WO2007009359A1

WO2007009359A1 - Derives de thymosine beta 4 et utilisation

Info

Publication number: WO2007009359A1
Application number: PCT/CN2006/001679
Authority: WO
Inventors: Liya Nie; Suyong Ma; Songshan Xu; Meiyu Wen
Original assignee: Beijing Northland Biotech Co., Ltd.
Priority date: 2005-07-15
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2007-01-25
Also published as: EP1908779A4; KR100984635B1; CN101218249A; US7816321B2; JP5180074B2; PL1908779T3; EP1908779B1; EP1908779A1; JP2009500045A; KR20080040708A; CN100582121C; US20090298758A1

Description

胸腺素 β 4衍生物及其应用技术领域

本发明涉及新的胸腺素 |3 4 ( Τ β 4 )衍生物 Gly-T β 4和 Ala-T β 4。本发明还涉及含有所述 Τ β 4衍生物的药物组合物。本发明还涉及所述 Τ β 4衍生物用于制备治疗皮肤组织损伤、心脏组织损伤、角膜损伤和 /或冠心病的药物的用途。本发明还涉及利用所述 Τ β 4 衍生物治疗皮肤组织损伤、心脏组织损伤、角膜损伤和 /或冠心病的疾病的方法。发明背景

免疫系统是人体的防御系统。参与免疫反应的主要细胞有 Τ淋巴细胞、 Β淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是 Τ淋巴细胞发育、分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子（或激素）是 Τ淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质，其中 Τ β 4是现已结构和功能较为明确的一种主要的胸腺因子。本领域周知， Τ β 4是 Golds tein等人，（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 257, No. 2， pp. 1000 - 1006， 1982， Chemical Characterizat ion of Thymos in beta)最早从小牛胸腺中提取的胸腺素组分 5 ( TF5 )中分离出来的一种多肽，含 43个數基酸，如 SEQ ID N0: 1所示，分子量 4. 963KD, 无二硫键与糖基化。

τ ρ - 是一种胚胎在心脏发病过程中表达的蛋白，它能促进心脏细胞的迁移并影响这些细胞的生死存亡 ( Thymos in beta 4 act ivates integrin-1 inked kinase and promotes cardiac cel l migrat ion, survival and cardiac repair. Nature, Vol. 432, 2004 年 11月 25 日）。上述文献研究表明，这种蛋白能够在实臉诱导的心脏病发作后防止细胞的死亡并限制疤痕组织形成的程度。 Τ β -4已经 9 被用于临床试验，以促进皮肤创伤的痊愈。研究人员相信不久的将来， Τ β -4蛋白将会进入心脏病治疗的临床试验阶段。

正如上述用 Τ β 4的活性所做的一项研究所表明的那样， Τβ 4增强组织培养物中胚胎及出生后心肌细胞的存活能力，在大鼠冠状动脉结扎后腹膜内注射该蛋白，能成功刺激心脏修复和激活 Akt存活激酶。这些结果说明， Τ-β 4对于急性冠状动脉闭塞是一个可能的治疗目标。

德克萨斯州大学的研究人员在上述文献中还发现一种在心脏发育过程中制造的蛋白质（即： Τ β - 4 )在心脏病发作后能够帮助心脏器官的自我修复。这些在大鼠实验中获得的发现最终可能导致新的心脏病疗法的出现并且可能改变医护人员对心脏病的处理方式。

本发明人通过对已知 Τ Ρ -4进行蛋白质三级结构分析，采用基因工程方法对所述蛋白质的 Ν -末端加以修饰，出人意料的获得在皮肤组织损伤修复、心脏组织损伤修复等方面活性明显高于天然 T p -4 的新 Τ β -4衍生物。发明内容

本发明的一个方面，涉及一种新 Τ β 4衍生物，其分别为 SEQ ID NO: 6所示的 Gly-T β 4 , 和 SEQ ID NO: 5所示的 Ala-T β 4。

本领域普通技术人员知晓，所述 Gly-T β 以及 Ala - Τ β 4可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中，所述 Gly-T β 4以及 Ala- Τ β 4是通过基因工程重组表达的方法获得的。

在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得 Ν -末端修饰的胸腺素 β 4衍生物： Gly-T 0 4或 Ala-T p 4, 包括如下步驟：

1 )表达载体的构建

依据已知 Τ β 4氨基酸序列（ SEQ ID NO: 1 ), 选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成 Τ β 4 DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之 Ν末端和 C末端加上限制性酶切位点，并进行 Ν -末端修饰，得到编码 Τ β 4衍生物： Gly- Τ β 4或 Ala-T P 4的核酸序列。依据已知 GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽 DNA序列且在相应于所编码的氨基酸序列之 N末端和 C末端加上限制性酶切位点，得到先导肽核酸序列。

再分别将如上述制备的先导肽序列、 Τ β 4衍生物序列以及筛选质粒 pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入 T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子。

用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的本公司质粒 pGM (该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达 GST类融合蛋白，为^司构建）连接，经筛选得到正确地重組子。

2 )重组 Τ β 4衍生物的表达及分离純化

将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到 GST 亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用凝血酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于 98 %的终产物。

本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的 Τ β 4衍生物： Gly- Τ β 4和 /或 Ala- Τ β 4，以及任选的药物上可接受的载体。

在本发明知，术语 "药物上可接受的" 意味着制药领域公认的可用于动物，更特别的是可用于人的。术语 "载体" 指稀释剂、佐剂（例如（完全或不完全）弗氏佐剂）、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介盾。

这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、诸如此类。静脉内施用药用组合物时， 7j是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果需要，组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠，或是 pH緩沖剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶嚢粉剂、緩释配方、诸如此类的形式。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形式，其中含有 0. 01%-0. 2%的胸腺素衍生物 Gly-T β 4或 Ala-T β 4, 以及 5%的甘露醇，以及药物上可接受的载体。

将本发明的药用组合物配制成与其意向施用路径相容。施用路径的实例包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔、鼻内（例如吸入）、经皮（例如局部）、经粘膜、和直肠施用。在一个具体实施方案中，依照常规流程将组合物配制成适合静脉内、皮下、肌肉内、口腔、鼻内、或局部施用于人类的药用组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性緩沖液中的溶液。如果需要，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如麦角胺以减轻注射部位的疼痛。

本发明的一个实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有 50-50(^g/ml的胸腺素衍生物 Gly-T β 4和 /或 Ala- Τ β 4，以及选自氯霉素或氧氟沙星的抗生素，以及药物上可接受的载体；在本发明的又一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有 50-50(^g/ml 的胸腺素衍生物 Gly- Τ β 4和 /或 Ala-T p 4,适量的透明质酸钠，以及药物上可接受的载体；在本发明的另一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有 50- 50(^g/ml的胸腺素衍生物 Gly- Τ β 4和 /或 Ala- Τ β 4,适量的透明质酸钠，氯霉素或氧氟沙星，以及药物上可接受的载体。

若要局部施用本发明的組合物，则可以将组合物配制成软膏、乳骨、皮肤贴、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳液的形式或是本领域技术人员众所周知的其它形式。参阅例如《雷明顿氏药物科学和药物剂型导论》（Remington' s Pharmaceut ical Sciences and Introduct ion to Pharmaceut ical Dosage Forms ), 第 19版， Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚， 1995年。

对于非可喷雾局部剂量形式，通常采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂且具有优选大于水的动态粘滞度的粘性至半固体或固体形式。合适的配方包括但不限于溶液、悬浮液、乳状液、乳骨、软骨、粉剂、搽剂、药骨、诸如此类，如果需要，是无菌的或与辅助试剂（例如防腐剂、稳定剂、润湿剂緩冲剂、或盐）混和以改变各种特性，诸如例如渗透压。其它合适的局部剂量形式包括可喷雾气雾剂制剂，其中优选联合固相或液相惰性载体的活性成分包装在含有增压挥发物（例如压缩气体，诸如氟利昂）的混合物或是挤瓶中。如果需要，还可以向药物组合物和剂量形式中添加增湿剂或湿润剂。这些额外成分的实例在本领域是众所周知的。

在本发明的又一实施方案中，所述药物組合物为软骨形式，其中含有 0. 01°/。- 0. 2%的胸腺素衍生物 Gly-T β 4或 Ala- Τ β 4, 和药物上可接受的赋形剂如凡士林。

若本发明的方法包括组合物的鼻内施用，则组合物可以配制成气雾剂、喷雾剂、轻雾剂、或滴剂的形式。具体而言，依照本发明使用的预防性或治疗性试剂可以使用合适的推进剂（例如二氯二氟甲烷、三氯单氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合适其它）以气雾剂喷雾呈现的形式由增压包装或喷雾器进行方便的投递。在增压气雾剂的情况中，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以投递计量数量。吸入器或吹入器中所使用的胶袭和药筒（由例如明胶构成）可以配制成含有化合物及合适粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。

在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物为喷剂，其中含有 5-50(^g/ml的胸腺素衍生物 Gly- Τ β 4或 Ala- Τ β 4 ,以及 0· 003% 的尼泊金乙酯，和药物上可接受的载体。

若本发明的方法包括口服施用，则组合物可以配制成片剂、胶嚢、药包、软胶嚢、溶液、悬浮液、诸如此类的形式。可以通过常规手段用药用可接受赋形剂诸如粘合剂（例如预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡略烷酮、或羟丙基曱基纤维素）；填料（例如乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钩）；润滑剂（例如硬脂酸镁、滑石、或硅石）；分解质（例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠）；或润湿剂（例如月桂醇硫酸钠）片剂或胶嚢。可以通过本领域众所周知的方法包被片剂。用于口腔施用的液体制剂可以采取但不限于溶液、糖浆、或悬浮液的形式，或者它们可以以干燥产品的形式存在，使用前用水或其它合适介盾溶解。可以通过常规手段用药用可接受添加剂，诸如悬浮剂（例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪）；乳化剂（例如卵磷脂或阿拉伯树胶）；非水性介质（例如杏仁油、油性酯、乙醇、或分馏植物油）；以及防腐剂（例如甲基或丙基 -对-羟基苯甲酸酯或山梨酸）制备这些液体制剂。制剂还可以适当包含緩沖盐、芳香剂、着色剂、和甜味剂。可以适当配制用于口腔施用的制剂以緩慢幹放、受控释放、或持续幹放预防性或治疗性试剂。

本发明的方法还包括配制用于通过注射（例如通过推注或连续输液）肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的配方可以以含有额外防腐剂的单位剂量形式（例如在安瓿中或在多剂量容器中）存在。组合物可以采取诸如油性或水性介盾中的悬浮液、溶液、或乳状液等形式，而且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂、和 /或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适介质（例如无菌、无热原水）溶解。

可用于提供本发明肠胃外剂量形式的合适介质对于本领域技术人员而言是众所周知的。在某些实施方案中，适于肠胃外剂量形式的介质包括但不限于注射用水 USP;水性介质包括但不限于氯化钠注射液、 Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、以及乳酸化 Ringer氏注射液；水易混介质包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及非水性介质包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、和苯甲酸苯甲酯。

本发明的再一方面，涉及选自 Gly-T P 4 和 Ala- Τ β 4之 Τ β 4 Ν 末端修饰衍生物用于制备治疗心脏組织损伤、皮肤组织损伤、角膜损伤和 /或冠心病的药物的用途。

本发明人出人意料的发现，在通过模式动物实验研究对受损心脏组织修复、皮肤組织损伤修复、角膜损伤修复的活性方面，本发明的 Gly-T β 4均具有明显高于天然 Τ β 4的活性。

本发明人首先研究了 Gly- Τ β 4和 Ala-T β 4对心脏组织修复的作用。研究人员将 60只成年大鼠的冠状动脉结扎模拟心脏病发作，从而得到大鼠冠状动脉左前降支结扎再灌流模型。连续注射胸腺素衍生物 Gly-T β 4、 Α1 -Τ β 4或胸腺素 Τ β 4—月的大鼠受损心脏中，细胞很少死亡，并在心脏病发后数周改善了心脏功能，而且 Gly-T β 4或 Ala- Τ β 4的治疗效果比 Τ β 明显。本发明人发现胸腺素衍生物 Gly- Τ β 4或 Ala- Τ β 4均能够改变细胞的代谢并创造出更强大的心肌细胞，这些细胞能够抵抗心脏病发后的低氧状况。

本发明人还研究了 Gly-T β 4和 Ala- Τ β 4对受损表皮组织的作用。研究人员将 30只成年大鼠的表皮划伤，从而得到大鼠表皮损伤模型。连续涂抹胸腺素 Gly- Τ 4、 Ala- Τ β 4或 Τ β 4 5天的大鼠的伤口长度比空白对照小 50%,而且 Gly- Τ β 4或 Ala- Τ β 4的治疗效果比 Τ β 4明显。本发明人还研究了 Gly-T P 4对受损角膜组织的作用，研究人员将 30只成年大鼠的角膜用 1N烧碱烧伤，从而得到大鼠角膜损伤模型。连续眼部滴胸腺素 Gly- Τ β 4或 Τ β 4 4天的大鼠的受损角膜完全恢复，而用生理盐水组的动物角膜不但没恢复，还出现了严重的炎症和充血。

上述结果表明 ,本发明的 Τ β 4衍生物 Gly-T β 4和 /或 Ala- Τ β 4 在治疗心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤等方面具有明显高于天然 Τ β 4的活性。

本发明的又一方面涉及利用所述 Τ β 4衍生物 Gly- Τ β 4和 /或 Ala- Τ β 4治疗受试对象特别是人的心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤的方法。自本发明的一个实施方案中，所述治疗心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜組织损伤的方法包括向所述受试对象施用治疗有效量的本发明所述 Τ β 4衍生物 Gly-T β 4和 /或 Ala-T p 4。

本领域普通技术人员知晓，施用的方式、频率和剂量将根据所治疗的病症、病况和个体的不同而异。一般来说，可以通过注射（例如皮内、肌内、静脉内或皮下）、局部施用（例如表皮施用）或滴加施用（例如滴眼剂）等方式施用。也可以根据患者个体的不同选择合理的施用途径和施用方案。合适的剂量为当施用上述的药物组合物后能够有效治疗心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤的的量。

一般来说，对于含有本发明所述 Τ β 4衍生物 Gly-T β 4和 /或 Ala-T β 4 的药物组合物，存在于每一个剂量中的量大约为 lOO g- 5mg。合适的剂量的多少将因患者病症以及给药方式而异，但一般从大约 0. 1ml- 5ml。附图说明图 1是对大鼠模型注射 Τ β 4和 Gly- Τ β 4后对大鼠心脏壁厚度的影响结果。

图 2是对大鼠模型注射 Τ β 4和 Gly- Τ β 4后对大鼠心脏壁纤维化程度的影响结果。

图 3是对大鼠模型使用 Τ β 4和 Gly- Τ β 4后对大鼠表皮伤口愈合程度的影响结果。

图 4是对大鼠模型使用 T P 4和 Gly- Τ β 4后对大鼠的损伤角膜表皮形成程度的影响结果。

图 5是对大鼠模型注射 Τ β 4和 Ala- Τ β 4后对大鼠心脏壁厚度的影响结果。

图 6是对大鼠模型注射 Τ β 4和 Ala- Τ β 4后对大鼠心脏壁纤维化程度的影响结果。

图 7是对大鼠模型使用 Τ Ρ 4和 Ala- Τ β 4后对大鼠表皮伤口愈合时间的影响结果。

图 8是对大鼠模型使用 Τ β 4和 Ala- Τ β 4后对大鼠表皮伤口瘢痕程度的影响结果。

图 9是对家兔角膜碱烧伤模型中施用 Τ β 4组（C )、 Ala -T P 4 组（ B )和 PBS组（ A )第 1天时，观察到角膜上皮被碱烧毁的结果。

图 10是对家兔角膜碱烧伤模型中施用 Τ β 4组（B )、 Ala -Τ β 4组（C )和 PBS组（Α )后笫 5天时，观察到角膜上皮恢复的结果。依照用于专利程序的布达佩斯条约，发明人于 2006年 7月 5日分别将通过基因工程重组获得的重组菌株 PGMT β 4-A/BL21和 PGMT β 4-G/BL21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( CGMCC，北京，中关村北一条， ) ，保藏号为 CGMCC 1750 和 CGMCC 1751。以下结合附图和实施例对本发明进一步示例性说明，但不构成对本发明产生任何限制。实施例 1. 胸腺素 P 4衍生物 Gly- T P 4的制备

1. 重组质粒 pGMT 4-G的制备

依据已知 Τ β 4氨基酸序列（SEQ ID NO: 1 ), 如下：

Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu l ie Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gin Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr l ie Glu Gin Glu Lys Gin Ala Gly Glu Ser

( SEQ ID NO: 1 );

选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成 T P 4 DNA序列，得到 Gly-T P 4 核酸序列，为方便基因重组操作，同时在相应于所述多肽之 N 末端和 C末端加上限制性酶切位点 BamHI、 Xhol ,在 N末端修饰上甘氨酸 Gly，如 SEQ ID NO: 2所示。

GGA TCC GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GAT AAG TCG

BaraH I

AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC AAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG

Xhol ( SEQ ID NO: 2 );

其中限制性酶切位点用下划线标明。

其所对应的氨基酸序列如下：

Gly Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu l ie Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gin Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr l ie Glu Gin Glu Lys Gin Ala Gly Glu Ser

( SEQ ID NO: 6 );

依据已知 GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽 DNA序列且在^ C末端加上限制性酶切位点 EcoRI、 BaraH I , 得到先导肽的核酸序列，如 SEQ ID NO: 3所示：

GAATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCA

EcoRI

ACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTG

ACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT GGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCC

BamHI ( SEQ ID NO: 3 ); 按照本领域常用方法，参见如《分子克隆（第二版)：实验室指南》（ 1992，冷泉港实验室），将如上述制备的先导肽、 Gly- Τ β 4以及筛选质粒 pBSK ( Stratagene公司 , 货号 212205 )用限制性内切酶 EcoRI , Xhol , BamHI处理，其中 EcoRI和 BamHI切先导肽， Xhol和 BamHI切 Gly- Τ β 4， EcoRI和 Xhol切筛选质粒 pBSK, 经计算各样品浓度后，按摩尔比 1: 1加入 T4连接体系。经转化、筛选出得到包含上述 Gly-T β 4核^^列和先导肽融合蛋白基因的重组质粒，命为 pSK- Τ β 41。

分别用相应的限制性内切酶切下所述融合蛋白基因，再将该融合蛋白基因片段与经 Xhol和 EcoR I欢酶切后质粒 pGM (该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达 GST类融合蛋白，为本公司构建）的回收大片段， 18 °C在 T4连接酶体系中三段目的基因片段进行连接。经酶切和序列测定对所得重组子筛选鉴别，得到正确连接的重组质粒，命名为 pGMTP4-G。

2. 含有重组质粒 pGMT04-G的基因工程菌的制备

然后用 CaCl₂法转化大肠杆菌 BL21,涂布在含有 5(^g/ml卡那霉素的 LB平板，挑选阳性菌落，鉴别含有上述重组质粒 pGMTP4-G的转化子。

在 LK液体培养基中培养所述转化子至 OD600为 0.6-0.8时，加入 IPTG 0. ImM诱导 3-4 小时离心收集菌体， 8M尿素破菌后 15% SDS- PAGE电泳时出现一条 30KD左右的蛋白带，表达量为 40%。经 T β 4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。获得高效表达胸腺素衍生物 Gly-TP4蛋白的基因工程菌，命名为 PGM2Tp4/BL21。

按照上述制备方法，申请人还获得了高效表达胸腺素衍生物 Gly-TP4 蛋白的基因工程菌，命名为 PGMTP4-G/BL21 (保藏号： CGMCC No: 1751)。

3. Gly-TP4的表达及纯化

1 )摇瓶表达：将如上述制备的含 Gly-T β 4蛋白基因的基因工程菌 PGMT β 4-G/BL21, 在含 50 μ g/ml卡那霉素的 LB培养基中摇瓶过夜培养（37°C， 200rpm), 再按体积比 1: 30接种至含有 50 μ g/ml 卡那霉素的 LB培养基中， 37Ό培养 3小时后，加入 0. ImM IPTG诱导 4小时。收集菌体经 SDS- PAGE电泳分析,发现含胸腺素衍生物 Gly- Τ(34 (30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的 60%。

2 ) 大规模发酵表达：

a.培养基组成：

a)种子液培养基 (LK ):

胰蛋白胨： 10克 /升、酵母粉： 5克 /升、氯化钠： 10克 /升、卡那霉素： 50微克 /毫升。 b)种养基（15升）：

磷酸氢二钠： 315克、磷酸二氢钾： 100克、氯化钠： 10. 05克、氯化铵： 50克、胰蛋白胨： 90克。

以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。硫酸镁： 15克、葡萄糖： 450克、补料（ 500克 /升）：葡萄糖。 b.发酵及诱导表达：

i)种子培养：

从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到 50毫升（ 250亳升的三角瓶） LK中， 36 、 200转 /分、 8小时后将这 50亳升种子液转接到 700亳升 LK中， 36 °C、 200转 /分，培养过夜。

i i)发酵及诱导表达过程：

将培养好的种子液（OD600=3-4 )加入罐中，调好各参数， 36° (：、 150转、溶氧 100%，开始发酵； 5小时后开始以 2. 5速流加 2小时，约加入 800亳升补料，加入 1克 IPTG诱导（三小时）。

3) .层析：

(i)亲和层析

采用 GSH-Agrose层析介质（Pharmacia公司），平衡液采用 25raM Tr is-HCl , pH8 , 上样平衡后，裂菌的离心上清上 Glutathione Sepharose层析柱（Pharmacia公司），平衡后用含 10mM还原型谷胱甘肽（GSH ) 的洗脱液洗下融合蛋白。

(i i)酶解

上一步的洗脱液加入凝血酶（5 NIHU/mL ) 37Ό酶切 2小时。 ( i)阴离子交换层析

釆用 Source30Q层析（Pharmacia公司）介质，平衡液为 20raM PB (磷酸氢二钠 -磷酸二氢钠溶液）， H7，将步骤 ( 2 )酶解得到的样品用水稀释 1倍进行上样，平衡后采用 20mM PB， pH7, 0-1M NaCl 的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。 4) .检测

将经过上述纯化步綠得到的 Gly- Τ β 4通过 SDS-PAGE纯度检测和反相 HPLC检测，纯度大于 98 %。实施例 2 胸腺素 Ρ 4衍生物 Ala- Τ β 4的制备

1. 重组质粒 pGMT p 4- Α的制备

依据已知 Τ β 4氨基酸序列（ SEQ ID NO: 1 )，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成 Τ β 4 DNA序列，得到 Ala- Τ β 4核酸序列，为方便基因重组操作，同时在相应于所述多肽之 Ν末端和 C末端加上限制性酶切位点 BamHI、 Xhol ,在 N末端修饰上丙氨酸 Ala，如 SEQ ID NO: 4所示：

GGA TCC CCT CGA GCT TCT GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA

BamH I

TTC GAT AAG TCG AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC AAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG

Xhol

( SEQ ID NO: 4 );

其中限制性酶切位点用下划线标明。

其所对应当氨基^^列如下：

Ala Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu l ie Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gin Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr l ie Glu Gin Glu Lys Gin Ala Gly Glu Ser

( SEQ ID NO: 5 ); 依据已知 GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽 DNA序列且在在相应于所述多肽之 N末端和 C末端加上限制性酶切位点 EcoRI、 BamH I , 得到先导肽核酸序列（如 SEQ ID NO: 3 所示）

按照本领域常用方法，参见如《分子克隆（笫二版）：实验室指南》（ 1992，冷泉港实验室），将如上述制备的先导肽核酸序列、 Ala-T β 4核酸序列以及筛选质粒 pBSK用限制性内切酶 EcoR I、 Xho I、 BamH I 处理，其中 EcoRI和 BamHI切先导肽， Xhol和 BamHI切 Ala- Τ β 4， EcoRI和 Xhol切筛选质粒 pBSK，经计算各样品浓度后，按摩尔比 1: 1加入 T4连接体系。经转化、筛选出得到包含上述 Ala-T β 4核列和先导肽融合蛋白基因的重组质粒，命为 pSK- T p 42。

用限制性内切酶切下所述融合蛋白基因，再将该融合蛋白基因片段与经 Xhol和 EcoR I双酶切后质粒 PGM (该盾粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达 GST类融合蛋白，为本公司构建）的回收大片段， 18°C在 T4连接酶体系中三段目的基因片断进行连接。经酶切和序列测定对所得重组子筛选鉴别，得到正确连接的重组质粒，命名为 pGMT β 4-Α。

2. 含有所述重组质粒的基因工程菌的制备

然后用 CaCl₂法转化大肠杆菌 BL21 ,涂布在含有 50μ_δ/ιη1卡那霉素的 LB平板，挑选阳性菌落，鉴别含有上述重组质粒 pGMT β 4-Α的转化子。

在 LK液体培养基中培养所述转化子至 OD600为 0. 6-0. 8时，加入 IPTG 0. lrnM诱导 3-4 小时离心收集菌体， 8M尿素破菌后 15% SDS- PAGE电泳时出现一条 30KD左右的蛋白带，表达量为 40%。经胸腺素 β 4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。获得高效表达胸腺素衍生物 Ala-T β 4蛋白的基因工程菌，命名为 PGMTp4/BL21 按照上述制备方法，申请人还获得了高效表达胸腺素衍生物 Gly-T P 4 蛋白的基因工程菌，命名为 PGMT β 4-A/BL21 (保藏号： CGMCC No: 1750 )。 3. Α1&-Τ β 4的表达及纯化

1 )摇瓶表达：将如上述制备的含 Ala- Τ β 4蛋白基因的基因工程菌 pGMT β 4-A/BL21 , 在含 50 μ g/ml卡那霉素的 LB培养基中摇瓶过夜培养（37°C， 200rpm ), 再按 1 : 30接种含有 50 μ g/ml卡那霉素的 LB培养基中， 37 °C培养 3小时后，加入 0. ImM IPTG倚导 4小时。收集菌体经 SDS- PAGE 电泳分析，发现含胸腺素衍生物 Ala- Τ β 4 (30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的 60%。

2 ) 大规模发酵表达：

a.培养基组成：

a)种子液培养基 ( LK )：

胰蛋白胨： 10克 /升、酵母粉： 5克 /升、氯化钠： 10克 /升、卡那霉素： 50微克 /亳升。

b)种养基（15升）：

以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。硫酸镁： 15克、葡萄糖： 450克、补料（ 500克 /升）：葡萄糖。 c发酵及诱导表达：

i )种子培养：

从已鉴定的平亚上划取菌种，接种到 50亳升（ 250亳升的三角瓶） LK中 36 °C、 200转 /分培养， 8小时后将这 50亳升种子液转接到 700亳升 LK中， 36 °C、 200转 /分，培养过夜。

i i)发酵及诱导表达过程：

将培养好的种子液（OD600=3-4 )加入罐中，调好各参数， 36 °C、 150转、溶氧 100%, 开始发酵； 5小时后开始以 2. 5速流加 2小时，约加入 800亳升补料，加入 1克 IPTG诱导（三小时）。 3)层析：

(i)亲和层析

采用 GSH-Agrose层析介质（Pharmacia公司），平衡液采用 25mM Tris-HCl , pH8 , 上样平衡后，裂菌的离心上清上 Glutathione Sepharose层析柱（Pharmacia公司），平衡后用含 l OmM还原型谷胱甘肽（GSH ) 的洗脱液洗下融合蛋白。

(i i)酶解

上一步的洗脱液加入凝血酶（5 NIHU/raL ) 37°C酶切 2小时。 (i i i)阴离子交换层析

采用 Sour ce 30Q层析（Pharmacia公司）介质，平衡液为 20mM PB， PH7, 将步骤（2 )酶解得到的样品用水稀释 1倍进行上样，平衡后采用 20raM PB， pH7, 0 - 1M NaCl的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

4)检测

得到的 Ala- Τ β 4通过 SDS- PAGE纯度检测和反相 HPLC检测，纯度大于 98 %。实施例 3 胸腺素 β 4衍生物 Gly- Τ β 4和 Ala- Τ β 4与天然胸腺素 Τ β 4对大鼠心脏缺血模型的治疗效果评价

1. 病态动物模型的制作与试验方法

为了评价和比较 Gly- Τ β 4与 Τ β 4减少心脏组织损伤和减少心肌纤维化的生物学活性，建立了急性心肌梗塞的病态动物模型 -一大鼠冠状动脉左前降支再灌流模型。

肌肉注射曱苯噻嗪 5mg/kg; 氯胺酮 50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位，在完全无菌状态下进行手术。切开大鼠前胸壁皮肤，切断第 3到第 6 肋骨，露出胸腔，将肺推向一侧，打开心囊，露出心脏。从冠状动脉左前降支起点到 3腿处，用 6-0聚丙烯结扎丝与 NELATON结扎血管， 1小时后再灌注。确认无出血后，将切断的肋骨与胸骨缝合，再缝合皮肤。手术后肌肉注射庆大霉素 3mg/kg/天，共 3天，防止感染。

2. 利用超声心动图比较左心室前壁厚度

1) Gly-TP4与 Τβ4的比较

依步骤 1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组（每组 20只，注射生理盐水 200μ1/只 /天），阳性对照组（每组 20只，腹腔注射天然胸腺素 Τβ4 10μ₈/只 /天），试验组（每组 20只，腹腔注射胸腺素衍生物 Gly-TP4 10μ₈/只 /天）给药。

给药后第 14、28、56天利用心脏超声心动图（Live 3D Echo 7500 ) 与探针（probe 15- 16L),测定各组动物左心室前壁厚度。结果如下：基础值（笫 0天，给药前），阴性对照组 0.2682 ±0.01，阳性对照组 0.2513 ± 0.032, Gly-T β 4组 0.2499 ± 0.0225, 各组之间无显著性差异。给药 14 天，阴性对照组 0.1365 ±0.0125，阳性对照组 0.1919士 0.012,与阴性对照组相比，有显著性差异（ ρ=0.048<0.05 )。

Gly-T β 4 组 0.2162 ± 0.0078, 与阴性对照组相比，有显著性差异 (ρ=0.003<0.05)。与阳性对照组相比，有差异（ρ=0.086<0.1)。

这些结果显示， Gly-T β 4与 Τ β 4均能有效恢复心肌梗塞引起的左心室壁厚度的减少（见图 1)。其中，所述 Gly-T β 4引起心脏左心室前壁厚度增加的效果出人意料的大大高于 Τ β 4的效果。

2) Α1&-Τβ4与 Τβ4的比较

依步骤 1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组（每组 20只，注射生理盐水 200μ1/只 /天），阳性对照组（每组 20只，腹腔注射天然胸腺素 Τβ4 10μ₈/只 /天），试验组（每组 20只，腹腔注射胸腺素衍生物 Ala- TP 4 10μ₈/只 /天）给药。给药后第 14、 28、 56天利用心脏超声心动图（ Live 3D Echo 7500 ) 与探针（probe 15-16L)，测定各组动物左心室前壁厚度。结果如下：基础值（笫 0天，给药前），阴性对照组 0.2594 ± 0.0225，阳性对照组 0.2378 ±0.018， Ala-T β 4组 0.2432 ± 0.01，各组之间无显箸性差异。

给药第 14天阴性对照组 0.1306 ± 0.0128，阳性对照組 0.1215 ±0.013， Ala-TP4组 0.1299 ±0.011，各组之间无显著性差异。

给药第 28天，阴性对照组 0.1207 ± 0.0151，阳性对照组 0.1233 ± 0.0071，人1&-1^4组0.1288 ±0.012，各组之间无显著性差异。

给药 56天，阴性对照组 0.1265 ±0.0125, 阳性对照组 0.1232 ± 0.0057, Ala-Τβ 4组 0.1672 ± 0.0078， Ala-T β 4组心脏左心室前壁厚度增加 (ρ<0.05)。

这些结果显示， Ala- Τβ4 能有效恢复心肌梗塞引起的左心室壁厚度的减少（见图 5)。其中，所述 Ala-T β 4引起心脏左心室前壁厚度增加的效果出人意料的大大高于 Τ β 4的效果。

3。利用组织学图片比较心室纤维化程度

依步骤 1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组（每组 20只，注射生理盐水 200μ1/只 /天），阳性对照组（每组 20只，腹腔注射胸腺素 Τβ4 10μ₈/只 /天），试验组（每组 20只，腹腔注射胸腺素 Gly- Τβ4 10μ₈/只 /天）给药。结果如下：

在给药后第 56天，取心脏，以乳头状肌肉为准，横切心脏，做成切片。用 1%福尔马林浸泡 24小时，制造石腊组织切片及玻片，进 Mas son' trichrom染色。各组之间比较采用了 Image- pro® PLUS ver.4.1 (Media Cybernetics)方法。

1) Gly-TP4与 Τβ4的比较

心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，阴性对照组 30.02士 5.1%，阳性对照組 23.15 ±2.9% ( P<0.05 ), Gly-TP4组 15.36 ±2·7%( Ρ< 0.0005)。

由上述结果显示，阴性对照组与阳性对照组、 Gly- Τβ4 组之间有显著性差异，尤其 Gly- Τβ4组有非常显箸性差异。所述结果表明 Gly-TP4和 Τβ4 均能有效减少心肌梗塞引起的心肌纤维化（见图 2)。其中，所述 Gly-T 4引起所述心肌纤维化的减少效果出人意料的大大高于 TP 4的效果。

2) Ala-TP4与 Τβ4的比较

心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，阴性对照组 28.13土 2.1%, 阳性对照组 22.91土 2.3% (Ρ < 0.05) , Ala-T β 4组 16.86土 1.8% (Ρ< 0.0005); 阴性对照组与阳性对照组、 Α1 -Τβ4组之间有显著性差异，尤其 Ala-T β 4 组有非常显著性差异。这些结果表明 Ala-T β 4和 Τβ4均能有效减少心肌梗塞引起的心肌纤维化（见图 6)。其中，所述 Ala- TP 4引起所述心肌纤维化的减少效果出人意料的大大高于 Τβ 4的效果。实施例 4 Gly-T β 4、 Ala-T β 4与 Τ β 4对大鼠表皮损伤模型的治疗效果评价

1. 病态动物模型的制作与试验方法

为了评价和比较 Gly- Τ β 4与 Τ β 4修复表皮组织损伤的活性性，建立了表皮损伤的病态动物模型：大鼠表皮损伤模型。

肌肉注射甲苯噻嗪 5mg/kg; 氯胺酮 50mg/kg麻醉，用碘酒、酒精消毒大鼠后背皮肤；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位，在完全无菌状态下进行手术。切开大鼠后背皮肤 3cm。

2. 利用电脑图像分析系统测量伤口长度 1) Gly-TP4与 Τβ4的比较

如上述步骤 1)建立大鼠表皮损伤模型后，分别向阴性对照組 (每组 10只，生理盐水 50μ1/只），阳性对照組（每组 10只，天然胸腺素 5μ /50μ1/只），试验组（每组 20只，胸腺素衍生物 Gly-T β4 5μ_§/50μ1/只）表皮涂抹给药，每天 4次。

给药 5天后，利用电脑图像分析系统测量伤口长度。结果如下：基础值（第 Q天，给药前），阴性对照组 3.15 ±0.21，阳性对照组 3.07土 0.18, Gly-T β 4组 3.13 ± 0, 11,各组之间无显箸性差异。

给药第 5天阴性对照组 2· 37土 0.18，阳性对照组 1.62士 0.13， Gly-T β 4组 1· 14 ± 0.12各组之间有显著性差异。

这些结果显示， Gly- Τβ4能有效促进表皮伤口愈合（见图 3)。其中， G 1 y-T Ρ 4促进表皮伤口愈合的活性出人意料的明显强于 Τ β 4。

2) Ala-TP4与 Τβ4的比较

如步骤 1)建立大鼠表皮损伤模型后，用喷雾器局部喷射给予阴性对照物（PBS)、阳性对照物（Τβ4)、试验物质 (Ala - Τ β 4 )，每天喷 4次。 TP 4、 Ala - Τβ4的药物浓度为 lOO g/ml,

用药后每天观察伤口愈合情况。

试验结果

① 伤口炎症反应： PBS组伤口的红肿、渗出等炎症反应较明显，持续约 2- 3天； Τβ 4组和 Ala -T β 4组的炎症反应较轻微，持续约 1-2天。

② 伤口愈合时间：伤口愈合时间 PBS组为 7.3 ±1.02天， Τβ4 组为 5.8 ±0.91天， Ala - Τ β 4组为 4.7 ± 0.83天。各组之间比较， Τ β 4组和 Ala - Τ β 4组伤口愈合时间明显短于 PBS组（Ρ<0.05) , 结果见图 7。

结果表明 Τβ4和 Ala - Τβ4均具有明显的促进伤口愈合的作用。其中，施用 Ala -Τβ 4的伤口愈合时间明显比施用 Τβ 4的短 ③瘢痕大小：给药 2周后，比较各组的瘢痕大小，其结果为：阴性对照组为 2.3 ± 0.31cm, Τ β 4组为 1· 9 ± 0.23cra, Ala - T β 4组为 1.7±0. 30cm; 而且 Τβ 4組和 Ala -Τβ 4组的瘢痕为较细的线状瘢痕、表面比较平整，而阴性对照组瘢痕为较粗、表面不平。

各组之间比较， Τ β 4组和 Ala - Τ β 4组伤口瘢痕明显小于 PBS组 (Ρ<0.05), 结果见图 8。

结果表明， Τ β 4和 Ala - Τ β 4均具有明显的抗瘢痕形成作用。其中，施用 Ala-TP4的伤口瘢痕明显比施用 Τβ4的小实施例 5 Gly-T β 4、 Ala- Τ β 4与 Τ β 4对大鼠角膜损伤模型的治疗效果评价

1. Gly-T&4与 Τβ4的比较

1)、病态动物模型的制作与试猃方法

为了评价 Gly- Τ β 4与 Τ β 4修复角膜组织损伤的活性性，建立了急性角膜损伤的病态动物模型：大鼠角膜碱烧伤模型。

把直径 2亳米的滤纸片浸泡到 1 Ν的烧碱中，然后将浸泡好的滤纸片放到大鼠角膜正中央， 30 秒以后用 PBS 充分沖洗。立刻用 Gly-TP4与 Τβ4治疗， 4天后挖出眼球， 10%甲醛固定后用石蜡包埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片用图像分析系统釆集、分析角膜上皮恢复情况。

2 ) .利用电脑图像分析系统测量角膜上皮恢复情况

如上述步骤 1)建立大鼠角膜损伤模型后，分别向阴性对照组 (每组 10只，用滴眼液局部给予生理盐水 30μ1/只， 4次 /天），阳性对照组（每组 10只，天然胸腺素 30μ1/只， 4次 /天），试验組 (每组 10只，胸腺素 Gly- Τβ 4 30μ1/只， 4次 /天）眼部给药。给药 4天后挖出眼球， 10%甲醛固定后用石蜡包埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片用图像分析系统釆集、分析角膜上皮恢复情况。结果如下：

基石出值（第 0天，给药前），阴性对照组 ⁴·⁸²±0·1², Τβ4组 4.76 ±0.18, 017-丁04组4.85±0.16，各组之间无显箸性差异。

给药笫 4天阴性对照组 4· 89 ±0.12， Τβ4组 7.03 ±0.13,Gly-T β 4组 7.62士 0.11, 阴性对照組与 Τ β 4组、 Gly-T β 4组之间有显著性差异，尤其 Gly-T β 4组有非常显著性差异。

这些结果表明 Gly-T β 4和 T P 4均能有效促进角膜碱烧伤后的恢复（见图 4)。其中， Gly-T Ρ 4促进角膜损伤修复的活性出人意料的明显强于 Τβ 4。

2. Ala-TP4与 Τβ4的比较

1)、病态动物模型的制作与试驗方法

为了评价 Ala-T Ρ 4与 Τ Ρ 4的药物有效性，建立了急性角膜损伤的病态动物模型：家兔角膜碱烧伤模型。

把直径 8亳米的滤纸片浸泡到 1 N的烧碱中，然后将浸泡好的滤纸片放到家兔角膜正中央， 30秒以后用生理盐水充分冲洗。立刻用 Ala-TP4与 Τβ4治疗。分别于 1, 5天后挖出眼球， 10%甲酪固定后用石蜡包埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片经染色后用图像分析系统釆集、分析角膜上皮恢复情况。

2)、给药方法

建立家兔角膜碱烧伤模型后，用滴眼液局部给予阴性对照物 ( PBS )、阳性对照物（ Τ β 4 )、试验物质 ( Ala - Τ β 4 )，每天滴 4次。 TP 4、人1&- 4的药物浓度为 50(^ 8/1111, 用药后每天观察角膜上皮恢复情况。

3)、试验结果角膜上皮恢复情况： Τβ4组、 Ala -Τ β 4组和 PBS组在给药第一天时，均观察到角膜上皮被减烧毁（参见图 9A-C；)。然而， PBS 组在第五天试验结束时，有部分角膜上皮细胞还未长出（见图 10A); Τ β 4组在第五天试验结束时，所有损伤的角膜上皮细胞均恢复正常，且可以观察到 1-2层上皮细胞出现（见图 10B); Ala- TP 4组在第五天试验结束时，所有损伤的角膜上皮细胞均恢复正常，且可以观察到 3-4层上皮细胞出现（见图 10C )。各组之间比较， Τ β 4组和 Ala -T β 4组角膜上皮恢复情况明显优于 PBS组， Ala -T β 4组角膜上皮恢复情况明显优于 Τ β 4组。结果表明 , Τ β 4和 Ala - Τ Ρ 4具有明显的促进膜碱烧伤的角膜上皮恢复作用，其中 Ala -Τβ 4的角膜上皮恢复作用优于 TP 4。

Claims

权利要求

1. 胸腺素 β 4衍生物，其选自具有 SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的 Gly-T β 4和具有 SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的 Ala- Τ β 4。

2. —种多核苷^列，其编码权利要求 1所述的胸腺素 β 4衍生物。

3. 一种药物组合物，其含有权利要求 1所述的胸腺素 β 4衍生物，以及任选的药物上可接受的载体。

4. 权利要求 1的胸腺素 Ρ 4衍生物用于制备治疗皮肤组织损伤、心脏组织损伤、角膜损伤和 /或冠心病的药物的用途。

5. —种治疗受试对象中皮肤组织损伤、心脏组织损伤、角膜损伤和 /或冠心病的方法，包括向所述受试对象施用治疗有效量的权利要求 1中所述的胸腺素 β 4衍生物。

6. 权利要求 5的方法，其中所述受试对象是人。