EP1708813A1 - Kontaminations-barriere - Google Patents

Kontaminations-barriere

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Publication number
EP1708813A1
EP1708813A1 EP05701140A EP05701140A EP1708813A1 EP 1708813 A1 EP1708813 A1 EP 1708813A1 EP 05701140 A EP05701140 A EP 05701140A EP 05701140 A EP05701140 A EP 05701140A EP 1708813 A1 EP1708813 A1 EP 1708813A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
contamination
hydrocarbon
contamination barrier
barrier according
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05701140A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Rothmann
Markus Sprenger-Haussels
Petra Benkel
Sabine Hermes
Friederike Wilmer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Priority to EP05701140A priority Critical patent/EP1708813A1/de
Priority to EP10153162.2A priority patent/EP2189219B1/de
Publication of EP1708813A1 publication Critical patent/EP1708813A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50851—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/141—Preventing contamination, tampering
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
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    • B01L3/50853—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates with covers or lids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the present invention relates to a contamination barrier and a method for avoiding contamination of aqueous solutions, which arise in particular as a result of carry-over and / or formation of aerosols, for example when pipetting on open systems.
  • hoods or, as shown in the patent application DE 200 06 546 U1 cover mats for protecting a plurality of reaction vessels formed in a plate-shaped body and open at the top are disclosed.
  • this type of cover only protects the samples of a rack, for example during transport and / or storage.
  • contamination continues to occur when processing the individual samples on the rack.
  • sterile consumables known in the prior art such as, for example, specially coated disposable pipettes and / or disposable filter tips only reduce the cross-contamination rate, but not completely eliminate it. Contamination is still a fundamental problem, especially in the ppm range (for example in the area of PCR diagnostics, where single molecules are detected).
  • closure options such as various lids, septa and / or filters etc. for individual or multiple sample vessels
  • closure options have been developed to protect them from contamination.
  • these have disadvantages in handling, in particular in the field of automation, since, for example, opening and closing closure caps etc., in particular individual samples, is very time-consuming and, depending on the closure system, can hardly be implemented mechanically.
  • sample vessels with septa and / or thin filter materials cannot be used variably in every robot or automatic pipetting system, since only a few pipette tips and / or pipette needles are suitable for the use of such sample vessels.
  • the present invention is based on the object of enabling an efficient and reproducible processing of a large number of samples while avoiding contamination in the solutions to be analyzed in open and / or automated systems.
  • This object is achieved according to the invention by the provision of a contamination barrier to avoid contamination of aqueous solutions in open and / or automated systems, which has at least one water-immiscible hydrocarbon and / or a hydrocarbon mixture.
  • the object of the present invention is therefore achieved by the provision of a method for avoiding contamination in that, for processing aqueous solutions in open and / or automated systems, they are overlaid with at least one water-immiscible hydrocarbon or a hydrocarbon mixture.
  • the contamination barrier according to the invention is characterized in particular by its flexible use in a wide variety of sample vessels. It is particularly advantageous that the contamination barrier according to the invention can be easily and quickly formed even in very small sample vessels and removed again. In particular, an increased time-consuming and costly, manual or even mechanical use of sealing caps and / or septa etc. can be dispensed with.
  • a further advantage of the contamination barrier according to the invention is its flexible introduction into the sample vessel, which, in contrast to the use of septa and / or filter materials which are fixedly arranged in the sample vessel, means that the volume of the aqueous solution can be varied at any time without forming a cavity, in which contamination-related aerosol formation occurs. Use with very small volumes of the aqueous solutions (e.g. in the ppm range and smaller) is also particularly advantageous.
  • the contamination barrier according to the invention applied in this way to the aqueous solution lies completely on the aqueous solution like a film and thus prevents the penetration and formation of aqueous aerosols.
  • the contamination barrier according to the invention preferably has at least one substituted or unsubstituted, branched or unbranched hydrocarbon.
  • the invention appropriate contamination barrier consist of or are formed from a cyclic, saturated or unsaturated hydrocarbon (such as cyclohexane etc.) or from an aromatic hydrocarbon (such as benzene or toluene etc.), however only such hydrocarbons are used, that are not miscible with water.
  • the hydrocarbons used according to the invention can carry, for example, one or more halogen atom (s), nitro group (s) and / or amino group (s) as substituents.
  • hydrocarbon compounds can be present individually or in mixtures (e.g. a hydrocarbon mixture such as mineral oil).
  • Mineral oil in the sense of the present invention is understood to mean the liquid distillation products obtained from mineral raw materials, such as petroleum, lignite and hard coal, wood or peat, which essentially consist of mixtures of long-chain, aliphatic and saturated hydrocarbons.
  • Distillation products or hydrocarbon mixtures such as white oil and / or other paraffin oils, which mainly contain long-chain alkanes with preferably 13 to 20, particularly preferably 14 to 16, carbon atoms are particularly suitable.
  • hydrocarbons are understood primarily to be branched or unbranched hydrocarbons which have 5 to 20, preferably 6 to 16, particularly preferably 8 to 12 carbon atoms.
  • Branched or unbranched alkanes having 8 to 12 carbon atoms are very particularly preferably used, of which octane, nonane, decane and / or dodecane and mixtures thereof are particularly preferred.
  • the contamination barrier according to the invention can be admixed with one or more water-immiscible additive (s).
  • additives are understood to be hydrophobic substances which additionally contribute to the reduction or prevention of aerosol formation.
  • silicone oils in a wide variety of compositions and viscosities is particularly preferred.
  • An important property of silicone oils in this context is their inert behavior towards others Substrates. It is also characterized by its high spreading capacity, which is accompanied by the development of special properties, such as hydrophobicity.
  • silicone oils are understood primarily to be synthetic oils based on semi-organic polymers and copolymers of silicon-oxygen units with organic side chains.
  • these unbranched chains which are alternately made up of silicon and oxygen atoms, preferably have a chain catch of 10 to 1000 silicon atoms, particularly preferably 30 to 500 silicon atoms, very particularly preferably 50 to 150 silicon atoms.
  • the contamination barrier according to the invention (with and without additives) is preferably used for overlaying aqueous solutions in open and / or automated systems with biological sample material.
  • biological sample material is understood to mean biopolymers which, on the one hand, can be naturally occurring macromolecules, such as, for example, nucleic acids, proteins or polysaccharides, but on the other hand can also be synthetically produced polymers, as long as they contain the same or similar building blocks as the natural macromolecules ,
  • FIG. 2 shows a contamination barrier according to the invention, coated on an aqueous solution, in an open sample vessel; 3 shows a schematic pipetting process known from the prior art from an open sample vessel, in which part of an aqueous solution is removed with formation of aerosols;
  • FIG. 4 shows a schematic pipetting process from an open sample vessel, in which part of an aqueous solution is removed below an inventive contamination barrier without aerosol formation;
  • FIG. 5 shows a schematic pipetting process from an open sample vessel, in which a further water-soluble part is added to an aqueous solution below a contamination barrier according to the invention without aerosol formation.
  • FIGS. 1 and 3 clearly shows that mechanical action during pipetting processes and / or mixing of the sample, etc., for example by means of a pipetting device 6 or the like, occurs in a commercially available reaction vessel 1 a pipetting plate 2 (such as a microtiter plate etc.) on an aqueous solution 3 which has biological sample material and which form aerosols 4.
  • a pipetting plate 2 such as a microtiter plate etc.
  • aqueous solution 3 which has biological sample material and which form aerosols 4.
  • aerosol formation can easily lead to contamination of adjacent reaction vessels as soon as the aerosol 4 flows out of the reaction vessel 1.
  • contamination barrier 5 Such contamination-related aerosol formation is avoided by the contamination barrier 5 according to the invention shown in FIGS. 2, 4 and 5, since. the aqueous aerosols 4 cannot penetrate the contamination barrier 5.
  • the water-insoluble contamination barrier 5 lies in the reaction vessel 1 like a film on the aqueous solution 3 in which the biological sample material is in dissolved form.
  • the aqueous solution 3 or the sample in the reaction vessel 1 is processed under the contamination barrier 5. Due to the water-insoluble composition of the contamination barrier 5, the formation of aerosols 4 is excluded both when the pipetting device 6 is immersed and withdrawn from the aqueous solution 3 and when mixing. Even if a further aqueous solution is added to the sample shown in FIG. 5, when the aqueous solution 3 presented is mixed with the additional solution, aerosol formation of the aqueous mixture 7 does not occur due to the contamination barrier 5 according to the invention.
  • the contamination barrier 5 in contrast to filters and / or septa permanently inserted in reaction vessels, is also very flexible, variable amounts of aqueous solution 3 can be removed or added to the reaction vessel 1 at any time by means of a pipetting device 6 without the surface of the aqueous solution 3 and the contamination barrier 5 forms a cavity, whereby the formation of aerosols 4 is additionally avoided.
  • cross-contamination tests were carried out using samples with biological sample material in the ppm range and smaller, as are used in common methods in the field of PCR diagnostics.
  • the tests were based on one current methods known in the prior art for isolating and purifying nucleic acids, in particular viral RNA (protocol used: QIAamp 96 Virus Mdx V1.1 / QIAGEN GmbH).
  • Kits e.g. QIAamp 96 Virus BioRobot Kit / QIAGEN GmbH
  • S-BIocks 96-well deepwell plates
  • Cross contamination tests carried out a) with a sample volume of 285 ⁇ ⁇ without alkane template and b) with a sample volume of 285 ⁇ ⁇ with alkane template.
  • Hepatitis C virus material (arHCV) with an average concentration of 10 8 - 10 9 RNA copies / ml was used as positive sample material (PP) and negative plasma (e.g. citrate plasma / Breitscheid) as negative sample material (NP).
  • PP positive sample material
  • NP negative sample material
  • 40 ⁇ l of a commercially available protease e.g. QIAGEN Protease / QIAGEN GmbH
  • the filters loaded with the nucleic acid were subsequently vacuumed with 800 ⁇ each of a commercially available washing buffer (e.g. Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (KQ 6!) And then in a second washing step with 930 / / l ethanol (pa or min. 96%) (KQ 7!) and then the membranes for removing ethanol under vacuum and 60 ° C in an automated vacuum device (e.g. RoboVac / QIAGEN GmbH) dried (KQ 8! ).
  • a commercially available washing buffer e.g. Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH
  • KQ 7 930 / / l ethanol
  • an automated vacuum device e.g. RoboVac / QIAGEN GmbH
  • the purified nucleic acid was finally eluted from the filter system under vacuum for one minute once with 50 ⁇ ⁇ and once with 100 / I of at least one commercially available elution buffer (e.g. Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) (KQ 9!).
  • the eluate collected was processed for the subsequent amplification process outside of the automated pipetting system.
  • a commercially available enzyme mix e.g. Mastermix / QIAGEN GmbH
  • An RT-PCR was carried out to determine the nucleic acid contamination and the results were evaluated.
  • the outlet openings of the filter system (nozzles) in row 1 at NP positions B, D, F (and also in run 1al and H) were as yellow as those of the PP.
  • Run Iblll was added after row B could not be included in run 1bll due to the missing PP task. During the course of the experiment, however, no special occurrences could be observed that indicate carryover of sample material during pipetting processes or aerosol formation.
  • Cross contamination tests carried out a) with a sample volume of 570 ⁇ ⁇ without alkane template and b) with a sample volume of 570 ⁇ ⁇ with alkane template.
  • Hepatitis C virus material ArHCV
  • PP positive sample material
  • NP negative plasma
  • 80 ⁇ l of a commercially available protease e.g. QIAGEN Protease J QIAGEN GmbH
  • a commercially available lysis buffer e.g. Lysis Buffer AL / QIAGEN GmbH
  • the filters loaded with the nucleic acid were subsequently vacuumed with 800 l of a commercially available washing buffer (e.g. Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (KQ 6!) And then in a second washing step with 930 / l ethanol (pa or min. 96%) (KQ 7! and then the membranes for removing ethanol under vacuum and 60 ° C in an automated vacuum device (e.g. RoboVac / QIAGEN GmbH) dried (KQ 8!).
  • the purified nucleic acid was finally eluted from the filter system under vacuum for one minute once with 50 ⁇ ⁇ and once with 100 ⁇ ⁇ of at least one elution buffer (e.g.
  • the dodecane used was previously colored with Sudan black.
  • the contamination barrier according to the invention can also be used in other sample processing modules in which (cross) contamination occurs.
  • the use of the contamination barrier according to the invention also advantageously prevents cross-contamination caused by aerosol formation, when overflowing with washing buffers, by dispensing with a dispenser, by introducing stirring or mixing devices (such as, for example, stirring fish, stirring bars, mixing punches) or mixing flask etc.) as well as during mechanical stirring and / or mixing processes.
  • stirring or mixing devices such as, for example, stirring fish, stirring bars, mixing punches
  • the contamination barrier used can also have a positive impact on other applications.
  • the use of the contamination barrier according to the invention in array experiments, as shown below, not only prevents contamination, but also stabilizes such an application.
  • mixtures of mineral and silicone oils were chosen in addition to mineral oils to overlay reaction batches for the array experiments.
  • the contamination barrier according to the invention was used in the course of a preparation of biotin-labeled cRNA for hybridization on microarrays (for example Human Genome U133B Array / Affymetrix, US), with different volumes of the contamination barrier being added to the cRNA fragmentation approaches. Different amounts of mineral oil or a mixture of mineral oil and silicone oil were used as a contamination barrier.
  • the hybridization samples were synthesized in accordance with the manufacturer's protocol (Affymetrix). After the synthesis of cRNA from 2 ⁇ g Heia S3 total RNA, 1 ⁇ ⁇ , 5 ⁇ ⁇ and 10 ⁇ ⁇ of the oils were added in different fragmentation approaches. These fragmentation approaches were transferred to the hybridization approach. The hybridization and analysis of the GeneChip arrays was carried out according to the manufacturer's instructions. Samples (K) were used as controls, which were also processed without contamination barrier according to the standard manufacturer's protocol for sample preparation.
  • Diagram 1 Representation of the calls on the array The results show that with the addition of the contamination barrier according to the invention (with and without additive) uniform hybridization results are achieved.
  • the fluctuations in the calls are +/- 2%, which corresponds to the fluctuation for technical replicas specified by the chip manufacturer.
  • the sample was previously overlaid with mineral oil and a mixture of mineral oil and silicone oil. To test whether the additive alone is also suitable for this application, a test batch was only covered with silicone oil. The RNA yield was then determined photometrically.

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Description

Kontaminationsbarriere
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kontaminationsbarriere sowie ein Verfahren zur Vermeidung von Verunreinigungen wässriger Lösungen, welche insbesondere durch Verschleppungen und/oder Aerosoibildung beispielsweise beim Pipettieren auf offenen Systemen entstehen.
Gerade im Bereich der Biotechnologie wurde in den letzten Jahren verstärkt nach Automationslösungen, zum sicheren und effizienten Abarbeiten, insbesondere bei einer großen Anzahl von Proben, wie sie beispielsweise beim HIV-Virus-Monotoring anfallen, gesucht. Vorzugsweise sind hierbei mehr und mehr vollautomatische Hochdurchsatz-Arbeitsstationen gefragt, die in kürzester Zeit eine sehr hohe Probenanzahl abarbeiten, wobei zudem immer mehr auf einen zusätzlichen manuellen Einsatz verzichtet wird, zugleich aber auch geringste Mengen an biologischem Material nachgewiesen werden sollen.
Derzeit gängige Robotersysteme weisen jedoch beim Arbeiten mit biologischem Material speziell im Bereich der Molekularbiologie und/oder der Diagnostik ein grundlegendes Problem auf. Da die Proben üblicherweise in einem plattenförmigen Körper (wie beispielsweise einem Rack) aufgearbeitet werden, wobei die einzelnen Probengefäße offen nebeneinander stehen, kommt es, vornehmlich durch Aerosolbildung, aber auch immer wieder durch mechanische Verschleppung von Probenmaterial, bei der Bearbeitung zu Kontaminationen vorwiegend benachbarter Proben .
Zur Vermeidung derartiger (Kreuz-) Kontaminationen sind im Stand der Technik bereits einige Zusatzmodule und/oder Verbrauchsmaterialien für Robotersysteme bekannt. So werden beispielsweise Hauben oder, wie in der Gebrausmusterschrift DE 200 06 546 U1 dargestellt, Abdeckmatten zum Schutz mehrerer in einem plattenförmigen Körper ausgebildeter und nach oben offener Reaktionsgefäße offenbart. Diese Art der Abdeckung schützt jedoch nur die Proben eines Racks beispielsweise beim Transport- und/oder im Lagerzustand. Bei der Bearbeitung der einzelnen Proben auf dem Rack treten jedoch weiterhin Kontaminationen auf.
Ferner kann auch durch die im Stand der Technik bekannte Verwendung von sterilem Verbrauchsmaterial wie beispielsweise speziell beschichteten Einmalpipetten und/oder Einmal- filtertips die Kreuzkontaminationsrate nur reduziert, nicht jedoch vollständig beseitigt werden. So sind Kontaminationen vor allem im ppm-Bereich auch weiterhin (zum Beispiel im Bereich der PCR-Diagnostik, wo Einzelmoleküle nachgewiesen werden) ein grundlegendes Problem.
Des weiteren sind Verfahren bekannt, bei denen, wie beispielsweise in der europäischen Patentschrift EP 0011327 B1 dargestellt, der wässrigen Lösung wasserlösliche Verbindungen zur Vermeidung von Aerosolbildung einverleibt werden. Da diese sich jedoch mit der Probenflüssigkeit vermischen und diese gegebenenfalls sogar verändern bzw. zu unerwünschten Nebenreaktionen führen könnten, ist deren Einsatz äußerst nachteilig und insbesondere in der PCR-Diagnostik nicht denkbar.
Weiterhin wurden zum Schutz vor Kontamination der Proben die unterschiedlichsten Verschlussmöglichkeiten, wie beispielsweise verschiedene Deckel, Septen und/oder Filter etc. für einzelne oder mehrere Probengefäße entwickelt. Diese weisen jedoch Nachteile im Handling, insbesondere im Bereich der Automatisierung auf, da beispielsweise das Öffnen und Schließen von Verschlussdeckeln etc., insbesondere einzelner Proben, sehr zeitaufwendig und je nach Verschlusssystem maschinell kaum realisierbar ist. Zudem besteht weiterhin die Gefahr, dass die im Probengefäß entstandenen Aerosole beim Bearbeiten entweichen und dadurch im nachfolgenden Schritt beim Öffnen des nebenstehenden Probengefäßes dessen Probe mit Probenmaterial kontaminiert werden kann.
Zudem sind Probengefäße mit Septen und/oder dünnen Filtermaterialien nicht in jedem Roboter- beziehungsweise automatischen Pipetiersystem variabel einsetzbar, da sich nur wenige Pipettenspitzen und/oder Pipettennadeln für den Gebrauch derartiger Probengefäße eignen.
Da der Stand der Technik keine bekannten Vorrichtungen und/oder kein bekanntes Verfahren, die/das in befriedigender Weise zur Vermeidung von Kontaminationen, insbesondere im Bereich der automatisierten PCR-Diagnostik, eingesetzt werden könnte, offenbart und sich eine solche Vorrichtung beziehungsweise ein solches Verfahren auch nicht daraus herleiten lässt, liegt der vorliegenden Erfindung die A u f g a b e zugrunde, eine effiziente und reproduzierbare Abarbeitung einer hohen Probenanzahl unter Vermeidung von Kontaminationen in den zu analysierenden Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen zu ermöglichen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung einer Kontaminationsbarriere zur Vermeidung von Verunreinigungen wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisieren Systemen g e l ö s t, die zumindest einen mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoff und/oder ein Kohlenwasserstoffgemisch aufweist. Mithin wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch die Bereitstellung eines Verfahrens zu Vermeidung von Kontaminationen dadurch gelöst, dass zur Bearbeitung wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen, diese mit zumindest einem mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoff oder einem Kohlenwasserstoffgemisch überschichtei: werden.
Die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere zeichnet sich insbesondere durch ihren flexiblen Einsatz in den unterschiedlichsten Probengefäßen aus. Besonders vorteilhaft ist, dass die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere einfach und schnell auch in sehr kleinen Probengefäßen ausgebildet und wieder entfernt werden kann. Insbesondere kann auf einen erhöhten zeit- und kostenaufwendigen, manuellen oder gar maschinellen Einsatz von Verschlusskappen und/oder Septen etc. verzichtet werden. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere ist deren flexible Einbringung in das Probengefäß, wodurch im Gegensatz zum Einsatz von Septen und/oder Fϊltermaterialien, die fest im Probengefäß angeordnet sind, das Volumen der wässrigen Lösung jederzeit variiert werden kann, ohne dass sich ein Hohlraum bildet, in dem es zu einer kontaminationsbedingenden Aerosolbildung kommt. Ganz besonders vorteilhaft ist auch der Einsatz bei sehr kleinen Volumina der wässrigen Lösungen (z. B. im ppm-Bereich und kleiner).
Ferner ergibt sich für die Überschichtung der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere aufgrund der mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoffe oder Kohlenwasserstoffgemische ein vorteilhaftes Einsatzgebiet auf nahezu jeglichen wässrigen Lösungen.
Um bei der Bearbeitung wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen Kontaminationen zu vermeiden wird auf die zu analysierende Lösung zumindest ein mit Wasser nicht mischbarer Kohlenwasserstoff, durch Überschichtung aufgebracht. Die derart auf die wässrige Lösung aufgebrachte erfindungsgemäße Kontaminationsba-rriere legt sich wie ein Film vollständig auf die wässrige Lösung und verhindert somit das Durchdringen sowie die Bildung von wässrigen Aerosolen. Vorteilhafterweise weist die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere vorzugsweise zumindest einen substituierten oder unsubstituierten, verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoff auf. Des weiteren kann die erfindungs- gemäße Kontaminationsbarriere aus einem cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff (wie z. B. Cyclohexan etc.) oder aus einem aromatischen Kohlenwasserstoff (wie z. B. Benzol oder Toluol etc.) bestehen beziehungsweise gebildet werden, wobei jedoch ausschließlich solche Kohlenwasserstoffe verwendet werden, die nicht mit Wasser mischbar sind. Zudem können die erfindungsgemäß eingesetzten Kohlenwasserstoffe als Substituenten beispielsweise ein oder mehrere Halogenatom(e), Nitrogruppe(n) und/oder Aminogruppe(n) tragen.
Alle vorgenannten (Kohlenwasserstoff-) Verbindungen können einzeln oder auch in Mischungen (z. B. ein Kohlenwasserstoffgemisch wie Mineralöl) vorliegen.
Unter Mineralöl im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die aus mineralischen Rohstoffen, wie beispielsweise Erdöl, Braun- und Steinkohlen, Holz oder Torf gewonnenen flüssigen Destillationsprodukte verstanden, die im wesentlichen aus Gemischen von langkettigen, aliphatischen und gesättigten Kohlenwasserstoffen bestehen. Besonders geeignet sind Destillationsprodukte beziehungsweise Kohlenwasserstoffgemische, wie beispielsweise Weißöl und/oder andere Paraffinöle, die hauptsächlich langkettige Alkane, mit vorzugsweise 13 bis 20, besonders bevorzugt 14 bis 16 Kohlenstoff atome enthalten.
Unter Kohlenwasserstoffen werden im Sinne der Erfindung in erster Linie verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffe verstanden, die 5 bis 20, vorzugsweise 6 bis 16, besonders bevorzugt 8 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen. Ganz besonders bevorzugt werden verzweigte oder unverzweigte Alkane mit 8 bis 12 Kohlenstoffatomen verwendet, worunter wiederum Oktan, Nonan, Dekan und/oder Dodekan sowie Mischungen daraus besonders bevorzugt werden.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann/können der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere ein oder mehrere mit Wasser nicht mischbare(s) Additiv(e) zugemischt werden. Als Additive im Sinne der Erfindung werden hydrophobe Substanzen verstanden, die zusätzlich zur Minderung bzw. zur Verhinderung von Aerosolbildung beitragen. Besonders bevorzugt ist hierbei die Zugabe von Siliconölen in verschiedensten Zusammensetzungen und Viskositäten. Eine wichtige Eigenschaft der Siliconöle ist in diesem Zusammenhang ihr inertes Verhalten gegenüber anderen Substraten. Charakteristisch ist auch ihr hohes Spreitungsvermögen, mit er die Ausbildung besonderer Eigenschaften, beispielsweise Hydrophobie, einhergeht.
Unter Siliconölen im Sinne der Erfindung werden in erster Linie Syntheseöle auf Basis halborganischer Polymere und Copolymere aus Silizium-Sauerstoff-Einheiten mit organischen Seitenketten verstanden. Hierbei haben diese unverzweigten wechselweise aus Silizium- und Sauerstoffatomen aufgebauten Ketten bevorzugt eine Kettenfänge von 10 bis 1000 Silizium-Atomen, besonders bevorzugt von 30 bis 500 Siliziurn-Atomen, ganz besonders bevorzugt von 50 bis 150 Silizium-Atomen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wircϊ die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere (mit und ohne Additive) vorzugsweise zur Überschichtung von wässrigen Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen mit biologischem Probenmaterial verwendet. Unter biologischem Probenmaterial werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Biopolymere verstanden, welche zum einen natürlich vorkommende Makromoleküle, wie beispielsweise Nukleinsäuren, Proteine oder Polysacharide, zum anderen aber auch synthetisch hergestellte Polymere sein können, solange diese die gleichen oder ähnliche Bausteine enthalten, wie die natürlichen Makromoleküle.
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass durch eine Überschichtung wässriger Lösungen, welche vorzugsweise biologisches Probenmaterial enthalten, mit Kohlenwasserstoffen der vorgenannten Art, insbesondere in Form der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere, speziell in offenen, automatisierten Systemen eine effiziente und reproduzierbare Vermeidung von vor allem aerosolbedingten Kontaminationen erfolgt.
Nachfolgend soll nun die vorliegende Erfindung anhand von beigefügten Zeichnungen sowie Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigt:
Fig. 1 die Bildung von Aerosolen aus einer wässrigen Lösung bei im Stand der Technik bekannten offenen Probengefäßen;
Fig. 2 eine auf eine wässrige Lösung überschichtete erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere in einem offenen Probengefäß; Fig. 3 einen schematischen aus dem Stand der Technik bekannten Pipetiervorgang aus einem offenen Probengefäß, bei dem ein Teil einer wässrigen Lösung unter Aerosolbildung entnommen wird;
Fig. 4 einen schematischen Pipetiervorgang aus einem offenen Probeπgefäß, bei dem ein Teil einer wässrigen Lösung unterhalb einer erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere ohne Aerosolbildung entnommen wird;
Fig. 5 einen schematischen Pipetiervorgang aus einem offenen Probengefäß, bei dem einer wässrigen Lösung unterhalb einer erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere ohne Aerosolbildung ein weiterer wasserlöslicher Teil hinzugegeben wird.
Dem in Fig. 1 und Fig. 3 dargestellten Stand der Technik ist deutlich zu entnehmen, dass sich durch mechanische Einwirkung beim Pipetiervorgängen und/oder Mixen der Probe etc., beispielsweise mittels einer Pipetiervorrichtung 6 o. ä., in einem handelsüblichen Reaktionsgefäß 1 auf einer Pipetierplatte 2 (wie beispielsweise einer Mikrotiterplatte etc.) auf einer biologisches Probenmaterial aufweisenden, wässrigen Lösung 3, die Aerosole 4 bilden. Eine derartige Aerosolbildung kann, sobald das Aerosol 4 aus dem Reaktionsgefäß 1 ausströmt, leicht zu Kontaminationen benachbarter Reaktionsgefäße führen.
Durch die in den Fig. 2, 4 und 5 dargestellte erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere 5 wird eine derartige kontaminationsbedingende Aerosolbildung vermieden, da. die wässrigen Aerosole 4 die Kontaminationsbarriere 5 nicht durchdringen können. Die wasserunlösliche Kontaminationsbarriere 5 liegt hierbei im Reaktionsgefäß 1 wie ein Film auf der wässrigen Lösung 3 in der sich das biologische Probenmaterial in gelöster Form befindet.
Beim Pipetiervorgang wird, wie in Fig. 4 und 5 gezeigt, die im Reaktionsgef-äß 1 befindliche wässrige Lösung 3 beziehungsweise die Probe jeweils unter der Kontaminationsbarriere 5 bearbeitet. Durch die wasserunlösliche Zusammensetzung der Kontaminationsbarriere 5 wird die Bildung von Aerosolen 4 sowohl beim Eintauchen und Zu rückziehen der Pipetiervorrichtung 6 aus der wässrigen Lösung 3 als auch beim Mischen ausgeschlossen. Auch beim in Fig. 5 dargestellten Hinzufügen einer weiteren wässrigen Lösung zur Probe, kommt es beim Mischen der vorgelegten wässrigen Lösung 3 mit der zusätzlichen Lösung aufgrund der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere 5 nicht zur Aerosolbildung der wässrigen Mischung 7.
Da die Kontaminationsbarriere 5, im Gegensatz zu fest in Reaktionsgefäßen eingebrachten Filtern und/oder Septen, zudem sehr flexibel ist, können jederzeit mittels einer Pipetiervorrichtung 6 dem Reaktionsgefäß 1 variable Mengen an wässriger Lösung 3 entnommen oder hinzugefügt werden, ohne dass sich zwischen der Oberfläche der wässrigen Lösung 3 und der Kontaminationsbarriere 5 ein Hohlraum ausbildet, wodurch zusätzlich die Bildung von Aerosolen 4 vermieden wird.
Bezuqszeichenliste
1 offenes Reaktionsgefäß
2 Pipetϊerplatte
3 wässrige Lösung
4 Aerosolmoleküle
5 Kontaminationsbarriere
6 Pipetiervorrichtung
7 wässrige Mischung (aus vorgelegter und hinzugefügter Probenlösung)
Ausführunqsbeispiele
Anhand der nachstehenden Versuchsdurchführungen werden die wesentlichen Kontaminationsquellen (KQ) offener, automatisierter Pipetiersysteme, insbesondere in vollautomatischen Hochdurchsatz-Arbeitsstationen, sog. Robotersystemen (wie z. B. BioRobot Mdx/ QIAGEN GmbH), aufgezeigt und Kontaminationen (K), die vornehmlich durch Aerosolbildung, aber auch immer wieder durch mechanische Verschleppung von Probenmaterial entstehen, nachgewiesen sowie die deutliche Verringerung derartiger Kontaminationen durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere dargestellt.
Zum Nachweis wurden Kreuzkontaminationstests anhand von Proben mit biologischem Probenmaterial im ppm-Bereich und kleiner, wie sie in gängigen Verfahren im Bereich der PCR-Diagnostik verwendet werden, durchgeführt. Die Versuche basierten hierbei auf einem gängigen im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere von viraler RNA (verwendetes Protokoll: QIAamp 96 Virus Mdx V1.1 / QIAGEN GmbH).
Als Systemzubehör, Reagenzien, Verbrauchsmaterial etc. wurden ebenfalls handelsübliche
Kits (z. B. QIAamp 96 Virus BioRobot Kit / QIAGEN GmbH) etc., die sich besonders für den
Einsatz in Robotersystemen eignen, verwendet.
Für die Versuchsdurchführung mit Alkanvorlage (Beispiele 1 b und 2b) wurde in gängigen
96-well-Deepwellplatten (im Folgenden S-BIocks genannt) manuell jeweils 100//I Dodekan vorgelegt.
Der Nachweis erfolgte nicht nur durch bloße Beobachtungen während der einzelnen Pipetiersch ritte im Aufreinigungsprozess, sondern ebenso durch die zusätzliche Bestimmung von tatsächlichen Nukleinsäure-Verunreinigungen in den Negativproben in einer anschließenden Downstream-Analyse (z. B. PCR, RT-PCR etc.). Neben den wesentlichen Kontaminationsquellen derartiger Systeme zeigen die nachstehenden Beispiele anhand der ermittelten Kontaminationsraten (KR) deutlich die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere.
Beispiel 1 :
Kreuzkontaminationstests, durchgeführt a) mit einem Probenvolumen von 285 μ\ ohne Alkanvorlage und b) mit einem Probenvolumen von 285 μ\ mit Alkanvorlage.
Der automatisierte Prozess wurde mit der Identifizierung der Proben, dem sog. Loadcheck, gestartet. Als positives Probenmaterial (PP) wurde Hepatitis-C-Virenmaterial (arHCV) mit einer durchschnittlichen Konzentration von 108 - 109 RNA copies/ ml und als negatives Probenmaterial (NP) Negativplasma (z. B. Citratplasma / Breitscheid) eingesetzt. Nach dem Loadcheck wurden jeweils 40 μ\ einer handelsüblichen Protease (z. B. QIAGEN Protease / QIAGEN GmbH) in den S-Block pipettiert, und das System auf 56°C hochgeheizt.
Die Zugabe von jeweils 285 μ\ Probenmaterial erfolgte, wie nachfolgend schematisch dargestellt, im "Schachbrett-Muster". Neben jeder PP (+) wurde alternierend eine NP (-) in den S-Block pipettiert (KQ 1 !). Tabelle 1 : Schematische Darstellung der Auftragung der PP und NP im Schachbrett-Muster / S-Block
Nachfolgend wurden den einzelnen Reaktionslösungen 305 μ\ eines handelsüblichen Lyse- puffers (z. B. Lysis Buffer AL / QIAGEN GmbH) zugegeben, diese dann durch auf und ab pipettieren gemischt (KQ 2!) und nachfolgend für 10 Minuten inkubiert. Abschließend wurden im Abstand von ca. einer Minute pro Reihe jeder Reaktionslösung jeweils zweimal 360 μ\ Ethanol (p.a. oder min. 96 %) zu pipettiert (KQ 3!).
Zur Trennung bzw. Aufreinigung der so isolierten Nukleinsäuren wurden jeweils 910 l Lysat automatisch in entsprechende Filtersysteme (z. B. QIAamp 96 plate/ QIAGEN GmbH) überführt (KQ 4!) und unter Vakuum 5 Minuten bei 25°C filtriert (KQ 5!).
Gemäß dem Versuchsprotokoll (s.o.) wurden die mit der Nukleinsäure beladenen Filter nachfolgend unter Vakuum mit jeweils 800 μ\ eines handelsüblichen Waschpuffers (z. B. Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (KQ 6!) und dann in einem zweiten Waschschritt mit 930 //l Ethanol (p.a. oder min. 96 %) (KQ 7!) gewaschen und anschließend die Membranen zur Beseitigung von Ethanol unter Vakuum und 60°C in einer automatisierten Vakuumvorrichtung (z. B. RoboVac/ QIAGEN GmbH) getrocknet (KQ 8!).
Die aufgereinigte Nukleinsäure wurde abschließend unter Vakuum eine Minute lang einmal mit 50 μ\ und einmal mit 100 /I mindestens eines kommerziell erhältlichen Elutionspuffers (z. B. Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) vom Filtersystem eluiert (KQ 9!). Das aufgefangene Eluat wurde für den nachfolgenden Amplifikationsprozess außerhalb des automatisierten Pipetiersystems aufbereitet. Dem für die RT-PCR aufbereiteten Eluat wurde ein handelsüblicher Enzymmix (z. B. Mastermix / QIAGEN GmbH) hinzu pipettiert (KQ 10!), zur Bestimmung der Nukleinsäure-Kontaminationen eine RT-PCR durchgeführt und die Ergebnisse ausgewertet. Die zwei Versuchsdurchläufe (Lauf 1al und lall) ohne Vorlage von Dodekan wurden mit folgender ar HCV-Verdünnung durchgeführt: 1χ1011 lU/ml + 148,5 ml NP = 1x109 lU/ml
Bis hin zur Zugabe des Elutionspuffers konnten weder im Lauf lal noch im Lauf lall
Beobachtungen gemacht werden, die insbesondere an den Kontaminationsquellen (KQ) 1-4 auf Kontaminationen hingewiesen hätten.
Erst im Verlauf der Elution (KQ 7) konnten diesbezüglich Beobachtungen gemacht werden.
So war beispielsweise eine deutliche Blasenbildung bei der Zugabe des Elutionspuffers insbesondere in Reihe 12 zu beobachten. Teilweise zerplatzten die Blasen beim Eintauchen und Herausziehen der Pipettenspitzen.
Nach der Elution waren in Reihe 1 bei den NP-Positionen B, D, F (sowie im Lauf 1al auch H) die Auslassöffnungen des Filtersystems (Nozzles) ebenso gelb wie die der PP.
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Lauf 1 al: 9 K /48 NP => KRLaUf iai = 18,75 % Lauf lall: 2 K /48 NP => KRLaufiaiι = 4,17 %
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 11 ,46 %.
Die drei Versuchsdurchläufe (Lauf 1bl, 1bll und I blll) mit Vorlage von Dodekan wurden ebenfalls mit der vorgenannten ar HCV-Verdünnung durchgeführt: 1x1011 lU/ml + 148,5 ml NP = 1x109 lU/ml
Lauf Iblll wurde nachgeschaltet, nachdem in Lauf 1bll die Reihe B aufgrund der fehlenden PP-Aufgabe nicht mitgewertet werden konnte. Während der Versuchsdurchführung konnten jedoch keine besonderen Vorkommnisse, die auf Verschleppung von Probenmaterial während der Pipetiervorgänge oder Aerosolbildung hinweisen, beobachtet werden.
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Lauf 1bl: 1 K /42 P => KRLauf 1bI = 2,38 % Lauf 1bll: 3 K/48 NP => KRLauf ibiι = 6,25 % Lauf 1 blll: 3 K /48 NP => KRLau{ 1b„, = 6,25 %
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 4,96 %. Nach dem Vergleich der ermittelten Kontaminationsraten konnte gezeigt werden, dass durc i den Einsatz von Dodekan die Kreuzkontaminationsrate für das gesamte Isolierungs- und Trennungsverfahren um mehr als das Doppelte (Faktor 2,3) verringert werden kann.
Beispiel 2:
Kreuzkontaminationstests, durchgeführt a) mit einem Probenvolumen von 570 μ\ ohne Alkanvorlage und b) mit einem Probenvolumen von 570 μ\ mit Alkanvorlage.
Der automatisierte Prozess wurde mit der Identifizierung der Proben, dem sog. Loadcheck: , gestartet. Als positives Probenmaterial (PP) wurde Hepatitis-C-Virenmaterial (arHCV) mrt einer durchschnittlichen Konzentration von 108 - 109 RNA copies/ ml und als negatives Probenmaterial (NP) Negativplasma (Citratplasma / Breitscheid) eingesetzt. Nach denn Loadcheck wurden jeweils 80 μ\ einer handelsüblichen Protease (z. B. QIAGEN Protease J QIAGEN GmbH) in den S-Block pipettiert, und das System auf 56°C hochgeheizt.
Die Zugabe von jeweils 570 μ\ Probenmaterϊal erfolgte, wie vorstehend in der Tabelle 1 bereits schematisch dargestellt, im "Schachbrett-Muster". Neben jeder PP (+) wurde alternierend eine NP (-) in den S-Block pipettiert (KQ 1 !).
Nachfolgend wurden den einzelnen Reaktionslösungen 610 //! eines handelsüblichen Lysepuffers (z. B. Lysis Buffer AL / QIAGEN GmbH) zugegeben, diese dann durch auf und ab pipettieren gemischt (KQ 2!) und nachfolgend für 10 Minuten inkubiert. Abschließend wurden im Abstand von einer Minute pro Reihe jeder Reaktionslösung jeweils zweima 720 μ\ Ethanol (p.a oder min. 96%) zu pipettiert (KQ 3!).
Zur Trennung bzw. Aufreinigung der so isolierten Nukleinsäuren wurden jeweils zwei ma.1 910 I Lysat automatisch in entsprechende Filtersysteme (z. B QIAamp 96 plate/ QIAGENJ GmbH) überführt (KQ 4!) und unter Vakuum 5 Minuten bei 25°C filtriert (KQ 5!).
Gemäß dem Versuchsprotokoll (s.o.) wurden die mit der Nukleinsäure beladene Filter nachfolgend unter Vakuum jeweils mit 800 l eines handelsüblichen Waschpuffers (z. B_ Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (KQ 6!) und dann in einem zweiten Waschschritt mit 930 /l Ethanol (p.a. oder min. 96 %) (KQ 7!) gewaschen und anschließend die Membranen zur Beseitigung von Ethanol unter Vakuum und 60°C in einer automatisierten Vakuumvorrichtung (z. B. RoboVac/ QIAGEN GmbH) getrocknet (KQ 8!). Die aufgereinigte Nukleinsäure wurde abschließend unter Vakuum eine Minute lang einmal mit 50 μ\ und einmal mit 100 μ\ mindestens eines Elutionspuffers (z. B. Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) vom Filtersystem eluiert (KQ 9!). Das aufgefangene Eluat wurde für den nachfolgenden Amplifikationsprozess außerhalb des automatisierten Pipetiersystems aufbereitet. Dem für die RT-PCR aufbereiteten Eluat wurde ein handelsüblicher Enzymmix (z. B. Mastermix / QIAGEN GmbH) hinzu pipettiert (KQ 10!), zur Bestimmung der Nukleinsäure-Kontaminationen eine RT-PCR durchgeführt und die Ergebnisse ausgewertet.
Die zwei Versuchsdurchläufe (Lauf 2al und 2all) ohne Vorlage von Dodekan wurden mit folgender ar HCV-Verdünnung durchgeführt: 15ml 1x109 lU/ml + 22,5 ml NP = 4x108 lU/mt
Schon bei der Zugabe des Lysepuffers in den S-Block türmen sich bereits die Blasen bis zur Oberkante der einzelnen Reaktionsgefäße auf. Zudem fuhren die Pipetierspitzen (Tips) so schnell wieder aus den Reaktionsgefäßen heraus, dass teilweise die entstandenen Blasen platzen (besonders in Position H5 und H10). Auch beim der zweiten Zugabe des Lysats entstanden beim Mischen im S-Block vermehrt Blasen, die beim Herausfahren der Tips mit hochgezogen wurden und/oder zerplatzten.
Auch bei der Zugabe des Elutionspuffers konnten sowohl im Lauf 2al als auch im Lauf 2all Beobachtungen hinsichtlich Kontaminationen gemacht werden. So war beispielsweise eine deutliche Blasenbildung während und nach der Zugabe des Elutionspuffers insbesondere in Reihe G sowie auf der Position H6 zu sehen. Teilweise zerplatzten auch hier die Blasen beim Eintauchen und/oder Herausziehen der Tips. Nach der Elution waren in Reihe 1 bei den NP-Positionen B, D, F und H die Nozzles unter der QIAplate ebenfalls gelb wie bei den PP.
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Lauf 2al: 31 K /48 NP = KRLauf 2aj = 64,58 %
Lauf 2all: 34 K /48 NP =» KRLauf 2aiι = 70,08 %
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 67,33 %.
An dieser Stelle zeigt sich deutlich, dass die Pipetierschritte mit steigendem Probevolumen wesentlich anfälliger für Kreuzkontaminationen sind, da hier das S-B!ock-Volumen vollständig ausgenutzt wird. Die zwei Versuchsdurchläufe (Lauf 2bl und 2bll) mit Vorlage von Dodekan wurden ebenfalls mit der vorgenannten ar HCV-Verdünnung durchgeführt: 15ml 1x109 lU/ml + 22,5 ml NP = 4x108 lU/ml
Um die Wirkung der Dodekan-Überschichtung in bezug auf eine Verminderung bzw. Verhinderung von Blasenbildungen etc. besser beobachten zu können, wurde das eingesetzte Dodekan vorher mit Sudanschwarz eingefärbt.
Während der gesamten Versuchsdurchführung konnten jedoch keine besonderen Vorkommnisse hinsichtlich Kontaminationen beobachtet werden. Auch wiesen die Nozzles an der QIAplate wie schon unter Beispiel 1 b) aufgeführt nach der Elution keine Rückstände bzw. Verfärbungen auf.
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Lauf 2bl: 6 K /48 NP => KRLauf 2bj = 12,50 % Lauf 2bll:10 K /48 NP => KR uf an = 20,83 %
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 16,67 %
Nach dem Vergleich der ermittelten Kontaminationsraten konnte somit gezeigt werden, dass durch den Einsatz von Dodekan die Kreuzkontaminationsrate für das gesamte Isolierungsund Trennungsverfahren mit höheren Proben- und Reaktionsvolumina sogar um mindestens den Faktor 4 verringert werden kann.
Wie bereits vorstehend aufgeführt, weist ein derartiges Gesamtverfahren jedoch etliche Fehler- bzw. Kontaminationsquellen auf. Um nun die Wirkung der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere für einen einzelnen Pipetierschritt zu bestimmen, wurden im Laufe dieser Versuchsreihen einzelne Proben (vorzugsweise NP) entnommen und mittels RT-PCR analysiert. Ausgehend von den in den Beispielen 1b und 2b gemachten Beobachtungen, dass durch die Überschichtung mit Dodekan die Bildung von Blasen beziehungsweise Aerosolen insbesondere in den ersten Prozessschritten (im Bereich der Kontaminationsquellen 1 bis 4) durch das Eintauchen und Herausziehen der Pipetierspitzen verhindert wurde, wurden an diesen Stellen des Gesamtverfahrens Proben entnommen und analysiert. Keine dieser Proben wies Nukleinsäure-Verunreinigungen auf. Für einzelne Prozessschritte können somit durch den Einsatz von Dodekan (Kreuz-) Kontaminationen sogar ganz vermieden werden.
Weitere Versuche zeigten, dass durch den Einsatz von Dodekan auch in den Pipetierschrit- ten der Downstream-Analysen (wie z. B. der RT-PCR) gute Erfolge bei der Verminderung von (Kreuz-) Kontaminationen erzielt werden können. So wurden beispielsweise in weiteren Kreuzkontaminationstests die für eine RT-PCR notwendige handelsüblich Enzymmischung (z. B. Mastermix / QIAGEN GmbH) einer mit Dodekan überschichteten Probe zugegeben. Auch hier wiesen die Negativproben in den Versuchsreihen mit der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere deutlich weniger bis gar keine Kontaminationen auf.
Das Überschichten mit der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere eignet sich jedoch nicht nur für jegliche Art von Pipetiervorgängen. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere auch in anderen Modulen der Probenbearbeitung, in denen (Kreuz-) Kontaminationen auftreten, eingesetzt werden. So verhindert die Verwendung der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere beispielsweise in ebenso vorteilhafter Weise eine Kreuzkontamination, die durch Aerosolbildung, beim Überschlagen mit Waschpuffern, durch die Abgabe mit einem Dispenser, durch das Einbringen von Rühr- oder Mischvorrichtungen (wie z. B. Rührfischen, Rührstäben, Mischstempel oder Mischkolben etc.) sowie bei mechanischen Rühr- und/oder Mischvorgängen auftritt. (Wobei mit Rühren eine kreisförmig Bewegung und mit Mischen eine Auf- und Abwärtsbewegung gemeint sein soll.)
Zudem kann die eingesetzte Kontaminationsbarriere auch weitere Applikationen positiv beeinflussen. So führt beispielsweise der Einsatz der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere in Arrayexperimenten wie im Folgenden dargestellt neben der Vermeidung von Kontaminationen auch zu einer Stabilisierung derartiger Applikation.
Beispiel 3:
Auf Grund der besonderen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Additive wurden zur Überschichtung von Reaktionsansätzen für die Arrayexperimente neben Mineralölen auch Mischungen aus Mineral- und Siliconölen gewählt. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere erfolgte hierbei im Laufe einer Präparation von biotin-markierter cRNA zur Hybridisierung auf Microarrays (z. B. Human Genome U133B Array / Affymetrix, US), wobei unterschiedliche Volumina der Kontaminationsbarriere zu den cRNA Fragmentierungsansätzen hinzugegeben wurden. Als Kontaminationsbarriere wurden unterschiedliche Mengen an Mineralöl bzw. einem Gemisch aus Mineralöl und Siliconöl eingesetzt.
Die Synthese der Hybridisierungsproben wurde gemäß dem Herstellerprotokoll (Affymetrix) durchgeführt. Nach der Synthese von cRNA aus 2 μg Heia S3 total RNA wurde in verschiedene Fragmentierungsansätze 1 μ\, 5 μ\ und 10 μ\ der Öle hinzugegeben. Diese Fragmentierungsansätze wurden in den Hybridsierungsansatz überführt. Die Hybridisierung und Analyse der GeneChip Arrays wurde gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Als Kontrollen wurden Proben (K) eingesetzt, die ohne Kontaminationsbarriere ebenfalls gemäß dem Standard-Herstellerprotokoll zur Probenaufbereitung prozessiert wurden.
Anschließend wurden zu dieser Versuchsreihe Daten (zum Hintergrund auf den verwendeten Arrays), zu detektierbaren, statistisch relevanten Signalen (Present Calls) und den nicht detektierbaren Signalen auf dem Array erhoben. Dabei sollten die Schwankungen der Messwerte gering und unabhängig von der Zugabe der Öle sein. Die ermittelten Daten wurden wie folgt in einem Säulendiagram dargestellt.
Diagramm 1: Darstellung der Calls auf dem Array Die Ergebnisse zeigen, dass unter Zugabe der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere (mit und ohne Additiv) gleichmäßige Hybridisierungsergebnisse erzielt werden. Die Schwankungen der Calls liegen bei +/- 2 %, was der vom Chip-Hersteller angegebenen Schwankung für technische Replikate entspricht.
Da ferner auch eine Vermeidung von Kreuzkontaminationen bei der automatisierten Präparation von Proben zur Hybridisierung auf Microarrays vorteilhaft und wünschenswert ist, wurde in weiteren Versuchen die Wirkung der erfindungsgemäßen Kontamination auf einem automatisierten System (BioRobot 8000 / QIAGEN GmbH), bei dem Verschleppungen von Teilen der Kontaminationsbarriere während der Prozessierungsschritte bzw. während der Probenvorbereitung auftreten können, überprüft. Für die automatisierte Präparation von RNA aus Zellkulturzellen wurde dabei die RNeasy 96 Chemie (QIAGEN GmbH) verwendet. Dazu wurden 5 μg total RNA aus Heia Zellen an die Säulenmatrix der RNeasy 96 Platten gebunden (n=4). Nach drei Waschschritten wurde die gereinigte RNA von der Säule mit Wasser eluiert. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen während der Elution und zur Verbesserung der Ausbeute wurde die Probe zuvor mit Mineralöl sowie einem Gemisch aus Mineralöl und Siliconöl überschichtet. Um zu überprüfen, ob gegebenenfalls auch das Additiv alleine für diese Applikation geeignet ist, wurde ein Versuchsansatz nur mit Silikonöl überschichtet. Nachfolgend wurde die RNA Ausbeute photometrisch bestimmt.
Auch die Überschichtung der Proben mit einer erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere, der als Additiv ein Siliconöl zugesetzt wurde, führte auf einem automatisierten System zu einer höheren Ausbeute als vergleichbare Versuche ohne die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere. Überraschenderweise konnte hierbei die Ausbeute mit dem Einsatz der erfindungsgemäßen Additive um bis zu 10% gesteigert werden, was eine weitere Verbesserung der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere darstellt.
Weitere Versuchsreihen ergaben zudem, dass neben den vorgenannten Mineralöl/Siliconöl- Mischungen auch Silikonöle alleine oder in Form von Additivgemischen in Hybridisierungsansätzen als erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere fungieren können. (Getestet wurden hierbei handelsübliche Silikonöle, wie AK 35, AK 50 und AK 100 der Wacker Chemie GmbH)

Claims

Patentansprüche
1. Kontaminationsbarriere zur Vermeidung von Verunreinigungen wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen, die zumindest einen mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch aufweist.
2. Kontaminationsbarriere gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass diese einen unsubstituierten Kohlenwasserstoff aufweist.
3. Kontaminationsbarriere gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass diese einen substituierten Kohlenwasserstoff aufweist.
4. Kontaminationsbarriere nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass diese einen cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff aufweist.
5. Kontaminationsbarriere nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass diese einen verzweigten und/oder unverzweigten acyclischen Kohlenwasserstoff aufweist.
6. Kontaminationsbarriere nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Kohlenwasserstoff 5 bis 20, vorzugsweise 6 bis 16, besonders bevorzugt 8 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist.
7. Kontaminationsbarriere nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass diese als Kohlenwasserstoff besonders bevorzugt ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkan, vorzugsweise mit 8 bis 12 Kohlenstoffatome, aufweist.
8. Kontaminationsbarriere nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass diese als Alkan bevorzugt Oktan, Nonan, Dekan und/oder Dodekan sowie Mischungen daraus aufweist.
9. Kontaminationsbarriere nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese als Kohlenwasserstoffgemisch Mineralöl aufweist.
10. Verfahren zur Vermeidung von Kontaminationen, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Bearbeitung wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisierten -Systemen, diese mit zumindest einem mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoff oder einem Kohlenwasserstoffgemisch überschichtet werden.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Ür>erschichtung ein unsubstituierter Kohlenwasserstoff verwendet wird.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Überschichtung ein substituierter Kohlenwasserstoff verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein cyclischer, gesättigter oder ungesättigter Kohlenwasserstoff eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein verzweigter und/oder unverzweigter acyclischer Kohlenwasserstoff eingesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kohlenwasserstoff mit 5 bis 20, vorzugsweise 6 bis 16, besonders be orzugt 8 bis 12 Kohlenstoffatomen eingesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoff besonders bevorzugt ein verzweigtes oder unverzweigtes Alkan, vorzugsweise mit 8 bis 12 Kohlenstoffatome eingesetzt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkan b evorzugt Oktan, Nonan, Dekan und/oder Dodekan sowie Mischungen daraus eingesetzt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoffgemisch Mineralöl eingesetzt wird.
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