WO2007023057A1 - Verfahren zur gewinnung von nukleinsäuren aus blut - Google Patents

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WO2007023057A1
WO2007023057A1 PCT/EP2006/064652 EP2006064652W WO2007023057A1 WO 2007023057 A1 WO2007023057 A1 WO 2007023057A1 EP 2006064652 W EP2006064652 W EP 2006064652W WO 2007023057 A1 WO2007023057 A1 WO 2007023057A1
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acid
copolymer
polymer
optionally
lysis
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PCT/EP2006/064652
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Christoph Erbacher
Ralf Himmelreich
Ralf Peist
Ingerlise Evans Haaland
Hege Hardersen
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Qiagen Gmbh
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to an improved method for isolating nucleic acids, in particular genomic deoxyribonucleic acid (DNA) from blood.
  • nucleic acids in particular genomic deoxyribonucleic acid (DNA) from blood.
  • nucleic acids in particular genomic DNA from so-called whole blood
  • methods for purifying and isolating nucleic acids are known from the prior art.
  • these prove to be very complex in their application and are also very labor intensive and time consuming.
  • most methods require isolation of the cell material or nuclei for a relatively long incubation period in the presence of proteinases, followed by - possibly multiple - phenol extractions (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al., Pg. 9,17-9 , 18 and Nucl. Acid Res. 3, 2303-2306).
  • EP 0 389 063 discloses a method in which the blood sample to be examined is treated with a chaotropic substance in the presence of a matrix material present in the form of particles, such as, for example, silica.
  • a matrix material present in the form of particles, such as, for example, silica.
  • the finding is that the nucleic acids are released from the cells under these reaction conditions and then bind to suitable - silica-based matrix materials. Thereafter, the matrix material comprising the nucleic acids - e.g. by centrifugation - be separated from the reaction solution. After removal of the supernatant, the matrix material is subjected to one or, if necessary, several washing steps.
  • the object of the present invention is therefore to avoid the disadvantages of the known from the prior art method and to provide a method for isolating nucleic acids preferably from genomic DNA from blood, which avoids particularly time-consuming and especially labor-intensive centrifugation steps and which in particular can be automated.
  • the earthquake should be kept to a minimum.
  • the nucleic acids or genomic DNA obtained in this way should be available in a form which they can use for subsequent reactions - such as e.g. Amplification reactions in particular PCR - makes available without additional process steps. This requirement arises from the need for genomic DNA for a variety of different assay methods, e.g. Genome typing (genotyping) etc.
  • genomic DNA which i.a. represents the essential starting material of the genome typing
  • SNP analyzes in the human genome
  • Diagnostic genotyping e.g., cystic fibrosis; factor V Leiden
  • the adsorbent material can also be present in the form of a matrix material which is not fixed to the boundary walls of the reaction vessel.
  • the internally coated reaction vessel is designed in such a way that it makes it possible to carry out an amplification reaction or PCR, and-in a particular embodiment-enables an automated performance of the desired reaction of several or of a plurality of samples.
  • erythrocyte lysis buffers have polyanionic structures, in particular anionic polymers, the functional groups of carboxylic acids or other acids, such as sulfonic or phosphonic acids or phenols as acids in the broadest sense - have, bind.
  • the erythrocyte lysis buffer used according to the invention mainly lyse erythrocytes, with white blood cells remaining substantially intact, or the latter being lysed only to the extent that they remain as so-called cell organelles (cell nuclei and mitochondria).
  • the cell organelles do not have to remain completely intact, but at least to the extent that adsorption of the surface of the cell organelles to the polymers having a polyanionic structure can take place.
  • the destruction of the cell organelles should also not have progressed so far that the nucleic acid was released from the cell organelles, since it has been shown that the nucleic acid as such binds poorly to the said polymers.
  • Zelldebris in which DNA is included, can be bound to the polymer matrix. All other interfering blood components - such as hemoglobin - can be removed as far as possible after lysis by removing the reaction solution or by washing the polyanionic polymer matrix with suitable washing buffers.
  • the lysis buffers required for lysis are known in the art and are also commercially available - e.g. "QIAGEN Buffer FG1", “QIAGEN Buffer C1” or Gentra RBC Lysis Solution. In principle, however, the use of any buffer is possible whose components are able to lyse erythrocytes.
  • a buffer solution containing 155 mM ammonium chloride and 10 mM potassium hydrogencarbonate may be mentioned.
  • Other suitable buffers are known in the art and may contain salts of inorganic or organic acids. They are preferably based on aqueous solutions of alkali earth alkaline metal halides - such as.
  • Potassium and magnesium chloride supplemented with a pH buffer, e.g. Tris, a detergent and possibly a complexing agent.
  • a pH buffer e.g. Tris
  • Particularly preferred salts of inorganic or organic acids are besides ammonium salts such as e.g. Ammonium chloride, ammonium sulfate or organic ammonium salts such as ammonium tartrate in concentrations between 100 and 500 mM, and anionic, neutral or cationic detergents in concentrations of 0.01% by weight - 5% by weight.
  • Preferred detergents are, for example, SDS, Chaps, Tween 20, Triton or Catrimox.
  • all anionic structures forming polymers are suitable as coating materials, with carboxylated polymers, copolymers or terpolymers or mixtures of these polymers being preferred.
  • carboxylated polymers such as 1-octadecene or isopropylene and maleic acid or acrylic acid, wherein the carboxyl functions may possibly be esterified to varying degrees, are used.
  • alkyl acrylates are: methyl acrylate, ethyl acrylate, vinyl acrylate, propyl acrylate, butyl acrylate, hexyl acrylate, octyl acrylate, decyl acrylate, dodecyl acrylate, myristyl acrylate, lauryl acrylate, cetyl acrylate, stearyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, propyl methacrylate, butyl methacrylate, isobutyl methacrylate, hexyl methacrylate, 2-ethyl hexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, phenyl methacrylate, octyl methacrylate, decyl methacrylate, dodecyl methacrylate, myristyl methacrylate, lauryl methacrylate, cetyl methacrylate
  • branched or unbranched C 1 - to C 2 -alkyl esters of acrylic or methacrylic acid in particular methyl methacrylate, ethyl methacrylate, butyl methacrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, methyl acrylate, ethyl acrylate, butyl acrylate and 2-ethylhexyacrylate or maleic acid alkyl esters, for example methyl maleate.
  • Polylanionen für FORM forming polymers having, for example, sulfonic or phosphonic acid groups or phenol residues or mixtures thereof;
  • the phenolic compounds may also be part of the backbone, it is preferred that these be located on side chains of the polymer backbone.
  • these In general, it is possible to introduce the phenol group into the polymer even after polymerization.
  • substituents such as amine radicals to polymerizable monomers such as acrylic acid, methacrylic acid or derivatives thereof.
  • a particularly preferred phenolic compound is tyramine.
  • polyesters which are capable of forming a polyanionic structure.
  • the monomers per se may have the groups which represent or form anionic sites in the polymer after the polymerization.
  • the polyesters may also be post-added with anion-forming groups, e.g. via unsaturated sites or other functional groups present in the polyester.
  • dicarboxylic acids such as succinic acid, adipic acid, phthalic acid or maleic acid and as the alcohol tartaric acid or other di- or trialcohols which contain at least one further anionic functionality.
  • di- or trialcohols without further anionic functionalities can also be used for the polymerization if the double bond remaining in the polymer is used, for example, by the maleic acid to subsequently introduce anion-forming groups, for example acrylic acid or methacrylic acid.
  • the copolymer capable of forming a polyanionic structure is preferably typified by a carboxylated polymer based on styrene and maleic anhydride.
  • the copolymer copolymer 5 to 95 wt .-%, preferably 25 to 95 wt .-% and particularly preferably 50 to 95 wt .-% of maleic acid on.
  • the copolymer capable of forming a polyanionic structure is also preferably embodied by a carboxylated polymer based on methyl vinyl ether and maleic acid.
  • the copolymer can be used, for example, as
  • carboxyl groups may be partially esterified, for example with a methyl group.
  • poly (methyl vinyl ether-old-maleic acid) copolymers having a molecular weight in a range from 1.0 10 3 to 2.5 10 6 , preferably 1.0 10 4 to 2.2 10 6 and more preferably in a range of 1.9 10 6 to 2.1 10 6 ,
  • carboxylated polymers are well known in the art - since these polymers are used in a variety of other technical applications, they are also, to a large extent, commercially available.
  • polymers can be prepared via radical polymerization with carboxyl group-containing monomers.
  • the polyanionic or carboxylated polymers can be applied in a variety of ways to the boundary wall / walls of the reaction vessel, be present in the liquid state or in the form of a suspension in the mixture resulting from the lysis, or in the form of a so-called dipstick.
  • the coating with a polymer melt can lead to the desired functionalized layer.
  • Reaction vessel is produced by injection molding - add the polymer as an additive before injection molding of the intended mass for injection molding; it is also possible to coat all or certain parts of the injection mold with the polymer prior to injection molding, wherein after the formation of the reaction vessel, the desired coatings are obtained.
  • any kind of amplification reaction - for example a PCR - can follow, which can be carried out under the reaction conditions well known from the prior art. No special process adjustments are necessary for this.
  • the reaction solution is first heated to a temperature in an interval of 45 to a maximum of 100 ° C., preferably to a temperature in an interval of 80 to 98 ° C. and particularly preferably 94 to 96 ° C., the nucleic acids or the genomic DNA ( thermal lysis) and is thus available in the subsequent PCR.
  • the polymer which is capable of forming polyanionic structures acts as an additional component for the polymer Lysis buffer or the mixture to be lysed is added.
  • the binding of gDNA-containing cell components such as mitochondria and cell nuclei does not then take place at the PCR vessel wall, but directly in the liquid phase. This leads to complexes consisting of the stated cell constituents and the carboxylated polymer which can adhere to the wall thereof during lysis and incubation in the PCR vessel.
  • the coating therefore takes place simultaneously during the lysis, ie cell constituents already bound in the liquid phase are deposited on the vessel wall together with the carboxylated polymer.
  • the gDNA-containing cell components remain and, as described, can be further treated or detected and quantified.
  • the method according to the invention not only enables a significant reduction in the number of operations and the risk of contamination of the samples, but also a significant reduction in biologically contaminated waste because the samples do not have to be repipetted.
  • kit formats currently available on the market are designed for the isolation of relatively large amounts of gDNA (typically 20 ⁇ g). This is oversized for many applications (e.g., single marker analysis).
  • the solution according to the invention can be designed for the preparation of 10 ng gDNA and thus additionally saves material. Both of these savings effects (fewer operations, smaller kits) significantly reduce material usage of specialty plastic articles (e.g., die-cut silica membranes in association with polypropylene injection molded parts) and buffer solutions. Secondly, the reduced use of materials also reduces the energy required for the production of the corresponding precursors.
  • speeds of from 100 to 500,000 rpm, more preferably from 500 to 13,000 rpm, most preferably from 1,000 to 5,000 rpm are used for the centrifugation.
  • Another object of the present invention is a kit for obtaining nucleic acid from samples containing cell organelles containing nucleic acids comprising
  • a matrix material which is either solid state on the inner wall of one or more empty reaction vessels or is present as a solid, in solution or in a dispersed state, and which is able to adsorb cell organelles, b) one or more erythrocytes C) if the matrix material is not located on the inner wall of the one or more empty reaction vessels, optionally one or more reaction vessels, d) optionally one or more wash solutions, e) optionally reagents for carrying out PCR reactions and f) optional an instruction manual.
  • the matrix material used is preferably the above-described polymer, copolymer or terpolymer capable of forming a polyanionic structure.
  • the reaction vessels are preferably sample vessels as used in the prior art for the purification of biological samples. These may be individual vessels or a conglomerate of several vessels, such as 48- or 96-well plates or other vessel conglomerates known from the prior art.
  • the matrix material is preferably located on the inner wall of these vessels. It may either be pre-fixed to the wall or adsorbed as described above, so that one or more already coated sample vessels are provided. There is also the possibility that the matrix material may be provided as a solid, in solution or in a dispersed state and added in the course of the method described above for obtaining the nucleic acid. It can be both to the lysis solution and to the sample it can be added to the empty reaction vessel or it can be added to the lysate.
  • the matrix material and the material of the sample vessels should be chosen so that the matrix material is fixed or adsorbed on the inner walls of the reaction vessel after lysis.
  • commercially available sample containers in particular made of plastic, can be used.
  • the use of PCR reaction vessels has the advantage that the prepared samples need no longer be transferred to perform the PCR reaction.
  • one or more of the sample containers can also be added to the kit.
  • FIG. 1 shows the following:
  • RNA from 5 donors was collected in 4 different blood collection tubes each.
  • 4 preparations were made in PCR tubes as described in Example 10.
  • qPCR a sequence segment of the human ⁇ -actin gene was amplified with the aid of so-called TaqMan probes.
  • the bar graph of Fig. 2 represents the results of quantitative PCR. Each bar represents the ct value averaged over four PCR tubes.
  • Fig. 3 shows the ct values of the PCR reactions of prepared samples according to Example 11 in sample vessels coated with different polymers.
  • FIG. 4 shows the calculated absolute amounts of nucleic acid obtained using a calibration curve, which result in the amplification according to Example 11.
  • N-Me-PVA N-methyl-polyvinylamine
  • TEA triethylamine
  • the monomer obtained from a) was dissolved in chloroform and after addition of a spatula tip AIBN was refluxed for 5 h. Then another spatula tip AIBN was added and boiled overnight. It was then hydrolyzed and extracted 2x with dichloromethane. The collected organic phases were dried over sodium sulfate and then the solvent was removed under reduced pressure. A reddish resin was obtained which was not further purified.
  • a coating solution having a concentration of 60 mg / ml in ethanol was prepared.
  • the monomer was dissolved in chloroform and after addition of a spatula tip AIBN was refluxed for 5h. Then another spatula tip AIBN was added and boiled overnight. It was then hydrolyzed and extracted 2x with dichloromethane. The collected organic phases were dried over sodium sulfate and then the solvent was removed under reduced pressure. A pale yellow resin was obtained, which was purified by dialysis.
  • a coating solution having a concentration of 60 mg / ml in deionized water was prepared.
  • a coating solution having a concentration of 60 mg / ml in deionized water was prepared.
  • lysis buffer 155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 in water
  • RT-PCR quantitative "real time" PCR
  • the coating solutions described in the respective examples listed were prepared.
  • the polymaleic acid N-propylamide solution was prepared in a concentration of 40 mg / ml in deionized water.
  • the poly (isobutylene-old-maleic acid) was prepared at a concentration of 5 l / ml in 1N KOH.
  • Example 10 a preparation of a blood sample and subsequent PCR reaction according to the description of Example 10 was performed.
  • the Ct values obtained in the polymers used are shown in FIG. 3, the calculated absolute yields obtained using a calibration curve are shown in FIG. 4.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere von genomischer Desoxyribonukleinsäure (DNA) aus Blut.

Description

Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Blut
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere genomischer Desoxyribonukleinsäure (DNA) aus Blut.
Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere genomischer DNA aus sog. Vollblut bekannt. Diese erweisen sich jedoch als sehr komplex in ihrer Anwendungsweise und sind darüber hinaus sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Daneben erfordern die meisten Methoden neben einer Isolierung des Zellmaterials oder der Zellkerne einen relativ langen Inkubationszeitraum in Gegenwart von Proteinasen, gefolgt von - ggf. mehreren - Phenolextraktionen (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al., pg. 9,17-9,18 sowie Nucl. Acid Res. 3, 2303 - 2306).
Angesichts dieser Nachteile wurden in der Folgezeit alternative Methoden entwickelt, mit denen nicht nur der Aufwand minimiert werden sollte, sondern auch die Ausbeute an Nukleinsäure bzw. genomischer DNA sowie deren Reinheitsgrad erhöht werden sollte. Derartige Methoden basieren auf dem Einsatz von sog. chaotropen Salzen (Nucl. Acid Res. 15, 9611 , 1987 sowie Anal. Biochem. 180, 276 - 278, 1989).
So wird u.a. in der Europäischen Offenlegungsschrift EP 0 389 063 ein Verfahren offenbart, in dem die zu untersuchende Blutprobe mit einer chaotropen Substanz in Gegenwart eines - in Form von Partikeln vorliegenden - Matrixmaterials, wie zum Beispiel Silica, behandelt wird. Dabei wird die Erkenntnis eingesetzt, dass die Nukleinsäuren unter diesen Reaktionsbedingungen aus den Zellen freigesetzt werden und dann an geeignete - auf Silica basierende Matrixmaterialien - binden. Danach kann das die Nukleinsäuren aufweisende Matrixmaterial - z.B. auf dem Wege der Zentrifugation - aus der Reaktionslösung abgetrennt werden. Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Matrixmaterial einem oder erforderlichenfalls mehreren Waschschritten unterworfen.
Die oben beschriebenen Methoden bergen allerdings diejenigen Nachteile in sich, dass sie sehr zeitaufwendig sind und unerwünschte Zentrifugationsschritte beinhalten, die zwangsläufig mit einem Materialtransfer verbunden sind, welcher wiederum für jede einzelne Probe aufwendig und daneben mit einer Kontaminationsgefahr verbunden ist. Daneben weist diese Verfahrensweise den schwerwiegenden Nachteil auf, dass sie nicht automatisierbar ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zu vermeiden und ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren bevorzugt von genomischer DNA aus Blut zur Verfügung zu stellen, welches insbesondere zeitaufwendige und vor allem arbeitsaufwendige Zentrifugationsschritte vermeidet und welches insbesondere automatisierbar ist. Danbeben soll die Kontaminationsgefahr und der anfallende biologisch kontaminierte Abfall und auf ein Minimum verringert werden. Des Weiteren sollen die so gewonnenen Nukleinsäuren bzw. genomische DNA in einer Form verfügbar sein, die sie für Folgereaktionen - wie z.B. Amplifikationsreaktionen insbesondere PCR - ohne zusätzliche Verfahrensschritte verfügbar macht. Diese Forderung erwächst aus dem Bedarf an genomischer DNA für zahlreiche verschiedene Untersuchungsmethoden wie z.B. Genom-Typisierungen (Genotyping) etc.
Die Anforderung, die an die vorgelagerte Isolierung der genomischen DNA gestellt wird, besteht insbesondere darin, dass die genomische DNA, die u.a. das essentielle Ausgangsmaterial der Genom-Typisierung darstellt, möglichst schnell aufgereinigt wird und ohne Zeitverzögerung und ohne mit fremder Nukleinsäure kontaminiert zu werden in der gewünschten Folgereaktion eingesetzt werden kann - insbesondere:
PCR basierte Genomtypisierung;
SNP-Analysen im humanen Genom;
Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks (Forensik, Kriminaltechnik);
Diagnostische Genotypisierung (z.B. zystische Fibrose; Faktor V Leiden);
Durchführung von vielfacher oder Multiplex-PCR aus einer Probe zum Nachweis von
Markern;
Restriktionslängenpolymorphismen basierend auf primärer PCR Amplifikation;
Durchführung von quantitativen PCRs. Gelöst werden die vorbeschriebenen Aufgaben durch das in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagene Verfahren, bei dem die - zu analysierende - Blutprobe zunächst mit einem Erythrozyten-Lysepuffer in einem Reaktionsgefäß in Kontakt gebracht wird, welches mit einer Beschichtung versehen ist, die durch die Lyse freigesetzten Zellkerne und Mitochondrien adsorbieren kann.
Daneben kann das adsorbierende Material auch in Form eines nicht an den Begrenzungswänden des Reaktionsgefäßes fixierten Matrixmaterials in dem zugegen sein. Vorteilhafterweise ist das innen beschichtete Reaktionsgefäß in der Weise ausgestaltet, dass es die Durchführung einer Amplifikationsreaktion bzw. PCR ermöglicht, und - in einer besonderen Ausführungsform - eine automatisierte Durchführung der gewünschten Reaktion von mehreren bzw. von einer Vielzahl von Proben ermöglicht.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass weiße Blutzellen und sowie durch die Erythrozytenlyse freigesetzte Zellbestandteile - wie Zellkerne und Mitochondrien - in Gegenwart von Erythrozyten-Lysepuffern an polyanionische Strukturen aufweisende Polymere, insbesondere anionische Polymere, die funktionelle Gruppen von Carbonsäuren oder anderen Säuren - wie Sulfon- oder Phosphonsäuren oder Phenole als Säuren im weitesten Sinne - aufweisen, binden. Dabei lysieren die erfindungsgemäß eingesetzten Erythrozyten-Lysepuffer vornehmlich Erythrozyten, wobei weiße Blutkörperchen im wesentlichen intakt bleiben, bzw. letztere werden nur so insoweit lysiert, dass sie als sog. Zellorganellen (Zellkerne und Mitochondrien) verbleiben. Die Zellorganellen müssen dabei nicht vollständig intakt bleiben, jedoch zumindest soweit, dass eine Adsorption der Oberfläche der Zellorganellen an die eine polyanionische Struktur aufweisenden Polymere erfolgen kann. Die Zerstörung der Zellorganellen sollte dabei auch noch nicht so weit fortgeschritten sein, dass die Nukleinsäure aus den Zellorganellen freigesetzt wurde, da sich gezeigt hat, dass die Nukleinsäure als solche schlecht an die genannten Polymere bindet. Auch Zelldebris, in die DNA eingeschlossen ist, kann an die Polymermatrix gebunden werden. Alle anderen störenden Blutbestandteile - wie z.B. Hämoglobin - können nach der Lyse durch Entfernen der Reaktionslösung bzw. durch Waschen der polyanionischen Polymermatrix mit geeigneten Waschpuffern weitestgehend entfernt werden. Die Adsorption der oben beschriebenen Zellorganellen an die Matrix anstelle einer Bindung der Nukleinsäuren direkt, wie es verschiedentlich im Stand der Technik beschrieben ist, und die Verwendung von polyanionische Strukturen aufweisenden Polymeren zu diesem Zweck hat den Vorteil, dass der pH-Wert im Lyseschritt im Vergleich zum pH-Wert bei einer optional anschließend erfolgenden PCR-Reaktion nicht geändert werden muss, sondern gleich bleiben kann. Dadurch kann es vermieden werden, zusätzliche Verfahrensschritte einzuführen, die der Neutralisation oder der Einstellung eines anderen pH-Wertes dienen.
Um die Blutprobe zu stabilisieren und etwaige Zersetzungsreaktionen zu verhindern oder zu verzögern kann es vorteilhaft sein, die Blutprobe möglichst kurz nach der Entnahme einzufrieren und die gefrorene Probe bzw. die aufgetaute Probe dem erfindungsgemäßen Verfahren zu unterziehen.
Die für die Lyse erforderlichen Lysepuffer sind aus dem Stand der Technik bekannt und daneben auch kommerziell erhältlich - z.B. „QIAGEN Buffer FG1 ", „QIAGEN Buffer C1" oder Gentra RBC-Lyselösung. Prinzipiell ist allerdings die Verwendung eines jeden Puffers möglich, dessen Bestandteile in der Lage sind, Erythrozyten zu lysieren. Als Beispiel sei eine Pufferlösung enthaltend 155 mM Ammoniumchlorid und 10 mM Kaliumhydrogencarbonat genannt. Weitere geeignete Puffer sind dem Fachmann bekannt und können Salze anorganischer oder organischer Säuren enthalten. Sie basieren dabei vorzugsweise auf wässerigen Lösungen von Alkali- Erdalkalimetallhalogeniden - wie z.B. Kalium- und Magnesiumchlorid, ergänzt um einen pH-Puffer, wie z.B. Tris, ein Detergenz und ggf. einen Komplexbildner. Besonders bevorzugte Salze anorganischer oder organischer Säuren sind daneben sind Ammoniumsalze wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder organische Ammoniumsalze wie Ammoniumtartrat in Konzentrationen zwischen 100 und 500 mM, sowie anionische, neutrale oder kationische Detergenzien in Konzentrationen von 0,01 Gew-% - 5 Gew-%. Bevorzugte Detergenzien sind beispielsweise SDS, Chaps, Tween 20, Triton oder Catrimox.
Als Beschichtungsmaterialien sind prinzipiell alle anionische Strukturen ausbildenden Polymere geeignet, wobei carboxylierte Polymere, Co- oder Terpolymere oder Mischungen dieser Polymere bevorzugt werden. Beispielsweise können Copolymere auf der Basis Styrol, Vinylmethylether, unverzweigten oder verzweigten Alkenen - wie z.B. 1 -Octadecen oder Isopropylen und Maleinsäure oder Acrylsäure, wobei die Carboxylfunktionen ggf. in unterschiedlichen Graden verestert sein können, zum Einsatz kommen. Bevorzugt seien als Beispiele folgende Acrylsäurealkylester genannt: Methylacrylat, Ethylacrylat, Vinylacrylat, Propylacrylat, Butylacrylat, Hexylacrylat, Octylacrylat, Decylacrylat, Dodecylacrylat, Myristylacrylat, Laurylacrylat, Cetylacrylat, Stearylacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Propylmethacrylat, Butylmethacrylat, Isobutylmethacrylat, Hexylmethacrylat, 2-Ethyl-hexylacrylat, 2- Ethyl-hexylmethacrylat Phenylemethacrylat, Octylmethacrylat, Decylmethacrylat, Dodecylmethacrylat, Myristylmethacrylat, Laurylmethacrylat, Cetylmethacrylat, worunter der Acrylsäuremethylester besonders bevorzugt wird.
Bevorzugt sind die verzweigten oder unverzweigten Cr bis Ci2-Alkylester der Acryl- oder Methacrylsäure, insbesondere Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, Methylacrylat, Ethylacrylat, Butylacrylat und 2-Ethylhexyacrylat oder Maleinsäurealkylester - wie z.B.: Maleinsäuremethylester.
Daneben ist es möglich, andere Polylanionenstrukturen ausbildende Polymere einzusetzen, die beispielsweise Sulfon- oder Phosphonsäuregruppen oder Phenolreste oder Mischungen derselben aufweisen; stellvertretend sei als Beispiel Polystyrolsulfonsäure in Form des Homopolymers oder als Bestandteil eines Copolymers genannt.
Obwohl die Phenolverbindungen auch Bestandteil der Hauptkette sein können, ist es bevorzugt, dass sich diese an Seitenketten des Polymerrückgrates befinden. Generell ist es möglich, die Phenolgruppe auch nach der Polymerisierung in das Polymer einzuführen. Eine besonders homogene Verteilung wird jedoch erzielt, wenn die Phenolgruppen bereits Bestandteil des Monomers sind. So können sie beispielsweise über Substituenten wie Aminreste an polymerisierbare Monomere wie Acrylsäure, Methacrylsäure oder deren Derivate gebunden werden. Um einen größeren Abstand des Phenols in der Seitenkette zum Polymerrückgrat zu erhalten können weitere Verbindungen zwischen dem polymerisierbaren Bestandteil und dem Phenolrest als Brücke fungieren. Bei einer besonders bevorzugt verwendeten Phenolverbindung handelt es sich um Tyramin.
Weitere geeignete Polymere stellen Polyester dar, die zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur in der Lage sind. Generell können die Monomere an sich die Gruppen aufweisen, die nach der Polymerisation anionische Stellen im Polymer darstellen oder ausbilden. Daneben können die Polyester auch nachträglich noch mit Anionen ausbildenden Gruppen versehen werden, z.B. über ungesättigte Stellen oder andere funktionelle Gruppen, die im Polyester vorliegen.
Vorzugsweise werden als Monomere Dicarbonsäuren wie Bernsteinsäure, Adipinsäure, Phthalsäure oder Maleinsäure und als Alkohol Weinsäure oder andere Di- oder Trialkohole, die mindestens eine weitere anionsche Funktionalität enthalten, verwendet. Bei Verwendung von Maleinsäure als Monomer können auch Di- oder Trialkohole ohne weitere anionischen Funktionalitäten zur Polymerisation verwendet werden, wenn die im Polymer verbleibende Doppelbindung von der Maleinsäure beispielsweise genutzt wird, um nachträglich Anionen ausbildende Gruppen einzuführen, wie beispielsweise Acrylsäure oder Methacrylsäure.
Das zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Copolymer wird vorzugsweise durch ein carboxyliertes Polymer auf der Basis von Styrol und Maleinsäureanhydrid verkörpert. Dabei weist das Copolymer Copolymer 5 bis 95 Gew.-%, bevorzugt 25 bis 95 Gew.-% und besonders bevorzugt 50 bis 95 Gew.-% an Maleinsäureeinheiten auf.
Das zur Ausbildung dass das zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Copolymer wird daneben ebenfalls vorzugsweise durchein carboxyliertes Polymer auf der Basis von Methylvinylether und Maleinsäure verkörpert. Das Copolymer kann dabei zum Beispiel als
Poly(methylvinylether-alt-maleinsäure)
Figure imgf000007_0001
vorliegen, deren Carboxylgruppen teilweise - z.B. mit einer Methylgruppe - verestert sein können.
Dabei können Poly(methylvinylether-alt-maleinsäure)-Copolymere mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 1.0 103 bis 2.5 106, bevorzugt 1.0 104 bis 2.2 106 und besonders bevorzugt in einem Bereich von 1.9 106 bis 2.1 106 liegt.
Namentlich werden besonders bevorzugt:
Poly(methyl vinyl ether-alt-maleinsäure) MW: 1.980.000 Poly(isobutylen-alt-maleinsäure) MW: 3.250.000 Polystyrol-co-maleinsäure, 50 Gewichtsprozent Maleinsäure Polystyrol-co-maleinsäure, 25 Gewichtsprozent Maleinsäure Polystyrol-co-maleinsäure, 14 Gewichtsprozent Maleinsäure Polyisopren-graft-maleinsäure 7 Gewichtsprozent Maleinsäure Poly(maleinsäure-1 -octadec-1-en) im Molverhältnis 1 :1 Poly(methylvinylether-alt maleinsäure) MW: 1.250.000 Polystyrol-alt-maleinsäure teilweise als Methylester Poly(acrylsäure-co-acrylsäuremethylester) Polystyrolsulfonsäure
Die Herstellung carboxylierter Polymere ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt - da diese Polymere in einer Vielzahl anderer technischer Anwendungen eingesetzt werden, sind sie zu einem großen Teil auch kommerziell erhältlich.
Weitere Polymere können über radiaklische Polymerisation mit Carboxylgruppen- aufweisenden Monomeren hergestellt werden.
Die polyanionischen bzw. carboxylierten Polymere können auf vielfältige Art und Weise auf die Begrenzungswand/-wände des Reaktionsgefäßes aufgebracht werden, in flüssigem Zustand bzw. in Form einer Suspension in dem aus der Lyse resultierenden Gemisch zugegen sein oder in Form eines sog. Dippsticks vorliegen. So kann die Beschichtung mit einer Polymerschmelze zu der gewünschten funktionalisierten Schicht führen. Daneben besteht die Möglichkeit - sofern das Reaktionsgefäß mittels Spritzguss hergestellt wird - das Polymer als Additiv vor dem Spritzguss der für den Spritzguss vorgesehenen Masse zuzufügen; ebenso besteht die Möglichkeit, alle oder bestimmte Teile der Spritzgussform mit dem Polymer vor dem Spritzguss zu beschichten, wobei nach dem Ausbilden des Reaktionsgefäßes die gewünschten Beschichtungen erhalten werden. Daneben besteht die Möglichkeit, eine Folie aus dem die polyanionischen Strukturen ausbildenden Polymer an der Innenwand des Reaktionsgefäßes anzubringen und z.B. durch sog. Triefzugverfahren in die gewünschte geometrische Form zu bringen. Bevorzugt wird daneben die Beschichtung mit dem polyanionischen Polymer, das in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst ist. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass das Polymer in der Lösung zunächst als in Form eines sog. Precursors vorliegt, aus dem im Zuge des Reaktionsverlaufs erst das die gewünschte Struktur aufweisende Polymer erst gebildet wird.
Des weiteren besteht die Möglichkeit - bei Auswahl dafür geeigneter Polymere, die dem Fachmann bekannt sind - nach der Herstellung des zunächst nicht funktionalisierten Reaktionsgefäßes -, die gewünschte Funktionalisierung der Oberfläche mit aus dem Stand der Technik bekannten „nasschemischen Verfahren" (Schwefelsäure/Wasserstoffperoxid) oder auf dem Wege Atmosphärendruck- Plasmabehandlung zu erzielen.
Im nachfolgenden Schritt kann sich beispielsweise eine wie auch immer geartete Amplifikationsreaktion.- beispielsweise eine PCR - anschließen, die unter den aus dem Stand der Technik wohlbekannten Reaktionsbedingungen durchgeführt werden kann. Hierzu sind keine besonderen Verfahrungsanpassungen erforderlich. Beim ersten Erhitzen der Reaktionslösung auf eine Temperatur in einem Intervall von 45 bis maximal 100 °C, bevorzugt auf eine Temperatur in einem Intervall von 80 bis 98 °C und besonders bevorzugt auf 94 - 96 °C werden die Nukleinsäuren bzw. die genomische DNA (thermische Lyse) freigesetzt und steht somit in der nachfolgenden PCR zur Verfügung.
In einer weiteren Ausführungsform kann auf eine Beschichtung oder Derivatisierung der Gefäßoberfläche verzichtet werden, wenn das zur Ausbildung von polyanionischen Strukturen befähigte Polymer als zusätzliche Komponente dem Lysepuffer oder dem zu lysierenden Gemisch zugefügt wird. Die Bindung von gDNA- haltigen Zellbestandteilen wie, Mitochondrien und Zellkernen findet dann nicht an der PCR-Gefäßwandung statt, sondern direkt in der flüssigen Phase. Dies führt zu Komplexen bestehend aus den genannten Zellbestandteilen und dem carboxylierten Polymer die während der Lyse und Inkubation im PCR-Gefäß an dessen Wandung adhärieren können. Die Beschichtung findet also simultan während der Lyse statt d.h. bereits in der flüssigen Phase gebundene Zellbestandteile werden zusammen mit dem carboxylierten Polymer an der Gefäßwand abgeschieden.
In allen Ausführungsformen bleiben nach der Lyse und ggf. dem Waschen der polyanionischen Polymere die gDNA-haltigen Zellbestandteile zurück und können - wie beschrieben - weiter behandelt bzw. detektiert und quantifiziert werden.
Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren mit der Durchführung der Analyse von der Lyse der Blutprobe bis zum Beginn der gewünschten Folgereaktion in einem Gefäß nicht nur eine deutliche Reduktion der Anzahl der Arbeitsschritte und der Kontaminationsgefahr der Proben, sondern auch damit einhergehend eine deutliche Verminderung an biologisch kontaminierten Abfall, da die Proben nicht mehr umpipettiert werden müssen.
Eine weitere Materialersparnis ergibt sich aus dem Umstand, dass die aktuell am Markt verfügbaren Kit-Formate für die Isolation von relativ großen Mengen gDNA ausgelegt sind (typischerweise 20 μg). Dies ist für viele Einsatzgebiete (z.B. Analyse einzelner Marker) überdimensioniert. Die erfindungsgemäße Lösung kann für die Präparation von 10 ng gDNA ausgelegt werden und spart so zusätzlich Material ein. Durch beide Einsparungseffekte (weniger Arbeitsschritte, kleinere Kits) vermindert sich insgesamt der Materialeinsatz an Spezial-Plastikartikeln (z.B. an gestanzten Silicamembranen im Verbund mit Polypropylen Spritzgußteilen) und Pufferlösungen erheblich. Zum Zweiten sinkt durch den verringerten Materialeinsatz auch der Energieaufwand für die Herstellung der entsprechenden Vorprodukte.
Obwohl es aus Gründen der Arbeitserleichterung und der Zeitersparnis bzw. der Möglichkeit zur Automatisierung bevorzugt ist, jegliche Zentrifugationsschritte wegzulassen besteht jedoch auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Möglichkeit, zusätzlich ein oder mehrere Zentrifugationsschritte zu integrieren. Vorteilhafterweise finden diese nach dem in Kontakt Bringen der Blutprobe mit dem Erythrozyten-Lysepuffer und vor der Entfernung der aus der Lyse resultierenden Reaktionsmischung statt. Es hat sich gezeigt, dass durch die Zentrifugation die Zellorganellen deutlich fester an die Matrix gebunden werden als ohne einen entsprechenden Zentrifugationsschritt. Dies hat den Vorteil, dass bei dem Waschschritt der Verlust an Zellorganellen, die sich beim Waschen von der Matrix lösen und zusammen mit der Waschlösung entfernt werden, und damit auch der Verlust an isolierter Nukleinsäure, verringert wird.
Bei einer Integration eines Zentrifugationsschrittes in das erfindungsgemäße Verfahren werden nicht unerwünschte Bestandteile der Lyselösung sedimentiert und die gewünschten Bestandteile in ein anderes Gefäß überführt, was zu Kontaminationen führen kann. Vielmehr wird diejenige überstehende Flüssigkeit abgetrennt, die anschließend verworfen wird, während die gewünschten Bestandteile adsorbiert werden und weiterhin im Gefäß verbleiben. Somit ist bei dem vorliegenden Verfahren die Gefahr einer Kontamination minimiert.
Vorteilhafterweise werden für die Zentrifugation Geschwindigkeiten von 100 bis 500.000 UpM, weiter bevorzugt von 500 bis 13.000 UpM, am meisten bevorzugt von 1.000 bis 5.000 UpM angewandt.
Es hast sich ebenfalls gezeigt, dass bei einer Reduktion der Probenmenge auf den Waschschritt verzichtet werden kann, ohne Ausbeuteverluste zu erleiden. Bei den üblich eingesetzten Probenmengen von etwa 20 I befinden sich im Sediment der adsorbierten bzw. adhäsierten Zellorganellen derartige Mengen an Inhibitoren, dass nachfolgende Anwendungen wie PCR-Amplifikation beeinträchtigt werden können. Durch Waschschritte kann eine Störung durch Inhibitoren verringert oder ganz verhindert und die Ausbeute erhöht werden. Eine Reduktion der Probenmenge führt jedoch ebenfalls dazu, dass die Menge an Inhibitoren verringert wird, auch ohne dass Waschschritte stattfinden. Gleichzeitig ist die Bindung der Nukleinsäure an die Matrix, insbesondere bei zusätzlicher Anwendung eines oder mehrerer Zentrifugationsschritte, anscheinend derart stark, dass es nicht zu Ausbeutverlusten kommt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Gewinnung von Nukleinsäure aus Proben enthaltend Zellorganellen, die Nukleinsäuren enthalten, umfassend
a) ein Matrixmaterial, das sich entweder in festem Zustand an der inneren Wand eines oder mehrerer leerer Reaktionsgefäße befindet oder als Feststoff, in Lösung oder in dispergiertem Zustand vorliegt, und das in der Lage ist, Zellorganellen zu adsorbieren, b) ein oder mehrere Erythrozyten-Lysepuffer, c) wenn sich das Matrixmaterial nicht an der inneren Wand der ein oder mehreren leeren Reaktionsgefäße befindet, optional ein oder mehrere Reaktionsgefäße, d) optional ein oder mehrere Waschlösungen, e) optional Reagenzien zur Durchführung von PCR-Reaktionen und f) optional eine Gebrauchsanleitung.
Als Matrixmaterial findet vorzugsweise das oben beschriebene, zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Polymer, Copolymer oder Terpolymer Anwendung.
Bei den Reaktionsgefäßen handelt es sich vorzugsweise um Probengefäße wie sie im Stand der Technik zur Aufreinigung biologischer Proben verwendet werden. Dabei kann es sich um Einzelgefäße oder um ein Konglomerat mehrerer Gefäße handeln, wie beispielsweise um 48- oder 96-Well-Platten oder um andere aus dem Stand der Technik bekannte Gefäßkonglomerate.
Das Matrixmaterial befindet sich vorzugsweise an der inneren Wand dieser Gefäße. Es kann dabei entweder wie oben beschrieben vorab an der Wand fixiert oder adsorbiert sein, so dass ein oder mehrere bereits beschichtete Probengefäße zur Verfügung gestellt werden. Es besteht auch die Möglichkeit, dass das Matrixmaterial als Feststoff, in Lösung oder in dispergiertem Zustand zur Verfügung gestellt wird und im Verlauf des oben beschriebenen Verfahrens zur Gewinnung der Nukleinsäure zugegeben wird. Es kann dabei sowohl zu der Lyselösung als auch zu der Probe zugegeben werden, es kann in dem leeren Reaktionsgefäß vorgelegt werden oder man kann es dem Lysat zufügen.
Das Matrixmaterial und das Material der Probengefäße sollten so gewählt werden, dass das Matrixmaterial nach der Lyse an den inneren Wänden des Reaktionsgefäßes fixiert oder adsorbiert ist. Bei Verwendung der oben beschriebenen Polymere können handelsübliche Probengefäße, insbesondere aus Plastik, verwendet werden. Die Verwendung von PCR-Reaktionsgefäßen hat den Vorteil, dass die vorbereiteten Proben zur Durchführung der PCR-Reaktion nicht mehr umgefüllt werden müssen.
Insbesondere wenn das Matrixmaterial noch nicht als Beschichtung der Probengefäße vorliegt, können dem Kit auch ein oder mehrere der Probengefäße beigefügt werden.
Anhand der nachfolgenden Beispiele soll die vorliegende Erfindung erläutert werden. Die Beispiele verkörpern lediglich vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Fig. 1 ist folgendes zu entnehmen:
8 Proben wurden in PCR-Gefäßen gemäß Beispiel 10, die gemäß Beispiel 9 , mit einer Poly(vinylmethylether-maleinsäure)-Beschichtung versehen waren, amplifiziert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Form der ct-Werte in Fig. 1 wiedergegeben.
Fig. 2 ist folgendes zu entnehmen:
Blut von 5 Spendern wurde in jeweils 4 verschiedenen Blutentnahmeröhrchen gesammelt. Für jede Probe/Blutentnahmeröhrchenkombination wurden 4 Präparationen in PCR-Gefäßen - wie in Beispiel 10 beschrieben - durchgeführt. Bei der qPCR wurde ein Sequenzabschnitt des humanen ß-Aktin Gens mit Hilfe von sog. TaqMan-Probes amplifiziert. Das Balkendiagramm der Fig. 2 stellt die Ergebnisse der quantitativen PCR dar. Jeder Balken gibt den über vier PCR-Gefäßen gemittelten ct- Wert wieder.
Fig. 3 zeigt die ct-Werte der PCR-Reaktionen von vorbereiteten Proben entsprechend Beispiel 11 in Probengefäßen, die mit unterschiedlichen Polymeren beschichtet wurden.
Fig. 4 zeigt die unter Verwendung einer Eichkurve erhaltenen berechneten absoluten Mengen an Nukleinsäure, die bei der Amplifikation entsprechend Beispiel 11 resultieren.
Beispiele
1.) Zu 50 ml Polystyrol-co-maleinsäure mit einem 14%-igen Gewichtsanteil an Maleinsäureanhydrid gelöst in DMSO (20 mg/ml Dimethylsulfoxid) gibt man 250 mg N-(2-Hydroxyethyl-iminodiessigsäure) und erhitzt über einen Zeitraum von 45 min auf 60 °C.
Anschließend verdünnt man mit DMSO 10-fach und erhält somit eine gebrauchsfertige Lösung zur Beschichtung von Reaktionsgefäßen für die Amplifikationsreaktionen bzw. PCR.
Figure imgf000014_0001
N-(2-Hydroxyethyl-
Figure imgf000014_0002
iminodiessigsäure)
Polystyrol-co-Maleinsäureanhydrid
Figure imgf000014_0003
2.) Zu 50ml Polystyrol-co-maleinsäure mit einem 50%-igen Gewichtsanteil an Maleinsäureanhydrid gelöst in DMSO (20mg/ml Dimethylsulfoxid) gibt man 1 ,3 g N- (2-Hydroxyethyl)-iminobis(methylphosphonsäure) und erhitzt über einen Zeitraum 1 h auf eine Temperatur von 60 °C. Anschließend verdünnt man mit DMSO 10-fach und erhält somit eine gebrauchsfertige Lösung zur Beschichtung von Reaktionsgefäßen für Amplifikationsreaktionen bzw. PCR.
-
Figure imgf000015_0001
Polystyrol-co-Maleinsäureanhydrid
Figure imgf000015_0002
3.) 50 mg (0.877 mmol) N-Me-PVA (N-Methyl-polyvinylamin) wurden in 2 ml Wasser gelöst und nach Zugabe von 1.31 mmol Bromessigsäure (180 mg, 1 ,5 eq) um 50 μl TEA (Triethylamin) über einen Zeitraum von 12 h geschüttelt. Man erhält so eine gebrauchsfertige Lösung zur Beschichtung von Reaktionsgefäßen für die Amplifikationsreaktionen bzw. PCR.
4.) 0.2 g Polyvinylalkohol (MW 9000 -10000) wurden mit 630 mg (0,454 mmol, 0,8 eq.) Bromessigsäure versetzt und nach Zugabe von 1 ,2 g K2CO3 (9,08 mmol, 1 ,5 eq.) wurde für 12 h geschüttelt. Es resultiert eine gebrauchsfertige Lösung zur Beschichtung von Reaktionsgefäßen für Amplifikationsreaktionen bzw. PCR. 5) a) Synthese von Methacrylsäure-N-(4-methylphenol)amid
Figure imgf000016_0001
302 mg (2.2 mmol) Tyramin werden in 5 ml_ THF gelöst, mit 570 μl_ Triethylamin versetzt und auf 0°C gekühlt. Nach langsamer Zugabe von 208 mg (2 mmol) Methacrylsäurechlorid wird über Nacht gerührt. Anschließend wird mit 1 M Salzsäure hydrolysiert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. (1.52 mmol, Ausbeute 76%)
b) Synthese von Poly(methylacrylsäure-N-(4-methylphenol)amid)
Figure imgf000016_0002
Das aus a) erhaltene Monomer wurde in Chloroform gelöst und nach Zugabe einer Spatelspitze AIBN wurde für 5h unter Rückfluss gekocht. Dann wurde nochmals eine Spatelspitze AIBN zugegeben und über Nacht gekocht. Anschließend wurde hydrolysiert und 2x mit Dichlormethan extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Es wurde ein rötliches Harz erhalten, das nicht weiter aufgereinigt wurde.
Es wurde eine Beschichtungslösung mit einer Konzentration von 60mg/ml in Ethanol hergestellt.
6) a) Synthese von Methacrylsäure-2-hydroxy-3-aminopropyl-N-(4-methylphenol)ester
Figure imgf000017_0001
302 mg (2.2 mmol) Tyramin und 284 mg (2 mmol) Methacrylsäure-Glycidolester wurden in 5 ml_ Dichlormethan (DCM) vorgelegt und nach langsamer Zugabe von 300 μl_ Triethylamin über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 1 M Salzsäure hydrolysiert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. (1 ,36 mmol, Ausbeute 68%)
b) Synthese von Poly(methacrylsäure-2-hydroxy-3-aminopropyl-N-(4- methylphenol)ester)
Figure imgf000017_0002
Das Monomer wurde in Chloroform gelöst und nach Zugabe einer Spatelspitze AIBN wurde für 5h unter Rückfluss gekocht. Dann wurde nochmals eine Spatelspitze AIBN zugegeben und über Nacht gekocht. Anschließend wurde hydrolysiert und 2x mit Dichlormethan extrahiert. Die gesammelten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Es wurde ein hellgelbes Harz erhalten, das mittels Dialyse aufgereinigt wurde.
Zur Herstellung einer Beschichtungslösung (analog zu Beispiel 9) wurde als Lösungsmittel Wasser verwendet.
7)
Synthese von Poly(maleinsäure-N-(4-methylphenol)amid)
Figure imgf000018_0001
500 mg Poly(maleinsäureanhydrid) (~5,1 mmol Maleinsäureanhydrid) wurden mit 680 mg (4,95 mmol) Tyramin vermengt und für 12h bei 60 °C gerührt. Anschließend wurde zum Reinigen dialysiert.
Es wurde eine Beschichtungslösung mit einer Konzentration von 60mg/ml in VE- Wasser hergestellt.
8) Poly(weinsäuresuccinat)
Figure imgf000018_0002
1 ,5 g (10 mmol) Weinsäure wurden mit 1g (10 mmol) Bernsteinsäureanhydrid gemischt und für 5h auf 60 °C erhitzt. Es entstand ein blassgelbes Harz, welches durch Dialyse aufgereinigt wurde.
Es wurde eine Beschichtungslösung mit einer Konzentration von 60mg/ml in VE- Wasser hergestellt.
9) Durchführung der Beschichtung
20 mg Poly(methylvinylether-alt-maleinsäure) wurden in 10 ml VE-Wasser gelöst. Nachdem das Polymer vollständig gelöst war, wurden in handelsübliche PCR- Gefäße (8-ter Strips) aus Polypropylen jeweils 50 μl der wässrigen Polymerlösung pipettiert. Nach 20 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde die wässrige Polymerlösung aus den PCR-Gefäßen pipettiert. Abschließend wurden die Gefäße einmal mit 120 μl Wasser gespült und bei 40 °C getrocknet.
10) Präparation der Blutprobe im PCR-Gefäß:
In den Kavitäten von PCR-Gefäßen wurden je 50μl Lysepuffer (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 in Wasser) vorgelegt und 10 μl Blut hinzupipettiert. Durch 10-maliges auf- und abpipettieren wurde die Blutprobe mit dem Lysepuffer vollständig vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 5 min wurde erneut vermischt und nach weiteren 15 min wurde der flüssige Inhalt der PCR-Gefäße verworfen, dann einmal mit 120 μl Waschpuffer (1 mM Tris-HCI, 0,5mM EDTA, pH 7,4 + 0,05% Nonidet P-40) gewaschen und rückstandslos verworfen. Anschließend wurden 25 μl eines PCR Reaktionsgemisches zugegeben und eine quantitative „real time" PCR (RT-PCR) durchgeführt. Die entsprechenden Resultate sind in Fig.2 wiedergegeben.
1 1 )
In einem weiteren Versuch wurden auf einer 96-Well-Platte jeweils 2 Reihen ä 8
Wells mit folgenden Polymeren beschichtet:
1 +2: Poly(methylacrylsäure-N- (4-methylphenol)amid) aus Beispiel 5
3+4: Poly(maleinsäure-N-propylamid)
5+6: Poly(maleinsäure-N- (4-methylphenol)amid) aus Beispiel 7
7+8: Poly(weinsäuresuccinat) aus Beispiel 8
9+10: Poly(isobutylen-alt-maleinsäure)
11 : Poly(methylvinylether-alt-maleinsäure) aus Beispiel 9
Zur Beschichtung wurden die in den jeweiligen aufgeführten Beispielen beschriebenen Beschichtungslösungen hergestellt. Die Polymaleinsäure-N- propylamid-Lösung wurde in einer Konzentration von 40mg/ml in VE-Wasser hergestellt. Die Poly(isobutylen-alt-maleinsäure) wurde in einer Konzentration von 5 l/ml in 1 N KOH hergestellt.
Nachdem das Polymer vollständig gelöst war, wurden in handelsübliche PCR- Gefäße (8-ter Strips) aus Polypropylen jeweils 50 μl der Polymerlösung pipettiert. Nach 5 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde der flüssige Inhalt der PCR- Gefäße abpipettiert. Anschließend wurden die Gefäße 1 Stunde bei 50°C getrocknet.
Anschließend wurde eine Präparation einer Blutprobe sowie anschließende PCR- Reaktion gemäß der Beschreibung aus Beispiel 10 durchgeführt. Die bei den verwendeten Polymeren erhaltenen Ct-Werte sind in Figur 3 dargestellt, die unter Verwendung einer Eichkurve erhaltenen, berechneten absoluten Ausbeuten zeigt Figur 4.
Die in den beiden Figuren dargestellten Ergebnisse zeigen, dass auch Polyphenole und Polyester als Beschichtungsmaterialien gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren aus Blut, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blutprobe in einem Reaktionsgefäß mit einem Erythrozyten-Lysepuffer in Gegenwart einer Matrix in Kontakt gebracht wird, welche die Zellorganellen adsorbieren kann, die aus der Lyse resultierende Reaktionsmischung entfernt, die Matrix ggf. gewaschen und auf eine Temperatur erwärmt wird, bei der die Nukleinsäuren aus den anhaftenden Blutbestandteilen freigesetzt und ggf. einer Folgereaktion unterworfen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure genomische DNA verkörpert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Matrixmaterial im festen Zustand an der Wand des Reaktionsgefäßes oder als Dippstick vorliegt, oder dass das Matrixmaterial am Anfang der Lyse in einem flüssigen oder dispersen Zustand vorliegt und nach der Lyse an den Wänden des Reaktionsgefäßes fixiert bzw. adsorbiert ist.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Matrixmaterial ein zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigtes Polymer, oder Copolymer bzw. Terpolymer oder Mischungen derselben ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass das zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Polymer, Copolymer oder Terpolymer ein Polycarboxylat oder ein carboxyliertes Polymer oder ein zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigter Polyester ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Polymer, Co- oder Terpolymer ein carboxyliertes Polymer auf der Basis von Vinylmethylether, Maleinsäureanhydrid, Styrol, unverzweigten oder verzweigten Alkenen oder Acrylsäure und deren Derivaten ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Acrylsäurederivat ein verzweigter oder unverzweigter CrCi2-Alkylester der Acryl- oder Methacrylsäure mit einem bis zwölf Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat, 2- Ethylhexylmethacrylat, Methylacrylat, Ethylacrylat, Butylacrylat und 2- Ethylhexyacrylat ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Polymer, Copolymer oder Terpolymer Phosphonsäuregruppen oder Sulfonsäuregruppen oder Phenolgruppen, vorzugsweise Tyramingruppen, oder Mischungen derselben aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Sulfonsäuregruppen aufweisende Polymer Polystyrolsulfonsäure oder ein Copolymer/Terpolymer mit Polystyrolsulfonsäure ist.
10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Co- oder Terpolymer ein carboxyliertes Polymer auf der Basis von Styrol und Maleinsäureanhydrid ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Copolymere 5 bis 95 Gewichtsprozent, vorzugsweise 25 bis 95 Gewichtsprozent, weiter bevorzugt 50 bis 95 Gewichtsprozent Maleinsäureeinheiten enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Ausbildung einer polyanionischen Struktur befähigte Co- oder Terpolymer ein carboxyliertes Polymer auf der Basis von Methylvinylether und Maleinsäure, vorzugsweise das Copolymer Poly(methylvinylether-alt-maleinsäure)
Figure imgf000023_0001
ist, wobei das Poly(methylvinylether-alt-maleinsäure)-Copolymer bevorzugt ein Molekulargewicht in einem Bereich von 1.0 103 bis 2.5 106, vorzugsweise in einem Bereich von 1.0 104 bis 2.2 106, weiter bevorzugt in einem Bereich von 1.9 106 bis 2.1 106 aufweist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Copolymer Poly(methylvinylether-alt-maleinsäure) als partieller Methylester vorliegt.
14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erythrozytenlyse ein Puffer eingesetzt wird, der ein oder mehrere Salze eines Alkali-, Pseudoalkali- oder Erdalkalimetallsalzes mit anorganischen oder organischen Säuren, ein oder ggf. mehrere kationische Detergenzien sowie ggf. eine den pH-Wert puffernde Substanz enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Waschpuffer Wasser oder ein Puffer, enthaltend TRIS, Komplexbildner und ggf. ein Detergens eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die nach dem Waschen an der Matrix adsorbierten Blutbestandteile ggf. in wässriger Lösung auf eine Temperatur in einem Intervall von 45 bis 100 °C, vorzugsweise von 80 bis 98 °C, weiter bevorzugt von 94-96 °C, erhitzt werden und ggf. einer Amplifikationsreaktion oder einer PCR unterworfen werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem in Kontakt Bringen der Blutprobe mit dem Erythrozyten-Lysepuffer und der Matrix und vor dem Entfernen der aus der Lyse resultierenden Reaktionsmischung ein oder mehrere Zentrifugationsschritte stattfinden.
18. Komplex bestehend aus Zellorganellen, bevorzugt Zellkernen und Mitochondrien, und einem eine polyanionische Struktur aufweisendem Polymer, Copolymer oder Terpolymer.
19. Kit zur Gewinnung von Nukleinsäure aus Blut enthaltend a) ein Matrixmaterial, das sich entweder in festem Zustand an der inneren Wandung eines oder mehrerer leerer Reaktionsgefäße befindet oder als Feststoff, in Lösung oder in dispergiertem Zustand vorliegt, und das in der Lage ist, Zellorganellen zu adsorbieren, b) ein oder mehrere Erythrozyten-Lysepuffer, c) wenn sich das Matrixmaterial nicht an der inneren Wand der ein oder mehreren leeren Reaktionsgefäße befindet, optional ein oder mehrere Reaktionsgefäße, d) optional ein oder mehrere Waschlösungen, e) optional Reagenzien zur Durchführung von PCR-Reaktionen und f) optional eine Gebrauchsanleitung.
20. Kit nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Matrixmaterial um das in den Ansprüchen 4 bis 13 beschriebene Material handelt.
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