheat flour hydrolyzate prepared analogously to Example II.3 (flasks 4-6) and rye flour hydrolyzate (flasks 7-9) were used in parallel.
  • compositions of the piston media 1 to 9 are listed in Table 11.
  • the flasks were incubated for 24 hours at 43 ° C and with agitation (250 rpm) in a humidified shaker cabinet.
  • the content of glucose and pantothenic acid was determined by HPLC.
  • the determination of glucose was carried out using an Aminex HPX-87H column from Bio-Rad.
  • the determination of the pantothenic acid concentration was carried out by separation on an Aqua C18 column from Phenomenex. The results are summarized in Table 12.
  • pantothenic acid was produced in comparable amounts on the order of about 1.5 to 2 g / L, corresponding to the yield achieved in a standard fermentation with glucose broth.
  • the pantothenic acid-containing fermentation broths thus obtained were partially processed according to Example 1 c.3) into an agglomerate or according to Example 1 c.4) on to a dry, coarse-particle powder.
  • a corn flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask experiments using Aspergillus niger (flasks 1-3).
  • a wheat flour hydrolyzate prepared analogously to Example II.3 (flask 4-6) and rye flour hydrolyzate (flask 7-9) were used in parallel.
  • An Aspergillus niger phytase production strain with 6 copies of the phyA gene from Aspergillus ficuum under the control of the glaA promoter was generated analogously to the preparation of NP505-7 described in detail in WO98 / 46772.
  • the control used was a strain with 3 modified glaA amplicons (analogous to ISO 505) but without integrated phyA expression cassettes.
  • compositions of the piston media 1 to 9 are listed in Table 14. Instead of flour hydrolyzate, an appropriate amount of glucose solution was used in the control medium.
  • the phytase-containing fermentation broths thus obtained were processed into a powder according to Example 1c.1) and into a particulate agglomerate according to Example 1c.3).
  • a corn flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask experiments using Ashbya gossypii (flasks 1-4).
  • a wheat flour hydrolyzate prepared analogously to Example II.3 (flask 5-8) and rye flour hydrolyzate (flask 9-12) were used in parallel. 6.1) strain
  • the riboflavin-producing strain used is an Ashbya gossypii ATCC 10895 (see also Schmidt G, et al., Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and Oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overproductor Ashbya gossypii.) Microbiology 142: 41 1-417, 1996).
  • the cells are incubated after streaking on sterile HMG agar (composition: see Table 16, 20 min at 121 ° C) for 72 h at 28 ° C.
  • 50 ml of the preculture medium (see Table 17) are inoculated into 250 ml Erlenmeyer flasks with two baffles each with one inoculation of cells and incubated for 24 h at 28 ° C. with agitation (180 rpm) in a humidified shaker.
  • compositions of piston media 1 to 12 are listed in Table 18. Instead of flour hydrolyzate, an appropriate amount of glucose solution was used in the control medium.
  • the thus obtained vitamin B2-containing fermentation broths were processed according to Example 1 c.1) to a powder and according to Example 1c.3) to a particulate agglomerate.
  • a corn flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask experiments using Corynebacterium glutamicum (flasks 1-3).
  • a wheat flour hydrolyzate prepared analogously to Example II.3 (flasks 4-6) and rye flour hydrolyzate (flasks 7-9) were used in parallel.
  • Corynebacterium strains producing methionine are known to those skilled in the art. The preparation of such strains is e.g. in Kumar D. Gomes J. Biotechnology Advances, 23 (1): 41-61, 2005; Kumar D. et al., Process Biochemistry, 38: 1 165-1171, 2003; WO 04/024933 and WO 02/18613.
  • compositions of piston media 1 to 9 are listed in Table 21.
  • control medium instead of flour hydrolyzate an appropriate amount of glucose solution was used.
  • the methionine-containing fermentation broths thus obtained were processed according to Example 1 c.4) into a coarse-particle powder.
  • a corn flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a was used in shake flask experiments using Bacterium 130Z.
  • the succinate-producing strain used was Bacterium 130Z (ATCC No. 55618).
  • composition of the medium is listed in Table 23 (see US 5,504,004).
  • control medium instead of flour hydrolyzate, a corresponding amount of glucose solution was used (final concentration of glucose: 100 g / l).
  • a corn flour hydrolyzate obtained according to Example II.3a is used in shake flask experiments using Escherichia coli (flasks 1-3).
  • a wheat flour hydrolyzate prepared analogously to Example II.3 (flasks 4-6) and rye flour hydrolyzate (flasks 7-9) are used in parallel.
  • Escherichia coli strains producing L-threonine are known to those skilled in the art.
  • the preparation of such strains is e.g. in EP 1013765 A1, EP 1016710 A2, US 5,538,873.
  • the cells are streaked on sterile LB agar. Antibiotics are added to the LB agar if suitable resistance genes exist as markers in the corresponding strain. For example, kanamycin (40 ⁇ g / ml) or ampicillin (100 mg / l) may be used. be used. The strains are incubated for 24 h at 30 ° C. The cells are incubated after plating on sterile M9 glucose minimal medium with methionine (50 ⁇ g / ml), kanamycin (40 ⁇ g / ml) and homoserine (10 ⁇ g / l) for 24 h at 30 ° C. The cells are then scraped off the plates and resuspended in saline.
  • suitable resistance genes exist as markers in the corresponding strain.
  • kanamycin 40 ⁇ g / ml
  • ampicillin 100 mg / l
  • the strains are incubated for 24 h at 30 ° C.
  • the cells are
  • compositions of piston media 1 to 9 are listed in Table 25.
  • control medium instead of flour hydrolyzate an appropriate amount of glucose solution is used.
  • the threonine-containing fermentation broths thus obtained were further processed according to Examples 1 c.1) to 1 c.3) to form a powder, an extrudate or an agglomerate.
  • the thus obtained amino acid-containing fermentation broths can be further processed according to Example 1c.1) to 1c.3) to a dry product.
  • a partially saccharified corn flour hydrolyzate was used in shake flask experiments using Aspergillus niger.
  • Example 5.1 The strain used in Example 5.1 was used.
  • the inoculum was prepared as described in Example 5.2).
  • To prepare the fermentation broth the compositions of the piston medium listed in Table 29 were used. From each sample, two flasks were set up.
  • the phytase-containing fermentation broths thus obtained were processed according to Examples 1 c.2) and 1c.3) to form an extrudate or an agglomerate.
  • a partially saccharified corn flour hydrolyzate was used in shake flask experiments using Corynebacterium glutamicum.
  • Example 3 The strain used in Example 3 was used. The preparation of the inoculum was carried out as described in Example 3.1).
  • compositions of the piston medium listed in Table 31 were used. From each sample, three flasks were set up.
  • the lysine-containing fermentation broths thus obtained were processed according to Examples 1 c.1) or 1 c.4) to form a powder or granules.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines nicht-flüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts in fester Form durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, wobei man einen die gewünschten Stoffwechsel produkte produzierenden Mikroorganismenstamm mit einem zuckerhaltigen Flüssigmedium, das einen Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums, aufweist, kultiviert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei man das zuckerhaltige Flüssigmedium herstellt durch: a1 ) Vermählen einer unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequelle; und a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms, wobei man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmenge des Mahlguts kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt. Weiterhin betrifft die Erfindung eine durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche feste Formulierung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts; sowie die Verwendung einer solchen festen Formulierung als Zusatz- oder Ergänzungsstoff für die Tier- oder Humanernährung bzw. für die Textil-, Leder-, Zellstoff-, Papier- oder O- berflächenbehandlung.

Description

Fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte in fester Form
Die vorliegende Erfindung betrifft die fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobiel- ler Stoffwechselprodukte in fester Form durch Vermählen, Verflüssigen und Verzuckern von unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequellen und den Einsatz des dadurch gewonnenen zuckerhaltigen Flüssigmediums zur Fermentation.
Verfahren zur Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte wie z.B. Aminosäuren, Vitamine und Carotinoide durch mikrobielle Fermentation sind allgemein bekannt. In Abhängigkeit von den verschiedenen Verfahrensbedingungen werden dabei unterschiedliche Kohlenstoffquellen genutzt. Diese reichen von reiner Saccharose über Rüben- und Zuckerrohrmelasse, sogenannten „ high test molasses" (invertierte Zuckerrohrmelasse) bis hin zu Glucose aus Stärkehydrolysaten. Für die biotechnologi- sehe Herstellung von L-Lysin werden darüber hinaus Essigsäure und Ethanol als großtechnisch einsetzbare Co-Substrate genannt (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufac- ture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59-1 12).
Auf Basis der genannten Kohlenstoffquellen sind verschiedene Methoden und Vorgehensweisen zur zuckerbasierten, fermentativen Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte etabliert. Am Beispiel des L-Lysins werden diese beispielsweise von Pfefferle et al. (a.a.O.) im Hinblick auf Stammentwicklung, Prozessentwicklung und großtechnische Produktion beschrieben.
Eine wichtige Kohlenstoffquelle für die durch Mikroorganismen vermittelte fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte ist Stärke. Diese muss in vorgelagerten Reaktionsschritten zunächst verflüssigt und verzuckert werden, bevor sie als Kohlenstoffquelle in einer Fermentation genutzt werden kann. Hierzu wird die Stärke aus einer natürlichen Stärkequelle wie Kartoffeln, Cassava, Getreide, z.B. Weizen, Mais, Gerste, Roggen, Triticale oder Reis üblicherweise in vorgereinigter Form gewonnen und anschließend enzymatisch verflüssigt und verzuckert, um dann in der eigentlichen Fermentation zur Produktion der gewünschten Stoffwechselprodukte eingesetzt zu werden.
Neben dem Einsatz derartig vorgereinigter Stärkequellen ist auch die Verwendung nicht-vorbehandelter Stärkequellen zur Herstellung von Kohlenstoffquellen für die fermentative Produktion nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte beschrieben worden. Typischerweise werden die Stärkequellen dabei zunächst durch Mahlen zerkleinert. Das Mahlgut wird dann einer Verflüssigung und Verzuckerung unterworfen. Da dieses Mahlgut naturgemäß neben Stärke noch eine Reihe von nicht-stärkehaltigen Bestandteilen enthält, die die Fermentation nachteilig beeinflussen, werden diese Be- standteile üblicherweise vor der Fermentation abgetrennt. Die Entfernung kann entweder direkt nach dem Mahlen (WO 02/277252; JP 2001-072701 ; JP 56-169594; CN 12181 11 ), nach der Verflüssigung (WO 02/277252; CN 1173541) oder im Anschluss an die Verzuckerung (CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229) erfolgen. In allen Varianten wird jedoch ein weitgehend reines Stärkehydrolysat in der Fermentation eingesetzt.
Neuere Techniken befassen sich insbesondere mit verbesserten Methoden, die vor der Fermentation eine Aufreinigung z.B. von verflüssigten und verzuckerten Stärkelösungen (JP 57159500) und von Fermentationsmedien aus erneuerbaren Ressourcen (EP 1205557) ermöglichen sollen.
Unaufbereitete Stärkequellen finden hingegen bekanntermaßen in großem Umfang Einsatz bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol. Dabei ist das als „ Dry- milling" bekannte Verfahren des trockenen Vermahlens, Verflüssigens und Verzu- ckerns von Stärkequellen technisch in großem Maßstab etabliert. Entsprechende Prozessbeschreibungen finden sich z.B. in „ The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries" , Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, und in McAloon et al., „ Determining the cost of producing ethanol from com starch and lignocellulosic feedstocks" , NREL/TP-580- 28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
Bei den Dry-milling-Verfahren werden im ersten Schritt ganze Getreidekörner fein ver- mahlen, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse und Roggen. Im Gegensatz zum sogenannten „ Wet-Milling" -Verfahren wird dabei keine zusätzliche Flüssigkeit zugesetzt. Das Zermahlen in feine Bestandteile dient dazu, die in den Körnern enthaltene Stärke in der nachfolgenden Verflüssigung und Verzuckerung der Einwirkung von Wasser und Enzymen zugänglich zu machen.
Da bei der fermentativen Herstellung von Bioethanol das Wertprodukt durch Destillation gewonnen wird, stellt der Einsatz von Stärkequellen aus dem Dry-Milling-Prozess in nicht vorgereinigter Form kein spezielles Problem dar. Bei der Anwendung eines Dry- Milling-Verfahrens zur Produktion nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechsel produkte ist jedoch der über die Zuckerlösung in die Fermentation eingetragene Feststoffstrom problematisch, da dieser sich sowohl negativ auf die Fermentation auswirken kann als auch die anschließende Aufarbeitung nicht unerheblich erschweren kann.
So ist für viele Fermentationen die Sauerstoffversorgung der eingesetzten Mikroorganismen, insbesondere wenn diese einen hohen Sauerstoffbedarf haben, ein limitierender Faktor. Über den Einfluss hoher Feststoffkonzentrationen auf den Sauerstoffübergang von der Gas- in die Flüssigphase und somit auf die Sauerstofftransferrate ist all- gemein wenig bekannt. Es ist andererseits bekannt, dass eine mit zunehmender Feststoffkonzentration ansteigende Viskosität zu einer verminderten Sauerstofftransferrate führt. Werden darüber hinaus oberflächenaktive Substanzen mit den Feststoffen in das Fermentationsmedium eingetragen, so beeinflussen diese die Koalugationsneigung der Gasblasen. Die dadurch resultierende Blasengröße beeinflusst ihrerseits maßgeblich den Sauerstofftransfer (Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreac- tors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370).
Durch den Feststoff ei ntrag kann in Bezug auf die Viskosität der verwendeten Medien bereits bei der Herstellung der stärkehaltigen Suspension ein kritischer Wert erreicht werden, weil z.B. eine Suspension mit mehr als 30 Gew.-% Maismehl in Wasser nicht mehr homogen mischbar ist (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T. Godfrey, S. West, 1996). Dadurch ist bei herkömmlichem Vorgehen die Glucosekonzentration begrenzt. Aus verfahrensökonomischen Gründen ist es in der Regel nachteilig, mit Lösungen geringerer Konzentration zu arbeiten, weil dies zu einer überproportionalen Verdün- nung der Fermentationsbrühe führt. Dadurch sinkt die erreichbare Endkonzentration der Zielprodukte, was zusätzliche Kosten bei deren Gewinnung aus dem Fermentationsmedium verursacht, und die Raum-Zeit-Ausbeute nimmt ab, was bei gleicher Produktionsmenge zu einem größeren Volumenbedarf, d.h. zu höheren Investitionskosten, führt.
Aufgrund dieser Schwierigkeiten eignen sich bisher bekannte Varianten des Dry- Milling-Verfahrens nicht zur Bereitstellung von Stärkequellen für die fermentative Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte und sind daher ohne wesentliche wirtschaftliche Bedeutung. Versuche zur Übertragung des Dry-Milling-Konzepts und der mit diesem Verfahren verbundenen prinzipiellen Vorteile auf die großtechnische Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte sind bisher lediglich unter Verwendung von Cassava als Stärkequelle beschrieben worden. So beschreibt die JP 2001/275693 ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, bei dem man als Stärkequelle geschälte Cassavaknollen einsetzt, die trocken vermählen wurden. Zur Durchführung des Verfahrens ist es jedoch erforderlich, eine Teilchengröße des Mahlgutes von < 150 μ m einzustellen. Bei der dazu ange- wendeten Filtration werden mehr als 10 Gew.-% des eingesetzten Mahlguts, einschließlich nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Verflüssigung/Verzuckerung der enthaltenen Stärke und der anschließenden Fermentation abgetrennt. Ein ähnliches Verfahren wird in der JP 2001/309751 zur Herstellung eines aminosäurehaltigen Futterzusatzes beschrieben.
Cassava sollte jedoch im Vergleich zu anderen Stärkequellen, insbesondere Getreide bzw. Getreidekörnern, für das Dry-Milling relativ unproblematisch sein. Während der Stärkeanteil der Cassavawurzel in trockenem Zustand typischerweise wenigstens 80 Gew.-% beträgt (Menezes et al., Fungal celluloses as an aid for the saccharification of Cassava, Biotechnology and Bioengineering, Bd. 20 (4), 1978, John Wiley and Sons, Inc., Tabelle 1 , Seite 558), liegt der Trockengehalt an Stärke im Vergleich dazu bei Getreide deutlich niedriger, in der Regel unterhalb 70 Gew.-%, z.B. bei Mais bei etwa 68 Gew.-% und bei Weizen bei etwa 65 Gew.-% (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.). Dementsprechend enthält die nach Verflüssigung und Verzuckerung erhaltene Glucoselösung bei Einsatz von trocken vermahlener Cassava vergleichsweise wenig Fremdbestandteile und insbesondere wenig Feststoffe. Diese Fremdbestandteile und insbesondere die nicht-stärkehaltigen Feststoffe erweisen sich bei Einsatz von Getreidekörnern als Stärkequelle als problematisch, da ihr Anteil in diesen Stärkequellen deutlich höher ist als in Cassava. Durch die erhöhte Menge an Fremdbestandteilen wird nämlich die Viskosität der Reaktionsmischung wesentlich erhöht.
Stärke aus Cassava sollte jedoch relativ leicht zu verarbeiten sein. Zwar weist sie im Vergleich zu Maisstärke eine höhere Viskosität bei der Quellungstemperatur auf, dafür nimmt die Viskosität jedoch bei ansteigender Temperatur bei Cassava schneller ab als beispielsweise bei Maisstärke (Menezes, T.J.B, de, Saccharification of Cassava for ethyl alcohol production, Process Biochemistry, 1978, Seite 24, rechte Spalte). Darüber hinaus sind die Quellungs- und Gelatinierungstemperaturen von Stärke aus Cassava niedriger als die von Stärke aus Getreide wie Mais, weshalb sie leichter für bakterielle α-Amylase zugänglich ist als Getreidestärke (Menezes, T.J.B, de, a.a.O.).
Weitere Vorteile von Cassava gegenüber Stärkequellen aus Getreide sind ihr geringer Cellulosegehalt und ihr niedriger Phytatgehalt. Cellulose und Hemicellulose können insbesondere unter sauren Verzuckerungsbedingungen in Furfurale umgewandelt wer- den (Jaques et al., The Alcohol Textbook, s.o.; Menezes, T.J.B, de, s.o.), die ihrerseits auf die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen eine inhibierende Wirkung haben können. Phytat inhibiert ebenfalls die für die Fermentation eingesetzten Mikroorganismen.
Während es somit technisch möglich ist, Cassava als Stärkequelle in einem dem Dry- milling entsprechenden Verfahren zu verarbeiten, so ist ein solches Verfahren auf Basis von Cassava dennoch komplex, nicht optimiert und daher nicht weit verbreitet. Über den Einsatz von Getreide als Stärkequelle in einem dem Dry-Milling-Prozess entspre- chenden Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien wie nichtflüchtigen mikrobiel- len Stoffwechselprodukten wurde bislang nicht berichtet.
Die WO2005/116228 beschreibt erstmalig ein zuckerbasiertes Fermentationsverfahren zur mikrobiellen Herstellung von Feinchemikalien, bei dem als Stärkequelle ein Mahl- gut von Getreidekörnern oder anderen trockenen Kornfrüchten oder Samen eingesetzt wird, ohne dass die nicht-stärkehaltigen Bestandteile vor der Fermentation entfernt werden. Eine weitgehende Entfernung der flüchtigen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe unter Erhalt eines das Fermentationsprodukt enthaltenden Feststoffs wird nicht beschrieben.
Es war Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizientes Verfahren zur zuckerbasierten fermentativen Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte bereitzustellen, das die Verwendung von Getreide, einschließlich Mais, als Stärkequelle erlaubt. Das Verfahren sollte eine leichte Aufarbeitung des Fermentationsgemisches, insbesondere mittels eines Trocknungsverfahrens, ermöglichen. Außerdem sollte es sich durch eine leichte Handhabbarkeit der verwendeten Medien auszeichnen und insbesondere aufwändige Vor- oder Aufreinigungsschritte, wie etwa die Abtrennung fester nicht-stärkehaltiger Bestandteile, vor der Fermentation vermeiden.
Im Rahmen der von der Anmelderin durchgeführten Arbeiten wurde überraschend gefunden, dass ein solches Verfahren trotz des inhärent erhöhten Feststoffeintrags effizient durchführbar ist, indem man zur Herstellung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums ein aus Getreidekörnern gewonnenes Mahlgut in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms verflüssigt und anschlie- ßend unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms verzuckert, wobei man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmenge des Mahlguts im Verlauf der Verflüssigung kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung wenigstens eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts in fester Form durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, wobei man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselpro- dukt(e) produzierenden Mikroorganismenstamm unter Verwendung eines zuckerhalti- gen Flüssigmediums, das einen Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums, aufweist, kultiviert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei man das zuckerhaltige Flüssigmedium herstellt durch:
a1 ) Herstellung eines Mahlguts durch Vermählen vermählen einer unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequelle; und
a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Ver- wendung mindestens eines verzuckernden Enzyms,
dadurch gekennzeichnet, dass man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmenge des Mahlguts im Verlauf des Verflüssigens kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt.
Als Stärkequelle kommen vor allem trockene Kornfrüchte oder Samen in Betracht, die in getrocknetem Zustand mindestens 40 Gew.-% und bevorzugt mindestens 50 Gew.- % Stärkeanteil aufweisen. Diese finden sich in vielen der heutzutage in großem Maßstab kultivierten Getreidepflanzen wie Mais, Weizen, Hafer, Gerste, Roggen, Triticale, Reis und verschiedenen Hirsesorten, z.B. Sorghum und MiIo. Bevorzugt ist die Stärkequelle unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern ausgewählt. Grundsätzlich lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit analogen Stärkequellen durchführen, wie beispielsweise einer Mischung verschiedener stärkehaltiger Kornfrüchte oder Samen.
Bei den im erfindungsgemäß hergestellten zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltenen Zuckern handelt es sich im Wesentlichen um Monosaccharide wie Hexosen und Pentosen, z.B. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Sorbose, Xylose, Arabinose und Ribose, insbesondere um Glucose. Der Anteil an von Glucose verschiedenen Mono- sacchariden kann abhängig von der verwendeten Stärkequelle und den darin enthaltenen nicht-stärkehaltigen Bestandteilen variieren und durch die Verfahrensführung, beispielsweise durch Aufschluss von Cellulosebestandteilen durch Zusatz von Cellulasen, beeinflusst werden. Vorteilhafterweise umfassen die Monosaccharide des zuckerhalti- gen Flüssigmediums einen Anteil an Glucose von mindestens 60 Gew.-%, bevorzugt mindestens 70 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 80 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge. Üblicherweise liegt der Glucoseanteil im Bereich von 75 bis 99 Gew.-%, insbesondere von 80 bis 97 Gew.-% und speziell von 85 bis 95 Gew.-%, bezogen auf die in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium enthaltene gesamte Zuckermenge.
Die Konzentration an Monosacchariden, speziell die Glucosekonzentration, im erfindungsgemäß hergestellten Flüssigmedium beträgt häufig wenigstens 25 Gew.-%, vor- zugsweise wenigstens 30 Gew.-%, besonders bevorzugt wenigstens 35 Gew.-%, insbesondere wenigstens 40 Gew.-%, z.B. 25 bis 55 Gew.-%, insbesondere 30 bis 52 Gew.-%, besonders bevorzugt 35 bis 50 Gew.-% und speziell 40 bis 48 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums.
Erfindungsgemäß enthält das zuckerhaltige Flüssigmedium, mit welchem der die gewünschten Stoffwechselprodukte produzierende Mikroorganismenstamm kultiviert wird, zumindest einen Teil, vorzugsweise wenigstens 20 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-%, speziell wenigstens 90 Gew.-% und ganz speziell wenigstens 99 Gew.-% der in den vermahlenen Getreidekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Be- standteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts (und damit auf die Menge an Monosaccharid im zuckerhaltigen Flüssigmedium) beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile in dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 25 Gew.-%, z.B. 25 bis 75 Gew.-% und speziell 30 bis 60 Gew.-%.
Zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums wird im Schritt a1 ) die jeweilige Stärkequelle mit oder ohne Zusatz von Flüssigkeit, z.B. Wasser, vermählen, bevorzugt ohne Zusatz von Flüssigkeit. Es kann auch eine Trockenvermahlung mit einer anschließenden Nassvermahlung kombiniert werden. Zur trockenen Vermahlung werden typischerweise Hammermühlen, Rotormühlen oder Walzen-Schrotmühlen eingesetzt; zur Nassvermahlung eignen sich Rührmixer, Rührwerkskugelmühlen, Zirkulationsmühlen, Scheibenmühlen, Ringkammermühlen, Schwingmühlen oder Planetenmühlen. Grundsätzlich kommen auch andere Mühlen in Betracht. Die zur Nassvermahlung erforderliche Flüssigkeitsmenge kann der Fachmann in Routineexperimenten ermitteln. Üblicherweise wird sie so eingestellt, dass der Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 20 Gew.-% liegt. Durch das Mahlen wird eine für die sich anschließenden Verfahrensschritte geeignete Korngröße eingestellt. Hierbei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das beim Vermählen, insbesondere bei trockener Vermahlung, im Schritt a1) erhaltene Mahlgut Mehlpartikel, d.h. teilchenförmige Bestandteile, mit einer Korngröße im Bereich von 100 bis 630 μ m in einem Anteil von 30 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% aufweist. Vorzugsweise enthält das erhaltene Mahlgut 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μ m. In der Regel weisen mindestens 95 Gew.-% der ermahlenen Mehlpartikel eine Korngröße von weniger als 2 mm auf. Die Messung der Korngröße erfolgt dabei mittels Siebanalyse unter Verwendung einer Vibrations-Analysenmaschine. Eine geringe Korngröße ist grundsätzlich zur Erzielung einer hohen Produktausbeute vorteilhaft. Eine zu geringe Teilchengröße kann jedoch zu Problemen, insbesondere durch Klumpenbildung/Agglomeration, beim Anmaischen des Mahlguts während der Verflüssigung bzw. bei der Aufarbeitung, z.B. bei der Trocknung der Feststoffe nach dem Fermentati- onsschritt, führen.
Üblicherweise werden Mehle durch den Ausmahlungsgrad bzw. durch die Mehltype charakterisiert, wobei diese so miteinander korrelieren, dass mit zunehmendem Ausmahlungsgrad auch die Kennzahl der Mehltype zunimmt. Der Ausmahlungsgrad ent- spricht der Gewichtsmenge des gewonnenen Mehls bezogen auf 100 Gewichtsteile des eingesetzten Mahlguts. Während beim Mahlen zunächst reines, feinstes Mehl, z.B. aus dem Inneren des Getreidekorns, anfällt, nimmt beim weiteren Vermählen, also mit steigendem Ausmahlungsgrad, der Anteil an Rohfaser- und Schalengehalt im Mehl zu, der Stärkeanteil wird dabei geringer. Der Ausmahlungsgrad spiegelt sich daher auch in der sogenannten Mehltype wider, die als Zahlenangabe zur Klassifizierung von Mehlen, insbesondere von Getreidemehlen, verwendet wird und die auf dem Aschegehalt des Mehles beruht (sogenannte Ascheskala). Die Mehltype bzw. die Typenzahl gibt hierbei die Menge Asche (Mineralstoffe) in mg an, die beim Verbrennen von 100 g Mehltrockensubstanz zurück bleibt. Für Getreidemehle bedeutet eine höhere Typzahl einen höheren Ausmahlungsgrad, da der Kern des Getreidekorns in etwa 0,4 Gew.-%, die Schale hingegen etwa 5 Gew.-% Asche enthält. Bei niederem Ausmahlungsgrad bestehen die Getreidemehle also überwiegend aus dem zerkleinerten Mehlkörper, d.h. dem Stärkebestandteil der Getreidekörner; bei höherem Ausmahlungsgrad enthalten die Getreidemehle auch die zerkleinerte, eiweißhaltige Aleuronschicht der Getreide- körner, bei Schrot auch die Bestandteile des eiweiß- und fetthaltigen Keimlings sowie der rohfaser- und aschehaltigen Samenschalen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind grundsätzlich Mehle mit einem hohen Ausmahlungsgrad bzw. einer hohen Typzahl bevorzugt. Wird Getreide als Stärkequelle eingesetzt, so werden vorzugsweise die ganzen ungeschälten Körner vermählen und weiter verarbeitet, gegebenenfalls nach vorheriger mechanischer Abtrennung von Keim und Spelzen.
Zum Verflüssigen des Stärkeanteils im Mahlgut gibt man im Schritt a2) wenigstens eine Teilmenge des Mahlgutes, vorzugsweise wenigstens 40 Gew.-%, insbesondere wenigstens 50 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 55 Gew.-% im Verlauf der Verflüssigung, jedoch vorzugsweise vor der Verzuckerung in den Reaktor. Häufig wird die zugegebene Menge an Mahlgut 90 Gew.-%, insbesondere 85 Gew.-% und besonders bevorzugt 80 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge an eingesetztem Mahlgut, nicht überschreiten. Typischerweise wird die im Verlauf der Verflüssigung zugegebene Teilmenge an Mahlgut dem Reaktor unter Bedingungen zugeführt, wie sie bei der Verflüssigung vorliegen. Die Zugabe kann diskontinuierlich, d.h. portionsweise in mehreren Teilportionen, die vorzugsweise jeweils nicht mehr als 20 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-%, z.B. 1 bis 20 Gew.-% insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, der Gesamtmenge des zu verflüssigenden Mahlgutes ausmachen, oder kontinuierlich erfolgen. Erfindungswesentlich ist, dass sich zu Beginn der Verflüssigung nur ein Teil des Mahlgutes, vorzugsweise nicht mehr als 60 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 50 Gew.-% und besonders bevorzugt nicht mehr als 45 Gew.-% des Mahlgutes, im Reaktor befindet und die Restmenge des Mahlgutes während des Verflüssigens zugegeben wird.
Das Mahlgut kann als Pulver, d.h. ohne Zusatz von Wasser, oder als Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit, z.B. Frischwasser, rückgeführtes Prozesswasser, z.B. aus der Fermentation oder der Aufarbeitung, zugegeben werden.
Die Verflüssigung kann auch kontinuierlich, z.B. in einer mehrstufigen Reaktionskaskade, durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß erfolgt das Verflüssigen in Schritt a2) in Gegenwart mindestens ei- nes Stärke verflüssigenden Enzyms, das vorzugsweise unter α-Amylasen ausgewählt ist. Andere unter den Reaktionsbedingungen aktive und stabile Stärke verflüssigende Enzyme sind ebenfalls einsetzbar.
Die nachfolgenden Ausführungen beziehen sich auf die Verwendung von α-Amylasen; sie gelten jedoch allgemein für alle Stärke verflüssigenden Enzyme.
Die α-Amylase (bzw. das verwendete Stärke verflüssigende Enzym) kann im Reaktionsgefäß vorgelegt oder im Verlauf des Schrittes a2) zugegeben werden. Vorzugswei- se gibt man eine Teilmenge der in Schritt a2) benötigten α-Amylase zu Beginn von Schritt a2) zu oder legt diese Teilmenge im Reaktor vor. Die Gesamtmenge an α- Amylase liegt üblicherweise im Bereich von 0,002 bis 3,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,01 bis 1 ,5 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
Die Verflüssigung kann oberhalb oder unterhalb der Gelierungstemperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise erfolgt die Verflüssigung in Schritt a2) zumindest zeitweise oberhalb der Gelierungstemperatur der eingesetzten Stärke (sogenannter Cooking Prozess). In der Regel wird eine Temperatur im Bereich von 70 bis 165°C, bevorzugt von 80 bis 125 °C und besonders bevorzugt von 85 bis 1 15 °C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt.
Für eine optimale Wirkung der α-Amylase wird Schritt a2) vorzugsweise zumindest zeitweise bei einem pH-Wert im schwach sauren Bereich, vorzugsweise zwischen 4,0 und 7,0, besonders bevorzugt von 5,0 bis 6,5 durchgeführt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn von Schritt a2) die pH-Einstellung vorgenommen wird; dieser pH-Wert wird während der Verflüssigung vorzugsweise kontrolliert und gegebenenfalls nachge- stellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt vorzugsweise mit verdünnten Mineralsäuren wie H2SO4 oder H3PO4 bzw. mit verdünnten Alkalilaugen wie wässrige Natronlauge (NaOH) oder Kalilauge (KOH) oder mit Erdalkalilaugen wie wässriges Calciumhydro- xid.
In einer bevorzugten Ausführungsform führt man Schritt a2) des erfindungsgemäßen Verfahrens so durch, dass zunächst eine Teilmenge von höchstens 60 Gew.-%, bevorzugt höchstens 50 Gew.-% und besonders bevorzugt höchstens 45 Gew.-%, z.B. 10 bis 60 Gew.-%, insbesondere 15 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 45 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge des Mahlguts, in einer wässrigen Flüssigkeit, z.B. Frischwasser, rückgeführtes Prozesswasser, z.B. aus der Fermentation oder der Aufarbeitung, oder in einer Mischung dieser Flüssigkeiten suspendiert wird und anschließend die Verflüssigung durchgeführt wird. Die zur Herstellung der Suspension des Mahlguts verwendete Flüssigkeit kann auf eine leicht erhöhte Temperatur, z.B. im Bereich von 40 bis 60°C, vortemperiert werden. Vorzugsweise wird die zur Herstellung der Suspension des Mahlguts eingesetzte Flüssigkeit 30°C nicht überschreiten und insbesondere Raumtemperatur, d.h. 15 bis 28 °C aufweisen. Zu dieser Suspension wird dann das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, gegeben. Wird eine α-Amylase verwendet, so gibt man vorteilhafterweise nur eine Teilmenge der α-Amylase zu, z.B. 10 bis 70 Gew.-% und insbesondere 20 bis 65 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt in Schritt a2) eingesetzte α-Amylase. Die zu diesem Zeitpunkt zugegebene Menge an α-Amylase richtet sich nach der Aktivität der jeweiligen α-Amylase in Bezug auf die verwendete Stärkequelle unter den Reaktionsbedingungen und liegt üblicherweise im Bereich von 0,0004 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 bis 1 ,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle. Alternativ kann die Teilmenge der α-Amylase vor dem Ansetzen der Suspension mit der verwendeten Flüssigkeit vermengt werden.
Hierbei wird vorzugsweise die Teilmenge an α-Amylase vor dem Beginn des Aufheizens auf die zur Verflüssigung angewendete Temperatur, insbesondere bei Raumtem- peratur oder nur leicht erhöhter Temperatur, z.B. im Bereich von 20 bis 30 °C, zu der Suspension gegeben.
Vorteilhafterweise werden die Mengen an α-Amylase und Mahlgut so ausgewählt sein, dass die Viskosität während des Verzuckerungsvorgangs, insbesondere des Gelie- rungsvorgangs, ausreichend reduziert ist, um eine effektive Durchmischung der Suspension, z.B. mittels Rühren, zu ermöglichen. Bevorzugt beträgt die Viskosität der Reaktionsmischung während des Gelierens maximal 20 Pas, besonders bevorzugt maximal 10 Pas und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Pas. Die Messung der Viskosität erfolgt in der Regel mit einem Haake Viskosimeter Type Roto Visko RV20 mit Mess- System M5 und Messeinrichtung MVDIN bei einer Temperatur von 50 °C und einer Schergeschwindigkeit von 200 S"1.
Die so angesetzte Suspension wird dann vorzugsweise auf eine Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der verwendeten Stärke erhitzt. In der Regel wird eine Tem- peratur im Bereich von 70 bis 165°C, bevorzugt von 80 bis 125 °C und besonders bevorzugt von 85 bis 115 °C gewählt, wobei die Temperatur vorzugsweise mindestens 5°C und besonders bevorzugt mindestens 10°C oberhalb der Gelierungstemperatur liegt. Unter Kontrolle der Viskosität werden nach und nach weitere Teilmengen des Mahlguts, z.B. portionsweise in Mengen von jeweils 2 bis 20 Gew.-% und insbesonde- re 5 bis 10 Gew.-% bezogen auf die gesamte eingesetzte Mahlgut, zu der Suspension des Mahlguts zugegeben. Es ist bevorzugt, die im Verlauf der Verflüssigung zuzugebende Teilmenge des Mahlgutes in mindestens 2, bevorzugt mindestens 4 und besonders bevorzugt mindestens 6 Teilportionen der Reaktionsmischung zuzugeben. Alter- nativ kann die Zugabe der beim Ansetzen der Suspension nicht eingesetzten Teilmenge des Mahlgutes kontinuierlich während der Verflüssigung erfolgen. Die Temperatur sollte bei der Zugabe vorteilhafterweise oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke gehalten werden. Bevorzugt erfolgt die Zugabe des Mahlguts in einer Weise, dass die Viskosität der Reaktionsmischung während der Zugabe, bzw. während des Verflüssi- gens, maximal 20 Pas, besonders bevorzugt maximal 10 Pas und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Pas beträgt.
Nach vollständiger Zugabe des Mahlguts wird das Reaktionsgemisch üblicherweise noch eine Zeit, z.B. 30 bis 60 Minuten oder länger, sofern erforderlich, bei der oberhalb der Gelierungstemperatur der Stärke eingestellten Temperatur gehalten, wobei die Stärkebestandteile des Mahlguts verkocht werden. Die Reaktionsmischung wird dann in der Regel auf eine etwas geringere Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur, z.B. 75 bis 90°C, abgekühlt, bevor eine weitere Teilmenge an α-Amylase, vorzugswei- se die Hauptmenge, zugesetzt wird. Je nach Aktivität der verwendeten α-Amylase unter den Reaktionsbedingungen beträgt die Menge an zu diesem Zeitpunkt zugegebener α-Amylase vorzugsweise 0,002 bis 2,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 0,02 bis 0,4 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle.
Bei diesen Temperaturen wird die granuläre Struktur der Stärke zerstört (Gelieren), wodurch deren enzymatischer Abbau (Verflüssigung) ermöglicht wird. Zum vollständigen Abbau der Stärke zu Dextrinen wird das Reaktionsgemisch so lange bei der eingestellten Temperatur gehalten oder gegebenenfalls weiter erhitzt, bis der Stärke- nachweis mit Jod oder gegebenenfalls ein anderer Test zum Nachweis von Stärke negativ oder mindestens im Wesentlichen negativ ausfällt. Gegebenenfalls können hierbei noch eine oder mehrere weitere Teilmengen α-Amylase, z.B. im Bereich von 0,001 bis 0,5 Gew.-% und bevorzugt 0,002 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zu der Reaktionsmischung gegeben werden.
Nach abgeschlossener Verflüssigung der Stärke wird eine Verzuckerung der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, d. h. deren Abbau zu Glucose, kontinuierlich o- der diskontinuierlich durchgeführt, bevorzugt kontinuierlich. Das verflüssigte Medium kann in einem speziellen Verzuckerungstank vollständig verzuckert werden, bevor es dem Fermentationsschritt b) zugeführt wird. Es hat sich andererseits als vorteilhaft erwiesen, vor der Fermentation nur eine teilweise Verzuckerung vorzunehmen. Beispielsweise kann man so vorgehen, dass man eine Teilmenge der in dem Flüssigmedium enthaltenen Dextrine, z.B. im Bereich von 10 bis 90 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 20 bis 80 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Dextrine (bzw. der ursprünglichen Stärke), verzuckert und das resultierende zuckerhaltige Flüssigmedium in der Fermentation einsetzt. Im Fermentationsmedium kann dann eine weitere Verzuckerung in situ erfolgen. Die Verzuckerung kann des Weiteren unter Wegfall ei- nes separaten Verzuckerungstanks direkt im Fermenter (in situ) durchgeführt werden.
Vorteile der in-situ-Verzuckerung, d.h. einer teilweise oder vollständig im Fermenter erfolgenden Verzuckerung, sind einerseits reduzierte Investitionskosten, andererseits kann durch eine retardierte Freisetzung der Glucose gegebenenfalls eine höhere GIu- cosekonzentration im Ansatz (Batch) vorgelegt werden, ohne dass eine Inhibierung oder Stoffwechseländerung der eingesetzten Mikroorganismen auftritt. Bei E. coli führt eine zu hohe Glucosekonzentration z.B. zur Bildung von organischen Säuren (Acetat), während Saccharomyces cerevisae in diesem Fall z.B. auf Vergärung umschaltet, obwohl in belüfteten Fermentern ausreichend Sauerstoff vorhanden ist (Crabtree-Effekt). Eine retardierte Freisetzung von Glucose ist durch die Regelung der Glucoamylase- konzentration einstellbar. Hierdurch können die vorgenannten Effekte unterdrückt werden und es kann mehr Substrat vorgelegt werden, so dass die aus dem zugeführten Feed-Strom resultierende Verdünnung reduziert werden kann.
Im Fall der separaten Verzuckerung, z.B. der Verzuckerung in einem Verzuckerungstank, wird die verflüssigte Stärkelösung üblicherweise auf das Temperaturoptimum des verzuckernden Enzyms oder leicht darunter, z.B. auf 50 bis 70 °C, bevorzugt 60 bis 65 °C abgekühlt bzw. temperiert und anschließend mit Glucoamylase versetzt.
Sofern man die Verzuckerung im Fermenter durchführt, wird man die verflüssigte Stärkelösung in der Regel auf Fermentationstemperatur, d. h. 32 bis 37°C, abkühlen, bevor man sie dem Fermenter zuführt. Die Glucoamylase (bzw. das mindestens eine verzuckernde Enzym) zur Verzuckerung wird in diesem Fall der Fermentationsbrühe direkt zugesetzt. Die Verzuckerung der verflüssigten Stärke gemäß Schritt a2) erfolgt hierbei parallel zur Verstoffwechselung des Zuckers durch die Mikroorganismen.
Vorteilhafterweise wird vor Zugabe der Glucoamylase der pH-Wert des Flüssigmediums auf einen Wert im optimalen Wirkungsbereich der eingesetzten Glucoamylase, vorzugsweise im Bereich von 3,5 bis 6,0; besonders bevorzugt von 4,0 bis 5,5 und ganz besonders bevorzugt von 4,0 bis 5,0 eingestellt. Es ist jedoch auch möglich, insbesondere bei Durchführung der Verzuckerung direkt im Fermenter, den pH-Wert außerhalb der vorgenannten Bereiche einzustellen, z.B. im Bereich von 6,0 bis 8,0. Dies kann z.B. bei der Herstellung von Lysin, Panthothenat und Vitamin B2 trotz der einge- schränkten Aktivität von Standard-Glucoamylasen in diesem pH-Bereich insgesamt vorteilhaft oder aufgrund der einzustellenden Fermentationsbedingungen erforderlich sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verzuckerung in einem speziellen Verzuckerungstank. Dazu wird die verflüssigte Stärkelösung auf eine für das Enzym optimale Temperatur oder leicht darunter temperiert und der pH-Wert in der oben beschriebenen Weise auf einen für das Enzym optimalen Wert eingestellt.
Die Glucoamylase wird dem dextrinhaltigen Flüssigmedium üblicherweise in einer Menge von 0,001 bis 5,0 Gew.-%, bevorzugt von 0,005 bis 3,0 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,01 bis 1 ,0 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der eingesetzten Stärkequelle, zugesetzt. Nach Zugabe der Glucoamylase wird die dextrinhaltige Suspension vorzugsweise für einen Zeitraum von z.B. 2 bis 72 Stunden oder länger, sofern erforderlich, insbesondere von 5 bis 48 Stunden bei der eingestellten Temperatur gehalten, wobei die Dextrine zu Monosacchariden verzuckert werden. Der Fortschritt der Verzuckerung kann mit dem Fachmann bekannten Methoden, z.B. HPLC, Enzymtests oder Glucose-Teststäbchen, verfolgt werden. Die Verzuckerung ist abgeschlossen, wenn die Konzentration der Monosaccharide nicht mehr wesentlich ansteigt oder wieder fällt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Zugabe des Mahlguts in Gegenwart der mindestens einen α-Amylase sowie der mindestens einen Glucoamylase im Schritt a2) derart, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas, bevorzugt maxi- mal 10 Pas und besonders bevorzugt maximal 5 Pas beträgt. Zur Unterstützung der Viskositätskontrolle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn mindestens 25 Gew.-%, bevorzugt mindestens 35 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 50 Gew.-% der Gesamtmenge des zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Ge- latinierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden. Die Kontrolle der Viskosität kann des Weiteren dadurch beeinflusst werden, dass das mindestens eine Stärke verflüssigende Enzym, vorzugsweise eine α-Amylase, oder/und das mindestens eine verzuckernde Enzym, vorzugsweise eine Glucoamylase, selbst portionsweise zugegeben werden.
Durch Anwendung der Schritte a1) und a2) ist es möglich, das zuckerhaltige Flüssigmedium mit einem Monosaccharidgehalt, insbesondere einem Glucosegehalt, von vorzugsweise mehr als 25 Gew.-%, z.B. mehr als 30 Gew.-% oder mehr als 35 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 40 Gew.-% , z.B. > 25 bis 55 Gew.-%, insbesondere > 30 bis 52 Gew.-%, besonders bevorzugt > 35 bis 50 Gew.-% und speziell > 40 bis 48 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums, herzustellen. Der Gesamtfeststoffgehalt im Flüssigmedium beträgt dann typischerweise 30 bis 70 Gew.-%, häufig 35 bis 65 Gew.-%, insbesondere 40 bis 60 Gew.-%. Die Konzentration an Mo- nosacchariden bzw. Glucose und der Feststoffgehalt hängen in an sich bekannter Weise vom Verhältnis des in die Verflüssigung eingesetzten Mahlguts und der Flüssigkeitsmenge sowie von dem Stärkeanteil des Mahlguts ab.
Zur Verflüssigung des Stärkeanteils im Mahlgut können grundsätzlich alle α-Amylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.1 ) eingesetzt werden, insbesondere α-Amylasen, die aus Ba- cillus lichenformis oder Bacillus staerothermophilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verflüssigen von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden. Die zum Verflüssigen geeigneten α-Amylasen sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novozy- mes unter der Bezeichnung Termamyl 120 L, Typ L; oder von Genencor unter der Bezeichnung Spezyme. Es kann auch eine Kombination verschiedener α-Amylasen zur Verflüssigung eingesetzt werden.
Zur Verzuckerung der Dextrine (d.h. Oligosaccharide) in der verflüssigten Stärkelösung können grundsätzlich alle zur Verzuckerung von Dextrinen geeignete Enzyme, typischerweise Glucoamylasen (Enzymklasse EC 3.2.1.3), eingesetzt werden. Insbesondere sind Glucoamylasen, die aus Aspergilus gewonnen wurden und speziell solche, die zum Verzuckern von durch Dry-Milling-Verfahren gewonnenen Materialien im Rahmen der Herstellung von Bioethanol verwendet werden, geeignet. Die zum Verzu- ckern geeigneten Enzyme sind auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von Novo- zymes unter der Bezeichnung Dextrozyme GA; oder von Genencor unter der Bezeichnung Optidex. Es kann auch eine Kombination verschiedener verzuckernder Enzyme, z.B. verschiedene Glucoamylasen verwendet werden.
Zur Stabilisierung der eingesetzten Enzyme kann gegebenenfalls die Konzentration an Ca2+-lonen, z.B. mit CaCb oder Ca(OH)2, auf einen enzymspezifischen optimalen Wert eingestellt werden. Geeignete Konzentrationswerte können vom Fachmann in Routineexperimenten bestimmt werden. Wird z.B. Termamyl als α-Amylase eingesetzt, so ist es vorteilhaft, eine Ca2+-Konzentration von z.B. 50 bis 100 ppm, bevorzugt 60 bis 80 ppm und besonders bevorzugt etwa 70 ppm im Flüssigmedium einzustellen.
Da zur Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums gemäß a1 ) die ganze Stärkequelle, d.h. das ganze Korn, vermählen wird, umfasst diese auch die nicht- stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Dies bedingt oftmals den Eintrag eines nicht zu vernachlässigenden Anteils an Phytat aus der Kornfrucht. Um die daraus resultierende inhibierende Wirkung zu vermeiden, wird vorteilhafterweise in Schritt a2) dem Flüssigmedium mindestens eine Phytase zugesetzt, bevor das zuckerhaltige Flüssigmedium dem Fermentationsschritt zugeführt wird.
Die Zugabe der Phytase kann vor, während oder nach der Verflüssigung oder der Verzuckerung erfolgen, sofern sie die jeweils erforderliche Hitzestabilität aufweist.
Es können beliebige Phytasen eingesetzt werden, soweit deren Aktivität unter den Reaktionsbedingungen jeweils höchstens unwesentlich eingeschränkt ist. Bevorzugt sind Phytasen mit einer Temperaturstabilität (T50) > 50 °C und besonders bevorzugt > 60 0C.
Die Menge an Phytase beträgt üblicherweise 1 bis 10000 Units/kg Stärkequelle und insbesondere 10 bis 2000 Units/kg Stärkequelle.
Zur Erhöhung der Gesamtzuckerausbeute bzw. zur Gewinnung freier Aminosäuren können dem Reaktionsgemisch während der Herstellung des zuckerhaltigen Flüssig- mediums außerdem weitere Enzyme, zum Beispiel Pullulanasen, Cellulasen, Hemicel- lulasen, Glucanasen, Xylanasen, Glucosidasen oder Proteasen, zugesetzt werden. Der Zusatz dieser Enzyme kann die Viskosität positiv beeinflussen, d.h. herabsetzen (z.B. durch Spaltung längerkettiger Glucane und/oder von (Arabino-)Xylanen), die Freisetzung metabolisierbarer Glucoside und die Freisetzung von (Rest-)Stärke bewirken. Der Einsatz von Proteasen hat analoge positive Effekte, wobei zusätzlich Aminosäuren als Wachstumsfaktoren für die Fermentation freigesetzt werden können.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das zuckerhaltige Flüssigmedium zur fermenta- tiven Herstellung eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts verwendet. Dazu wird das in den Schritten a1 ) und a2) hergestellte zuckerhaltige Flüssigmedium einer Fermentation zugeführt. In der Fermentation werden die nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechsel produkte von den Mikroorganismen produziert.
Die Durchführung des Fermentationsverfahrens kann in der Regel in der dem Fach- mann bekannten üblichen Art und Weise erfolgen. Dabei liegt das Volumenverhältnis von zugeführtem zuckerhaltigem Flüssigmedium zu dem vorgelegten und die Mikroorganismen enthaltenden Flüssigmedium im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 :10 bis 10:1 , vorzugsweise im Bereich von etwa 1 :2 bis 2:1 , z.B. bei etwa 1 :2 oder etwa 2:1 und insbesondere bei etwa 1 :1. Insbesondere über die Zufuhrgeschwindigkeit des zuckerhaltigen Flüssigmediums kann der Zuckergehalt in der Fermentationsbrühe reguliert werden. In der Regel wird man die Zufuhrgeschwindigkeit so einstellen, dass der Monosaccharidgehalt in der Fermentationsbrühe im Bereich von > 0 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% liegt; die Fermentation kann jedoch auch bei deutlich höheren Monosaccha- ridgehalten in der Fermentationsbrühe, z.B. etwa 5 bis 20 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, durchgeführt werden.
Sofern die Verzuckerung und die Fermentation separat durchgeführt wird, kann das in Schritt a) erhaltene, zuckerhaltige Flüssigmedium vor der Fermentation gegebenenfalls sterilisiert werden, wobei man gegebenenfalls präsente, störende Mikroorganismen, die z.B. durch das Mahlgut eingebracht wurden (Kontaminanten), durch ein geeignetes Verfahren, typischerweise durch ein thermisches Verfahren abtötet. Beim thermischen Verfahren heizt man die Brühe üblicherweise auf Temperaturen oberhalb 80°C auf. Die Abtötung bzw. Lyse der Zellen kann unmittelbar vor der Fermentation erfolgen. Hierzu wird die gesamte zuckerhaltige Flüssigmedium der Lyse bzw. Abtötung zugeführt. Es hat sich jedoch im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens als nicht notwendig erwiesen, vor der Fermentation einen Sterilisierungsschritt wie hier beschrieben durchzuführen, sondern es hat sich vielmehr als vorteilhaft erwiesen, keinen solchen Sterili- sierungsschritt durchzuführen. Dementsprechend betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren, bei dem das in Schritt a) (bzw. den Schritten a1 ) und a2)) erhaltene Flüssigmedium unmittelbar, d.h. ohne vorherige Sterilisation, der Fermentation zugeführt oder eine zumindest teilweise in-situ-Verzuckerung durchgeführt wird.
Bei der Fermentation resultiert ein Flüssigmedium, das neben dem gewünschten nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukt und Wasser im Wesentlichen unlösliche Feststoffe, z.B. die während der Fermentation erzeugte Biomasse, die nicht verstoff- wechselten Bestandteile der verzuckerten Stärkelösung und insbesondere die nicht- stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle, wie z.B. Fasern, , sowie die in der Fermentationsbrühe gelöst vorliegenden Bestandteile (lösliche Bestandteile), z.B. nicht verwertete Puffer- und Nährsalze sowie nicht umgesetzte Monosaccharide (d.h. nicht verwertete Zucker), enthält. Dieses Flüssigmedium wird im Folgenden auch als Fermentationsbrühe bezeichnet, wobei der Ausdruck Fermentationsbrühe auch das (zu- ckerhaltige) Flüssigmedium umfasst, bei dem eine erst teilweise oder unvollständige fermentative Umsetzung der darin enthaltenen Zucker, d.h. eine teilweise oder unvollständige mikrobielle Verstoffwechselung der Monosaccharide, erfolgt ist. Erfindungsgemäß werden zumindest die flüchtigen Bestandteile des Fermentationsmediums entfernt. Auf diese Weise erhält man einen Feststoff, welcher das nichtflüchtige Wertprodukt zusammen mit den unlöslichen Bestandteilen der Fermentationsbrühe und gegebenenfalls den in der Fermentationsbrühe gelöst vorliegenden Bestandteilen enthält.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukten Verbindungen verstanden, die sich im Allgemeinen auf destillativem Weg nicht unzersetzt aus der Fermentationsbrühe entfernen lassen.
Diese Verbindungen weisen in der Regel einen Siedepunkt oberhalb des Siedepunktes von Wasser, häufig oberhalb 150 °C und insbesondere oberhalb 200 °C bei Normaldruck auf. In der Regel handelt es sich um Verbindungen, die bei Normalbedingungen (298 K, 101 ,3 kPa) in festem Zustand vorliegen. Es ist jedoch auch möglich, das erfin- dungsgemäße Verfahren zur Herstellung nichtflüchtiger mikrobieller Stoffwechselprodukte einzusetzen, die bei Normaldruck einen Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser oder/und eine ölige Konsistenz aufweisen. In diesem Fall ist in der Regel eine Kontrolle der maximalen Temperaturen während der Aufarbeitung, insbesondere während der Trocknung erforderlich. Vorteilhaft können diese Verbindungen auch dadurch hergestellt werden, dass man sie in quasi fester Form (pseudofester Form) auf Adsorbentien formuliert.
Zu diesem Zweck geeignete Adsorbentien sind z.B. Aktivkohlen, Aluminiumoxide, Kieselgele, Kieselsäure, Ton, Ruße, Zeolithe, anorganische Alkali- und Erdalkalimetallsal- ze wie Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Calciumhydroxide, -carbonate, -Silikate, -sulfate, -phosphate, insbesondere Magnesium- und Calciumsalze, z.B. Mg(OH)2, MgCO3, MgSiO4, CaSO4, CaCO3, Erdalkalimetalloxide, z.B. MgO und CaO, andere anorganische Phosphate und Sulfate, z.B. ZnSO4, Salze organischer Säuren, insbesondere deren Alkali- und Erdalkalimetallsalze und speziell deren Natrium- und KaIi- umsalze, z.B. Natrium- und Kaliumacetat, -formiat, -hydrogenformiate und - citrat, sowie höhermolekulare organische Träger wie Kohlenhydrate, z.B. Zucker, gegebenenfalls modifizierte Stärken, Cellulose, Lignin, sowie allgemein die weiter unten im Zusammenhang mit der Produktformulierung genannten Trägermaterialien. In der Regel werden die genannten Trägermaterialien keine oder nur geringe Anteile, insbesondere lediglich Spuren an Halogenen wie Chloridionen und an Nitraten aufweisen.
Beispiele für Verbindungen, die vorteilhaft auf diese Weise durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden können, sind y -Linolensäure, Dihomo-γ - Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure, weiterhin Propionsäure, Milchsäure, Propandiol, Butanol und Aceton. Auch diese Verbindungen in pseudofester Formulierung werden im Sinne der vorliegenden Erfindung als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in fester Form verstanden.
Der Begriff nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte umfasst im Folgenden insbesondere organische, gegebenenfalls 1 oder mehrere, z. B. 1 , 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen tragende Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit vorzugsweise 3 bis 10 C- Atomen, z.B. Weinsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Propionsäure, Milchsäure, 3- Hydroxypropionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, 2,5-Furandicarbonsäure, Glutarsäu- re, Lävulinsäure, Gluconsäure, Aconitsäure und Diaminopimelinsäure, Zitronensäure; proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren, z.B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Asparaginsäure, Tryptophan und Threonin; Purin- und Pyrimidinbasen; Nukleoside und Nukleotide, z.B. Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) und Adenosin- 5' -monophosphat (AMP); Lipide; gesättigte und ungesättigte Fettsäuren mit vorzugsweise 10 bis 22 C-Atomen, z.B. y -Linolensäure, Dihomo-γ -Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure; Diole mit vorzugsweise 3 bis 8 C-Atomen, z.B. Propandiol und Butandiol; höherwertige Alkohole mit 3 oder mehr, z.B. 3, 4, 5 oder 6 OH-Gruppen, z.B. Glycerin, Sorbitol, Manitol, Xylitol und Arabinitol; län- gerkettige Alkohole mit wenigstens 4 C-Atomen, z.B. mit 4 bis 22 C-Atomen, z.B. Butanol; Kohlenhydrate, z.B. Hyaluronsäure und Trehalose; aromatische Verbindungen, z.B. aromatische Amine, Vanillin und Indigo; Vitamine und Provitamine, z.B. Ascorbin- säure, Vitamin Be, Vitamin B12 und Riboflavin, Cofaktoren und sogenannte Nutrazeuti- ka; Proteine, z.B. Enzyme wie Amylasen, Pektinasen, saure, hybride oder neutrale Zellulasen, Esterasen wie Lipasen, Pankreasen, Proteasen, Xylanasen und Oxidore- duktasen wie Laccase, Katalase und Peroxidase, Glucanasen, Phytasen; Carotinoide, z.B. Lycopin, ß-Carotin, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxanthin; Ketone mit vorzugsweise 3 bis 10 C-Atomen und gegebenenfalls 1 oder mehreren Hydroxylgruppen, z.B. Aceton und Acetoin; Lactone, z.B. y -Butyrolacton, Cyclodextrine, Biopolymere, z.B. Polyhydroxyacetat, Polyester, z.B. Polylactid, Polysaccharide, Polyisoprenoide, Polyamide; sowie Vorstufen und Derivate der vorgenannten Verbindungen. Weitere als nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukte in Frage kommende Verbindungen sind von Gutcho in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086 beschrieben.
Der Begriff "Cofaktor" umfasst nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise orga- nisch. Beispiele solcher Moleküle sind NAD und Nikotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP); die Vorstufe dieser Cofaktoren ist Niacin.
Der Begriff "Nutrazeutikum" umfasst Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tie- ren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und bestimmte Lipide, z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren.
Insbesondere sind die hergestellten Stoffwechselprodukte unter Enzymen, Aminosäu- ren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen ausgewählt.
Es versteht sich für den Fachmann, dass die erfindungsgemäß auf fermentativem Weg hergestellten Verbindungen jeweils in der von den eingesetzten Mikroorganismen produzierten Enantiomerenform erhalten werden (sofern unterschiedliche Enantiomere existieren). So erhält man z.B. von den Aminosäuren in der Regel das jeweilige L- Enantiomer.
Die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen richten sich in an sich bekannter Weise nach den jeweiligen mikrobiellen Stoffwechselprodukten, wie unten im einzelnen erläutert. Sie können natürlichen Ursprungs oder genetisch modifiziert sein. Beispiele für geeignete Mikroorganismen und Fermentationsverfahren sind in der fol- genden Tabelle A angegeben:
Tabelle A:
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Bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen die Herstellung von Enzymen wie Phytasen, Xylanasen, Glucanasen; Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin; Vitaminen wie Pantothensäure und Riboflavin, Vorläufern und Folgeprodukten davon, sowie die Herstellung von den vorgenannten Mono-, Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Propionsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure, aliphatischen Hydroxy- carbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; von den vorgenannten längerket- tigen Alkanolen, insbesondere Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; von den vorgenannten Diolen, insbesondere Alkandiolen mit 3 bis 10 und insbesondere 3 bis 8 C-Atomen wie Propandiol; von den vorgenannten Ketonen, insbesondere Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; und von den vorgenannten Kohlehydraten und insbesondere Disacchariden wie Trehalose.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen daher ausgewählt unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme wie Phytase, Xylanase, Glucanase; Aminosäuren wie Lysin, Threonin und Methionin; Vitamine wie Pantothensäure und Riboflavin; Vorläufer und/oder Folgeprodukte davon; Disaccharide wie Trehalose; aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C- Atomen wie Propionsäure, Fumarsäure und Bernsteinsäure; aliphatische Hydroxycar- bonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen wie Milchsäure; Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen wie Aceton; Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen wie Butanol; und Alkandiole mit 3 bis 8 C- Atomen wie Propandiol.
Insbesondere sind die Mikroorganismen ausgewählt unter den Gattungen Corynebac- terium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaero- biospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus und Clostridium, insbesondere unter Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger oder Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succi- niproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propioni- bacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutlicum, Rhizopus arrhizus und Rhizopus oryzae.
In einer speziellen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fer- mentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Lysin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in Pfefferle et al., a.a.O. und US 3,708,395. Prinzipiell kommen sowohl eine kontinuierliche als auch eine diskontinuierliche (Batch oder Fed-Batch) Betriebsweise in Betracht, bevorzugt ist die Fed-Batch Betriebsweise.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Methionin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 03/087386 und WO 03/100072.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Pan- tothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Ri- boflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in WO 01/01 1052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1 186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this ri- boflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um Fu- marsäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in Rhodes et al, Production of Fumaric Acid in 20- L Fermen- tors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1), 9-15. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt um eine Phytase. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen be- schrieben wurden, z.B. in der WO 98/55599.
Vor der weiteren Verarbeitung der Fermentationsbrühe wird vorzugsweise ein Sterili- sierungsschritt durchgeführt. Der Sterilisierungsschritt kann thermisch, chemisch oder mechanisch oder durch eine Kombination dieser Massnahmen durchgeführt werden. Die thermische Steriliserung kann in der oben beschriebenen Weise erfolgen. Zur chemischen Sterilisierung wird man die Fermentationsbrühe in der Regel mit Säuren oder Laugen in einer Weise behandeln, die zu einer Abtötung der Mikroorganismen führt. Die mechanische Sterilisierung erfolgt in der Regel durch Eintrag von Scherkräften. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekann.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst vorteilhafterweise die folgenden drei aufeinander folgenden Verfahrensschritten a), b) und c):
a) Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% gemäß den Schritten a1) und a2), wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle umfasst;
b) Einsatz des zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer Fermentation zur Produktion des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukte(s); und
c) Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form zusammen mit wenigstens einem Teil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle aus der Fermentationsbrühe durch wenigstens teilwei- ses Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe.
Das in Schritt a) erhaltene zuckerhaltige Flüssigmedium, mit welchem in Schritt b) der die gewünschten Stoffwechsel produkte produzierende Mikroorganismenstamm kultiviert wird, enthält zumindest einen Teil oder die Gesamtmenge, in der Regel jedoch wenigstens 90 Gew.-% und speziell etwa 100 Gew.-% der in den vermahlenen Getreidekörnern enthaltenen nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile, entsprechend dem Ausmahlungsgrad. Bezogen auf die stärkehaltigen Bestandteile des Mahlguts beträgt der Anteil der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile in dem zuckerhaltigen Flüssig- medium vorzugsweise wenigstens 10 Gew.-% und insbesondere wenigstens 25 Gew.- %, z.B. von 25 bis 75 Gew.-% und speziell von 30 bis 60 Gew.-%. Diese nichtstärkehaltigen festen Bestandteile werden zusammen mit dem zuckerhaltigen Flüssigmedium der Fermentation gemäß Schritt b) zugeführt und sind somit auch in der resul- tierenden Stoffwechselprodukt-haltigen Fermentationsbrühe vorhanden.
Sofern gewünscht, kann vor dem Entfernen der flüchtigen Bestandteile gemäß Schritt c) ein Teil, z.B. 5 bis 80 Gew.-% und insbesondere 30 bis 70 Gew.-%, der nichtstärkehaltigen festen, d.h. unlöslichen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe abge- trennt werden. Eine solche Abtrennung erfolgt typischerweise durch übliche Verfahren der Fest-Flüssig-T rennung z.B. mittels Zentrifugation oder Filtration. Gegebenenfalls wird man eine solche Vorabtrennung durchführen, um gröbere Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellen Stoffwechselprodukt enthalten, zu entfernen. Zur Vorfiltration können dem Fachmann bekannte, übliche Verfahren, z.B. unter Verwendung grobmaschiger Siebe, Netze, Lochbleche, oder dergleichen angewendet werden. Gegebenenfalls kann eine Abtrennung grober Feststoffpartikel auch in einem Fliehkraftabscheider erfolgen. Die hierbei eingesetzten Apparaturen wie Dekanter, Zentrifugen, Sedikanter und Separatoren sind dem Fachmann e- benfalls bekannt. Vorzugsweise wird man jedoch vor dem Entfernen der flüchtigen Be- standteile nicht mehr als 30 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 5 Gew.-% der unlöslichen Bestandteile der Fermentationsbrühe entfernen.
Bevorzugt gewinnt man das wenigstens eine nichtflüchtige Stoffwechselprodukt in fester Form im Wesentlichen ohne vorherige Abtrennung fester Bestandteile zusammen mit der Gesamtheit aller festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe.
Erfindungsgemäß erfolgt im Anschluss an die Fermentation, gegebenenfalls nach teilweiser Abtrennung der festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile, die weitgehende Entfernung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe. Weitgehend bedeutet, dass nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile ein fester oder zumindest halbfester Rückstand verbleibt, der sich gegebenenfalls durch Zusatz von Feststoffen in ein festes Produkt überführen lässt. In der Regel bedeutet dies, die flüchtigen Bestandteile bis zu einem Restfeuchtegehalt von nicht mehr als 20 Gew.-%, häufig nicht mehr als 15 Gew.-% und insbesondere nicht mehr als 10 Gew.-%, zu entfernen. In der Regel wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe vorteilhafterweise bis auf einen Restfeuchtigkeitsgehalt im Bereich von 0,2 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 2 bis 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das nach Trocknung ermittelte Gesamtgewicht der festen Bestandteile, aus der Fermentationsbrühe entfernen. Der Restfeuchtigkeitsgehalt kann durch übliche dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden, z.B. mittels Thermogravimetrie (Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989).
Zur Entfernung der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe kann man gemäß einer ersten Ausführungsform so vorgehen, dass man im wesentlichen nur die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe entfernt, z.B. in dem man sie verdampft.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform entfernt man die flüssigen Anteile der Fermentationsbrühe, welche neben den flüchtigen Bestandteilen in der Regel auch gelöste, nicht-flüchtige Bestandteile enthält, von den nicht gelösten Bestandteilen, d.h. das gewünschte Stoffwechselprodukt sowie Biomasse und die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle. Die Entfernung der flüssigen Anteile erfolgt dann durch übliche Verfahren der Fest-Flüssig-T rennung wie Filtration, Zentrifugation usw..
Man kann auch diese Verfahren der ersten und zweiten Ausführungsform in Kombination anwenden. Beispielsweise kann man zunächst einen Teil oder die Hauptmenge der flüssigen Anteile der Fermentationsbrühe von den ungelösten Bestantdteilen ab- trennen und die Restmengen an flüchtigen Bestandteilen aus den abgetrennten ungelösten Bestandteilen der Fermentationsbrühe durch Verdampfen entfernen. Man kann weiterhin die Haupt- oder Gesamtmenge der flüchtigen Bestandteile aus dem abgetrennten flüssigen Anteil der Fermentationsbrühe durch Verdampfen entfernen und weiterverarbeiten. Auch kann man den Rückstand, welcher durch Verdampfen der flüchtigen Bestandteile aus den abgetrennten flüssigen Bestandteilen erhalten wird, mit den nach Abtrennung der flüssigen Bestandteile erhaltenen Feststoffe vereinigen, was aus verfahrenstechnischer Sicht besonders vorteilhaft sein kann.
Die Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form aus der Fermentationsbrühe in Schritt c) kann, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, in ein, zwei oder mehreren Stufen erfolgen, insbesondere in einem ein- oder zweistufigen Vorgehen. In der Regel wird mindestens eine, insbesondere die abschließende Stufe zur Gewinnung des Stoffwechselprodukts in fester Form einen Trocknungsschritt umfassen.
Bei der einstufigen Vorgehensweise wird man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, entfernen, bis der gewünschte Restfeuchtigkeitsgehalt erreicht ist. Bei der zwei- oder mehrstufigen Vorgehensweise wird man die Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach vorgenannter Vorabtrennung, zunächst aufkonzentrieren, z.B: mittels (Mikro-, Ultra-)Filtration oder thermisch durch Verdampfen eines Teils der flüch- tigen Bestandteile. Der Anteil der flüchtigen Bestandteile, die in dieser Stufe entfernt werden beträgt in der Regel 10 bis 80 Gew.-% und insbesondere 20 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe.
In einer oder mehreren sich anschließenden Stufen werden die restlichen flüchtigen
Bestandteile der Fermentationsbrühe entfernt, bis der gewünschte Restfeuchtigkeits- gehalt erreicht ist.
Erfindungsgemäß erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile des Flüssigmediums im Wesentlichen ohne eine vorherige Abreicherung oder gar Isolierung des Wertprodukts. Folglich wird bei der Entfernung der flüchtigen Bestandteile der Fermen- tationsbrühe das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt im Wesentlichen nicht zusammen mit den flüchtigen Bestandteilen des Flüssigmediums entfernt, sondern verbleibt mit wenigstens einem Teil, üblicherweise mit der Hauptmenge und insbesodere mit der Gesamtmenge der sonstigen festen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe im so erhaltenen Rückstand. Erfindungsgemäß können aber auch - vorzugsweise geringe - Anteile des gewünschten nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts, in der Regel maximal 20 Gew.-%, z.B. 0,1 bis 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 10, insbesondere nicht mehr als 5 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 2,5 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, beim Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fer- mentationsbrühe zusammen mit diesen entfernt werden. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform verbleibt das gewünschte nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukt zu wenigstens 90 Gew.-%, insbesondere wenigstens 95 Gew.-%, speziell 99 Gew.-% und ganz speziell etwa 100 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamttrockengewicht des Stoffwechselprodukts, als Feststoff in Mischung mit dem nach Ent- fernen der flüchtigen Bestandteile erhaltenen Teil oder der Gesamtheit der festen Bestandteile des Fermentationsmediums.
Auf diese Weise erhält man einen festen oder halbfesten, z.B. pastösen Rückstand, welcher das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt und die nichtflüchtigen, in der Regel festen nicht-stärkehaltigen Bestandteile der Stärkequelle oder zumindest große Teile davon, häufig wenigstens 90 Gew.-% oder die Gesamtmenge der festen nicht- strärkehaltigen Bestandteile enthält. Durch Zugabe von Formulierungshilfsmitteln wie Träger- und Coatingmaterialien, Bindemitteln sowie anderer Additive können die Eigenschaften des getrockneten und zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentation vorliegenden Stoffwechselprodukts gezielt hinsichtlich verschiedener Parameter wie Wirkstoffgehalt, Korngröße, Partikelform, Neigung zum Stauben, Hygroskopizität, Stabilität, insbesondere Lagerstabilität, Farbe, Geruch, Fließverhalten, Agglomerationsneigung, elektrostatischer Aufladung, Licht- und Temperaturempfindlichkeit, mechanischer Stabilität und Re- dispergierbarkeit in an sich bekannter Weise konfektioniert werden.
Zu den üblicherweise verwendeten Formulierungshilfsmitteln gehören z.B. Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, Viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxi- dantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle o- der Mischungen hieraus. Derartige Formulierungshilfsmittel werden vorteilhaft insbe- sondere bei Anwendung von Formulierungs- und Trocknungsverfahren wie Sprüh-, Wirbelschicht- und Gefriertrocknung als Trocknungshilfsmittel eingesetzt.
Beispiele für Bindemittel sind Kohlenhydrate, insbesondere Zucker wie Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, z.B. Dextrine, Trehalose, Glucose, Glucosesirup, Maltose, Saccharose, Fructose und Lactose; kolloidale Substanzen wie tierische Proteine, z.B. Gelatine, Casein, insbesondere Natriumcaseinat, pflanzliche Proteine, z.B. Sojaprotein, Erbsenprotein, Bohnenprotein, Lupin, Zein, Weizenprotein, Maisprotein und Reisprotein, synthetische Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und insbesondere die Kollidon-Marken der Fa. BASF, gegebenenfalls modifizierte Biopolymere, z.B. Lig- nin, Chitin, Chitosan, Polylactid und modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid (OSA); Gummen, z.B. Gummi acacia; Cellulosederivate, z.B. Methylcellulose, Ethylcellulose, (Hydroxyethyl)methylcellulose (HEMC), (Hydroxypropyl)methylcellulose (HPMC), Carboxymethylcellulose (CMC); Mehle, z.B. Maismehl, Weizenmehl, Roggenmehl, Gerstenmehl und Reismehl.
Beispiele für Trägermaterialien sind Kohlenhydrate, insbesondere die als Bindemittel vorgenannten Zucker sowie Stärken, z.B. aus Mais, Reis, Kartoffel, Weizen und Cassava; modifizierte Stärken, z.B. Octenylsuccinatanhydrid; Cellulose und mikrokristalline Cellulose; anorganische Mineralien oder Lehm, z.B. Ton, Kohle, Kieselgur, Kieselsäure, Talg und Kaolin; Gries, z.B. Weizengries, Kleie, z.B. Weizenkleie, die als Bindemittel vorgenannten Mehle; Salze wie Metallsalze, insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallsalze organischer Säuren, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-citrat, -acetat, -formiat und - hydrogenformiate, anorganische Salze, z.B. Mg-, Ca-, Zn-, Na-, K-sulfate, -carbonate, -Silikate oder -phosphate; Erdalkalimetalloxide wie CaO und MgO; anorganische Pufferungsmittel wie Alkalimetallhydrogenphosphate, insbesondere Natrium- und Kaliumhydrogenphosphate, z.B. K2HPO4, KH2PO4 und Na2HPO4; sowie allgemein die im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Herstellung von Stoffwechselprodukten mit niedrigem Schmelzpunkt bzw. öliger Konsistenz genannten Adsorbentien.
Beispiele für Puderungsmittel bzw. Fließhilfsmittel sind Kieselgur, Kieselsäure, z.B. die Sipernat-Marken der Fa. Degussa; Ton, Kohle, Talg und Kaolin; die als Trägermaterialien vorgenannten Stärken, modifizierten Stärken, anorganischen Salze, Salze organischer Säuren und Pufferungsmittel; Cellulose und mikrokristalline CeIIuIo- se.
Hinsichtlich sonstiger Additive seien als Beispiele genannt Farbpigmente wie Tiθ2, Carotinoide und deren Derivate, Vitamin B2, Capsanthin, Lutein, Kryptoxanthin, Canthaxanthin, Astaxanthin, Tartrazin, Sunsetgelb FCF, Indigotin, Pflanzenkohle, Bixin, Eisenoxid ; Biozide wie Natriumbenzoat, Sorbinsäure, (Erd-)Alkalimetallsorbate wie Natriumsorbat, Kaliumsorbat und Calciumsorbat, 4-Hydroxybenzoesäureethylester, Alkalimetallbisulfite wie Natriumbisulfit und Natriummetabisulfit, Ameisensäure, Formiate und insbesondere Alkalimetallformiate wie Natriumformiat, Formaldehyd, Natriumnitrat, Acetate und insbesondere (Erd-)Alkalimetallacetate wie Natrium- und Kaliumacetat, Essigsäure, Milchsäure, Propionsäure, Dispergiermittel und Viskositätsregulierende Mittel wie Alginate, Lecithin, 1 ,2-Propandiol, Agar-Agar, Carragen, Gummi Arabikum, Guargummi, Xanthangummi, Gellangummi, Cässia-Gum, Sorbit, Polyethylenglykol, Glycerin, Pektin, modifizierte Stärken, modifizierte Cellulosen (z.B: Methylcellulose, HPMC, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose), mikrokristalline Cellulose, Mono- und Digylceride, Sucroseester; Antischaummittel wie vinylfunktionelle Siliconöle, z.B. SILOFOAM®SC 155 der Fa. Wacker Chemie, und Fettalkoholalkoxylate, z.B. Plurafac® der Fa. BASF AG; anorganische Säuren wie Phosphorsäuren, Salpetersäure, Salzsäure, Schwefelsäure; organische Säuren wie gesättigte und ungesättigte Mono- und Dicarbonsäuren, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure und Fumarsäure; Laugen wie Alkalimetallhydroxide, z.B. NaOH und KOH; Antioxidantien wie Vitamin C, 3 tert-Butyl-4-hydroxyanisole (BHA), 3,5-Ditertiär-4- hydroxytoluol (BHT), 6-Ethoxy-1 ,2-dihydroxy-2,2,4-trimenthylchinolin (Ethoxyquine); Enzymstabilisatoren wie Calciumsalze, Zinksalze wie Zinksulfat, Magnesiumsalze wie Magnesiumsulfat, Aminosäuren; Enzyminhibitoren wie Pepstatin A oder Guanidin*HCI; Adsorbate wie Kieselsäure, Siliziumoxid, Zucker oder Salze; Fette wie Glyceride, z.B. Mono-, Di und Trigylceride; Fettsäuren wie Stearinsäure; Öle wie Sonnenblumenöl, Maiskernöl, Soyaöl und Palmöl.
Der Anteil an den vorgenannten Zusatzstoffen und gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen wie Coatingmaterialien kann je nach den speziellen Erfordernissen des jeweiligen Stoffwechselprodukts sowie in Abhängigkeit von den Eigenschaften der eingesetzten Zusatzstoffe stark variieren und z.B. im Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 1 bis 30 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des fertig formulierten Produkts bzw. Stoffgemischs, liegen.
Die Zugabe von Formulierungshilfsmitteln kann vor, während oder nach der Aufarbeitung der Fermentationsbrühe (auch als Produktformulierung oder Feststoffdesign bezeichnet) und insbesondere während der Trocknung erfolgen. Eine Zugabe von Formu- lierungshilfsmitteln vor Aufarbeitung der Fermentationsbrühe bzw. des Stoffwechselprodukts kann insbesondere vorteilhaft sein, um die Prozessierbarkeit der aufzuarbeitenden Stoffe bzw. Produkte zu verbessern. Die Formulierungshilfsmittel können sowohl dem in fester Form erhaltenen Stoffwechselprodukt als auch einer dieses enthaltenden Lösung oder Suspension zugegeben werden, z.B. nach abgeschlossener Fer- mentation direkt zu der Fermentationsbrühe oder zu einer im Verlauf der Aufarbeitung erhaltenen Lösung oder Suspension vor dem abschließenden Trocknungsschritt.
So können die Hilfsstoffe z.B. in eine Suspension des mikrobiellen Stoffwechselprodukts eingemischt werden; eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z.B. durch Aufsprühen oder Untermischen. Die Zugabe von Formulierungshilfsstoffen während der Trocknung kann z.B. eine Rolle spielen, wenn eine das Stoffwechselprodukt enthaltende Lösung oder Suspension versprüht wird. Insbesondere nach der Trocknung erfolgt eine Zugabe von Formulierungshilfsmitteln z.B. beim Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf getrocknete Par- tikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach einem eventuellen Coatingschritt können dem Produkt weitere Hilfsmittel zugegeben werden.
Das Entfernen der flüchtigen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe erfolgt in an sich bekannter Weise durch übliche Verfahren zur Abtrennung fester Phasen von flüs- sigen Phasen, einschließlich Filtrationsverfahren und Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile der flüssigen Phasen. Derartige Verfahren, die auch Schritte zur Grobreinigung der Wertstoffe sowie Schritte zur Konfektionierung umfassen können, werden z.B. in Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), und Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH, beschrieben. Im Rahmen der Produktformulierung bzw. der Aufarbeitung nach abgeschlossener Fermentation anwendbare, dem Fachmann bekannte Verfahren, Apparaturen, Hilfsstoffe bzw. allgemeine und spezielle Ausfüh- rungsformen sind ferner in EP 1038 527, EP 0648 076, EP 835613, EP 0219 276, EP 0394 022, EP 0547 422, EP 1088 486, WO 98/55599, EP 0758 018 und WO 92/12645 beschrieben.
In einer ersten, bevorzugten Ausführungsform der Abtrennung der flüchtigen Bestand- teile von dem Wertprodukt und den nicht-stärkehaligen festen Bestandteilen der Fermentationsbrühe wird man das nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukt, sofern es in der flüssigen Phase gelöst vorliegt, aus der flüssigen Phase in die feste Phase überführen, z.B. durch Kristallisation oder Fällung. Anschließend erfolgt eine Abtrennung der nichtflüchtigen festen Bestandteile einschließlich des Stoffwechselprodukts von den flüssigen Bestandteile mittels eines üblichen Verfahren der Fest-Flüssig- Trennung, z.B. mittels Zentrifugation, Dekantieren oder Filtration. In ähnlicher Weise kann man auch ölige Stoffwechselprodukte abtrennen, wobei man die jeweiligen öligen Fermentationsprodukte durch Zusatz von Adsorbentien, z.B. Kieselsäure, Kieselgele, Lehm, Ton und Aktivkohle, in eine feste Form überführt.
Die Fällung der mikrobiellen Stoffwechselprodukte kann in an sich bekannter Weise erfolgen (siehe z.B. J. W. Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993). Die Fällung kann beispielsweise durch Zugabe eines weiteren Lösungsmittels, Zugabe von Salzen und die Variation der Temperatur bewirkt werden. Der entste- hende Niederschlag kann, zusammen mit den übrigen festen Bestandteilen, durch die hier beschriebenen üblichen Verfahren zur Abtrennung von Feststoffen von der Brühe separiert werden.
Die Kristallisation von mikrobiellen Stoffwechselprodukten kann ebenfalls in üblicher Weise durchgeführt werden. Übliche Kristallisations-Verfahren sind z.B. in Janeic, S. J., Grootscholten, P.A., Industrial Crystallization, New York, Academic, 1984; A. W. Bam- forth: Industrial Crystallization, Leonard Hill, London 1965; G. Matz: Kristallisation, 2. Aufl., Springer Verlag, Berlin 1969; J. Nyvlt: Industrial Crystallization - State of the Art. VCH Verlagsges., Weinheim 1982; S. J. Janeic', P. A. M. Grootscholten: Industrial Crystallization, Reidel, Dordecht 1984; O. Söhnel, J. Garside: Precipitation, Butterworth-Heinemann, Oxford, 1992; A. S. Myerson (Hg.): Handbook of Industrial Crystallization, Butterworth-Heineman, Boston 1993; J. W. Mullin: Crystallization, 3. Aufl., Butterworth-Heinemann, Oxford 1993; A. Mersmann (Hg.): Crystallization Technology Handbook, Marcel Dekker, New York 1995 beschrieben. Eine Kristallisation kann z.B. durch Kühlung, Verdampfung, Vakuumkristallisation (adiabate Kühlung), Reaktionskristallisation oder Aussalzen initiiert werden. Die Kristallisation kann z.B. in gerührten und ungerührten Kesseln, im Direkt-Kontakt-Verfahren, in Verdampfungskristallisatoren (R. K. Multer, Chem Eng. (N.Y.) 89 (1982) March, 87-89), in Vakuumkristallisatoren absatzweise oder kontinuierlich, z.B. in Zwangsumlauf-Kristallisatoren (Swenson forced- circulation crystaller) oder Wirbelschicht-Kristallisatoren (Oslo-type) (A. D. Randolph, M. A. Larson: Theory of Particulate Processes, 2. Aufl. Academic Press, New York 1988; J. Robinson, J. E. Roberts, Can. J. Chem. Eng. 35 (1957) 105-1 12; J. Nyvlt: De- sign of Crystallizers, CRC Press, Boca Raton, 1992) durchgeführt werden. Auch fraktionierte Kristallisation ist möglich (L. Gordon, M. L. Salutsky, H. H. Willard: Precipita- tion from Homogeneous Solution, Wiley-Interscience, New York 1959). Ebenso können Enantiomere und Racemate getrennt werden (J. Jacques, A. Collet, S. H. Willen: En- antiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York 1981 ; R. A. Sheldon: Chiro- technology, Marcel Dekker, New York 1993; A. N. Collins, G. N. Sheldrake, J. Crosby (Hg.): Chirality in Industry, Wiley, New York 1985).
Übliche Filtrations-Verfahren sind z.B. die Kuchen- und Tiefenfiltration (z.B. beschrieben in A. Rushton, A. S. Ward, R. G. Holdich: Solid - Liquid Filtration and Separation Technology, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1996, pp. 177ff . , K. J. Ives, in A. Rushton (Hg.): Mathematical Models and Design Methods in Solid-Liquid Separation, NATO ASI series E Nr. 88, Martinus Nijhoff, Dordrecht 1985, pp. 90ff.) und Cross-flow- Filtrationen, insbesondere die Mikrofiltration zur Abtrennung von Feststoffen > 0,1 μm (z.B. beschrieben in J. Altmann, S. Ripperger, J. Membrane Sei. 124 (1997) 1 19 - 128.).
Bei der Mikro- und Ultrafiltration können z.B. mikroporöse (A. S. Michaels: "Ultrafiltration," in E. S. Perry (ed.): Progress in Separation and Purification, vol. 1 , Interscience Publ., New York 1968.), homogene (J. Crank, G. S. Park (eds.): Diffusion in Polymers, Academic Press, New York 1968; S. A. Stern: "The Separation of Gases by Selective Permeation," in P. Meares (ed.): Membrane Separation Processes, Elsevier, Amsterdam 1976.), asymetrische (R. E. Kesting: Synthetic Polymerie Membranes, A Structural Perspective, Wiley-Interscience, New York 1985.) und elektrisch geladene (F. HeIf- ferich: Ion-Exchange, McGraw-Hill, London 1962.) Membranen eingesetzt werden, die nach verschiedenen Verfahren erzeugt werden (R. Zsigmondy, US 1 421 341 , 1922; D. B. PaII, US 4 340 479, 1982; S. Loeb, S. Sourirajan, US 3 133 132, 1964.). Typische Werkstoffe sind Celluloseester, Nylon, Polyvinylchlorid, Acrylnitril, Polypropylen, PoIy- carbonat und Keramik. Der Einsatz dieser Membranen erfolgt als Plattenmodul (R. F. Madsen, Hyperfiltration and Ultrafiltration in Plate-and-Frame Systems, Elsevier, Amsterdam 1977), Spiralmodul (US 3 417 870, 1968 (D. T. Bray)), Rohrbündel bzw. Hohlfasermodul (H. Strathmann: "Synthetic Membranes and their Preparation," in M. C. Porter (ed.): Handbook of Industrial Membrane Technology, Noyes Publication, Park Ridge, NJ 1990, pp. 1 - 60). Daneben ist die Verwendung flüssiger Membranen möglich (N. N. Li: "Permeation Through Liquid Surfactant Membranes," AIChE J. 17 (1971) 459; S. G. Kimura, S. L. Matson, W. J. Ward IM: "Industrial Applications of Facili- tated Transport," in N. N. Li (ed.): Recent Developments in Separation Science, Bd. V, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1979, pp. 1 1-25). Die gewünschten Stoffe können sowohl feedseitig angereichert und über den Retentatstrom abgeführt als auch feedsei- tig abgereichert und über den FiltraWPermeatstrom abgeführt werden.
Übliche Zentrifugations-Verfahren sind z.B. in G. Hultsch, H. Wilkesmann, "Filtering Centrifuges," in D.B. Purchas, Solid - Liquid Separation, Upland Press, Croydon 1977, pp. 493 - 559; und H. Trawinski, Die äquivalente Klärfläche von Zentrifugen, Chem. Ztg. 83 (1959) 606-612 beschrieben. Verschiedene Bauformen wie Röhren- und Korbzentrifugen sowie im speziellen Schub-, Stülpfilterzentrifugen und Tellerseparatoren können eingesetzt werden.
In dem Verfahren gemäß dieser ersten Ausführungsform kann sich gegebenenfalls der Abtrennung der festen von der flüssigen Phase ein Trocknungsschritt anschließen, der in üblicher Weise durchgeführt wird. Übliche Verfahren zur Trocknung sind z.B. in O. Krischer, W. Käst: Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik, 3. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; R. B. Keey: Drying: Principles and Practi- ce, Pergamon Press, Oxford 1972; K. Kröll: Trockner und Trocknungsverfahren, 2. Aufl., Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1978; Williams-Gardener, A.: Industrial Drying, Houston, GuIf, 1977; K. Kröll, W. Käst: Trocknen und Trockner in der Produktion, Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1989 beschrieben. Zu den Beispielen für Trocknungsverhafen zählen Verfahren zur Konvektionstrocknung, z.B. in einem Tro- ckenofen, Tunneltrockner, Bandtrockner, Scheibentrockner, Jettrockner, Wirbelschichttrockner, belüftete sowie rotierende Trommeltrockner, Sprühtrockner, Stromtrockner, Zyklontrockner, Mischertrockner, Pasten-Mahltrockner, Mahltrockner, Ringtrockner, Schachttrockner, Drehrohrtrockner, Karusseltrockner. Weitere Verfahren nutzen die Kontakttrocknung, z.B. Schaufeltrockner; Vakuum- bzw. Gefriertrocknung, Konustrock- ner, Nutschtrockner, Scheibentrockner, Dünnschicht-Kontakttrockner, Walzentrockner, Zähphasen-Trockner, Tellertrockner, Wendelfördertrockner, Doppelkonustrockner; o- der Wärmestrahlung (Infrarot, z.B. Infrarot-Drehrohrtrockner) oder dielektrische Energie (Mikrowellen) zur Trocknung. Die für thermische Trocknungsverfahren verwendeten Trocknungsapparate werden meist durch Dampf, Öl, Gas oder elektrischen Strom beheizt und können, je nach Auslegung, zum Teil unter Vakuum betrieben werden.
Die abgetrennte flüssige Phase kann als Prozesswasser zurückgeführt werden. Der Anteil der nicht in den Prozess zurückgeführten flüssigen Phase kann in einer mehrstufigen Eindampfung zu einem Sirup aufkonzentriert werden. Wenn vor dem Dekantieren das gewünschte Stoffwechselprodukt nicht von der flüssigen in die feste Phase überführt wurde, dann enthält der so erhaltene Sirup auch das Stoffwechselprodukt. Der Sirup weist in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 20 bis 80 Gew.-% und besonders bevorzugt 25 bis 65 Gew.-% auf. Dieser Sirup wird mit den beim Dekantieren abgetrennten Feststoffen vermischt und anschließend getrocknet. Die Trocknung kann z.B. mittels Trommeltrockner, Sprühtrockner oder Schaufeltrockner erfolgen, bevorzugt wird ein Trommeltrockner eingesetzt. Die Trocknung wird bevorzugt so durchgeführt, dass der erhaltene Feststoff ei- nen Gehalt an Restfeuchte von maximal 30 Gew.-%, bevorzugt maximal 20 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des erhaltenen Feststoffs, aufweist.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Abtrennung der flüchtigen Bestand- teile von dem Wertprodukt und den nicht-stärkehaligen festen Bestandteilen der Fermentationsbrühe werden die flüchtigen Bestandteile, ggf. nach einem zuvor beschriebenen Vorabtrennungsschritt fester Bestandteile, durch Verdampfen entfernt. Das Verdampfen kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Beispiele für geeignete Verfahren zum Verdampfen flüchtiger Bestandteile sind die Sprühtrocknung, Wirbelschichttrock- nung bzw. -agglomeration, Gefriertrocknung, Strom- und Kontakttrocknern sowie Extrusionstrocknung. Auch eine Kombination der vorgenannten Verfahren mit formgebende Verfahren wie Extrusion, Pelletierung oder Prilling kann vorgenommen werden. Beii diesen letztgenannten Verfahren werden vorzugtsweise teilweise oder weitgehend vorgetrocknete Stoffwechselprodukt-haltige Stoffgemische eingesetzt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe ein Verfahren zur Sprühtrocknung oder ein Verfahren der Wirbelschichttrocknung, einschließlich der Wirbelschichtgranulierung. Hierzu wird die Fermentationsbrühe, gegebenenfalls nach einer Vorabtrennung zur Entfer- nung grober Feststoffpartikel, die keine oder nur geringe Anteile an nichtflüchtigem mikrobiellen Stoffwechselprodukt enthalten, einer oder mehreren Sprüh- oder Wirbelschichttrocknungsapparaturen zugeführt. Der Transport bzw. die Zuführung der fest- stoffbeladenen Fermentationsbrühe erfolgt zweckmäßigerweise mittels üblicher Trans- Portvorrichtungen für feststoffhaltige Flüssigkeiten, z.B. Pumpen wie Exzenterschneckenpumpen (z.B. der Fa. Delasco PCM) oder Hochdruckpumpen (z.B. der Fa. LEWA Herbert Ott GmbH).
Als Sprühtrocknungsvorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Sprühtrocknungsapparaturen zum Einsatz kommen, wie z.B. in der oben zitierten Literatur beschrieben, insbesondere Düsentürme, speziell mit Druckdüsen, und Scheibentürme; Sprühtrockner mit integriertem Wirbelbett und Wirbelschicht- Sprühgranulatoren werden vorzugsweise in der unten beschriebenen Ausführungsform unter Einsatz von Wirbelschicht-Trocknung eingesetzt.
Für die Trocknung mittels Sprühtrocknung, sind insbesondere Anlagen geeignet, in denen die feststoffbeladene Fermentationsbrühe im Gleich- oder Gegenstrom, bevorzugt im Gegenstrom getrocknet wird. Dabei wird die Fermentationsbrühe vorteilhafter- weise am Kopf eines vertikal ausgerichteten Sprühturms durch eine Düse oder über eine rotierende Scheibe in diesen eingeleitet und gleichzeitig zerstäubt, während der zur Trocknung eingesetzte Gasstrom, z.B. Luft oder Stickstoff, im oberen bzw. unteren Bereich des Sprühturms in diesen eingeleitet wird. Die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe werden über den unteren Auslass bzw. den Kopf des Sprühturms ausgetragen, während die nichtflüchtigen bzw. festen Bestandteile einschließlich des gewünschten mikrobiellen Stoffwechselprodukts als ein im Wesentlichen trockenes Pulver unten ausgetragen bzw. dem Sprühturm entnommen und der Weiterverarbeitung zugeführt werden können.
Die gewünschte Restfeuchte der Produkte muss jedoch nicht bereits in diesem einen Trocknungsschritt erreicht werden, sondern kann in einem anschließenden weiteren Trocknungsschritt eingestellt werden. Hierzu kann z.B. eine Wirbelschichtrocknung an die Sprühtrocknung angeschlossen werden. Die Abluft des Sprühturms und/oder der Wirbelschicht wird vorteilhafterweise von mitgerissenen Partikeln bzw. Staub mittels Zyklon und/oder Filter befreit und zur Weiterverarbeitung aufgefangen; die flüchtigen Bestandteile können dann gegebenenfalls z.B. in einer Kondensationseinheit aufgefangen und weiter verwendet werden, z.B. als rückgeführtes Prozesswasser.
Bei Auslegung und Betrieb der verwendeten Apparatur wird ein Fachmann den teil- weise erheblichen Feststoffanteil in der Fermentationsbrühe entsprechend berücksichtigen. So sind insbesondere die Innendurchmesser und/oder Austrittsöffnungen eingesetzter Sprühdüsen so auszuwählen, dass die Neigung zu Verstopfung oder Verblo- ckung möglichst gering gehalten bzw. eliminiert wird. Eine angemessene Größe der Austrittsöffnungen bzw. des Innendurchmessers wird in der Regel bei mindestens 0,4 mm, bevorzugt mindestens 1 mm und üblicherweise, in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Fermentationsbrühe und der darin enthaltenen Stoffe, vom Druck und von dem gewünschten Durchsatz, im Bereich von 0,6 bis 5 mm liegen.
Der zur Trocknung eingesetzte Gasstrom weist üblicherweise eine Temperatur oberhalb der Siedetemperatur der wässrigen Fermentationsbrühe bei dem gewünschten Druck auf, z.B. im Bereich von 110 bis 300 °C, insbesondere von 120 bis 250 °C und speziell 130 bis 220 °C. Ein Erwärmen des wässrigen Fermentationsmediums auf eine Temperatur unterhalb seines Siedepunktes, z.B. im Bereich von 25 bis 85 °C und insbesondere von 30 bis 70 °C, ist ebenfalls möglich, um den Trocknungsprozess zu unterstützen. Ebenfalls möglich ist eine Überhitzung des wässrigen Fermentationsmediums über vorzugsweise 100 °C, wobei das Flüssigmedium soweit erhitzt wird, dass es vor der Düse unter dem gewählten Druck noch nicht siedet und nach Entspannung durch die Düse eine spontane Verdampfung eintritt.
Die Fermentationsbrühe kann vor Einleitung in den Sprühturm zusätzlich mit einem gegebenenfalls vorgeheizten, z.B. auf eine Temperatur im Bereich von 30 bis 90 °C, Gasstrom, z.B. Luft oder Stickstoff, vermischt werden. Bei Verwendung von Zweistoff- statt Einstoffdüsen kann diese Vermischung direkt vor Eintritt in den eigentlichen Trocknungsraum des Sprühturms erfolgen.
Bei der Auswahl der Temperaturen ist in jedem Fall die Hitzestabilität bzw. Siedetemperatur des jeweils gewünschten mikrobiellen Stoffwechselprodukts zu berücksichti- gen. In der Regel ist es zweckmäßig, die Temperatur des zur Trocknung verwendeten Gasstroms auf eine Temperatur einzustellen, die um mindestens 20 °C und bevorzugt mindestens 50 °C unterhalb der Siede- oder Zersetzungstemperatur des betreffenden nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts liegt. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Temperatur des Trockenguts z.T. deutlich unter der Temperatur des zugeführ- ten Gasstroms liegen kann, solange noch nicht alle flüchtigen Bestandteile abgedampft wurden. Insofern wird die Temperatur des Trockengutes auch über die Einstellung der Verweilzeit beeinflusst. Der Trocknungsvorgang kann daher, zumindest zeitweise, mit Zulufttemperaturen durchgeführt werden, die im Bereich des Siedepunktes der zu trocknenden Stoffwechselprodukte oder darüber liegen. Die geeigneten Temperatur- bedingungen kann der Fachmann durch Routineexperimente ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform führt man die Trocknung in einem vertikal ausgerichteten Sprühturm, der im Gleich- oder Gegenstrom, bevorzugt im Ge- genstrom betrieben wird, durch. Die Einleitung der auf Raumtemperatur abgekühlten oder noch bei der Fermentationstemperatur oder darunter befindlichen, z.B. von 18 °C bis 37 °C, feststoffbeladenen Fermentationsbrühe erfolgt am Kopf des Sprühturms ü- ber eine oder mehrere, z.B. 1 , 2, 3 oder 4, insbesondere 1 oder 2 Sprühdüsen. In den oberen bzw. unteren Bereich des Sprühturms leitet man den zur Trocknung vorgesehenen heißen Gasstrom, vorzugsweise Luft, ein. Das erhaltene Pulver wird am unteren Ende bzw. am Kopf des Sprühturms entnommen. Sofern gewünscht, kann hieran eine Wirbelschichttrocknung angeschlossen werden.
Die mittlere Teilchengröße der erhaltenen Pulver wird entscheidend durch den erreichten Grad an Zerstäubung bei Einleitung der feststoffbeladenen Fermentationsbrühe in den Sprühturm bestimmt. Der Zerstäubungsgrad hängt seinerseits vom aufgewendeten Druck an den Sprühdüsen bzw. der Rotationsgeschwindigkeit der rotierenden Scheibe ab. Der an den Sprühdüsen angelegte Druck liegt üblicherweise im Bereich von 5 bis 200 bar, z.B. bei etwa 10 bis 100 bar und insbesondere bei etwa 20 bis 60 bar, über Normaldruck. Die Rotationsgeschwindigkeit der rotierenden Scheibe liegt üblicherweise im Bereich von 5000 bis 30000 Upm. Die Durchsatzgeschwindigkeit des zur Trocknung eingeleiteten Gasstroms ist sehr stark vom Durchsatz des Flüssigmediums abhängig. Bei niedrigem Durchsatz an Flüssigmedium (z.B. im Bereich von 10 bis 1000 l/h) liegt sie üblicherweise im Bereich von 100 bis 10000 m3/h, bei höherem Durchsatz (z.B. im Bereich von 1000 bis 50000 l/h) üblicherweise im Bereich von 10000 bis 10000000 m3/h.
Gegebenenfalls können im Fachgebiet bekannte übliche Hilfsmittel zur Sprühtrocknung mit verwendet werden. Diese vermindern oder verhindern eine Agglomeration der im Sprühturm gebildeten primären Pulverteilchen, so dass die Eigenschaften der dem Sprühturm entnommenen Pulver gezielt beeinflusst werden können, z.B. bezüglich der Teilchengrößen, im Sinne eines verbesserten Trockengrades, einer verbesserten Rieselfähigkeit und/oder besseren Redispergierbarkeit in Lösungsmitteln wie Wasser. Als Beispiele üblicher Sprühhilfsmittel seien die oben erwähnten Formulierungshilfsmittel genannt. Diese werden in den üblicherweise verwendeten Mengen, z.B. im Bereich von 0,1 bis 50 Gew.-%, insbesondere 0,1 bis 30 Gew.-% und speziell 0,1 bis 10 Gew.- %, bezogen auf das Gesamttrockengewicht der nichtflüchtigen festen Bestandteile der Fermentationsbrühe, eingesetzt.
Die im Einzelfall zweckmäßigerweise zu wählende Auslegung der jeweiligen Apparatur, insbesondere die Abmessungen der eingesetzten Sprühdüsen und die geeigneten Be- triebsparameter, kann der Fachmann ohne Weiteres durch Routineexperimente ermitteln.
In einer weiteren Ausgestaltung der zweiten bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Verfahren zur Wirbelschichttrocknung. Hierbei gelten die oben für den Einsatz von Verfahren zur Sprühtrocknung gemachten Angaben in analoger Weise, z.B. zum Transport der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe, zur Auslegung der Apparaturen und zur Auswahl der Betriebsparameter, insbesondere der Betriebstemperatur. Als Wirbel- schicht-Trocknungsvorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Wirbelschichttrockner, insbesondere Sprühtrockner mit integriertem Wirbelbett und Wirbelschicht-Sprühgranulatoren, z.B. der Firmen Allgaier, DMR, Glatt, Heinen, Hüttlin, Niro und Waldner, zum Einsatz kommen.
Wirbelschichttrockner können kontinuierlich oder batchweise betrieben werden. Beim kontinuierlichen Betrieb beträgt die Verweilzeit im Trockner mehrere Minuten bis zu mehreren Stunden. Der Apparat ist deshalb auch zur Langzeit-Trocknung, z.B. über einen Zeitraum von etwa 1 h bis 15 h geeignet. Wenn eine enge Verweilzeitverteilung gewünscht ist, kann die Wirbelschicht durch Trennbleche kaskadiert werden oder der Produktfluss durch meanderförmige Einbauten einer idealen Kolbenströmung angenähert werden. Insbesondere größere Trockner werden in mehrere Trocknungszonen, z.B. 2 bis 10 und insbesondere 2 bis 5 unterteilt, die mit unterschiedlicher Gasgeschwindigkeit und -temperatur betrieben werden. Die letzte Zone kann dann als Kühlzone genutzt werden; in diesem Fall wird üblicherweise eine Zulufttemperatur im Be- reich von 10 bis 40 °C eingestellt.
Im Aufgabebereich des Feuchtguts wird man in der Regel darauf zu achten, dass keine Verklumpungen auftreten. Dies kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z.B. durch eine lokal höhere Gasgeschwindigkeit oder Einsatz eines Rührwerks. Bei kleine- ren Anlagen oder zwecks leichter Reinigung der Anlage können die Filter zur Abgasreinigung in den Wirbelschichttrockner integriert werden.
Bei den batchweise betriebenen Wirbelschichttrocknern liegt die Verweilzeit ebenfalls zwischen mehreren Minuten und Stunden. Auch diese Apparate sind zur Langzeit- Trocknung geeignet.
Wirbelschichttrockner können vibriert betrieben werden, wobei die Vibration den Produkttransport bei niedrigen Gasgeschwindigkeiten (d.h. unterhalb der Minimalfluidisati- ons-Geschwindigkeit) und niedriger Schichthöhe unterstützt und Verklumpungen verhindern kann. Neben der Vibration kann auch eine gepulste Gaszufuhr zur Reduzierung des Verbrauchs an Trocknungsgas angewendet werden. Das Feuchtgut wird im aufwärts gerichteten, heißen Gasstrom turbulent vermischt und trocknet dadurch bei hohen Wärme- und Stoffübergangskoeffizienten. Die erforderliche Gasgeschwindigkeit hängt im Wesentlichen von der Partikelgöße und -dichte ab. Beispielsweise können für Partikel mit Durchmessern von mehreren hundert Mikrometern Gasleerrohrgeschwindigkeiten im Bereich von 1 bis 10 m/s erforderlich sein. Ein perforierter Boden (Lochblech, Conidur-Blech, Böden aus Gewebe oder Sintermetall) verhindert das Durchfal- len des Feststoffs in den Heißgas-Raum. Die Wärmezufuhr erfolgt entweder nur über das Trocknungsgas oder es werden zusätzlich Wärmetauscher (Rohrbündel oder Platten) in die Wirbelschicht eingebracht (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991 ; Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995).
Im Übrigen gilt für die Wirbelschichttrocknung das für die Sprühtrocknung Gesagte in analoger Weise, z.B. hinsichtlich des Zusatzes von Trocknungshilfsmitteln und der dadurch möglichen Beeinflussung der Produkteigenschaften.
Im Fall öliger Stoffwechselprodukte kann eine Trocknung unter Einsatz eines Wirbelschichtapparats oder eines Mischers z.B. derart vorgenommen werden, dass man ein Adsorptionmittel in dem Wirbelschichtapparat oder Mischer vorlegt und durchmischt bzw. fluidisiert. Die Fermentationsbrühe mit den öligen Stoffwechselprodukten wird hierbei auf das Adsorptionsmittel aufgesprüht. Die flüchtigen Bestandteile der Fermen- tationsbrühe können dann durch Energieeintrag in den Mischer abgedampft werden oder werden durch den erhitzten Luftstrom in der Wirbelschicht verdunstet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Verfahren zur Gefriertrock- nung. Dabei wird die feststoffhaltige Fermentationsbrühe vollständig eingefroren und die gefrorenen flüchtigen Bestandteile aus dem festen Zustand verdampft, d.h. subli- miert (Georg-Wilhelm Oetjen, Gefriertrocknen, VCH 1997). Als Gefriertrocknungsvorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Gefriertrockner, z.B. der Firmen Klein Vakuumtechnik und Christ, zum Einsatz kommen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Stromtrocknern. Dabei wird die feststoffhaltige Fermentationsbrühe in den unteren Teil eines vertikal stehenden Trock- nungsrohrs gegeben. Das Trocknungsgas treibt mit Gasleerrohrgeschwindigkeiten von 10 bis 20 m/s die entstehenden Partikel nach oben. Die Aufgabe der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe erfolgt mit Schnecken, Schleuderrädern oder durch pneumatischen Eintrag. Die Partikel werden am Kopf des Trocknungsrohrs mittels Zyklon abge- schieden und können, falls der gewünschte Trocknungsgrad noch nicht erreicht ist, in das Trocknungsrohr zurückgeführt werden oder in eine nachgeschaltete Wirbelschicht geleitet werden (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991 ; Arun S. Mujumdar, Handbook of Industrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995). Als Vorrichtungen können alle herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Stromtrockner, z.B. der Firmen Nara und Orth, zum Einsatz kommen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe unter Einsatz von Kontakttrocknern. Diese Art von Trocknern eignet sich besonders gut für das Trocknen von pastösen Medien. Der Einsatz von Kontakttrockner ist jedoch auch vorteilhaft für Medien, worin die Feststoffe bereits in partikulärer Form vorliegen. Die feststoffhaltige Fermentationsbrühe wird auf die Heizflächen des Trockners gegeben, über die der Energieeintrag erfolgt. Die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe verdampfen (K. Masters: Spray Drying Handbook, Longman Scientific & Technical 1991 ; Arun S. Mujumdar, Handbook of In- dustrial Drying, Marcel Dekker, Inc. 1995). Eine Vielzahl unterschiedlicher Bauformen von Kontakttrocknern existieren und kommen zum Einsatz, siehe hierzu die oben genannten Beispiele. Diese sind dem Fachmann insbesondere bekannt als: Dünnschicht- Kontakttrockner, z.B. der Firma BUSS-SMS, Walzentrockner, z.B. der Firma Gouda, Schaufeltrockner, z.B. der Firmen BTC-Technology und Drais, Kontaktbandtrockner, z.B. der Firmen Kunz und Merk sowie rotierende Rohrbündeltrockner, z.B. der Fa. Vetter.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der Formulierungshilfsstoffe vor der Trocknung eingesetzt werden, können z.B. Stabilisatoren oder Bindemittel wie Polyvinylalkohol und Gelatine, in eine Suspension des mikrobiel- len Stoffwechselprodukts eingemischt werden, z.B. in einem Rührbehälter oder vor einem statischen Mischer. Eine solche Suspension kann auch auf ein Trägermaterial gegeben werden, z.B. durch Aufsprühen oder Untermischen in einem Mischer oder in einem Wirbelbett.
Eine weitere spezielle Ausführungsform, bei der Formulierungshilfsstoffe während der Trocknung zugegeben werden, betrifft die Puderung von feuchten, das Stoffwechselprodukt enthaltenden Tropfen (vgl. hierzu die EP 0648 076 und EP 835613), wobei die Stoffwechselprodukt-haltige Suspension versprüht wird, die Tropfen zur Stabilisierung mit Puderungsmittel, z.B. Kieselsäure, Stärke oder einem der zuvor genannten Puderungsmittel bzw. Fließhilfsmittel, gepudert und anschließend gegebenenfalls getrocknet werden, z.B. in einer Wirbelschicht.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform, bei der Formulierungshilfsstoffe nach der Trocknung zugegeben werden, betrifft z.B. das Aufbringen von Überzügen bzw. Coatings/Coatingschichten auf getrocknete Partikel. Sowohl nach dem Trocknen als auch nach dem Coatingschritt können dem Produkt insbesondere Fließhilfsmittel zur Verbesserung der Fließeigenschaften, z.B. Kieselsäure, Stärken oder die anderen zuvor genannten Fließhilfsmittel, zugegeben werden.
Zur Gewinnung öliger Stoffwechselprodukte oder solcher mit einem Schmelzpunkt unterhalb des Siedepunktes von Wasser wird das betreffende Produkt vorteilhafterweise auf einem Adsorptionsmittel (Beispiele siehe oben) adsorbiert. Dabei geht man in der Regel so vor, dass man das betreffende Adsorptionsmittel am oder nach dem Ende der Fermentation der Fermentationsbrühe zugibt. Gegebenenfalls kann die Zugabe des Adsorptionsmittels nach vorheriger Aufkonzentration der Fermentationsbrühe erfolgen. Es können sowohl hydrophobe als auch hydrophile Adsorptionsmittel eingesetzt wer- den. Im ersteren Fall werden die Adsorptionsmittel zusammen mit dem adsorbierten Stoffwechselprodukt in gleicher Weise wie die festen Bestandteile zusammen mit diesen von den flüchtigen Bestandteilen der Fermentationsbrühe abgetrennt. Im letzteren Fall ist darauf zu achten, dass die gelöst oder suspendiert vorliegenden Adsorptionsmittel mit den adsorbierten Produkten durch die Aufarbeitung nicht ausgetragen wer- den. Bei Einsatz einer Filtration kann dies z.B. durch die Wahl einer genügend kleinen Porengröße der Filter erreicht werden. Bevorzugte hydrophobe bzw. hydrophile Adsor- bentien sind die oben im Zusammenhang mit der Herstellung nichtflüchtiger mikrobiel- ler Stoffwechselprodukte in pseudofester Form genannten Adsorbentien, insbesondere Kieselgur, Kieselsäure, Zucker und die oben genannten anorganischen und organi- sehen Alkali- und Erdalkalimetallsalze.
Eine weitere Möglichkeit der Produktformulierung besteht in der Formgebung durch mechanische Einwirkung, z.B. mittels Extrusion, Pelletierung oder sogenanntem PrN- ling. Hierbei wird das Stoffwechselprodukt bzw. das dieses enthaltende Stoffgemisch, das vorzugsweise getrocknet, vorgetrocknet und/oder mit Formulierungshilfsmitteln versetzt wurde, in der Regel durch eine Matrize oder ein Sieb gepresst. Die Förderung des Produktes zu der Matrize erfolgt üblicherweise durch eine oder mehrere Schnecken, einen Kollergang oder andere mechanische, z.B. rotierende oder sich longitudi- nal bewegende, Bauteile. Die nach Durchgang durch die Matrize oder das Sieb anfallenden Stränge können mechanisch, z.B. mit einem Messer, abgetrennt werden oder gegebenenfalls quasi von selbst zu kleineren Partikeln zerfallen. Formgebende Verfahren zur Produktformulierung, die ohne Matrizen arbeiten, sind z.B. die Kompaktierung und Granulierung in Mischern, z.B. die sogenannte „ high shear granulation" .
Die genannten formgebenden Verfahren werden vorteilhaft eingesetzt, wenn durch Eindampfen einer Stoffwechselprodukt-haltigen Suspension und/oder durch Zugabe von Formulierungshilfsstoffen, z.B. Trägermaterialien wie Stärke und Klebermaterialien wie Lignin oder Polyvinylalkohol, zu einer solchen direkt ein Material erhältlich ist, das hochviskos, teigig bzw. granulierbar und somit unmittelbar in einem dieser Verfahren einsetzbar ist. Anderenfalls kann die erforderliche hochviskose bzw. teigige Konsistenz auch vor Extrusion, Pelletierung, Kompaktierung, Granulierung (z.b. high shear granu- lation) oder Prilling durch Trocknung bzw. Vortrocknung der Stoffwechselprodukt- enthaltenden Suspension, z.B. der Fermentationsbrühe, mittels der oben beschriebenen Trocknungsverfahren, bevorzugt mittels Sprühtrocknung eingestellt werden. Das so gewonnene Produkt wird gegebenenfalls mit üblichen, dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Formulierungshilfsstoffen gemischt und einer Extrusion, Pelletierung, Kompaktierung, Granulierung oder dem Prilling zugeführt. Diese Verfahren können auch so betrieben werden, dass vor dem formgebenden Schritt wenigstens ein Inhaltsstoff des Stoffwechselprodukt-haltigen Stoffgemischs aufgeschmolzen wird und nach dem formgebenden Schritt wieder erstarrt. Für eine derartige Ausführung ist in der Regel eine Zugabe von üblichen, dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Hilfsstof- fen erforderlich. Die hierbei erhaltenen Produkte haben typischerweise Partikelgrößen im Bereich von 500 μ m bis 0,05 m. Durch Zerkleinerungsverfahren wie Mahlung, gegebenenfalls in Kombination mit Siebverfahren, lassen sich hieraus, sofern gewünscht, kleinere Partikelgrößen erhalten.
Die durch die beschriebenen formgebenden Formulierungsverfahren gewonnen Parti- kel können durch die oben beschriebenen Trocknungsverfahren bis auf den gewünschten Restfeuchtigkeitsgehalt getrocknet werden.
Alle in einer der oben beschriebenen Weisen in fester Form erhaltenen Stoffwechselprodukte bzw. diese enthaltenden Stoffgemische, z.B. Partikel, Granulate und Extruda- te, können mit einem Überzug bzw. einem Coating beschichtet werden, d.h. mit mindestens einer weiteren Stoffschicht überzogen werden. Das Coaten erfolgt z.B. in Mischern oder Wirbelschichten, in denen die zu beschichtenden Teilchen aufgewirbelt bzw. „ fluidisiert" werden und dann mit dem Überzugs- bzw. Coatingmaterial be- sprüht werden. Das Coatingmaterial kann trocken, z.B. als Pulver, oder in Form einer Lösung, Dispersion, Emulsion oder Suspension in einem Lösungsmittel, z.B. Wasser, organische Lösungsmittel und Mischungen davon, insbesondere in Wasser, vorliegen. Sofern vorhanden, wird das Lösungsmittel während oder nach dem Aufsprühen auf die Teilchen durch Verdampfen entfernt. Des Weiteren können Coatingmaterialien wie Fette auch als Schmelzen aufgebracht werden.
Coatingmaterialien, die als wässrige Dispersion oder Suspension aufgesprüht werden können sind z.B. in der WO 03/059087 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyolefine wie Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenwachse, Wachse, Salze wie (Erd-)Alkalimetallsulfate, -Chloride und -carbonate, z.B. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Calciumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Natriumcarbo- nat, Magnesiumcarbonat und Calciumcarbonat; Acronale, z.B. Butylacrylat- Methylacrylat-Copolymer, die Styrofan-Marken der Fa. BASF, z.B. auf Basis von Styrol und Butadien, und hydrophobe Substanzen wie in der WO 03/059086 beschrieben. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 15 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.
Coatingmaterialien, die als Lösungen aufgesprüht werden können sind z.B. Polyethy- lenglykole, Cellulosederivate wie Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Ethylcellulose, Polyvinylalkohol, Proteine wie Gelatine, Salze wie (Erd-)Alkalimetall- sulfate, -Chloride und -carbonate, z.B. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Calciumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Natriumcarbonat, Magnesiumcarbonat und Calciumcarbonat; Kohlenhydrate wie Zucker, z.B. Glucose, Lactose, Fructo- se, Saccharose und Trehalose; Stärken und modifizierte Stärken. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coatingmaterials typischerweise im Bereich von 0,1 bis 30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,2 bis 15 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 10 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.
Coatingmaterialien, die als Schmelze aufgesprüht werden können sind z.B. in der DE 199 29 257 und WO 92/12645 beschrieben. Hierzu gehören insbesondere Polyethy- lenglykole, synthetische Fette und Wachse, z.B. Polygen WE® der Fa. BASF, natürliche Fette wie tierische Fette, z.B. Bienenwachs, und pflanzliche Fette, z.B. Candelila- wachs, Fettsäuren, z.B. tierische Wachse, Taigfettsäuren, Palmitinsäure, Stearinsäure, Triglyceride, Edenor-Produkte, Vegeole-Produkte, Montanesterwachse, z.B. Luwax E® der Fa. BASF. Bei Applikation derartiger Materialien liegt der Feststoffgehalt des Coa- tingmaterials typischerweise im Bereich von 1 bis 30 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 2 bis 25 Gew.-% und speziell im Bereich von 3 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des formulierten Endprodukts.
Coatingmaterialien, die als Pulver beim Trockencoating verwandt werden können sind z.B. Polyethylenglykole, Cellulose und Cellulosederivate wie Methylcellulose, Hydro- xypropylmethylcellulose und Ethylcellulose, Polyvinylalkohol, Proteine wie Gelatine, Salze wie (Erd-)Alkalimetallsulfate, -Chloride und -carbonate, z.B. Natriumsulfat, Mag- nesiumsulfat, Calciumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Natri- umcarbonat, Magnesiumcarbonat und Calciumcarbonat; Kohlenhydrate wie Zucker, z.B. Glucose, Lactose, Fructose, Saccharose und Trehalose, Stärken und modifizierte Stärken, Fette, Fettsäuren, Talg, Mehl, z.B. aus Mais, Weizen, Roggen, Gerste oder Reis, Ton, Asche und Kaolin. Die Verklebung des als Coating aufzubringenden Pulvers mit den zu beschichtenden Produkten kann mit den Stoffen, die als Lösungen oder als Schmelzen aufgesprüht werden können, erfolgen. Das Sprühen dieser Lösungen oder Schmelzen kann alternierend zum Einbringen des Pulvers oder parallel erfolgen. Vorzugsweise wird das zu coatende Produkt in einer Wirbelschicht oder einem Mischer fluidisiert. Das Pulver wird dann, bevorzugt kontinuierlich, zum Coaten in die Wirbel- schicht oder den Mischer geführt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird während der Pulverzugabe die Lösung oder Schmelze in den Prozessraum gegeben. Die Lösung kann z.B. über einen Stutzen zugeführt oder bevorzugt durch eine Düse (z.B. Einstoff- oder Zweistoffdüse) in den Prozessraum eingesprüht werden. Besonders bevorzugt sind die Aufgabestelle des Pulvers und die Position der Düse in dem Prozessraum räumlich voneinander getrennt, so dass die Lösung oder Schmelze vorwiegend das zu coatende Produkt und nicht das aufzubringende Pulver trifft.
Es ist ebenfalls möglich, Mischungen verschiedener Coatingmaterialien aufzubringen, insbesondere können mehrere gleiche oder unterschiedliche Coatingschichten sukzes- sive aufgebracht werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann das gewünschte nichtflüchtige mikrobielle Stoffwechselprodukt zusammen mit den festen Bestandteilen der Fermentationsbrühe ähnlich wie das bei der Herstellung von Bioethanol anfallende Nebenprodukt (das dort „ Distiller' s Dried Grains with Solubles (DDGS)" genannt und als solches vermarktet wird) aus der verbleibenden Fermentationsbrühe gewonnen werden. Hierbei kann eine im Wesentlichen vollständige oder nur teilweise Abtrennung der flüssigen Bestandteile der Fermentationsbrühe von den Feststoffen erfolgen. Das auf diese Weise erhaltene proteinhaltige Nebenprodukt kann sowohl vor als auch nach weiteren Be- bzw. Verarbeitungsschritten als Futtermittel oder Futtermitteladditiv zur Fütterung von Tieren, bevorzugt von landwirtschaftlichen Nutztieren, besonders bevorzugt von Rindern, Schweinen und Geflügel, ganz besonders bevorzugt von Rindern verwendet werden.
Üblicherweise wird hierzu die gesamte Brühe, d.h. einschließlich des nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts sowie der sonstigen unlöslichen bzw. festen Bestandteile, in einer ein- oder in der Regel mehrstufigen Verdampfung teilweise aufkon- zentriert (eingedampft) und die enthaltenen Feststoffe werden anschließend von der verbliebenen Flüssigkeit (flüssige Phase) abgetrennt, z.B. mit einem Dekanter. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann zunächst das gewünschte Stoffwechselprodukt, z.B. durch Kristallisation oder Fällung, aus der flüssigen Phase in die feste Form überführt werden, so dass es mit den sonstigen Feststoffen zusammen gewonnen wird. Die hier abgetrennten Feststoffe weisen in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 80 Gew.-%, bevorzugt 15 bis 60 Gew.-% und besonders bevorzugt 20 bis 50 Gew.-% auf und können gegebenenfalls mit üblichen, z.B. den oben beschriebenen, Trocknungsverfahren weiter getrocknet werden. Die durch weitere Be- bzw. Verarbeitung erhaltene fertige Formulierung weist vorteilhafterweise einen Gehalt von mindestens etwa 90 Gew.-% Trockensubstanz auf, so dass die Gefahr von Verderb bei einer Lagerung reduziert ist.
Die abgetrennte flüssige Phase kann als Prozesswasser zurückgeführt werden. Der Anteil der nicht in den Prozess zurückgeführten flüssigen Phase kann in einer mehrstu- figen Eindampfung zu einem Sirup aufkonzentriert werden. Wenn vor dem Dekantieren das gewünschte Stoffwechselprodukt nicht von der flüssigen in die feste Phase überführt wurde, dann enthält der so erhaltene Sirup auch das Stoffwechselprodukt. Der Sirup weist in der Regel einen Gehalt an Trockensubstanz im Bereich von 10 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 20 bis 80 Gew.-% und besonders bevorzugt 25 bis 65 Gew.-% auf. Dieser Sirup wird mit den beim Dekantieren abgetrennten Feststoffen vermischt und anschließend getrocknet. Die Trocknung kann z.B. mittels Trommeltrockner, Sprühtrockner oder Schaufeltrockner erfolgen, bevorzugt wird ein Trommeltrockner eingesetzt. Die Trocknung wird bevorzugt so durchgeführt, dass der erhaltene Feststoff einen Gehalt an Restfeuchte von maximal 30 Gew.-%, bevorzugt maximal 20 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamttrockengewicht des erhaltenen Feststoffs, aufweist. Nicht nur die in dieser alternativen Ausführungsform abgetrennte flüssige Phase kann als Prozesswasser zurückgeführt werden, sondern auch die bei den anderen oben beschriebenen Ausführungsformen gegebenenfalls aufgefangenen flüchtigen Bestandteile nach deren Kondensation. Diese rückgeführten Teile der flüssigen bzw. flüchtigen Phase können vorteilhaft z.B. ganz oder teilweise bei der Herstellung der zuckerhaltigen Flüssigkeit nach Schritt a) eingesetzt werden oder zum Ansetzen von Puffer- bzw. Nährsalzlösungen für den Einsatz in der Fermentation verwendet werden. Bei der Zumischung von rückgeführtem Prozesswasser in Schritt a) ist zu berücksichtigen, dass ein zu hoher Anteil die Fermentation durch ein Überangebot an bestimmten Mineral- Stoffen und Ionen, z.B. Natrium- und Lactationen, negativ beeinflussen kann. Vorzugsweise ist der Anteil an rückgeführtem Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension zur Stärkeverflüssigung erfindungsgemäß daher auf maximal 75 Gew.-%, bevorzugt maximal 60 Gew.-% und besonders bevorzugt maximal 50 Gew.-% beschränkt. Vorteilhafterweise liegt der Anteil an Prozesswasser beim Ansetzen der Suspension in der bevorzugten Ausgestaltung von Schritt a2) im Bereich von 5 bis 60 Gew.-% und bevorzugt von 10 bis 50 Gew.-%.
Durch die hier beschriebenen Verfahren der Trocknung und Konfektionierung können die mittleren Teilchengrößen der erhaltenen Feststoffe in einem großen Bereich variiert werden, z.B. von relativ kleinen Teilchen im Bereich von etwa 1 bis 100 μ m, über mittlere Teilchengrößen im Bereich von 100 bis zu mehreren hundert μ m, bis hin zu relativ großen Teilchen von etwa wenigstens 500 μ m oder etwa 1 mm und größer bis hin zu mehreren mm, z.B. bis 10 mm. Bei der Herstellung von Pulvern liegt die mittlere Teilchengröße in der Regel im Bereich von 50 bis 1000 μ m. Bei Herstellung anderer fester Formen der Produkte, z.B. Extrudaten, Kompaktaten und insbesondere Granulaten, z.B. durch Wirbelschicht-Sprühtrockner und - Sprühgranulatoren hergestellten, werden in der Regel größere Dimensionen eingestellt, hierbei liegt die mittlere Teilchengröße häufig im Bereich von 200 bis 5000 μ m. Der Begriff „ mittlere Teilchengröße" bezieht sich hierbei auf den Durchschnittswert der maximalen Teilchenlängen bei den einzelnen Teilchen im Falle nicht-sphärischer Partikel bzw. auf den Durchschnittswert der Durchmesser sphärischer oder näherungsweise sphärischer Partikel. Zu beachten ist, dass durch Agglomeration der Primärpartikel während des Sprühtrocknungsprozesses größere Sekundärpartikel gebildet werden können. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die bei Sprühtrocknungen üblichen Teilchengrößenverteilungen erhalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass man (i) dem in Schritt a2) erhaltenen zuckerhaltigen Flüssigmedium, das die nichtstärkehaltigen festen Bestandteile der unter Getreidekörnen ausgewählten Stärkequelle enthält, eine Teilmenge von nicht mehr als 50 Gew.-% entnimmt und mit der Restmenge eine Fermentation zur Herstellung eines ersten nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts (A) in fester Form durchführt; und
(ii) von dieser Teilmenge die nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle ganz oder teilweise abtrennt und mit dieser eine Fermentation zur Herstel- lung eines zweiten nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts (B) in fester Form, das mit dem Stoffwechselprodukt (A) identisch oder davon verschieden ist, durchführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile gemäß (ii) so, dass der Feststoffgehalt des verbleibenden Anteils des zuckerhaltigen Flüssigmediums maximal 50 Gew.-%, bevorzugt maximal 30 Gew.- %, besonders bevorzugt maximal 10 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-% beträgt.
Diese Vorgehensweise ermöglicht es, in der separaten Fermentation gemäß (ii) Mikroorganismen einzusetzen, für die bestimmte Mindestanforderungen erfüllt sein müssen, z.B. bezüglich der Sauerstofftransferrate. Für solche in der separaten Fermentation gemäß (ii) eingesetzten Mikroorganismen kommen z.B. Bacillus species, bevorzugt Bacillus subtilis in Betracht. Die durch derartige Mikroorganismen in der separaten Fermentation produzierten Verbindungen sind insbesondere unter Vitaminen, Cofakto- ren und Nutrazeutika, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden und Nukleotiden, Lipi- den, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, aromatischen Verbindungen, Proteinen, Carotinoiden, speziell unter Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika, Proteinen und Carotinoiden und ganz speziell unter Riboflavin und Calciumpantothenat ausgewählt.
Eine bevorzugte Ausgestaltung dieser Vorgehensweise betrifft die parallel betriebene Herstellung gleicher Stoffwechselprodukte (A) und (B) in zwei separaten Fermentationen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn für verschiedene Anwendungen des gleichen Stoffwechselprodukts unterschiedliche Anforderungen an die Reinheit zu stel- len sind. Demnach wird das erste Stoffwechselprodukt (A), z.B. eine als Futtermitteladditiv zu verwendende Aminosäure, z.B. Lysin, unter Einsatz der feststoffhaltigen Fermentationsbrühe und das gleiche zweite Stoffwechselprodukt (B), z.B. die gleiche als Nahrungsmitteladditiv zu verwendende Aminosäure, hier z.B. Lysin, unter Einsatz der gemäß (ii) feststoffabgereicherten Fermentationsbrühe hergestellt. Durch die vollständige oder teilweise Abtrennung der nicht-stärkehaltigen festen Bestandteile kann der Reinigungsaufwand bei der Aufarbeitung des Stoffwechselprodukts, dessen Anwendungsbereich eine höhere Reinheit erfordert, z.B. als Nahrungsmitteladditiv, reduziert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Riboflavin. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/011052, DE 19840709, WO 98/29539, EP 1 186664 und Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie folgt vorgegangen werden. Man implementiert eine vorzugsweise großvolumige Fermentation zur Herstellung von Stoffwechselprodukten A, z.B. von Aminosäuren wie Lysin, entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren, z.B. unter Anwendung der bevorzugten Verfahrensschritte a) bis c). Gemäß (i) wird ein Teil des nach Schritt a) erhaltenen, zuckerhal- tigen Flüssigmediums entnommen und gemäß (ii) durch übliche Verfahren, z.B. Zentri- fugation oder Filtration, vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreit. Das daraus gewonnene, im Wesentlichen vollständig oder teilweise von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird gemäß (ii) einer Fermentation zur Produktion eines Stoffwechselprodukts B, z.B. Riboflavin, zugeführt. Der gemäß (ii) abgetrennte Feststoffstrom wird vorteilhafterweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurück gegeben.
Die auf diese Art und Weise gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in DE 4037441 , EP 464582, EP 438767 und DE 3819745. Nach Lyse der Zellmasse erfolgt die Abtrennung des kristallin vorliegenden Riboflavins vorzugsweise durch Dekantieren. Andere Arten der Feststoffabtrennung, z.B. Filtration, sind ebenfalls möglich. Anschließend wird das Riboflavin getrocknet, bevorzugt mittels Sprüh- und Wirbelschichttrocknern. Alternativ dazu kann das gemäß (ii) erzeugte, Riboflavin-haltige Fermentationsgemisch nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie z.B. in der EP 1048668 und EP 730034 beschrieben. Nach Pasteurisierung wird die Fermentationsbrühe hier zentrifugiert und die zurückbleibende feststoffhaltige Fraktion mit ei- ner mineralischen Säure behandelt. Das gebildete Riboflavin wird aus dem wässrig- sauren Medium filtriert, gegebenenfalls gewaschen und anschließend getrocknet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgehensweise handelt es sich bei dem in der Fermentation von den Mikroorganismen produzierten Stoffwechselprodukt B um Pantothensäure. Zur Durchführung der Fermentation können hier analoge Bedingungen und Vorgehensweisen angewendet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der WO 01/021772.
Zur Durchführung dieser Variante des Verfahrens kann z.B. wie oben für Riboflavin beschrieben vorgegangen werden. Das gemäß (ii) vorgereinigte, vorzugsweise im Wesentlichen von den Feststoffen befreite, zuckerhaltige Flüssigmedium wird einer Fermentation gemäß (ii) zur Produktion von Pantothensäure zugeführt. Dabei ist die im Vergleich zum feststoffhaltigen Flüssigmedium verringerte Viskosität besonders vor- teilhaft. Der abgetrennte Feststoffstrom wird vorzugsweise zum Strom des zuckerhaltigen Flüssigmediums der großvolumigen Fermentation zurückgegeben.
Die gemäß (ii) erzeugte, Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann nach analogen Bedingungen und Vorgehensweisen aufgearbeitet werden, wie sie für andere Kohlenstoffquellen beschrieben wurden, z.B. in der EP 1050219 und WO 01/83799. Nach Pasteurisieren der gesamten Fermentationsbrühe werden die verbleibenden Feststoffe z.B. durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt. Der Klarlauf der Feststoffabtrennung wird teilweise eingedampft, gegebenenfalls mit Calciumchlorid versetzt und getrocknet, insbesondere sprühgetrocknet.
Die abgetrennten Feststoffe werden im Rahmen des parallel betriebenen, großvolumigen Fermentationsverfahrens zusammen mit dem jeweiligen gewünschten nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukt (A) gewonnen.
Nach der Trocknung und/oder Formulierung können der Produktformulierung ganze oder gemahlene Getreidekörner, bevorzugt Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Triticale und/oder Roggen zugegeben werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind feste Formulierungen nichtflüchtiger Stoff- Wechselprodukte, die durch das hier beschriebene Verfahren erhältlich sind. Diese Formulierungen enthalten üblicherweise neben dem mindestens einen, nichtflüchtigen Stoffwechselprodukt (Bestandteil A) der Fermentation, Biomasse aus der Fermentation (Bestandteil B) und Teile oder die Gesamtmenge der nicht-stärkehaltigen festen Be- standteile der Stärkequelle (Bestandteil C). Daneben enthalten die erfindungsgemäßen Stoffgemische gegebenenfalls die oben erwähnten Formulierungshilfsmittel wie Bindemittel, Trägermaterialien, Puderungs-/Fließhilfsmittel, ferner Farbpigmente, Biozide, Dispergiermittel, Antischaummittel, Viskositätsregulierende Mittel, Säuren, Laugen, Antioxidantien, Enzymstabilisatoren, Enzyminhibitoren, Adsorbate, Fette, Fettsäuren, Öle und dergleichen.
Die Menge an Stoffwechselprodukt macht typischerweise mehr als 10 Gew.-%, z. B. >10 bis 80 Gew.-%, insbesondere 20 bis 60 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C aus. Bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung beträgt die Menge an Stoffwechselprodukt typischerweise 0,5 bis 80 Gew.-%, insbesondere 1 bis 60 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
Die Menge an Biomasse aus der das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt produzieren- den Fermentation beträgt typischerweise 1 bis 50 Gew.-%, insbesondere 10 bis 40 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C, bzw. 0,5 bis 50 Gew.-%, insbesondere 2 bis 40 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
Die Menge an nicht-stärkehaltigen festen Bestandteilen der Stärkequelle aus der Fermentationsbrühe beträgt in der Regel mindestens 1 Gew.-% und insbesondere 5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C, bzw. mindestens 0,5 Gew.-%, insbesondere wenigstens 2 Gew.-%, z.B. im Bereich von 2 bis 50 Gew.-%, insbesondere 5 bis 40 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formu- lierung.
Die Menge an Formulierungshilfsmitteln wird in der Regel bis 400 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten A, B und C, betragen und liegt häufig im Bereich von 0 bis 100 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Bestandteile A, B und C, bzw. im Bereich von 0 bis 80 und insbesondere 1 bis 30 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen liegen in fester Form vor und haben typischerweise die Form von Pulvern, Granulaten, Pellets, Extrudaten, Kompaktaten oder Agglomeraten.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen weisen typischerweise Ballaststoffe (dietary fibers) auf, die zum einen aus den festen Bestandteilen der Stärkequelle resultieren und die außerdem als Streckmittel/Trägerstoffe bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Formulierungen eingesetzt werden. Hinsichtlich der Definition und der Komponenten, die im Sinne der Erfindung von dem Begriff „ Ballaststoffe" umfasst werden sollen, wird auf den Bericht der American Association of Cereal Chemists (AACC) in Cereal Foods World (CFW), 46 (3), „ The Definition of Dietary Fiber" , 2001 , S. 112- 129, insbesondere S. 1 12, 113 und 118, Bezug genommen. Der Gehalt an Ballaststoffen beträgt in der Regel wenigstens 1 Gew.-%, insbesondere wenigstens 5 Gew.-%, speziell wenigstens 10 Gew.-% und liegt häufig im Bereich von 1 bis 60 Gew.-%, insbesondere 5 bis 50 Gew.-% und speziell im Bereich von 10 bis 40 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung. Die Bestimmung des Ballaststoffgehalts erfolgt im Allgemeinen nach einer Standardmethode der AACC (American Association of Cereal Chemists. 2000. Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists, 10. Aufl., Method 32-25, Total dietary fiber determined as neutral sugar residues, uronic acid residues, and Klason lignin (Uppsala method). The Associ- ation, St. Paul, MN).
Die erfindungsgemäßen Stoffgemische besitzen einen hohen Proteingehalt, der im Wesentlichen der Biomasse B entspricht. Weitere Anteile am Proteingehalt können auch der eingesetzten Stärkequelle entstammen. Der Proteingehalt liegt typischerwei- se im Bereich von 20 bis 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
Der immanente Gehalt an Protein (speziell Komponente B) und an Ballaststoffen (speziell Komponente C) ist für verschiedene Formulierungsverfahren, z.B. im Fall öliger Stoffwechselprodukte, insbesondere im Hinblick auf hierbei angewendete Trocknungsschritte vorteilhaft.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen enthalten vorteilhafterweise eine oder mehrere essentielle Aminosäuren, insbesondere wenigstens eine unter Lysin, Methionin, Threonin und Tryptophan ausgewählte Aminosäure. Die essentiellen Aminosäuren, insbesondere die genannten, liegen, sofern vorhanden, in der Regel jeweils in einer Menge vor, die gegenüber einem herkömmlichen DDGS-Nebenprodukt, das bei einer fermentativen Bioethanolproduktion anfällt, erhöht ist, insbesondere um einen Faktor von wenigstens 1 ,5. Sofern die jeweilige Aminosäure in der Formulierung enthalten ist, weist die Formulierung in der Regel einen Gehalt an Lysin von wenigstens 1 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 1 bis 5 Gew.-%, einen Gehalt an Methionin von wenigstens 0,8 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,8 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,8 bis 5 Gew.-%, einen Ge- halt an Threonin von wenigstens 1 ,5 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 1 ,5 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 1 ,5 bis 5 Gew.-% und/oder einen Gehalt an Tryptophan von wenigstens 0,4 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,4 bis 10 Gew.-% und speziell im Bereich von 0,4 bis 5 Gew.-%, jeweils bezogen auf die gesamte Tro- ckenmasse der Formulierung, auf.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen enthalten üblicherweise noch einen geringen Anteil Wasser, häufig im Bereich von 0 bis 25 Gew.-%, insbesondere im Bereich von 0,5 bis 15 Gew.-%, speziell im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und ganz speziell im Be- reich von 1 bis 5 Gew.-% Wasser, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind zur Verwendung für die Tier- oder Humanernährung, z.B. als solche oder als Zusatz- oder Ergänzungsstoff, auch in Form von Prämixen, geeignet. Hierfür kommen insbesondere Formulierungen in Betracht, die Aminosäuren, z.B. Lysin, Glutamat, Methionin, Phenylalanin, Threonin oder Tryptophan; Vitamine, z.B. Vitamin B2 (Riboflavin), Vitamin Be, oder Vitamin B12; Carotinoide, z.B. Astaxanthin oder Cantaxanthin; Zucker, z.B. Trehalose; oder organische Säuren, z.B. Fumarsäure, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind auch für die Anwendung in der Textil-, Leder-, Zellstoff- und Papierindustrie geeignet. Hierbei werden im Textilbereich insbesondere Formulierungen zum Einsatz kommen, die als Stoffwechselprodukte Enzyme wie Amylasen, Pektinasen und/oder saure, hybride oder neutrale Zellulasen enthalten; in Bereich Leder insbesondere solche, die Enzyme wie Lipasen, Pankreasen oder Proteasen enthalten; und in der Zellstoff- und Papierindustrie insbesondere solche, die Enzyme wie Amylasen, Xylanasen, Zellulasen, Pectinasen, Lipasen, Esterasen, Proteasen, Oxidoreductasen, z.B. Laccase, Katalase und Peroxidase, enthalten.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung einzelner Aspekte der vorliegenden Erfindung, sie sind jedoch in keiner Weise als einschränkend zu verstehen.
Beispiele
I. Vermählen der Stärkequelle
Die im folgenden eingesetzten Mahlgüter wurden wie folgt hergestellt. Ganze Maiskörner wurden unter Verwendung einer Rotormühle vollständig vermählen. Unter Einsatz unterschiedlicher Schlägerwerke, Mahlbahnen bzw. Siebeinbauten wurden dabei drei verschiedene Feinheiten erzielt. Eine Siebanalyse des Mahlgutes mittels Labor- Vibrationssieb (Vibrations-Analysenmaschine: Retsch Vibrotronic Typ VE1 ; Siebzeit 5 min; Amplitude: 1 ,5 mm) ergab die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse.
Tabelle 1
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1) Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge an Mahlgut
II. Enzymatische Stärkeverflüssigung und - Verzuckerung
11.1. Ohne Phytase im Verzuckerungsschritt
II.1a) Enzymatische Stärkeverflüssigung
Aus 320 g trocken vermahlenem Maismehl (T71/03) wurde unter stetem Rühren eine Suspension in 480 g Wasser angesetzt und mit 310 mg Calciumchlorid versetzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 6,5 und Erhitzen auf 35 °C wurden 2,4 g Termamyl 120L Typ L (Novozymes A/S) zugegeben. Über 40 min wurde das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur von 86,5 °C erhitzt, wobei der pH gegebenenfalls mit NaOH auf den zuvor eingestellten Wert nachjustiert wurde. Innerhalb von 30 min wurden weitere 400 g des trocken vermahlenen Maismehls (T71/03) zugegeben, wobei die Temperatur auf 91 °C erhöht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ca. 100 min bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wurden weitere 2,4 g Termamyl 120L zugegeben und die Temperatur ca. 100 min gehalten. Der Fortschritt der Verflüssigung wurde während der Durchführungsdauer mit der Jod-Stärke-Reaktion verfolgt. Die Temperatur wurde abschließend auf 100 °C erhöht und das Reaktionsgemisch weitere 20 min gekocht. Zu diesem Zeitpunkt war keine Stärke mehr nachzuweisen. Der Reaktor wurde auf 35 °C abgekühlt.
11.1 b) Verzuckerung
Die aus 11.1 a) erhaltene Reaktionsmischung wurde unter stetem Rühren auf 61 °C erhitzt. Das Rühren wurde während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 wurden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozy- me GA (Novozymes A/S) zugegeben. Die Temperatur wurde ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wurde. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 aufgeführt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Es wurden ca. 1 180 g flüssiges Produkt mit einer Dichte von ca. 1 ,2 kg/l und einem mittels Infrarottrockner bestimmten Gehalt an Trockenmasse von etwa 53,7 Gew.-% erhalten. Der Gehalt an Trockenmasse (ohne wasserlösliche Inhaltsstoffe) betrug nach Waschen mit Wasser etwa 14 Gew.-%. Der durch HPLC bestimmte Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch betrug 380 g/l (vgl. Tab. 2, Probe Nr. 7).
Tabelle 2
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II.2. Mit Phytase im Verzuckerungsschritt
II.2a) Stärkeverflüssigung
Eine trocken vermahlene Maismehlprobe wird entsprechend 11.1 a) verflüssigt.
11.2b) Verzuckerung Die aus ll.2a) erhaltene Reaktionsmischung wird unter stetem Rühren auf 61 °C erhitzt. Das Rühren wird während der gesamten Versuchsdurchführung fortgesetzt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit H2SO4 auf 4,3 werden 10,8 g (9,15 ml) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) und 70 μ I Phytase (700 Units Phytase, Natuphyt Liquid 10000L von der BASF Aktiengesellschaft) zugegeben. Die Temperatur wird ca. 3 h gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion mit Glucoseteststäbchen (S-Glucotest von Boehringer) verfolgt wird. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf 80 °C erhitzt und danach abgekühlt. Das erhaltene Produkt wird mittels Infrarottrockner getrocknet und mit Wasser gewaschen. Der Anteil an Glucose im Reaktionsgemisch wird durch HPLC be- stimmt.
II.3 Weitere Arbeitsvorschriften zur enzymatischen Stärkeverflüssigung und -Verzuckerung
II.3a) Maismehl
360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. 1 ,54 ml CaCb Stammlösung (100 g CaCb x 2 H2O / 1) werden bis zu einer Endkonzentration von etwa 70 ppm Ca2+ in der Maische zugegeben. Unter stetem Rühren lässt man 240 g Mais- mehl langsam in das Wasser einrieseln. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 4,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf bis zu 85 °C erhitzt. Hierbei muss der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls ange- passt werden.
Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 50 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCb Stammlösung zu, um die Ca2+-Konzentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (50 g Mehl und 0,13 ml CaCb Stammlösung) zugibt. Nach Zugabe von zwei Portionen gibt man 1 ,67 ml Termamyl zu; anschließend gibt man zwei weitere Portionen (jeweils 50 g Mehl und 0,13 ml CaCb Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100 °C und kocht die Mai- sehe 10 min.
Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g I und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1 ,67 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.
Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungsreaktion auf 61 °C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61 °C gehalten. 5,74 ml (= 1 ,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozym GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivie- rung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85 °C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4 °C. Es wurde eine Endkonzent- ration an Glucose von 420 g/l erzielt.
II.3b) Roggenmehl (inklusive Cellulase/Hemicellulase-Vorbehandlung)
360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Roggenmehl langsam in das Wasser einrieseln. Die Temperatur wird konstant bei 50 °C gehalten. Nach Einstellung des pH auf 5,5 mit 50 Gew.- %iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Viscozyme L (Novozymes A/S) zu. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man erneut 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.
1 ,7 ml CaCb Stammlösung (100 g CaCb x 2 H2O / 1) werden zugegeben. Nach Einstellung des pH auf 6,5 mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung gibt man 5,0 ml (= 2 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Termamyl 120 L Typ L (Novozymes A/S) zu. Die Maische wird dann schnell auf 85 °C erhitzt. Hierbei wird der pH fortwährend kontrolliert und gegebenenfalls angepasst.
Nach Erreichen der endgültigen Temperatur beginnt man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst von 60 g Mehl. Zusätzlich gibt man der Maische 0,13 ml CaCb Stammlösung zu, um die Ca2+-Koncentration bei 70 ppm zu halten. Während der Zugabe hält man die Temperatur konstant bei 85 °C. Man wartet mindestens 10 min ab, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten, bevor man eine weitere Portion (40 g Mehl und 0,1 ml CaCb Stammlösung) zugibt. Man gibt 1 ,1 ml Termamyl zu; anschließend gibt man eine weitere Portionen (40 g Mehl und 0,1 ml CaCb Stammlösung) zu. Es wird ein Gehalt an Trockenmasse von 55 Gew.-% erreicht. Nach der Zugabe erhöht man die Temperatur auf 100 °C und kocht die Maische 10 min.
Man entnimmt eine Probe und kühlt diese auf Raumtemperatur. Nach Verdünnung der Probe mit deionisiertem Wasser (etwa 1 :10) gibt man einen Tropfen konzentrierte Lu- golsche Lösung (Mischung von 5 g I und 10 g Kl pro Liter) zu. Eine tiefblaue Färbung zeigt einen Gehalt an verbleibender Stärke an; eine Braunfärbung tritt ein, wenn die Stärke vollständig hydrolysiert wurde. Wenn der Test einen Anteil verbleibender Stärke anzeigt, wird die Temperatur erneut auf 85 °C erniedrigt und konstant gehalten. Man gibt weitere 1 ,1 ml Termamyl zu, bis die lod-Stärke-Reaktion negativ ausfällt.
Die negativ auf Stärke getestete Mischung wird dann für die folgende Verzuckerungs- reaktion auf 61 °C gebracht. Der pH wird durch Zugabe von 50 %iger Schwefelsäure auf 4.3 eingestellt. Im Verlauf der Reaktion wird der pH bei diesem Wert gehalten. Die Temperatur wird bei 61 °C gehalten. 5,74 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) werden zugegeben, um die verflüssigte Stärke in Glucose umzuwandeln. Man lässt die Reaktion eine Stunde fortschreiten. Zur Inaktivie- rung des Enzyms erhitzt man die Mischung auf 85 °C. Die heiße Mischung füllt man in sterile Behälter und lagert diese nach Abkühlung bei 4 °C. Es wurde eine Endkonzentration an Glucose von 370 g/l erzielt.
II.3c) Weizenmehl (inklusive Xylanase-Vorbehandlung)
360 g deionisiertes Wasser werden in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Das Wasser wird auf 55 °C erhitzt und der pH mit 50 Gew.-%iger wässriger NaOH-Lösung auf 6,0 eingestellt. Nach Einstellung von Temperatur und pH gibt man 3,21 ml (= 2,5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Shearzyme 500L (Novozymes A/S) zu. Unter stetem Rühren lässt man 155 g Weizenmehl langsam in die Lösung einrieseln. Die Temperatur und der pH werden konstant gehalten. Nach 30 min startet man die Zugabe von weiterem Mehl, zunächst gibt man 55 g Mehl zu. Nach weiteren 30 min gibt man 50 g Mehl hinzu; 30 min später noch einmal 40 g Mehl. 30 min nach der letzten Zugabe kann mit der Verflüssigung begonnen werden.
Die Verflüssigung und Verzuckerung werden wie unter II.3b beschrieben durchgeführt. Es wurde eine Endkonzentration an Glucose von 400 g/l erzielt. Stamm ATCC13032 lysCfbr
In einigen der nachfolgenden Beispiele wurde ein modifizierter Stamm von Corynebac- terium glutamicum eingesetzt, der unter der Bezeichnung ATCC13032 lysCfbr in der WO 05/059144 beschrieben wurde.
Beispiel 1
a) Enzymatische Stärkeverflüssigung und - Verzuckerung
500 g trocken vermahlenes Maismehl wurden in 750 ml Wasser suspendiert und in einem Rührmixer erneut fein vermählen. Die Suspension wurde in 4 Proben Nr. 1 bis 4 geteilt, die jeweils mit ca. 3 g hitzestabiler α -Amylase (Proben Nr. 1 und 2: Termamyl L; Proben Nr. 3 und 4: Spezyme) behandelt wurden. Die Proben Nr. 2 und 4 wurden nachfolgend mit ca. 7 g/l Glucoamylase (Probe Nr. 2: Dextrozyme GA; Probe Nr. 4: Optidex) behandelt. Es wurden gelbliche, viskose Proben erhalten, deren Feststoffanteil jeweils durch Zentrifugation abgetrennt wurde, wobei über der klaren Flüssigphase eine Schicht hydrophober Feststoffe aufschwamm.
Von den so erhaltenen Proben wurde unter Vernachlässigung bzw. unter Einbeziehung des abzentrifugierten Pellets jeweils der klare Überstand in konzentrierter Form und in 10-facher Verdünnung mittels HPLC analysiert. Bei Berücksichtigung des Pellets wurde ein Gehalt an Trockenmasse für das Pellet von 50 Gew.-% angenommen. Die Ergebnisse, bezogen auf die Ausgangsprobe, sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufge- führt.
Tabelle 3
Figure imgf000066_0001
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b) Fermentation
Zwei gemäß Beispiel 11.1 erhaltene Maismehlhydrolysate wurden in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt (Kolben 4-9). Außerdem wurde parallel ein analog Beispiel 11.1 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 1-3) verwendet.
b.1 ) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 4; 20 min bei 121 °C) 48 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von ODδoo = 1 bei 600 nm erreicht.
Tabelle 4: Zusammensetzung des CM-Agar
Figure imgf000067_0002
b.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5: Kolbenmedien
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* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Zuckern und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC wurde mit einem 1 100 Series LC System von Agilent durchgeführt. Eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäure, die Auftrennung des Produktgemischs erfolgt mit einer Hypersil AA-Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt.
Tabelle 6
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In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 30 bis 40 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.
c) Herstellung von Trockenpulvern
c.1 ) Sprühtrocknung
In einem Becherglas wurden bei Raumtemperatur 250 g einer Lysin-haltigen Brühe mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 Gew.-% (erhalten aus einer Maismehlsuspension analog Beispiel 1 a und 1 b) vorgelegt und mittels einer Schlauchpumpe (Typ: ISM444, Ismatec) in eine Gleichstrom-Zweistoffdüse eines Sprühturms (Niro, Minor High Tee) gefördert. Der Sprühdruck betrug 4 bar. Während des Sprühvorgangs wurden schrittweise etwa 2 bis 3 g Sipernat S22 zudosiert. Die Eingangstemperatur lag von 95 °C bis 100 °C. Die Förderleistung der Pumpe wurde so eingestellt, dass die Temperatur des Produkts 50 °C im Wesentlichen nicht unterschritt.
Die Wände des Sprühturms wurden während der Durchführung der Sprühtrocknung mäßig mit Lysin belegt. Das erhaltene Trockenpulver ist optisch fein und gut fließfähig. Es wurden 23 g Trockenpulver erhalten.
c.2) Extrusion
Zu 400 g einer Lysin-haltigen Brühe mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 Gew.-% (erhalten aus einer Maismehlsuspension analog Beispiel 1a und 1 b), die 60 min bei 80 °C getempert wurde, gab man eine durch Lösen von 14 g Polyvinylalkohol (PVA; Mw = 10000 bis 190000 g/mol) in 75 g Wasser hergestellte wässrige PVA-Lösung. Der pH- Wert der erhaltenen Suspension lag bei etwa 7. Diese wurde zu etwa 950 g in einem Lödigemischer vorgelegter Maisstärke (Fa. Roquette) gegeben und bei etwa 100-350 Upm untergemischt.
Das dem Mischer entnommene mehlige, feuchte teigartige Produkt mit einer Temperatur von etwa 30 °C wurde anschließend einem DOME-Extruder (Fa. Fuji Paudal Co. Ltd.) zugeführt und bei einer Temperatur von weniger als 30 °C extrudiert. Das bei der Extrusion erhaltene Produkt wurde in einem Wirbelbetttrockner der Fa. BÜCHI 120 min bei einer Produkttemperatur von weniger als 60 °C getrocknet. Es wurden 600 g Granulat erhalten.
c.3) Agglomeration im Wirbelbett
Im Konus einer Wirbelbettapparatur Aeromatic MP-1 (Fa. Niro Aeromatic; Lochfläche des Lochbodens: 12% (12% FF)) wurden 500 g Na2SO4 vorgelegt und auf eine Tempe- ratur von 50 °C erwärmt. Mittels einer Schlauchpumpe wurden 998 g einer Lysin- haltigen Brühe mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 Gew.-% (erhalten aus einer Maismehlsuspension analog Beispiel 1 a und 1 b) einer Zweistoffdüse (d = 1 ,2 mm) zugeführt und über diese in „ Topspray" -Position (d.h. von oben) auf den im Konus vorgelegten Feststoff aufgesprüht. Der Sprühdruck betrug 1 ,5 bar. Der Sprühvorgang wurde nach Zugabe von 278 g und nach Zugabe weiterer 320 g der Lysin-haltigen Brühe (entsprechend einem Anteil von 10 bzw. 20 Gew.-% aufgesprühtem Fermentationsfeststoff, bezogen auf den Gesamtfeststoff in der Wirbelbettapparatur) jeweils zwecks Zwischentrocknung und Probenahme (je 50 g) unterbrochen. Die Zuluftmenge wurde im Bereich von etwa 45 bis 60 m3/h eingestellt und während der Trocknungs- schritte reduziert. Die Temperatur der Zuluft lag im Bereich von etwa 46 °C bis 80 °C, während der abschließenden Trocknung zum Teil darunter. Die Förderleistung der Pumpe wurde so eingestellt, dass die Temperatur des Produkts bei etwa 50 °C lag und 45 °C im Wesentlichen nicht unterschritt. Nach Abkühlung wurden 513 g Produkt ausgetragen. Die Größe der Agglomerate aller drei entnommenen Produktproben lag im Bereich von einigen hundert Mikrometern.
c.4) Kontakttrocknung
240 g einer Lysin-haltigen Brühe mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 Gew.-% (erhal- ten aus einer Maismehlsuspension analog Beispiel 1 a und 1 b) wurden in einen 500 ml Rundkolben eingebracht und anschließend am Rotationsverdampfer bei leicht vermindertem Druck (880 bis 920 mbar) eingeengt. Die Badtemperatur lag bei 140-145°C. Nach etwa 40 min. wurde der an der Kolbenwand entstehende Belag mechanisch zerkleinert und die Trocknung fortgesetzt und nach weiteren 40 min. eine erneute Zerklei- nerung vorgenommen. Die Trocknung wurde anschließend fortgesetzt und gelegentlich unterbrochen um eine weitere Zerkleinerung des Rückstands vorzunehmen. Die Ge- samttrocknungsdauer betrug 2,5 h. Das erhaltene Granulat ist dunkelbraun und gut fließfähig. Die Restfeuchte des Granulats betrug 3 %. Es hafteten nur geringe Mengen Granulat an der Kolbenwand.
Beispiel 2
Unter Verwendung eines gemäß Beispiel 11.1 erhaltenen Maismehlhydrolysats wird eine Fermentation analog Beispiel 1 b) durchgeführt, wobei der in WO 05/059144 beschriebene Stamm ATCC13032 lysCfbr verwendet wurde. Die Zellen werden auf sterilem CM-Agar (Zusammensetzung Tabelle 4; 20 min bei 121 °C) 48 h bei 30 °C inku- biert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums 1 bzw. 2 (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkol- ben werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von ODβio = 1 bei 610 nm erreicht. Die Proben werden dann bei 200 Upm und 30 °C in einem befeuchteten Schüttelschrank (85% rel. Luftfeuchte) 48 h inkubiert. Die Konzentration des Lysins in den Medien wird mittels HPLC bestimmt. In allen Fällen wurden annähernd gleiche Mengen an Lysin produziert.
Die derart erhaltenen Lysin-haltigen Fermentationsbrühen wurde gemäß Beispiel 1 c.2) zu einem Extrudat verarbeitet.
Beispiel 3
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum (ATCC13032 lysCfbr) eingesetzt (Kolben 1 +2). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 3+4) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 5+6) verwendet.
3.1 ) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+CaAc-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 7; 20 min bei 121 °C) 48 h bei 30 °C inkubiert, dann auf eine neue Platte überimpft und über Nacht bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 23 ml des Mediums (siehe Tabelle 8) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von ODβio = 0,5 bei 610 nm erreicht. Tabelle 7: Zusammensetzung der CM+CaAc-Agarplatten
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3.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 6 sind in Tabelle 8 aufgeführt.
Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet.
Tabelle 8: Kolbenmedien
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Figure imgf000073_0001
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1 100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Aminosäurebestimmung erfordert eine Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthalaldehyd, die Auftrennung erfolgt auf einer Zorbax Extend C18 Säule von Agilent. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengestellt.
Tabelle 9
Figure imgf000073_0002
Figure imgf000074_0001
In allen Kolben wurde Lysin in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 10 bis 12 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute.
Die derart erhaltenen Lysin-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß Beispiel 1 c.1 ) zu einem fließfähigen Pulver verarbeitet.
Beispiel 4
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen verwendet (Kolben 1-3). Als Panthothenat-produzierender Stamm wurde Bacil- lus PA824 eingesetzt (genaue Beschreibung in WO 02/061108). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.
4.1 ) Herstellung des Inokulums
42 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 10) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 0,4 ml einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 43 °C unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.
Tabelle 10: Zusammensetzung des Vorkulturmediums
Figure imgf000074_0002
Figure imgf000075_0001
* mit verdünnter wässriger KOH-Lösung einzustellen
42 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 1 1) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 1 ml Vorkultur angeimpft.
4.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 11 aufgeführt.
Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet.
Tabelle 11 : Kolbenmedien
Figure imgf000075_0002
Figure imgf000076_0001
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 24 h bei 43 °C und unter Bewegen (250 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Pantothensäure per HPLC bestimmt. Die Bestimmung der Glucose erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule der Firma Bio-Rad. Die Bestimmung der Pantothensäurekonzentration erfolgte mittels Auftrennung auf einer Aqua C18-Säule der Firma Phenomenex. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt.
Tabelle 12
Figure imgf000076_0002
In allen Kolben wurde Pantothensäure in vergleichbaren Mengen in der Größenordnung von etwa 1 ,5 bis 2 g/l produziert, entsprechend der in einer standardmäßigen Fermentation mit Glucose-Nährlösung erreichten Ausbeute. Die derart erhaltenen Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühen wurden teilweise gemäß Beispiel 1 c.3) zu einem Agglomerat oder gemäß Beispiel 1 c.4) weiter zu einem trockenen, grobteiligen Pulver verarbeitet.
Beispiel 5
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt (Kolben 1-3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4- 6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.
5.1 ) Stämme
Ein Aspergillus niger Phytase-Produktionsstamm mit 6 Kopien des phyA-Gens aus Aspergillus ficuum unter der Kontrolle des glaA-Promotors wurde analog zur im Detail in WO98/46772 beschriebenen Herstellung von NP505-7 erzeugt. Als Kontrolle wurde ein Stamm mit 3 modifizierten glaA Amplikons (analog ISO 505), jedoch ohne integrierte phyA-Expressionskassetten verwendet.
5.2) Herstellung des Inokulums
20 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 13) in 100 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 100 μl einer Gefrierkultur angeimpft und 24 h bei 34 °C unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.
Tabelle 13: Zusammensetzung des Vorkulturmediums
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen
50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 14) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft.
5.3) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 14 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet.
Tabelle 14: Kolbenmedien
Figure imgf000078_0002
* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays bestimmt. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Phytinsäure als Substrat und auf einem geeignetem Phytaseaktivitätsniveau (Standard: 0,6 U/ml) in 250 mM Essigsäure / Natriumacetat / Tween 20 (0,1 Gew.-%), pH 5,5 Puffer bestimmt. Der Assay wurde standardisiert für die Anwendung in Mikrotiterplatten (MTP). 10 μl der Enzymlösung wurden mit 140 μl 6,49 mM Phytatlösung in 250 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,5 (Phy- tat: Dodecanatriumsalz der Phytinsäure) gemischt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe des gleichen Volumens (150 μl) Trichloressig- säure gestoppt. Ein Aliquot dieser Mischung (20 μl) wurde überführt in 280 μl einer Lösung, die 0,32 N H2SO4, 0,27 Gew.-% Ammoniummolybdat und 1 ,08 Gew.-% As- corbinsäure enthält. Anschließend erfolgte eine 25-minütige Inkubation bei 50°C. Die Absorption der blau gefärbten Lösung wurde bei 820 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengestellt.
Tabelle 15
Figure imgf000079_0001
*) FTU = Formazin-Turbidity-Einheit
Die derart erhaltenen Phytase-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß Beispiel 1 c.1 ) zu einem Pulver und gemäß Beispiel 1c.3) zu einem partikelförmigen Agglomerat verarbeitet.
Beispiel 6
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Ashbya gossypii eingesetzt (Kolben 1-4). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 5- 8) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 9-12) verwendet. 6.1 ) Stamm
Bei dem eingesetzten Riboflavin-produzierenden Stamm handelt es sich um ein Ash- bya gossypii ATCC 10895 (s.a. Schmidt G , et al. Inhibition of purified isocitrate lyase identified itaconate and Oxalate as potential antimetabolites for the riboflavin overpro- ducer Ashbya gossypii. Microbiology 142: 41 1-417, 1996).
6.2) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem HMG-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 16; 20 min bei 121 °C) 72 h bei 28 °C inkubiert.
Tabelle 16: Zusammensetzung der HMG-Agarplatten
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Anschließend werden 50 ml des Vorkulturmediums (siehe Tabelle 17) in 250 ml Erlen- meyerkolben mit zwei Schikanen jeweils mit einer Impföse voll Zellen angeimpft und 24 h bei 28 °C unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert.
Tabelle 17: Zusammensetzung des Vorkulturmediums
Figure imgf000080_0002
mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen 50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 18) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit 5 ml Vorkultur angeimpft
6.3) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 12 sind in Tabelle 18 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet.
Tabelle 18: Kolbenmedien
Figure imgf000081_0001
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 28 °C und unter Bewegen (180 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Vitamin B2 per HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 zusammengestellt.
Tabelle 19
Figure imgf000081_0002
Die derart erhaltenen Vitamin B2-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß Beispiel 1 c.1 ) zu einem Pulver und gemäß Beispiel 1c.3) zu einem partikelförmigen Agglomerat verarbeitet.
Beispiel 7
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt (Kolben 1-3). Außerdem wurden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.
7.1 ) Stämme
Stämme von Corynebacterium, die Methionin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in Kumar D. Gomes J. Biotechnology Advances, 23(1):41-61 , 2005; Kumar D. et al., Process Biochemistry, 38:1 165-1171 , 2003; WO 04/024933 und WO 02/18613 beschrieben.
7.2) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem CM+Kan-Agar (Zusammensetzung: siehe Tabelle 20; 20 min bei 1210C) 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 5) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von ODβio = 0,5 bei 610 nm erreicht.
Tabelle 20: Zusammensetzung der CM+Kan-Agarplatten
Figure imgf000082_0001
25,0 g/l Agar
7.3) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 21 aufgeführt. Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.
Tabelle 21 : Kolbenmedien
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0002
* mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen
** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht war. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Methionin per HPLC bestimmt (Säule: Agilent ZORBAX Eclipse AAA; Methode It. Eclipse AAA protocol, Technical Note 5980-1 193). Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 zusammengestellt.
Tabelle 22
Figure imgf000084_0001
Die derart erhaltenen Methionin-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß Beispiel 1 c.4) zu einem grobteiligen Pulver verarbeitet.
Beispiel 8
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenver- suchen unter Verwendung von Bacterium 130Z eingesetzt.
8.1 ) Stamm
Als Succinat-produzierender Stamm wurde Bacterium 130Z eingesetzt (ATCC No. 55618).
8.2) Herstellung der Fermentationsbrühe
50 ml des Hauptkulturmediums (siehe Tabelle 23) in 120 ml Serumflaschen werden jeweils mit 1 ml einer Gefrierkultur angeimpft. Vor dem Verschließen wird auf die Serumflaschen CO2 aufgepresst (0,7 bar).
Die Zusammensetzung des Mediums ist in Tabelle 23 aufgeführt (vgl. US 5,504,004). Im Kontrollmedium wurde statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselö- sung verwendet (Endkonzentration Glucose: 100 g/l).
Tabelle 23: Medium*
Figure imgf000085_0001
begast mit und abgefüllt unter CO2/N2 ** Glucosekonzentration im Hydrolysat
*** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Serumflaschen 46 h bei 37 °C und unter Bewegen (160 Upm) in einem Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Succinat per HPLC bestimmt. Die Bestimmung erfolgte mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 zusammengestellt.
Tabelle 24
Figure imgf000086_0001
Die derart erhaltenen Succinat-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß Beispiel 1 c.1 ) zu einem trockenen Pulver verarbeitet.
Beispiel 9
Ein gemäß Beispiel II.3a erhaltenes Maismehlhydrolysat wird in Schüttelkolbenversu- chen unter Verwendung von Escherichia coli eingesetzt (Kolben 1-3). Ebenso werden parallel ein analog Beispiel II.3 hergestelltes Weizenmehlhydrolysat (Kolben 4-6) und Roggenmehlhydrolysat (Kolben 7-9) verwendet.
9.1 ) Stamm
Escherichia coli- Stämme, die L-Threonin produzieren, sind dem Fachmann bekannt. Die Herstellung solcher Stämme ist z.B. in der EP 1013765 A1 , EP 1016710 A2, US 5,538,873 beschrieben.
9.2) Herstellung des Inokulums
Die Zellen werden auf sterilem LB-Agar ausgestrichen. Dem LB-Agar werden Antibiotika zugefügt, wenn geeignete Resistenz-Gene als Marker in dem entsprechenden Stamm existieren. Hierfür können z.B. Kanamycin (40 μg/ml) oder Ampicillin (100 mg/l) verwendet werden. Die Stämme werden 24 h bei 30 °C inkubiert. Die Zellen werden nach dem Ausstreichen auf sterilem M9 Glucose-Minimalmedium mit Methionin (50 μg/ml), Kanamycin (40 μg/ml) und Homoserin (10 μg/l) 24 h bei 30 °C inkubiert. Anschließend werden die Zellen von den Platten abgekratzt und in Saline resuspendiert. 25 ml des Mediums (siehe Tabelle 25) in 250 ml Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen werden jeweils mit einer solchen Menge der so hergestellten Zellsuspension angeimpft, dass die optische Dichte einen Wert von ODβio = 0,5 bei 610 nm erreicht.
9.3) Herstellung der Fermentationsbrühe
Die Zusammensetzungen der Kolbenmedien 1 bis 9 sind in Tabelle 25 aufgeführt. Im Kontrollmedium wird statt Mehlhydrolysat eine entsprechende Menge Glucoselösung verwendet.
Tabelle 25: Kolbenmedien
Figure imgf000087_0001
mit verdünnter wässriger NaOH-Lösung einzustellen * Glucosekonzentration im Hydrolysat ** Einwaage an Hydrolysat pro Liter Medium Nach dem Animpfen werden die Kolben bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert, bis die Glucose aufgebraucht ist. Nach dem Abbruch der Fermentation kann der Gehalt an L-Threonin durch reversed-phase- HPLC bestimmt werden, wie von Lindroth et al., Analytical Chemistry 51 :1 167-1174, 1979 beschrieben.
Die derart erhaltenen Threonin-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß den Beispielen 1 c.1 ) bis 1 c.3) weiter zu einem Pulver, einem Extrudat oder einem Agglomerat verarbeitet.
Beispiel 10
In analoger Weise wie in Beispiel 9 beschrieben werden durch Einsatz entsprechender Stämme die weiteren L-Aminosäuren Glutamat, Histidin, Prolin und Arginin hergestellt. Die jeweiligen Stämme sind z.B. in der EP 1016710 beschrieben.
Die derart erhaltenen Aminosäure-haltigen Fermentationsbrühen können gemäß Beispiel 1c.1 ) bis 1c.3) weiter zu einem trockenen Produkt verarbeitet werden.
Beispiel 1 1
Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Aspergillus niger eingesetzt.
1 1.1) Verflüssigung und (Teil-)Verzuckerung
Die Verflüssigung wurde analog Beispiel II.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61 °C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eisbad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.
11.2) Fermentation
Es wurde der in Beispiel 5.1) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Ino- kulums erfolgte wie in Beispiel 5.2) beschrieben. Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 29 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden zwei Kolben angesetzt.
Tabelle 29: Kolbenmedien
Figure imgf000089_0001
* mit verdünnter Schwefelsäure einzustellen
*** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium
Nach dem Animpfen wurden die Kolben 6 Tage bei 34 °C und unter Bewegen (170 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde die Phytaseaktivität mit Hilfe eines Assays (wie in Beispiel 5.3 beschrieben) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 30 zusammengestellt.
Tabelle 30
Figure imgf000089_0002
Figure imgf000090_0001
Die derart erhaltenen Phytase-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß den Beispielen 1 c.2) und 1c.3) zu einem Extrudat bzw. einem Agglomerat verarbeitet.
Beispiel 12
Ein teilverzuckertes Maismehlhydrolysat wurde in Schüttelkolbenversuchen unter Verwendung von Corynebacterium glutamicum eingesetzt.
12.1) Verflüssigung und (Teil-)Verzuckerung
Die Verflüssigung wurde analog Beispiel II.3a durchgeführt. Nach Abkühlung der Suspension auf 61 °C und Einstellung des pH auf 4,3 wurden 5,38 ml (= 1.5 Gew.-% Enzym/Trockenmasse) Dextrozyme GA (Novozymes A/S) zugegeben. Jeweils 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach Zugabe des Enzyms wurden 50 g Probe entnommen und in 25 ml sterilem, eisgekühltem VE-Wasser suspendiert. Die Proben wurden in ein Eisbad gestellt und sofort im Kolbentest eingesetzt. Es erfolgte keine Inaktivierung des Enzyms.
12.2) Fermentation
Es wurde der in Beispiel 3) verwendete Stamm eingesetzt. Die Herstellung des Inoku- lums erfolgte wie in Beispiel 3.1) beschrieben.
Zur Herstellung der Fermentationsbrühe wurden die in Tabelle 31 aufgeführten Zusammensetzungen des Kolbenmediums verwendet. Aus jeder Probe wurden drei Kolben angesetzt.
Tabelle 31 : Kolbenmedien
Figure imgf000091_0001
* mit verdünnter wässriger NaOH- Lösung einzustellen *** Einwaage an teilverzuckertem Hydrolysat pro Liter Medium Nach dem Animpfen wurden die Kolben 48 h bei 30 °C und unter Bewegen (200 Upm) in einem befeuchteten Schüttelschrank inkubiert. Nach dem Abbruch der Fermentation wurde der Gehalt an Glucose und Lysin per HPLC bestimmt. Die HPLC Analysen wurden mit Geräten der 1 100 Series LC von Agilent durchgeführt. Die Glucose wurde mit Hilfe einer Aminex HPX-87H Säule von Bio-Rad bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC. Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho- Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisches findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32 zusammengestellt.
Tabelle 32
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Die derart erhaltenen Lysin-haltigen Fermentationsbrühen wurden gemäß den Beispielen 1 c.1 ) oder 1 c.4) zu einem Pulver bzw. zu einem Granulat verarbeitet.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung wenigstens eines nichtflüchtigen mikrobiellen Stoffwechselprodukts in fester Form durch zuckerbasierte mikrobielle Fermentation, wobei man einen das(die) gewünschte(n) Stoffwechselprodukt(e) produzierenden
Mikroorganismenstamm unter Verwendung eines zuckerhaltigen Flüssigmediums, das einen Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Flüssigmediums, aufweist, kultiviert und anschließend die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe weitgehend entfernt, wobei die Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums umfasst:
a1 ) Herstellung eines Mahlguts durch Vermählen einer unter Getreidekörnern ausgewählten Stärkequelle; und
a2) Verflüssigen des Mahlguts in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens eines Stärke verflüssigenden Enzyms und anschließendes Verzuckern unter Verwendung mindestens eines verzuckernden Enzyms,
dadurch gekennzeichnet, dass man zum Verflüssigen mindestens eine Teilmen- ge des Mahlguts im Verlauf des Verflüssigens kontinuierlich oder diskontinuierlich zu der wässrigen Flüssigkeit gibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , umfassend:
a) Herstellung des zuckerhaltigen Flüssigmediums mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 20 Gew.-% gemäß den Schritten a1 ) und a2), wobei das zuckerhaltige Flüssigmedium auch nicht-stärkehaltige feste Bestandteile der Stärkequelle umfasst;
b) Einsatz des zuckerhaltigen Flüssigmediums in einer Fermentation zur Produktion des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukte(s); und
c) Gewinnung des(der) nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts(-produkte) in fester Form zusammen mit wenigstens einem Teil der nicht-stärkehaltigen fes- ten Bestandteile der Stärkequelle aus der Fermentationsbrühe durch wenigstens teilweises Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt a) hergestellte zuckerhaltige Flüssigmedium wenigstens 20 Gew.-% der nichtstärkehaltigen festen Bestandteile der Stärkequelle enthält.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das Mahlgut in einer wässrigen Flüssigkeit in Gegenwart mindestens einer α-Amylase verflüssigt und anschließend unter Verwendung mindestens einer Glucoamylase verzuckert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a2) eine Teilmenge der mindestens einen α-Amylase während des Verflüssigens zu der wässrigen Flüssigkeit zugegeben wird.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Getreide ausgewählt ist unter Mais-, Roggen-, Triticale- und Weizenkörnern.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das beim Vermählen im Schritt a1 ) erhaltene Mahlgut mindestens 50 Gew.-% an Mehlpartikeln mit einer Korngröße von mehr als 100 μm umfasst.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verflüssigen und Verzuckern des Mahlguts im Schritt a2) derart erfolgt, dass die Viskosität des Flüssigmediums maximal 20 Pas beträgt.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 25 Gew.-% der Gesamtmenge des während der Verflüssigung zugegebenen Mahlguts bei einer Temperatur oberhalb der Gelierungstemperatur der im Mahlgut enthaltenen Stärke zugegeben werden.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zuckerhaltiges Flüssigmedium mit einem Monosaccharidgehalt von mehr als 30 Gew.-% herstellt.
1 1. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man dem zuckerhaltigen Flüssigmedium vor dem Fermentationsschritt mindestens eine Phytase zusetzt.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das(die) hergestellten nichtflüchtige(n) Stoffwechselprodukt(e) unter organischen, gegebenenfalls Hydroxylgruppen tragenden Mono-, Di- und Tricarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Purin- basen, Pyrimidinbasen; Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden; gesättigten und ungesättigten Fettsäuren; Diolen mit 4 bis 10 C-Atomen, höherwertigen Alkoholen mit 3 oder mehr Hydroxylgruppen, längerkettigen Alkoholen mit wenigstens 4 C- Atomen, Kohlenhydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Provitaminen, Cofaktoren, Nutrazeutika, Proteinen, Carotinoiden, Ketonen mit 3 bis 10 C- Atomen, Lactonen, Biopolymeren und Cyclodextrinen ausgewählt ist(sind).
13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten nichtflüchtigen Stoffwechselprodukte ausgewählt sind unter Enzymen, Aminosäuren, Vitaminen, Disacchariden, aliphatischen Mono- und Dicar- bonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatischen Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis
10 C-Atomen, Ketonen mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanolen mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiolen mit 3 bis 10 C-Atomen.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismen, die wenigstens eines der folgenden Stoffwechselprodukte produzieren: Enzyme, Aminosäuren, Vitamine, Disaccharide, aliphatische Mono- und Dicarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, aliphatische Hydroxycarbonsäuren mit 3 bis 10 C-Atomen, Ketone mit 3 bis 10 C-Atomen, Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen und Alkandiole mit 3 bis 10 C-Atomen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind unter den Gattungen Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lacto- bacillus, Propionibacterium, Clostridium und Rhizopus, insbesondere unter
Stämmen von Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succi- niproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Pro- pionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium acetobutli- cum, Clostridium formicoaceticum, Rhizopus oryzae und Rhizopus arrhizus.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man vor Entfernen der flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe nicht mehr als 30 Gew.-% der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Feststoffe entfernt.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die flüssige Phase der Fermentationsbrühe ohne vorherige Abtrennung unlöslicher Bestandteile der Fermentationsbrühe entfernt und das Stoffwechselprodukt zusammen mit der Gesamtheit aller unlöslichen Bestandteile der Fermenta- tionsbrühe gewinnt.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das wenigstens eine nichtflüchtige Stoffwechselprodukt in fester Form ohne vorherige Abtrennung der unlöslichen Bestandteile der Fermentationsbrühe zu- sammen mit der Gesamtheit aller unlöslichen Bestandteile aus der Fermentationsbrühe gewinnt.
19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die flüchtigen Bestandteile der Fermentationsbrühe bis auf einen Restfeuch- tigkeitsgehalt von 0,2 bis 20 Gew.-%, bevorzugt von 1 bis 15 Gew.-% und besonders bevorzugt von 5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das trockene Gesamtgewicht der festen Bestandteile, aus der Fermentationsbrühe entfernt.
20. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Entfernung der flüchtigen Bestandteile eine Sprühtrocknung, Wirbelschichttrocknung oder Gefriertrocknung der Fermentationsbrühe durchführt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man einen oder mehrere Trocknungshilfsstoffe verwendet.
22. Feste Formulierung eines Stoffwechselprodukts, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
23. Formulierung nach Anspruch 22, enthaltend:
A) >10 bis 80 Gew.-% mindestens eines nichtflüchtigen Stoffwechselprodukts; B) 1 bis 50 Gew.-% an Biomasse aus der das nichtflüchtige Stoffwechselprodukt produzierenden Fermentation;
C) 1 bis 50 Gew.-% an nicht-stärkehaltigen festen Bestandteilen der Stärke- quelle aus der Fermentationsbrühe; und
D) 0 bis 400 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Komponenten A, B und C, übliche Formulierungshilfsmittel;
wobei sich die Gewichtsanteile A, B und C zu 100 Gew.-% ergänzen.
24. Formulierung nach Anspruch 23, enthaltend wenigstens 5 Gew.-% Ballaststoffe, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung.
25. Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 22 bis 24 für die Tier- oder Humanernährung.
26. Verwendung einer Formulierung nach einem der Ansprüche 22 bis 24 für die Textil-, Leder-, Zellstoff-, Papier- oder Oberflächenbehandlung.
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