WO2007013430A1 - 歯の再生方法 - Google Patents

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WO2007013430A1
WO2007013430A1 PCT/JP2006/314631 JP2006314631W WO2007013430A1 WO 2007013430 A1 WO2007013430 A1 WO 2007013430A1 JP 2006314631 W JP2006314631 W JP 2006314631W WO 2007013430 A1 WO2007013430 A1 WO 2007013430A1
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tooth
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growth factor
cell
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Mariko Yamaki
Hidehiro Ozawa
Satoshi Ebina
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Matsumoto Dental University
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for regenerating a mammalian tooth, and more particularly, to a method for forming a tooth using a chimeric embryoid body of an undifferentiated mammalian cell and a tooth germ mesenchymal cell. Specifically, it relates to regenerative medicine, dental regenerative medicine and diagnosis, and drug development using this method.
  • Tooth is formed from ectoderm-derived epithelial cells (dental germ epithelium) and head neural crest-derived mesenchymal cells (tooth germ mesenchymal system).
  • the tooth germ epithelium is a part of the oral epithelium invaded in the early stage of embryogenesis, while the tooth germ mesenchymal system has mesenchymal cells including nerve-derived undifferentiated cells accumulated under the tooth germ. It is a thing.
  • Fibroblast growth factor (FGF) family secreted by tooth germ epithelial cells for example, see Non-Patent Document 2
  • osteogenic factor 4 (BMP4) osteogenic factor 4
  • SHH sock hedgehog
  • Induction of home box genes such as Msxl, Msx2, Dlxl, Dlx2, Lefl, and Barxl is induced in mesenchymal cells.
  • the function of determining the shape and position of the crown, and the function of controlling the separation of epithelial cells for example, see Non-Patent Document 3).
  • SHH is a secreted protein and is known as a factor involved in body axis formation.
  • tooth germ epithelial cells secrete and are considered to be particularly important factors that transmit various signals to tooth germ mesenchymal cells via BMP (see Non-Patent Document 4, for example).
  • BMP Non-Patent Document 4, for example.
  • mouse and rat teeth, tooth germ parts, pulp, etc. have been transplanted directly into the living body, these tissues are cultured as they are (organ culture), transplanted into living bodies, or unitized into cell units (i.e. Numerous teeth regeneration experiments using cells cultured in pieces There are no examples in which there is clear evidence that a reported force tooth has formed.
  • the previous attempts can be broadly divided into three directions as shown below.
  • Tissue such as tooth germ, dental pulp, periodontal ligament is transplanted as it is (see Non-patent Document 5, for example).
  • tooth germ is separated into epithelial cells and mesenchymal cells and cultured, and enamel blasts and odontoblasts are induced to differentiate from each other to try to form teeth in vitro.
  • Undifferentiated cells are cultured with an appropriate inducer on a culture dish, and tooth formation is induced using a three-dimensional culture method or the like.
  • the method 3) is a new attempt compared to 1) and 2).
  • the tooth germ epithelium of a 10-day-old (ED10) mouse fetus was removed by surgery, cultured on mouse embryonic stem cells, bone marrow stem cells, etc. in the presence of FGF8 or BMP4, and transplanted into the mouse maxilla.
  • ED10 10-day-old
  • the histological basis of tooth formation includes a) calcium deposition (calcification, ie, dentin ⁇ ), b) enamel matrix formation, and c) cementum formation.
  • Enamel plays an important role in maintaining tooth strength and caries resistance, and is not regenerated after formation.
  • tissue staining methods such as von Kossa and Alizarin red S, bone sialoprotein (BSP), osteopontin (OPN; BSP-1), dental sialoprotein (DSP)
  • BSP bone sialoprotein
  • OPN osteopontin
  • DSP dental sialoprotein
  • the constituent protein of the enamel substrate is used.
  • Enamel plays an important role in maintaining tooth strength and caries resistance! It is not regenerated after formation. The presence or absence of enamel formation can be confirmed by the expression of genes and proteins such as amelogenin, enamelin, and ameloblastin, which are enamel constituents as described above. Since enamel formation is evidence of tooth formation, confirmation of amelodienin, enamelin, ameloblastin, etc. is the key to tooth regeneration.
  • Non-Patent Literature 1 1. ThesleiF. Epithelia and mesenchymal signaling regulating toothmorphog enesis. J. Cell Sci. (2003), 116, 1647-1648.
  • Non-patent document 2 M. Mandler, A. Neubuser.FGF signaling is necessary for the specifica tion of the odontogenic mesenchyme. Dev. Biol. (2001) 240, 548-559.
  • Non-Patent Document 3 A. S. Tucker, K.L.Matthews, P.T.Sharpe.Transformation of tooth ty pe induced byinhibition of BMP signaling.Science (1998) 282, 1136-1138.
  • Non-Patent Document 4 P. Maye, S. Becker, H. Siemen, J. Thorne, N. Byrd, J. Carpentino, L. rabel.Hedgehog signaling is required for the differentiation of ES cells into neuroec toderm. Dev. Biol. (2004) 265,276—290.
  • Non-Patent Document 5 E. Koyama, C. Wu, T. Shimo, M. Pacifici. Chick limbs with mouseteet h: an effective in vivo culture system for tooth germ development andanalysis. Dev. Dyn. (2003) 226, 149— 154.
  • Non-Patent Document 6 MJ Tabata, T, Matsumura, T. Fujii, M. Abe, K. Kurisu. Fibronectin accelerates the growth and differentiation of ameloblast lineage cells invitro. J. Histo 1. Cyto. (2003) 51, 1673- 1679.
  • Non-Patent Document 7 A. Ohazama, S.A.Modino, l.Miletich, P.T.Sharpe. Stem-cell-based t issue engineering of murine teeth.J. Dent. Res. (2004) 83, 518-522.
  • Non-Patent Document 8 SAC Mondino, PT Sharpe. Tissueengineering of teeth using adult stem cells. Archiv. Oral Biol. (2005) 50,255—258. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel method for forming a tooth by culturing a body on a three-dimensional matrix.
  • teeth occurs during the entire process of formation of ectoderm-derived epithelial cells (tooth germ epithelial cells) and neural crest-derived mesenchymal cells (tooth germ-mesenchymal cells). ) Is formed by the interaction between the two. Therefore, it was considered that the formation of teeth requires an epithelial cell lineage and a mesenchymal cell lineage derived from tooth germ, but the tooth germ epithelial cell line is difficult to become a stable cell line alone. Tooth germ itself, tooth germ epidermis only, tooth germ mesenchymal cells only, mixed tooth group of tooth germ epithelium and tooth germ mesenchymal cells could not fully regenerate teeth .
  • tooth germ mesenchymal cells can produce a cell lineage in a state of maintaining undifferentiated cells and epithelial cell supporting activity.
  • Use mouse embryonic stem cells as an alternative
  • tooth germ epithelial cells can be induced to differentiate by interaction with tooth germ mesenchymal cells, these were obtained after culturing embryonic stem cells on tooth germ mesenchymal cells.
  • the mixed cells are singulated (i.e., disaggregated) and seeded on a low-adhesion plastic plate to create a new chimeric embryoid body.
  • a unique manufacturing method has been developed for the formation of teeth by culturing on the original matrix.
  • the object is to produce a chimeric embryoid body by culturing undifferentiated mammalian cells and dental embryo mesenchymal cells together in the presence of an inducer as described in claim 1.
  • the inducing factor is activin, bone inducing factor 4, insulin growth factor 1, fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor ⁇ 1 to produce a chimeric embryoid body Achieved by the way you do.
  • undifferentiated mast cells of allogeneic mammals such as mice, for example, embryonic stem cells and dental germ mesenchymal cells are cultured together in the presence of an appropriate inducer. Accordingly, a novel chimeric embryoid body can be produced.
  • the invention according to claim 2 provides the chimeric embryoid body according to claim 1, wherein the mammal is a kind selected from all mammalian forces in the invention according to claim 1. It is characterized by a manufacturing method.
  • a chimeric embryoid body that can be produced using any kind of stem cells of all mammals including mice can be provided.
  • the invention according to claim 3 is characterized in that, in the invention according to claim 1, the undifferentiated cells are a kind from which all stem cell forces are selected.
  • the invention according to claim 4 is characterized by a chimeric embryoid body produced by the method according to any one of claims 1 to 3.
  • An invention according to claim 6 is a method for forming a tooth comprising the method according to any one of claims 1 to 3 and the culture method using the chimeric embryoid body according to claim 5. Can be achieved.
  • the invention according to claim 7 is the invention according to claim 6, wherein the culture method includes activin, osteoinductive factor 4, transforming growth factor j81, insulin growth factor 1 or fibroblast growth. It is characterized by culturing for 3 days on a three-dimensional matrix in serum medium in which neither factor 2 is present.
  • the invention according to claim 8 is the invention according to claim 6, wherein the culture method includes activin, osteoinductive factor 4, transforming growth factor j81, insulin growth factor 1 or fibroblast growth. It is characterized by culturing for 2 days in the presence of factor 2 and then 3 days on a three-dimensional matrix in serum medium in which none of the above factors are present. According to the invention described in claim 8, in all mammals including mice, allogeneic mammalian tooth germ mesenchymal cells and all stem cells including embryonic stem cells By culturing together in the presence, a chimeric embryoid body can be produced.
  • the produced chimeric embryoid body can be treated with activin, osteoinductive factor 4, transforming growth factor
  • Both secretory dentin and enamel are secreted by culturing for 3 days in the presence of factor 2 for 3 days on a 3D matrix in serum medium without any of the above factors.
  • Secretory cells can be induced, and a new method of forming teeth can be provided.
  • the invention according to claim 9 can be achieved by a biological material obtained by the method for forming a tooth according to any one of claims 6 to 8.
  • a chimeric embryoid body is prepared by culturing together in the presence, and the prepared chimeric embryoid body is further cultured for 3 days on a three-dimensional matrix in which no inducer is present, or a medium to which an inducer is added. 2 days, and then culturing for 3 days in a serum medium excluding the inducer, a dentin-like structure having dentin and enamel can be provided. It can be used for regenerative medicine that is embedded in the part and regenerates complete teeth.
  • a chimeric embryoid body is produced using undifferentiated cells of allogeneic mammals and tooth germ mesenchymal cells, and further, the produced chimeric embryoid body is displayed on a three-dimensional matrix.
  • a biomaterial of the present invention having odontoblasts and enamel blasts regenerated in vitro that is, a group of cells secreting a substrate for the formation of a tooth-like structure, is embedded in a tooth extraction part and sutured to obtain a complete tooth.
  • a regenerative medicine technique that utilizes the regenerative function of the living body can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a tooth formation process.
  • FIG. 2 is a schematic diagram for explaining a method for forming teeth according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing culture of mesenchymal cells from which mouse tooth germs have also been isolated and confirmation of various markers.
  • FIG. 4 shows the expression of various marker genes and protein expression of MDU1.
  • FIG. 5 is a phase-contrast microscope image showing the process of producing a chimeric embryoid body.
  • FIG. 6 shows in vitro gene expression of chimeric embryoid bodies prepared in the presence of various inducers.
  • FIG. 7 shows in vitro calcification tests of chimeric embryoid bodies prepared in the presence of various inducers.
  • FIG. 8 is a diagram showing a calcification test of a sample obtained by transplanting a chimeric embryoid body produced in the presence of various inducers into a living mouse.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression of a marker protein in a sample obtained by transplanting a chimeric embryoid body produced in the presence of various inducers into a living mouse.
  • the present invention relates to undifferentiated cells, which are all stem cells, including embryonic stem cells (hereinafter referred to as ES cells), which can be separated into a wide variety of cells and tissues in mammals, and teeth.
  • ES cells embryonic stem cells
  • Embryonic mesenchymal cells are used to produce chimera embryoid bodies, and then, the new chimera embryoid bodies are cultured on a three-dimensional matrix, leading to a new method of tooth formation.
  • ES cells and tissues derived from living organisms are cultured together.
  • ES cells and other cells are cultured to produce chimeric embryo-like cells. The method for producing the body is not known, and even so, the method of using the chimeric embryoid body produced thereby has never been known.
  • the method for forming a tooth of the present invention includes the step of culturing a chimeric embryoid body of an undifferentiated cell and a tooth germ mesenchymal cell in the presence of an inducer of the same species of mammal. In addition, it is characterized by a combination force with “the step of culturing the produced chimeric embryoid body on a three-dimensional matrix”.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the method of forming teeth of the present invention in a mouse.
  • FIG. 2 In summary of the present invention, as shown in FIG. 2, first, differentiation control into epithelial cells is performed.
  • the embryonic mesenchymal cells of 14-day-old (ED14) mouse embryos that become functional are collected and subcultured to produce a stable cell line.
  • This cell line is then used as a feeder cell, and ES cells from the same mouse are co-cultured in the presence of an inducer to produce a “mixed cell group” of mouse tooth germ mesenchymal cells and ES cells. .
  • the mixed cell group is unified (that is, separated) and seeded on a low-adhesion plastic plate to produce a chimeric embryoid body.
  • the process of seeding on this low-adhesion plastic plate is the process power of culturing in a low-adhesion 96-well plastic plate for 1 day, then transferring to a low-adhesion 24-well plastic plate and culturing with an inducer for 4 days. .
  • a “step of culturing and producing a chimeric embryoid body of undifferentiated cells and tooth germ mesenchymal cells in the presence of an inducing factor” is performed to produce a chimeric embryoid body.
  • the step of culturing the produced chimeric embryoid body on a three-dimensional matrix is performed.
  • the produced chimeric embryoid body is seeded on a three-dimensional matrix made of porous collagen, cultured, and cultured in a serum medium from which the inducing factor is removed for 3 days. Further, as a more preferable culture condition, the produced chimeric embryoid body is seeded on a three-dimensional matrix made of porous collagen in the same manner as described above, and cultured for 2 days in the presence of an inducer, and a serum medium from which the inducer is removed. Can also be cultured for 3 days. Therefore, the present invention is characterized in that a tooth is formed by a step of producing a chimeric embryoid body and a step of culturing the produced chimeric embryoid body.
  • the stem cell according to the present invention is a cell that has the ability to transform into a specific cell upon receiving an instruction to change into a certain cell, that is, the ability to differentiate, and in an undivided state before undergoing the change.
  • Stem cells are hierarchical, and more undifferentiated stem cells can be divided into a very wide range of cell lines with high self-renewal capacity. The series is limited.
  • ES cells are stem cells located next to fertilized eggs. Mammalian organs have tissue-specific stem cells (ie, somatic stem cells, also known as tissue stem cells).
  • somatic stem cells maintain their respective tissues by regenerating (self-replicating) cells that have the same ability as the self when dividing, and having the ability to split into a unique lineage. It is. That is, embryonic stem cells from embryos, ie ES cells, somatic stem cells from adults, Embryonic germ cells can be removed from the fetus.
  • ES cells self-replicate semipermanently while maintaining an undivided state under certain culture conditions, and totipotency that can be distributed to all types of cells including germline.
  • ES cells are harvested from the early stage of fertilized embryos, that is, embryos that are in a state where fertilized eggs are separated and developed into fetuses, and grow into any cell in the body. It is also called a pluripotent stem cell because of its possible properties. ES cells are collected and cultured from the inner layer cells (inner mass cells) of blastocysts 2.5 days after fertilization, unlike somatic stem cells that are collected from the human body. Because it has the versatility that can be propagated to any cell and can be changed to any cell, it can create various cells to replace cells, tissues, organs, etc. that have been damaged by accidents or diseases. It is being researched as a “material” that can be used.
  • cells that have been differentiated from ES cells can be replaced with immune-related genes using gene therapy techniques, or embryos with the genetic information of patients can be created. By doing so, a method of transplanting an organ without causing a rejection reaction is also conceivable.
  • somatic stem cells refer to cells in a state prior to separation that are extracted from the tissue already formed in the body. There are many cells in a tissue that have a specific function in the tissue and have already been separated, but some of them are undifferentiated cells before differentiation into cells with such specific functions, That is, stem cells are present in a mixed state. Somatic stem cells have the ability to replicate and produce the same cells as themselves, and by virtue of it, they can create any individual cell in the tissue!
  • Typical examples include bone marrow stem cells used for bone marrow transplantation that are already active in many treatments due to their ability to be divided into specific tissues and are necessary for the treatment of leukemia etc. is there.
  • the present invention can be achieved by using stem cells having the functions described above.
  • the embryonic force mesenchymal cells of the mandibular molar teeth of 14-day-old (ED14) mouse embryos are collected, and cultured mesenchymal cells and ES cells of allogeneic mice are induced factors.
  • the stem cells used are not limited to ES cells, as long as they lead to the production of the above-mentioned chimeric embryoid bodies, somatic stem cells, bone marrow stem cells, etc.
  • Bone-inducing factor 4 bone morphogenetic protein—4, BMP—4; SIGMA
  • transforming growth factor- ⁇ 1, TGF- ⁇ 1, TO YOB O can be used appropriately.
  • a preferred method for producing a chimeric embryoid body by co-culture of mouse tooth germ mesenchymal cells and mouse ES cells is also described in detail in the examples below, and is performed by the following method. That is, the cultured cells cover the petri dish with about 70-80%, that is, the mouse embryonic mesenchymal cells before confluent growth are cultured for about 5 days and cultured for about 5 days. Fully differentiate. In the process of producing this chimeric embryoid body, the cell mixing ratio of mouse tooth embryo mesenchymal cells and mouse ES cells is about 2: 1. Specifically, the mouse cultured in this embodiment is There were 3 mouse ES cells 8xl0 versus 4 7xl0 cells of the tooth germ mesenchymal cells. One day after co-cultivation, MSCGM medium containing the above inducer is used and cultured at 37 ° C under 5% CO for a total of 5 days as described above. Then trypsin and E
  • Cells are collected by DTA treatment, singulated through a plastic filter, seeded in a low-adhesion 96-well plastic plate, then seeded in a 24-well plastic plate and cultured in the presence of an inducer to obtain mouse ES cells And chimera embryoid body of mouse embryonic mesenchymal cells.
  • the chimeric embryoid body produced by the above method is cultured on a three-dimensional matrix.
  • the produced chimeric embryoid body is cultured on a 1 to 2 ⁇ 1 to 2 ⁇ 1 to 2 mm collagen carrier and cultured for 3 days in a serum medium excluding the above-mentioned inducer.
  • the produced chimeric embryoid body is cultured on a collagen carrier of 1 to 2 ⁇ 1 to 2 ⁇ 1 to 2 mm, cultured for 2 days in the presence of the above-mentioned induction factor, and then in a serum medium excluding the induction factor. Incubate for 3 days.
  • the biological material produced by further processing the produced chimeric embryoid body is calcified on the carrier, as in the tooth formation process shown in FIG. It was found to express the genes and proteins of bone shaloprotein and tooth shaloprotein, and to express the genes and proteins of enamel substrates, amelogenin and enamelin.
  • a chimeric embryoid body of mouse embryonic tooth embryo-derived mesenchymal cells and mouse ES cells is prepared, and the chimeric embryoid body is further cultured on a three-dimensional matrix.
  • dentin blast cells and enamel blast cells which are the secretory cells of dentin and enamel, which are tooth constituents, could be induced simultaneously.
  • mouse ES cells are differentiated into epithelial cells (enamel blasts) by tooth germ mesenchymal cells, and it can be recognized that tooth regeneration was successful for the first time.
  • the biological material obtained by the method for forming teeth according to the present invention can be used for tooth production or regeneration.
  • Tooth production refers to the production of new teeth inside and outside a mammal's living body. Tooth regeneration refers to restoring teeth by recovering tooth damage caused by diseases such as caries in and out of the living body. That is, the biological material according to the present invention can be used for so-called regenerative medicine.
  • the cells were similarly cultured at 37 ° C and 5% CO. After that, the cells about on the petri dish
  • a stable mesenchymal cell line was produced by subculturing 70-80%, ie, before becoming confluent growth.
  • Commercial mouse ES-D3 cells (American Type Culture Collection (ATCC), USA) were seeded in a 25 mL culture flask pre-coated with 0.1% gelatin without a feeder cell. Cultured while maintaining. Medium is 15% KSR (Gibco), 0. ImM j8-mercaptoethanol (Sigma), 0. ImM non-essential amino acid (Sigma), 8 mM L-glutamine (Sigma), and 1,00 OUZml leukemia suppression It was changed every other day using KnockOut DMEM medium (Gibco) containing a factor (Lleukemia inhibitory factor LIF; Chemicon).
  • this cell line showed a temporary decrease in mitotic potential after 20 days of culture, but became active again after 30 days. After dividing, cell lines that could be stably subcultured were obtained. As can be seen in the center of Fig. 3, in the cells cultured for 4 weeks (2 passages), approximately 70% of nestin positive cells, which are undivided markers, can be confirmed, which is a tooth germ epithelial cell marker Cytokeratin 14 (cytokeratin 14) positive cells were not found (not shown). In addition, as shown in the right of Fig.
  • MDU 1 maintains strong mesenchymal cell properties even after passage, does not lose undifferentiated properties, and shows a tendency toward calcification in long-term culture experiments.
  • the fact that the inductive ability was maintained also contributed. Therefore, it was suggested that this cell line has a strong ability to induce teeth.
  • mouse ES cells were cultured for 5 days in a state where the cells covered the petri dish about 70 to 80%, that is, before they became confluent growth. Then, the ES cells were fully separated ( Figure 5 left). Cell mixing ratio is 4 for MDU1 1. 7xl0 and mouse E There were 3 SxlOxlO (Fig. 5 middle). After co-cultivation in the absence of inducer for 1 day, use MSCGM medium with various inducers added to the medium at 37 ° C, 5% CO for a total of 5
  • the inducers used were activin (Ajinomoto), bone inducer 4 (bone morphogenetic protein—4, BMP—4; SIGMA), insulin growth factor 1 (insul in growth factor—1, IGF—l; TOYOBO), fibroblast They were cell growth factor 2 (fibroblas t growth factor-2, FGF-2; TOYOBO) and transforming growth factor j81 (transforming growth factor- ⁇ 1, TGF- ⁇ 1; TOYOBO).
  • GEBCO trypsin-EDTA treatment
  • the produced chimeric embryoid body was cultured on a collagen carrier (Collagen Sponge Honeycomb TM) of 1 to 2xl to 2xl to 2 mm for 3 days in a serum medium excluding the inducing factor.
  • the chimera embryoid body adhered to the collagen carrier was found to adhere to and extend to the beam portion of the collagen carrier having a hercome structure (Fig. 5, right).
  • the produced chimeric embryoid body was cultured for 2 days in the presence of the above-mentioned induction factor using different culture conditions, and then the serum medium without the induction factor was used for 3 days. Cultured for days. It was found that the chimaeric embryoid body adhered to the collagen carrier adhered and extended well to the beam portion of the collagen carrier having a heart-shaped structure under this culture condition.
  • a part of the collagen carrier adsorbing the chimeric embryoid body is fixed as it is and paraffin Embedding and tissue staining were observed, and the rest were transplanted subcutaneously under the skull and dorsal fascia of living mice and taken out 42 days later to prepare paraffin-embedded samples and electron microscope samples.
  • the beam portion of the collagen carrier is called a skifold, and the space portion is called a matrix.
  • Fig. 6 First, as shown in Fig. 6, we examined what kind of marker gene the chimeric embryoid body expressed by real-time PCR.
  • the controls were embryonic bodies (control (—ES)) containing no mouse ES cells without addition of various inducers and chimeric embryos (control (+ ES) containing mouse ES cells without addition of various inducers.
  • the ratio of marker gene expression was expressed as a relative value to control (-ES).
  • ALP alkaline phosphatase
  • the calcified collagen carrier skifold was not stained in any sample, and the collagen carrier matrix was stained with amelogenin, osteopontin or bone shear protein.
  • the collagen carrier matrix was stained with amelogenin, osteopontin or bone shear protein.
  • cells in which the cytoplasm was filled with minerals and only the nuclei were visible were observed in the matrix.
  • the force matrix in which amelogenin and osteobontin were stained along the skated field of the calcified collagen carrier was almost unaltered.
  • Collagen carrier matrix with activin, BMP4, and TGF- ⁇ 1 stained amelogenin and osteopontin, and the staining of bone shaloprotein was strong.
  • both dentin and enamel secretory cells (dentin blasts and enamel blasts), which are tooth constituents, are derived from chimeric embryoid bodies of mesenchymal cells derived from mouse embryonic tooth embryos and mouse ES cells. I was able to. In this system, it was suggested that mouse ES cells are separated into epithelial cells (enamel blasts) by tooth germ mesenchymal cells. In addition, when an appropriate inducer (such as FGF2 or TGF- ⁇ 1) is applied to this system, it can be separated into the teeth. The conversion was strongly promoted.
  • an appropriate inducer such as FGF2 or TGF- ⁇ 1
  • odontoblasts and enamel blasts which are tooth constituents, can be induced from a chimeric embryoid body of mouse embryonic tooth embryonic mesenchymal cells and mouse ES cells.
  • the present invention can be applied to general mammals that are not limited to mice, and can be applied to regeneration of mammalian teeth including humans.
  • the undifferentiated cells used in the present invention are not limited to ES cells, and all stem cells are applicable to the present invention.
  • mammalian stem cells can be used to regenerate dentin and enamel, regenerative medicine in which these cells are packed in sealed holes and sealed to regenerate teeth, and extraction is possible.
  • Internal force such as regenerating complete teeth by suturing biological materials with odontoblasts and enamel blasts regenerated in vitro on the teeth, ie, cells that secrete the substrate for the formation of tooth-like structures
  • a method applied to regenerative medicine utilizing the regenerative function of the living body can be developed.
  • it can be used in a wide range of applications, such as application to diagnostics for detailed diagnosis of dental diseases, evaluation system (assessment system), and the possibility of being used for experiments in drug development. Therefore, the present invention opens up all the possibilities described above, and the prospect of its practical use and the industrial utility value are extremely high.

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Abstract

　本発明は、同種哺乳類の未分化細胞と歯胚間葉系細胞とを用いてキメラ胚様体を作製し、さらに、作製されたキメラ胚様体を３次元マトリクス上で培養することによって、新規な歯の形成方法の提供を目的とする。 　同種哺乳類の歯胚間葉系細胞と未分化細胞とを誘導因子の存在下で共に培養してキメラ胚様体を作製し、さらに、作製したキメラ胚様体を３次元マトリクス上に培養することによって、歯の形成がなされる。なお、作製したキメラ胚様体の３次元マトリクス培養は誘導因子を除いた血清培地で３日間培養するか、又は、誘導因子を加えた培地で２日間し、その後、誘導因子を除いた血清培地で３日間培養する。使用する未分化細胞は、ＥＳ細胞を含む、すべての幹細胞から選ばれる一種であり、哺乳類は、すべての哺乳類から選ばれる一種である。また、誘導因子は、アクチビン、骨誘導因子４、インスリン成長因子、繊維芽細胞成長因子２及びトランスフォーミング増殖因子β１であることを特徴とする。

Description

歯の再生方法
技術分野
[0001] 本発明は、哺乳類の歯の再生法に関し、より詳細には、同種哺乳類の未分化細胞 と歯胚間葉系細胞とのキメラ胚様体を利用した歯の形成法に関し、さらにより詳細に は、当該方法を利用する再生医学、歯の再生医療及び診断、並びに医薬品開発に 関する。
背景技術
[0002] in vitroで哺乳類の歯を再生する試みや、哺乳類の歯の再生機構を解明して、そ こ力も得られる知見を活用してヒトの歯を再生しょうとする試みが、長年にわたり続け られて 、る。「歯」は外胚葉由来の上皮系細胞 (歯胚上皮）と頭部神経冠由来の間葉 系細胞 (歯胚間葉系）から形成される。歯胚上皮は、胎生初期に口腔上皮の一部が 陥入したものであり、一方、歯胚間葉系は、神経提由来の未分化細胞を含む間葉系 細胞が歯胚上皮下に集積したものである。歯の形成の全過程において、歯胚におけ る上皮系と間葉系細胞との間の相互作用が重要な役割を担っている (例えば、非特 許文献 1参照)。歯胚上皮系細胞が分泌する繊維芽細胞成長因子 (FGF)ファミリー (例えば、非特許文献 2参照）、骨形成因子 4 (BMP4)、ソ-ックヘッジホッグ (SHH) などの誘導因子が、歯胚間葉系細胞に Msxl、 Msx2、 Dlxl、 Dlx2、 Lefl、 Barxl などのホメォボックス遺伝子の発現を誘導し、その結果、マウスでは、歯胚間葉系細 胞は、胎生 11乃至 14日齢 (ED11— 14)で、歯冠の形や歯の位置を決定する機能 や、上皮系細胞の分ィ匕を制御する機能を持つようになると考えられている（例えば、 非特許文献 3参照)。 SHHは分泌性の蛋白質であり、体軸形成に関わる因子として 知られている。歯の形成の過程では歯胚上皮細胞が分泌し、 BMPを介して歯胚間 葉系細胞に様々なシグナルを伝達する特に重要な因子と考えられて 、る（例えば、 非特許文献 4参照)。これまで、マウスやラットの歯、歯胚部分、歯髄などを直接生体 に移植したり、これらの組織をそのまま培養して (器官培養)生体移植したり、細胞単 位まで単一化 (つまり、バラバラに）して培養した細胞を用いた歯の再生実験が数多く 報告されている力 歯が形成された明確な証拠が認められる例は存在していない。こ れまでの試みは以下に示すように、大きく 3つの方向に分けられる。
1)：生体内で歯形成に関与している組織 (歯乳頭、歯髄、歯根膜など)を利用する方 法。
1)—1、歯胚、歯髄、歯根膜などの組織をそのまま移植する (例えば、非特許文献 5 参照)。
1) 2、歯胚を上皮系細胞と間葉系細胞とに分離して各々培養し、それぞれからェ ナメル芽細胞、象牙芽細胞を分化誘導して in vitroで歯の形成を試みる。
1) 3、分離培養した歯胚上皮細胞と間葉系細胞を再度混合し、マウス皮下などの 生体組織に移植して、歯の形成を試みる。（例えば、非特許文献 6参照。 )
2)：胚性幹細胞や間葉性幹細胞など、多分化能を持つ未分化細胞を利用する方法
[0003] 未分化細胞を培養シャーレ上で適当な誘導物質とともに培養し、 3次元培養法など を用いて歯の形成を誘導する。
3)： 1)と 2)の双方を利用する方法。
[0004] この 3)の方法は、 1)や 2)に比べて新しい試みである。実際に、 10日齢 (ED10)の マウス胎仔の歯胚上皮を手術により取り出し、 FGF8や BMP4存在下でマウス胚性 幹細胞、骨髄幹細胞などの上に積層して培養し、マウス上顎内に移植して歯が形成 された報告がある（例えば、非特許文献 7、 8参照)。しかし、この事例は、後述するよ うに、エナメル基質形成の証拠がないので、完全な歯の形成の成功例とは認められ ていない。
[0005] 歯形成の組織学的根拠としては、 a)カルシウムの沈着 (石灰化、すなわち、象牙質 ィ匕）と、 b)エナメル基質形成及び c)セメント質の形成があげられる。エナメル質は歯 の強度や虫歯抵抗性を保つうえで重要な役割を担い、かつ、形成後再生が行われ ない。象牙質化の確認には、 von Kossa、 Alizarin red Sなどの組織染色法と、 骨シァロプロテイン（bone sialoprotein、 BSP)、ォステオポンチン（OPN； BSP - 1)、歯シァロプロテイン（dental sialoprotein、 DSP)などの蛋白質や遺伝子の発 現確認が必要である。エナメル基質形成の確認には、エナメル基質の構成蛋白質で あるァメロジェニン、ェナメリン、ァメロブラスチンなどの遺伝子や蛋白質の発現の確 認が必要である（図 1)。これまで歯再生研究のなかで、石灰化 (象牙質化)や骨化の 報告が多いが、いずれも、エナメル基質の形成を、ァメロジェニン、ェナメリン、ァメロ ブラスチンなどで確認した事例はな力つた。
"エナメル質"は歯の強度や虫歯抵抗性を保つうえで重要な役割を担!、、かつ、形 成後再生が行われない。エナメル形成の有無は、上述のごとぐエナメル構成物質で あるァメロジェニンやェナメリン、ァメロブラスチンのなどの遺伝子や蛋白質の発現に より確認することができる。エナメル質の形成が歯の形成の証拠となるので、ァメロジ ェニン、ェナメリン、ァメロブラスチンなどの確認が歯再生の鍵となる。
非特干文献 1 : 1. ThesleiF. Epitheliaト mesenchymal signaling regulating toothmorphog enesis. J. Cell Sci. (2003), 116, 1647-1648.
非特許文献 2 : M. Mandler, A. Neubuser. FGF signaling is necessary for thespecifica tion of the odontogenic mesenchyme. Dev. Biol. (2001) 240, 548-559.
非特許文献 3 : A. S. Tucker, K.L. Matthews, P.T. Sharpe. Transformation of tooth ty pe induced byinhibition of BMP signaling. Science (1998) 282, 1136—1138.
非特許文献 4 : P. Maye, S. Becker, H. Siemen, J.Thorne, N. Byrd, J. Carpentino, L. rabel. Hedgehog signaling is required forthe differentiation of ES cells into neuroec toderm. Dev. Biol. (2004) 265,276—290.
非特許文献 5 : E. Koyama, C. Wu, T. Shimo, M. Pacifici. Chick limbs with mouseteet h: an effective in vivo culture system for tooth germ development andanalysis. Dev. Dyn. (2003) 226, 149—154.
非特許文献 6 : M.J. Tabata, T, Matsumura, T. Fujii, M. Abe, K. Kurisu. Fibronectin accelerates the growth and differentiation of ameloblast lineage cells invitro. J. Histo 1. Cyto. (2003) 51, 1673-1679.
非特許文献 7 : A. Ohazama, S.A. Modino, l.Miletich, P.T. Sharpe. Stem-cell-based t issue engineering of murine teeth. J. Dent. Res. (2004) 83, 518-522.
非特許文献 8 : S.A.C. Mondino, P.T. Sharpe. Tissueengineering of teeth using adult stem cells. Archiv. Oral Biol. (2005) 50,255—258. 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 上述したように、従来の歯を再生する手法にお!、て、胚性幹細胞や体性幹細胞な どの未分化細胞を使用する方法がある。このような多分化能をもつ未分化細胞は、 未分ィ匕のまま生体移植すると腫瘍ィ匕するという不利な点を有するが、適当な条件下 であれば培養して大量に増やすことが可能であること、添加する誘導因子により様々 な器官や組織に誘導できるなどの利点も多い。そのため、歯の再生のための細胞供 給源として、多分化能を有する未分化細胞を利用する研究開発に大きな期待が寄せ られており、近年、歯を再生するために、胚性幹細胞、体性幹細胞、骨髄幹細胞など の多分ィ匕能をもつ未分ィ匕細胞を積極的に活用した歯の再生工学が注目されて 、る ( 例えば、非特許文献 7、 8参照)。
[0008] しかしながら、上述のごとぐこの事例では、 in vivoでも in vitroでも、歯の形成に 不可欠なエナメル質である、ァメロジェニン、ェナメリン、ァメロブラスチンなどの基質 形成は確認されて 、な 、。
[0009] したがって、本発明は上述に鑑みてなされたものであり、同種哺乳類の未分化細胞 と歯胚間葉系細胞とを用いてキメラ胚様体を作製し、さらに、作製されたキメラ胚様体 を 3次元マトリックス上で培養することによって、新規な歯の形成方法を提供すること を目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 哺乳類の生体において、歯の形成は、その形成の全過程において、外胚葉由来の 上皮系細胞 (歯胚上皮系細胞）と神経堤由来の間葉系細胞 (歯胚間葉系細胞）との 間の相互作用によって形成されることが分力つている。したがって、歯の形成には、 歯胚由来の上皮系細胞系列と間葉系細胞系列が必要であることが考えられたが、歯 胚上皮系細胞は単独で安定して細胞系列となりにくぐまた、歯胚そのもの、歯胚上 皮のみ、歯胚間葉系細胞のみ、歯胚上皮と歯胚間葉系細胞との混合細胞群によつ て歯の完全な再生は得られていな力 た。そこで、本発明者らは、歯胚の間葉系細 胞は未分化細胞や上皮細胞支持活性を維持した状態で細胞系列を作製できるとい う実験結果に着目して、歯胚上皮系細胞の代替としてマウス胚性幹細胞を利用する ことによって、歯胚間葉系細胞との相互作用により、歯胚上皮細胞を分化誘導できる ヽぅ知見に基づき鋭意検討した結果、歯胚間葉系細胞上で胚性幹細胞を培養した 後、これらの混合細胞を単一化 (つまり、バラバラに)し、低接着性のプラスチックプレ ート上に播種して、新規なキメラ胚様体を作製し、さらに、この新規なキメラ胚様体を 三次元マトリクス上で培養することによる歯の形成に非常に独特な製造方法を開発し た。
[0011] 即ち、上記目的は、請求項 1に記載されるがごとぐ同種哺乳類の未分化細胞と歯 胚間葉系細胞とを誘導因子の存在下で共に培養してキメラ胚様体を作製する方法 であって、前記誘導因子は、ァクチビン、骨誘導因子 4、インスリン成長因子 1、繊維 芽細胞成長因子 2及びトランスフォーミング増殖因子 β 1であることを特徴とするキメ ラ胚様体を作製する方法によって達成される。
[0012] 請求項 1に記載の発明によれば、マウスなど同種哺乳類の未分ィ匕細胞、例えば、 胚性幹細胞と歯胚間葉系細胞とを適切な誘導因子の存在下で共に培養することに よって、新規なキメラ胚様体を作製することができる。
[0013] 請求項 2にかかる発明は、請求項 1に記載の発明において、前記哺乳類は、すべ ての哺乳類力 選ばれる一種であることを特徴とする請求項 1に記載のキメラ胚様体 を作製する方法を特徴とする。
[0014] 請求項 2に記載の発明によれば、マウスを含めたすべての哺乳類のいずれの種の 幹細胞を使用しても作製可能なキメラ胚様体を提供できる。
[0015] 請求項 3にかかる発明は、請求項 1に記載の発明において、前記未分化細胞は、 すべての幹細胞力も選ばれる一種であることを特徴とする。
[0016] 請求項 3に記載の発明によれば、胚性幹細胞を含むすべての幹細胞の!/、ずれを 使用しても作製可能なキメラ胚様体が提供できる。
[0017] 請求項 4にかかる発明は、請求項 1乃至 3のいずれか一項に記載の方法で作製し たキメラ胚様体を特徴とする。
[0018] 請求項 4に記載の発明によれば、マウスを含むすべての哺乳類において、同種哺 乳類の歯胚間葉系細胞と、胚性幹細胞を含むすべての幹細胞力 選ばれる一種と を適切な誘導因子の存在下で共に培養することで、キメラ胚様体を提供できる。 [0019] 請求項 5にかかる発明は、請求項 4に記載のキメラ胚様体を利用する培養方法によ つて達成でさる。
[0020] 請求項 5に記載の発明によれば、マウスを含むすべての哺乳類において、同種哺 乳類の歯胚間葉系細胞と、胚性幹細胞を含むすべての幹細胞とを適切な誘導因子 の存在下で共に培養することで作製したキメラ胚様体を利用する新規な培養方法が 提供できる。
[0021] 請求項 6にかかる発明は、請求項 1乃至 3のいずれか一項に記載の方法と、請求項 5に記載のキメラ胚様体を利用する培養方法と、からなる歯の形成方法によって達成 できる。
[0022] 請求項 6に記載の発明によれば、マウスを含むすべての哺乳類において、同種哺 乳類の歯胚間葉系細胞と、胚性幹細胞を含むすべての幹細胞とを適切な誘導因子 の存在下で共に培養することでキメラ胚様体が作製でき、さらに、作製されたキメラ胚 様体を培養することによって、歯構成物質である象牙質とエナメル質をそれぞれ分泌 する両方の分泌細胞を誘導することができ、新規な歯の形成方法を提供できる。
[0023] 請求項 7にかかる発明は、請求項 6に記載の発明において、前記培養方法は、ァク チビン、骨誘導因子 4、トランスフォーミング増殖因子 j8 1、インスリン成長因子 1又は 繊維芽細胞成長因子 2のいずれも存在しない血清培地中の 3次元マトリクス上で 3日 間培養することを特徴とする。
[0024] 請求項 7に記載の発明によれば、マウスを含むすべての哺乳類において、同種哺 乳類の歯胚間葉系細胞と、胚性幹細胞を含むすべての幹細胞とを適切な誘導因子 の存在下で共に培養することでキメラ胚様体が作製でき、さらに、作製されたキメラ胚 様体を誘導因子が存在しない 3次元マトリクス上で培養することによって、歯構成物 質である象牙質とエナメル質をそれぞれ分泌する両方の分泌細胞を誘導することが でき、新規な歯の形成方法を提供できる。
[0025] 請求項 8にかかる発明は、請求項 6に記載の発明において、前記培養方法は、ァク チビン、骨誘導因子 4、トランスフォーミング増殖因子 j8 1、インスリン成長因子 1又は 繊維芽細胞成長因子 2の存在下で 2日間、その後、前述のいずれの因子も存在しな い血清培地中の 3次元マトリクス上で 3日間培養することを特徴とする。 [0026] 請求項 8に記載の発明によれば、マウスを含むすべての哺乳類において、同種哺 乳類の歯胚間葉系細胞と、胚性幹細胞を含むすべての幹細胞とを適切な誘導因子 の存在下で共に培養することでキメラ胚様体が作製でき、さらに、作製されたキメラ胚 様体をァクチビン、骨誘導因子 4、トランスフォーミング増殖因子 |8 1、インスリン成長 因子 1又は繊維芽細胞成長因子 2の存在下で 2日間、前述のいずれの因子も存在し ない血清培地中の 3次元マトリクス上で 3日間培養することによって、歯構成物質であ る象牙質とエナメル質をそれぞれ分泌する両方の分泌細胞を誘導することができ、新 規な歯の形成方法を提供できる。
[0027] 請求項 9にかかる発明は、請求項 6乃至 8のいずれか一項に記載の歯の形成方法 により得られる生物材料によって達成できる。
[0028] 請求項 9に記載の発明によれば、マウスを含むすべての哺乳類において、同種哺 乳類の歯胚間葉系細胞と、胚性幹細胞を含むすべての幹細胞とを適切な誘導因子 の存在下で共に培養することでキメラ胚様体を作製し、作製されたキメラ胚様体をさ らに誘導因子が存在しない 3次元マトリクス上で 3日間培養するか、または誘導因子 を加えた培地で 2日間、その後、誘導因子を除いた血清培地で 3日間培養することに よって、象牙質とエナメル質を有する歯様構造体が提供でき、さらに、例えば、該歯 様構造体を哺乳類の抜歯部分に埋め込んで完全な歯の再生を行う再生医療に利用 することができる。
発明の効果
[0029] 本発明によれば、同種哺乳類の未分化細胞と歯胚間葉系細胞とを用いてキメラ胚 様体を作製し、さら〖こ、作製されたキメラ胚様体を 3次元マトリクス上で培養することに よって、新規な歯の形成方法を提供することができる。例えば、抜歯部分に in vitro で再生した象牙芽細胞とエナメル芽細胞を持った本発明の生物材料、つまり歯様構 造体形成の基質を分泌する細胞群を埋め込み、縫合して完全な歯の再生を行なうな ど、生体の再生機能を活用する再生医療の手法が提供できる可能性がある。
図面の簡単な説明
[0030] [図 1]歯の形成過程を示す図である。
[図 2]本発明の歯の形成法を説明する概略図である。 [図 3]マウス歯胚カも分離した間葉系細胞の培養と各種マーカーの確認の図である。
[図 4]MDU1の各種マーカー遺伝子発現と蛋白質発現を示す図である。
[図 5]キメラ胚様体作製過程を示す位相差顕微鏡像である。
[図 6]各種誘導因子の存在下で作製したキメラ胚様体の in vitroでの遺伝子発現を 示す図である。
[図 7]各種誘導因子の存在下で作製したキメラ胚様体の in vitroカルシウム沈着試 験を示す図である。
[図 8]各種誘導因子の存在下で作製したキメラ胚様体を生体マウスに移植した試料 のカルシウム沈着試験を示す図である。
[図 9]各種誘導因子の存在下で作製したキメラ胚様体を生体マウスに移植した試料 のマーカー蛋白質の発現を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0031] 本発明の一つの好ましい態様について詳述して説明する力 本発明はこれに限定 されるものではない。
[0032] 本発明は、哺乳類において、多種多様な細胞や、組織に分ィ匕することができる、胚 性幹細胞（以下、 ES細胞という）を含む、すべての幹細胞である未分化細胞と、歯胚 間葉系細胞とを用いてキメラ胚様体を作製し、さら〖こ、作製されたキメラ胚様体を 3次 元マトリクス上で培養することによって、新規な歯の形成方法を導く。ここで注目すベ きことは、これまで ES細胞と生体由来の組織を共に培養することは知られていたが、 本発明のように、 ES細胞と他の細胞とを培養してキメラ胚様体を作製する方法は知 られておらず、ましてや、それによつて作製したキメラ胚様体を利用する手法は全く知 られて ヽなかったことである。
[0033] したがって、本発明の歯の形成方法は、同種の哺乳類の「未分化細胞と歯胚間葉 系細胞とのキメラ胚様体を誘導因子の存在下で培養して作製するステップ」と、さらに 、「作製されたキメラ胚様体を 3次元マトリクス上で培養するステップ」との組み合わせ 力 なることを特徴とする。
[0034] 図 2は、マウスにおいて本発明の歯の形成法を説明する図である。
[0035] 本発明を概要すると、図 2に示されるように、はじめに、上皮系細胞への分化制御 機能を有するようになる 14日齢 (ED14)のマウス胎仔の歯胚間葉系細胞を採取し継 代培養して、安定な細胞系列を作製する。次いで、この細胞系列をフィーダ一細胞と して同種マウスの ES細胞を誘導因子の存在下で共に培養して、マウスの歯胚間葉 系細胞と ES細胞との「混合細胞群」を作製する。次いで、混合細胞群を単一化 (つま り、バラバラに)し、低接着性のプラスチックプレートに播種してキメラ胚葉体を作製す る。この低接着性のプラスチックプレートに播種する過程は、低接着性 96穴プラスチ ックプレートに 1日培養し、次いで、低接着性 24穴プラスチックプレートに移して、誘 導因子で 4日間培養する過程力もなる。このようにして、「未分化細胞と歯胚間葉系 細胞とのキメラ胚様体を誘導因子の存在下で培養して作製するステップ」がなされて キメラ胚葉体が作製される。次いで、「作製されたキメラ胚様体を 3次元マトリクス上で 培養するステップ」がなされる。すなわち、作製したキメラ胚様体を多孔質コラーゲン 製の 3次元マトリクス上に播種して培養し誘導因子を除いた血清培地で 3日間培養す る。また、より好ましい培養条件として、作製したキメラ胚様体を上記同様に、多孔質 コラーゲン製の 3次元マトリクス上に播種して、誘導因子存在下で 2日間培養し、誘導 因子を除いた血清培地で 3日間培養することもできる。したがって、本発明は、キメラ 胚様体を作製するステップと、作製されたキメラ胚様体を培養するステップとにより、 歯を形成することを特徴とする。
ここで本発明で使用する幹細胞について説明する。本発明に係る幹細胞は、ある 細胞に変化するようにという指示を受けると特定の細胞に変身、すなわち分化する能 力を有する細胞であり、また、変化を遂げる前の未分ィ匕の状態で長期間にわたって 自らを複製、再生する能力も備えている細胞である。幹細胞には階層性があり、より 未分化な幹細胞は自己複製能が高ぐ非常に広範な細胞系列に分ィ匕できるが、幹 細胞も下位になるに従い自己複製能は失われ、分化できる細胞系列が限定されてく る。 ES細胞は受精卵に次いで上位に位置する幹細胞である。哺乳類の臓器には、 組織特異的な幹細胞 (すなわち、体性幹細胞、別名組織幹細胞）が存在する。体性 幹細胞は固有の系列への分ィ匕能を有するとともに、分裂した際自己と同じ能力を持 つた細胞を再生（自己複製)することにより、それぞれの組織を維持して 、ると考えら れている。つまり、胚からは胚性幹細胞、すなわち ES細胞、成人からは体性幹細胞、 胎児からは胚生殖細胞を取り出すことができる。
[0037] 特に、 ES細胞は、ある一定の培養条件下で未分ィ匕な状態を保持しながら半永久 的に自己複製し、生殖細胞系列を含むあらゆる種類の細胞に分ィ匕できる全能性、多 分化能を有する細胞として知られて ヽる。
[0038] ES細胞は、受精した胚、つまり、受精卵が分ィ匕して胎児に発展するまでの状態で ある胚の初期段階力 採り出されるもので、身体のどのような細胞にも成長できる性 質を有するため多能性幹細胞とも呼ばれている。 ES細胞は、受精後 2. 5日目の胚 盤胞の内層細胞（内部塊細胞)カゝら採り出して培養され、人体から採り出される体性 幹細胞と違って、培養によって実験室において無限に増殖させることができ、かつ、 どのような細胞にも変化できる万能性を有することから、事故や病気によって機能を 損なわれた細胞や組織、臓器などの取って代わるための各種細胞を作り出すことの できる"素材"として研究されている。理論上、 ES細胞から分化させた細胞に遺伝子 治療の技術を用いて免疫関係の遺伝子を入れ替えたり、患者の遺伝情報を持つ胚 を作り、そこ力も ES細胞を取り出して目的の細胞に誘導したりすることによって、拒絶 反応を起こさずに臓器を移植する方法も考えられる。
[0039] 一方、体性幹細胞とは、体の中にすでにかたちづくられた組織の中から採り出され る分ィ匕する前の状態の細胞をいう。組織内には、その組織における特定の働きを担う 、すでに分ィ匕を終えた細胞が多数存在しているが、中にはそうした特定の働きを持つ 細胞へと分化する前の未分化細胞、すなわち幹細胞が混じって存在している。体性 幹細胞は、自らと同じ細胞を複製し、製造する能力を持つとともに、分ィ匕によって、そ れが存在して!/、た組織内のあらゆる個別細胞を作り出すことができる。
[0040] 特定の組織に分ィ匕することがわ力つているためにすでに多くの治療に活力され、白 血病などの治療に必要な骨髄移植に用いられる骨髄幹細胞などが代表的な例であ る。
[0041] したがって、上述したような機能を有する幹細胞を用いることによって、本発明を達 成することが可能である。本発明の好ましい実施態様では、 14日齢 (ED14)のマウ ス胎仔の下顎臼歯の歯胚力 間葉系細胞を採取し、培養した間葉系細胞と同種マウ スの ES細胞とを誘導因子の存在下で共に培養して、マウスの歯胚間葉系細胞と ES 細胞とのキメラ胚様体を作製した力 同種哺乳類において、上記したキメラ胚様体の 作製を導くものであれば、使用する幹細胞は ES細胞に限定されず、体性幹細胞、骨 髄幹細胞などの多分ィ匕能を有する、すべての幹細胞のいずれか一種を使用してよい
[0042] また、上記マウスの歯胚間葉系細胞と ES細胞とのキメラ胚様体を作製するために 使用される誘導因子は、下記の実施例でも詳述するが、ァクチビン (味の素）、骨誘 導因子 4 (bone morphogenetic protein—4、 BMP—4 ; SIGMA)、インスリン成 長因子 1 (insulin growth factor— 1、 IGF— 1； TOYOBO)、繊維芽細胞成長 因子 2 (fibroblast growth factor— 2、 FGF— 2 ; TOYOBO)及びトランスフォー ミング増殖因子 13 1 (transforming growth factor- β 1、 TGF— β 1； TO YOB O)を適切に使用することができる。
[0043] また、マウスの歯胚間葉系細胞とマウス ES細胞との共存培養によるキメラ胚様体の 好ましい作製方法は、下記の実施例にも詳述するが、以下の手法によってなされる。 すなわち、培養した細胞がシャーレ上を約 70〜80%覆った状態、つまり confluent growthになる前の歯胚間葉系細胞にマウス ES細胞をカ卩えて約 5日間培養し、当 該 ES細胞を十分に分化させる。このキメラ胚様体の作製過程において、マウスの歯 胚間葉系細胞とマウス ES細胞との細胞混合比は、約 2 : 1であり、具体的には、本実 施態様において培養した上記マウスの歯胚間葉系細胞 1. 7xl04個に対しマウス ES 細胞 8xl03個であった。共存培養 1日後に上記の誘導因子をカ卩えた MSCGM培地 を用い、 37°C、 5%CO下で上述のように計 5日間培養を行う。その後、トリプシンと E
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DTAの処理により細胞を回収してプラスチックフィルターを通してシングル化し、低 接着性の 96穴プラスチックプレートに播種し、次いで 24穴プラスチックプレートに播 種して誘導因子の存在下で培養して、マウス ES細胞とマウスの歯胚間葉系細胞との キメラ胚様体を作製する。
[0044] 次に、作製したキメラ胚様体をさらに培養することによって、歯を形成する方法を説 明する。上述の方法で作製したキメラ胚様体を 3次元マトリクス上にて培養する。例え ば、作製したキメラ胚様体を 1乃至 2x1乃至 2x1乃至 2mmのコラーゲン担体上で培 養し、上述した誘導因子を除いた血清培地で 3日間培養する。また、より好ましい培 養条件として、例えば、作製したキメラ胚様体を 1乃至 2x1乃至 2x1乃至 2mmのコラ 一ゲン担体上で培養し、上述した誘導因子存在下で 2日間培養し、誘導因子を除い た血清培地で 3日間培養する。
[0045] このように、作製したキメラ胚様体をさらなる培養によって処理することで生じた生物 材料は、図 1に示される歯の形成過程と同様に、担体上で石灰化が起こり、ォステオ ボンチンと骨シァロプロテイン、歯シァロプロテインの遺伝子と蛋白質を発現し、さら に、エナメル基質であるァメロジェニンとェナメリンの遺伝子と蛋白質を発現すること が分かった。
[0046] したがって、本実施態様において、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞とマウス ES 細胞とのキメラ胚様体を作製し、さらに当該キメラ胚様体を 3次元マトリックス上で培養 することによって、歯構成物質である象牙質とエナメル質のそれぞれの分泌細胞であ る、象牙芽細胞とエナメル芽細胞を同時に誘導できた。これにより、本発明では、マウ ス ES細胞が歯胚間葉系細胞により上皮系細胞 (エナメル芽細胞)へと分化すること が示され、歯の再生にはじめて成功したことが認識できる。
[0047] また、本発明に係る歯の形成方法によって得られた生物材料は、歯の生産、または 再生に利用することができる。
[0048] ここでいう、歯の生産とは、哺乳類の生体の内外において、新たに歯を作製すること をいう。また、歯の再生とは、虫歯などの疾患によって生じた歯の損傷等を、生体の 内外において回復させ、歯を再生させることをいう。すなわち、本発明に係る生物材 料は、いわゆる再生医療に利用可能である。
[0049] なお、ここではマウスを用いた実施態様を示した力 本発明は、ヒトを含めた哺乳類 全てにお 、て実施可能である。
実施例
[0050] 以下、実施例により本発明の方法にしたがって実施した具体例を更に詳細に説明 するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本発明の趣旨及 び範囲を逸脱しない限り、その細部については様々な態様が可能である。
[0051] まず、歯胚間葉系細胞系列の確立について説明する。
[0052] 14日齢（ED14)のマウス胎仔 7匹分の下顎臼歯の歯胚を取り出し、 Hanks液中で 洗浄し、氷上で 4時間デイスパーゼ処理をして組織を十分にほぐし、間葉系細胞塊を 分離した。 12, OOOrpmで 3分間遠心洗浄した後、それを lOcmfのプラスティックディ ッシュに移し 10%FBS (fetal bovine serum)加 a— MEM培地（Gibro社）で 37 °C、 5% CO下で 1日間培養した。翌日、培地を MSCGM培地（Chambrex社）に
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置換して、同様に 37°C、 5% CO下で培養を行った。以後、細胞がシャーレ上を約
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70〜80%覆った状態、つまり confluent growthになる前に継代培養して安定ィ匕 した間葉系細胞系列を作った。市販のマウス ES— D3細胞（American Type Cul ture Collection (ATCC)、米国）は、あらかじめ 0. 1%のゼラチンをコートした 25 mL培養用フラスコにフィーダ一細胞なしで播種し、未分ィ匕を維持しながら培養した。 培地は、 15% KSR(Gibco社）、 0. ImM j8—メルカプトエタノール（Sigma社）、 0 . ImM非必須アミノ酸（Sigma社）、 8mM L—グルタミン（Sigma社）、および 1, 00 OUZml白血病抑制因子（Lleukemia inhibitory factorゝ LIF； Chemicon社）を 含む KnockOut DMEM培地（Gibco社）を用い 1日おきに交換した。
[0053] 図 3左グラフに示したように、この細胞系列は、 20日間の培養を過ぎた時点で一時 的に分裂能力の低下が見られたが、 30日を越えた時点から再び活発に分裂を行な うようになり、以後、安定して継代培養できる細胞系列が得られた。図 3中央に見られ るように、 4週間培養した細胞（2継代）では、未分ィ匕マーカーであるネスチン (nestin )陽性細胞がおよそ 70%確認でき、歯胚上皮系細胞マーカーであるサイトケラチン 1 4 (cytokeratin 14)陽性細胞は認められなかった（図は示さな 、)。また、図 3右に 示すように、 8週間培養した細胞（7継代)でも、ネスチン陽性細胞（図は示さな ヽ）と、 別の未分ィ匕マーカーであるアルカリフォスファターゼ (ALP)陽性細胞が確認できた。 この結果、 70日以上継代培養した歯胚由来の間葉系細胞は、歯胚上皮系細胞を含 まず、かつ、未分化細胞を維持した細胞系列であることが示唆された。以下、この細 胞系列を MDU1と呼ぶ。
[0054] 次 、で、この細胞系列の特性を、遺伝子発現レベル（リアルタイム PCR法）と蛋白 質発現レベル (免疫染色法)で調べた。その結果、図 4左グラフに示すように、 MDU 1は 8週間培養細胞で 4週間培養細胞よりも SHHの遺伝子発現が増加し、歯シァロ プロテイン (DSP)、 ALP遺伝子の発現も亢進していた。また、図 4右の免疫染色像 からも、 8週間培養細胞は未分ィ匕マーカーである Oct3Z4とネスチン陽性細胞をそ れぞれ〜 1%と〜 70%維持し、間葉系マーカーであるビメンチンを発現、 SHH、 DS P陽性細胞と若干の AMG、 ENL陽性細胞が確認できた。これらの結果から、 MDU 1は継代によっても間葉系細胞の性質を強く維持し、未分化性を失わず、かつ、長期 培養実験により石灰化の傾向を示すことから象牙芽細胞への分化誘導能も維持して いることが分力つた。したがって、この細胞系列は、強い歯の誘導能を持つことが示 唆された。
[0055] なお、歯胚間葉系細胞系列を確立する試みと並行して、歯胚から分離した上皮系 細胞についても継代培養を試みた力 この細胞系は培養 5日目で増殖が止まり、継 代が不可能になったことから、安定した細胞系列はできにくいことが分力つた。その 理由として、上皮系細胞は間葉系細胞力 分離されると、分裂能力や非誘導能力を 急速に失うことが考えられた。すなわち、上皮系細胞の安定培養には間葉系細胞が 必須であることが考免られる。
[0056] 次に、マウス ES細胞と歯胚間葉系細胞系列とのキメラ胚様体の作成について説明 する。
[0057] 生体においては、歯胚の上皮系細胞と間葉系細胞との相互作用により歯が形成さ れることが分力つている。したがって、 in vitroで歯の再生機構を検討するためには 、安定して得られる歯胚由来の上皮細胞系列と間葉系細胞系列が必要であると考え られる。しかし、上に述べたように、歯胚上皮系細胞は単独では安定した細胞系列が 作りにくいことが明らかになった。また、これまで歯胚そのもの、歯胚上皮のみ、歯胚 間葉系細胞のみ、歯胚上皮と歯胚間葉系細胞との混合細胞群を移植し歯再生を試 みた実験が報告されているが、完全な歯が再生できたという報告はな力つた。発明者 は、歯胚の間葉系細胞は未分化細胞や上皮細胞支持活性を維持した状態で細胞 系列を作製できることから (例： MDU1)、歯胚上皮系細胞の代替として、マウス ES細 胞を利用することを試みた。
[0058] 図 5に示したように、細胞がシャーレ上を約 70〜80%覆った状態、つまり confluen t growthになる前の歯胚間葉系細胞にマウス ES細胞をカ卩ぇ 5日間培養し、 ES細 胞を十分に分ィ匕させた（図 5左)。細胞混合比は MDU1 1. 7xl04個に対しマウス E S細胞 8xl03個であった（図 5中央)。誘導因子非存在下で 1日共存培養をした後、 培地に種々の誘導因子を加えた MSCGM培地を用い、 37°C、 5% CO下で計 5
2 日間培養を行った。使用した誘導因子は、ァクチビン (味の素）、骨誘導因子 4 (bone morphogenetic protein— 4、 BMP— 4 ; SIGMA)、インスリン成長因子 1 (insul in growth factor— 1、 IGF— l ;TOYOBO)、繊維芽細胞成長因子 2 (fibroblas t growth factor— 2、 FGF— 2 ;TOYOBO)、トランスフォーミング増殖因子 j8 1 ( transforming growth factor- β 1、 TGF— β 1； TOYOBO)だった。その後ト リプシン一 EDTA処理（GIBCO)により細胞を回収してプラスチックフィルターを通し てシングル化し、低接着性の 96穴プラスチックプレート（Nunc社）に播種して 1日培 養し、次いで、低接着性の 24穴プラスチックプレート (Nunc社）に移して上記の誘導 因子の存在下で 4日間培養して、キメラ胚様体を作製した。つまり、この過程を説明 すると、歯胚間葉系細胞とマウス ES細胞との混合細胞を回収してシングルィ匕し、低 接着性 96穴プラスチックプレートに播種して 1日培養した時点で混合細胞は丸くなる 力 この混合細胞はまだ小さくて細胞数が十分ではないので、低接着性 24穴プラス チックプレートに移して栄養 (すなわち、血清培地と誘導因子)を十分に与えて大きく し、ほぼ 100〜200micro径のキメラ胚様体が作製された時点（すなわち、 4日間培 養)で終了する。
[0059] 次に、キメラ胚様体の 3次元マトリクス上の培養と生体マウスへの移植について説明 する。
[0060] 作製したキメラ胚様体を l〜2xl〜2xl〜2mmのコラーゲン担体（Collagen Spo nge Honeycomb™)上で、上記の誘導因子を除!、た血清培地で 3日間培養した。 コラーゲン担体に接着したキメラ胚様体は、ハ-カム構造をしたコラーゲン担体の梁 部分に接着し伸展していることが分力つた（図 5右)。
[0061] さらに、上記と同様のコラーゲン担体上で、別の培養条件を用いて、作製したキメラ 胚様体を上記の誘導因子存在下で 2日間培養し、誘導因子を除いた血清培地で 3 日間培養した。この培養条件によって、コラーゲン担体に接着したキメラ胚様体は、 ハ-カム構造をしたコラーゲン担体の梁部分に良好に接着し伸展していることが分か つた。キメラ胚様体を吸着したコラーゲン担体の一部は、そのまま固定してパラフィン 包埋し組織染色を行って観察し、残りは生体マウスの頭蓋上皮下および背部筋膜下 に移植して 42日後に取り出しパラフィン包埋試料、電顕試料を作製した。以後、コラ 一ゲン担体の梁部分をスキヤフォルド、空間部分をマトリクスと呼ぶ。
[0062] はじめに、図 6に示すように、リアルタイム PCR法でキメラ胚様体がどのようなマーカ 一遺伝子を発現しているかを検討した。対照は、各種誘導因子を添加せず、マウス E S細胞を含まない胚様体 (control (— ES) )と各種誘導因子を添加せず、マウス ES 細胞を含むキメラ胚様体 (control (+ES) )であり、マーカー遺伝子発現の割合を、 c ontrol (-ES)に対する相対値として表示した。その結果、アルカリフォスファタ一ゼ（ ALP)に関しては、発現が、いずれもほぼ一定のレベルで推移し、歯胚間葉系細胞 内の未分ィ匕細胞の数はほぼ一定に保たれて 、る可能性が考えられた。ァメロジェ二 ン（AMG)、ェナメリン（ENL)、歯シァロプロテイン（DSP)、ソニックヘッジホッグ（S HH)に関しては、 TGF- β 1添カ卩によりもっとも発現が増加し、 FGF2によっても A MGの発現上昇が確認された。その他、ァクチビン、 BMP4、 IGF1添加試料に関し ても、マーカー遺伝子の発現上昇が観察された。また、歯胚間葉系細胞に ES細胞を 加えただけでも、これらの遺伝子の発現上昇が見られた。この結果から、キメラ胚様 体では、象牙芽細胞形成だけでなぐエナメル芽細胞形成も同時に進んでいることが 示唆された。
[0063] 次に、同じ試料で象牙質化 (石灰化)の程度を、カルシウム沈着特異的組織染色 (V on Kossa— Kernechtrot法）で調べた。この染色法では、細胞はピンク色に、カル シゥム沈着部位は褐色に染色される。対照はキメラ胚様体に誘導因子を加えないも のである。その結果、対照も含め、どの試料でも、コラーゲン担体のスキヤフォルド〖こ 、カルシウムの沈着が生じていることが分かった。その中でも、特に、 IGF— 1を作用 した試料は強くカルシウム沈着が生じることが分力つた。生体内でも歯形成はコラー ゲン繊維の石灰化力 始まることが知られて！/、る。
[0064] 同じ試料を、生体マウスの頭蓋上皮下および背部筋膜下に移植し、 42日間経過し た後に取り出して、カルシウムの沈着の有無を、 von Kossa— Kernechtrot染色法 とァリザリンレッド S染色法を使って調べた。なお、ァリザリンレッド S染色法では、カル シゥムは赤色に染色される力 細胞は染色されない。 [0065] 調べた試料の中でも特に IGF— 1を作用した試料は、コラーゲン担体のスキヤフォ ルドに沿って強ぐまた、マトリクス内部にもカルシウム沈着が起こっていることが確認 された。
[0066] 次に、免疫染色法でマーカー蛋白質の発現を調べた。
[0067] 図 9の結果から、石灰化したコラーゲン担体のスキヤフォルドは、どの試料でも染色 されず、コラーゲン担体のマトリクスがァメロジェニン、ォステオポンチンまたは骨シァ 口プロテインで染色されていた。また、マトリクス内には細胞質が無機質で埋まり核の みが見えるような細胞も観察された。対照では、石灰化したコラーゲン担体のスキヤフ ォルドに沿ってァメロジェニン、ォステオボンチン、が染色された力 マトリクスはいず れも殆ど変化が見られな力つた。ァクチビン、 BMP4、 TGF- β 1を作用させたコラ 一ゲン担体のマトリクスでは、ァメロジェニンとォステオポンチンが染色され、骨シァロ プロテインの染色は見らな力つた。一方、 IGF—1を作用させたコラーゲン担体では、 マトリクス全体がァメロジェニンとォステオボンチンで強力に染色され、骨シァロプロテ インではわずかに染色されていた。これらの結果から、コラーゲン担体マトリクスは骨 様ではなぐ象牙質様の石灰化が起こっていることが明らかになった。
[0068] 上述したように、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞を継代培養した細胞系列を作 成し、それにマウス ES細胞を加えて混合培養したのち、細胞を単一化（つまり、バラ ノ ラに）して、低接着性プラスチックプレートに播種しキメラ胚様体を作製した。このキ メラ胚様体をコラーゲン担体上で培養すると、接着したキメラ細胞群はコラーゲン担 体のスキヤフォルドを石灰化し、マトリクス部分はァメロジェニン陽性でエナメル基質 形成がみられた。さらに遺伝子解析からもァメロジェニン、ェナメリン、歯シァロプロテ イン、ォステオボンチン、あるいは骨シァロプロテインの遺伝子発現の上昇が確認さ れた。また、免疫染色の結果から、これらの蛋白質が実際に発現していることが明ら 力になった。したがって、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞とマウス ES細胞のキメラ 胚様体から、歯構成物質である象牙質とエナメル質の両方の分泌細胞 (象牙芽細胞 、エナメル芽細胞）を誘導することができた。この系では、マウス ES細胞は、歯胚間葉 系細胞により上皮系細胞 (エナメル芽細胞)へと分ィ匕することが示唆された。また、こ の系に対して適切な誘導因子 (FGF2や TGF— β 1など）を作用させると、歯への分 化が強く促進された。
[0069] なお、本実施例では、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞とマウス ES細胞のキメラ 胚様体から、歯構成物質である象牙芽細胞と、エナメル芽細胞とを誘導することがで きたが、本発明はマウスに限定したものではなぐ哺乳類一般に対して実施可能であ り、ヒトを含めた哺乳類の歯の再生に適用可能である。また、本発明で使用する未分 化細胞は、 ES細胞に限ったものでなぐすべての幹細胞が本発明に対して適用可 能である。
[0070] 以上本発明の好ましい実施例について詳述した力 本発明はかかる特定の実施形 態に限定されるものではなぐ特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨の範囲内 において、種々の変形 ·変更が可能である。
産業上の利用可能性
[0071] 哺乳類の幹細胞を活用して象牙質とエナメル質を再生することができれば、虫歯な どで削られた穴にこれらの細胞群を詰め、密封して歯再生を行なう再生医療や、抜 歯部分に in vitroで再生した象牙芽細胞とエナメル芽細胞を持った生物材料、つま り歯様構造体形成の基質を分泌する細胞群を縫合して完全な歯の再生を行なうなど 、内側力 生体の再生機能を活用する再生医療に適用する方法が開発できる可能 性がある。その他、歯の疾患を詳細に診断するための診断学への応用や評価系（ァ ッセィ系）、医薬品開発の実験に供する可能性など活用範囲は広いと考えられる。し たがって、本発明は、上に述べたすべての可能性を拓くものであり、その実用化の見 通しと産業上の利用価値は極めて高 、。
[0072] 本国際出願は、 2005年 7月 29日に出願した日本国特許出願 2005— 221668号 に基づく優先権を主張するものであり、 2005— 221668号の全内容を本国際出願 に援用する。

Claims

請求の範囲
[1] 同種哺乳類の未分化細胞と歯胚間葉系細胞とを誘導因子の存在下で共に培養し てキメラ胚様体を作製する方法であって、前記誘導因子は、ァクチビン、骨誘導因子
4、インスリン成長因子 1、繊維芽細胞成長因子 2及びトランスフォーミング増殖因子 β 1であることを特徴とするキメラ胚様体を作製する方法。
[2] 前記哺乳類は、すべての哺乳類力 選ばれる一種であることを特徴とする請求項 1 に記載のキメラ胚様体を作製する方法。
[3] 前記未分ィ匕細胞は、すべての幹細胞力も選ばれる一種であることを特徴とする請 求項 1に記載のキメラ胚様体を作製する方法。
[4] 請求項 1乃至 3の 、ずれか一項に記載の方法で作製したキメラ胚様体。
[5] 請求項 4に記載のキメラ胚様体を利用する培養方法。
[6] 請求項 1乃至 3のいずれか一項に記載の方法と、
請求項 5に記載のキメラ胚様体を利用する培養方法と、
からなる歯の形成方法。
[7] 前記培養方法は、ァクチビン、骨誘導因子 4、トランスフォーミング増殖因子 β ΐ、ィ ンスリン成長因子 1又は繊維芽細胞成長因子 2のいずれも存在しない血清培地中の
3次元マトリクス上で 3日間培養することを特徴とする請求項 6に記載の歯の形成方法
[8] 前記培養方法は、ァクチビン、骨誘導因子 4、トランスフォーミング増殖因子 β ΐ、ィ ンスリン成長因子 1又は繊維芽細胞成長因子 2の存在下で 2日間、その後、前述の いずれの因子も存在しない血清培地中の 3次元マトリクス上で 3日間培養することを 特徴とする請求項 6に記載の歯の形成方法。
[9] 請求項 6乃至 8の ヽずれか一項に記載の歯の形成方法により得られる生物材料。
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