KR101910908B1 - Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)을 함유하는 안구건조증 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Gly-Tβ4를 유효성분으로 하는 안구건조증 치료용 약학적 조성물로서, 손상된 각막 상피세포를 회복시키고, 동시에 Goblet cell(술잔세포)가 증식시키는 효과를 보이므로, 안구건조증의 치료, 예방, 경감에 효과적이다.

Description

Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)을 함유하는 안구건조증 치료용 약학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF DRY EYE HAVING Gly-Tβ4}
본 발명은 Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
안구건조증은 눈을 촉촉하게 적셔서 부드럽고 편안한 눈 상태를 유지해주는 눈물층의 양과 질이 감소하거나 변동이 생겨 눈물층에 이상이 발생하는 것을 의미하며, 눈물이 부족하거나, 눈물이 지나치게 증발하거나 또는 눈물의 구성성분의 균형이 맞지 않아 안구 표면이 손상되어 느끼는 자극감, 이물감 또는 건조감 등의 자극 증상은 물론, 이러한 증상으로부터 비롯된 각막염 또는 막 상피 상처 등을 포함한다. 대표적으로, 안구 건조증에는 결막건조증 또는 건성각결막염 등이 있지만, 이에 한정되지만은 않는다.
이러한 안구건조증은 i)눈 표면에서 눈물 증발되는 경우 ii)눈물샘의 염증으로 인해 눈물 분비가 되지 않은 경우 iii)점액층(mucin) 손상으로 그 윗층의 물 층이 충분하게 눈 표면을 덮지 못해 눈물이 부족한 경우에 발생한다고 알려져있으나, 아직도 그 명확한 원인이 밝혀지지 않은 상태이다.
안구건조증을 치료하기 위한 치료제로서는 RESTASIS®(Cyclosporin A) by Allergan, DIQUAS®(Diquafosol) by Santen 및 Hyalein®(Sodium Hyaluronate) by Santen and Generics등이 시판되고 있으나, 이러한 치료제들은 안구작열감 및 점안감이 좋지 못한 단점이 있으며, 다인성질환 안구건조증에 부적합하다. 또한 이러한 치료제들은 항염증작용 또는 뮤신(mucin)의 분비 촉진을 통해 안구건조증 개선효과를 발휘하지만 근본적인 치료는 어려운 실정이다.
한편, Gly-Tβ4 (Gly-Thymosin β4)는 44개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로서 기존의 Thymosin β4(Tβ4)의 N-말단에 Gly(글리신)을 추가한 것이다.
Gly-Tβ4는 이미 공지된 Tβ-4의 4차 구조 분석과 상기 단백질 N-말단의 유전 공학적 변형을 통해 발견된 것으로 본래 Tβ-4과는 다른 활성을 보인다.
Tβ4는 구조와 기능이 상대적으로 정의되고 공지된 주요 흉선 인자 중 하나이다. Tβ4는 소 유선에서 추출된 티모신 분획 5 (TF5)에서 처음 분리된 폴리펩티드이며, 43개의 아미노산을 가지며, 이황화 결합과 글리코실화 없이 4.963KD의 분자량을 갖는 것으로 공지되어 있다(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 257, No.2, pp.1000-1006, 1982, Chemical Characterization of Thymosin beta). Tβ4는 배아에서 심장 질환이 발병하는 동안 발현되는 단백질이며, 심장 세포의 이동을 증진시키고, 이러한 세포의 생존에 영향을 미칠 수 있다 (티모신 베타 4는 인테그린-링크된 키나아제를 활성화시키고, 심장 세포 이동, 생존 및 심장 수선을 증진시킨다, Nature, Vol. 432, Nov. 25, 2004)라고 알려져 있다.
본 발명자는 Gly-Tβ4 에 대한 연구끝에 안구건조증 동물 모델 및 임상연구를 통해서 안구건조증 환자의 증상이 개선되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자는 Tβ4 및 이에 대한 유도체에 대한 연구중 Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)가 Tβ4 보다 안구건조증 치료효과가 더 우수함을 확인하였고, Gly-Tβ4를 유효성분으로 하는 조성물이 안구건조증 치료제로 활용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해, Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)를 유효성분으로 포함하는 안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 Gly-Tβ4 는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 Gly-Tβ4 의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.005 ~ 5%(w/v) 일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 점안제 형태일 수 있다.
상기 안구건조증은 수성 눈물 -결핍성 안구건조증 또는 증발성 안구건조증인 것일 수 있다.
상기 안구건조증은 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증, 알레르기성 결막염 수반 안구건조증, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소 및 공기 조절장치로 인한 건조한 방에 의해 야기되는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소를 포함하는 안구건조증 유사 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 손상된 각막 상피세포를 회복시키고, 동시에 Goblet cell(술잔세포)를 증식시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)를 유효성분으로 포함하는 안구건조증 경감 또는 예방용 인공눈물을 제공한다.
본 발명은 Gly-Tβ4를 유효성분으로 하는 안구건조증 치료용 약학적 조성물로서, 손상된 각막 상피세포를 회복시키고, 동시에 Goblet cell(술잔세포)를 증식시키는 효과를 보이므로, 안구건조증의 치료, 예방, 경감에 효과적이다.
도1은 실험그룹(Group1: EDE, Group 2: Vehicle, Group 3: Gly-Tβ4 10 ug/mL, Group4: Gly-Tβ4 100 ug/mL, Group 5: Gly-Tβ4 1000 ug/mL)에서 측정한 눈물양을 측정한 결과이다.
도2는 실험그룹(Group1: EDE, Group 2: Vehicle, Group 3: Gly-Tβ4 10 ug/mL, Group4: Gly-Tβ4 100 ug/mL, Group 5: Gly-Tβ4 1000 ug/mL)에서 눈물막 파괴시간(Tear Film But)을 측정한 결과이다.
도3는 실험그룹(Group1: EDE, Group 2: Vehicle, Group 3: Gly-Tβ4 10 ug/mL, Group4: Gly-Tβ4 100 ug/mL, Group 5: Gly-Tβ4 1000 ug/mL)에서 형광염색을 통해 각막에서의 상처를 수치화한 결과이다.
도4는 T cell의 분포(Conjunctiva)를 측정하기 위한 Flow Cytometer 결과이다.
도5는 T cell의 분포(Lacrimal gland)를 측정하기 위한 Flow Cytometer 결과이다.
도6은 실험그룹(Group1: EDE, Group 2: Vehicle, Group 3: Gly-Tβ4 10 ug/mL, Group4: Gly-Tβ4 100 ug/mL, Group 5: Gly-Tβ4 1000 ug/mL)에서의 Goblet Cell Density 측정결과이다.
도7은 실험그룹(Group1: EDE, Group 2: Vehicle, Group 3: Gly-Tβ4 10 ug/mL, Group4: Gly-Tβ4 100 ug/mL, Group 5: Gly-Tβ4 1000 ug/mL)에서 손상된 각막상피세포를 확인하기 위한 형광염색결과이다.
도8은 Gly-Tβ4, Tβ4의 효능비교를 위해 재생된 술잔세포의 농도를 비교한 결과이다.
Gly-Tβ4 (Gly-Thymosin β4)는 44개의 아미노산 서열로 이루어진 Tβ4 유도체(아미노산 서열번호 1)로서 기존의 Thymosin β4(Tβ4)의 N-말단에 Gly(글리신)을 추가한 것이다. Gly-Tβ4 는 유전적 재조합 방법을 통해서 발현되거나, 화학 합성에 의해 제조될 수 있으며, 이에 국한되지 않고 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 보다 바람직하게는 유전적 재조합을 통한 재조합 및 발현 방법을 통해 얻어질 수 있으며, 보다 구체적으로는 Gly-Tβ4 유전자가 포함된 플라즈미드(plasmid)로 형질전환된 대장균을 이용하여 배양을 진행하여 재조합 단백질(GST-Tβ4 융합단백질)형태로 과발현시킨 후, 이를 정제한 다음 트롬빈으로 처리하여 최종 산물인 Gly-Tβ4 를 획득할 수 있다.
Gly-Tβ4는 각막상피세포의 이동을 촉진시킬 수 있으며, 이로 인하여 콜라겐 및 laminin-5의 형성이 촉진될 수 있다. 이러한 콜라겐 및 laminin-5은 각막의 손상을 회복시키며 최종적으로는 안구건조를 개선시킬 수 있다. 또한 이에 한정되지 않고, Gly-Tβ4는 MUC5AC (안구표면에 존재하는 Goblet cell) 및 Goblet cell 성장을 촉진시켜 뮤신(Mucin)을 증가시키고, 손상된 각막상피세포의 재생을 도와 안구건조를 치유하는 효력을 갖는다고 알려져 있다.
안구건조증(Dry eye syndrome)은 눈물 결핍 또는 과다 증발로 인한 눈물막의 장애를 포함하며 안검 사이(interpalpebral)의 눈 표면의 훼손을 야기하는 눈의 불편감의 증상도 포함할 수 있다. 또한 안구건조증은 불편감, 시력 장애 및 눈물막 불안정성의 증상과 함께 눈 표면에 잠재적인 훼손을 야기하는 눈물 및 눈 표면의 다인자 질병을 의미할 수 있으며, 이러한 질병은 눈물막의 증가된 삼투압 및 눈 표면의 염증을 동반할 수 있다.
안구건조증은 수성 눈물-결핍성 안구건조증 및 증발성 안구건조증을 포함하며, 수성 눈물-결핍성 안구건조증은 눈물샘 눈물 분비의 부족으로 인해 야기된 질병을 포함할 수 있다. 또한, 증발성 안구건조증은 정상적 눈물샘 분비 기능의 존재 하에서의 노출된 눈 표면으로부터의 과다한 수분 상실로 인하여 야기된 질병을 포함할 수 있다.
본 발명은 Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)를 유효성분으로 포함하는 안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물에 대한 것이다.
본 약학적 조성물은 안과용 제제일 수 있다.
상기 제제는 겔, 로션, 분무제, 크림, 현탁액, 용액, 분산액 또는 오일형태일 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 허용되는, 보다 바람직하게는 안과용으로 허용될 수 있는 부형제 또는 담체가 포함될 수 있다. '약학적으로 허용되는'은 일반적으로 동물 또는 구체적으로 포유류, 특히 인간에 대한 용도를 의미한다.
또한, 상기 조성물에는 안정제, 용해제, 완충제, 보존제, 증점제 또는 기타 부형제가 포함될 수 있다.
상기 담체는 국소투여 또는 범용 투여에 적절한 것이면 본 발명에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 상기 담체는 물, 물과 수-혼화성 용매들의 혼합물[상기 수-혼화성 용매는 예를 들면, C1 내지 C7 알칸올류, 식물성 오일류 또는 미네랄 오일류(예를 들면 0.5 내지 5 중량%의 히드록시에틸셀룰로스, 에틸 올레에이트, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐-피롤리돈 등), 아크릴레이트류(예를 들면 폴리아크릴산의 염류 또는 에틸 아크릴레이트), 메타크릴레이트류, 폴리아크릴아미드류, 천연 생성물류(예를 들면 젤라틴, 알기네이트류, 팩틴류, 트라가칸트, 카라야 검, 크산탄 검, 캐라기닌, 한천, 아카시아, 전분 유도체(예를 들면 전분 아세테이트 및 히드록시프로필 전분))], 안과 용도의 기타 무독성 수-용해성 중합체(예를 들면 셀룰로스 유도체(예를 들면 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스의 알칼리금속 염들, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 메틸히드록시프로필셀룰로스 및 히드록시프로필셀룰로스)), 다른 합성 생성물들(예를 들면 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리에틸렌 산화물, 가교된 폴리아크릴산(예를 들면 중성 카보폴)), 또는 이들 중합체들의 혼합물일 수 있다.
상기 완충제는 보레이트계, 탄산 수소/카르보네이트계, 글루코네이트계, 포스페이트계, 프로피오네이트계 및 트로메타민(TRIS)계 완충제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 완충제는 트로메타민계 완충제 또는 보레이트계 완충제일 수 있다. 상기 완충제 기질의 양은, 예를 들어, 생리학상 허용되는 pH 범위를 보장하고 유지하는데 필요한 양일 수 있다. 상기 생리학상 허용되는 pH 범위는 pH 5 내지 9, 구체적으로, 6 내지 8.2, 더욱 구체적으로, 6.8 내지 8.1일 수 있다.
상기 보존제는 4차 암모늄염(예를 들면 세트리미드, 염화 벤잘코늄 또는 염화 벤족소늄), 티오살리실산의 알킬-수은 염류(예를 들면 티메로살, 페닐머큐리산 나이트레이트, 페닐머큐리산 아세테이트 또는 페닐머큐리산 보레이트), 파라벤류(예를 들면 페닐파라벤 또는 프로필파라벤), 알콜류(예를 들면 클로로부탄올, 벤질 알콜 또는 페닐 에탄올), 구아니딘 유도체(예를 들면 클로로헥시딘 또는 폴리헥사메틸렌 비구아니드), 또는 소르브산일 수 있다. 구체적으로, 상기 보존제는 4차 암모늄염 또는 파라벤류일 수 있다. 상기 보존제의 함량은 세균 및 진균에 의해 사용중에 유발되는 2차 오염을 막을 수 있는 양이라면 특별히 한정되지 않는다.
안과용 제제 내의 적절한 점도를 유지하기 위하여 다음 제형이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다: (a) 단량체성 폴리올류(예를 들면, 틸록사폴, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜); (b) 중합체성 폴리올류, (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(예, PEG 300, PEG 400)); (c) 셀룰로스 유도체 (셀룰로스 부류의 중합체들)(예를 들면, 히드록시에틸셀룰로스, 히프로멜로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 히드록실프로필셀룰로스); (d)덱스트란류(예를 들면, 덱스트란 70); (e) 수용성 단백질(예를 들면, 젤라틴); (f) 비닐 중합체류(예를 들면, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리딘); (g) 다른 폴리올류(예를 들면, 폴리소르베이트 80, 포비돈); (h) 카르보머류(예를 들면, 카르보머 934P, 카르보머 941, 카르보머 940, 카르보머 974P); 및 (i) 다당류/글리코사미노글리칸류(예를 들면, 히알루로난 (히알루로란산/히알루로네이트), 콘드로이틴 설페이트).
본 발명의 이미 상술한 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안구건조증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 동물, 보다 구체적으로는 포유류일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간을 포함할 수 있다.
상기 투여는 경피투여, 비경구투여, 비강내(이를 테면, 흡입)투여, 점액막을 통한 투여를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 눈 조직에 직간접적으로 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)를 유효성분으로 포함하며 상기 조성물은 단독투여 또는 기타 다른 약물과 병용투여도 가능하다.
상기 조성물은 총 조성물 기준으로 0.005 내지 5 %(w/v)의 Gly-Tβ4를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 총 조성물 기준으로 0.01 내지 0.1 %(w/v)의 Gly-Tβ4를 포함할 수 있다.
본 발명은 Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)를 유효성분으로 포함하는 안구건조증 경감 또는 예방용 인공눈물을 제공한다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예1 . Gly - Tβ4 의 제조
HU024(Gly-Tβ4)는 WCB 1 vial을 해동하여 2번의 시드 배양(seed culture)를 진행하여 세포수를 증식한 후 배양기(Production Bioreactor)에서 배양한다. 배양 종료후 슬러리를 만든 후 세포 파쇄하고 이를 Depth/Micro Filtration(UF/DF)한다. 배양 상등액은 이온 교환 크로마토그래피(Anion Exchange Chromatography)한 후 친화 크로마토그래피(Affinity Chromatography)를 진행한다. 이후 효소분해하고 다시 음이온 교환, 양이온 교환 크로마토그래피를 진행하고 UF/DF를 통해 최종 원제 제형으로 만든다.
하기 표는 500L 기준 배양 및 정제에 대한 구성도이다.
500L 제조공정
배양 (발효) 정제
Cell bank thaw (WCB) Anion Exchange Chromatography
2000 mL Erlenmeyer flask 1 ea (500 mL) Affinity Chromatography
25 L Seed Bioreactor (15 L) Enzyme Digestion
500 L Production Bioreactor (440 L) Affinity Chromatography
Harvest Cation Exchange chromatography
Slurry Preparation Ultrafiltration/Diafiltration
Cell Disruption Sterile Filtration
Depth Filtration/Micro Filtration Storage of DS
실험예1 . Gly - Tβ4의 안구건조증 치료 효능실험
스코폴라민(Scopolamine)를 투여(0.5mg/0.2ml, 3 times a day )한 후 케이지내 건조 공기를 Fan을 통해 주입(air draft)시켜 만든 실험적 건선안 마우스 모델 (Experimental Dry Eye(EDE) Model)을 이용하여 본 발명의 Gly-Tβ4(이하, U024)의 효능을 다음과 같이 검증하였다.
1. 실험군
Group Description Subject
G1 EDE Control Group N=5
G2 EDE+ Vehicle N=5
G3 HU024 (Gly-Tβ4) 10 ug/ml N=5
G4 HU024 (Gly-Tβ4) 100 ug/ml N=5
G5 HU024 (Gly-Tβ4) 1000 ug/ml N=5
2. 투여방법
Gly-Tβ4를 하루 3회, 마우스의 각 눈당 1방울씩 투여하였다.
3. 평가방법
1) Clinical Parameters를 위해 a.Tear Volume (Day 7, Day 14 간격으로 측정), b.Tear Film BUT (Day 7, Day 14 간격으로 측정), c.Fluorescent Staining (Day 7, Day 14 간격으로 측정)을 실시하였다.
2) Biochemical Parameters을 위해 a.Inflammatory Cytokine 분석 (대상 사이토카인: IL-1β, TNF-α)를 실시하였다.
3) Immunological/Cellular Parameters을 위해 a.Goblet Cell Density 확인 (PAS Staining 법을 사용) b.Inflammatory T Cell 분포 확인 (Flow Cytometer, CD4+CCR5+)를 실시하였다.
4. 실험결과
1.1. Tear Volume 측정
눈물분비량은 마우스의 외안각쪽 결막낭에 Phenol-red impregnated cotton threads를 20초간 접촉시켜 그 길이를 SMZ microscopy를 이용하여 측정한 다음, 정해진 공식에 대입하여 부피로 변환하였다. 그 결과는 다음과 같다(도1참조).
　 Group 1
(EDE) 		Group 2
(Vehicle) 		Group 3
(10 ug /mL) 		Group4
(100 ug /mL) 		Group 5
(1000 ug /mL)
Day 7 0.057±0.006 0.059±0.018 0.066±0.011 0.069±0.006 0.076±0.010
Day 14 0.056±0.007 0.059±0.009 0.069±0.009 0.073±0.013 0.079±0.014
1.2 Tear Film BUT
건성안에 있어 가장 중요한 임상 인자인 눈물막의 안정성(tear film stability)을 판단하는 눈물막 파괴시간의 검사를 위해, 마우스의 아래쪽 결막낭에 1% 형광염색액 (Fluorescein) 1 ul을 점안한 후 눈을 3회 정도의 눈 깜박임을 시킨 후 부드럽게 벌린 다음, Cobalt blue filter가 장착된 세극등 현미경을 통해 염색된 눈물막에 첫 번째 결손이 생길 때까지의 시간(초)을 측정하였다. 이를 3회 반복 시행하여 평균값을 구하였다. 그 결과는 다음과 같다(도2참조).
　 Group 1
(EDE) 		Group 2
(Vehicle) 		Group 3
(10 ug /mL) 		Group 4
(100 ug /mL) 		Group 5
(1000 ug /mL)
Day 7 2.87±0.54 3.03±0.32 3.18±0.27 4.15±0.64 4.70±0.29
Day 14 2.44±0.16 2.76±0.25 2.96±0.33 3.55±0.39 4.07±0.29
1.3 형광염색(Fluorescent Staining)
1% 형광염색액 1 μL염색을 점안 후 식염수로 세척한 다음, 마우스의 각막을 세극등 현미경으로 관찰하여 상피손상 정도 (형광염색이 묻어나는 정도)를 점수화하여 평가하였다. 이를 위해 각막을 4개의 구역으로 나눈 다음, 각 등분을 아래와 같이 0-4점까지 평가한 후 합산하였다(총 0-16점).
① Absent
② Slightly punctuate staining < 30 spots
③ Punctate staining > 30 spots, but not diffuse
④ Severe diffuse staining but no positive plaque
그 결과는 다음과 같다(표3참조).
　 Group 1
(EDE) 		Group 2
(Vehicle) 		Group 3
(10 ug /mL) 		Group 4
(100 ug /mL) 		Group 5
(1000 ug /mL)
Day 7 11.9±1.79 11.2±2.66 8.8±1.14 8.1±1.20 6.7±1.16
Day 14 13.5±1.08 12.5±1.43 11.4±1.51 8.6±0.97 7.7±1.16
2.1. Biochemical Parameter
각 군당 3마리 6안에서 결막 조직을 절제 채취한 후, 이를 protease inhibitor를 포함한 lysis buffer에 30분간 담근 후 원심분리하여 -70oC에 보관하였다. 그 후 Luminex multiplex immunobead assay를 이용하여 항염성 사이토카인(IL-1b, TNF-a)의 농도(pg/ml)를 측정하였으며 그 결과는 다음과 같다.
Conjunctival Gland
Group 0
(EDE) 		Group 1
(Vehicle) 		Group 2
(10 ug/mL) 		Group 3
(100 ug/mL) 		Group 4
(1000 ug/mL)
IL-1b 21.22 9.13 12.52 3.67 3.13
TNF-a 20.02 18.88 15.86 11.15 10.22
Conjunctival Gland
Group 0
(EDE) 		Group 1
(Vehicle) 		Group 2
(10 ug /mL) 		Group 3
(100 ug /mL) 		Group 4
(1000 ug /mL)
IL-1b 21.22 9.13 12.52 3.67 3.13
TNF-a 20.02 18.88 15.86 11.15 10.22
3.1 Immunological/Cellular Parameter
결막을 절제하여 가위로 쪼갠 후 0.5 mg/mL collagenase type D로 37 ℃에서 60분간 섞어주었다. 조직을 갈은 후 cell strainer에 통과시킨 다음 원심분리를 시행하였다. Fluorescein-conjugated anti-CD4 antibody와 phycoerythrin-conjugated anti-IFN-γ antibody를 이용하여 flow cytometry를 시행하여 CD4+CCR5+T세포의 수를 계산하였다. T cell의 분포를 측정한 결과는 다음과 같다(도4, 도5 참조).
　 Group 1
(EDE) 		Group 2
(Vehicle) 		Group 3
(10 ug /mL) 		Group 4
(100 ug /mL) 		Group 5
(1000 ug /mL)
Conjunctiva 40.55 28.2 20.94 20.63 9.26
Lacrimal gland 39.56 34.39 27.66 24.48 20.94
PAS (Periodic acid-Schiff) 염색을 실시하여 술잔세포의 밀도를 평가하였다.
마우스의 눈과 부속기를 절제하여 4% paraformaldehyde에 고정하고 파라핀에 임베딩시킨 다음 조직 단면에 대한 PAS 염색을 시행하였다. 각 단면에서 현미경과 image-analysis software를 이용하여 결막 내 술잔세포(goblet cell)의 밀도를 계산하였다. 그 결과, 술잔세포의 밀도는 아래와 같다(도6, 도7 참조).
Group 1
(EDE) 		Group 2
(Vehicle) 		Group 3
(10 ug /mL) 		Group 4
(100 ug /mL) 		Group 5
(1000 ug /mL)
3.8±0.8 5.2±1.2 9.2±1.0 10.2±1.5 15.5±1.9
건선안에서 HU024 농도의존적으로 Tear volume의 증가가 확인되었으며, 또한 Tear Film BUT의 경우 농도의존적으로 시간이 증가하였다.
그리고 Fluorescent Staining의 경우 안구건조증이 심해지면 손상된 각막 상피 세포의 염색된 점들의 수가 증가함을 확인하여 안구건조증을 확인하는데, 이 수치가 감소했음을 알 수 있다.
이러한 세가지 방법을 통해 농도의존적인 Tear Volume의 증가, Tear film BUT의 감소, Fluorescent Staining의 감소가 확인되어 건선안 모델에서 안구건조증상이 완화/치료됨을 확인할 수 있었다.
또한, 염증작용을 하는 interleukin-1beta와 TNF-alpha의 양이 농도의존적으로 감소하는 것이 확인이 되어 HU024의 항염증 작용을 확인할 수 있으며, 또한 Flow Cytometer의 결과에서도 CD4+CCR5+ T cell의 분포가 농도의존적으로 감소하였는 바, 염증부위에 특이적으로 존재하는 T cell의 양이 감소함으로 염증이 완화되었음을 간접적으로 확인할 수 있다.
그리고 PAS 염색을 통한 Goblet Cell Density가 HU024 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있는데, 기존의 Fluorecent staining 결과에서 알 수 있듯이 손상된 각막 상피세포가 줄어듦과 동시에 술잔세포가 증식되었음을 알 수 있다.
이러한 결과에서 알 수 있듯이 HU024는 항염증 효과와 세포재생효과를 가진 것을 확인할 수 있었다.
비교예 . 효능비교실험( Gly - Tβ4 , Tβ4의 효능 비교 실험)
실험군은 다음과 같이 구성하였다.
Group 1: EDE , Group 2: Vehicle, Group 3: WT-Tβ4,Group 4: Gly-Tβ4
Goblet Cell Density 값의 증가를 통해 실험적 건선안 유도에 따라 줄어든 각막내 술잔세포가 약물에 의해 재생되어 증가됨을 확인할 수 있다.
Group 1
(EDE)		 Group 2
(Vehicle)		 Group 3
WT-Tβ4		 Group 4
Gly-Tβ4
Goblet Cell Density 3.3 ± 0.8 5.0 ± 1.3 9.7 ± 0.8 11.0 ± 0.8
상기 표에서 확인할 수 있듯이 Group 3: WT-Tβ4 대비 Group 4: Gly-Tβ4에서 술잔세포가 더 많이 재생된 것을 확인할 수 있다(도8참조).
<110> Huons <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF DRY EYE HAVING Gly-Tb4 <130> 17p1108 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> recombinant Gly-Thymosin beta4 <400> 1 Gly Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser 1 5 10 15 Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys 20 25 30 Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 35 40

Claims (8)

  1. Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)를 유효성분으로 포함하고,
    안구건조증은 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증, 알레르기성 결막염 수반 안구건조증, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소 및 공기 조절장치로 인한 건조한 방에 의해 야기되는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소를 포함하는 안구건조증 유사 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
    안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Gly-Tβ4 는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 Gly-Tβ4의 함량은 조성물 전체 부피를 기준으로 0.005 ~ 5%(w/v)인 것을 특징으로 하는 안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 점안제 형태인 것을 특징으로 하는 안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 안구건조증은 수성 눈물 -결핍성 안구건조증 또는 증발성 안구건조증인 것을 특징으로 하는 안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 손상된 각막 상피세포를 회복시키고, 동시에 Goblet cell(술잔세포)를 증식시키는 것인 특징으로 하는 안구건조증 치료, 경감 또는 예방용 약학적 조성물.
  8. Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)를 유효성분으로 포함하고,
    안구건조증은 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증, 알레르기성 결막염 수반 안구건조증, VDT (영상 단말기 (Visual Display Terminal)) 노동자의 눈물 감소 및 공기 조절장치로 인한 건조한 방에 의해 야기되는 임의의 전신 증상이 없는 눈물 감소를 포함하는 안구건조증 유사 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 안구건조증 경감 또는 예방용 인공눈물.
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