WO2007009812A1 - Auflösungsgesteigerte lumineszenz-mikroskopie - Google Patents

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WO2007009812A1
WO2007009812A1 PCT/EP2006/007212 EP2006007212W WO2007009812A1 WO 2007009812 A1 WO2007009812 A1 WO 2007009812A1 EP 2006007212 W EP2006007212 W EP 2006007212W WO 2007009812 A1 WO2007009812 A1 WO 2007009812A1
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WO
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sample
radiation
excitation radiation
state
illumination
Prior art date
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PCT/EP2006/007212
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English (en)
French (fr)
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Ralf Wolleschensky
Michael Kempe
Original Assignee
Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Carl Zeiss Jena Gmbh
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Publication date
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the invention relates to the resolution-enhanced luminescence microscopy and more particularly to a method in which a luminescent sample to be examined is illuminated with excitation radiation and an image of the sample excited for luminescence is obtained.
  • the invention further relates to a microscope for the resolution-enhanced luminescence microscopy of a sample, the means for exciting luminescence which irradiate excitation radiation in the sample and means for obtaining an image of the excited sample.
  • the invention further relates to a laser scanning microscope with an illumination beam source and a detection beam path, the radiation guided in a sample and / or backscattered radiation along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided, via which of the illumination beam source emitted illumination radiation is directed in an illumination beam path to the sample, wherein the beam splitter does not pass to the sample specularly reflected illumination radiation to the detector device and arranged for this purpose in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored.
  • a classical field of application of light microscopy for the investigation of biological preparations is luminescence microscopy.
  • certain dyes so-called phosphors or fluorophores
  • the sample is illuminated with excitation radiation and the luminescence light stimulated thereby is detected with suitable detectors.
  • a dichroic beam splitter in combination with block filters is provided for this purpose in the light microscope, which split off the fluorescence radiation from the excitation radiation and enable separate observation.
  • the representation of individual, differently colored cell parts in the light microscope is possible.
  • several parts of a preparation can be colored simultaneously with different, specifically attaching to different structures of the preparation dyes. This method is called Multiple luminescence. It is also possible to measure samples which luminesce per se, ie without the addition of dye.
  • Luminescence is understood here, as is common practice, as a generic term for phosphorescence and fluorescence, so it covers both processes.
  • LSM laser scanning microscopes
  • a confocal detection arrangement this is called a confocal LSM
  • multiphoton microscopy a nonlinear sample interaction
  • An optical section is obtained, and the recording of several optical sections at different depths of the sample then makes it possible, with the aid of a suitable data processing device, to generate a three-dimensional image of the sample, which is composed of the various optical sections.
  • Laser scanning microscopy is thus suitable for the examination of thick specimens.
  • luminescence microscopy and laser scanning microscopy is also used in which a luminescent sample is imaged at different depth levels by means of an LSM.
  • the optical resolution of a light microscope including an LSM, diffraction-limited by the laws of physics.
  • special lighting configurations such as 4Pi or standing wave field devices.
  • the resolution especially in the axial direction compared to a classic LSM can be significantly improved.
  • the resolution can be further increased to a factor of up to 10 compared to a diffraction-limited confocal LSM.
  • FIGS. 1 a / b show such a method, as described, for example, in US Pat. No. 5,866,911.
  • work is done to increase the resolution with a two wavelengths having light radiation.
  • the light radiation of one wavelength is focused as an excitation light beam 1 on the sample to be measured by means of an objective and there stimulates luminescence, here fluorescence.
  • the illustration in FIGS. 1a / b shows only the one-dimensional case for the sake of simplicity.
  • the increase in the spatial resolution now takes place in that a light beam 2 with the other wavelength in subregions depopulates the excited by the excitation light beam fluorescent state.
  • this light beam is also called "depopulation radiation.”
  • the irradiation takes place, for example, so that the main maximum of the depopulation light beam 2 and the main maximum of the excitation light beam 1 partially overlap, as can be clearly seen in Fig. 1a.
  • a reduced volume 3 emits fluorescence, as can clearly be seen in Fig. 1b.
  • the resolution is consequently increased by this volume reduction.
  • Figures 2a-c show three possible mechanisms by which such depopulation can occur.
  • STED stimulated emission stimulation
  • the excitation radiation is in the fluorophore of the level S1 (arrow A).
  • the depopulation of the thus excited level S1 is accomplished in the direction of the basic level SO by light radiation having a wavelength in the range of the fluorescence wavelength.
  • Arrow SE shows this stimulated emission whose wavelength corresponds to that of luminescence (arrow F) almost identical.
  • the excitation wavelength is shorter wavelength than the amount of de-population radiation by the amount of stoke shift.
  • the increase in resolution according to this approach therefore requires two different light sources, as evidenced by the state of the art in the form of DE 4416558 C2.
  • Fig. 2b illustrates another possible process of depopulation for the excited level S1 (arrow A) by excitation to an even higher level S2 (arrow A +) which can no longer emit luminescence.
  • This lifting is referred to in English as Excited State Absorption, which is why this procedure is also evidenced by the abbreviation ESA.
  • ESA Excited State Absorption
  • a corresponding description of this process can be found, for example, in US Pat. No. 6,634,432.
  • a light source with a lower energy and thus a longer wavelength is used for depopulation in the ESA process , as a suggestion. So you need two different light sources.
  • Another method for depopulation represents for fluorescence the so-called reversible saturable optical fluorescence transition, which is described for example in DE 10325460 A1 and illustrated in FIG. 2c.
  • This approach uses for high-resolution spatial imaging a dye which is repeatedly converted by means of a switching beam 4 from a first state 5, in which fluorescence takes place, into a second state 6, in which the dye is not fluorescent, wherein the dye from the second State 6 can return to the first state 5, as Fig. 2c illustrates.
  • the sample with the dye is transferred in partial areas with the switching beam 4 in the second state 6, wherein a defined region of the sample is omitted. With an excitation beam 1 then fluorescent light 7 is excited and then registered.
  • the fluorescent light 7 comes only from sample volumes that were not previously applied to the switching beam 7.
  • the volume from which fluorescent light 7 is emitted smaller than it allowed the resolution of the excitation beam 1 and the sharpness of the zero point of the switching beam 4 a priori.
  • Fig. 3 shows a known device using one of the three mentioned resolution enhancement methods, in the example of Fig. 3 the STED process.
  • An excitation beam source 8 generates an Airy distribution in the sample 10, with which the sample is transferred from the basic level SO to the excited state S1.
  • the depopulation of the state S1 is effected by means of a depopulation light source 11 which, using a phase plate 12, has a donut- or torus-shaped beam distribution 13 in the sample 10.
  • the luminescent radiation of the non-depopulated, i.e. non-depleted dye molecules are detected by a detector 14.
  • the depopulation increases the resolution of the microscope beyond the diffraction limit resulting from the Airy distribution. This is expressed by a reduced point spread distribution 15 of the high-resolution microscope compared to the conventional microscope 16.
  • the object in a laser scanning microscope is that the illumination radiation, which is excitation radiation in the mentioned case of fluorescence microscopy, must be separated from the radiation to be detected, since in most cases the
  • Illumination radiation and the detection radiation are passed through a common lens, i. the illumination radiation is incident on the lens, with which the
  • Detection radiation is passed to the detector. It is therefore customary to couple the illumination radiation via a beam splitter, which ensures that reflected back to the sample illumination radiation or not to the lowest possible proportion to
  • Beam splitter is unnecessarily attenuated.
  • a spectrally independent approach is DE 10257237A1.
  • the laser scanning microscope of the type mentioned therein uses the fact that radiation coming from the sample is usually emitted incoherently, ie not directionally, to the sample, whereas specularly reflected excitation or illumination radiation couples in a directed manner into the detection beam path.
  • the DE 10257237A1 therefore proposes in a Pupille the illumination beam path to insert a beam splitter, which is transparent at the piercing point of the optical axis and otherwise mirrored. At the same time, the illumination radiation is focused precisely on this transparent spot.
  • laser scanning microscopy is particularly suitable for examining biological samples.
  • the amount of time it takes to take an image is naturally a significant factor in biological samples, especially when examining living samples or analyzing fast-paced processes. It is therefore constant efforts in laser scanning microscopy to increase the image acquisition speed.
  • microscope systems have recently been described which do not scan a sample with a dot-like light spot (i.e., not a confocal dot scanner), but use a line-shaped illumination and scan (i.e., a confocal slit).
  • DE 10257237A1 provides a suitable beam splitter in which a line-shaped region in the form of a narrow rectangle is then mirrored on the beam splitter.
  • the invention is therefore based on the other object of a laser scanning microscope of the type mentioned in such a way that a fast image recording is possible without the associated with a slit depth resolution restriction.
  • the first object is achieved according to the invention with a resolution-enhanced luminescence microscopy method in which a sample is excited by the emission of excitation radiation for the emission of specific luminescence radiation and an image of the luminescent sample is obtained, wherein the luminescent sample from a first luminescence state in which the excitability for emission of the determined luminescence radiation increases with increasing excitation radiation power up to a maximum value which is associated with an excitation radiation power threshold value, is convertible to a second luminescence state in which the sample is reduced from the first state Excitability for emission of the particular luminescence radiation, wherein the sample is brought into the second state by irradiation of excitation radiation power above the threshold, the sample is placed in partial areas in the first state and in adjacent partial areas in the second state by the Irradiation of excitation radiation with an excitation radiation distribution takes place, which has at least one local power maximum above the threshold value and at least one local, local power minimum below the threshold value, the image of the luminescent sample sample areas in the first one n
  • the first object is further achieved with a microscope for resolution-enhanced luminescence microscopy, which has means for exciting luminescence, the excitation radiation irradiate the sample and thus stimulate the emission of certain luminescence in the sample, means for obtaining an image of the luminescent sample, wherein the excitation means irradiate the excitation radiation with a particular excitation radiation distribution having at least a local power maximum that is above a threshold and at least one local local power minimum that is below the threshold, the threshold separating two luminescent regions of the sample a first state region present at excitation radiation powers below the threshold value, in which the excitability for emission of the determined luminescence radiation increases with increasing excitation radiation power up to a maximum value which reaches the threshold value rd, rises, and a second at and / or after excitation radiation powers above the threshold state condition in which the sample has a reduced relative to the first region excitability for emission of the determined luminescence, and wherein the means for image acquisition sample areas in the first region, which were i
  • a sample is used or the microscope is designed for a corresponding sample whose luminescent material can be located substantially in two states.
  • a first state which occurs when the excitation radiation power is irradiated below the threshold value and which is achieved by means of the excitation, the material emits luminescent radiation whose power as a rule increases with the excitation radiation power.
  • a second state which is present when the excitation radiation power is irradiated above the threshold value, either no or reduced luminescence takes place.
  • changed absorption properties and / or luminescence radiation emission with other optical properties than in the first state for example, with other spectral composition, polarization or lifetime, take place.
  • sample regions are now placed in the first state region (or state for short) and other sample regions in the second state region (or state for short).
  • the local proximity of the regions which have been brought into the first state that is to say to the excitation radiation power below the threshold value, and regions in the second state, ie regions which are irradiated with excitation radiation power above the threshold value, permits a significant increase of the resolution with respect to the excitation radiation distribution ,
  • the solution according to the invention thus achieves the increase in resolution by means of a nonlinear luminescence characteristic which describes the emitted luminescence power as a function of the excitation radiation power and has a local maximum. It is advantageous, but not mandatory, if the characteristic has relatively steep flanks on both sides of this maximum. Also, a multiphoton process can be used for excitation.
  • the microscope is tuned to the sample because the incident excitation radiation distribution takes into account the threshold for the line.
  • the sample areas which are illuminated with excitation radiation power above the threshold value were previously excited "normally" (as is required, for example, in the case of the STED or ESA approach) if a sample is used, which shows after irradiation with lying above the threshold excitation radiation power permanently or at least for a certain period of time, a significantly reduced or even vanishing excitability.
  • a sample or dye which does not luminesce at an excitation radiation power above the threshold, emits luminescent radiation having different properties than the particular luminescent radiation, and / or has altered excitation radiation absorption characteristics leading to decreased luminescence.
  • the increase in resolution is thus achieved according to the invention in that no or only little luminescence radiation contributes to image generation from sample areas which are illuminated with excitation radiation intensity lying above the threshold value.
  • this reduced contribution to the image takes place in different ways. If the sample no longer shows any luminescence, luminescence radiation is no longer detected from sample regions which are in the second state.
  • a corresponding optical filtering for example with regard to spectral composition or polarization, will be used to hide.
  • a temporal filtering achieves a blanking out.
  • a sample or dyes is used or the microscope according to the invention tunes it, which can be reset from the second state by irradiation of a reset radiation having other optical properties than the excitation radiation back to the (original) first state.
  • the microscope has suitable means for this purpose. This means that the second state is an at least largely reversible state. By irradiation of excitation radiation power above the threshold value of the luminescent image hidden areas can then be excited after irradiation of the reset radiation back to normal luminescence in the first state.
  • Such a further developed method or microscope designed in this way is then suitable for applications in which different regions of a sample are to be imaged several times.
  • a sample or a dye is used, the or the second state, ie after illumination with excitation radiation above the threshold, reduced sensitivity for excitation radiation shows, by irradiation of a reset radiation, the other optical Properties as the excitation radiation, the sensitivity reduction is at least partially reversed (and the first state is restored).
  • At least the sample areas which are illuminated above the threshold excitation radiation power are irradiated with reset radiation. It is important in this case that the reset radiation, which transfers the sample back into the first state, does not contribute anything to effecting the increase in resolution, ie it can also be coupled into the sample in a very coarse or not at all structured manner.
  • the sample which can be returned to the first state in terms of its luminescence properties permits imaging by scanning.
  • the sample can be scanned, for example, with a spot, line or multispot area, for example by a scanner device.
  • Resetting radiation is then radiated in each case between two scanning steps in order to be able to irradiate again excitation radiation below and above the threshold value during the new scanning step.
  • an increased resolution is achieved in each scanning step, which overall provides a significantly resolution-enhanced image.
  • the irradiation of the excitation radiation distribution thus produces a local structure of the fluorescence radiation. This is usually symmetrical with respect to the excitation radiation distribution. If one wishes to have a certain fluorescent surface form, e.g. a point, then advantageously parts of the fluorescent sample are hidden. This is possible without affecting the resolution of the desired surface shape, as one can provide sufficient spacing between adjacent fluorescent regions.
  • a principle diffraction-limited illumination which may be punctiform, may be radially symmetric or a central maximum, as the known Airy function may have, but need not.
  • the excitation radiation distribution is diffraction-limited.
  • the diffraction-limited excitation radiation distribution it is particularly advantageous to use a toroidal distribution which, in the core region of the toroidal distribution, has an excitation radiation power above the threshold value, in edge regions below the threshold value.
  • the Toms one then obtains a point-like luminescence distribution, which is clearly smaller than it would be a diffraction-limited Airy disk. Since, of course, for the reasons of symmetry mentioned above, sample areas lying at the outer edge of the torus are also illuminated with excitation radiation power lying below the threshold value, luminescence radiation is also excited there.
  • a planar, structured illumination wherein the surface can also be formed as one or more lines diffraction-limited in one direction. Subareas of the illuminated area have an excitation radiation power and other subareas have an excitation radiation power below the threshold value.
  • Such a surface illumination makes it possible to rasterize a larger sample very quickly.
  • a flat structured sample illumination in particular a strip or cross lattice in question.
  • sample areas in the second state may still show some residual luminescence. This can either be due to the sample itself, or through
  • Sample areas for example by diffusion.
  • the sample itself may e.g. Disturbing autofluoresce or contain other dyes that are not in a second, reversible
  • this residual luminescence can be suppressed by a suitable threshold in the detection.
  • the excitation radiation is intensity-modulated according to a reference frequency either in sample areas which are placed in the second state or in sample areas which remain in the first state, and this reference frequency in the detection of the luminescence radiation by way of the lock-in technique recycle.
  • the microscope has a modulator and a lock-in amplifier connected downstream of the luminescence detector. This then separates the modulated signals and suppresses the unmodulated signals, which allows a high-resolution detection even in the said residual luminescence, without the peak level of the useful signal decreases. As a result, the modulated signals contribute fully to the high-resolution image.
  • An alternative way of suppressing residual luminescence is a difference method in which two images are subtracted from each other. A first image is recorded with excitation radiation power below the threshold value, a second image with excitation radiation power above the threshold value. The difference the separation between the two images causes the residual luminescence.
  • Other possible approaches for the suppression of the residual luminescence use further properties of samples or dyes used in variants of the invention, for example the evaluation of different Lumineszenzlebensdauem in the first or second state, the use of different optical properties of the luminescence in the first or second state above
  • sample parts that lie outside the focal plane to be detected are hidden in order to increase the depth of field. This simultaneously decouples the axial from the lateral resolution.
  • the sample is first transferred unstructured to the second state and then reset only in the focal plane. The same achieves a corresponding deep structuring of the excitation radiation intensity, with a minimum in the focal plane.
  • the aforementioned microscope according to the invention realizes in advantageous embodiments, one or more of the above-mentioned developments. Since the excitation radiation is used both to excite the luminescence and to prevent or reduce luminescence, it is advantageously possible to provide a single excitation radiation source which emits the excitation radiation and downstream of which is a minimum, preferably variable, beam profile Depth, imposes, with the minimum power below the threshold.
  • the second object is achieved according to the invention with a laser scanning microscope with an illumination beam source and a detection beam path, the radiation in a sample and / or backscattered radiation along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided on the illumination of the beam source emitted illumination radiation is directed in an illumination beam path to the sample, wherein the beam splitter does not pass to the sample specularly reflected illumination radiation to the detector device and to do so in a pupil of the
  • Illuminating beam path is arranged and partially mirrored, solved, in which the
  • Beam splitter has a lying in the detection beam path beam splitter surface, the three
  • Piercing point of the optical axis lie, and in which the illumination beam source generates a number of points corresponding to the number of partial beams and this on the points of
  • a laser scanning microscope is provided with an illumination beam source and a detection beam path which guides radiation excited and / or backscattered in a sample along an optical axis to a detector device and in which a beam splitter is provided via the illumination radiation emitted by the illumination beam source is directed to the sample in an illumination beam path, wherein the beam splitter on the sample does not pass mirroring reflected illumination radiation to the detector device and arranged in a pupil of the illumination beam path and partially mirrored, wherein the beam splitter has a lying in the detection beam path reflecting beam splitter surface which at least three Is not mirrored points for the illumination radiation, which lie on the beam splitter surface on a circle around the piercing point of the optical axis, and the illumination beam source one of the score
  • the invention achieves highly efficient dot group generation by means of a simple construction.
  • the beam splitter is formed so that the sample is illuminated with a point group in the form of a pattern generated by interference.
  • This allows parallel illumination of multiple points and also parallel scanning of these simultaneously illuminated points when the detector device performs multi-point detection on the illuminated spots.
  • a sampling rate multiplied by the number of dots is obtained without affecting the depth resolution.
  • the illumination (in fluorescence microscopy, excitation) of the sample with the regular dot group pattern is made according to the present invention utilizing an interference effect, so that the number of illumination rays provided by the illumination source is much smaller than the numbers of illumination spots in the regular pattern.
  • the interference effect only requires at least three reflective dots / transmitting holes on the beam splitter, onto which the illumination radiation is focused, so that at least three illumination beams are coupled in at the beam splitter.
  • This number of illumination beams (in this specification the term "beam” is used synonymously for a corresponding beam) can be easily generated.
  • the illumination beam source comprises a laser emitting a laser beam and a divider device. which divides the laser beam into the at least three partial beams and focuses on the points / holes by means of an optical device.
  • the number of reflective or transmissive points is not limited to three. It is also possible to use more points which should be distributed as equidistantly as possible or equidistant on the circle or along the circumference, but which must be disjoint. At four points, these may be e.g. lie at the corners of a square, in the center of which the puncture point is located.
  • the microscope according to the invention with the beam splitter which effects the illumination by utilizing the interference achieves, as already mentioned, a high scanning speed by parallelization of the illumination and possibly detection.
  • the requirements for the scan mechanism required for scanning can be drastically reduced since it is only necessary to perform a shift within a period of the periodic dot group pattern for scanning the image area.
  • the scanning device if it is designed, for example, as an optical scanner acting in the beam path, then only has to achieve a comparatively small deflection angle. This matches the scanning speed as well as simplifications of apparatus.
  • the interference-related generation of the illumination point group pattern makes it possible to easily adjust the brightness of the light spots with respect to the dark areas surrounding the light spots, namely by varying the intensity of respectively diagonally opposite partial beams.
  • suitable means for variation which are arranged upstream of the beam splitter in the illumination direction, and are formed for example in the form of adjustable attenuation elements.
  • the number of bright spots in the dot group pattern depends exclusively on the illuminated area on the sample, if in the illumination beam path substantially an image of the pupil, in which the beam splitter is arranged, is made on the sample.
  • the illuminated area of the sample and thus the number of sample points can then be effected simply by means for the focal length variation of the image between the beam splitter and the sample. In other words, means of changing the of the optical image
  • the captured field size automatically also varies the number of illumination points that arise on the sample due to the interference.
  • Parallel detection of the simultaneously illuminated spots on the sample increases the image acquisition speed.
  • Such a parallel scan can be achieved in a particularly simple manner if the detection beam path ends in a matrix detector, which may optionally be preceded by a pinhole mask tuned to the illumination pattern.
  • the spatially resolving elements of the matrix detector can also assume the function of the pinhole mask.
  • the reflective elements of the beam splitter must only reflect for illumination radiation, not for detection radiation.
  • the beam splitter can therefore also be formed dichroic.
  • the dot pitch in the dot group pattern can be adjusted via the distance of the foci to the beam splitter, ie over the circle radius.
  • FIGS. 1a and 1b show location-dependent power distributions for prior art methods
  • 2a-2c are diagrams for various prior art dissolution enhancement methods
  • Fig. 6a / b one- or two-dimensional power distributions, as obtained in the resolution increase according to a first and second method form
  • Fig. 7 is a representation similar to Fig. 6a / b for a third method form
  • FIG. 10 shows a power distribution similar to FIG. 6a to illustrate the mode of operation of the microscope of FIG. 9,
  • FIG. 1a / b shows a characteristic similar to FIG. 4 and a power distribution to illustrate a second resolution-enhanced microscope;
  • 13 is a schematic of a third resolution enhanced microscope
  • 14 is a schematic diagram of the operation of the third microscope
  • FIG. 16a a distribution of the excitation or reset radiation in a pupil of the fourth microscope
  • FIG. 16b a multispot distribution realized with the fourth microscope
  • FIG. 18 shows a distribution of the excitation or reset radiation in a pupil of FIG
  • FIG. 19 shows a schematic view of a laser scanning microscope
  • FIG. 20 shows an alternative embodiment of an illumination source for the microscope of FIG
  • Figure 21 is a plan view of a beam splitter of the microscope of Figure 19 and
  • FIG. 22 shows an illumination pattern on the sample effected by the microscope of FIG.
  • FIG. 4 shows a fluorescence characteristic curve 17 for a dye which is used according to the invention.
  • This fluorescence characteristic 17 reproduces the power L of the emitted fluorescence radiation F as a function of the power L of the excitation radiation A.
  • the characteristic 17 increases largely linearly, at least monotonically, up to a maximum 18 and then drops above a threshold value 19 for the excitation radiation power again. Visible are two state regions, each of which lies to the left and to the right of the threshold value 19 or the maximum 18. If an excitation radiation power is irradiated below the threshold value 19, the Dye primarily in a first state 5. In this he can emit fluorescence radiation.
  • Dye molecules in the second state 6 either can not fluoresce, emit fluorescence radiation with altered optical properties, and / or have an altered absorption property compared to the first state 5.
  • the altered optical properties for fluorescence emission or absorption may relate to the spectral composition, the polarization and / or the lifetime of the fluorescence radiation.
  • the invention now uses the characteristic curve 17 such that the irradiation of the excitation radiation A only a part of the sample in the first state region (or short first state) 5, another part of the sample but in the second state region (or short second state) 6 brings. Areas that were / are illuminated with excitation radiation power above the threshold value 19 thus emit only certain fluorescence radiation. It is advantageous if the second state 6 is a reversible state. This means that at least after a certain time or after active action, a dye once irradiated with excitation radiation power above the threshold value 19 again shows the properties of the first state 5.
  • Dronpa is the substance designated as Dronpa, which is described in R.
  • the dye is available from Amalgaam, Woburn, Massachusetts, USA, under the name Dronpa-Green, Code No. AM-V0071
  • Dronpa can be excited at a wavelength of 488 nm, and after excitation into the second state 6 by radiation at a wavelength of 405 nm again in the first state 5 are returned.
  • the use of the dye with the characteristic curve of FIG. 4 or a corresponding characteristic leads to a significant increase in the resolution.
  • only radiation having a wavelength is irradiated, and only this radiation contributes to the resolution.
  • the switching back can be achieved by irradiation of a reset radiation R, which is, however, irrelevant to the increase in resolution, the embodiments in which the dye does not spontaneously return to the first state 5.
  • the excitation radiation A also brings about the prevention of fluorescence or depopulation (second state 6).
  • the dye molecules are rearranged from the first state to the second state.
  • the two states have different optical fluorescence properties from each other.
  • the high-resolution fluorescence image can be obtained immediately, wherein high-resolution refers to the optical resolution of the excitation radiation A.
  • a reset for example by means of a reset radiation R, which has different optical properties from the excitation radiation A, is actively accomplished.
  • the corresponding scheme is shown in FIG. 5.
  • Sample areas B2 in the second state 6 can no longer efficiently fluoresce, especially if an excitation radiation power clearly above the threshold value 19 was used.
  • fluorescence refers to fluorescence radiation with certain properties, so it is quite possible that fluorescence radiation is emitted even in the second state 6, but with different properties than in the first state 5. Either the absorption properties change in the second state / and the fluorescence properties of the sample.
  • Areas B1 of the sample remaining in the first state 5 continue to emit the same fluorescence radiation F after irradiation of excitation radiation A. Irradiation of reset radiation R (in FIG. 5 this process is illustrated by a corresponding arrow) brings the entire sample P back into the first state 5, reverses the division into two differently fluorescent sample regions B1 and B2.
  • sample areas B1 which are in the first state 5, and sample areas B2, which are in the second state 6, now enables the emission of fluorescence radiation F to a volume of the sample P which is smaller than the original volume illuminated with excitation radiation A.
  • fluorescence radiation F to a volume of the sample P which is smaller than the original volume illuminated with excitation radiation A.
  • FIGS. 6a and 6b show two procedural forms of how the excitation radiation distribution may look to increase the resolution. Both figures show on the left a one-dimensional section through the excitation radiation distribution or fluorescence radiation distribution. On the right in each case the two-dimensional image of the fluorescence radiation distribution can be seen in plan view.
  • a punk-shaped distributed excitation radiation A is irradiated.
  • the distribution here is a diffraction-limited Airy distribution.
  • fluorescence radiation F is excited in the dye with an ellipsoidal donut distribution, which is represented in the two-dimensional image as a laterally fluorescent, circular ring.
  • Only the sample areas B1 fluoresce. Axially is a fluorescent elliptical ring. This sample area B1 is smaller than the diffraction limit of the excitation radiation allowed.
  • a radiating sample area B1 results which corresponds to a reduced Airy distribution which is surrounded by an annular fluorescent area.
  • three peaks therefore appear in the distribution of the fluorescence radiation F as sample areas B1.
  • the point spread distribution 16 is smaller than the diffraction limit allows. The improvement of the resolution over the normal point spread distribution depends essentially on the combination of characteristic 17 and power distribution of the excitation radiation A.
  • an imaging volume B (dotted line in the right-hand illustration of Figure 7) is achieved that is two and a half times narrower than the conventional spot spread distribution, and even 1.7 times narrower than a confocal point spread distribution.
  • the resulting distribution of the imaging volume B and the mean peak, respectively is Point spread distribution of Fig. 6b radially symmetric. If two illumination spots are used, a maximum increase in resolution is achieved along the line connecting the spot maxima.
  • the outer fluorescent ring in FIG. 6b is masked out by targeted switching back of the dye from the second state 6 to the first state 5 in the region of the confocal detection volume D.
  • the procedure / principle is then as follows: First, it is excited with excitation radiation so that the sample section to be examined completely reaches the second state. Subsequently, reset radiation R is irradiated with a distribution corresponding to the confocal detection volume D, and thus a part of the sample is switched back. Upon repeated excitation with the excitation radiation distribution A according to FIG. 7, only the imaging region B lying in this sample part then reaches the first state and emits fluorescence radiation F in the form of the middle peak, as it remains in the variant of FIG. 7. The annular outer region remains in the second state and does not fluoresce.
  • structured planar illumination takes place, as shown, for example, in FIG. 8a.
  • An excitation radiation A distributed sinusoidally in the x-direction leads to fluorescence radiation F in the valleys of the sinusoidal power distribution.
  • the fluorescent sample areas B1 are strip-shaped. However, the strips are significantly narrower than the strips of the sinusoidal distribution of the excitation radiation A. It is advantageous here that the sinusoidal distribution of the excitation radiation A as minima has no zeros or must have.
  • the resulting distribution of the fluorescence radiation F does indeed depend on the power of the excitation minima in terms of their height, but not in terms of their width. The depth of the minima of the sinusoidal excitation radiation distribution is thus uncritical for the width of the stripes and thus for the resolution.
  • the period of the sinusoidal strip distribution of the excitation radiation A is set at the cut-off frequency of the resolution.
  • a detector e.g. a matrix detector is used.
  • the stripe width and thus the resolution is improved by a factor of 6 compared to the cutoff frequency of the resolution.
  • a high-resolution image is now obtained by shifting the stripe pattern.
  • FIG. 8b shows a development of the fourth method form of FIG. 8a.
  • the distribution of the resolution radiation A is structured in both lateral axes, ie in the sample plane, so that a matrix-shaped illumination spot distribution is given. This is shown one-dimensionally in the sectional representation of the left half of FIG. 8b.
  • a matrix of bright excitation spots is shown on the sample.
  • Each illumination spot is now assigned a detector.
  • a shift of the spot pattern relative to the sample also allows the spaces between the points to be measured.
  • the area in which the displacement of the matrix-shaped pattern is to take place is shown in FIG. 8b as area G1.
  • area G1 The area in which the displacement of the matrix-shaped pattern is to take place.
  • Fig. 9a shows a laser scanning microscope that can realize any of the explained method forms.
  • the laser scanning microscope 20 z. B. formed as a single-point scanning microscope. It has an excitation module 21, a microscope module 22 and a detector module 23.
  • the microscope module 22 is a sample 24 in the focus of an objective 25, which is preceded by a tube lens 26 in the illumination direction.
  • a scanning optics 27 In front of this optics is a scanning optics 27, which together with a scanner 28 allows scanning of the sample 24 by moving the focus point on the sample.
  • a main color splitter 29 couples the radiation from the excitation radiation module 21 into the microscope module 22 and separates radiation received from the microscope module 22 from the sample 24 to the detector module 23.
  • the excitation module 21 has a light source 30 whose radiation is focused via the main color splitter 29 to the focal point in the sample 24.
  • the fluorescence radiation F excited in the focal point of the sample 24 is collected by the objective 25 and decoupled at the main color splitter 29 on the basis of the spectral properties changed compared to the excitation radiation A to a pinhol optic 31, which is followed by a pinhole 32 and an (optional) block filter 33.
  • a dot detector 34 detects the power of the fluorescence radiation F at the focal point. The detection can additionally be spectrally resolved, polarization-resolved and / or time-resolved.
  • the signals of the detector 34 become from a controller 35, which controls the operation of the laser scanning microscope 20 as a whole.
  • FIG. 9a The construction of FIG. 9a has a beam splitter 36 which decouples 50% of the beam power of the light source 30.
  • the beam splitter 36 is a polarization beam splitter.
  • the sub-beams split up in this way are subsequently superimposed again via a further beam splitter 40 into a common beam, wherein the intensities and phases of the sub-beams are previously set suitably.
  • a phase element 39 is provided in a partial beam, which can be formed either as a solid phase element or as a variably adjustable phase element.
  • the phase element 39 has z. B. a phase-changing region 44 and a phase-neutral region 49, so that a donut-shaped power distribution is generated in the beam.
  • excitation radiation A according to FIG. 10 is obtained.
  • the structure of the phase element 39 is shown by way of example in FIG. 9b.
  • variable attenuators 37 and 38 are provided in each partial beam.
  • the result is a distribution of the power of the excitation radiation A, as shown in FIG. 10 as a sectional view along an axis perpendicular to the optical axis extending x-axis.
  • the distribution has a minimum 45, the depth of which is adjusted by adjusting the attenuators 38 and 37, respectively. is variably adjustable by changing the relative power of the two partial beams, z.
  • the adaptation of the minimum 45 makes it possible to optimally set the intensity of the fluorescence radiation F also drawn in FIG. 10.
  • the depth 45 that can be set in terms of depth can also be generated by the use of a variably adjustable phase element without the formation of partial beams.
  • a phase element is a matrix of liquid crystals in question, in which the phase of each pixel is adjustable.
  • other means for generating a donatförmigen beam distribution with adjustable minimum 45 are possible.
  • a reset radiation source 41 can be provided, which is integrated into the excitation beam path of the excitation module 21 via a third divider 42.
  • the reset radiation source 41 is only required if the dye of the sample 24 does not spontaneously return to the first state, but requires an active reset by optical reset radiation R.
  • reset radiation can also be applied to the sample 24 by other means, for example by irradiation obliquely to the optical axis of the objective 25 with the aid of a reset beam source mounted laterally by the laser scanning microscope.
  • the microscope of FIG. 9a can perform the method forms described above.
  • the third method requires the use of the pinhole 32 and the pinhole optic 31 in the detector module 23. Whenever no confocal detection is required, the components (31, 32) required for this purpose can be dispensed with.
  • Fig. 11 a shows a further possibility for improving the procedure according to the invention.
  • the transition of the sample in the partial region B2 from the first state to the second state 6 can take place incompletely. This is the case, for example, when the fluorescence characteristic curve 17 reaches the maximum value 18, i. for powers of the excitation radiation A above the threshold value 19, does not drop steeply enough. In the example of FIG. 11 a, the characteristic 17 does not return to zero even at high excitation radiation powers. This leads to a residual fluorescence 47 in the sample areas B2, which are in the second state 6, since the reduced proportion 46 does not correspond to the maximum value of 18. If the fluorescence radiation F were then measured with the microscope according to FIG.
  • the imaging volume B would be composed of a low-resolution base S and a high-resolution distribution V. This is schematically illustrated in FIG. 11 b, which hatches the base S and shows the high-resolution distribution V black.
  • the base S can be suppressed by suitable image recording.
  • a second embodiment of a laser scanning microscope 20 that realizes this is shown by way of example in FIG. 12. With the construction according to FIG. 9a matching components are provided with the same reference numerals, so that it can be dispensed with their repeated explanation.
  • the detector 34 is now connected to a lock-in amplifier 48, wherein this connection in FIG. 12 is merely an example of the control unit 35 is realized. Of course, a direct connection is possible. Also, the lock-in amplifier 48 can be integrated into the control unit 35. The lock-in amplifier 48 is connected to a frequency generator 49 which modulates the minimum 45 in amplitude. For this purpose, the power of one of the two partial beams in the excitation module 21 is suitably modulated, which is done, for example, by triggering one of the two attenuators 37 or 38. In the illustration of FIG. 12, the control line for the attenuator 38 is shown in dashed lines to indicate this option. Of course, the control of the attenuator can also be done by the controller 35, which evaluates the signal of the frequency generator 49 accordingly. As already mentioned, the lock-in amplifier 48 and / or the frequency generator 49 may be components of the control unit 35.
  • the frequency provided by the frequency generator 49 for modulating the minimum is also supplied to the lock-in amplifier 48.
  • the lock-in amplifier 48 separates out the modulated signals and suppresses signals from the pedestal S. As a result, the distribution V is separated from the pedestal S, and the high-resolution detection is achieved even with an incomplete transition to the second state 6.
  • image information can be e.g. refer to different fluorescent sample areas / properties.
  • the high and low resolution can be displayed superimposed arbitrarily encoded (e.g., color coded).
  • two images can also be recorded.
  • a first image is recorded with minimum 45 excitation radiation distribution, the second without minimum 45.
  • first image minus second image only the images are then subtracted from each other (first image minus second image).
  • the result image only contains the information with the high-resolution distribution V.
  • Further possibilities for suppressing a low-resolution socket may be the use of the different optical properties of the first state 5 and of the second state 6, for example if the lifetimes of the two states differ. It is also possible to use a different characteristic of the emission spectrum, or a different characteristic of the absorption spectrum between the first state 5 and the second state 6.
  • FIG. 13 shows a further modification of the laser scanning microscope 20 of FIG. 9a for realizing one of the method forms with linear illumination.
  • Fig. 9a matching elements with the same reference numerals, so that in turn their description can be omitted.
  • the now coherent light source 30 radiates its radiation through a grating 50, which generates two 1st diffraction orders, o + and o-, and an O. diffraction order.
  • the grid is followed by a cylindrical lens 50a, which is an example of an anamorphic element here.
  • a line perpendicular to the optical axis is focused on the sample.
  • the diffraction orders fall when focusing grazing to each other and thus arrive in the sample to interference.
  • the Talbot effect creates a so-called Talbot grid along the optical axis OA. This is shown schematically in the upper half of FIG. The +1, the 0 and the -1. Allows to enter the sample 24 at different angles and the interferences produce the Talbot structure known to those skilled in the art.
  • Fig. 14 shows a depth section (x, z-plane) through the sample.
  • the sample enters the second state 6, d. H. it is achieved a depopulation of the excited states by switching the dye molecules.
  • areas B1 of low intensity the sample remains in the first state 5 (hatched and white areas).
  • Detection takes place with a line detector 34, which in the construction of FIG. 13 is shown by way of example as combined with the control unit 35.
  • the line detector 34 again (optionally) a block filter 33 is presented. Further, the line detector 34 is preceded by a slit diaphragm (not shown in FIG. 13 applied directly to the line detector 34) along the x-axis to effect the required confocal selection of a depth plane and thereby detect only the shaded areas.
  • the scanner 28 makes it possible to move the excitation radiation distribution over the sample 24 perpendicular to the optical axis, ie along the x and y axes.
  • the optical axis ie along the x and y axes.
  • Reset radiation source 41 for example, a homogeneous line along the x-axis in the
  • Sample 24 can be generated, which allows switching of the dyes from the second state 6 in the first state 5, as Fig. 5 illustrates.
  • This line can also be one
  • the laser scanning microscope according to FIG. 13 thus implements the method according to FIG. 8a.
  • the depth of the minima 45 can be done by the quality of the grid or the individual attenuation of the individual orders.
  • FIG. 15 a shows an arrangement for realizing the method form according to FIG. 8 b, wherein only the excitation module 21 is shown here by the laser scanning microscope 20 since otherwise the microscope module 22 has the already described construction.
  • two partial beams are generated by means of a first beam splitter 53, here spaced perpendicular to the plane of the drawing.
  • a second beam splitter 52 produces a total of four parallel partial beams.
  • Fig. 15b shows the arrangement in a rotated by 90 ° degree section. Overall, there are four partial beams 54, 55 of the same intensity (the center beams are drawn). In the drawing, two partial beams each take the same path, so that they are hidden.
  • the partial beams are focused by lenses in a pupil of the microscope module 22, so that within a boundary 56 of the pupil results in the point distribution shown in Fig. 16a.
  • the four partial beams 55, 54 occupy the corners of a square. In the sample 24, the partial beams reach the interference, whereby perpendicular to the optical axis
  • Multispot pattern 58 as shown in FIG. 16b on the sample 24 is formed.
  • Multispot pattern 58 can be varied, for example, by changing the intensities of the respective diagonally opposite beams 54, 55. Suitable adjustable attenuators (not shown) for the partial beams are provided for this purpose.
  • FIG. 16b shows in the lower image the multi-spot pattern 58 and above it the fluorescence pattern 59 excited thereby.
  • a further beam 57 can be focused into the pupil, which thus illuminates a homogeneous surface in the sample 24. This results in a switching back of the fluorescence molecules from the second state 6 in the first state 5, as already explained between two scan steps and optionally also within a Schanönes.
  • the reset beam 47 can also have a lighting pattern that corresponds to the areas B2, since only these must be reset.
  • the beam 47 is analogous to the partial beams 54, 55 also divided into four partial beams and imaged in the pupil, so that within the boundary 56 of the pupil, for example, the distribution shown in Fig. 18 results.
  • the optical axis of the partial beams 57 of the reset radiation R with respect to the optical axis of the excitation radiation A is tilted such that the resulting in the sample minima of the multi-spot pattern 58 of the excitation radiation A coincide with the maxima of the Multispot Wegsetzmusters
  • the embodiment according to Figure 15a in the variant of FIG Fig. 18 is an exemplary example that by appropriate structuring of the reset radiation, a sample- or dye-sparing reset takes place only in the areas B2.
  • sample is divided by appropriate irradiation of excitation radiation A in areas B1 in the first state and in areas B2 in the second state.
  • the transfer of sample areas to the second state can therefore also be used by selecting a depth plane of the sample (see Fig. 14), so that sample areas B1 can not contribute to crosstalk of adjacent detector elements / regions.
  • the adjustment of the power of the excitation radiation A as a function of the fluorescence characteristic of the sample with special consideration of the local distribution of the excitation radiation A is of importance.
  • the depth of one or more minima 45 and the height of the respective maxima of the excitation radiation of the distribution determines the achievable increase in resolution.
  • An optimization of the adjustment of the local power distribution of the excitation radiation A can be realized in two ways: With knowledge of the characteristic curve 17, which for example is provided correspondingly to the control device 35, the optimum power level is calculated and adjusted accordingly for a given local excitation distribution , For example, by outputting a setpoint or even direct control of the excitation module 21st
  • the actual resolution can be determined on a test preparation or a reference point of the sample to be examined, and the optimum power level can be determined for a given excitation distribution in an interactive process and then used to image the sample 24.
  • the distribution can be changed, for example, by appropriate adjustment of the phase element 39th
  • the fluorescence characteristic of the sample 24, for example the fluorescence characteristic of a dye, can be determined by examination on a test preparation or a reference site of the Sample already be determined under later image acquisition conditions.
  • the power of the detected fluorescence radiation F is determined as a function of the power of the excitation radiation A at a point or an area of the sample.
  • the fluorescence characteristic, ie the characteristic curve 17 does not depend on the concentration of the fluorescent material, for example of the dye (in contrast to the emitted power of the fluorescence radiation F).
  • the control unit 35 of the scanning microscope 20 can automatically determine the optimum power from the determined curve 17 or a curve 17 supplied or stored in a memory and set it accordingly.
  • the iterative determination is always advantageous if the fluorescence properties are strongly sample-dependent and a reference point on the sample for determining the fluorescence characteristic is present or can not be found.
  • the excitation power is optimized on the basis of a quality criterion of the resolution (for example the contrast in a selected location or the extension of the frequency range transmitted in the image in the Fourier space). It is generally sufficient to adjust the power in the minimum of the excitation distribution or a spatially broad distributed underground performance.
  • the excitation radiation A and the reset radiation R can be generated from a single radiation source.
  • the radiation source can either be switched directly or provided with a downstream selection arrangement.
  • FIG. 19 shows a schematic view of a laser scanning microscope 100, which can also be used independently of the concept described so far.
  • the solid lines represent the illumination beam path B; the dashed lines represent the detection beam path 102.
  • the laser scanning microscope images a sample 103 onto a detector 104 in a scanning manner, the sample being illuminated by means of an illumination source 105.
  • the detection beam path 102 has from the sample 103 to the detector 104 along an optical axis OA an objective 106 and a tube lens 107, which is followed by a scanning objective 108a, after which a scanner 109 is provided.
  • a relay optics 108b, 110 and a Pinholeoptik 111 the radiation passes through a beam splitter 113 and passes to a detector 104, which is designed here as a matrix detector, and a filter 112 for blocking the last portions of the illumination radiation is arranged upstream.
  • the detection beam path 102 can also be designed differently, for example, one can do without the filter 112 as well as on the provided in the construction of Figure 20 between the elements 108a and 107 intermediate image, which is symbolized by a dashed line.
  • the pupil planes in which the scanner 109 and the beam splitter 113 still to be explained are located are conjugate to each other and to the rear focal plane of the objective 106, which is drawn between the elements 106 and 107 as a solid line.
  • the illumination source 105 has a laser 114, which generates four partial beams Sa, Sb, Sc, Sd by a divider 116, which will be explained in more detail, wherein only the center beams are shown in FIG.
  • the divider 116 focuses these four sub-beams Sa-d, of which only two can be seen in the schematic representation of FIG. 19 (the other two are one above the other perpendicular to the plane of the drawing) onto the beam splitter 113.
  • the divider 116 has two dividers 117 and 118 and a deflection mirror 119, which generate four parallel partial beams Sa, Sb and Sc and Sd from the one beam S emitted by the laser 114.
  • the partial beams Sa and Sb are superimposed, as are the partial beams Sc and Sd.
  • Lenses 120 and 121 in the divider 116 effect the focusing so that the sub-beams Sa-c are focused at four points on the surface of the beam splitter 113.
  • the generation of the four partial beams Sa-c can, of course, also be effected differently by a divider device 16 which is designed differently, for example, in which four lasers 14 are used.
  • a possible further embodiment for the divider 116 is shown in FIG. 20, in which the divider 118 and the mirror 119 are interchanged with the divider 117.
  • FIG. 21 shows the beam splitter 113 in a plan view of its beam splitter surface 122.
  • the illumination source 105 focuses the four partial beams Sa-d onto the four mirror surface elements 123a-d.
  • the partial beams thus focused and reflected into the pupil reach the interference, as a result of which the multispots shown in FIG. Pattern 128 is created in the sample.
  • the multi-spot pattern 128 is a regular array of light spots 126 surrounded by a dark area 127.
  • the intensity difference between the light spots 126 and the dark area 127 that is to say the depth of the zeros, can be varied by changing the intensities of the respectively opposite partial beams Sa, Sd and Sb, Sc.
  • diagonal (with respect to the optical axis) opposite partial beams or in each case separated by a partial beam between them partial beams are preferably adjusted in the same direction. With three partial beams one is adjusted opposite two (or vice versa).
  • the spatial extent of the pattern 128 can be adjusted by varying the magnification scale of the microscope (e.g., focal length variation at 110 and 108b) by changing the image field in the sample covering the pattern 128.
  • the focal length of the lenses 1 10, 121 can be adjusted.
  • the effect of the beam splitter 113 is as follows:
  • the dot pattern 128 with regularly arranged light spots 126 is formed on the sample 103.
  • fluorescence is thus excited at the light spots 126.
  • This arises spatially incoherent and thus fills homogeneously the rear focal plane of the microscope 106 (drawn between the elements 106 and 107 as a solid line).
  • diffuse reflection which can also be used for image acquisition.
  • the incoherent radiation to be detected also fills the entire pupil in which the beam splitter 113 is arranged and thus illuminates the entire beam splitter surface 122.
  • specularly reflected illumination radiation is focused onto the mirror surface elements 123a-d and thus reflected back to the illumination source 105.
  • the beam splitter 113 passes only the radiation to be detected, which was spatially incoherent, ie undirected, in the sample 103.
  • the beam splitter 1 13 thus causes a separation of detection radiation and specularly reflected illumination radiation without a chromatic adjustment would have to be made.
  • This has the advantage that not only is a higher yield achieved, but also the beam splitter 113 can be used for a wide variety of illumination wavelengths and detection wavelengths.
  • the usually provided with color dividers exchange mechanisms or change gears are not necessary.
  • the detection in FIG. 19, the pupil beam path is shown by dashed lines) takes place, for example, with the detector 104 embodied as a matrix detector, which may optionally be preceded by a pinhole mask.
  • the illuminated spots are displayed confocally.
  • This mask can lie in an intermediate image plane of the observation beam path in front of the detector or alternatively in the relay optics (between 110 and 108b). The latter also improves the beam profile on the lighting side.
  • the scanning of the sample 103 is effected by the action of the scanner 109.
  • a much smaller displacement of the illuminating light spots on the sample 103 is required than is required for a single-point scanner.
  • the individual light spots 126 are displaced simultaneously by the scanner 109, since they are caused by interference in the sample. It is therefore sufficient to move by means of the scanner 109, which scans the dark area 127 between adjacent light spots 126.
  • the scanning displacement of the light spots is thus preferably carried out within only one period length of the periodic regular pattern 128.
  • the structure shown in FIG. 19 can also be inverted to interchange the detection beam path from the beam splitter 113 and the illumination source 105.
  • the beam splitter 1 13 is then negative with respect to the mirroring to the construction shown in Figure 21, i. the mirror surface elements 123a-d are holes in a mirror surface.
  • the beam splitter 113 can also be combined with a Nipkow disc as a scanner, or integrated as such.

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Abstract

Es wird ein Lumineszenz-Mikroskopieverfahren beschrieben, bei dem eine Probe (24) durch Anregungsstrahlung (A) zu Emission von bestimmter Lumineszenzstrahlung (F) angeregt wird, wobei die lumineszierende Probe (24) aus einem ersten Lumineszenz-Zustand (5), in dem die Anregbarkeit mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert (18), welcher einem Anregungsstrahlungsleistungs-Schwellwert (19) zugeordnet ist, steigt, in einen zweiten Lumineszenz-Zustand (6) überführbar ist, in dem die Probe (24) gegenüber dem ersten Zustand (5) verminderte Anregbarkeit aufweist, wobei die Probe (24) durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes (19) in den zweiten Zustand (6) bringbar ist, die Probe (24) in Teil-Bereichen in den ersten Zustand (5) und in angrenzenden Teil-Bereichen in den zweiten Zustand (6) versetzt wird, indem die Einstrahlung von Anregungsstrahlung (A) mit einer Anregungsstrahlungsverteilung erfolgt, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum über dem Schwellwert (19) aufweist, das Bild der lumineszierenden Probe (24) Proben-Bereiche im ersten Zustand (5) und Proben-Bereiche im zweiten Zustand (6) umfaßt, wodurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. Es wird weiter bereitgestellt ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Strahlteiler (113), über den von einer Beleuchtungsstrahlquelle (105) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf eine Probe (103) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (113) an der Probe (103) spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zu einer Detektoreinrichtung (104) passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, indem er eine Strahlteilerfläche (122) aufweist, die zumindest an drei Punkten (123a-d) für die Beleuchtungsstrahlung verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (122) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (125) der optischen Achse (OA) liegen, wodurch in der Probe (103) ein Interferenzmuster (128) in Form periodisch über die Probe (113) verteilter Beleuchtungsflecke (126) entsteht.

Description

Auflösunqsgesteiqerte Lumineszenz-Mikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf die auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie und insbesondere auf ein Verfahren, bei dem eine zu untersuchende lumineszierende Probe mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird und ein Bild der zur Lumineszenz angeregten Probe gewonnen wird. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenzmikroskopie einer Probe, das Mittel zur Anregung von Lumineszenz, die in der Probe Anregungsstrahlung einstrahlen und Mittel zur Gewinnung eines Bildes der angeregten Probe aufweist.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist.
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, z.B. von Zellteilen, verwendet. Die Probe wird, wie erwähnt, mit Anregungsstrahlung beleuchtet und das dadurch angeregte Lumineszenzlicht mit geeigneten Detektoren erfaßt. Üblicherweise ist dazu im Lichtmikroskop ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern vorgesehen, die die Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Lichtmikroskop möglich. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren.
Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfaßt also beide Prozesse.
Weiter ist es zur Probenuntersuchung bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die aus einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene wiedergeben, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es anschließend, mit Hilfe eines geeigneten Datenverarbeitungsgerätes ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet.
Natürlich wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning- Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird.
Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskopes, auch eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. Zur optimalen Auflösung innerhalb dieser Grenzen sind spezielle Beleuchtungskonfigurationen bekannt, wie beispielsweise 4Pi-Anordnung oder Anordnungen mit Stehwellenfeldern. Damit kann die Auflösung, insbesondere in axialer Richtung gegenüber einem klassischen LSM deutlich verbessert werden. Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann weiter die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 gegenüber einem beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden.
Die Fig. 1 a/b zeigen ein solches Verfahren, wie es z.B. in US 5866911 beschrieben ist. Dabei wird zur Auflösungssteigerung mit einer zwei Wellenlängen aufweisenden Lichtstrahlung gearbeitet. Die Lichtstrahlung der einen Wellenlänge wird als Anregungslichtstrahl 1 auf die zu messende Probe mittels eines Objektives fokussiert und regt dort Lumineszenz, hier Fluoreszenz, an. Die Darstellung in den Fig. 1a/b zeigt zur Vereinfachung nur den eindimensionalen Fall. Die Erhöhung der Ortsauflösung erfolgt nun dadurch, daß ein Lichtstrahl 2 mit der anderen Wellenlänge in Teilbereichen den durch den Anregungslichtstrahl angeregten fluoreszierenden Zustand entvölkert. Man bezeichnet diesen Lichtstrahl deshalb auch als „Entvölkerungs-Strahlung". Nun erfolgt die Einstrahlung z.B. so, daß sich das Hauptmaximum des Entvölkerungs-Lichtstrahls 2 und das Hauptmaximum des Anregungslichtstrahls 1 teilweise überdecken, wie es in Fig. 1a gut zu erkennen ist. Durch diese „Abregung" der Probe an den Rändern des mit Anregungsstrahlung 1 beleuchteten Bereiches, sendet nur noch ein reduziertes Volumen 3 Fluoreszenz aus, wie in Fig. 1 b gut zu sehen ist. Die Auflösung ist durch diese Volumenreduktion folglich gesteigert.
Fig. 2a-c zeigen drei mögliche Mechanismen, mit denen eine solche Entvölkerung erfolgen kann. In Fig. 2a ist der Prozeß der Abregung durch stimulierte Emission (STED) dargestellt. Die Anregungsstrahlung liegt im Fluorophor des Niveaus S1 an (Pfeil A). Die Entvölkerung des derart angeregten Niveaus S1 wird in Richtung des Grundniveaus SO durch Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge im Bereich der Fluoreszenzwellenlänge bewerkstelligt. Pfeil SE zeigt diese stimulierte Emission, deren Wellenlänge der der Lumineszenz (Pfeil F) fast identisch entspricht. Somit ist die Anregungswellenlänge um den Betrag des Stokesshiftes kurzwelliger als die der Entvölkerungs-Strahlung. Die Auflösungssteigerung gemäß dieses Ansatzes benötigt also zwei unterschiedliche Lichtquellen, wie auch der Stand der Technik in Form der DE 4416558 C2 belegt.
Fig. 2b veranschaulicht einen weiteren möglichen Prozeß der Entvölkerung für das angeregte Niveau S1 (Pfeil A), indem eine Anregung in ein noch höheres Niveau S2 (Pfeil A+) erfolgt, das keine Lumineszenz mehr aussenden kann. Dieses Anheben wird im Englischen als Excited State Absorption bezeichnet, weshalb dieses Vorgehen auch mit dem Kürzel ESA belegt ist. Eine entsprechende Schilderung dieses Prozesses findet sich beispielsweise in der US 6633432. Da der Abstand der Energieniveaus in einer Probe bzw. einem Farbstoff zu höheren Niveaus hin abnimmt, verwendet man zur Entvölkerung bei dem ESA-Prozeß eine Lichtquelle mit einer geringeren Energie und damit längeren Wellenlänge, als zur Anregung. Man braucht also wiederum zwei verschiedene Lichtquellen.
Ein weiteres Verfahren zur Entvölkerung stellt für die Fluoreszenz die sogenannte Reversible Saturable Optical Fluorescence Transition dar, die z.B. in DE 10325460 A1 beschrieben und in Fig. 2c veranschaulicht ist. Dieser Ansatz verwendet zum räumlich hochauflösenden Abbilden einen Farbstoff, der mit Hilfe eines Umschaltstrahls 4 wiederholt aus einem ersten Zustand 5, in dem Fluoreszenz stattfindet, in einen zweiten Zustand 6, in dem der Farbstoff nicht fluoresziert, überführbar ist, wobei der Farbstoff aus dem zweiten Zustand 6 in den ersten Zustand 5 zurückkehren kann, wie Fig. 2c veranschaulicht. Die Probe mit dem Farbstoff wird in Teilbereichen mit dem Umschaltstrahl 4 in den zweiten Zustand 6 überführt, wobei ein definierter Bereich der Probe ausgelassen wird. Mit einem Anregungsstrahl 1 wird dann Fluoreszenzlicht 7 angeregt und anschließend registriert. Das Fluoreszenzlicht 7 stammt dann nur aus Probenvolumina, die zuvor nicht mit dem Umschaltstrahl 7 beaufschlagt wurden. Durch geeignete Überlappung von Anregungsstrahl 1 und Umschaltstrahl 4 ist das Volumen, aus dem Fluoreszenzlicht 7 emittiert wird, kleiner, als es die Auflösung des Anregungsstrahls 1 und die Schärfe der Nullstelle des Umschaltstrahls 4 a priori erlaubten.
In allen drei genannten Verfahren gemäß Fig. 2a bis 2c erfolgt also die Verhinderung von Fluoreszenz durch den Einsatz von Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge, die ungleich der Wellenlänge zur Anregung ist. Zugleich muß diese Lichtstrahlung mindestens eine scharf begrenzte örtliche Nullstelle der Strahlungsleistung aufweisen, die die endgültige Auflösung der detektierten Fluoreszenzstrahlung bestimmt. Sobald die Nullstelle nur mehr als Minimum ausgebildet ist und nicht völlig auf Null zurückgeht, verringert sich weiter die Fluoreszenzleistung und damit die Effizienz des Verfahrens. Dies liegt z.B. bei Aberrationen der optischen Anordnung bzw. im Präparat vor.
Fig. 3 zeigt eine bekannte Vorrichtung, die eines der drei genannten Verfahren zur Auflösungssteigerung verwendet, im Beispiel der Fig. 3 den STED-Prozeß. Eine Anregungsstrahlquelle 8 erzeugt eine Airy-Verteilung in der Probe 10, mit der die Probe aus dem Grundniveau SO in den angeregten Zustand S1 überführt wird. Die Entvölkerung des Zustande S1 erfolgt mittels einer Entvölkerungslichtquelle 11 , die unter die Verwendung einer Phasenplatte 12 eine donut- oder torus-förmigen Strahlverteilung 13 in der Probe 10 hat. Die Lumineszenzstrahlung der nicht-entvölkerten d.h. nicht-abgeregten Farbstoffmoleküle wird mit Hilfe eines Detektors 14 erfaßt. Durch die Entvölkerung wird die Auflösung des Mikroskops über die Beugungsbegrenzung, die sich aus der Airy-Verteilung ergibt, hinaus gesteigert. Dies kommt durch eine verkleinerte Punktverwaschungsverteilung 15 des hochauflösenden Mikroskops im Vergleich zum konventionellen Mikroskop 16 zum Ausdruck.
Ein weiteres Verfahren zur Auflösungssteigerung wird in der EP 1157297 B1 angesprochen. Dabei sollen mittels strukturierter Beleuchtung nichtlineare Prozesse ausgenützt werden. Als Nichtlinearität erwähnt die Druckschrift dabei die Sättigung der Fluoreszenz. Das geschilderte Verfahren nimmt in Anspruch, durch eine strukturierte Beleuchtung eine Verschiebung des Objektraumspektrums relativ zur Übertragungsfunktion des optischen Systems zu realisieren. Konkret bedeutet die Verschiebung des Spektrums, daß Objektraumfrequenzen VO bei einer Raumfrequenz VO - Vm, wobei Vm die Frequenz der strukturierten Beleuchtung ist, übertragen werden. Bei gegebener durch das System maximal übertragbarer Raumfrequenz ermöglicht dies den Transfer von um die Verschiebefrequenz Vm über der maximalen Frequenz der Übertragungsfunktion liegender Raumfrequenzen des Objektes. Dieser Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild. Der Erfindung liegt deshalb zum einen die Aufgabe zugrunde, ein Lumineszenzmikroskopieverfahren bzw. ein Lumineszenzmikroskop anzugeben, das eine Auflösungssteigerung ohne Rückgriff auf mehrere Wellenlängen bzw. ohne aufwendige Bildrekonstruktionsalgorithmen erreicht.
Für Laser-Scanning-Mikroskope, die, wie beispielsweise in der DE 19702753A1 beschrieben ist, eine Probe durch Abrastem einer konfokalen Abbildung erfassen, ist die Untersuchung biologischer Präparate mittels Fluoreszenzmikroskopie deshalb eine verbreitete Anwendung. Dabei wird in einer Probe Fluoreszenz angeregt, wodurch gegenüber der Anregungsstrahlung spektral Stokes-verschobene Fluoreszenzstrahlung entsteht, die dann mit dem Laser-Scanning- Mikroskop konfokal detektiert wird. Anstelle einer konfokalen Detektion kann auch eine Weitfelddetektion erfolgen, beispielsweise im Falle einer Multi-Photonen-Anregung.
Grundsätzlich stellt sich bei einem Laser-Scanning-Mikroskop die Aufgabe, daß die Beleuchtungsstrahlung, die im erwähnten Fall der Fluoreszenzmikroskopie Anregungsstrahlung ist, von der zu detektierenden Strahlung getrennt werden muß, da zumeist die
Beleuchtungsstrahlung und die Detektionsstrahlung über ein gemeinsames Objektiv geführt werden, d.h. die Beleuchtungsstrahlung fällt über das Objektiv ein, mit dem auch die
Detektionsstrahlung zum Detektor geleitet wird. Es ist deshalb üblich, die Beleuchtungsstrahlung über einen Strahlteiler einzukoppeln, der dafür sorgt, daß an der Probe rückreflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht oder zu einem möglichst geringen Anteil zum
Detektor passiert.
In der Fluoreszenzmikroskopie macht man sich die Stokes-bedingte Wellenlängenverschiebung zwischen Detektions- und Anregungsstrahlung zunutze und verwendet für den Strahlteiler geeignete dichroitische Elemente, weshalb sich für den Strahlteiler auch der Begriff Farbteiler oder Hauptfarbteiler eingebürgert hat. Unterscheiden sich Beleuchtungs- und
Detektionsstrahlung jedoch spektral nicht, hilft dieser Ansatz nicht weiter. Auch ist die
Trennschärfe eines dichroitischen Strahlteilers begrenzt, was entweder dazu führt, daß im Detektionsstrahlengang nach dem Strahlteiler immer noch an der Probe rückreflektierte
Anregungsstrahlung verbleibt oder daß die Detektionsstrahlung beim Durchgang durch den
Strahlteiler unnötig abgeschwächt wird.
Einen spektral unabhängigen Ansatz stellt die DE 10257237A1 vor. Das dort beschriebene Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art verwendet die Tatsache, daß von der Probe kommende Strahlung in der Regel inkohärent, d.h. nicht gerichtet an der Probe emittiert wird, wohingegen spiegelnd reflektierte Anregungs- oder Beleuchtungsstrahlung gerichtet in den Detektionsstrahlengang einkoppelt. Die DE 10257237A1 schlägt deshalb vor, in eine Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs einen Strahlteiler einzufügen, der am Durchstoßpunkt der optischen Achse transparent und ansonsten verspiegelt ist. Zugleich wird die Beleuchtungsstrahlung genau auf diesen transparenten Fleck fokussiert. Im Ergebnis erhält man damit eine flächige Beleuchtung der Probe und zugleich gelangt an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung wieder auf die Spiegelfläche des Strahlteilers und wird dadurch aus dem nachfolgenden Teil des Detektionsstrahlengangs aufgespiegelt. Die diffus in der Probe erzeugte Detektionsstrahlung hingegen wird nicht fokussiert, füllt die ganze Pupille und wird fast vollständig transmittiert. Der als Auskoppelgrad der Beleuchtungsstrahlung zu verstehende Wirkungsgrad dieses Strahlteilers ist also nur durch das Flächenverhältnis von Pupille zu transparentem Fleck gegeben. Er kann bei geeigneter Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung weit über 90% liegen. Der derart durch die DE 10257237A1 erreichte Strahlteiler ist spektral unempfindlich und erlaubt eine hohe Ausbeute der Detektionsstrahlung.
Die Laser-Scanning-Mikroskopie eignet sich, wie bereits erwähnt, besonders zur Untersuchung biologischer Proben. Die Zeitdauer, die für die Aufnahme eines Bildes benötigt wird, ist bei biologischen Proben naturgemäß ein bedeutender Faktor, insbesondere wenn man lebende Proben untersuchen oder schnell ablaufende Vorgänge analysieren möchte. Es ist deshalb stetes Bestreben in der Laser-Scanning-Mikroskopie, die Bildaufnahmegeschwindigkeit zu steigern. Hierzu sind in letzter Zeit vermehrt Mikroskopsysteme beschrieben worden, die eine Probe nicht mit einem punkt-artigen Lichtfleck (d.h. mit nicht einem konfokalen Punkt-Scanner) abtasten, sondern mit einer zeilenförmigen Beleuchtung und Abtastung (d.h. eine konfokale Schlitzblende) verwenden. Auch hierfür stellt die DE 10257237A1 einen geeigneten Strahlteiler bereit, bei dem dann ein zeilenförmiger Bereich in Form eines schmalen Rechteckes auf dem Strahlteiler verspiegelt ist.
Zwar erreichen zeilen-scannende Systeme eine hohe Bildaufnahmegeschwindigkeit, jedoch ist die Tiefenschärfeauflösung gegenüber einem punkt-scannenden System vermindert, da es in der konfokalen Abbildung mit der Schlitzblende prinzipbedingt zu einem gewissen Übersprechen längs der Schlitzblendenrichtung kommt.
Der Erfindung liegt deshalb zum anderen die Aufgabe zugrunde ein Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, daß eine schnelle Bildaufnahme möglich ist, ohne die mit einer Schlitzblende einhergehende Tiefenauflösungseinschränkung.
Die erstgenannte Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem eine Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung zur Emission von bestimmter Lumineszenzstrahlung angeregt wird und ein Bild der lumineszierenden Probe gewonnen wird, wobei die lumineszierende Probe aus einem ersten Lumineszenz-Zustand, in dem die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert, welcher einem Anregungsstrahlungsleistungs-Schwellwert zugeordnet ist, steigt, in einen zweiten Lumineszenz-Zustand überführbar ist, in dem die Probe gegenüber dem ersten Zustand verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung aufweist, wobei die Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes in den zweiten Zustand bringbar ist, die Probe in Teil-Bereichen in den ersten Zustand und in angrenzenden Teil-Bereichen in den zweiten Zustand versetzt wird, indem die Einstrahlung von Anregungsstrahlung mit einer Anregungsstrahlungsverteilung erfolgt, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum über dem Schwellwert und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum unter dem Schwellwert aufweist, das Bild der lumineszierenden Probe Proben-Bereiche im ersten Zustand und Proben-Bereiche im zweiten Zustand umfaßt, wobei zum Bild der lumineszierenden Probe überwiegend Proben-Bereiche im ersten Zustand beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungs-verteilung gesteigerte Ortsauflösung hat.
Die erste Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopie, das Mittel aufweist zur Anregung von Lumineszenz, die Anregungsstrahlung auf die Probe einstrahlen und damit die Emission bestimmter Lumineszenzstrahlung in der Probe anregen, Mittel zur Gewinnung eines Bildes der lumineszierenden Probe, wobei die Mittel zur Anregung die Anregungsstrahlung mit einer bestimmten Anregungsstrahlungsverteilung einstrahlen, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum aufweist, das über einem Schwellwert liegt, und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum aufweist, das unter dem Schwellwert liegt, wobei der Schwellwert zwei Lumineszenz-Regionen der Probe trennt, eine erste, bei Anregungsstrahlungsleistungen unterhalb des Schwellwertes vorliegende Zustands-Region, in der die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert, welcher am Schwellwert erreicht wird, steigt, und einer zweiten bei und/oder nach Anregungsstrahlungsleistungen oberhalb des Schwellwertes vorliegende Zustands-Region, in der die Probe eine gegenüber der ersten Region verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung aufweist, und wobei die Mittel zur Bildgewinnung Proben-Bereiche in der ersten Region, die mit Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes bestrahlt wurden, und Proben-Bereiche in der zweiten Region, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes bestrahlt wurden, erfassen, wobei zum Bild der Probe überwiegend Proben-Bereiche in der ersten Region beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. Es wird also eine Probe verwendet bzw. das Mikroskop ist für eine entsprechende Probe ausgelegt, deren lumineszierendes Material sich im wesentlichen in zwei Zuständen befinden kann. In einem ersten Zustand, der sich bei der Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes einstellt und der mittels der Mittel zur Anregung erreicht wird, strahlt das Material Lumineszenzstrahlung ab, deren Leistung in der Regel mit der Anregungsstrahlungsleistung zunimmt. In einem zweiten Zustand, der bei Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes vorliegt, erfolgt entweder gar keine oder verminderte Lumineszenz. Auch können gegenüber dem ersten Zustand geänderte Absorptionseigenschaften und/oder Lumineszenzstrahlungsemission mit anderen optischen Eigenschaften als im ersten Zustand, beispielsweise mit anderer spektraler Zusammensetzung, Polarisation oder Lebensdauer, erfolgen. Bezogen auf die Probe, die sich natürlich aus einer Vielzahl von fluoreszierenden oder auto-fluoreszierenden Molekülen zusammensetzt, ergeben sich zwei Zustandsregionen. In einer ersten Zustandsregion ist die Mehrzahl der Moleküle im ersten Zustand, in einer zweiten Zustandsregion ist die Mehrzahl im zweiten Zustand. Erfindungsgemäß werden nun Proben-Bereiche in die erste Zustandsregion (oder kurz Zustand) und andere Proben-Bereiche in die zweite Zustandsregion (oder kurz Zustand) verbracht. Die örtliche Nähe der Bereiche, die in den ersten Zustand gebracht wurden, also auf die Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes fällt, und Bereichen im zweiten Zustand, d.h. Bereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes bestrahlt werden, erlaubt eine signifikante Steigerung der Auflösung gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung.
Die erfindungsgemäße Lösung erreicht also die Auflösungssteigerung durch eine nichtlineare Lumineszenzkennlinie, die die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung beschreibt und ein lokales Maximum hat. Es ist dabei vorteilhaft, aber nicht zwingend erforderlich, wenn die Kennlinie beiderseits dieses Maximums relativ steile Flanken aufweist. Auch kann zur Anregung ein Multiphotonenprozeß zum Einsatz kommen.
Da beim erfindungsgemäßen Ansatz möglichst ausschließlich Proben-Bereiche im ersten Zustand zum Bild Lumineszenzstrahlung beitragen und Proben-Bereiche im zweiten Zustand zumindest in einem geringeren Maße lumineszieren, ist eine Auflösungssteigerung erreicht, da das Probenbild eine über die Anregungsstrahlungsverteilung hinausgehende Struktur zeigt. Diese Intensitätsstruktur ist um so ausgeprägter, je deutlicher die Emissionsleistung sich zwischen erstem und zweitem Zustand unterscheidet.
Durch Einstrahlung der Anregungsleistung oberhalb des Schwellwertes, der dem Maximum der Fluoreszenzkennlinie entspricht, wird weniger Fluoreszenz angeregt als im ersten Zustand. Im Mikroskop ist dazu die Anregungsstrahlungsverteilung mit Leistungen über dem Schwellwert versehen. Strahlung anderer Wellenlänge, wie sie im Stand der Technik bislang erforderlich war, ist nicht mehr nötig. Das erfindungsgemäße Mikroskop bzw. eine Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind deshalb sehr viel einfacher, benötigen insbesondere nur eine einzige Lichtquelle, deren Auflösung sich auf die Bildqualität auswirkt. Auch sind die chromatischen Anforderungen hinsichtlich der Einkopplung der Anregungsstrahlung gegenüber dem Stand der Technik deutlich vereinfacht, da nicht mehr ein relativ breiter Wellenlängenbereich abgedeckt werden muß.
Das Mikroskop ist auf die Probe abgestimmt, da die eingestrahlte Anregungsstrahlungsverteilung den Schwellwert für die Leitung berücksichtigt.
Für den erfindungsgemäßen Ansatz ist es darüber hinaus nicht zwingend erforderlich, daß die Probenbereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes beleuchtet werden, zuvor „normal" angeregt wurden (wie dies beispielsweise beim STED- oder beim ESA- Ansatz erforderlich ist), wenn eine Probe verwendet wird, die nach Bestrahlung mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung dauerhaft oder zumindest für eine gewisse Zeitdauer eine deutlich herabgesetzte oder gar verschwindende Anregbarkeit zeigt.
Es ist bevorzugt, daß eine Probe bzw. ein Farbstoff verwendet wird, die/der bei einer Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert nicht luminesziert, Lumineszenzstrahlung mit anderen Eigenschaften als die bestimmte Lumineszenzstrahlung abstrahlt und/oder geänderte, zu verminderter Lumineszenz führende Absorptionseigenschaften für Anregungsstrahlung aufweist.
Die Auflösungssteigerung wird also erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß aus Proben- Bereichen, die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsintensität beleuchtet werden, keine oder nur mehr wenig Lumineszenzstrahlung zur Bilderzeugung beiträgt. Je nach Lumineszenzeigenschaft, die die Probe im zweiten Zustand, d.h. bei und/oder nach oberhalb dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung zeigt, erfolgt dieser verminderte Beitrag zum Bild auf unterschiedliche Weise. Zeigt die Probe überhaupt keine Lumineszenz mehr, wird aus Proben-Bereichen, die im zweiten Zustand sind, auch keine Lumineszenzstrahlung mehr detektiert. Zeigt die Probe im zweiten Zustand hingegen Lumineszenzstrahlung mit geänderten optischen Eigenschaften, wird man eine entsprechend optische Filterung, beispielsweise hinsichtlich spektraler Zusammensetzung oder Polarisation zum Ausblenden vornehmen. Zeigen sich veränderte Lebensdauern der angeregten Lumineszenzzustände, erreicht eine zeitliche Filterung eine Ausblendung. Um die Proben-Bereichen im ersten Zustand weiter einzugrenzen bzw. einige dieser Proben- Bereiche auszuwählen, ist es bevorzugt eine konfokale Detektion vorzunehmen. Durch die erfindungsgemäße Reduktion des zur Lumineszenz angeregten Volumens unterhalb der Beugungsgrenze wird dabei eine Ortsauflösung erreicht, die diejenige bei normaler konfokaler Detektion übertrifft.
Wesentlich ist, daß nicht alle mit Anregungsstrahlung beleuchteten Bereiche zum Lumineszenzbild beitragen, sondern daß mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtete Proben-Bereiche im Bild nicht oder nur vermindert enthalten sind, wodurch sich automatisch die Auflösungssteigerung gegenüber der Einstrahlung der Anregungsstrahlung ergibt, da eine räumliche Reduktion des lumineszierenden Probenvolumens gegenüber dem angeregten Probenvolumen erreicht ist. Es finden sich im Bild optische Strukturen, die in der Anregungsstrahlungsverteilung nicht vorhanden waren. Die Auflösung des Bildes ist also über die Auflösung der Anregungsstrahlungseinkopplung hinaus gesteigert.
In besonders vorteilhafter Weise verwendet man eine Probe bzw. Farbstoffe bzw. stimmt das erfindungsgemäße Mikroskop darauf ab, die vom zweiten Zustand durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung, die andere optische Eigenschaften als die Anregungsstrahlung hat, wieder in den (ursprünglichen) ersten Zustand zurückgesetzt werden können. Das Mikroskop weist dazu geeignete Mittel auf. Dies bedeutet, daß der zweite Zustand ein zumindest weitgehend reversibler Zustand ist. Durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes aus dem Lumineszenzbild ausgeblendete Bereiche können dann nach Einstrahlung der Rücksetzstrahlung wieder zur normalen Lumineszenz im ersten Zustand angeregt werden. Ein derart weitergebildetes Verfahren bzw. ein derart ausgestaltetes Mikroskop eignet sich dann für Anwendungen, bei denen verschiedene Bereiche einer Probe mehrfach abgebildet werden sollen. Es wird für solche Anwendungen deshalb bevorzugt, daß eine Probe bzw. ein Farbstoff verwendet wird, die bzw. der im zweiten Zustand, also nach Beleuchtung mit Anregungsstrahlung über dem Schwellwert, verminderte Empfindlichkeit für Anregungsstrahlung zeigt, wobei durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung, die andere optische Eigenschaften als die Anregungsstrahlung hat, die Empfindlichkeitsverminderung zumindest teilweise reversiert wird (und der erste Zustand wiederhergestellt wird). Zumindest die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchteten Proben- Bereiche werden mit Rücksetzstrahlung bestrahlt. Es ist dabei bedeutsam, daß die Rücksetzstrahlung, die die Probe wieder in den ersten Zustand überführt, zur Bewerkstellung der Auflösungssteigerung nichts beiträgt, also auch nur sehr grob oder überhaupt nicht strukturiert in die Probe eingekoppelt werden kann. In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung erlaubt die hinsichtlich ihrer Lumineszenzeigenschaften wieder in den ersten Zustand rückführbare Probe eine Bilderzeugung durch Abscannen. Dabei kann die Probe beispielsweise mit einem Spot-, Zeilenoder Multispotbereich abgerastert werden, z.B. durch eine Scannereinrichtung. Zwischen zwei Scanschritten wird dann jeweils Rücksetzstrahlung eingestrahlt, um beim neuen Scanschritt jeweils erneut Anregungsstrahlung unter und über dem Schwellwert einstrahlen zu können. Dadurch wird in jedem Scanschritt eine gesteigerte Auflösung erzielt, was insgesamt ein deutlich auflösungsverbessertes Bild liefert.
Die Einstrahlung der Anregungsstrahlungsverteilung erzeugt also eine örtliche Struktur der Fluoreszenzstrahlung. Diese ist meist symmetrisch bezüglich der Anregungsstrahlungsverteilung. Möchte man eine bestimmte fluoreszierende Flächenform, z.B. einen Punkt, so werden vorteilhafterweise Teile der fluoreszierenden Probe ausgeblendet. Dies ist ohne Auswirkung auf die Auflösung der erwünschten Flächenform möglich, da man für ausreichende Abstände zwischen benachbarten fluoreszierenden Bereichen sorgen kann.
Für die Anregung der Probe über bzw. unter dem Schwellwert sind prinzipiell zwei Varianten möglich. In einer ersten Variante erfolgt eine prinzipiell beugungsbegrenzte Beleuchtung, wobei diese punktförmig sein kann, radial symmetrisch sein kann oder ein zentrales Maximum, wie die bekannte Airy-Funktion aufweisen kann, jedoch nicht muß. In dieser Form der Anregungsverteilung ist es bevorzugt, daß die Anregungsstrahlungsverteilung beugungs- begrenzt ist.
Bei der beugungsbegrenzten Anregungsstrahlungsverteilung kann man besonders vorteilhaft eine torusförmige Verteilung verwenden, die im Kernbereich der torusförmigen Verteilung eine Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert, in Randbereichen unter dem Schwellwert hat. Im vom Toms umschriebenen Zentrum erhält man dann eine punktförmige Lumineszenzverteilung, die deutlich kleiner ist, als es ein beugungsbegrenztes Airy-Scheibchen wäre. Da natürlich aus den erwähnten Symmetriegründen auch am Außenrand des Torus liegende Proben-Bereiche mit unter dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtet werden, wird auch dort Lumineszenzstrahlung angeregt. Um ein punktförmiges Fluoreszenzbild zu erzeugen, ist es zweckmäßig, diese Bereiche auszublenden, beispielsweise mit Hilfe einer konfokalen Detektion, die lediglich im vom Torus umschriebenen Zentrum entstehende Lumineszenzstrahlung passieren läßt. Das lumineszierende Zentrum ist dabei dennoch kleiner, als es die (beugungsbegrenzte) Auflösung der konfokalen Detektion per se erlaubt. Das Ausblenden kann natürlich auch anders bewerkstelligt werden. Z.B. können die Außenbereiche bezüglich der Lumineszenzanregbarkeit gezielt ausgeschaltet bzw. das umschriebene Zentrum gezielt eingeschaltet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. Mikroskop erlaubt damit eine Auflösung über die physikalische Beugungsgrenze hinaus bei gleichzeitiger Beeinflussung der fluoreszierenden Bereichsform.
In einer zweiten Variante wird eine flächige, strukturierte Beleuchtung eingesetzt, wobei die Fläche auch als eine oder mehrere, in einer Richtung beugungsbegrenzte Linie(n) ausgebildet werden kann. Teilbereiche der beleuchteten Fläche weisen eine Anregungsstrahlungsleistung über und andere Teilbereiche eine Anregungsstrahlungsleistung unter dem Schwellwert auf.
Eine solche flächige Beleuchtung erlaubt es, eine größere Probe besonders schnell abzurastem. Gleiches gilt natürlich auch für eine Multispot-Anordnung, bei der mehrere beugungsbegrenzte Beleuchtungsspots auf die Probe fallen, die so weit voneinander räumlich getrennt sind, daß sie eindeutig voneinander getrennt detektiert werden können. Als flächige strukturierte Probenbeleuchtung kommt insbesondere ein Streifen- oder Kreuzgitter in Frage.
Je nach Probe können Proben-Bereiche im zweiten Zustand noch eine gewisse Restlumineszenz zeigen. Dies kann entweder durch die Probe selbst bedingt sein, oder durch
Wanderungen von lumineszierendem Material zwischen den unterschiedlich beleuchteten
Proben-Bereichen, beispielsweise durch Diffusion. Die Probe selbst kann z.B. störend autofluoreszieren oder andere Farbstoffe enthalten, die nicht in einen zweiten, reversiblen
Zustand überführbar sind. Im Ergebnis hat man eine Restlumineszenzstrahlung in Bereichen, die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtet wurden.
Prinzipiell kann diese Restlumineszenz durch einen geeigneten Schwellwert bei der Detektion unterdrückt werden.
Die Verwendung einer an und für sich bekannten Lock-In-Technik unterdrückt diese Hintergrundstrahlung bei verbessertem Bildsignal. Dazu wird man entweder in Proben- Bereiche, die in den zweiten Zustand versetzt werden oder in Proben-Bereiche, die im ersten Zustand verbleiben, die Anregungsstrahlung gemäß einer Referenzfrequenz intensitätsmodulieren und diese Referenzfrequenz bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung im Wege der Lock-In-Technik verwerten. Das Mikroskop weist dazu einen Modulator und einen dem Lumineszenzdetektor nachgeschalteten Lock-In-Verstärker auf. Dieser separiert dann die modulierten Signale und unterdrückt die unmodulierten Signale, was eine hochaufgelöste Detektion auch bei der genannten Restlumineszenz ermöglicht, ohne daß der Spitzenpegel des Nutzsignals sinkt. Dadurch tragen die modulierten Signale voll zum hochaufgelösten Bild bei.
Eine alternative Möglichkeit zur Unterdrückung einer Restlumineszenz ist ein Differenzverfahren, bei dem zwei Bilder voneinander substrahiert werden. Ein erstes Bild wird mit Anregungsstrahlungsleistung unter dem Schwellwert, ein zweites Bild mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes aufgezeichnet. Die Differenz zwischen den beiden Bildern bewirkt die Abseparierung der Restlumineszenz. Andere mögliche Ansätze zur Unterdrückung der Restlumineszenz nutzen weitere Eigenschaften von in Varianten der Erfindung verwendeten Proben bzw. Farbstoffen, beispielsweise die Auswertung unterschiedlicher Lumineszenzlebensdauem im ersten bzw. zweiten Zustand, die Nutzung unterschiedlicher optischer Eigenschaften der Lumineszenzstrahlung im ersten oder zweiten Zustand o.a.
Weiter werden in vorteilhaften Ausgestaltungen Probenteile, die außerhalb der zu detektierenden Fokusebene liegen, ausgeblendet, um die Tiefenschärfe zu steigern. Dadurch wird gleichzeitig die axiale von der lateralen Auflösung entkoppelt. Dazu wird zuerst die Probe unstrukturiert in den zweiten Zustand überführt und dann nur in der Fokusebene rückgesetzt. Gleiches erreicht eine entsprechende Tiefenstrukturierung der Anregungsstrahlungsintensität, mit einem Minimum in der Fokusebene. Hierzu kann man eine Anordnung gemäß den Prinzipien der DE 102 57 423 A1 geeignet abwandeln.
Das eingangs genannte erfindungsgemäße Mikroskop verwirklicht in vorteilhaften Ausgestaltungen eine oder mehrere der oben genannten Weiterbildungen. Da die Anregungsstrahlung sowohl zur Anregung der Lumineszenz als auch zur Verhinderung bzw. Minderung von Lumineszenz verwendet wird, ist es vorteilhafterweise möglich, eine einzige Anregungsstrahlungsquelle vorzusehen, welche die Anregungsstrahlung abgibt und der eine Einrichtung nachgeordnet ist, welche dem Strahlprofil ein Minimum, vorzugsweise mit variabler Tiefe, aufprägt, wobei im Minimum die Leistung unter dem Schwellwert liegt.
Die zweite Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des
Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist, gelöst, bei dem der
Strahlteiler eine im Detektionsstrahlengang liegende Strahlteilerfläche aufweist, die an drei
Punkten verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche auf einen Kreis um den
Durchstoßpunkt der optischen Achse liegen, und bei dem die Beleuchtungsstrahlquelle eine der Punktzahl entsprechende Anzahl an Teilstrahlen erzeugt und diese auf die Punkte des
Strahlteilers derart fokussiert, daß in der Probe ein Interferenzmuster in Form periodisch über die Probe verteilter Beleuchtungsflecke entsteht. Die erfindungsgemäße Lösung läßt sich natürlich auch invertieren, indem der Strahlteiler die Detektionsstrahlung ausspiegelt und spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung passieren läßt. Dazu ist vorgesehen, ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist, wobei der Strahlteiler eine im Detektionsstrahlengang liegende reflektierende Strahlteilerfläche aufweist, die zumindest an drei Punkten für die Beleuchtungsstrahlung nicht verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt der optischen Achse liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen erzeugt und diese auf die drei Punkte des Strahlteilers derart fokussiert, daß in der Probe ein Interferenzmuster in Form periodisch über die Probe verteilter Beleuchtungsflecke entsteht.
Die Erfindung erzielt eine hocheffiziente Punktgruppenerzeugung mittels eines einfachen Aufbaus.
Erfindungsgemäß wird der Strahlteiler so ausgebildet, daß die Probe mit einer Punktgruppe in Form eines durch Interferenz erzeugten Musters beleuchtet wird. Dies erlaubt eine parallele Beleuchtung mehrerer Punkte und auch ein paralleles Abtasten dieser gleichzeitig beleuchteten Punkte, wenn die Detektoreinrichtung eine Multipunktdetektion an den beleuchteten Flecken vornimmt. Im Ergebnis erhält man gegenüber einer Einzelpunktbeleuchtung eine um die Punktanzahl vervielfachte Abtastgeschwindigkeit, ohne daß die Tiefenauflösung beeinträchtigt wäre. Die Beleuchtung (in der Fluoreszenzmikroskopie, Anregung) der Probe mit dem regelmäßigen Punktgruppenmuster erfolgt erfindungsgemäß unter Ausnutzung eines Interferenzeffektes, so daß die Anzahl an Beleuchtungsstrahlen, welche die Beleuchtungsquelle bereitstellt, sehr viel geringer ist, als die Anzahlen an Beleuchtungsflecken im regelmäßigen Muster. Der Interferenzeffekt benötigt lediglich mindestens drei reflektierende Punkte / transmittierende Löcher am Strahlteiler, auf die die Beleuchtungsstrahlung fokussiert wird, so daß man mindestens drei Beleuchtungsstrahlen am Strahlteiler einkoppelt. Diese Anzahl an Beleuchtungsstrahlen (in dieser Beschreibung wird der Begriff "Strahl" synonym für ein entsprechendes Strahlbündel verwendet) läßt sich einfach erzeugen. Z.B. werden bei einem Ausgangsstrahl lediglich zwei Teilerelemente benötigt. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Beleuchtungsstrahlquelle einen Laser, der einen Laserstrahl abgibt, und eine Teilereinrichtung, die den Laserstrahl in die mindestens drei Teilstrahlen aufteilt und mittels einer Optikeinrichtung auf die Punkte / Löcher fokussiert, aufweist.
Die Anzahl an reflektierenden bzw. transmittierenden Punkten ist nicht auf drei begrenzt. Es können auch mehr Punkte verwendet werden, die auf dem Kreis symmetrisch bzw. entlang der Kreislinie möglichst gleich verteilt oder äquidistant liegen sollten, aber disjunkt sein müssen. Bei vier Punkten können diese z.B. an den Ecken eines Quadrates liegen, in dessen Zentrum sich der Durchstoßpunkt befindet.
Das erfindungsgemäße Mikroskop mit dem die Beleuchtung unter Ausnutzung der Interferenz bewirkenden Strahlteiler erzielt, wie bereits erwähnt, eine hohe Scangeschwindigkeit durch Parallelisierung der Beleuchtung und gegebenenfalls Detektion. Zugleich können in einer vorteilhaften Ausgestaltung die Anforderungen an den zum Scannen erforderlichen Scanmechanismus drastisch reduziert werden, da es zum Abrastern der Bildfläche nur noch erforderlich ist, eine Verschiebung innerhalb einer Periode des periodischen Punktgruppenmusters auszuführen. Die Scaneinrichtung muß also, wenn sie beispielsweise als optischer im Strahlengang wirkender Scanner ausgebildet ist, nur noch einen vergleichsweise geringen Ablenkwinkel erreichen. Dies kommt der Scangeschwindigkeit wie apparativen Vereinfachungen gleichermaßen entgegen. Es ist deshalb in einer Weiterbildung zu bevorzugen, daß in Beleuchtungsrichtung dem Strahlteiler nachgeordnet eine Scaneinrichtung vorgesehen ist, die eine Verschiebung des Punkgruppenmusters über der Probe innerhalb einer Periode des Punktgruppenmusters bewirkt. Neben einer strahlablenkend arbeitenden Scaneinrichtung kann dabei natürlich auch eine Bewegung der Probe, z. B. durch einen sogenannten Tischscanner, verwendet werden.
Die interferenzbedingte Erzeugung des Beleuchtungs-Punktgruppenmusters erlaubt es, die Helligkeit der Lichtflecke gegenüber den die Lichtflecke umgebenden Dunkelbereichen einfach zu verstellen, indem nämlich die Intensität jeweils diagonal gegenüberliegend fokussierter Teilstrahlen variiert wird. Es sind deshalb in einer Weiterbildung der Erfindung geeignete Mittel zur Variation vorgesehen, die dem Strahlteiler in Beleuchtungsrichtung vorgeordnet sind, und beispielsweise in Form einstellbarer Abschwächelemente ausgebildet sind.
Die Anzahl an hellen Flecken im Punktgruppenmuster hängt ausschließlich von dem ausgeleuchteten Bereich auf der Probe ab, wenn im Beleuchtungsstrahlengang im wesentlichen eine Abbildung der Pupille, in welcher der Strahlteiler angeordnet ist, auf die Probe erfolgt. Der beleuchtete Bereich der Probe und damit die Anzahl an Probenpunkten läßt sich dann einfach durch Mittel zur Brennweitenvariation der Abbildung zwischen Strahlteiler und Probe bewirken. Mit anderen Worten, Mittel zur Veränderung der von der optischen Abbildung erfaßten Bildfeldgröße variieren automatisch auch die Anzahl an Beleuchtungspunkten, die auf der Probe durch die Interferenz entstehen.
Eine parallele Detektion der gleichzeitig beleuchteten Flecken auf der Probe erhöht, wie bereits erwähnt, die Bildaufnahmegeschwindigkeit. Besonders einfach kann eine solche parallele Abtastung erreicht werden, wenn der Detektionsstrahlengang in einem Matrixdetektor endet, dem optional noch eine auf das Beleuchtungsmuster abgestimmte Pinholemaske vorgeordnet werden kann. Natürlich können aber auch die ortsauflösenden Elemente des Matrixdetektors die Funktion der Pinholemaske übernehmen.
Die reflektierenden Elemente des Strahlteilers müssen nur für Beleuchtungsstrahlung reflektieren, nicht für Detektionsstrahlung. Der Strahlteiler kann also auch dichroitisch ausgebildet werden.
Der Punktabstand im Punktgruppenmuster kann über den Abstand der Foki auf den Strahlteiler, also über den Kreisradius, verstellt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielhalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
Fig. 1a und 1 b ortsabhängige Leistungsverteilungen für Verfahren des Standes der Technik,
Fig. 2a-2c Schemazeichnungen für verschiedene Verfahren zur Auflösungssteigerung gemäß dem Stand der Technik,
Fig. 3 ein auflösungsgesteigertes Fluoreszenzmikroskop nach dem Stand der Technik,
Fig. 4 eine Fluoreszenzkennlinie einer Probe,
Fig. 5 eine Schemazeichnung zur erfindungsgemäßen Auflösungssteigerung,
Fig. 6a/b ein- bzw. zweidimensionale Leistungsverteilungen, wie sie bei der Auflösungssteigerung nach einer ersten und zweiten Verfahrensform anfallen, F Fiigg.. 7 7 eine Darstellung ähnlich der Fig. 6a/b für eine dritte Verfahrensform,
Fig. 8a/b Darstellungen ähnlich der Fig. 6a/b für eine vierte und fünfte Verfahrensform,
Fig. 9a/b eine Schemazeichnung für ein erstes auflösungsgesteigertes Mikroskop,
Fig. 10 eine Leistungsverteilung ähnlich der Fig. 6a zur Verdeutlichung der Wirkungsweise des Mikroskops der Fig. 9, Fig. 1 1a/b eine Kennlinie ähnlich der Fig. 4 sowie eine Leistungsverteilung zur Verdeutlichung eines zweiten auflösungsgesteigerten Mikroskops,
Fig. 12 eine Schemadarstellung des zweiten Mikroskops,
Fig. 13 eine Schemadarstellung eines dritten auflösungsgesteigerten Mikroskops, Fig. 14 eine Schemadarstellung zur Funktionsweise des dritten Mikroskops,
Fig. 15a/b Schemadarstellungen von Teilen eines vierten Mikroskops,
Fig. 16a eine Verteilung der Anregungs- bzw. Rücksetzstrahlung in einer Pupille des vierten Mikroskops, Fig. 16b eine mit dem vierten Mikroskop realisierte Multispotverteilung,
Fig. 17 eine Fluoreszenzverteilung beim vierten Mikroskop,
Fig. 18 eine Verteilung der Anregungs- bzw. Rücksetzstrahlung in einer Pupille einer
Variante des vierten Mikroskops,
Figur 19 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops, Figur 20 eine alternative Ausgestaltung einer Beleuchtungsquelle für das Mikroskop der
Figur 19,
Figur 21 eine Draufsicht auf einen Strahlteiler des Mikroskops der Figur 19 und
Figur 22 ein vom Mikroskop der Figur 19 bewirktes Beleuchtungsmuster auf der Probe.
Nachfolgend werden in verfahrenstechnischer Erläuterung sowie in Mikroskopbeschreibungen verschiedene Ausführungsformen zur auflösungsgesteigerten Lumineszenzmikroskopie dargestellt. Dies geschieht rein exemplarisch anhand verschiedener Fluoreszenzmikroskope bzw. Fluoreszenzmikroskopieverfahren. Natürlich sind die nachfolgend geschilderten Ausführungsbeispiele, d.h. Verfahrensformen und Mikroskope, auch für andersartig lumineszierende Substanzen einsetzbar, beispielsweise für phosphorisierende Proben oder Farbstoffe. Soweit nachfolgend von einem Farbstoff gesprochen wird, so ist auch dies nur beispielshalber aufzufassen. Anstelle eines Farbstoffes, der zur Präparation einer Probe eingesetzt werden kann, kann natürlich auch eine direkt fluoreszierende (oder phosphorisierende) Substanz als Probe treten, wodurch eine Farbstoffzugabe entbehrlich ist. Auch können zusätzliche Farbstoffe verwendet werden, die andere Eigenschaften zeigen und nicht in einen zweiten Zustand bringbar sind. Weiter können für einzelne Verfahrensformen oder Mikroskope geschilderte Merkmale auch für andere beschriebene Verfahrensformen oder Mikroskope eingesetzt werden, so daß auch hier nicht geschilderte Kombinationen möglich sind.
Fig. 4 zeigt beispielshalber eine Fluoreszenz-Kennlinie 17 für einen Farbstoff, der erfindungsgemäß verwendet wird. Diese Fluoreszenz-Kennlinie 17 gibt die Leistung L der abgegebenen Fluoreszenzstrahlung F als Funktion der Leistung L der Anregungsstrahlung A wieder. Wie zu sehen ist, steigt die Kennlinie 17 weitgehend linear, jedenfalls monoton, bis zu einem Maximum 18 und fällt dann oberhalb eines Schwellwerts 19 für die Anregungsstrahlungsleistung wieder ab. Erkennbar sind zwei Zustands-Regionen, die jeweils links und rechts vom Schwellwert 19 bzw. dem Maximum 18 liegen. Wird eine Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwerts 19 eingestrahlt, befindet sich der Farbstoff vorrangig in einem ersten Zustand 5. In diesem kann er Fluoreszenzstrahlung abstrahlen. Wird die Anregungsstrahlungsleistung über den Schwellwert 19 erhöht, findet eine Umschichtung der Farbstoffmoleküle in einen zweiten Zustand 6 statt. Farbstoffmoleküle im zweiten Zustand 6 können entweder nicht fluoreszieren, strahlen eine Fluoreszenzstrahlung mit geänderten optischen Eigenschaften ab und/oder besitzen eine gegenüber dem ersten Zustand 5 geänderte Absorptionseigenschaft. Die geänderten optischen Eigenschaften für Fluoreszenzemission oder Absorption können die spektrale Zusammensetzung, die Polarisation und/oder die Lebensdauer der Fluoreszenzstrahlung betreffen. Im Ergebnis fällt in der zweiten Zustands-Region die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F, wenn man sich auf die Art der Fluoreszenzstrahlung, die im ersten Zustand 5 abgeben wird, bezieht, wieder ab.
Die Erfindung setzt nun die Kennlinie 17 dahingehend ein, daß die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A nur einen Teil der Probe in die erste Zustands-Region (oder kurz ersten Zustand) 5, einen anderen Teil der Probe jedoch in die zweite Zustands-Region (oder kurz zweiten Zustand) 6 bringt. Bereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes 19 beleuchtet wurden/werden, emittieren somit die bestimmte Fluoreszenzstrahlung nur vermindert. Dabei ist es vorteilhaft, wenn der zweite Zustand 6 ein reversibler Zustand ist. Dies bedeutet, daß zumindest nach einer gewissen Zeit oder nach aktiver Einwirkung ein einmal mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes 19 bestrahlter Farbstoff wieder die Eigenschaften des ersten Zustandes 5 zeigt. Ein Beispiel für einen Farbstoff, für den die Erfinder eine Kennlinie gemäß der Fig. 4 erkannten, ist die als Dronpa bezeichnete Substanz, die in der Veröffentlichung R. Ando et al., „Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting", Science, 19. November 2004, Vol. 306, S. 1370-1373, beschrieben ist. Der Farbstoff ist von der Firma Amalgaam, Woburn, Massachusetts, USA, unter der Bezeichnung Dronpa-Green, Code-Nr. AM-V0071 , verfügbar und bislang im Zusammenhang mit der Fluoreszenzmarkierung von Molekülen, deren Transporteigenschaften durch Zellmembranen untersucht werden sollen, bekannt. Der Farbstoff Dronpa kann bei einer Wellenlänge von 488 nm angeregt werden, und nach Anregung in den zweiten Zustand 6 durch Strahlung bei einer Wellenlänge von 405 nm wieder in den ersten Zustand 5 zurückgeführt werden.
In Kombination mit einer geeigneten Anregungsstrahlungsverteilung beim Beleuchten der Probe führt die Verwendung des Farbstoffes mit der Kennlinie der Fig. 4 oder einer entsprechenden Kennlinie zu einer deutlichen Steigerung der Auflösung. Dabei wird im Gegensatz zum Stand der Technik nur Strahlung mit einer Wellenlänge eingestrahlt, und nur diese Strahlung trägt zur Auflösung bei. Das Rückschalten kann den Ausführungsformen, bei denen der Farbstoff nicht spontan in den ersten Zustand 5 zurückkehrt, durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung R erreicht werden, die jedoch zur Auflösungssteigerung unbeachtlich ist. Mit der Anregungsstrahlung A wird neben der Anregung der Farbstoffmoleküle aus dem Grundniveau heraus in das erste angeregte Niveau (erster Zustand 5) auch die Verhinderung von Fluoreszenz oder auch eine Entvölkerung (zweiter Zustand 6) bewerkstelligt. Bei der Entvölkerung erfolgt eine Umlagerung der Farbstoffmoleküle aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand. Die beiden Zustände haben voneinander verschiedene optische Fluoreszenzeigenschaften. Nach der Anregung mit der Anregungsstrahlung A kann sofort das hochaufgelöste Fluoreszenzbild gewonnen werden, wobei hochaufgelöst sich auf die optische Auflösung der Anregungsstrahlung A bezieht. Falls der Farbstoff aus dem zweiten Zustand nicht spontan in den ersten Zustand zurückkehrt, wird aktiv eine Rücksetzung, beispielsweise mittels einer Rücksetzstrahlung R, die von der Anregungsstrahlung A verschiedene optische Eigenschaften aufweist, bewerkstelligt. Das entsprechende Schema zeigt Fig. 5.
Ursprünglich befindet sich z.B. die zu untersuchende Probe P im ersten Zustand 5, in dem die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F mit der Leistung der Anregungsstrahlung A steigt. Die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A erfolgt nun so, daß in einzelnen Proben-Bereichen B2 die Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert 19 liegt. In anderen Bereichen B1 liegt sie darunter. Somit sind einige Proben bereiche im ersten Zustand 5, andere im zweiten Zustand 6, je nach dem ob die Leistung der Anregungsstrahlung über oder unter dem Schwellwert 19 liegt. Fig. 5 zeigt schematisch die Überführung der Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung A in Probenbereiche B1 im ersten Zustand 5 (rechter Teil der unteren Hälfte der Fig. 5) sowie Probenbereiche B2 im zweiten Zustand 6 (linker Teil). Probenbereiche B2 im zweiten Zustand 6 können nicht mehr effizient fluoreszieren, vor allem wenn eine Anregungsstrahlungsleistung deutlich über dem Schwellwert 19 verwendet wurde. Der Begriff „fluoreszieren" bezieht sich dabei auf Fluoreszenzstrahlung mit bestimmten Eigenschaften. Es ist also durchaus möglich, daß auch im zweiten Zustand 6 Fluoreszenzstrahlung abgegeben wird, jedoch mit anderen Eigenschaften als im ersten Zustand 5. Entweder ändern sich im zweiten Zustand also die Absorptionseigenschaften oder/und die Fluoreszenzeigenschaften der Probe.
Bereiche B1 der Probe, die im ersten Zustand 5 bleiben, emittieren nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung A weiterhin dieselbe Fluoreszenzstrahlung F. Einstrahlung von Rücksetzstrahlung R (in Figur 5 ist dieser Vorgang durch einen entsprechenden Pfeil veranschaulicht) bringt die gesamte Probe P wieder in den ersten Zustand 5, reversiert also die Aufteilung in zwei verschieden fluoreszierende Probenbereiche B1 und B2.
Die Aufteilung der Probe in Probenbereiche B1 , die sich im ersten Zustand 5 befinden, und Probenbereiche B2, die sich im zweiten Zustand 6 befinden, ermöglicht es nun, die Emission von Fluoreszenzstrahlung F auf ein Volumen der Probe P zu beschränken, das kleiner ist, als das ursprüngliche mit Anregungsstrahlung A beleuchtete Volumen. Es läßt sich somit also eine Struktur im fluoreszierenden Bild erreichen, die ursprünglich in der Anregungsstrahlungsverteilung nicht vorhanden war. Ursache dafür ist die geschickt eingesetzte Nichtlinearität der Kennlinie 17.
Die Fig. 6a und 6b zeigen zwei Verfahrensformen, wie die Anregungsstrahlungsverteilung zur Auflösungssteigerung aussehen kann. Beide Figuren zeigen links einen eindimensionalen Schnitt durch die Anregungsstrahlungsverteilung bzw. Fluoreszenzstrahlungsverteilung. Jeweils rechts ist das zweidimensionale Bild der Fluoreszenzstrahlungsverteilung in Draufsicht zu sehen.
In Fig. 6a wird eine punkförmige verteilte Anregungsstrahlung A eingestrahlt. Die Verteilung ist hier eine beugungsbegrenzte Airy-Verteilung. Hierdurch wird im Farbstoff Fluoreszenzstrahlung F mit einer ellipsoidförmigen Donut-Verteilung angeregt, die sich im zweidimensionalen Bild als lateral fluoreszierender, kreisförmiger Ring darstellt. Es fluoreszieren nur die Proben-Bereiche B1. Axial liegt ein fluoreszierender ellipsenförmiger Ring dar. Dieser Probenbereich B1 ist kleiner als die Beugungsgrenze der Anregungsstrahlung erlaubt.
Strahlt man dagegen, wie in Fig. 6b gezeigt, eine ebenfalls beugungsbegrenzte Donut-förmige Verteilung der Anregungsstrahlung A ein, ergibt sich ein abstrahlender Proben-Bereich B1 , der einer verkleinerten Airy-Verteilung entspricht, welche von einem ringförmigen fluoreszierenden Bereich umgeben ist. In der Schnittdarstellung zeigen sich in der Verteilung der Fluoreszenzstrahlung F deshalb drei Peaks als Proben-Bereiche B1. Auch hier ist die Punktverwaschungsverteilung 16 kleiner als die Beugungsgrenze zuläßt. Die Verbesserung der Auflösung über die normale Punktverwaschungsverteilung hängt wesentlich von der Kombination aus Kennlinie 17 und Leistungsverteilung der Anregungsstrahlung A ab.
Zur Ausblendung des ringförmigen Außenbereichs ist es zusätzlich möglich, eine konfokale Detektion durchzuführen, die den mittleren Peak durch geeignete Einstellung eines konfokalen Detektionsvolumens D auswählt. Dies ist schematisch als dritte Verfahrensform in Fig. 7 dargestellt. Der nun noch detektierte fluoreszierende Proben-Bereich B1 besteht dann aus dem mittleren Peak. Insgesamt ist z.B. ein bildgebendes Volumen B (punktierte Linie in der rechten Darstellung der Fig. 7) erreicht, das zweieinhalb mal schmäler ist, als die konventionelle Punktverwaschungsverteilung, und sogar 1 ,7-mal schmäler, als eine konfokale Punktverwaschungsverteilung. Bei einer Donut-förmigen Anregungsverteilung, wie sie die durchgezogene Kurve in der rechten Darstellung der Fig. 6b bzw. 7 zeigt, ist die resultierende Verteilung des bildgebenden Volumens B bzw. der mittlere Peak der Punktverwaschungsverteilung der Fig. 6b radialsymmetrisch. Verwendet man zwei Beleuchtungsspots, erreicht man eine maximale Auflösungssteigerung entlang der Verbindungslinie der Spotmaxima.
Alternativ wird der äußere fluoreszierende Ring in Fig. 6b durch ein gezieltes Rückschalten des Farbstoffs aus dem zweiten Zustand 6 in den ersten Zustand 5 im Bereich des konfokalen Detektionsvolumens D ausgeblendet. Das Vorgehen/Prinzip ist dann wie folgt: Zuerst wird mit Anregungsstrahlung so angeregt, daß der zu untersuchende Probenabschnitt vollständig in den zweiten Zustand gelangt. Anschließend wird Rücksetzstrahlung R mit einer Verteilung entsprechend dem konfokalen Detektionsvolumen D eingestrahlt und damit ein Teil der Probe zurückgeschaltet. Bei nochmaliger Anregung mit der Anregungsstrahlungsverteilung A gemäß Fig. 7 gelangt dann nur der in diesem Probenteil liegende bildgebende Bereich B in den ersten Zustand und emittiert Fluoreszenzstrahlung F in Form des mittleren Peaks, wie er auch in der Variante der Fig. 7 verbleibt. Der ringförmige Außenbereich verbleibt im zweiten Zustand und fluoresziert nicht.
In einer vierten Verfahrensform erfolgt eine strukturierte flächige Beleuchtung, wie sie beispielsweise in Fig. 8a gezeigt ist. Eine in x-Richtung sinusförmig verteilte Anregungsstrahlung A führt in den Tälern der sinusförmigen Leistungsverteilung zu Fluoreszenzstrahlung F. Die fluoreszierenden Proben-Bereiche B1 sind streifenförmig. Die Streifen sind jedoch deutlich schmaler als die Streifen der sinusförmigen Verteilung der Anregungsstrahlung A. Vorteilhaft ist hierbei, daß die sinusförmige Verteilung der Anregungsstrahlung A als Minima keine Nullstellen aufweist bzw. aufweisen muß. Die resultierende Verteilung der Fluoreszenzstrahlung F hängt zwar in ihrer Höhe, nicht jedoch in der Breite von der Leistung der Anregungsminima ab. Die Tiefe der Minima der sinusförmigen Anregungsstrahlungsverteilung ist also unkritisch für die Breite der Streifen und somit für die Auflösung. Im Beispielfall ist die Periode der sinusförmigen Streifenverteilung der Anregungsstrahlung A an der Grenzfrequenz der Auflösung eingestellt. Als Detektor wird z.B. ein Matrixdetektor verwendet. Die Streifenbreite und mithin die Auflösung ist um Faktor 6 gegenüber der Grenzfrequenz der Auflösung verbessert. Ein hochaufgelöstes Bild wird nun durch Verschiebung des Streifenmusters gewonnen.
Alternativ kann statt einer streifenförmigen Weitfeldbeleuchtung auch eine brennlinienförmige Beleuchtung verwendet werden, wobei die Linie entlang ihrer Längsachse (z.B. sinusförmig) moduliert ist, so daß die Leistung in Linienabschnitten über dem Schwellwert und in Linienabschnitten unter dem Schwellwert liegt. Die Scanbewegung erfolgt senkrecht zur Linie und entlang der Linie. Der Detektor ist ein geeignet hochauflösender Zeilendetektor. Fig. 8b zeigt eine Weiterbildung der vierten Verfahrensform der Fig. 8a. In dieser fünften Verfahrensform erfolgt die Strukturierung der Verteilung der Auflösungsstrahlung A in beiden lateralen Achsen, d. h. in der Probenebene, so daß eine matrixförmige Beleuchtungsspotverteilung gegeben ist. Dies ist in der Schnittdarstellung der linken Hälfte der Fig. 8b eindimensional dargestellt. Senkrecht zur optischen Achse ist eine Matrix aus hellen Anregungsspots auf die Probe abgebildet. Jedem Beleuchtungsspot wird nun ein Detektor zugeordnet. Eine Verschiebung des Spotmusters relativ zur Probe erlaubt es, die Zwischenräume zwischen den Punkten ebenfalls zu vermessen. Der Bereich in dem die Verschiebung des matrixförmigen Musters zu erfolgen hat, ist in Fig. 8b als Gebiet G1 dargestellt. Durch eine Abrasterung der Spotmatrix, beispielsweise wie mit einem konventionellen Laserscanningmikroskop bekannt, wird insgesamt das gesamte Gebiet G2 aus Einzelgebieten G1 zusammengesetzt. Durch diese Parallelisierung ist eine sehr hohe Scangeschwindigkeit erreicht. Zugleich ist die Auflösung, wie die schmalen Peaks der Fluoreszenzstrahlung F in der Schnittdarstellung zeigen, über die Auflösung der Anregungsstrahlungsverteilung hinaus gesteigert.
Obwohl bislang nur die laterale Auflösung erwähnt wurde, ist auch die axiale Auflösung für die Ausführungsformen verbessert.
Fig. 9a zeigt ein Laserscanningmikroskop, das jede der erläuterten Verfahrensformen realisieren kann. Für die Verfahrensformen 1 bis 3 ist das Laserscanningmikroskop 20 z. B. als einzelpunktscannendes Mikroskop ausgebildet. Es weist ein Anregungsmodul 21 , ein Mikroskopmodul 22 sowie ein Detektormodul 23 auf. Im Mikroskopmodul 22 befindet sich eine Probe 24 im Fokus eines Objektivs 25, dem in Beleuchtungsrichtung eine Tubuslinse 26 vorgeschaltet ist. Vor dieser Optik liegt eine Scanoptik 27, die zusammen mit einem Scanner 28 ein Abscannen der Probe 24 durch Verschieben des Fokuspunktes auf der Probe ermöglicht. Ein Hauptfarbteiler 29 koppelt die Strahlung aus dem Anregungsstrahlungsmodul 21 in das Mikroskopmodul 22 ein und trennt aus dem Mikroskopmodul 22 von der Probe 24 aufgenommene Strahlung zum Detektormodul 23 ab.
Das Anregungsmodul 21 verfügt über eine Lichtquelle 30, deren Strahlung über den Hauptfarbteiler 29 zum Fokuspunkt in der Probe 24 gebündelt wird. Die im Fokuspunkt der Probe 24 angeregte Fluoreszenzstrahlung F wird vom Objektiv 25 gesammelt und am Hauptfarbteiler 29 aufgrund der im Vergleich zur Anregungsstrahlung A geänderten Spektraleigenschaften zu einer Pinholeoptik 31 ausgekoppelt, der ein Pinhole 32 sowie ein (optionaler) Blockfilter 33 nachgeschaltet sind. Ein Punkt-Detektor 34 erfaßt die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F am Fokuspunkt. Die Erfassung kann zusätzlich spektral aufgelöst, polarisationsaufgelöst und/oder zeitaufgelöst erfolgen. Die Signale des Detektors 34 werden von einem Steuergerät 35 ausgelesen, das insgesamt den Betrieb des Laserscanningmikroskops 20 steuert.
Zur Auflösungssteigerung erfolgt die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A in den Fokuspunkt 24 mit einer bestimmten Leistungsverteilung. Um diese vorzugeben und einzustellen, ist ein geeigneter Aufbau im Anregungsmodul 21 vorgesehen. Die Bauweise der Fig. 9a weist einen Strahlteiler 36 auf, der 50% der Strahlleistung der Lichtquelle 30 auskoppelt. In der Ausführungsform handelt es sich bei dem Strahlteiler 36 um einen Polarisationsstrahlteiler. Die derart aufgespaltenen Teilstrahlen werden nachher über einen weiteren Strahlteiler 40 wieder zu einem gemeinsamen Strahl überlagert, wobei die Intensitäten und Phasen der Teilstrahlen zuvor geeignet eingestellt werden. Zusätzlich ist in einem Teilstrahl ein Phasenelement 39 gestellt, das entweder als festes Phasenelement oder als variabel einstellbares Phasenelement ausgebildet werden kann. Das Phasenelement 39 hat z. B. einen phasenverändernden Bereich 44 sowie einen phasenneutralen Bereich 49, so daß eine donutförmige Leistungsverteilung im Strahl erzeugt wird. Nach Überlagerung der beiden Teilstrahlen nach dem Strahlteiler 40 erhält man Anregungsstrahlung A gemäß Fig. 10. Der Aufbau des Phasenelementes 39 ist exemplarisch in Fig. 9b gezeigt. Zur Einstellung der Leistungsanteile der beiden Teilstrahlen vor der Überlagerung sind in jeden Teilstrahl noch variable Abschwächer 37 bzw. 38 gestellt.
Im Ergebnis erhält man eine Verteilung der Leistung der Anregungsstrahlung A, wie sie in Fig. 10 als Schnittdarstellung entlang einer senkrecht zur optischen Achse verlaufende x-Achse gezeigt ist. Die Verteilung weist ein Minimum 45 auf, dessen Tiefe durch Einstellung der Abschwächer 38 bzw. 37, d.h. durch Änderung der relativen Leistung der beiden Teilstrahlen variabel einstellbar ist, z. B. durch das Steuergerät 35. Die Anpassung des Minimums 45 erlaubt es, die Intensität der ebenfalls in Fig. 10 eingezeichneten Fluoreszenzstrahlung F optimal einzustellen.
Das hinsichtlich der Tiefe einstellbare Minimum 45 kann auch durch den Einsatz eines variabel einstellbaren Phasenelementes ohne Bildung von Teilstrahlen erzeugt werden. Für ein solches Phasenelement kommt eine Matrix aus Flüssigkristallen in Frage, bei der die Phase jedes einzelnen Pixels einstellbar ist. Natürlich sind noch andere Einrichtungen zur Erzeugung einer donatförmigen Strahlverteilung mit einstellbarem Minimum 45 möglich.
Für ein optionales Rückschalten der Proben-Bereiche B2 vom zweiten Zustand 6 in den ersten Zustand 5 kann eine Rücksetzstrahlungsquelle 41 vorgesehen werden, die über einen dritten Teiler 42 in den Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls 21 eingebunden ist. Diese Bauweise ist jedoch optional, weshalb die Darstellung der Fig. 9a auch eine gestrichelte Darstellung für diese Elemente zeigt. Die Rücksetzstrahlungsquelle 41 ist nur dann erforderlich, wenn der Farbstoff der Probe 24 nicht spontan wieder in den ersten Zustand zurückkehrt, sondern eines aktiven Rücksetzens durch optische Rücksetzstrahlung R bedarf. Rücksetzstrahlung kann jedoch auch anderweitig auf die Probe 24 aufgebracht werden, beispielsweise durch eine Einstrahlung schräg zur optischen Achse des Objektivs 25 mit Hilfe einer seitlich vom Laserscanningmikroskop angebrachten Rücksetzstrahlquelle.
Das Mikroskop der Fig. 9a kann die eingangs geschilderten Verfahrensformen ausführen. Die dritte Verfahrensform erfordert dabei die Verwendung des Pinholes 32 und der Pinholeoptik 31 im Detektormodul 23. Immer dann, wenn man keine konfokale Detektion benötigt, können die dafür nötigen Bauteile (31 , 32) entfallen.
Fig. 11 a zeigt eine weitere Verbesserungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Vorgehens auf. Der Übergang der Probe im Teil-Bereich B2 aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand 6 kann unvollständig stattfinden. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn die Fluoreszenzkennlinie 17 nach dem Maximalwert 18, d.h. für Leistungen der Anregungsstrahlung A oberhalb des Schwellwertes 19, nicht steil genug abfällt. Im Beispiel der Fig. 11 a geht die Kennlinie 17 auch bei hohen Anregungsstrahlungsleistungen nicht auf Null zurück. Dies führt zu einer Restfluoreszenz 47 in den Proben-Bereichen B2, die im zweiten Zustand 6 sind, da der geminderte Anteil 46 nicht dem Maximalwert 18 entspricht. Würde man die Fluoreszenzstrahlung F dann mit dem Mikroskop gemäß Fig. 9a beispielsweise in Realisierung der dritten Verfahrensform vermessen, so würde sich das bildgebende Volumen B aus einem niedrig aufgelösten Sockel S und einer hochaufgelösten Verteilung V zusammensetzen. Dies ist in Fig. 11 b schematisch dargestellt, die den Sockel S schraffiert und die hochaufgelöste Verteilung V schwarz zeigt.
Der gleiche Effekt kann auftreten, wenn in der Probe eine starke Diffusion des fluoreszierenden Materials, beispielsweise der Farbstoffmoleküle, herrscht. Auch dann ergibt sich eine Restfluoreszenz 47 in den Proben-Bereichen B2, jedoch nicht aufgrund einer vergleichsweise schwach abfallenden Kennlinie 17, sondern durch Diffusion des fluoreszierenden Materials.
Der Sockel S läßt sich durch geeignete Bildaufnahme unterdrücken. Eine dies realisierende zweite Ausführungsform eines Laserscanningmikroskops 20 ist exemplarisch in Fig. 12 dargestellt. Mit der Bauweise gemäß Fig. 9a übereinstimmende Komponenten sind mit denselben Bezugszeichen versehen, so daß auf ihre nochmalige Erläuterung verzichtet werden kann.
Im Unterschied der Bauweise der Fig. 9a ist nun der Detektor 34 mit einem Lock-In-Verstärker 48 verbunden, wobei diese Verbindung in Fig. 12 lediglich exemplarisch über das Steuergerät 35 realisiert ist. Natürlich ist auch eine direkte Verbindung möglich. Auch kann der Lock-In- Verstärker 48 in das Steuergerät 35 integriert werden. Der Lock-In-Verstärker 48 ist mit einem Frequenzgenerator 49 verbunden, der das Minimum 45 in seiner Amplitude moduliert. Hierzu wird die Leistung einer der beiden Teilstrahlen im Anregungsmodul 21 geeignet moduliert, was z.B. durch eine Ansteuerung einer der beiden Abschwächer 37 oder 38 geschieht. In der Darstellung der Fig. 12 ist die Ansteuerleitung für den Abschwächer 38 gestrichelt dargestellt, um diese Option anzudeuten. Natürlich kann die Ansteuerung der Abschwächer auch durch das Steuergerät 35 erfolgen, das das Signal des Frequenzgenerators 49 entsprechend auswertet. Wie bereits erwähnt, können der Lock-In-Verstärker 48 und/oder der Frequenzgenerator 49 Bestandteile des Steuergerätes 35 sein.
Die vom Frequenzgenerator 49 zur Modulation des Minimums bereitgestellten Frequenz wird auch dem Lock-In-Verstärker 48 zugeführt. Durch die Modulation des Minimums 45 verändert sich das Signal aus den Proben-Bereichen im ersten Zustand 5, wohingegen Signale aus dem Sockel S konstant bleiben. Der Lock-In-Verstärker 48 separiert die modulierten Signale heraus und unterdrückt Signale aus dem Sockel S. Im Ergebnis erfolgt eine Trennung der Verteilung V vom Sockel S, und die hochaufgelöste Detektion ist auch bei einem unvollständigem Übergang in den zweiten Zustand 6 erreicht.
Verwertet man gezielt den Gleichanteil des Signals, erreicht man eine zusätzliche Bildinformation, die nicht hochaufgelöst ist. Diese Bildinformation kann sich z.B. auf andersartig fluoreszierende Proben-Bereiche/-Eigenschaften beziehen. Die hoch und niedrig aufgelösten können beliebig codiert (z.B. farbcodiert) überlagert dargestellt werden.
Alternativ oder zusätzlich zu dieser Lock-In-Detektion können auch zwei Bilder aufgezeichnet werden. Ein erstes Bild wird mit Anregungsstrahlungsverteilung mit Minimum 45, das zweite ohne Minimum 45 aufgezeichnet. Zur Separierung der hochaufgelösten Verteilung V vom Sockel S werden dann nur noch die Bilder voneinander subtrahiert (erstes Bild minus zweites Bild). Das Ergebnisbild enthält nur noch die Informationen mit der hochaufgelösten Verteilung V. Weitere Möglichkeiten zur Unterdrückung eines niedrig aufgelösten Sockels können die Nutzung der unterschiedlichen optischen Eigenschaften des ersten Zustands 5 und des zweiten Zustande 6 sein, beispielsweise wenn sich die Lebensdauer der beiden Zustände unterscheiden. Auch kann man eine unterschiedliche Charakteristik des Emissionsspektrums verwenden, bzw. eine unterschiedliche Charakteristik des Absorptionsspektrums zwischen erstem Zustand 5 und zweiten Zustand 6.
Fig. 13 zeigt eine nochmalige Abwandlung des Laserscanningmikroskops 20 der Fig. 9a zur Realisierung einer der Verfahrensformen mit linienförmiger Beleuchtung. Auch hier sind mit der Fig. 9a übereinstimmende Elemente mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet, so daß auf deren Beschreibung wiederum verzichtet werden kann. Weiter sind nur die Mittelstrahlen eingezeichnet.
Die nun kohärente Lichtquelle 30 strahlt ihre Strahlung durch ein Gitter 50, das zwei 1. Beugungsordnungen, o+ und o-, sowie eine O.-Beugungsordnung erzeugt. Dem Gitter ist eine Zylinderlinse 50a nachgeordnet, die hier ein Beispiel für ein anamorphotisches Element ist. Auf die Probe wird eine senkrecht zur optischen Achse liegende Linie fokussiert.
Die Beugungsordnungen fallen beim Fokussieren streifend zueinander ein und gelangen so in der Probe zur Interferenz. Durch den Talbot-Effekt entsteht ein sogenanntes Talbotgitter entlang der optischen Achse OA. Dies ist schematisch in der oberen Hälfte der Fig. 14 gezeigt. Die +1., die 0. sowie die -1. Ordnung fallen in der Probe 24 unter verschiedenen Winkeln ein und die Interferenzen erzeugen die dem Fachmann bekannte Talbotstruktur.
Die Wirkung innerhalb der Probe zeigt sich in der unteren Hälfte Fig. 14, die einen Tiefenschnitt (x,z-Ebene) durch die Probe zeigt. An den Stellen hoher Intensität (schwarze Bereiche B2) gelangt die Probe in den zweiten Zustand 6, d. h. es wird eine Entvölkerung der angeregten Zustände durch Umschalten der Farbstoffmoleküle erreicht. In den Bereichen B1 geringer Intensität verbleibt die Probe im ersten Zustand 5 (schraffierte und weiße Bereiche).
Die Detektion erfolgt mit einem Zeilendetektor 34, der in der Bauweise der Fig. 13 exemplarisch als mit dem Steuergerät 35 vereinigt dargestellt ist. Dem Zeilendetektor 34 ist wieder (optional) ein Blockfilter 33 vorgestellt. Weiter ist dem Zeilendetekor 34 eine (in Fig. 13 nicht dargestellte, da direkt auf den Zeilendetektor 34 aufgebrachte) entlang der x-Achse liegende Schlitzblende vorgeordnet, um die erforderliche konfokale Selektion einer Tiefenebene zu bewirken und dadurch nur die schraffierten Bereiche zu detektieren.
Der Scanner 28 ermöglicht die Bewegung der Anregungsstrahlungsverteilung über die Probe 24 senkrecht zur optischen Achse, also entlang der x- und y-Achse. Optional kann mit der
Rücksetzstrahlungsquelle 41 beispielsweise eine homogene Line entlang der x-Achse in der
Probe 24 erzeugt werden, die ein Umschalten der Farbstoffe aus dem zweiten Zustand 6 in den ersten Zustand 5 ermöglicht, wie dies Fig. 5 veranschaulicht. Diese Linie kann auch ein
Beleuchtungsmuster aufweisen, daß passend zu den Proben-Bereichen B2 im zweiten Zustand 6 liegt, da nur diese Bereiche zurückgesetzt werden müssen. Das Laserscanningmikroskop gemäß Fig. 13 realisiert also die Verfahrensform gemäß Fig. 8a. Die Tiefe der Minima 45 kann durch die Güte des Gitters bzw. die individuelle Abschwächung der einzelnen Ordnungen erfolgen.
Fig. 15a zeigt eine Anordnung zur Realisierung der Verfahrensform gemäß Fig. 8b, wobei vom Laserscanningmikroskop 20 hier nur das Anregungsmodul 21 gezeigt ist, da das Mikroskopmodul 22 ansonsten den bereits geschilderten Aufbau hat. Aus der Lichtquelle 30 werden mittels eines ersten Strahlteilers 53 zwei Teilstrahlen erzeugt, hier senkrecht zur Zeichenebene beabstandet. Ein zweiter Strahlteiler 52 erzeugt insgesamt vier parallel laufende Teilstrahlen. Fig. 15b zeigt die Anordnung in einem um 90° Grad gedrehten Schnitt. Insgesamt liegen vier Teilstrahlen 54, 55 gleicher Intensität (gezeichnet sind die Mittelstrahlen) vor. In der Zeichnung nehmen jeweils zwei Teilstrahlen den gleichen Weg, so daß sie verdeckt sind.
Die Teilstrahlen werden durch Linsen in eine Pupille des Mikroskopmoduls 22 fokussiert, so daß sich innerhalb einer Berandung 56 der Pupille die in Fig. 16a dargestellte Punktverteilung ergibt. Die vier Teilstrahlen 55, 54 nehmen die Ecken eines Quadrates ein. In der Probe 24 gelangen die Teilstrahlen zur Interferenz, wodurch senkrecht zur optischen Achse ein
Multispotmuster 58 gemäß Fig. 16b auf der Probe 24 entsteht. Die Tiefe der Nullstellen dieses
Multispotmusters 58 kann beispielsweise durch die Änderung der Intensitäten der jeweils diagonal gegenüberliegenden Strahlen 54, 55 variiert werden. Hierzu sind geeignete einstellbare Abschwächer (nicht gezeigt) für die Teilstrahlen vorgesehen.
An den Stellen hoher Intensität (helle Bereiche B2) im Multispotmuster 58 der Fig. 16b gelangt die Probe 24 in den zweiten Zustand 6. Fluoreszenzstrahlung F entsteht in den Bereichen B1 geringer Intensität (dunkle Bereiche). Die Fluoreszenzstrahlung F wird dann wie üblich am Hauptfarbteiler 29 abgeteilt. Der Detektor 54 ist ein auf das Spotmuster angepaßter Matrixdetektor, optional mit vorgeschalteter Pinholemaske. Die Detektorelemente sind auf die Bereiche B1 ausgerichtet. Der Scanner 28 ermöglicht wiederum die Verschiebung der Anregungsstrahlungsverteilung über die Probe 24 in x- und/oder y-Richtung. Fig. 17 zeigt im unteren Bild das Multispotmuster 58 und darüber das damit angeregte Fluoreszenzmuster 59.
Von der Rücksetzlichtquelle 41 kann ein weiterer Strahl 57 in die Pupille fokussiert werden, der damit eine homogene Fläche in der Probe 24 ausleuchtet. Dadurch erfolgt ein Rückschalten der Fluoreszenzmoleküle aus dem zweiten Zustand 6 in den ersten Zustand 5, wie bereits erläutert zwischen zwei Scanschritten und gegebenenfalls auch innerhalb eines Schanschrittes.
Der Rücksetzstrahl 47 kann aber auch ein Beleuchtungsmuster aufweisen, das den Bereichen B2 entspricht, da nur diese rückgesetzt werden müssen. Hierzu wird der Strahl 47 analog zu den Teilstrahlen 54, 55 ebenfalls in vier Teilstrahlen zerlegt und in die Pupille abgebildet, so daß sich innerhalb der Berandung 56 der Pupille beispielsweise die in Fig. 18 gezeigte Verteilung ergibt. Zusätzlich ist die optische Achse der Teilstrahlen 57 der Rücksetzstrahlung R gegenüber der optischen Achse der Anregungsstrahlung A derart verkippt, daß die in der Probe entstehenden Minima des Multispotmuster 58 der Anregungsstrahlung A mit den Maxima des Multispotrücksetzmusters zusammenfallen Die Ausführungsform gemäß Figur 15a in der Variante von Fig. 18 ist ein exemplarisches Beispiel dafür, daß durch geeignete Strukturierung der Rücksetzstrahlung eine proben- bzw. farbstoffschonende Rücksetzung nur in den Bereichen B2 erfolgt.
Es kommt darauf an, daß die Probe durch geeignete Einstrahlung von Anregungsstrahlung A in Bereiche B1 im ersten Zustand und in Bereiche B2 im zweiten Zustand aufgeteilt wird. Die Überführung von Proben-Bereichen in den zweiten Zustand kann deshalb auch durch zur Auswahl einer Tiefenebene der Probe (vgl. Fig. 14) eingesetzt werden, so daß Proben-Bereiche B1 nicht zu einem Übersprechen benachbarter Detektorelemente/-regionen beitragen können.
Für das vorstehend in verschiedenen Varianten geschilderte Verfahren bzw. Mikroskop ist die Einstellung der Leistung der Anregungsstrahlung A abhängig von der Fluoreszenzcharakteristik der Probe unter besonderer Berücksichtigung der örtlichen Verteilung der Anregungsstrahlung A von Bedeutung. Insbesondere bestimmt die Tiefe eines oder mehrer Minima 45 und die Höhe der entsprechenden Maxima der Anregungsstrahlung der Verteilung die erreichbare Auflösungssteigerung. Ein Optimierung der Einstellung der örtlichen Leistungsverteilung der Anregungsstrahlung A kann auf zwei Wegen realisiert werden: Bei Kenntnis der Kennlinie 17, die dazu beispielsweise dem Steuergerät 35 entsprechend zur Verfügung gestellt ist/wird, wird für eine gegebene örtliche Anregungsverteilung der optimale Leistungspegel errechnet und entsprechend eingestellt, beispielsweise durch Ausgabe eines Sollwertes oder sogar direkte Ansteuerung des Anregungsmoduls 21.
Alternativ oder zusätzlich kann an einem Testpräparat oder einer Referenzstelle der zu untersuchenden Probe die tatsächliche Auflösung ermittelt und der optimale Leistungspegel bei gebender Anregungsverteilung in einem interativen Prozeß ermittelt und dann zur Abbildung der Probe 24 verwendet werden.
Anstelle einer reinen Leistungsskalierung kann natürlich auch die Verteilung verändert werden, beispielsweise durch entsprechende Einstellung des Phasenelements 39.
Die Fluoreszenzcharakteristik der Probe 24, beispielsweise die Fluoreszenzcharakteristik eines Farbstoffs, kann durch Untersuchung an einem Testpräparat oder einer Referenzstelle der Probe bereits unter späteren Bildgewinnungsbedingungen ermittelt werden. Dazu wird die Leistung der detektierten Fluoreszenzstrahlung F als Funktion der Leistung der Anregungsstrahlung A an einen Punkt oder einem Gebiet der Probe ermittelt. Für eine besonders gute Einstellung ist es günstig, wenn die Fluoreszenzcharakteristik, d.h. die Kennlinie 17 nicht von der Konzentration des fluoreszierenden Materials, beispielsweise des Farbstoffs abhängt (im Gegensatz zur emittierten Leistung der Fluoreszenzstrahlung F). Das Steuergerät 35 des Scanningmikroskops 20 kann dazu aus der ermittelten Kurve 17 oder einer zugeführten bzw. in einem Speicher abgelegten Kurve 17 automatisch die optimale Leistung ermitteln und entsprechend einstellen.
Die iterative Bestimmung ist immer dann vorteilhaft, wenn die Fluoreszenzeigenschaften stark probenabhängig sind und eine Referenzstelle an der Probe für die Ermittlung der Fluoreszenzcharakteristik vorhanden ist oder nicht gefunden werden kann. In diesem Fall kann man entweder an einem begrenzten Gebiet innerhalb oder außerhalb des interessierenden Probenfeldes oder anhand einer Bildgebung im gesamten abzubildenden Probenfeld eine Leistungsoptimierung vornehmen bzw. durch das Steuergerät 35 ausführen lassen. Anhand eines Gütekriteriums der Auflösung (z.B. der Kontrast in einer ausgewählten Stelle oder die Ausdehnung des im Bild übertragenen Frequenzbereichs im Fourierraum) wird die Anregungsleistung optimiert. Dabei ist es im allgemeinen ausreichend, die Leistung im Minimum der Anregungsverteilung bzw. eine räumlich breit verteilte Untergrundleistung anzupassen.
Die Anregungsstrahlung A und die Rücksetzungsstrahlung R können aus einer einzigen Strahlungsquelle erzeugt werden. Die Strahlungsquelle kann entweder direkt umschaltbar oder mit einer nachgeordneten Selektionsanordnung versehen sein.
Figur 19 zeigt ein Laser-Scanning-Mikroskop 100 in schematischer Darstellung, das auch unabhängig vom bisher beschriebenen Konzept verwendet werden kann. Die durchgezogenen Linien stellen den Beleuchtungsstrahlengang B dar; die gestrichelten Linien den Detektionsstrahlengang 102. Das Laser-Scanning-Mikroskop bildet eine Probe 103 rasternd auf einen Detektor 104 ab, wobei die Probe mittels einer Beleuchtungsquelle 105 beleuchtet wird.
Der Detektionsstrahlengang 102 weist von der Probe 103 zum Detektor 104 längs einer optischen Achse OA ein Objektiv 106 sowie eine Tubuslinse 107 auf, der ein Scanobjektiv 108a folgt, nach der ein Scanner 109 vorgesehen ist. Nach einer Relaisoptik 108b, 1 10 sowie einer Pinholeoptik 111 passiert die Strahlung einen Strahlteiler 113 und gelangt zu einem Detektor 104, der hier als Matrixdetektor ausgebildet ist, und dem ein Filter 112 zum Abblocken letzter Anteile der Beleuchtungsstrahlung vorgeordnet ist. Natürlich kann der Detektionsstrahlengang 102 auch anders ausgestaltet sein, beispielsweise kann man auf den Filter 112 sowie auf das in der Bauweise der Figur 20 zwischen den Elementen 108a und 107 vorgesehene Zwischenbild, das durch eine gestrichelte Linie symbolisiert ist, verzichten.
Im in Figur 19 gezeigten Mikroskop 100 sind die Pupillenebenen, in denen der Scanner 109 sowie der noch zu erläuternde Strahlteiler 113 liegen, zueinander und zur rückwärtigen Brennebene des Objektives 106, die zwischen den Elementen 106 und 107 als durchgezogene Linie eingezeichnet ist, konjugiert.
Die Beleuchtungsquelle 105 weist einen Laser 114 auf, der durch eine Teilereinrichtung 116, die noch näher erläutert wird, vier Teilstrahlen Sa, Sb, Sc, Sd erzeugt, wobei in Figur 19 nur die Mittelstrahlen eingezeichnet sind. Die Teilereinrichtung 116 fokussiert diese vier Teilstrahlen Sa-d, von denen in der schematischen Darstellung der Figur 19 nur zwei zu sehen sind (die anderen zwei liegen senkrecht zur Zeichenebene übereinander) auf den Strahlteiler 113.
Im einzelnen weist die Teilereinrichtung 116 zwei Teiler 117 und 118 und einen Umlenkspiegel 119 auf, die aus dem einen vom Laser 114 abgegebenen Strahl S vier parallele Teilstrahlen Sa, Sb sowie Sc und Sd erzeugen. In der Darstellung der Figur 19 liegen die Teilstrahlen Sa und Sb übereinander, wie auch die Teilstrahlen Sc und Sd. Linsen 120 und 121 in der Teilereinrichtung 116 bewirken die Fokussierung derart, daß die Teilstrahlen Sa-c auf vier Punkte auf der Fläche des Strahlteilers 113 fokussiert werden.
Die Erzeugung der vier Teilstrahlen Sa-c kann natürlich auch durch eine andersartig ausgebildete Teilereinrichtung 1 16 oder grundsätzlich anders erfolgen, beispielsweise in dem vier Laser 1 14 verwendet werden. Eine mögliche weitere Ausgestaltung für die Teilereinrichtung 116 ist in Figur 20 gezeigt, in der der Teiler 118 und der Spiegel 119 mit dem Teiler 117 vertauscht sind.
Figur 21 zeigt den Strahlteiler 113 in Draufsicht auf dessen Strahlteilerfläche 122. Auf der Strahlteilerfläche 122 sind vier reflektierende Spiegelflächenelemente 123a, 123b, 123c und 123d angeordnet, die an den Eckpunkten eines gedachten Quadrates 124 liegen, dessen Zentrum der Durchstoßpunkt 125 der optischen Achse OA bildet. Nur dort ist die Strahlteilerfläche 125 reflektierend, im übrigen Bereich ist sie transmittierend zumindest für Detektionsstrahlung.
Die Beleuchtungsquelle 105 fokussiert die vier Teilstrahlen Sa-d auf die vier Spiegelflächenelemente 123a-d. In der Probe 103 gelangen die derart in die Pupille fokussiert und reflektierten Teilstrahlen zur Interferenz, wodurch das in Figur 22 dargestellte Multispot- Muster 128 in der Probe entsteht. Das Multispot-Muster 128 ist eine regelmäßige Anordnung von Lichtflecken 126, die von einem Dunkelbereich 127 umgeben sind. Die Intensitätsdifferenz zwischen den Lichtflecken 126 und dem Dunkelbereich 127, also die Tiefe der Nullstellen, kann durch Änderung der Intensitäten der jeweils gegenüberliegenden Teilstrahlen Sa, Sd und Sb, Sc variiert werden. Dabei werden diagonal (bezogen auf die optische Achse) gegenüberliegende Teilstrahlen oder jeweils durch einen dazwischenliegenden Teilstrahl getrennte Teilstrahlen vorzugsweise gleichsinnig eingestellt. Bei drei Teilstrahlen wird einer gegenüber zwei verstellt (oder umgekehrt).
Die räumliche Ausdehnung des Musters 128 kann durch Variation des Vergrößerungsmaßstabes des Mikroskops (z.B. Variation der Brennweite bei 110 und 108b) angepaßt werden, indem das Bildfeld in der Probe, das das Muster 128 überdeckt, verändert wird. Alternativ kann die Brennweite der Linsen 1 10, 121 dazu eingestellt werden.
Die Wirkung des Strahlteilers 113 ist wie folgt:
Durch die geometrische Anordnung der Spiegelflächenelemente 123a-d und die darauf fokussierten Teilstrahlen Sa-d entsteht das Punkt-Muster 128 mit regelmäßig angeordneten Lichtflecken 126 auf der Probe 103. Bei einer Anwendung in der Fluoreszenzmikroskopie wird somit an den Lichtflecken 126 Fluoreszenz angeregt. Diese entsteht räumlich inkohärent und füllt somit homogen die rückwärtige Brennebene des Mikroskops 106 (zwischen den Elementen 106 und 107 als durchgezogene Linie eingezeichnet). Analoges gilt für diffuse Reflektion, die ebenfalls zur Bildgewinnung herangezogen werden kann.
Da die rückwärtige Brennebene mit der Pupille, in welcher der Strahlteiler 113 angeordnet ist, konjugiert ist, füllt die zu detektierende inkohärente Strahlung auch die gesamte Pupille, in der der Strahlteiler 113 angeordnet ist und leuchtet somit die gesamte Strahlteilerfläche 122 aus. Spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung wird dagegen auf die Spiegelflächenelemente 123a-d fokussiert und somit zur Beleuchtungsquelle 105 zurückgeworfen.
Im Ergebnis passiert den Strahlteiler 113 nur die zu detektierende Strahlung, die räumlich inkohärent, d.h. ungerichtet in der Probe 103 entstand. Der Strahlteiler 1 13 bewirkt damit eine Trennung von Detektionsstrahlung und spiegelnd reflektierter Beleuchtungsstrahlung ohne daß eine chromatische Einstellung vorgenommen werden müßte. Dies hatte den Vorteil, daß nicht nur eine höhere Ausbeute erreicht wird, auch kann der Strahlteiler 113 für verschiedenste Beleuchtungswellenlängen und Detektionswellenlängen verwendet werden. Die üblicherweise bei Farbteilern vorgesehenen Austauschmechanismen bzw. Wechselräder sind nicht nötig. Die Detektion (in Figur 19 ist der Pupillenstrahlengang gestrichelt gezeichnet) erfolgt beispielshalber mit dem als Matrixdetektor ausgebildeten Detektor 104, dem optional eine Pinholemaske vorgeordnet sein kann. Dabei werden die beleuchteten Spots konfokal abgebildet. Diese Maske kann in einer Zwischenbildebene des Beobachtungsstrahlenganges vor dem Detektor liegen oder alternativ in die Relaisoptik (zwischen 110 und 108b) gestellt werden. Letzteres verbessert das Strahlprofil auch beleuchtungsseitig.
Das Abtasten der Probe 103 erfolgt durch Wirkung des Scanners 109. Dabei ist eine sehr viel geringere Verschiebung der beleuchtenden Lichtflecke auf der Probe 103 nötig, als dies bei einem Einzelpunktscanner erforderlich ist. Die einzelnen Lichtflecke 126 werden vom Scanner 109 simultan verschoben, da sie durch Interferenz in der Probe entstehen. Es genügt deshalb eine Bewegung mittels des Scanners 109, die den Dunkelbereich 127 zwischen benachbarten Lichtflecken 126 abtastet. Die scannende Verschiebung der Lichtflecke erfolgt also vorzugsweise nur innerhalb einer Periodenlänge des periodischen regelmäßigen Musters 128.
Der in Figur 19 gezeigte Aufbau kann auch dahingehend invertiert werden, daß der Detektionsstrahlengang ab dem Strahlteiler 113 und die Beleuchtungsquelle 105 vertauscht werden. Der Strahlteiler 1 13 ist dann bezüglich der Verspiegelung negativ zu der in Figur 21 gezeigten Bauweise, d.h. die Spiegelflächenelemente 123a-d sind Löcher in einer Spiegelfläche.
Der Strahlteiler 113 kann auch mit einer Nipkow-Scheibe als Scanner kombiniert werden, bzw. als solche integriert werden.
Die Ausgestaltung gemäß Fig. 19 bis 22 kann weiter besonders vorteilhaft auch mit der Bauweise bzw. dem Verfahren gemäß Fig. 4 bis 18 kombiniert werden, wobei auch nur einzelne Merkmale (z.B. der Strahlteiler 113) zur Kombination herangezogen werden können.

Claims

Patentansprüche
1. Auflösungsgesteigertes Lumineszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem - eine Probe (P, 24) durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung (A) zur Emission von bestimmter Lumineszenzstrahlung (F) angeregt wird und ein Bild der lumineszierenden Probe (P, 24) gewonnen wird, wobei die lumineszierende Probe (P, 24) aus einem ersten Lumineszenz-Zustand (5), in dem die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) mit steigender Anregungsstrahluπgsleistung bis zu einem Maximalwert (18), welcher einem Anregungsstrahlungsleistungs-Schwellwert (19) zugeordnet ist, steigt, in einen zweiten Lumineszenz-Zustand (6) überführbar ist, in dem die Probe (P, 24) gegenüber dem ersten Zustand (5) verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) aufweist, wobei die Probe (P, 24) durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes (.19) in den zweiten Zustand (6) bringbar ist, die Probe (P, 24) in Teil-Bereichen (B1) in den ersten Zustand (5) und in angrenzenden Teil-Bereichen (B2) in den zweiten Zustand (6) versetzt wird, indem die Einstrahlung von Anregungsstrahlung (A) mit einer Anregungsstrahlungsverteilung erfolgt, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum über dem Schwellwert (19) und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum (45) unter dem Schwellwert aufweist, das Bild der lumineszierenden Probe (P1 24) Proben-Bereiche (BI ) im ersten Zustand (5) und Proben-Bereiche (B2) im zweiten Zustand (6) umfaßt, wobei zum Bild der lumineszierenden Probe (P, 24) überwiegend Proben-Bereiche (B1) im ersten Zustand (5) beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem eine Probe (P, 24) verwendet wird, die nach Überführung in den zweiten Zustand (6) wieder in den ersten Zustand (5) zurückkehrt, entweder durch aktive Einwirkung oder spontan.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem eine Rücksetzstrahlung (R) eingestrahlt wird, die die Probe (P, 24) aus dem zweiten Zustand (6) in den ersten Zustand (5) zurücksetzt und die von der Anregungsstrahlung (A) verschiedene optische Eigenschaften hat.
4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Büd durch Abscannen der Probe (P, 24) mit einem Spot-, Zeilen- oder Multispotmuster (58) gewonnen wird und insbesondere zwischen zwei Scanschritten Rücksetzstrahlung (R) eingestellt wird.
5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine Probe (P, 24) verwendet wird, die bei einer Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert (19) nicht luminesziert,
Lumineszenzstrahlung mit anderen Eigenschaften als die bestimmte Lumineszenzstrahlung (F) abstrahlt und/oder geänderte, zu verminderter Lumineszenz führende Eigenschaften aufweist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Anregungsstrahlungsverteiluπg beugungsbegrenzt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem eine torusförmig verteilte Anregungsstrahlung (A) verwendet wird und vorzugsweise zusätzlich bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung (F) außerhalb des Torus liegende Proben-Bereiche ausgeblendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung (A) eine linienförmige oder flächige strukturierte Probenbeleuchtung, insbesondere gemäß eines Streifen- oder Kreuzgitters, aufweist sowie bei dem eine ortsaufgelöste Detektion zur Bildgewinnung verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine konfokale Detektion (D) von im ersten Zustand (5) befindlichen Proben-Bereichen (B1) durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem eine Tiefenauflösungssteigerung entlang der optischen Achse (OA) erfolgt, indem das Leistungsminimum (45) unter dem
Schwellwert (19) und das Leistungsmaximum über dem Schwellwert (19) entlang der optischen Achse (OA) benachbart sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem eine Tiefenauflösungssteigerung entlang der optischen Achse erfolgt, indem zuerst in einem die Fokusebene enthaltenden
Tiefenbereich Anregungsstrahlung (A) mit einer Leistung über dem Schwellwert eingestrahlt wird, in die Fokusebene Rücksetzstrahiung (R) eingestrahlt wird und anschließend die
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Anregungsstrahlung (A) mit der Anregungsstrahlungsverteilung eingestrahlt wird, wobei das Leistungsminimum (45) im Fokusbereich liegt.
12. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem entweder in Proben-Bereichen (B1), die den ersten Zustand (5), oder in Proben-Bereichen (B2), die den zweiten Zustand (6) aufweisen, die Anregungsstrahlungsleistung gemäß einer Refereπzfrequenz moduliert wird, und diese Referenzfrequenz bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung im Wege der Lock-In- Technik verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem zusätzliche aus einem Gleichsignalanteil (S) ein niedrig aufgelöstes Bild gewonnen wird.
14. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine fluoreszierende Probe (P, 24) verwendet wird, insbesondere eine mit mindestens einem Fluorophor versehene Probe (P1 24).
15. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem zusätzlich ein Bild mit Anregungsstrahlungsverteilung ohne Leistungsminimum (45) unter dem Schwellwert aufgenommen und zur Differenzbildung verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine Lumineszenzkennlinie (17), die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung angibt, ausgewertet, daraus der Schwellwert (19) ermittelt und/oder die Anregungsstrahlungsverteilung kennlinienabhängig gewählt wird.
17. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung iterativ unter Auswertung der Bildauflösung optimiert wird.
18. Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopie, das aufweist:
Mittel (21 , 22) zur Anregung von Lumineszenz, die Anregungsstrahlung (A) auf die Probe (P, 24) einstrahlen und damit die Emission bestimmter Lumineszenzstrahlung (F) in der Probe (P, 24) anregen,
Mittel (22, 23) zur Gewinnung eines Bildes der lumineszierenden Probe (P, 24), wobei die Mittel zur Anregung die Anregungsstrahlung (A) mit einer bestimmten Anregungsstrahlungsverteilung einstrahlen, die zumindest ein Örtliches Leistungsmaximum aufweist, das über einem Schwellwert (19) liegt, und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum (45) aufweist, das unter dem Schwellwert (19) liegt, wobei der Schwellwert (19) zwei Lumineszenz-Regionen (5, 6) der Probe (P, 24) trennt, eine erste, bei Anregungsstrahlungsleistungen unterhalb des Schwellwertes (19) vorliegende
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Zustands-Region (5), in der die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert (18), welcher am Schwellwert (19) erreicht wird, steigt, und einer zweiten bei und/oder nach Anregungsstrahlungsleistungen oberhalb des Schwellwertes (19) vorliegende Zustands-Region (6), in der die Probe (P, 24) eine gegenüber der ersten Region (5) verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) aufweist, und wobei die Mittel zur Bildgewinnung Proben-Bereiche (B1) in der ersten Region (5), die mit Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes (19) bestrahlt wurden, und Proben- Bereiche (B2) in der zweiten Region (6), die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes (19) bestrahlt wurden, erfassen, wobei zum Bild der Probe überwiegend Proben- Bereiche (B1) in der ersten Region (5) beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat.
19. Mikroskop nach Anspruch 18, mit einer Anregungsstrahlungsquelle (30), welche die Anregungsstrahlung (A) abgibt, und einer der Anregungsstrahlungsquelle nachgeordneten Einrichtung (36-40), welche einen Anregungsstrahl abgibt, der ein Strahlprofil mit dem Leistungsminimum (45) hat, das eine unter dem Schwellwert (19) liegende Anregungsstrahlungsleistung hat.
20. Mikroskop nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Scannereiπrichtung (28) die Probe (P, 24) mit Anregungsstrahlung (A) abrastert.
21. Mikroskop nach Anspruch 20, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung mindestens ein beugungsbegrenztes Punktbild aufweist,
22. Mikroskop nach Anspruch 21 , wobei die Anregungsstrahlungsverteilung mindestens einen linienförmigen oder streifen- oder gitterförmigen Proben-Bereich mit Anregungsstrahlung (A) beleuchtet, wobei die Anregungsstrahlungsleistung in Teilen des Streifens bzw. Gitters über dem Schwellwert (19) und in Teilen des Streifen bzw. Gitters unter dem Schwellwert (19) liegt.
23. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung das örtliche Leistungsminimum (45) und das örtliche Leistungsminimum entlang der optischen Achse (OA) benachbart sind.
24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 23, gekennzeichnet durch Mittel (41, 42) zum Rücksetzen der Probe (24) aus der zweiten (6) in die erste Zustands-Region (5), die eine Strahlquelle (41), weiche Rücksetzstrahiung (R) mit von der Anregungsstrahiung (A)
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP verschiedenen optischen Eigenschaften aussendet, und eine Optik (42) zum Einkoppeln der Rücksetzstrahlung (R) aufweisen.
25. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 24, gekennzeichnet durch einen Intensitätsmodulator (37,38,49,35), der die Verteilung der Anregungsstrahlung (A) mit einer Referenzfrequenz moduliert, und einen in den Mitteln zur Bildgewinnung vorgesehenen oder damit verbundenen Lock-In-Verstärker (48), der die Referenzfrequenz auswertet und Hintergrundstrahlung (S) reduziert.
26. Mikroskop nach Anspruch 25, mit einem Gleichsignalsausgang zur Gewinnung eines zusätzlichen niedrig aufgelösten Bildes.
27. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 26 mit einem Steuergerät (35), das das Mikroskop zur Ausführung eines der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 ansteuert.
28. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 27, mit einem Steuergerät (35), das die Mittel zur Anregung und die Mittel zur Bildgewinnung ansteuert bzw. ausliest und die Anregungsstrahlungsverteilung zur Optimierung der Bildauflösung einstellt.
29. Mikroskop nach Anspruch 28, bei dem das Steuergerät (35) eine Speicher- oder Dateneingabeeinrichtung aufweist, über die dem Steuergerät eine Lumineszeπzkenπlinie (17) verfügbar ist, wobei die Lumineszenzkennlinie (17) die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung wiedergibt und wobei das Steuergerät (35) aus der Lumineszenzkennlinie (17) den Schwellwert (19) ermittelt und/oder die Anregungsstrahlungsverteilung kennlinienabhängig einstellt.
30. Mikroskop nach Anspruch 28, bei dem das Steuergerät (35) aus dem Bild der Probe (P, 24) die Auflösung ermittelt und die Anregungsstrahlungsverteilung iterativ zur Optimierung der Bildauflösung einstellt.
31. Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle (105) und einem Detektionsstrahlengang (102), der in einer Probe angeregte (103) und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse (OA) zu einer Detektoreinrichtung (104) leitet und in dem ein Strahlteiler (113) vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle (105) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf die Probe (103) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (113) an der Probe (103) spiegeind reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung (104) passieren läßt und dazu in einer
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP Pupille des Beleuchtungsstrahienganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (113) eine im Detektionsstrahlengang (102) liegende Strahlteilerfläche (122) autweist, die zumindest an drei Punkten (123a-d) für die Beleuchtungsstrahlung verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (122) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (125) der optischen Achse (OA) liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle (105) eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen (Sa- d) erzeugt und diese auf die drei Punkte (123a-d) des Strahlteilers (113) derart fokussiert, daß in der Probe (103) ein Interferenzmuster (128) in Form periodisch über die Probe (113) verteilter Beleuchtungsflecke (126) entsteht.
32. Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle (105) und einem Detektionsstrahlengang (102), der in einer Probe angeregte (103) und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse (OA) zu einer Detektoreinrichtung (104) leitet und in dem ein Strahlteiler (113) vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle (105) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf die Probe (103) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (113) an der Probe (103) spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung (104) passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahienganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (113) eine im Detektionsstrahlengang (102) liegende reflektierende Strahlteilerfläche (122) aufweist, die zumindest an drei Punkten (123a-d) für die Beleuchtungsstrahlung nicht verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (122) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (125) der optischen Achse (OA) liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle (105) eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen (Sa- d) erzeugt und diese auf die drei Punkte (123a-d) des Strahlteilers (113) derart fokussiert, daß in der Probe (103) ein Interferenzmuster (128) in Form periodisch über die Probe (113) verteilter Beleuchtungsflecke (126) entsteht.
33. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsstrahlquelle (105) einen Laser (114), der einen Laserstrahl (S) abgibt, und eine Teilereinrichtung (116), die den Laserstrahl (S) in die Teilstrahlen (Sa-d) aufteilt und mittels einer Optikeinrichtung (120, 121) auf die Punkte (123a-d) fokussiert, aufweist.
34. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Scanneinrichtung (108), die in Beleuchtungsrichtung dem Strahlteiler (113) nachgeordnet ist und ein Abscannen durch Verschieben des Interferenzmusters (128) auf die Probe (103) bewirkt, wobei die Verschiebung innerhalb einer Periode der periodisch verteilten Beleuchtungsflecke (126) erfolgt.
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP
35. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zur Variation der Intensität jeweils diagonal gegenüberliegend fokussierter Teilstrahlen (Sa, Sc; Sb, Sd).
36. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektionsstrahlengang in einem Matrixdetektor (104) endet.
37. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zur Brennweitenvariation (110, 108a, 108b) zwischen Strahlteiler (113) und Probe (103).
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP
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