WO2007007787A1 - Ａｄａｍ１１遺伝子が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物 - Google Patents

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WO2007007787A1
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human
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Eiki Takahashi
Kazuto Yamazaki
Toru Oki
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Definitions

  • the present invention relates to a non-human gene disrupted animal produced by disrupting the ADAM11 gene and its use.
  • ADAM Disintegrin and Metalloprotease
  • Dice integrin is a peptide with anticoagulant activity that is contained in hemolytic snake venoms such as rattle snakes, which can inhibit the binding of integrin a lib ⁇ 3 and fibrinogen on platelets.
  • hemolytic snake venoms such as rattle snakes
  • the amino acid sequence of the ADAM family disintegrin-like domain is highly homologous to the snake venom disintegrin, and in fact, several ADAM proteins have been reported to bind to integrins (Judith M White. 2003). Cell Biology 15: 598—606).
  • ADAM protein functions There are two possible functions: the function of recognizing ntegrin and the function of specifically processing substrate proteins, some with both functions, and some with only one of the functions.
  • ADAM protein is expressed on the cell surface when the Proprotein domain is cleaved after being produced as a precursor.
  • the ADAM11 gene of the ADAM family has been confirmed to be a breast cancer suppressor gene, since the full-length sequence of the gene has been confirmed so far (JP-A-7-330799).
  • Many ADAM families are specifically expressed in reproductive tissues or expressed in a wide range of tissues, whereas the ADAM11 gene is highly expressed specifically in nervous tissues.
  • the ADAM11 gene is highly expressed specifically in nervous tissues.
  • the inventors of the present invention created a mouse in which the ADAM11 gene was knocked out, and found that the knockout mouse exhibited a trait of a nerve-related disease.
  • the present invention is based on this finding.
  • non-human gene-disrupted animal and its offspring (hereinafter referred to as "non-human gene-disrupted animal according to the present invention"), wherein both or one of the alleles of the ADAM11 gene is disrupted, are provided.
  • a gene-disrupted animal in which both alleles are disrupted (ADAM11 gene is inactivated) and exhibits a form of nerve-related disease.
  • the non-human gene-disrupted animal of the first aspect according to the present invention is useful for elucidating the mechanism of a disease involving the ADAM11 gene and for searching for and developing a substance useful for treating a nerve-related disease.
  • a gene-disrupted animal in which one of the alleles is disrupted (second embodiment) can be obtained by crossing both of the ADAM11 gene counter genes.
  • a gene-disrupted animal (first embodiment) in which is disrupted can be obtained.
  • the non-human gene disrupted animal of the second aspect according to the present invention is useful as a parent animal for producing the gene disrupted animal of the first aspect.
  • the present invention is as follows.
  • nerve-related disease is coordination movement disorder, memory disorder, cognitive disorder, learning disorder, or pain disorder.
  • ES cells non-human animal embryonic stem cells
  • a manufacturing method comprising:
  • ES cells non-human animal embryonic stem cells
  • a manufacturing method comprising:
  • step (iii) further includes (iv) a step of comparing the degree of symptoms of the nerve-related disease before administration of the test substance and the degree of symptoms of the nerve-related disease after administration of the test substance.
  • nerve-related disease is a coordination movement disorder, a memory disorder, a cognitive disorder, a learning disorder, or a pain disorder.
  • ADAM 11 protein for the manufacture of a medicament for use in the treatment of nerve-related diseases caused by inactivation of ADAM 11 gene.
  • a method for treating a nerve-related disease caused by inactivation of an ADAM11 gene comprising a step of administering a therapeutically effective amount of an ADAMll protein to a mammal.
  • a gene therapeutic agent for a nerve-related disease caused by inactivation of the ADAM11 gene comprising a gene transfer vector in which the ADAMll gene is operably linked.
  • a method for treating a nerve-related disease caused by inactivation of an ADAM11 gene comprising a step of administering to a mammal a gene transfer vector operably linked to an ADAM11 gene or an AD AMI1 gene.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of a targeting vector.
  • FIG. 2 shows a Southern plot analysis performed to select clones in which homologous recombination occurs.
  • FIG.3 Southern blot analysis using genomic DNA of mice with disrupted AD AMI 1 gene
  • FIG. 4 shows a Western blot analysis using mouse cerebellum in which the AD AMI 1 gene was disrupted.
  • FIG. 7 is a diagram showing the time taken for each group of mice to drop from the stainless steel rod in the suspension test.
  • FIG. 8 is a graph showing scores of each group of mice in the suspension test.
  • FIG. 9 is a diagram showing the left and right hind limb widths (left and right widths) of each group of mice in a walking test. [10] This is a figure showing the stride (front / rear width) of both hind limbs of each group of mice in the walking test.
  • FIG. 11 is a view showing the staying time of each group of mice in the rotating rod test (stationary state).
  • FIG. 12 is a graph showing the residence time of each group of mice in a rotating rod test (rotating at 5 rpm).
  • * means that the homo mouse group is significantly different from the wild type mouse group (ANOVA method, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 13 is a graph showing the residence time of each group of mice in a rotating rod test (rotated at 10 rpm).
  • * means that the homo mouse group is significantly different from the wild type mouse group (ANOVA method, p ⁇ 0. 05).
  • FIG. 14 is a graph showing the residence time of each group of mice in a rotating rod test (rotating at 15 rpm).
  • * means that the homo mouse group is significantly different from the wild type mouse group (ANOVA method, p ⁇ 0. 05).
  • FIG. 15 is a diagram showing a circular pool used in a training session for a water maze test.
  • the circular pool is divided into four equal parts, and the platform is fixed to the TQ part.
  • FIG. 16 A graph showing changes in escape latency of each group of mice in a water maze test training session.
  • * means that the homo mouse group is significantly different from the wild type mouse group (Dunnett method, p 0.05).
  • FIG. 17 shows the swimming path of each group of mice in the water maze test probe trial.
  • FIG. 18 is a graph showing the residence time of each group of mice divided into four equal parts in a water maze test probe trial.
  • * means that there is a significant difference (Dunnett method, p 0.05) in the homomous group and the wild-type mouse group in terms of residence time in TQ.
  • FIG. 19 is a diagram showing the change in escape latency time for each group of mice in a test with a mark on the platform.
  • FIG. 20 is a diagram showing the reticking (including biting) time of each group of mice in the formalin test every 5 minutes.
  • FIG. 21 is a graph showing the reticking (including biting) time for each group of mice in the first and second phases of the formalin test.
  • * means that the homomouse group is significantly different from the wild-type mouse group (Dunnett method, p ⁇ 0.05).
  • FIG. 22 shows the number of agony symptoms in each group of mice in the acetic acid rising method.
  • * means that the homo mouse group is significantly different from the wild type mouse group (Dunnett method, p ⁇ 0.05).
  • the ADAM11 gene can be any gene as long as it is present in the autosomal genome and can be transcribed to produce mRNA encoding the AD AMI 1 protein. This refers to cDNA that encodes.
  • the ADAM11 gene to be disrupted in the gene disrupted animal according to the present invention is known to humans and mice.
  • the literature and database accession numbers for each DNA sequence are as follows.
  • ADAM11 gene sequence inherent in the animal based on the known full-length sequence of ADAM11 gene. That is, a homology search is performed based on the human or mouse ADAM11 gene, and the ADAM11 gene of the animal can be searched and specified. For homology search, BLAST etc. described later can be used.
  • Examples of the ADAM11 gene include a gene encoding a human AD AMI 1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a gene encoding a mouse ADAM 11 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the AD AMI 1 gene disrupted in the gene disrupted animal according to the present invention includes a gene encoding a protein functionally equivalent to the ADA Mil protein.
  • “functionally equivalent” means that the normal functions of the cranial nervous system (for example, coordination, memory, cognition, learning, or somatic sensation (pain)) are maintained at substantially the same level.
  • Whether it is “functionally equivalent” is determined by comparing a non-human gene-disrupted animal comprising a homozygous disruption of the gene with a normal non-human animal, and the normal function of the cranial nervous system (eg, coordination, memory, It can be determined by assessing whether cognition, learning, or somatosensory (nociception) is maintained at substantially the same level. That is, if the normal function of the cranial nervous system of a non-human gene disrupted animal that includes homozygous disruption of the gene is reduced or lost, the gene is functionally equivalent to the ADAM11 gene. It can be determined that there is. For the determination, a rotating rod test, a water maze test, a formalin test, an acetic acid rising method test, etc. can be used.
  • ADAM11 protein when a gene encoding an amino acid sequence (for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) is a polymorphism, the polymorphism Is also included.
  • ADAM11 protein for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • insertion, substitution or deletion of one or more amino acids, or addition to one or both ends thereof A gene encoding the amino acid sequence made (modified amino acid sequence);
  • ADAM11 protein eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • a gene encoding an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of ADAM11 protein for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4).
  • amino acid sequence in the amino acid sequence, one or a plurality of amino acids are inserted, substituted or deleted, or added to one or both ends thereof.
  • site-specific mutagenesis This means that it has been made by a well-known technical method such as a method, or by substitution of a plurality of amino acids to the extent that can occur naturally.
  • the modified amino acid sequence of the ADAM11 protein has, for example, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 2 amino acids. It may be one in which insertion, substitution or deletion of no acid, or addition to one or both ends thereof.
  • the modified amino acid sequence preferably has one or more (preferably 1 or several, more preferably 1, 2, or 3) conservative substitutions in the amino acid sequence of the ADA Mil protein. It can have an amino acid sequence.
  • substitution refers to substitution of one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the function of the protein. means. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted with another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted with another polar residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. Specific examples include nonpolar (hydrophobic) amino acids , Norin, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanin, methionine and the like.
  • Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, thiocin, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • Examples of positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • a gene (cDNA) having complementarity that hybridizes with a gene sequence encoding ADAM11 protein under stringent conditions is specifically FASTA, BLAST, Smith-Waterman (Meth. Enzym., 164,
  • the base sequence encoding the ADAM11 protein is at least 70%, preferably 80% or more.
  • Preferred is a polynucleotide having a homology of 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • ⁇ stringent conditions '' means that the reaction is performed at a temperature of 40 ° C to 70 ° C, preferably 60 ° C to 65 ° C, in a hybridization buffer that can be used by those skilled in the art. line It can be carried out according to a method of washing in a washing solution having a salt concentration of 15 to 300 mmol ZL, preferably 15 to 60 mmol ZL, etc. The temperature and salt concentration can be appropriately adjusted according to the length of the probe used.
  • the conditions for washing the hybridized can be 0.2 or 2 X SSC, 0.1% SDS, temperature 20 ° C to 68 ° C. ) Or mild (low stringency) conditions can be determined by the salt concentration or temperature at the time of washing.
  • hybridization In the case of carrying out the preno and the ibridization, it is usually carried out under the same conditions as the hybridizing. However, hybridization and pre-hybridization washing are not always performed under the same conditions. [0026]
  • the hybridization can be performed according to a known method. In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • identity (sometimes referred to as homology) with respect to amino acid sequences is used to mean the degree of coincidence of amino acid residues constituting each sequence among the sequences to be compared. It is done. At this time, the existence of gaps and the nature of amino acids are considered (Wilbur, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726-730 (1983)).
  • homology commercially available software such as BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183: 63-69 (1990), etc. are used. be able to.
  • the amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence of ADAM11 protein is preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, Particularly preferred is an amino acid sequence having identity of 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the numerical value of “identity” may be any numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art.
  • the homology algorithm of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLAST (Basic local alignment search tool) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ can be calculated using the default (initial setting) parameters.
  • the AD AMI 1 gene is disrupted by inserting a foreign sequence into the ADAM 11 gene, replacing the entire AD AMI 1 gene or part thereof with a foreign sequence, or all or part of the ADAM11 gene. This can be done by deletion of.
  • the number of bases in the foreign sequence and the position of substitution, deletion, and insertion are not particularly limited as long as ADAM11 protein expression and activity are substantially lost.
  • the foreign sequence is preferably a selectable marker gene.
  • the selection marker gene can be appropriately selected and used, and preferably includes a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene and a puromycin resistance gene.
  • Disruption of the ADAM11 gene can be preferably performed by replacing all or part of the AD AMI1 gene with an exogenous gene.
  • Examples of the ADAM11 gene to be replaced include the ADAM11 Pro domain and the metaprotease-like domain.
  • the gene region from exon 5 to exon 7 is from exon 9 to etason 15. The gene region of can be replaced.
  • Disruption of the ADAM11 gene can also be performed by introducing mutations such as deletion, insertion, or substitution into the ADAM11 gene.
  • mutations that have fatal effects (loss of expression or activity) on protein functions such as frameshifts and nonsense mutations can be introduced.
  • ADAM11 gene can be disrupted by targeted disruption.
  • Target destruction is performed by introducing into a cell a nucleic acid (preferably a selected gene, more preferably a gene inserted with a resistance gene for a drug) in which the nucleotide sequence of the target gene is modified.
  • a nucleic acid preferably a selected gene, more preferably a gene inserted with a resistance gene for a drug
  • This refers to a technology that introduces mutations into a target gene by causing homologous recombination between the nucleic acid and the target gene and selecting cells that have undergone homologous recombination (Capecchi MR, Science 244: 1288-1292, 1989).
  • the target destruction is an example of a technique for inactivating the gene based on the information of the base sequence of the ADAM11 gene. Included in human genetically disrupted animals.
  • mutations may be introduced into the base sequence of the target gene.
  • chemical synthesis, site-directed mutagenesis, or Mutations can be introduced using known genetic engineering techniques such as PCR.
  • it can be produced using a positive negative selection method applying homologous recombination (US Pat. Nos. 5,464,764, 5,487,992, 5,627,059) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, 8932-8935, 1989, Nature, Vol. 342, 435-438, 1989, etc.).
  • Gene-disrupted animals According to the first embodiment of the gene-disrupted animal of the present invention, a non-human gene-disrupted animal and its progeny, in which both alleles of the ADAM11 gene are disrupted, are provided.
  • AD AMI 1 protein is not expressed because it contains homozygous disruption of ADAM11 gene. That is, according to the first aspect, a non-human animal in which the ADAM11 gene is knocked out is provided.
  • the gene-disrupted animal of the first aspect has a phenotype that develops a nerve-related disease. Therefore, the gene-disrupted animal of the first aspect can be used to screen for a substance used for the treatment of nerve-related diseases.
  • the "neural-related disease” means a coordination movement disorder, a memory disorder (for example, spatial
  • Reference memory disorder cognitive disorder, learning disorder, and pain disorder.
  • Coordination movement disorders are disorders caused by, for example, abnormalities in the central nervous system such as the cerebellum, damage to peripheral nervous systems such as motor nerves, muscle strength, and skeletal abnormalities. Symptoms such as loss of smoothness of movement and loss of accuracy of movement appear because the body posture cannot be adjusted well. For example, in the case of a non-human animal, if the coordination disorder is due to an abnormality in the central nervous system, it can be confirmed, for example, using a rotating rod test. In addition, when the coordination movement disorder is caused by peripheral nervous system or muscle strength disorder, skeletal abnormality, etc., it can be confirmed by using, for example, a grip strength test (traction force test), a suspension test, and a gait test. These tests can refer to the method described in Ogura H, Matsumoto M, Mikoshiba K. (2001) Be hav Brain Res. L22 (2): 215-219.
  • Memory impairment is caused by, for example, damage to the hippocampus. For example, you forget what you promised, you made a mistake in the date and time, you cannot get to the destination because you have lost power, and you get lost. Symptoms like this appear. For example, in the case of a non-human animal, it can be confirmed using, for example, a water maze test.
  • Pain disorder is a disorder mainly caused by damage to receptors and effectors related to pain and their transmission pathways, and symptoms such as pain dullness appear.
  • a non-human animal it can be confirmed using a formalin test or an acetic acid rising method.
  • AD AMI1 protein is still expressed because it contains heterozygous disruption of ADAM11 gene.
  • the gene disrupted animal of the first aspect comprising homozygous disruption of the AD AMI1 gene is obtained.
  • the gene-disrupted animal of the second aspect can be used as a parent animal for producing the non-human gene-disrupted animal of the first aspect.
  • non-human animals are not particularly limited, rodents that are relatively easy to reproduce and can acquire individuals in a relatively short period of time are preferred from the viewpoint of creating an animal model. More preferred are mice and rats.
  • the offspring of a gene-disrupted animal according to the present invention is provided.
  • the term “offspring” means a progeny possessing a disrupted ADAM11 gene possessed by a gene disrupted animal according to the present invention.
  • tissue obtained from the non-human gene-disrupted animal according to the present invention and its offspring.
  • tissue include all organs and organs such as brain, heart, thymus, kidney, liver, spleen, muscle, bone, bone marrow, and skin.
  • the present invention also provides a non-human gene-disrupted animal according to the present invention and a non-human animal cell capable of obtaining its progeny.
  • the present invention further provides a non-human gene-disrupted animal according to the present invention and a breeding material from which the progeny can be obtained.
  • the propagation material include sperm, unfertilized eggs, fertilized eggs and the like.
  • ES cells non-human animal embryonic stem cells
  • a manufacturing method comprising:
  • ES cells non-human animal embryonic stem cells
  • a manufacturing method comprising:
  • DNA comprising a portion of the AD AMI 1 gene is prepared prior to the production of a polynucleotide comprising the disrupted ADAM11 gene.
  • the DNA encoding ADAM11 protein is set based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and PCR is performed from genomic DNA or cDNA of non-human animals, or RNA power of non-human animals is also RT-PCR. Can be obtained by law.
  • a probe is synthesized based on the nucleotide sequence described in the above cited reference, and a clone that hybridizes with the probe is selected from a genomic DNA library or cDNA library of a non-human animal.
  • a clone containing the ADAM11 gene or a part thereof preferably 5 kbp or more, more preferably 10 kbp or more. Confirm the restriction enzyme cleavage site contained in the cloned DNA and prepare a restriction enzyme map. If it is difficult to obtain a DNA of sufficient length for homologous recombination, preferably 5 kbp or more, more preferably lOkbp or more, the DNA is excised from multiple clones at appropriate restriction enzyme sites and ligated. It is allowed to match.
  • a positive selection marker such as a drug resistance gene, preferably a neomycin resistance gene or a puromycin resistance gene, is introduced into the restriction enzyme site of the etason region in the DNA having a length sufficient for homologous recombination. .
  • a part of exon may be removed and replaced with a drug resistance gene instead.
  • PCR may be performed, and an appropriate restriction enzyme site may be introduced by ligation of an oligonucleotide containing the restriction enzyme site.
  • an appropriate restriction enzyme site may be introduced by ligation of an oligonucleotide containing the restriction enzyme site.
  • homologous recombination does not occur between the introduced DNA and the ADAM11 gene, and embryonic stem cells (ES cells) in which the introduced DNA has been inserted at sites other than the AD AMI 1 gene are removed. Therefore, it is desirable to include a negative selection marker such as a thymidine kinase gene, a diphtheria toxin gene, etc. in the vector.
  • a negative selection marker such as a thymidine kinase gene, a diphtheria toxin gene, etc.
  • the vector used for preparing the targeting vector is not particularly limited as long as it is capable of self-replication in a cell to be transformed (for example, E. coli).
  • E. coli for example, commercially available pBluscript (Stratagene), pZErOl. 1 (Invitrogen), pGEM-1 ( promega)) can be used.
  • the prepared targeting vector is cleaved with a restriction enzyme to form a linear DNA, and purified by, for example, phenol'chloroform extraction, agarose electrophoresis, ultracentrifugation, etc., and transferred to an ES cell, for example, TT2. .
  • a restriction enzyme for example, phenol'chloroform extraction, agarose electrophoresis, ultracentrifugation, etc.
  • Examples of the method of transformation include powers such as electoral position and lipofectin.
  • the present invention is not limited to this.
  • Transfected ES cells are cultured in an appropriate selective medium, for example, in a selective medium containing neomycin and ganciclovir in the medium when a targeting vector incorporating a neomycin resistance gene and a thymidine kinase gene is constructed.
  • a transgene for example, a neomycin resistance gene
  • a transgene for example, a neomycin resistance gene
  • ADAM11 gene knockout mice can be used to collect 8-cell embryos or blastocysts after fertilization, microinjection of ES cells that have undergone homologous recombination, manipulation into pseudopregnant mice, transplantation of eggs, birth of pseudopregnant mice and breeding of offspring , Selection of transgenic mice by PCR method and Southern plot method, and establishment of strains of mice carrying the transgene (Yagi, T. et. Al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993).
  • ES cells having undergone homologous recombination are injected into the mouth.
  • Microinjection is based on, for example, the descriptions of Hogan, BLM, Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986 and Yagi T. et.al, Analytical Biochem. 214, 70, 1993. Under an inverted microscope, it can be performed using a micromanipulator, microinjector, injection pipette and holding pipette.
  • the injection dish for example, a droplet of 5 ⁇ l medium and a suspension of ES cells made in Falcon 3002 (Becton Dickinson Labware) and liquid paraffin layered are used.
  • the blastocyst is called an engineered egg, which is a microinjected embryo of ES cells that have undergone homologous recombination.
  • Pseudopregnant mice are created by mating vagina male and normal female mice, and manipulated eggs are transplanted.
  • Hogan, BLM A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 198b, Yagi T. et.al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993 This can be done based on the description. Examples of specific operations are described below, but the present invention is not limited thereto.
  • mice Pseudopregnant mice were anesthetized with, for example, sodium pentobarbital with a weight of 50 mgZkg, and the ovaries and fallopian tubes were exposed by incising both tendons, and the ovarian sac was incised with forceps under a stereomicroscope. Then expose the fallopian tube. Next, feed 7 to 8 manipulated eggs per fallopian tube into the fallopian tube. At this time, it is confirmed that it has been transplanted into the fallopian tube by the microbubbles inserted with the manipulated egg. Thereafter, the fallopian tube and ovary are returned to the abdominal cavity, both incisions are sutured, and the mouse is awakened from anesthesia. In some cases, the manipulated egg may be cultured until the next day, developed into a blastocyst, and transplanted into a force uterus.
  • offspring mice are obtained 17 days after transplantation.
  • the offspring mouse is usually a chimera of ES cells that have undergone homologous recombination and mouse cells from which fertilized eggs are collected.
  • TT2 is used as ES cells and injected into 8-cell embryos collected from ICR mice, the chimera rate is high.
  • the pup mouse has a dominant body color in the wild mouse color, and the mouse having a low chimera ratio has the white color in the body color.
  • transgene is contained in germ cells can be easily confirmed by mating with a mouse having a white hair color (for example, ICR) and the hair color of the pup mouse obtained. Or, since mice are expected to have a high chimerism rate and germ cells also contain a transgene, it is preferable to select a mouse with a chimera rate as high as possible.
  • a white hair color for example, ICR
  • heterozygouse By crossing the obtained chimeric mouse with a wild type mouse (normal mouse), a heterozygous mouse (hereinafter sometimes referred to as "heteromouse” t) can be obtained.
  • the presence or absence of the transgene can be confirmed by extracting DNA from the tail of the resulting pup and performing PCR.
  • a more reliable genotype can be identified by Southern plot analysis instead of PCR.
  • ADAM11 gene knockout mice By crossing heterozygous mice, it is possible to obtain AD AMI 1 gene knockout mice (hereinafter sometimes referred to as “homo mice”) in which the introduced gene is homozygous in the resulting pups. it can.
  • ADAM11 gene knockout mice can be obtained by crossing heterozygous mice, heterozygous mice and AD AMI1 gene knockout mice, or ADAM11 gene knockout mice.
  • the presence or absence of mRNA expression in ADAM11 gene knockout mice can be confirmed by Northern blot analysis, RT-PCR, RNAse protection assay, in situ, and the like.
  • the expression of ADAM11 protein can be confirmed by immunohistochemical staining, an antibody recognizing the protein, or the like.
  • the non-human gene-disrupted animal of the first aspect according to the present invention is a phenotype of a neurological disorder such as coordination movement disorder, memory disorder (for example, spatial / reference memory disorder), cognitive disorder, learning disorder, and pain disorder.
  • a neurological disorder such as coordination movement disorder, memory disorder (for example, spatial / reference memory disorder), cognitive disorder, learning disorder, and pain disorder.
  • a screening method for a substance or a salt thereof or a solvate thereof used for the treatment of a nerve-related disease there is provided a screening method for a substance or a salt thereof or a solvate thereof used for the treatment of a nerve-related disease
  • a method comprising is provided.
  • step (iii) the degree of symptoms of the nerve-related disease before administration of the test substance is compared with the degree of symptoms of the nerve-related disease after administration of the test substance. It may further include a process.
  • the substance screened using the screening method according to the present invention may be a salt or a solvate.
  • the salt with an acid include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, and phosphate, formic acid, acetic acid, lactic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, citrate, tartaric acid, Examples thereof include salts with organic acids such as benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and trifluoroacetic acid.
  • the salts with bases include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, dicyclohexylamine. N, N, -dibenzylethylenediamine, arginine, lysine and other organic base salts (organic amine salts), and ammonium salts.
  • the substance screened using the screening method according to the present invention may be an anhydride or may form a solvate such as a hydrate.
  • the solvate may be either a hydrate or a non-hydrate, but a hydrate is preferred.
  • the solvent water, alcohol (for example, methanol, ethanol, n-propanol), dimethylformamide and the like can be used. Further, when solvates and Z or optical isomers of these substances exist, the substances screened by the screening method of the present invention include those solvates and Z or optical isomers.
  • Substances screened using the screening method according to the present invention also include substances that undergo metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, and conjugation in vivo.
  • substances screened using the screening method according to the present invention also include compounds that generate sulfonamide compounds by undergoing metabolism such as oxidation, reduction, and hydrolysis in vivo.
  • the degree of the symptom of the nerve-related disease in the gene-disrupted animal before administration of the test substance and the symptom of the nerve-related disease in the gene-disrupted animal after administration of the test substance If the latter is improved over the former, it can be determined that the substance is useful for the treatment of nerve-related diseases.
  • a rotating rod test, a water maze test, a formalin test, an acetic acid rising method test, etc. can be used.
  • the rotating rod test is a test to check the disturbance of motor coordination, in which an animal is placed on a rotating rod (preferably 1 to 20 rotations per minute) and the fall frequency or the time to fall is examined. is there.
  • the non-human gene-disrupted animal of the present invention is placed on a rotating rod before administration of the test substance, and the fall frequency or the time until the drop is measured.
  • the non-human gene-destructed animal of the first aspect is placed on a rotating rod after administration of the test substance, and the fall frequency or the time until the drop is measured. If the drop frequency decreases or the time until the drop becomes longer after administration of the test substance, it can be determined that the test substance is a substance that improves the movement coordination function.
  • the water maze test for example, is a device in which water turbid with milk or ink is stored in a pool with a diameter of 1 to 2 m as necessary, and an evacuation platform is installed in a place in the pool , And measure the time (Escape latency) to reach the platform (goal point) where the non-human gene-disrupted animals of the first aspect can swim in the pool and reach their feet.
  • This is an index test.
  • the water maze test of the non-human gene-disrupted animal of the present invention is performed before the test substance is administered, and the time required to reach the platform is measured.
  • a water maze test is performed to measure the time to reach the platform. If the time required for the animal to reach the platform is shorter after administration of the test substance than before administration, the test substance improves memory impairment (including cognitive impairment, learning impairment, etc.). It can be judged as a material.
  • the formalin test is a test for observing and evaluating animal pain. It is associated with more clearly showing painful behavior (eg shaking, licking, biting, etc.).
  • the state of the paw of the animal before the formalin is administered to the paw of the non-human gene disrupted animal of the present invention is observed.
  • the state of the animal's foot licking or biting
  • the test substance can be determined to be a substance that improves pain sensation.
  • acetic acid rising test when acetic acid is administered to mice, peculiar “worrisome symptoms (rising)” appear due to pain.
  • the screening method according to the present invention for example, the state of the animal before administration of acetic acid into the peritoneal cavity of the non-human gene disrupted animal of the present invention is observed.
  • the test substance is administered into the abdominal cavity of the animal, and then the condition of the animal (rising, etc.) is observed. If the reaction appears faster in the animal after administration of the test substance than before administration, the test substance can be determined to be a substance that improves pain sensation.
  • a pharmaceutical composition comprising ADAM11 protein, which is used for the treatment of nerve-related diseases caused by inactivation of ADAM11 gene.
  • ADAM 11 protein for the manufacture of a medicament for use in therapy is provided.
  • a method for treating a nerve-related disease caused by ADAM11 gene inactivity wherein a therapeutically effective amount of ADAM11 protein is administered to a patient in need of treatment.
  • a therapeutic method comprising is provided.
  • treatment generally means obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect.
  • the effect is prophylactic in terms of completely or partially preventing the disease and Z or symptoms and is therapeutic in terms of partial or complete cure of the adverse effects caused by the disease and Z or disease.
  • Treatment includes any treatment of disease in mammals, particularly humans, and includes, for example, the following treatments:
  • examples of "nerve-related diseases caused by ADAM11 gene inactivity” include coordination disorders, memory disorders (for example, spatial and reference memory disorders), cognitive disorders, Learning disorders and pain disorders.
  • the ADAM11 protein in the treatment using the ADAM11 protein, can be provided as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the proportion of active ingredient to carrier may vary between 1 and 90% by weight.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be used for human or non-human organisms [for example, non-human mammals (for example, rabbits, monkeys, birds, cats, mice, rats, rats, mice, pigs, inu, etc.] , Birds, reptiles, amphibians, fish, insects, etc.] in various forms, oral or parenteral (eg intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, transdermal) Can be administered.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be applied to humans or non-human organisms in any of various forms, oral or parenteral (eg, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration). It can be administered by the route of administration. Therefore, the pharmaceutical group according to the present invention The active ingredient can be used alone.
  • the composition can be formulated into an appropriate dosage form using a pharmaceutically acceptable carrier by a method conventionally used depending on the route of administration.
  • vaginal dosage forms include, for example, tablets, powders, fine granules, granules, coated tablets, capsules, syrups, lozenges, oral preparations, inhalants, suppositories, injections (infusions) ), Ointments, eye drops, eye ointments, nasal drops, ear drops, poultices, lotions, ribosomes and the like.
  • Carriers used for formulating these preparations include, for example, commonly used excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring agents, and if necessary, stabilizers, emulsifiers, Absorption accelerators, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, extenders, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc. It can be used, and it can be formulated by a conventional method by mixing components generally used as raw materials for pharmaceutical preparations.
  • Non-toxic components that can be used include, for example, animal and vegetable oils such as soybean oil, beef tallow and synthetic glycerides; hydrocarbons such as liquid paraffin, squalene and solid paraffin; for example, otatildodecyl myristate, myristic acid Ester oil such as isopropyl; for example, higher alcohols such as cetostearyl alcohol, behelic alcohol, etc .; silicone resin; silicone oil; for example, polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxy Surfactants such as ethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymer; for example, hydroxyethyl cellulose, polyacrylic acid, carboxyvinyl polymer, polyethylene Water-soluble polymers such as ethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone and methyl cellulose; lower alcohols such as ethanol and
  • excipient examples include lactose, fructose, corn starch, sucrose, glucose, mannto
  • polyvinylolenoreconole polyvinylinoretenole
  • methinoresenorelose ethinoresenorelose
  • arabic gum tragacanth
  • gelatin shellac
  • shellac etc.
  • Hydroxypropylmethylcellulose hydroxypropylcellulose
  • polyvinylpyrrolidone polypropylene glycol
  • polyoxyethylene block polymer medalmin
  • Disintegrants include, for example, starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium bicarbonate, Calcium citrate, dextrin, pectin, carboxymethyl cellulose 'Calcium isokinetic lubricants include, for example, magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hard Vegetable oils, etc. are permitted to be added to pharmaceuticals as coloring agents, and flavourants include cocoa powder, hearth brain, aroma powder, heart force oil, dragon brain, cinnamon powder, etc. Used. The component may be a salt thereof or a solvate thereof.
  • the oral preparation is prepared by adding an excipient, and further, for example, a binder, a disintegrating agent, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent and the like to the active ingredient used in the present invention, and then using a conventional method.
  • an excipient for example, powders, fine granules, granules, tablets, coated tablets, capsules and the like are used.
  • sugar coating or other appropriate coating may be used if necessary.
  • syrups and injectable preparations for example, add pH adjusters, solubilizers, isotonic agents, etc., and if necessary, solubilizing agents, stabilizers, etc. To do.
  • a manufacturing method in particular is not limited, It can manufacture by a conventional method.
  • the base material to be used various raw materials usually used for pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and the like can be used.
  • animal and vegetable oils, mineral oils, ester oils, waxes, higher alcohols examples include fatty acids, silicone oils, surfactants, phospholipids, alcohols, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, clay minerals, purified water, etc.
  • Oxidizing agents, chelating agents, antiseptic / antifungal agents, coloring agents, fragrances and the like can be added.
  • components such as blood flow promoters, bactericides, anti-inflammatory agents, cell activators, vitamins, amino acids, moisturizers, and keratolytic agents can be added as necessary.
  • the ratio of the active ingredient to the carrier at this time can vary between 1 and 90% by weight.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition according to the present invention is preferably used after being purified to at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more. That's right.
  • the dosage form and the required dosage range of the pharmaceutical composition according to the present invention will depend on the subject of administration, the route of administration, the nature of the formulation, the condition of the patient, and the judgment of the physician.
  • a suitable dose is, for example, about 0.1 to 500 8 , preferably about 0.1 to 100 g, more preferably about 1 to 50 / ⁇ per kg body weight of the patient.
  • the required dosage is expected to vary widely.
  • oral administration is expected to require higher doses than intravenous administration.
  • the active ingredient of the pharmaceutical composition according to the present invention and the gene therapy agent described later may be a prodrug thereof.
  • a pharmaceutical composition or the like of a substance found by the screening method of the present invention can be prepared according to the above description.
  • prodrug means “active drug substance” (“drug agent” corresponding to prodrug for the purpose of improving bioavailability, reducing side effects, etc. Means an agent that has been chemically modified to an inactive substance, and is metabolized into an active substance in the body after absorption, thereby producing an action.
  • prodrug has a lower intrinsic activity than the corresponding “drug”, but when administered to a biological system, it is a spontaneous chemical or enzyme-catalyzed or metabolic reaction. As a result, it refers to any compound, peptide, or polynucleotide that produces the “drug” substance.
  • prodrug examples include amino group, hydroxyl group, carboxyl group and the like of the above-mentioned compounds, peptides or polynucleotides exemplified above, which are acylated, alkylated, phosphorylated, borated, carbonated, esterified, amide.
  • Various prodrugs such as sulfonated or urethanized compounds, peptides, and polynucleotides can be exemplified.
  • the exemplified groups are merely typical rather than comprehensive, and those skilled in the art will recognize other known various prodrugs by the known methods, the compounds, the peptides or the polynucleotides exemplified above. Can be prepared.
  • a therapeutic agent for a gene related to a nerve-related disease caused by inactivation of an ADAM11 gene which comprises a gene transfer vector obtained by operably linking ADAM11 genes.
  • a gene transfer vector comprising an ADAM11 gene operably linked for the manufacture of a therapeutic agent for a gene related to a nerve-related disease caused by inactivation of the ADAM11 gene. Is done.
  • a method for treating a nerve-related disease caused by ADAM11 gene inactivity wherein the ADAM11 gene or the ADAM11 gene is operably linked to a patient in need of treatment.
  • a therapeutic method comprising administering a gene transfer vector.
  • the introduction vector can be directly administered to a patient using a gene introduction vector known in the art such as a retrovirus vector.
  • the ADAM11 gene or gene transfer vector operably linked to the ADAM11 gene used for gene therapy according to the present invention is formulated by blending a pharmaceutically acceptable carrier in the same manner as the pharmaceutical composition according to the present invention. For example, it can be administered parenterally. Variations in dosage levels can be adjusted using standard empirical optimization procedures, as is well understood in the art.
  • an ADAM11 gene or a gene transfer vector operably linked to an ADAM11 gene can be administered by a catheter or a gene gun according to a conventional method.
  • the ADAM11 gene can be introduced into the target cell using a method known in the art such as the calcium phosphate method, the electopore position method, or the virus transduction method. .
  • Target cells can be collected at the ischemic site of the cranial nervous system.
  • an ADAM11 gene or a gene transfer vector operably linked to the ADAM11 gene is introduced into the cell, After expressing the peptide, the cell can be transplanted into a patient to treat a nerve-related disease caused by inactivation of the ADAM11 gene.
  • Gene transfer vectors that can be used for gene therapy are well known in the art and can be appropriately selected depending on the gene transfer method and host. Examples of such vectors include adenovirus vectors and retrovirus vectors.
  • a control sequence such as a promoter or terminator, a signal sequence, a polypeptide stability sequence, etc. may be appropriately linked so that it can be expressed in the host. it can.
  • Miller, A.D “Blood, 76, 271-278, 1990, Vile, R.G., Gene Therapy, Churchill Livingstone, 12-30, 1995, Emi, N., et al, J.
  • a nerve-related disease obtained by introducing an ADAM11 gene into a cell collected from a living body using a gene transfer vector in which the ADAM11 gene or ADAM11 gene is operably linked.
  • Cells used for gene therapy can be provided.
  • the amino acid sequence of the mouse AD AMI 1 gene is reported in Gene, 236: 79-86. (1999), and the cDNA sequence is registered in GenBank as Accession Number AB009676.
  • the homologous sequences used for targeting were obtained by amplifying mouse genomic sequences of Exon 5 and about 3.8 kbp upstream and Exon 7 and 6.3 kbp downstream by PCR. Specifically, primers (SEQ ID NO: 5; SGN055N and SEQ ID NO: No. 6; SGN043S) was designed and PCR was carried out using the C57BLZ6 mouse genomic DNA in a saddle shape to amplify an approximately 5 kbp DNA fragment, and then an approximately 3.8 kbps fragment (SEQ ID NO.
  • PCR was performed using the primers (SEQ ID NO: 8; SGN034S and SEQ ID NO: 9; SGN037S) using the genomic DNA of C57BLZ6 mice as a cage, and a DNA fragment of approximately 6.3 kbp (SEQ ID NO: 10) was used.
  • the targeting vector was constructed by the following method. First, the 5'-arm (fragment of SEQ ID NO: 7), neomycin resistance gene (PGK-neo), and 3, -arm (fragment of SEQ ID NO: 10) were sequentially ligated according to a conventional method, and then this was selected as a negative selection gene. was introduced into a pUC 18 vector containing the herpes simplex virus thymidine kinase gene, and a targeting vector (pKO—MDC9) was prepared (FIG. 1).
  • the targeting vector pKO-MDC9 was cleaved with to obtain linear DNA (lmgZ ml).
  • Mouse embryonic stem cells (ES cells) were TT2 (Gibco BRL, Tokyo) (Yagi T. et.al, Analytical Biochem. 214, 70, 1993), and linear targeting vector (200 g Zml) was used as ES cells (lxl0 7 cellsZml) was transferred to the cells with electoral position (250V, 975 ⁇ F, room temperature), and after 2 days of culture, medium containing G418 (250 ⁇ g / ml) and Ganshiku mouth building (0.2 ⁇ ) And then cultured for 3 days in a medium containing G418.
  • PCR was carried out using the sequence (SEQ ID NO: 12; AGN1) as a primer, and a clone that produced a PCR product of about 6.5 kb was subjected to homologous recombination to make it a possible candidate.
  • ES cells homologously recombined into the resulting 8-cell embryos, under an inverted microscope (Diaphoto TM D: Nihon Kogyo, Tokyo), a micromanipulator (a joystick suspended on a coarse-motion electric manipulator, 3D hydraulic micro Microinjection was performed using a manipulator (Narishige, Tokyo), a microphone mouth injector (Narishige, Tokyo), an injection pipette and a holding pipette.
  • the injection dish used was a droplet of 5 ⁇ l of Falcon 3002 (Becton Dickinson Labware) and a suspension of ES cells suspended in liquid paraffin.
  • mice male ligament ICR: Charles River Japan, Kanagawa
  • normal female mice ICR: Charles River Japan, Kanagawa
  • mice mice that were crossed to create pseudopregnant mice, and three different Manipulated eggs microinjected with recombinant ES cell clones were transplanted.
  • Pseudopregnant mice are anesthetized with 50 mg Zkg body weight pentobarbital sodium (Nembutal: Abbott Laboratories), incisions are made on both tendons to expose the ovaries and fallopian tubes, and the ovarian sac is tweezers under a real microscope. An incision was made to expose the fallopian tube, and then 7 to 8 manipulated eggs per oviduct were fed into the fallopian tube. Thereafter, the oviduct and ovary were returned to the abdominal cavity and both incisions were sutured.
  • a 100% chimeric mouse having a wild hair color was born from a mouse transplanted with a manipulated egg and pregnant.
  • the offspring were confirmed by mating with ICR female mice, and the body color of all offspring was wild.
  • the germ cells of the chimeric mouse were confirmed to be derived from ES cells.
  • Heterogeneous mice were obtained by crossing the chimeric mice with C57BL / 6.
  • the ADAM11 gene knockout mouse was obtained by crossing.
  • Genome 20 / ⁇ 8 extracted from the liver of each mouse was cleaved with ⁇ mHI, separated by 7.5% agarose electrophoresis, transferred to a nylon membrane, and hybridized with an isotope-labeled BE2K probe. After the membrane was washed, the image of the hybridized labeled probe was analyzed using a BAS 5000 bioimage analyzer (FUJIFILM).
  • mice with individual numbers 5 and 6 were AD AMI 1 gene knockout mice having homologous disruption alleles (FIG. 3).
  • the cerebellum of the 6 mice used in the analysis in 1.2.1 was also removed, and 1 ml of TN (+) solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP—40, 1 X Comlete ( The cerebellar lysate was prepared by soaking in TM)) and crushing with a Polytron 'homogenizer. To cerebellar lysate, 100 / zl of Concanavalin A-Sepharose (Amersham) was added and incubated at room temperature for 60 minutes.
  • TN (+) solution 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP—40, 1 X Comlete ( The cerebellar lysate was prepared by soaking in TM)) and crushing with a Polytron 'homogenizer.
  • 100 / zl of Concanavalin A-Sepharose was added and incubated at room temperature for 60 minutes.
  • the PVDF membrane was washed 3 times, then treated with anti-mouse IgG-HRP conjugate (Amersham) for 1 hour at room temperature. After washing 3 times, ECL-Plus reagent (Amersham) was used to detect ADAM11 protein. Detected. In addition, mouse ADAM11 protein tagged with HA tag Forced expression of HeLa cell lysate was used for analysis as a positive control [P]
  • mice About 24-week-old male mice (wild-type mice, hetero mice, and homo mice 8, 8, 8 each)
  • Body weight, total brain weight, cerebral weight, and cerebellar weight were measured, and each weight was strong without significant difference in each group (Table 1). In other words, it was confirmed that there was no change in the outer shape in each group.
  • Spontaneous momentum was measured using Versamax analysis software (Accuscan).
  • 24-week-old male mice (8, 8, and 8 wild-type mice, heterozygous mice, and homozygous mice) are placed in the Versamax cage, the number of horizontal behaviors, normal behaviors, and rises for 90 minutes immediately after that Since the total number of times is analyzed and displayed by the analysis software, this total number (count number) was used as an index of the amount of spontaneous exercise.
  • the grip strength (traction force) test was performed using a traction device (FU-1, Muromachi Kikai Co., Ltd.). Hold a stainless steel rod (2 mm in diameter) that is towed by the front limb of a 24-week-old male mouse (wild-type mouse, heterozygous mouse, homozygous mouse 12, 10, 12 mice) at the lump of the tail. And the tail I was pulled and the forearm I force generated until the forelimbs were released was measured.
  • a traction device FU-1, Muromachi Kikai Co., Ltd.
  • Skeletal abnormalities were measured by a gait test.
  • 24 weeks old male mice wild type mice, hetero mice, homo mice 12, 12, and 12 each
  • the left and right hind limb widths left and right widths
  • the stride lengths of both hind limbs front and back widths
  • the coordination movement disorder was measured by a rotating rod test.
  • 24-week-old male mice wild-type mouse, heteromouse, and homomouse 11, 14, and 12 each
  • the drum was set to 0 ( Rotating for 120 seconds at 5, 10 and 15 rpm, and measuring the time until the mouse falls as the dwell time, and this time was used as an index of impaired coordination.
  • Rotarod KN-75, Natsume Seisakusho Co., Ltd.
  • the homo mouse group was able to stay on the drum like the other mouse groups at rest (Fig. 11).
  • the wild type mouse group As a result, the coordinating movement disorder was significantly shorter compared to the time of stay (Figs. 12-14).
  • the heterozygous mouse group was stronger than the wild-type mouse group, even when the rotor was rotated at rest, 5, 10, and 15 rpm, but there was no significant difference in coordination impairment.
  • mice did not climb to the platform after 60 seconds, the mouse was left on the platform for 15 seconds at the end of the test, and the latency was recorded as 60 seconds.
  • Each mouse was trained once a day (4 trials per session) for 3 consecutive days, and the escape latency was measured.
  • mice 24% -old male mice (wild-type, heterozygous, and homozygous mice 8, 8, and 8 each) were administered 3% formalin 20 1 in their hind limbs, and 60 minutes after administration, The duration of the licking (including biting) reaction of hind limbs, which is the appearance of bruising, was measured and used as an index of pain dysfunction. Measurements were taken 12 times at 5 minute intervals.
  • Figure 20 shows the reticking time every 5 minutes. The appearance of Ricking is divided into two phases at 15 minutes after administration. Therefore, the first phase appears as the first phase (0-5 minutes), and the second phase appears as the second phase (15-60 minutes).
  • the homomouse group showed a pain disorder with significantly shorter reticking time than the wild-type mouse group even in the first and second phases! / ( Figure 21).
  • -Male rats wild-type mice, heterozygous mice, homozygous mice 12, 12, and 12 mice
  • acetic acid 0.6% acetic acid
  • the number of painful symptoms such as stretching the body or hind limbs, twisting the body, etc. was measured for a minute and used as an indicator of pain dysfunction.
  • the homozygous mouse group showed pain dysfunction with a significantly smaller number of agonizing symptoms compared to the wild-type mouse group (Fig. 22).

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Abstract

　本発明は、ＡＤＡＭ１１遺伝子が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物の提供を目的とする。本発明によれば、ＡＤＡＭ１１遺伝子の対立遺伝子の一方または双方が破壊されてなる、非ヒト遺伝子破壊動物が提供される。

Description

AD AMI 1遺伝子が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物
発明の分野
[0001] 本発明は、 ADAM11遺伝子を破壊することにより作製した非ヒト遺伝子破壊動物 およびその用途に関する。
背景技術
[0002] ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease)は、デイスインテグリン様ドメインとメタ 口プロテアーゼ様ドメインの 2つの特徴的なドメイン構造を有する 1回膜貫通型タンパ ク質の総称である。 1992年に Blobelらが ADAM1 (Fertilin a )および ADAM2 (Fert ilin jS )のクローユングに成功して以来（Blobel CP, Wolfsberg TG et al. (1992). Natur e. 356:248-252)、続々とパラローグがクロー-ングされた結果、現在 ADAM遺伝子 は約 30種力もなる巨大なファミリーを形成することが明ら力となっている。
[0003] デイスインテグリンは、ハブゃガラガラへビなどの溶血性蛇毒中に含まれる血液凝 固阻止能を有するペプチドで、血小板上のインテグリン a lib β 3とフイブリノ一ゲンの 結合を阻害することが知られている。 ADAMファミリーのデイスインテグリン様ドメイン のアミノ酸配列は蛇毒ディスインテグリンと高い相同性を有しており、実際に、数種の ADAMタンパク質についてはインテグリンと結合することが報告されている（Judith M White. (2003) .Cell Biology 15:598—606)。
[0004] もう一つの特徴的なドメインであるメタ口プロテアーゼ様ドメインは、蛇毒メタ口プロテ ァーゼやマトリックスメタ口プロテア一ゼと高 、アミノ酸相同性を有して ヽることから、プ 口テアーゼとして機能することが予想され、実際に、幾つかの ADAMタンパク質につ いてプロテアーゼ活性を有することが示されている（D.F.Seals and S.A.Courtneidge ( 2003) .Genes & Development 17:7-30)。しかしながら AD AM遺伝子の約半数は、メ タロプロテアーゼ活性に必須と考えられて ヽる亜鉛結合モチーフ（HEXXHXXGXX H)を保持しておらず、これらはプロテアーゼとしての活性を有さな 、と考えられて!/ヽ る。
[0005] これらの特徴的なドメイン構造を踏まえると、 ADAMタンパク質の機能は、特定のィ ンテグリンを認識する機能、そして基質タンパクを特異的にプロセシングする機能、と いう 2つの機能が考えられ、あるものは両方の機能、またあるものはいずれかの機能 の一方のみを有すると考えられる。また、 ADAMタンパク質は、前駆体として生産さ れた後に、 Proドメイン（proprotein domain)が切断されると細胞表面に発現されること が報告されている。
[0006] ADAMファミリーの、 ADAM11遺伝子は、これまでに遺伝子の全長配列が確認さ れ、乳ガン抑制遺伝子であることが報告されている（特開平 7— 330799号公報)。多 くの ADAMファミリーが生殖系組織に特異的に発現している力、または広範囲な組 織にぉ 、て発現して 、るのに対し、 ADAM11遺伝子は神経系組織に特異的に高 発現していることが認められた（Sagane K., Ohya Y, et al.(1998).Biochem J 334:93-9 8)。し力しながら、 AD AMI 1遺伝子の神経系組織への具体的な機能については報 告がなされていない。
発明の概要
[0007] 本発明者らは、 ADAM11遺伝子をノックアウトしたマウスを作出したところ、そのノ ックアウトマウスが神経関連疾患の形質を示すことを見出した。本発明はこの知見に 基づくものである。
[0008] 本発明によれば、 ADAM11遺伝子の対立遺伝子の双方または一方が破壊されて なる、非ヒト遺伝子破壊動物およびその子孫（以下、「本発明による非ヒト遺伝子破壊 動物」という）が提供される。
[0009] 本発明による非ヒト遺伝子破壊動物のうち対立遺伝子の双方が破壊された遺伝子 破壊動物 (第一の態様）は、 ADAM11遺伝子が不活性化され、神経関連疾患の形 質を示す。
[0010] 従って、本発明による第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物は、 ADAM11遺伝子 が関与する疾患のメカニズムの解明や神経関連疾患の治療に有用な物質の探索お よび開発に有用である。
[0011] また、本発明による非ヒト遺伝子破壊動物のうち対立遺伝子の一方が破壊された遺 伝子破壊動物 (第二の態様）は、これらを交配させることにより ADAM11遺伝子の対 立遺伝子の双方が破壊された遺伝子破壊動物 (第一の態様)を得ることができる。従 つて、本発明による第二の態様の非ヒト遺伝子破壊動物は、第一の態様の遺伝子破 壊動物を作出するための親動物として有用である。
具体的には、本発明は以下のとおりである。
(1) ADAMl l遺伝子の対立遺伝子の双方が破壊されてなる、非ヒト遺伝子破壊動 物またはその子孫。
(2) ADAM11遺伝子の対立遺伝子の双方の全部または一部の外来配列による置 換により、 ADAM11遺伝子の対立遺伝子の双方が破壊されている、前記（1)に記 載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫。
(3)神経関連疾患を発症する表現型を有する、前記（1)または（2)に記載の非ヒト遺 伝子破壊動物またはその子孫。
(4)神経関連疾患が、協調運動障害、記憶障害、認知障害、学習障害、または痛覚 障害である、前記（3)に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫。
(5) ADAM11遺伝子の対立遺伝子の一方が破壊されてなる、非ヒト遺伝子破壊動 物またはその子孫。
(6) ADAM11遺伝子の対立遺伝子の一方の全部または一部の外来配列による置 換により、 ADAM11遺伝子の対立遺伝子の一方が破壊されている、前記（5)に記 載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫。
(7)非ヒト動物が齧歯類動物である、前記（1)〜（6)の 、ずれか一項に記載の非ヒト 遺伝子破壊動物またはその子孫。
(8)齧歯類動物がマウスである、前記（7)に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその 子孫。
(9)前記（1)〜（8)の ヽずれか一項に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫 カゝら得られる組織。
(10)前記（1)〜（8)の 、ずれか一項に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子 孫から得られる動物細胞。
(11)前記（1)〜（8)の 、ずれか一項に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子 孫から得られる繁殖材料。
(12)前記（5)〜（8)の!、ずれか一項に記載の AD AMI 1遺伝子の対立遺伝子の一 方が破壊されてなる非ヒト遺伝子破壊動物の製造方法であって、
(a)非ヒト動物胚性幹細胞 (ES細胞）を、破壊された ADAM11遺伝子を含んでなる ポリヌクレオチドにより形質転換する工程；
(b)前記ポリヌクレオチドがそのゲノムに取り込まれた ES細胞を選択する工程；
(c)選択された ES細胞を非ヒト動物胚性細胞に導入する工程；
(d) ES細胞が導入された非ヒト動物胚性細胞を、野生型偽妊娠非ヒト雌性動物の生 殖器に移植して、キメラ動物を繁殖させる工程;および
(e)得られたキメラ動物と野生型非ヒト動物とを交配させ、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の一方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程
を含んでなる、製造方法。
(13)前記（1)〜（4)、（7)、および（8)のいずれか一項に記載の AD AMI 1遺伝子 の対立遺伝子の双方が破壊されてなる非ヒト遺伝子破壊動物の製造方法であって、
(a)非ヒト動物胚性幹細胞 (ES細胞）を、破壊された ADAM11遺伝子を含んでなる ポリヌクレオチドにより形質転換する工程；
(b)前記ポリヌクレオチドがそのゲノムに取り込まれた ES細胞を選択する工程；
(c)選択された ES細胞を非ヒト動物胚性細胞に導入する工程；
(d) ES細胞が導入された非ヒト動物胚性細胞を、野生型偽妊娠非ヒト雌性動物の生 殖器に移植して、キメラ動物を繁殖させる工程；
(e)得られたキメラ動物と野生型非ヒト動物とを交配させ、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の一方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程;および
(f)得られた非ヒト遺伝子破壊動物の雄と雌を交配し、 ADAM11遺伝子の対立遺伝 子の双方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程
を含んでなる、製造方法。
(14)神経関連疾患の治療に用いられる物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和 物のスクリーニング方法であって、
(i)前記（1)〜（4)、（7)、および（8)のいずれか一項に記載の ADAM11遺伝子の 対立遺伝子の双方が破壊されてなる非ヒト遺伝子破壊動物の神経関連疾患の症状 の程度を測定する工程； (ii)被検物質を前記非ヒト遺伝子破壊動物に投与する工程;および
(iii)被検物質投与後の前記非ヒト遺伝子破壊動物の神経関連疾患の症状の程度を 測定する工程
を含んでなる方法。
(15)工程 (iii)の後に、（iv)被検物質投与前の神経関連疾患の症状の程度と、被検 物質投与後の神経関連疾患の症状の程度とを比較する工程を更に含んでなる、前 記（14)に記載のスクリーニング方法。
(16)神経関連疾患が、協調運動障害、記憶障害、認知障害、学習障害、または痛 覚障害である、前記（14)または（15)に記載のスクリーニング方法。
(17) ADAMl lタンパク質を含んでなる、 ADAMl l遺伝子の不活性化に起因する 神経関連疾患の治療に用いられる医薬組成物。
(18) ADAM 11遺伝子の不活性化に起因する神経関連疾患の治療に用いられる 医薬の製造のための、 ADAM 11タンパク質の使用。
(19)治療上の有効量の ADAMl lタンパク質を哺乳類に投与する工程を含んでな る、 ADAM11遺伝子の不活性ィ匕に起因する神経関連疾患の治療方法。
(20) ADAMl l遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターを含有して なる、 ADAM11遺伝子の不活性化に起因する神経関連疾患遺伝子治療剤。
(21) ADAM 11遺伝子の不活性化に起因する神経関連疾患遺伝子治療剤の製造 のための、 ADAM11遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入べクタ一の使用
(22) ADAM11遺伝子または AD AMI 1遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子 導入ベクターを哺乳類に投与する工程を含んでなる、 ADAM 11遺伝子の不活性化 に起因する神経関連疾患の治療方法。
図面の簡単な説明
[図 1]ターゲテイングベクターの構造を示した図である。
[図 2]相同組換えが生じているクローンを選択するために行ったサザンプロット解析を 示した図である。
[図 3]AD AMI 1遺伝子を破壊したマウスのゲノム DNAを用いたサザンブロット解析 を示した図である。
[図 4]AD AMI 1遺伝子を破壊したマウスの小脳を用いたウェスタンブロット解析を示 した図である。
圆 5]マウス各群の自発運動量 (カウント数)を示した図である。
圆 6]マウス各群の牽引力 (握力）を示した図である。
[図 7]懸垂試験におけるマウス各群がステンレス棒から落下するまでの時間を示した 図である。
[図 8]懸垂試験におけるマウス各群のスコアを示した図である。
[図 9]歩行試験におけるマウス各群の左右の後肢幅 (左右幅）を示した図である。 圆 10]歩行試験におけるマウス各群の両後肢それぞれの歩幅 (前後幅)を示した図 である。
圆 11]回転棒試験 (静止状態）におけるマウス各群の滞在時間を示した図である。
[図 12]回転棒試験（5rpmで回転）におけるマウス各群の滞在時間を示した図である 。図中において *はホモマウス群が野生型マウス群と有意差 (ANOVA法、 p< 0. 05 )があることを意味する。
[図 13]回転棒試験（lOrpmで回転）におけるマウス各群の滞在時間を示した図であ る。図中において *はホモマウス群が野生型マウス群と有意差 (ANOVA法、 p< 0. 0 5)があることを意味する。
[図 14]回転棒試験（15rpmで回転）におけるマウス各群の滞在時間を示した図であ る。図中において *はホモマウス群が野生型マウス群と有意差 (ANOVA法、 p< 0. 0 5)があることを意味する。
[図 15]水迷路試験の訓練セッションに用いた円形プールを示した図である。円形プ ールは 4等分され、 TQ部分にはプラットフォームが固定されて 、る。
[図 16]水迷路試験の訓練セッションにおけるマウス各群の逃避潜時時間の推移を示 した図である。図中にお 、て *はホモマウス群が野生型マウス群と有意差（Dunnett 法、 pく 0. 05)があることを意味する。
[図 17]水迷路試験のプローブトライアルにおけるマウス各群の泳路を示した図である [図 18]水迷路試験のプローブトライアルにおけるマウス各群の 4等分した各部分への 滞留時間を示した図である。図中において *は、 TQへの滞留時間についてホモマ ウス群が野生型マウス群と有意差 (Dunnett法、 pく 0. 05)があることを意味する。
[図 19]プラットフォームに目印を付けた試験におけるマウス各群の逃避潜時時間の推 移を示した図である。
[図 20]ホルマリン試験におけるマウス各群の 5分ごとのリツキング (バイティングを含む )時間を示した図である。
[図 21]ホルマリン試験の第一相および第二相における、マウス各群のリツキング (バイ ティングを含む）時間を示した図である。図中にお 、て *はホモマウス群が野生型マ ウス群と有意差 (Dunnett法、 p< 0. 05)があることを意味する。
[図 22]酢酸ライジング法におけるマウス各群の苦悶症状の回数を示した図である。図 中において *はホモマウス群が野生型マウス群と有意差（Dunnett法、 p< 0. 05)が あることを意味する。
発明の具体的な説明
[0014] ADAM 11遣伝子
ADAM11遺伝子は、常染色体ゲノム中に存在し、転写されて AD AMI 1タンパク 質をコードする mRNAを産生するものであればいかなる遺伝子でもよぐ例えば、 A DAM11タンパク質をコードするゲノム遺伝子、 ADAM11タンパク質をコードする c DNA等をいう。
本発明による遺伝子破壊動物にぉ 、て破壊される ADAM11遺伝子はヒトおよび マウスにぉ 、て公知である。それぞれの DNA配列が開示されて 、る文献およびデ ータベースのァクセッション番号は下記の通りである。
ヒト：特開平 7— 330799号公報、 GenBank: AB009675 (配列番号 1)
マウス： Sagane K. et al., Gene 1999 Aug 5;236(1):79— 86、 GenBank: AB009676 (配列 番号 3)
[0015] ラット、ィヌ、チンパンジーについては、ゲノム配列力もコンピュータ解析により推測 された配列が以下のとおりデータベースに登録されており、これらを利用することもで きる。 ラット： Genbank#XM_340916
ィヌ： Genbank#XM— 537616
チンパンジー： Genbank#XM_511556
ォナガドリ： Genbank#XM_425842
[0016] 上記以外の動物についても、当業者であれば、公知の ADAM11遺伝子の全長配 列に基づ 、て、その動物に内在する ADAM 11遺伝子の配列を特定することができ る。すなわち、ヒトあるいはマウスの ADAM11遺伝子に基づいて相同性検索を行い 、その動物の ADAM11遺伝子を検索し、特定することができる。相同性検索に当た つては後述する BLAST等を利用することができる。
[0017] ADAM11遺伝子の例として、配列番号 2のアミノ酸配列からなるヒト AD AMI 1タ ンパク質をコードする遺伝子および配列番号 4のアミノ酸配列力 なるマウス ADAM 11タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
[0018] 本発明による遺伝子破壊動物において破壊される AD AMI 1遺伝子には、 ADA Mi lタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで「 機能的に同等」とは、脳神経系の正常な機能 (例えば、協調運動、記憶、認知、学習 、または体性感覚 (痛覚)）を実質的に同程度維持することを意味する。「機能的に同 等」かどうかは、その遺伝子のホモ接合体型破壊を含んでなる非ヒト遺伝子破壊動物 と非ヒト正常動物を比較し、脳神経系の正常な機能 (例えば、協調運動、記憶、認知 、学習、または体性感覚 (痛覚)）が実質的に同程度維持されているかを評価すること により決定することができる。すなわち、その遺伝子のホモ接合体型破壊を含んでな る非ヒト遺伝子破壊動物の脳神経系の正常な機能が低下するか、あるいは失われた 場合には、その遺伝子は ADAM11遺伝子と機能的に同等であると決定できる。決 定に当たっては、回転棒試験、水迷路試験、ホルマリン試験、酢酸ライジング法試験 などを用いることができる。
[0019] また、 ADAM11タンパク質と機能的に同等のものとしては、アミノ酸配列（例えば、 配列番号 2のアミノ酸配列および配列番号 4のアミノ酸配列）をコードする遺伝子が多 型である場合、当該多型も含まれる。
[0020] ADAM11タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子としては下 記が挙げられる。
• ADAM11タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号 2のアミノ酸配列および配 列番号 4のアミノ酸配列）において、 1または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠 失、あるいはその一方または両末端への付加がなされたアミノ酸配列（改変アミノ酸 配列）をコードする遺伝子；
• ADAM11タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号 2のアミノ酸配列および配 列番号 4のアミノ酸配列）をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でノヽイブリダィズ する遺伝子；および
• ADAM11タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号 2のアミノ酸配列および配 列番号 4のアミノ酸配列）と少なくとも 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコー ドする遺伝子。
[0021] 本願明細書において、「アミノ酸配列において、 1または複数個のアミノ酸の挿入、 置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付加がなされた」とは、部位特 異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の 複数個の数のアミノ酸の置換等によりなされたことを意味する。
[0022] ADAM11タンパク質の改変アミノ酸配列は、例えば、 1〜30個、好ましくは 1〜20 個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個、特に好ましくは 1〜2個のアミ ノ酸の挿入、置換または欠失、あるいはその一方または両末端への付加がなされた ものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列力 ADA Mi lタンパク質のアミノ酸配列において 1または複数個（好ましくは 1または数個、よ り好ましくは、 1、 2、または 3個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができ る。
[0023] ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、 1または 複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味 する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性 残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。こ のような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分 野において公知である。具体例を挙げると、非極性 (疎水性)アミノ酸としては、ァラ- ン、ノ リン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フエ二ルァラニン、メチォ ニンなどが挙げられる。極性（中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チ 口シン、グルタミン、ァスパラギン、システィンなどが挙げられる。陽電荷をもつ (塩基 性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷 をもつ（酸性)アミノ酸としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
[0024] ADAM11タンパク質をコードする遺伝子配列とストリンジヱントな条件下でハイブリ ダイズする相補性を有する遺伝子（cDNA)は、具体的には、 FASTA、 BLAST, S mith - Waterman(Meth. Enzym., 164, 765 (1988》などの相同性検索ソフトウェアに より、デフォルト (初期設定)のパラメーターを用いて計算したときに、その ADAM11 タンパク質をコードする塩基配列と少なくとも 70%以上、好ましくは 80%以上、より好 ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に 好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の相同性を有するポリヌクレオ チドが挙げられる。また、「ストリンジ ントな条件下」とは、当業者が通常使用し得る ハイブリダィゼーシヨン緩衝液中で、温度が 40°C〜70°C、好ましくは 60°C〜65°Cな どで反応を行い、塩濃度が 15〜300mmolZL、好ましくは 15〜60mmolZLなどの 洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプロ ーブの長さに応じて適宜調整することが可能である。さらに、ハイブリダィズしたもの を洗净するときの条件は、 0. 2または 2 X SSC、0. 1%SDS、温度 20°C〜68°Cで行 うことができる。ストリンジェント（high stringency)な条件にするかマイルド（low stringe ncy)な条件にするかは、洗浄時の塩濃度または温度で差を設けることができる。塩濃 度でノ、イブリダィズの差を設ける場合には、ストリンジェント洗浄バッファー (high strin gency wash buffer)として 0. 2 X SSC、0. 1%SDS、マイルド洗浄バッファー（low stri ngency wash buffer)として 2 X SSC、 0. 1%SDSで行うことができる。また、温度でハ イブリダィズの差を設ける場合には、ストリンジェントの場合は 68°C、中等度 (moderat e stringency)の場合は 42°C、マイルドの場合は室温（20°C〜25°C)でいずれの場 合も 0. 2 X SSC、 0. 1%SDSで行えばよい。
[0025] プレノ、イブリダィズを実施する場合には、通常、ハイブリダィズと同じ条件で行う。し かし、ハイブリダィズとプレ（予備)ハイブリダィズ洗浄は同じ条件で行うとは限らない。 [0026] ノ、イブリダィゼーシヨンは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライ ブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる
[0027] 本願明細書において、アミノ酸配列について「同一性」（相同性という場合もある）と は、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度 の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される (Wil bur, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983))。相同性の計算には、市販の ソフトである BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))、 FASTA(Peasron ： Methods in Enzymology 183:63-69 (1990》等を用いることができる。
ADAM11タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも 70%以上の同一性を有するァミノ 酸配列は、好ましくは、 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以 上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 9 9%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
[0028] 「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出 される数値であればよぐ例えば、全米バイオテクノロジー情報センター (NCBI)の相 同'性ァノレゴリスム BLAST (Basic local alignment search tool) http://www.nc bi.nlm.nih.gov/BLAST/にお!/、てデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いること により、算出することができる。
[0029] ADAM 11遣伝子の破璩
本発明における遺伝子破壊動物において、 AD AMI 1遺伝子の破壊は、 ADAM 11遺伝子への外来配列の挿入、 AD AMI 1遺伝子全体またはその一部の外来配 列による置換、または ADAM11遺伝子の全部または一部の欠失によって行うことが できる。外来配列の塩基数並びに置換、欠失、および挿入の位置は、 ADAM11タ ンパク質の発現や活性が実質的に喪失する限り、特に限定されない。遺伝子組換え 体の選別の観点から、外来配列は選択マーカー遺伝子であることが好ましい。選択 マーカー遺伝子は公知のもの力 適宜選択して使用でき、好ましくは薬剤に対する 耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが 挙げられる。 [0030] ADAM11遺伝子の破壊は、好ましくは、 AD AMI 1遺伝子の全部または一部を外 来遺伝子に置換することにより行うことができる。置換される ADAM11遺伝子の一部 としては、例えば、 ADAM11の Proドメインやメタ口プロテアーゼ様ドメインが挙げら れ、具体的には、ェクソン 5からェクソン 7にかけての遺伝子領域ゃェクソン 9からエタ ソン 15にかけての遺伝子領域などを置換することができる。
[0031] ADAM11遺伝子の破壊はまた、 ADAM11遺伝子に欠失、挿入、または置換の ような変異を導入することによつても行うことができる。例えば、フレームシフトやナン センス変異などのタンパク質の機能に致命的な影響 (発現や活性の喪失)を与える 変異を導入することができる。
[0032] 遺伝子破壊の技術は当業者に公知であり、当業者であれば公知の方法に従って 遺伝子の破壊を実施することができる。好ましくは、標的破壊 (targeted disruption)に より ADAM11遺伝子を破壊することができる。
[0033] 標的破壊は、標的となる遺伝子の塩基配列に改変を施した核酸 (好ましくは選択マ 一力一遺伝子、更に好ましくは薬剤に対する耐性遺伝子を挿入した遺伝子)を細胞 に導入し、導入した核酸と標的遺伝子との間で相同組換えを生じさせ、相同組換え が生じた細胞を選択することにより、標的遺伝子に変異を導入する技術を意味する（ Capecchi MR, Science 244:1288-1292, 1989)。なお、標的破壊は、 ADAM11遺伝 子の塩基配列の情報に基づいて該遺伝子を不活性化させる技術の例示であって、 これ以外の技術によって当該遺伝子を不活性化させたものも本発明による非ヒト遺伝 子破壊動物に含まれるものとする。
[0034] 相同組換えに使用する核酸を作成する場合には、標的となる遺伝子の塩基配列へ 変異を導入してもよぐその場合には化学合成、部位特異的突然変異誘発法、また は PCR法などの公知の遺伝子工学的手法を用いて変異を導入できる。さらに、相同 組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法を用いて作製することができる（ 米国特許第 5, 464, 764号公報、同 5, 487, 992号公報、同 5, 627, 059号公報 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.86, 8932—8935, 1989、 Nature, Vol.342, 435—438, 1989など）。
[0035] 遺伝子破壊動物 本発明による遺伝子破壊動物の第一の態様によれば、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の双方が破壊されてなる、非ヒト遺伝子破壊動物およびその子孫が提供され る。第一の態様の遺伝子破壊動物では、 ADAM11遺伝子のホモ接合体型破壊 (ho mozygous disruption)を含んでいるため、 AD AMI 1タンパク質が発現されない。す なわち、第一の態様によれば、 ADAM11遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物が提 供される。
[0036] 第一の態様の遺伝子破壊動物は、神経関連疾患を発症する表現型を有する。従 つて、第一の態様の遺伝子破壊動物を用いて、神経関連疾患の治療に用いられる 物質をスクリーニングすることができる。
[0037] 本発明において「神経関連疾患」とは、協調運動障害、記憶障害 (例えば、空間的
，参照記憶障害)、認知障害、学習障害、および痛覚障害を含む意味で用いられるも のとする。
[0038] 協調運動障害は 例えば、小脳などの中枢神経系の異常や、運動神経などの末梢 神経系や筋力などの損傷、骨格の異常などによってもたらされる障害であって、腕や 脚の位置や体の姿勢などをうまく調節できなくなるため、動作の滑らかさの消失や、 動作の正確度が失われるといった症状が現れる。例えば、非ヒト動物の場合、協調運 動障害が中枢神経系の異常による場合は、例えば、回転棒試験を用いて確認するこ とができる。また、協調運動障害が末梢神経系や筋力の障害、骨格異常などによる 場合は、例えば、握力試験 (牽引力試験)、懸垂試験、歩行試験などを用いて確認 することができる。これらの試験は、 Ogura H, Matsumoto M, Mikoshiba K. (2001) Be hav Brain Res.l22(2):215-219.に記載された方法を参照することができる。
[0039] 記憶障害は、例えば、海馬の損傷によってもたらされる障害であって、約束したこと を忘れたり、日時を間違えたり、場所が分力 なくなり目的地へ着くことができず迷子 になったりするような症状が現れる。例えば、非ヒト動物の場合、例えば、水迷路試験 を用いて確認することができる。
[0040] 痛覚障害は、主に痛みに関する受容器や効果器、その伝達経路の損傷によっても たらされる障害であって、痛みの鈍化といった症状が現れる。例えば、非ヒト動物の場 合、ホルマリン試験や酢酸ライジング法を用いて確認することができる。 [0041] 本発明による遺伝子破壊動物の第二の態様によれば、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の一方が破壊されてなる、非ヒト遺伝子破壊動物およびその子孫が提供され る。第二の態様の遺伝子破壊動物では、 ADAM11遺伝子のヘテロ接合体型破壊（ heterozygous disruption)を含んでいるため、 AD AMI 1タンパク質が依然として発現 されている。しかし、後述するように、第二の態様の遺伝子破壊動物の雌雄を交配す ることにより、 AD AMI 1遺伝子のホモ接合体型破壊（homozygous disruption)を含ん でなる第一の態様の遺伝子破壊動物を得ることができる。すなわち、第二の態様の 遺伝子破壊動物は、第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物を作出するための親動物と して使用することができる。
[0042] 非ヒト動物は特に限定されるものではないが、動物モデルの作出の観点からは、繁 殖が比較的容易で、比較的短期間で個体を取得できる齧歯類動物が好ましぐより 好ましくはマウスおよびラットである。
[0043] 本発明によれば、本発明による遺伝子破壊動物の子孫が提供される。本発明にお Vヽて「子孫」とは、本発明による遺伝子破壊動物が保有する破壊された ADAM11遺 伝子を保有する子孫を意味する。
[0044] 本発明によればまた、本発明による非ヒト遺伝子破壊動物およびその子孫カゝら得ら れる組織が提供される。組織としては、例えば、脳、心臓、胸腺、腎臓、肝臓、脾臓、 筋肉、骨、骨髄、皮膚等すベての臓器、器官等が挙げられる。
[0045] 本発明によればまた、本発明による非ヒト遺伝子破壊動物およびその子孫力も得ら れる非ヒトの動物細胞が提供される。
[0046] 本発明によれば更に、本発明による非ヒト遺伝子破壊動物およびその子孫力も得ら れる繁殖材料が提供される。繁殖材料としては、例えば、精子、未受精卵、受精卵等 が挙げられる。
[0047] 遺伝子破壊動物の作製
本発明によれば、第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物の製造方法であって、
(a)非ヒト動物胚性幹細胞 (ES細胞）を、破壊された ADAM11遺伝子を含んでなる ポリヌクレオチドにより形質転換する工程；
(b)前記ポリヌクレオチドがそのゲノムに取り込まれた ES細胞を選択する工程； (c)選択された ES細胞を非ヒト動物胚性細胞に導入する工程；
(d) ES細胞が導入された非ヒト動物胚性細胞を、野生型偽妊娠非ヒト雌性動物の生 殖器に移植して、キメラ動物を繁殖させる工程；
(e)得られたキメラ動物と野生型非ヒト動物とを交配させ、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の一方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程;および
(f)得られた非ヒト遺伝子破壊動物の雄と雌を交配し、 ADAM11遺伝子の対立遺伝 子の双方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程
を含んでなる、製造方法が提供される。
[0048] 本発明によれば、第二の態様の非ヒト遺伝子破壊動物の製造方法であって、
(a)非ヒト動物胚性幹細胞 (ES細胞）を、破壊された ADAM11遺伝子を含んでなる ポリヌクレオチドにより形質転換する工程；
(b)前記ポリヌクレオチドがそのゲノムに取り込まれた ES細胞を選択する工程；
(c)選択された ES細胞を非ヒト動物胚性細胞に導入する工程；
(d) ES細胞が導入された非ヒト動物胚性細胞を、野生型偽妊娠非ヒト雌性動物の生 殖器に移植して、キメラ動物を繁殖させる工程;および
(e)得られたキメラ動物と野生型非ヒト動物とを交配させ、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の一方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程
を含んでなる、製造方法が提供される。
[0049] 以下に本発明による非ヒト遺伝子破壊マウスの作製について詳細に説明する。最 初に ADAM 11遺伝子の標的破壊法につ!、て、 AD AMI 1遺伝子のクローユング、 用的破壊法に用いるターゲテイングベクターの構築、相同組換えを起こした ES細胞 の取得の順に説明する。マウス以外の遺伝子破壊動物の作製については当該技術 分野において公知であり、例えば、ラットについては Dev. Biol. 163(1):288-292, 1994 を、ゥサギについては Mol. Reprod. Dev. 45 (4) :439-443, 1996を、サルについては Pr oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995を参照できる。
[0050] [工程 (a) : ES細胞の形質転換]
破壊された ADAM11遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドの作製に先立って、 AD AMI 1遺伝子の一部を含む DNAを準備する。 [0051] ADAM11タンパク質をコードする DNAは、配列番号 2に記載のアミノ酸配列を基 にプライマーを設定し、非ヒト動物のゲノム DNAあるいは cDNAから PCR法により、 あるいは非ヒト動物の RNA力も RT— PCR法により得ることができる。また別法として は、前述の引用文献に記載の塩基配列を基にプローブを合成して、非ヒト動物のゲ ノム DNAライブラリーあるいは cDNAライブラリーから、当該プローブとハイブリダィズ するクローンを選び出し、塩基配列を決定して、 ADAM11遺伝子あるいはその一部 、好ましくは 5kbp以上、更に好ましくは lOkbp以上の塩基配列を含むクローンを選 択しても良 ヽ。クローユングされた DNAに含まれる制限酵素切断部位を確認して制 限酵素地図を作製する。相同組換えするのに十分な長さの DNA、好ましくは 5kbp 以上、更に好ましくは lOkbp以上のクローンが得られな力つた場合は、複数のクロー ンより適切な制限酵素部位で DNAを切り出して繋ぎ合わせることも許される。
[0052] 得られた相同組換えに十分な長さの DNA中のエタソン領域の制限酵素部位に、 薬剤耐性遺伝子などのポジティブ選択マーカー、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝 子またはピューロマイシン耐性遺伝子を導入する。また、ェクソンの一部を取り除いて 、代わりに薬剤耐性遺伝子に置き換えてもよい。
[0053] 適当な制限酵素部位が無い場合には PCR法を実施し、制限酵素部位を含むオリ ゴヌクレオチドのライゲーシヨン等により、適当な制限酵素部位を導入してもよい。好 ましくは、導入された DNAと ADAM11遺伝子の間に相同組換えが起こらず、導入 された DNAが AD AMI 1遺伝子以外の部位に挿入されてしまった胚性幹細胞 (ES 細胞）を除去するために、ベクター内にはネガティブ選択マーカー、例えば、チミジン キナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子などを含むのが望ましい。これらの DNAの 塩基配列を操作する組換え DNA技術は、例えば、 Sambruck, J., Fritsch, E. F.， and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L aboratory, Cold Spring Harbor, NYに記載された方法によって行うことができるが、 適当な糸且換え DNAを得ることができれば、これらの方法に限られるものではない。な お、ターゲテイングベクターの作製に用いられるベクターは、特に限定されず、形質 転換を行う細胞 (例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、 市販の pBluscript (Stratagene社製）、 pZErOl. 1 (Invitrogen社）、 pGEM— 1 ( promega社)等が使用可能である。
[0054] [工程 (b) :形質転換された ES細胞の選択]
作製したターゲテイングベクターを、制限酵素で切断して直鎖状 DNAとし、例えば 、フエノール'クロロフオルム抽出、ァガロース電気泳動、超遠心分離等により精製し て、 ES細胞、例えば、 TT2へトランスフエクシヨンする。トランスフエクシヨンの方法とし ては、エレクト口ポレーシヨン、リポフエクチンなどが挙げられる力 本発明はこれに限 られるものではない。トランスフエクシヨンした ES細胞は適当な選択培地中、例えば、 ネオマイシン耐性遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝子を組み込んだターゲティングベタ ターを構築した場合には、培地中にネオマイシンとガンシクロビルを含む選択培地中 で培養する。両薬剤に対し薬剤耐性を呈して増殖してきた ES細胞に、導入遺伝子、 例えば、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたことは、 PCR法等で容易に同定す ることができる。更にターゲテイングベクターの外側の 5'上流もしくは 3'下流の DNA の一部をプローブとしてサザンプロット解析する事により、相同組み換えを起こしたか どうかを確認する事もできる。また、ターゲテイングベクターがランダムに挿入されてい ないことを確かめるために、ターゲティングベクター内の DNAをプローブとしてサザ ンブロット解析する事により確認できる。これらの方法を組み合わせることにより、相同 組み換えを起こした ES細胞を取得することができる。
[0055] [工程 (c)： ES細胞の胚または胚盤胞への導入]
ADAM11遺伝子ノックアウトマウスは、受精後 8細胞期胚あるいは胚盤胞の採取、 相同組み換えを起こした ES細胞のマイクロインジェクション、偽妊娠マウスへの操作 卵の移植、偽妊娠マウスの出産と産仔の育成、 PCR法およびサザンプロット法による 遺伝子導入マウスの選抜、導入遺伝子をもつマウスの系統榭立、のステップを経て 作製することができる（Yagi, T. et. al.， Analytical Biochem. 214, 70, 1993)。
[0056] ES細胞の胚または胚盤胞への導入は次のよう〖こして実施できる。
[0057] まず、 8細胞期胚あるいは胚盤胞の採取受精卵は、雌マウスに過剰排卵を誘発さ せるため、妊馬血清性生殖腺刺激ホルモン 5国際単位とヒト絨毛性生殖腺刺激ホル モン 2. 5国際単位をそれぞれ腹腔内投与して、受精後 2. 5日目の雌マウスより卵管 一子宫還流法により 8細胞期胚を得る。なお胚盤胞を用いる場合は受精後 3. 5日目 、雌マウスの子宫を取り出し、子宫還流により胚を得る。
[0058] 次 、で、得られた 8細胞期胚または胚盤胞に、相同組換えを起こした ES細胞をマ イク口インジェクションする。マイクロインジェクションは、例えば、 Hogan, B.L.M., Alab oratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yo rk, 1986や、 Yagi T. et. al, Analytical Biochem. 214, 70, 1993の記載に基づき、倒 立顕微鏡下で、マイクロマニピュレータ、マイクロインジェクター、インジェクションピぺ ットおよびホールディングピペットを用いて行うことができる。また、インジェクション用 ディッシュには、例えば、 Falcon 3002 (Becton Dickinson Labware)に培地 5 μ 1の 液滴および ES細胞を浮遊させた液滴を作り、流動パラフィンを重層したものを用いる 。以下相同組換えを起こした ES細胞のマイクロインジェクションした 8細胞期胚ある ヽ は胚盤胞を操作卵と称す。
[0059] [工程 (d)および (e)：偽妊娠マウスへの操作卵の移植とヘテロ接合型マウスの系統 樹立]
精管結紮雄マウスと正常雌マウスを交配させて偽妊娠マウスを作成し、操作卵を移 植する。操作卵の移植は、例えば、 Hogan, B.L.M., A laboratory Manual, Cold Sprin g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 198bや、 Yagi T. et. al., Analytical Biochem. 214, 70, 1993の記載に基づいて行うことができる。以下に具体 的操作の例を記すが、本発明はこれに限られるものではない。
[0060] 偽妊娠マウスを、例えば、 50mgZkg体重のペントバルビタールナトリウムにて全身 麻酔を行い、両けん部を約 lcm切開して卵巣および卵管を露出し、実体顕微鏡下で 卵巣嚢をピンセットで切開し卵管采を露出させる。次に卵管あたり 7〜8個の操作卵 を卵管采に送り込む。この時、操作卵とともに入れた微小気泡によって、卵管内に移 植されたことを確認する。このあと卵管および卵巣を腹腔に戻し両切開部を縫合し、 マウスを麻酔から覚醒させる。場合によっては、操作卵を翌日まで培養し、胚盤胞に 発生させて力 子宮に移植しても良い。
[0061] 多くの場合、移植後 17日目には仔マウスが得られる。仔マウスは通常、相同組換え 起こした ES細胞と、受精卵を採取したマウス細胞のキメラとなる。例えば、 ES細胞と して TT2を用い、 ICRマウスより採取した 8細胞期胚に注入した場合、キメラ率の高い 仔マウスは体毛色が野ネズミ色優位となり、キメラ率の低いマウスは体毛色が白色優 位となる。
[0062] 導入遺伝子が生殖細胞に入っているかどうかは、体毛色が白色のマウス (たとえば I CR)と交配し、得られた仔マウスの体毛色により容易に確認することができる。あるい はキメラ率の高 、マウスは生殖細胞も導入遺伝子を含んで 、ることが期待されること から、できるだけキメラ率の高 、マウスを選択することが好ま 、。
[0063] 得られたキメラマウスを野生型マウス (正常マウス）と交配することにより、ヘテロ接合 型マウス（以下「ヘテロマウス」 t 、うことがある）を得ることができる。得られた仔マウス の尾より DNAを抽出して PCR法をすることにより、導入遺伝子の有無を確認できる。 また、 PCR法の代わりにサザンプロット解析により、より確実な遺伝子型を同定できる
[0064] [工程 (f) :ホモ接合型マウスの系統榭立]
ヘテロ接合型マウス同士を交配することによって、得られた仔マウスの中に導入遺 伝子がホモに存在する AD AMI 1遺伝子ノックアウトマウス（以下「ホモマウス」 t 、う ことがある）を得ることができる。 ADAM11遺伝子ノックアウトマウスは、ヘテロ接合型 マウス同士、ヘテロ接合型マウスと AD AMI 1遺伝子ノックアウトマウス、 ADAM11 遺伝子ノックアウトマウス同士のいずれの交配でも得ることができる。 ADAM11遺伝 子ノックアウトマウスの mRNAの発現の有無はノーザンブロット解析、 RT—PCR法、 RNAseプロテクションアツセィ、 in situ等により確認できる。また ADAM11タンパク 質の発現を免疫組織染色、当該タンパク質を認識する抗体等により確認することが できる。
[0065] スクリーニング方法
本発明による第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物は、協調運動障害、記憶障害（ 例えば、空間的 ·参照記憶障害)、認知障害、学習障害、および痛覚障害などの神 経関連疾患の表現形を有する。第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物は、 ADAM 11 遺伝子のホモ接合型破壊を有して ヽることから、神経関連疾患の表現形は ADAM 1 1遺伝子が不活性ィ匕されたことに起因するものであると考えられる。従って、本発明に よる第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物は、 ADAM11遺伝子の不活性ィ匕により起 こる神経関連疾患のモデル動物として使用でき、特に、中枢神経系疾患や痛覚障害 の治療薬の探索および開発や、学習、記憶、運動機能、体性感覚などの中枢神経 系や痛覚伝達経路の機能解析 (特に、分子レベルでの機能解析）に使用することが できる。
[0066] 本発明によれば、神経関連疾患の治療に用いられる物質もしくはその塩またはそ れらの溶媒和物のスクリーニング方法であって、
(i)第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物の神経関連疾患の症状の程度を測定するェ 程；（ii)被検物質を前記非ヒト遺伝子破壊動物に投与する工程；および
(iii)被検物質投与後の前記非ヒト遺伝子破壊動物の神経関連疾患の症状の程度を 測定する工程
を含んでなる方法が提供される。
本発明によるスクリーニング法においては、工程 (iii)の後に、（iv)被検物質投与前 の神経関連疾患の症状の程度と、被検物質投与後の神経関連疾患の症状の程度と を比較する工程を更に含んで 、てもよ 、。
[0067] 本発明によるスクリ一ユング方法を用 V、てスクリ一ユングされる物質には特に制限は ないが、例えば、神経関連疾患の治療剤あるいはその候補化合物、具体的には、運 動失調改善剤、記憶改善剤、および無痛覚症改善剤並びにそれらの候補化合物を スクリーニングの対象にすることができる。
本発明によるスクリーニング方法を用いてスクリーニングされる物質は、塩であって もよぐまた、溶媒和物であってもよい。酸との塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素 酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩や蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレ イン酸、クェン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、 p—ト ルエンスルホン酸、トリフルォロ酢酸などの有機酸との塩を挙げることができる。また、 塩基との塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、 マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、トリメチルァミン、トリエチルァミン、ピリジ ン、ピコリン、ジシクロへキシルァミン、 N, N，ージベンジルエチレンジァミン、アルギ ニン、リジン等の有機塩基との塩 (有機ァミン塩）、アンモ-ゥム塩を挙げることができ る。 また、本発明によるスクリーニング方法を用いてスクリーニングされる物質は、無水 物であっても、水和物などの溶媒和物を形成していてもよい。溶媒和物は水和物また は非水和物のいずれであってもよいが、水和物が好ましい。溶媒は水、アルコール（ 例えば、メタノール、エタノール、 n—プロパノール）、ジメチルホルムアミドなどを使用 することができる。さらに、これら物質の溶媒和物および Zまたは光学異性体が存在 する場合には、本発明のスクリーニング方法でスクリーニングされる物質は、それらの 溶媒和物および Zまたは光学異性体が含まれる。
また、本発明によるスクリーニング方法を用いてスクリーニングされる物質は、生体 内で酸化、還元、加水分解、抱合などの代謝を受ける物質をも包含する。
さらに、本発明によるスクリーニング方法を用いてスクリーニングされる物質は、生体 内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けてスルホンアミドィ匕合物を生成するィ匕 合物をも包含する。
本発明によるスクリーニング方法にぉ 、ては、被検物質を投与する前の遺伝子破 壊動物の神経関連疾患の症状の程度と、被検物質を投与した後の遺伝子破壊動物 の神経関連疾患の症状の程度とを比較し、後者が前者よりも改善されている場合に は、神経関連疾患の治療に有用な物質であると決定することができる。症状の程度 の測定に当たっては、回転棒試験、水迷路試験、ホルマリン試験、酢酸ライジング法 試験などを用いることができる。
回転棒試験は、運動協調性の障害を調べる検査であって、回転する棒 (好ましくは 、 1分間に 1〜20回転)の上に動物を置き、落下頻度または落下までの時間を調べる 試験である。本発明によるスクリーニング方法では、被検物質を投与する前に回転す る棒の上に本発明の非ヒト遺伝子破壊動物を置き、落下頻度または落下までの時間 を測定する。次に被検物質を投与した後に回転する棒の上に第一の態様の非ヒト遺 伝子破壊動物を置き、落下頻度または落下までの時間を測定する。被検物質投与 後に落下頻度が低下または落下までの時間が長くなつた場合、当該被検物質は、運 動協調機能を改善する物質であると判断することができる。
水迷路試験は、例えば、直径 l〜2mのプールに必要に応じて牛乳または墨汁等 で濁らせた水を溜め、プール内のある場所に避難用のプラットホームを設置した装置 を使用し、そのプールで第一の態様の非ヒト遺伝子破壊動物を泳がせ、足をつくこと のできるプラットホーム（ゴール地点）にたどり着くまでの時間（Escape latency)を測定 し、空間認知能力の一つの指標とする試験である。本発明によるスクリーニング方法 では、被検物質を投与する前に本発明の非ヒト遺伝子破壊動物の水迷路試験を行 い、プラットホームにたどり着くまでの時間を測定する。次に、被検物質を投与した後 に水迷路試験を行いプラットホームにたどり着くまでの時間を測定する。被検物質投 与の後が該投与前よりも、当該動物がプラットホームにたどり着くまでの時間が短縮し た場合、当該被検物質は、記憶障害 (認知障害、学習障害等を含む)を改善する物 質であると判断することができる。
ホルマリン試験は，動物の痛みを観察，評価するための試験である。痛みを表わす 行動をよりはっきりと示すこと (例えば、注射された足を振る、舐める、咬む等）と関連 している。本発明によるスクリーニング方法では、例えば、ホルマリンを本発明の非ヒト 遺伝子破壊動物の足に投与する前の当該動物の足の状態を観察する。次に当該動 物の足に被検物質を投与した後に、当該動物の足の状態（リツキング (licking)または バイティング (biting) )を観察する。被検物質投与の後が該投与前よりも当該動物の 足の状態に反応が速く現れた場合、当該被検物質は、痛覚障害を改善する物質で あると半 lj断することができる。
酢酸ライジング試験とは、マウスに酢酸を投与すると、痛みにより特有の「身もだえる ような症状 (ライジング)」が現れる。本発明によるスクリーニング方法では、例えば、酢 酸を本発明の非ヒト遺伝子破壊動物の腹腔内に投与する前の当該動物の状態を観 察する。次に当該動物の腹腔内に被検物質を投与した後に、当該動物の状態 (ライ ジング等)を観察する。被検物質投与の後が該投与前よりも当該動物の状態に反応 が速く現れた場合、当該被検物質は、痛覚障害を改善する物質であると判断するこ とがでさる。
[0069] 医蓉組成物および遣伝 '治療剤
本発明によれば、 ADAM 11タンパク質を含んでなる、 ADAM11遺伝子の不活性 化に起因した神経関連疾患の治療に用いられる医薬組成物が提供される。
[0070] 本発明によればまた、 ADAM11遺伝子の不活性化に起因する神経関連疾患の 治療に用いられる医薬の製造のための、 ADAM 11タンパク質の使用が提供される。
[0071] 本発明によればまた、 ADAM11遺伝子の不活性ィ匕に起因した神経関連疾患の 治療方法であって、治療が必要な患者に、治療上の有効量の ADAM11タンパク質 を投与することを含んでなる治療方法が提供される。
[0072] ここで、本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/ま たは生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および Zまたは症状を完全 にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および Zまたは疾病に起因す る悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において
「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば、以下の治療を 含む：
•疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者にお いて、疾病または症状が起こることを予防すること；
•疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；
•疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転 を引き起こすこと。
[0073] 本明細書にぉ 、て「ADAM11遺伝子の不活性ィ匕に起因した神経関連疾患」の例 としては、協調運動障害、記憶障害 (例えば、空間的 ·参照記憶障害)、認知障害、 学習障害、および痛覚障害が挙げられる。
[0074] ADAM11タンパク質を用いた治療に当たっては、 ADAM11タンパク質を薬学的 に許容され得る担体と配合して医薬組成物として提供できる。
[0075] 有効成分の担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また、本発 明による医薬組成物は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば、非ヒト哺乳動物 (例えば、 ゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両 生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば、静脈注射、 筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与すること ができる。即ち、本発明による医薬組成物は、ヒトまたはヒト以外の生物に、種々の形 態、経口または非経口（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮 投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明による医薬組 成物は、有効成分単独で用いることも可能である力 投与経路に応じて慣用される方 法により薬学的に許容され得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することが可能で ある。
[0076] 好ま ヽ剤形としては、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル 剤、シロップ剤、トローチ剤等による経口剤、吸入剤、坐剤、注射剤（点滴剤を含む） 、軟膏剤、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤、リボソーム 剤等による非経口剤が挙げられる。
[0077] これらの製剤の製剤化に用いる担体には、例えば、通常用いられる賦形剤、結合 剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収 促進剤、界面活性剤、 pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活 性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤等を使用することができ、 一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化すること が可能である。使用可能な無毒性のこれらの成分としては、例えば、大豆油、牛脂、 合成グリセライド等の動植物油；例えば、流動パラフィン、スクヮラン、固形パラフィン 等の炭化水素；例えば、ミリスチン酸オタチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル等の エステル油；例えば、セトステアリルアルコール、ベへ-ルアルコール等の高級アルコ ール；シリコン榭脂；シリコン油；例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタ ン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸 エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレン ポリオキシプロピレ ンブロックコポリマー等の界面活性剤；例えば、ヒドロキシェチルセルロース、ポリアク リル酸、カルボキシビ二ルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メ チルセルロース等の水溶性高分子；例えば、エタノール、イソプロパノール等の低級 アルコール；例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソル ビトール、ポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；例えば、ダルコ ース、ショ糖等の糖;例えば、無水ケィ酸、ケィ酸アルミニウムマグネシウム、ケィ酸ァ ルミ-ゥム等の無機粉体;塩ィ匕ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの無機塩;精製水等が 挙げられる。
[0078] 賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マン-トー ル、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が、結合剤としては、例えば、ポリビ ニノレアノレコーノレ、ポリビニノレエーテノレ、メチノレセノレロース、ェチノレセノレロース、ァラビ ァゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキ シプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール.ポリオキシェ チレン ·ブロックポリマー、メダルミン等力 崩壊剤としては、例えば、澱粉、寒天、ゼラ チン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クェン酸カルシウム、 デキストリン、ぺクチン、カルボキシメチルセルロース 'カルシウム等力 滑沢剤として は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化 植物油等が、着色剤としては医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯 臭剤としては、ココア末、ハツ力脳、芳香散、ハツ力油、竜脳、桂皮末等が、それぞれ 用いられる。上記の成分は、その塩またはその溶媒和物であってもよい。
経口製剤は、本発明において使用する有効成分に、賦形剤、さらに必要に応じて、 例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加えた後、常法により例 えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤等とする。錠剤'顆粒剤 の場合には、例えば、糖衣、その他必要により適宜コーティングすることはもちろん差 支えない。シロップ剤や注射用製剤等の場合は、例えば、 pH調整剤、溶解剤、等張 ィ匕剤等と、必要に応じて溶解補助剤、安定化剤等とを加えて、常法により製剤化する 。また、外用剤の場合は、特に製法が限定されず、常法により製造することができる。 使用する基剤原料としては、医薬品、医薬部外品、化粧品等に通常使用される各種 原料を用いることが可能であり、例えば、動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス類 、高級アルコール類、脂肪酸類、シリコン油、界面活性剤、リン脂質類、アルコール類 、多価アルコール類、水溶性高分子類、粘土鉱物類、精製水等の原料が挙げられ、 必要に応じ、 PH調整剤、抗酸化剤、キレート剤、防腐防黴剤、着色料、香料等を添 加することができる。さらに、必要に応じて血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活 剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤等の成分を配合することもできる。この 時の有効成分の担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。本発明 による医薬組成物の有効成分は、少なくとも 90%以上、好ましくは 95%以上、より好 ましくは 98%以上、さらに好ましくは 99%以上に精製されたものを使用するのが好ま しい。
[0080] 本発明による医薬組成物の投与形態および必要な投与量範囲は、投与対象、投 与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な 投与量は患者の体重 lkgあたり、例えば、約 0. 1〜500 8、好ましくは約0. 1〜10 0 g、より好ましくは 1〜50 /^程度である。投与経路の効率が異なることを考慮す れば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば、経口投与は 静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レべ ルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用 いて調整することができる。
[0081] 本発明による医薬組成物および後述する遺伝子治療剤の有効成分は、そのプロド ラッグであってもよい。なお、本発明のスクリーニング方法によって見出された物質の 医薬組成物等も上記の記載に従って作製することができる。
[0082] 本明細書にぉ 、て、「プロドラッグ」とは、バイオアベイラビリティ (bioavailability)の改 善や副作用の軽減等を目的として、「薬剤の活性本体」（プロドラッグに対応する「薬 剤」を意味する）を不活性な物質に化学修飾したものを意味し、吸収後、体内では活 性本体へ代謝され、作用を発現する薬剤のことである。従って、「プロドラッグ」という 用語は、対応する「薬剤」よりも固有活性 (intrinsic activity)は低いが、生物学的な系 に投与されると、自発的な化学反応または酵素触媒反応または代謝反応の結果、そ の「薬剤」物質を生成する任意の化合物、ペプチド、ポリヌクレオチドを指す。当該プ ロドラッグとしては、上記例示した前記化合物類、前記ペプチド類もしくは前記ポリヌ クレオチド類のアミノ基、水酸基、カルボキシル基などがァシル化、アルキル化、リン 酸化、ホウ酸化、炭酸化、エステル化、アミド化またはウレタン化された化合物、ぺプ チド、ポリヌクレオチドなどの種々のプロドラッグを例示することができる。但し、例示し た群は包括的なものではなぐ典型的なものに過ぎず、当業者は他の既知の各種プ ロドラッグを公知の方法によって上記例示した前記化合物類、前記ペプチド類または 前記ポリヌクレオチド類力 調製することができる。上記例示した前記化合物類、前 記ペプチド類または前記ポリヌクレオチド類力もなるプロドラッグは、本発明の範囲内 に含まれる。 [0083] 本発明によれば、 ADAM11遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入べクタ 一を含有してなる、 ADAM11遺伝子の不活性化に起因した神経関連疾患遺伝子 治療剤が提供される。
[0084] 本発明によればまた、 ADAM11遺伝子の不活性化に起因する神経関連疾患遺 伝子治療剤の製造のための、 ADAM11遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子 導入ベクターの使用が提供される。
[0085] 本発明によればまた、 ADAM11遺伝子の不活性ィ匕に起因した神経関連疾患の 治療方法であって、治療が必要な患者に、 ADAM11遺伝子または ADAM11遺伝 子を作動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターを投与することを含んでなる治療 方法が提供される。
[0086] 本発明による遺伝子療法に当たっては、遺伝子導入ベクターを患者に直接投与す る「in vivo法」を選択しても、患者の体内から標的細胞を採取し、体外で ADAM11 遺伝子または遺伝子導入ベクターを導入し、遺伝子またはベクターが導入された標 的細胞を患者の体内に戻す「ex vivo法」を選択してもよ!/、。
[0087] in vivo法の場合には、レトロウイルスベクターなどの当該技術分野において公知の 遺伝子導入ベクターを用いて、患者に直接導入ベクターを投与することができる。本 発明による遺伝子治療に使用する ADAM11遺伝子または ADAM11遺伝子を作 動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターは、本発明による医薬組成物と同様に薬 学上許容される担体を配合して製剤化することができ、例えば、非経口的に投与する ことができる。投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経 験的な最適化手順を用いて調整することができる。 in vivo法においては、 ADAM11 遺伝子または ADAM11遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターを、 常法に従って、カテーテルまたは遺伝子銃によって投与することができる。
[0088] ex vivo法の場合には、リン酸カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法、ウィルス形質 導入法などの当該技術分野にぉ 、て公知の方法を用いて、標的細胞に ADAM11 遺伝子を導入することができる。標的細胞は脳神経系の病変部位等力 採取するこ とができる。 ex vivo法を選択した場合には、 ADAM11遺伝子または ADAM11遺伝 子を作動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターを細胞に導入し、当該細胞で前記 ペプチドを発現させた後、当該細胞を患者に移植することによって、 ADAM11遺伝 子の不活性ィ匕に起因した神経関連疾患を治療することができる。
[0089] 遺伝子治療に利用可能な遺伝子導入ベクターは当該技術分野にお!、て周知であ り、遺伝子導入の方法や宿主に応じて適宜選択することができる。このようなベクター としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。また、 A DAM11遺伝子を遺伝子導入ベクターに連結するに当たっては、宿主において発 現可能なように、プロモーターやターミネータ一のような制御配列やシグナル配列、 ポリペプチド安定ィ匕配列などを適宜連結することができる。遺伝子導入ベクターの選 択ゃ構築については、例えば、 Miller, A. D" Blood, 76, 271-278, 1990、 Vile, R. G ., Gene Therapy, Churchill Livingstone, 12—30, 1995、 Emi,N.,et al, J.Virol., 65,120 2-1207,1991、 YeeJ.K.'et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91, 9564-9568, 1994、 Yang, Y.'et al.Hum.Gene.Ther.6,1203-1213,1995 Chen,S.T.,et al. Proc.Natl.Acad. Sci.US A,93,10057-10062, 1996、 Ory,D.S.et.al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93, 11400-11406, 1 996等を参照することができる。
[0090] 本発明によれば、生体から採取された細胞に、 ADAM11遺伝子または ADAM1 1遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターを用いて ADAM 11遺伝子 を導入してなる、神経関連疾患の遺伝子治療に用いられる細胞を提供することがで きる。
実施例
[0091] 以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定す るものではない。
[0092] 実施例 1 :ADAM11遣伝子ノックアウトマウスの作製
1. 1. 1 :AD AMI 1遺伝子のクロー-ング
マウス AD AMI 1遺伝子のアミノ酸配列は、 Gene, 236: 79-86.(1999)にて報告され ており、同 cDNA配列は Accession Number AB009676として、 GenBankに登録され ている。ターゲテイングに用いる相同配列は、ェクソン 5とその上流の約 3. 8kbpなら びにェクソン 7とその下流 6. 3kbpのマウスゲノム配列を PCR法によって増幅すること によって獲得した。具体的には、プライマー（配列番号 5 ; SGN055N及び、配列番 号 6； SGN043S)を設計し C57BLZ6マウスのゲノム DNAを铸型に PCR法をおこ ない約 5kbpの DNAフラグメントを増幅した後、 Hindlllと Sail 消化で得られた約 3. 8kbpsのフラグメント（配列番号 7)を得た。また、同様に（配列番号 8 ; SGN034S及 び配列番号 9； SGN037S)のプライマーを用いて C57BLZ6マウスのゲノム DNAを 铸型とした PCR法をおこない、約 6. 3kbpの DNAフラグメント（配列番号 10)を得た
[0093] 1. 1. 2 :ターゲティングベクター（pKO— MDC9)の構築
ターゲテイングベクターは、以下の方法で構築した。まず、 5 '—アーム (配列番号 7 のフラグメント）、ネオマイシン耐性遺伝子（PGK— neo)、 3，—アーム（配列番号 10 のフラグメント）を常法にしたがって順次連結させた後、これをネガティブ選別遺伝子 である単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子を含有する pUC 18ベクター に導入し、ターゲテイングベクター (pKO— MDC9)を作製した（図 1)。
[0094] 1. 1. 3：相同組み換え胚性幹細胞 (ES細胞）の取得
ターゲティングベクター pKO— MDC9を で切断して直鎖上の DNA(lmgZ ml)とした。マウス胚性幹細胞 (ES細胞）は TT2 (ギブコ BRL,東京）を用い (Yagi T. et.al, Analytical Biochem. 214, 70, 1993)、直鎖ターゲッティングベクター（200 g Zml)を ES細胞（lxl07cellsZml)へエレクト口ポレーシヨン（250V、 975 ^ F,室 温）によりトランスフエクシヨンし、培養 2日後より G418 (250 μ g/ml)およびガンシク 口ビル (0. 2 μ Μ)を含んだ培地で 3日間培養し、その後、 G418を含んだ培地で更 に 3日間培養した。生じた ES細胞コロニーのうち、無作為に選んだ株力もそれぞれ D ΝΑを抽出し、ターゲテイングベクター外の塩基配列（配列番号 11 ; SGN033)、導 入遺伝子 (ネオマイシン耐性遺伝子）中に含まれる塩基配列 (配列番号 12； AGN1) をプライマーとして PCR法を行って、約 6. 5kbの PCR産物を生じるクローンを相同組 み換えを起こして 、る可能性のある候補とした。
[0095] 候補クローンの中力 サザンブロット解析により相同組み換えのみが起きているクロ ーンを同定した。抽出したゲノムを S HIで切断し、 BE2Kプローブ（ターゲティング ベクター 5 '—アーム上流の約 2. Okbpの DNA断片、配列番号 13、図 1参照）でハイ ブリダィズすると、野生型は 13. 7kbのバンドとして検出されるのに対し、相同組換え の起こっているクローンは 10. 3kbのバンドとして検出されるので、これを相同糸且換え の起こって!/、るクローンとして選択した（図 2)。
[0096] 1. 1. 4 :AD AMI 1遺伝子ノックアウトマウスの作製
雌マウス (ICR: 日本チャールズリバ一、神奈川）に、妊馬血清性生殖腺刺激ホル モン (pregnant mare's serum gonadotropin,PMSG :セロトロピン：帝国臓器，東京) 5 国際単位とヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin, hCG :ゴ ナトロピン:帝国臓器，東京) 2. 5国際単位をそれぞれ腹腔内投与して、受精 2. 5日 目に卵管一子宫還流法により 8細胞期胚を得た。
[0097] 得られた 8細胞期胚へ、相同組み換えした ES細胞を倒立顕微鏡 (ダイァフォト TM D :日本光学工業，東京）下で、マイクロマニピュレータ (粗動電動マニピュレータに懸 架式ジョイスティック 3次元油圧マイクロマニピュレータを装着:ナリシゲ,東京）、マイク 口インジェクター（ナリシゲ,東京）、インジェクションピペットおよびホールディングピぺ ットを用いてマイクロインジェクションした。また、インジェクション用ディッシュには、 Fa lcon3002 (Becton Dickinson Labware)〖こ培地 5 μ 1の液滴および ES細胞を浮遊さ せた液滴を作り、流動パラフィンを重層したものを用いた。
[0098] 精管結紮雄マウス (ICR: 日本チャールズリバ一、神奈川）と正常雌マウス (ICR: 日 本チャールズリバ一、神奈川）とを交配させて偽妊娠マウスを作成し、異なる 3つの相 同組換え ES細胞クローンをマイクロインジェクションした操作卵を移植した。偽妊娠 マウスを 50mgZkg体重のペントバルビタールナトリウム（Nembutal : Abbott Laborato ries)にて全身麻酔を行い、両けん部を約 lcm切開して卵巣および卵管を露出し、実 体顕微鏡下で卵巣嚢をピンセットで切開し卵管采を露出させ、次いで卵管あたり 7〜 8個の操作卵を卵管采に送り込んだ。その後、卵管および卵巣を腹腔に戻し両切開 部を縫合した。
[0099] 操作卵を移植し妊娠したマウスより、体毛色が野ネズミ色の 100%キメラマウスを出 産させた。得られた 100%キメラマウスの生殖細胞力 ¾S細胞由来であることを確認す るために、 ICRメスマウスと交配して産仔を確認したところ、全ての産仔の体毛色が野 ネズミ色であり、キメラマウスの生殖細胞は ES細胞由来であることが確認された。キメ ラマウスを C57BL/6と交配することによってヘテロマウスを得て、ヘテロマウス同士 の交配によって ADAM11遺伝子ノックアウトマウスを得た。
[0100] 1. 2. 1 : ADAM 11遺伝子破壊の検証 (サザンブロット解析）
ヘテロマウス同士の交配によって得られた 6ヶ月齢の雄のマウス 6匹（個体番号： 1, 2, 3, 4, 5, 6)の遺伝子型を、サザンプロット解析によって確認した。それぞれのマウ スの肝臓から抽出したゲノム ϋΝΑ20 /ζ 8を^ mHIにより切断し、 7. 5%ァガロース 電気泳動で分離した後にナイロンメンブレンへ転写し、アイソトープ標識した BE2K プローブとハイブリダィズさせた。メンブレンを洗浄した後に、ハイブリダィズした標識 プローブのイメージを BAS 5000バイオイメージアナライザー（FUJIFILM)を用いて 解析した。
[0101] その結果、個体番号 5および 6由来のゲノム DNAからは、 10. 3kbのバンドのみが 検出された。したがって、個体番号 5および 6のマウスは破壊対立遺伝子をホモに有 する AD AMI 1遺伝子ノックアウトマウスであることが確認された（図 3)。
[0102] 1. 2. 2 :ADAM11遺伝子破壊の検証（ウェスタンブロット解析）
1. 2. 1で解析に用いた 6匹のマウス力も小脳を取り出し、 1mlの TN ( + )溶液（50 mM Tris-HCl,pH7. 5, 150mM NaCl, 1% NP— 40, 1 X Comlete(TM) )に 浸し、ポリトロン'ホモジナイザーによって破砕することによって、小脳ライセートを作製 した。小脳ライセートに、 100 /z lのコンカナパリン A—セファロース（Concanavalin A- Sepharose ) (Amersham)を添加し、室温で 60分間培養した。次に、コンカナパリン A —セファロースを、 TN ( + )溶液で 2回洗浄した後、 120 1の SDS— PAGEサンプ ルローデイング溶液に懸濁し、 95°Cで 3分間処理の溶出操作をおこなうことによって 、コンカナパリン A (Concanavalin A)に結合していたマウス小脳由来の糖タンパクの 濃縮サンプルを作製した。同サンプルを 10%SDS— PAGEにて分離し、 PVDF膜 へ転写した。転写した PVDF膜は、ブロックエース溶液 (大日本製薬)で室温におい て 1時間ブロッキングした後に、 1 μ gZmlの抗 AD AMI 1モノクローナル抗体 (特開 平 7— 330799号公報）で室温において 3時間の処理をおこなった。同 PVDF膜を 3 回洗浄した後に、抗マウス IgG—HRPコンジュゲート（Amersham)で室温において 1 時間の処理をおこない、 3回洗浄した後に ECL— Plus試薬 (Amersham)を用いて、 A DAM11タンパクを検出した。尚、 HAタグを付カ卩したマウス ADAM11タンパク質を 強制発現させた HeLa細胞のライセートを、陽性コントロール [P]として解析に供した
[0103] その結果、野生型 (個体番号 1、 2)およびへテロ接合体 (個体番号 3、 4)では、約 7 OkDの抗 AD AMI 1抗体と反応する単一のバンドが検出されたのに対して、ホモ接 合体 (個体番号 5、 6)、すなわち AD AMI 1遺伝子ノックアウトマウス、では全くバンド が検出されな力つた（図 4)。なお、陽性コントロールでは、約 90kDの前駆体および 約 70kDの成熟型の 2本のバンドが検出されている力 マウス小脳からは成熟型のみ が検出された。
[0104] 以上の結果から、本発明の ADAM11遺伝子ノックアウトマウスにおいては、 ADA
Ml 1タンパク質が合成されて 、な 、ことが確認された。
[0105] ¾施例 2 : ADAMU遣伝早ノックアウトマウスの神終瞳害についての確認試験
2. 1 :各群の体重および脳重量の測定
24週齢の雄マウス（野生型マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 8、 8、 8匹）について
、体重、総脳重量、大脳重量および小脳重量を測定したところ、各重量は各群にお いて有意な差は認められな力つた (表 1)。すなわち、各群において、外形には変化 は認められな ヽことが確認された。
[表 1]
体重 ） 総脳重量（mg) 大脳重量（mg) 小脳重量 (mg) 野生型マウス 32. 5±0. 8 453. 8±1. 8 321. 3±3.0 43. 8±1. 8 ヘテロマウス 33. 3±1. 6 453. 8±1. 8 323. 8±2.6 45. 0±1. 9 ホモマウス 32. 8±1. 1 456. 3±1. 8 320. 0±2.7 45. 0±1. 9
[0106] 2. 2 :協調運動障害試験
(1)自発運動量の測定
自発運動量は Versamax解析ソフト (Accuscan社)を用いて測定した。 24週齢の雄マ ウス（野生型マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 8、 8、 8匹）を Versamaxケージ内に入 れると、その直後から 90分間の水平行動回数、常同行動回数および立ち上がり回数 の合計回数が解析ソフトにより解析表示されるので、この合計回数 (カウント数)を自 発運動量の指標とした。
[0107] その結果、各群のマウスにおいてカウント数には有意な差は認められず、自発運動 量には変化が認められな 、ことが確認された（図 5)。
[0108] (2)握力（牽引力)試験
握力（牽引力)試験は牽引装置 (FU-1、室町機械株式会社)を用いて行った。 24 週齢の雄マウス（野生型マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 12、 10、 12匹）の尾のつ けねから lcmのところを持ち、前肢で装置の牽引するステンレス棒（直径 2mm)を握 らせ、尾を引 、て前肢を離すまでに生じた牽弓 I力を測定した。
[0109] その結果、各群のマウスにおいて有意な差は認められず、牽引力つまり握力には 変化が認められな 、ことが確認された（図 6)。
[0110] (3)懸垂試験
運動神経および骨格筋の筋力の測定は、懸垂試験により行った。本試験は、ステ ンレス棒（直径 2mm、長さ 50cm)を 37cmの高さに水平にはり、その中央に 24週齢 の雄マウス（野生型マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 12、 10、 12匹）の両前肢をか け 30秒間観察し、落下するまでの時間とスコアを測定し、この時間とスコアを運動神 経および骨格筋の筋力の指標として行った。なお、スコアは以下の通りとした。 0 :直 ちに落下した。 1：両前肢でステンレス棒を握って 、る状態。 2：両前肢でステンレス棒 を握り、懸垂しようと試みた状態。 3 :両前肢でステンレス棒を握り、かつ、少なくともど ちらか一方の後肢でステンレス棒を握って 、る状態。 4：前肢及び後肢でステンレス 棒を握り、かつ、尾をステンレス棒に巻きつけている状態。 5 :4での状態にカ卩え、ステ ンレス棒の先端まで移動した状態。
[0111] その結果、各群のマウスにおいて有意な差は認められず、運動神経などの末梢神 経系や骨格筋の筋力には顕著な変化が認められないことが確認された（図 7および 8
) o
[0112] (4)歩行試験
骨格異常の測定は、歩行試験により行った。本試験は、 24週齢の雄マウス (野生型 マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 12、 10、 12匹）の両後肢を墨汁で塗り、マウスを (9 X 25 X 10cm)の通路を真っ直ぐに歩力せ、左右の後肢幅 (左右幅）と両後肢そ れぞれの歩幅 (前後幅)を測定し、骨格異常の指標とした。
[0113] その結果、各群のマウスで有意な差は認められず、後肢の骨格異常や歩行時にお ける足の運びに変化が認められないことが確認された（図 9および 10)。
[0114] (5)回転棒試験
協調運動障害の測定は、回転棒試験により行った。本試験は、ロータロッド (KN— 75、夏目製作所株式会社)のドラム上に 24週齢の雄マウス（野生型マウス、ヘテロマ ウス、ホモマウス各 11、 14、 12匹）を乗せ、ドラムを 0 (静止状態）、 5、 10および 15rp mで 120秒間回転させ、ドラム上力もマウスが落下するまでの時間を滞在時間として 測定し、この時間を協調運動障害の指標として行った。静止状態と 5rpmについては 各回転を 4回、 lOrpmについては 8回、 15rpmについては 20回それぞれ試行した。
[0115] その結果、ホモマウス群は静止状態では他のマウス群と同様にドラム上に滞在する ことができたが（図 11)、 5、 10および 15rpmとロータを回転させると、野生型マウス群 と比較して滞在時間が有意に短ぐ協調運動障害が認められた (図 12〜14)。なお、 ヘテロマウス群は野生型マウス群と比較して、静止状態、 5、 10および 15rpmとロー タを回転させても、協調運動障害に有意な差は認められな力つた。
[0116] 上記の（2)握力（牽引力）試験、（3)懸垂試験、（4)歩行試験の結果、ヘテロマウス 及びホモマウス共に野生型マウスとの間に有意な差は認められず、ホモマウスには 運動神経などの末梢神経系や筋力などの明らかな損傷、骨格異常等が認められな いことが確認された。以上の結果より、ホモマウスの協調運動障害は中枢神経系の障 害由来であることが考えられる。
[0117] 2. 3 :記憶障害試験
記憶障害の測定は、水迷路試験により行った。 [0118] まず、 24週齢の雄マウス（野生型マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 11、 14、 12匹 )に、水を満たした円形プール（直径 1. 5m、高さ 30cm)内の水面下に固定したプラ ットフォーム（直径 8cm、水面下 lcm)を見つけだすように学習させた。マウスの方向 決定が容易になるように、プールの周囲には外部視覚的手力 Sかり（蛍光灯、実験機 械、壁紙等)を設置し、これらは実験期間を通じて常に一定にした。実験日にはブー ルを 4等分して（図 15) 4力所の出発点をランダムに選び、マウスの頭部をプールの壁 に向けて水中に入れ、プラットフォームに逃避するまでの潜時を測定した。マウスが プラットフォームに登ったときは、そのまま 15秒間放置した。もし 60秒経過してもマウ スがプラットフォームに登らなかった場合は、その時点で試験終了としてマウスをプラ ットフォーム上において、同じく 15秒間放置し、潜時を 60秒と記録した。各マウスに は 1日 1回の訓練セッション（1セッション当たり 4回の試行）を 9日連続して行い、逃避 潜時時間を測定した。その後、セッション 9 (9日目）の 24時間後にプラットフォームを 取り除き、マウスを 60秒間泳がせて、この時の泳路と 4等分した各場所にいた時間を 測定した (プローブトライアル（10日目））。プラットフォームの場所 (TQ)を認知して記 憶している場合は、プラットフォームがあった場所に長く留まるため、 4等分した各範 囲における滞留時間を指標として記憶能力を測定することができる。
[0119] その結果、訓練セッションにおいては各群で逃避潜時時間の短縮が認められたが 、ホモマウス群は野生型マウス群と比較して、逃避潜時時間短縮の程度が有意に小 さぐ記憶学習障害が認められた。一方、ヘテロマウス群は野生型マウス群と比較し て逃避潜時時間短縮の程度には有意な差は認められな力 た（図 16)。また、プロ 一ブトライアルにおいては、各群において泳路には有意な差がみとめられな力つたが (図 17)、ホモマウス群は野生型マウス群と比較して、プラットフォームの場所 (TQ)に 滞留している時間が有意に短ぐ記憶障害が認められた。一方、ヘテロマウス群は野 生型マウス群と比較して有意な差は認められな力つた（図 18)。
[0120] 次に、この水路迷路試験で必要となる、水面下にあるプラットフォームの位置を覚え るのに手がかりとなる蛍光灯、実験機械、壁紙等を見つけ出す視覚能力、泳動に必 要な運動能力、プラットフォームへ逃避する自発性を確認するため、以下の試験を行 つた o [0121] まず、プラットフォームの位置が泳動しているマウス力も容易にわ力るように目印とな る旗をプラットフォーム上に立て、実験日は、試行ごとに旗付プラットフォームの位置 を変え、 4力所の出発点はランダムに選び、マウスの頭部をプールの壁に向けて水中 に入れ、旗付プラットフォームに逃避するまでの潜時を測定した。マウスがプラットフ オームに登ったときは、そのまま 15秒間放置した。もし 60秒経過してもマウスがプラッ トフオームに登らな力つた場合は、その時点で試験終了としてマウスをプラットフォー ム上において、同じく 15秒間放置し、潜時を 60秒と記録した。各マウスには 1日 1回 の訓練セッション（1セッション当たり 4回の試行)を 3日連続して行い、逃避潜時時間 を測定した。
[0122] その結果、各群のマウスにおいて有意な差は認められず、水迷路試験に必要な、 各群のマウスの視覚能力、泳動に必要な運動能力、プラットフォームへ逃避する自 発性には問題がな ヽことが確認された（図 19)。
[0123] 2. 4 :痛覚障害試験
(1)ホルマリン試験
24週齢の雄マウス（野生型マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 8、 8、 8匹）の後肢 躕に 3%ホルマリン 20 1を投与し、投与直後から 60分間ホルマリン投与部位の後肢 躕に対するマウスの傷みの現れである、後肢躕のリツキング (licking) (バイティング (bi ting)を含む)反応の持続時間を測定し、痛覚障害の指標とした。測定は 5分間隔で 1 2回測定した。 5分ごとのリツキング時間を図 20に示す。リツキングの出現は、投与後 15分を境に 2相に分かれるので、初期に現れる相を第 1相（0〜5分）、後半に現れる 相を第 2相（15〜60分)とした。
[0124] その結果、ホモマウス群は第一相および第二相の!/、ずれにお 、ても、野生型マウ ス群と比較して、リツキング時間が有意に短ぐ痛覚障害が認められた（図 21)。
[0125] (2)酢酸ライジング試験
ー晚絶食させた 24週齢の雄マウス（野生型マウス、ヘテロマウス、ホモマウス各 12、 10、 12匹）に、 0. 6%酢酸（lOmlZkg)を腹腔内投与し、この 10分後から 10分間、 体または後肢を伸ばす、体をひねるなどの苦悶症状の回数を測定し、痛覚障害の指 標とした。 その結果、ホモマウス群は野生型マウス群と比較して、苦悶症状の回数が有意に 少なぐ痛覚障害が認められた (図 22)。

Claims

請求の範囲
[I] ADAMl 1遺伝子の対立遺伝子の双方が破壊されてなる、非ヒト遺伝子破壊動物 またはその子孫。
[2] ADAM11遺伝子の対立遺伝子の双方の全部または一部の外来配列による置換 により、 ADAM11遺伝子の対立遺伝子の双方が破壊されている、請求項 1に記載 の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫。
[3] 神経関連疾患を発症する表現型を有する、請求項 1または 2に記載の非ヒト遺伝子 破壊動物またはその子孫。
[4] 神経関連疾患が、協調運動障害、記憶障害、認知障害、学習障害、または痛覚障 害である、請求項 3に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫。
[5] ADAM11遺伝子の対立遺伝子の一方が破壊されてなる、非ヒト遺伝子破壊動物 またはその子孫。
[6] ADAM11遺伝子の対立遺伝子の一方の全部または一部の外来配列による置換 により、 ADAM11遺伝子の対立遺伝子の一方が破壊されている、請求項 5に記載 の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫。
[7] 非ヒト動物が齧歯類動物である、請求項 1〜6のいずれか一項に記載の非ヒト遺伝 子破壊動物またはその子孫。
[8] 齧歯類動物がマウスである、請求項 7に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子 孫。
[9] 請求項 1〜8のいずれか一項に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫から 得られる組織。
[10] 請求項 1〜8のいずれか一項に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫から 得られる動物細胞。
[II] 請求項 1〜8のいずれか一項に記載の非ヒト遺伝子破壊動物またはその子孫から 得られる繁殖材料。
[12] 請求項 5〜8のいずれか一項に記載の ADAM11遺伝子の対立遺伝子の一方が 破壊されてなる非ヒト遺伝子破壊動物の製造方法であって、
(a)非ヒト動物胚性幹細胞 (ES細胞）を、破壊された ADAMl 1遺伝子を含んでなる ポリヌクレオチドにより形質転換する工程；
(b)前記ポリヌクレオチドがそのゲノムに取り込まれた ES細胞を選択する工程；
(c)選択された ES細胞を非ヒト動物胚性細胞に導入する工程；
(d) ES細胞が導入された非ヒト動物胚性細胞を、野生型偽妊娠非ヒト雌性動物の生 殖器に移植して、キメラ動物を繁殖させる工程;および
(e)得られたキメラ動物と野生型非ヒト動物とを交配させ、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の一方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程
を含んでなる、製造方法。
[13] 請求項 1〜4、 7、および 8のいずれか一項に記載の AD AMI 1遺伝子の対立遺伝 子の双方が破壊されてなる非ヒト遺伝子破壊動物の製造方法であって、
(a)非ヒト動物胚性幹細胞 (ES細胞）を、破壊された ADAM11遺伝子を含んでなる ポリヌクレオチドにより形質転換する工程；
(b)前記ポリヌクレオチドがそのゲノムに取り込まれた ES細胞を選択する工程；
(c)選択された ES細胞を非ヒト動物胚性細胞に導入する工程；
(d) ES細胞が導入された非ヒト動物胚性細胞を、野生型偽妊娠非ヒト雌性動物の生 殖器に移植して、キメラ動物を繁殖させる工程；
(e)得られたキメラ動物と野生型非ヒト動物とを交配させ、 ADAM11遺伝子の対立 遺伝子の一方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程;および
(f)得られた非ヒト遺伝子破壊動物の雄と雌を交配し、 ADAM11遺伝子の対立遺伝 子の双方が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物を繁殖させる工程
を含んでなる、製造方法。
[14] 神経関連疾患の治療に用いられる物質もしくはその塩またはそれらの溶媒和物の スクリーニング方法であって、
(i)請求項 1〜4、 7、および 8のいずれか一項に記載の ADAM11遺伝子の対立遺 伝子の双方が破壊されてなる非ヒト遺伝子破壊動物の神経関連疾患の症状の程度 を測定する工程；
(ii)被検物質を前記非ヒト遺伝子破壊動物に投与する工程;および
(iii)被検物質投与後の前記非ヒト遺伝子破壊動物の神経関連疾患の症状の程度を 測定する工程
を含んでなる方法。
[15] 工程 (m)の後に、（iv)被検物質投与前の神経関連疾患の症状の程度と、被検物質 投与後の神経関連疾患の症状の程度とを比較する工程を更に含んでなる、請求項 1
4に記載のスクリーニング方法。
[16] 神経関連疾患が、協調運動障害、記憶障害、認知障害、学習障害、または痛覚障 害である、請求項 14または 15に記載のスクリーニング方法。
[17] ADAM 11タンパク質を含んでなる、 ADAMl l遺伝子の不活性化に起因する神 経関連疾患の治療に用いられる医薬組成物。
[18] ADAMl l遺伝子の不活性ィ匕に起因する神経関連疾患の治療に用いられる医薬 の製造のための、 ADAM 11タンパク質の使用。
[19] 治療上の有効量の ADAMl lタンパク質を哺乳類に投与する工程を含んでなる、
ADAMl l遺伝子の不活性ィ匕に起因する神経関連疾患の治療方法。
[20] ADAMl 1遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターを含有してなる、
ADAMl l遺伝子の不活性化に起因する神経関連疾患遺伝子治療剤。
[21] ADAMl 1遺伝子の不活性化に起因する神経関連疾患遺伝子治療剤の製造のた めの、 ADAMl 1遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入ベクターの使用。
[22] ADAMl 1遺伝子または ADAMl 1遺伝子を作動可能に連結してなる遺伝子導入 ベクターを哺乳類に投与する工程を含んでなる、 ADAM 11遺伝子の不活性化に起 因する神経関連疾患の治療方法。
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