WO2007001200A1 - Cellules dendritiques matures chargees d'un polylysat de tumeurs, et vaccin antitumoral a base desdites cellules - Google Patents

Cellules dendritiques matures chargees d'un polylysat de tumeurs, et vaccin antitumoral a base desdites cellules Download PDF

Info

Publication number
WO2007001200A1
WO2007001200A1 PCT/RU2005/000348 RU2005000348W WO2007001200A1 WO 2007001200 A1 WO2007001200 A1 WO 2007001200A1 RU 2005000348 W RU2005000348 W RU 2005000348W WO 2007001200 A1 WO2007001200 A1 WO 2007001200A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
tumors
polylysate
dendritic cells
tumor
Prior art date
Application number
PCT/RU2005/000348
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mikhail Valentinovich Kiselevsky
Yana Ivanovna Telnyuk
Rem Viktorovich Petrov
Olga Vyacheslavovna Smirnova
Adilya Rafik Kyzy Chervenko
Original Assignee
Obschestvo S Ogranichennoi Otvetsvennostyu 'rusgen'
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Obschestvo S Ogranichennoi Otvetsvennostyu 'rusgen' filed Critical Obschestvo S Ogranichennoi Otvetsvennostyu 'rusgen'
Priority to PCT/RU2005/000348 priority Critical patent/WO2007001200A1/ru
Publication of WO2007001200A1 publication Critical patent/WO2007001200A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464499—Undefined tumor antigens, e.g. tumor lysate or antigens targeted by cells isolated from tumor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]

Definitions

  • the present invention relates to the fields of medicine and veterinary medicine, in particular oncology, and can be used to prevent oncological diseases, in particular for “group risk” and “family forms)) of cancer, as well as to prevent the recurrence of a malignant neoplasm in an individual in need in this, after the antitumor treatment.
  • DC dendritic cells
  • Mature DCs for antitumor vaccines are most often obtained from CD 14+ monocytes by a 2-step procedure.
  • monocytes develop into immature DCs in the presence of granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4).
  • Immature DCs are highly capable of capturing antigens by macropinocytosis and phagocytosis (Keller, R. Depritis cells: th Candidair sigpifivicapse ⁇ ntended ⁇ réelleêtrionpd disansase. - Impol. Letters. 2001.- vol. 78.- p.
  • immature DCs are large, irregularly shaped cells that weakly or do not adhere to the plasticity, significantly expressing the co-stimulator CD86 (B7-2), weakly expressing the monocyte / macrophage marker CD 14 and the marker of mature DC83 CD83 (Haseb, H., Nagauama, H., Sato, K., Butpoto, M., Takeda, Y., Takahashi T. A., Nashppi K., Erigushi M. Dusfu ⁇ popioplégulátiop o otdepoved sé conclusionsdel . & Pharmacother. 2000.- vol. 54.- pp.
  • DCs significantly lose their ability to endocytize and process antigens.
  • mature DCs retain the ability to present immunogenic peptides that do not require prior processing inside the cell (Sallusto F., NiColo C, De Maria R., Corinti S., Testi R. Sericide iptact apdepreceptive Xperts. . 1996.- vol. 184.- N B. - R. 2411-2416).
  • Mature DCs stably express on their surface complexes of the molecules of the main histocompatibility complex (MHC) with peptides (Cella M., Engering A., Pinet V., Pietras A., Lapzavissia A. Ipflashtul stimuli induce accumulation of MHC class II complexes II. -Nature. 1997.- vol. 388.- p. 782-787). They also differ from immature DCs by the expression of characteristic markers of mature DCs - CD83 and DC-LAMP - a member of the family of membrane glycoproteins associated with lysosomes; in addition, the number of co-stimulating molecules increases significantly.
  • MHC main histocompatibility complex
  • immature DCs with tumor antigens should be incubated in the presence of stimuli leading to the maturation of DCs (Dhodarkar, MV, Bhardway, N. Assive Imaguizizatiof humaps with Deps. - J. Slip. Impol. 2000.- vol. 20.- p. 167-173).
  • OAA should include, first, oncogenic antigens viruses (liver carcinoma - hepatitis B and C viruses, cervical cancer - papilloma virus, Burkitt's lymphoma - Epstein-Barr virus, etc.), secondly, altered proteins resulting from somatic mutations, and thirdly, not antigens expressed in somatic tissues of an adult organism ( ⁇ -fetoprotein, telomerase), fourthly, normal antigens overexpressed by a tumor (antigens of melanoma and prostate cancer).
  • oncogenic antigens viruses liver carcinoma - hepatitis B and C viruses, cervical cancer - papilloma virus, Burkitt's lymphoma - Epstein-Barr virus, etc.
  • altered proteins resulting from somatic mutations and thirdly, not antigens expressed in somatic tissues of an adult organism ( ⁇ -fetoprotein, telomerase)
  • ⁇ -fetoprotein, telomerase normal antigens overexpressed by
  • the disadvantage of vaccines based on specific peptides or proteins is, firstly, that not all OAAs are already identified.
  • the tumor cell population is heterogeneous and some of the cells may not express a separate antigen (Dhodarkar, MV, Bhardwaj, N. Active immunity with humility spp. - J. Slip. Impol. 2000.- vol. 20.- p. 16. -173).
  • the tumor lysate obviously, contains a wide range of different antigens, including unknown OAAs.
  • Recently, a preliminary report appeared on the use of DCs transfected with total tumor RNA for the treatment of common forms of colon and lung cancer (Nair S. K., Morse M., Vozzkowski D., Curnming R.
  • DCs induced the development of CTLs that can specifically lyse a tumor.
  • the route of administration of DCs may affect their migration into lymphoid tissue and their immunogenicity.
  • a comparative study in mice suggests that DCs administered intravenously are less immunogenic than those administered subcutaneously (Larrip M.
  • HRT delayed-type hypersensitivity reaction
  • Another study involved 11 patients with a common form of melanoma in the GV stage (Thurper B., Haendle L, Roder C, Dieckmann D., Keikavousi R., Jopuleit H., Bender A., Maszek C, Schreiner D., vop d Driesh R., Vrosker EB, Steipmap RM, Epk A., Kampgen E., Sshuler G., Vassipatiop with mage-ZAl rertide-rulsed mature, moposute derived depdritis sell ehrapds sresifis sutotohis ipduses apd T sells some metastases regressiop ° F Ip GV stage advapsed melapoma .-- J.
  • a DC-based vaccine obtained by pulsation of mature DCs with a tumor lysate can be considered (Nouri-Shirázi M., Banchereau J., Fau J., Rulaska K., Dépritis cell based tumors, Irishpol. . 2000, - vol. 74.- p. 5-10).
  • the disadvantage of this method is the need to obtain tumor material from a particular patient to obtain a lysate, which is not always possible.
  • the tumor material may not be available due to the peculiarities of the localization of the tumor or with complete regression of the tumor after a successful antitumor treatment, such as chemo- or radiation therapy.
  • mice Another important aspect is the prevention of relapse after antitumor therapy, including chemotherapy, radiation therapy or radical surgical removal of the primary tumor site, when the tumor mass is significantly reduced.
  • antitumor therapy including chemotherapy, radiation therapy or radical surgical removal of the primary tumor site
  • experiments on mice have shown the efficacy of this vaccination method for preventing the recurrence of liver carcinoma after removal of the primary lesion (Homma S., Toda G., Gong X, Kufe D., Ohno T. Reveptive apitumotivit agapiutsoppsuppo b) immunity with ssiofs of dendritic cells and HCC sells ip mice. - J. Gastroeperol. 2001.- vol. 36.- p. 764-771).
  • the present invention provides mature dendritic cells, characterized in that they are derived from the mononuclear leukocytes of a mammalian individual and are loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors.
  • the mammal from which the dendritic cells are derived is a human.
  • the mammal is one of the domestic animals, such as cat, dog, horse.
  • the tumors from which the polylysate is obtained are selected from the group consisting of ovarian cancer, intestinal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, breast cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer.
  • the invention provides a method for producing mature dendritic cells from mononuclear leukocytes of an individual being a mammal, loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors, comprising the steps of: a) isolating mononuclear lymphocytes from an individual; b) incubation of isolated mononuclear lymphocytes with growth factors to obtain immature dendritic cells from them; c) obtaining a polylysate of tumors; g) processing the resulting immature dendritic cells with a tumor polylyzate; e) the induction of maturation of immature dendritic cells treated with tumor polylysate into mature dendritic cells loaded with tumor polylysate.
  • the mammal from which the dendritic cells are derived is a human.
  • the mammal is one of the domestic animals, such as a cat, dog, horse.
  • mononuclear leukocytes are isolated from the peripheral blood of an individual.
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 Interleukin-4
  • the tumors from which the polylysate is obtained are selected from the group consisting of ovarian cancer, intestinal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, breast cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer.
  • the polylysates are obtained by repeating three times the freezing and thawing of the crushed tumor in distilled water and subsequent filtration through a sterilizing filter.
  • the maturation induction is carried out using
  • the invention provides an antitumor vaccine, characterized in that it contains an effective amount of mature dendritic cells derived from the mononuclear leukocytes of a mammalian individual and loaded with a polylysate of tumors of various origin derived from at least two types of tumors and physiologically acceptable carriers, excipients or other additives.
  • the anti-tumor vaccine further comprises at least one immunomodulator.
  • an immunomodulator is polyoxidonium.
  • the mammal from which the dendritic cells are derived is a human.
  • the mammal is one of the domestic animals, such as a cat, dog, horse.
  • the tumors from which the polylysate is obtained are selected from the group consisting of ovarian cancer, intestinal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, breast cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer.
  • an antitumor vaccine is used to prevent a malignant neoplasm in an individual in need thereof, the malignant neoplasm to be prevented being of the same type as at least one of the tumors used to produce the polylysate.
  • an antitumor vaccine is used to prevent a relapse of a malignant neoplasm in an individual in need thereof after an antitumor treatment, the malignant neoplasm to be prevented from relapsing is of the same type as at least one of the tumors used to produce the polylysate.
  • an antitumor vaccine is used to prevent a malignant neoplasm in an individual at risk or predisposed to “family forms” of cancer, moreover, the forms of cancer to be prevented are of the same types as the tumors used to produce the polylysate.
  • a further aspect of the present invention is the use of mature dendritic cells derived from the mononuclear leukocytes of an individual being a mammal and loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors, or an antitumor vaccine, which is one aspect of the present invention, for the manufacture of a medicament for the prevention of malignant neoplasms in an individual in need of this, and the malignant neoplasm to be prevented is of the same type, then at least one of the tumors used for polilizata.
  • this aspect essentially relates to a method for the prevention of malignant neoplasms in a mammal in need thereof, which comprises administering an effective amount of dendritic cells derived from mononuclear leukocytes of said individual and loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors, or an antitumor vaccine, which is one of the above aspects of the present invention, the malignant neoplasm to be prevented Azovation is of the same type as at least one of the tumors used to produce the polylysate.
  • the mammal from which the dendritic cells are derived is a human.
  • the mammal is one of the domestic animals, such as a cat, dog, horse.
  • the tumors from which the polylysate is obtained are selected from the group consisting of ovarian cancer, intestinal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, breast cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer.
  • Another aspect of the invention is the use of mature dendritic cells derived from the mononuclear leukocytes of an individual being a mammal and loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors, or an antitumor vaccine, which is one aspect of the present invention, for the manufacture of a medicament for preventing relapse of a malignant neoplasm in the specified an individual in need of it after antitumor treatment, and the relapse prevention of the malignant neoplasm is of the same type as at least one of the tumors used to produce the polylysate.
  • this aspect essentially relates to a method for preventing a relapse of a malignant neoplasm in a mammal in need thereof, which comprises administering an effective amount of dendritic cells derived from mononuclear leukocytes of the indicated individual and loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors , or an antitumor vaccine, which is one of the above aspects of the present invention, moreover, to prevent relapse okachestvennoe tumor are of the same type as at least one of the tumors used for polilizata.
  • the mammal from which the dendritic cells are derived is a human.
  • the mammal is one of the domestic animals, such as a cat, dog, horse.
  • the tumors from which the polylysate is obtained are selected from the group consisting of ovarian cancer, intestinal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, breast cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer.
  • another aspect of the present invention is the use of mature dendritic cells derived from the mononuclear leukocytes of a mammalian individual and loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors, or an antitumor vaccine, which is one aspect of the present invention, for the manufacture of a medicament for the prevention of malignant neoplasms in an individual belonging to a risk group or predisposed to “family forms” of cancer, moreover, to be prevented some forms of cancer are of the same types as the tumors used to produce the polylysate.
  • this aspect essentially relates to a method for the prevention of malignant neoplasms in an individual in need thereof, a mammal belonging to a risk group or predisposed to “family forms” of cancer, which comprises administering an effective amount of dendritic cells derived from mononuclear cells leukocytes of the indicated individual and loaded with a polylysate obtained from at least two types of tumors, or an antitumor vaccine, which is one of the aspects of the present invention discussed above, the forms of cancer to be prevented belong to the same types as the tumors used to obtain the polylysate.
  • the mammal from which the dendritic cells are derived is a human.
  • the tumors from which the polylysate is obtained are selected from the group consisting of ovarian cancer, intestinal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, breast cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer.
  • the advantage of the mature DCs of the present invention and the antitumor vaccine (multivaccine) based on them compared with existing variants of monovaccines is the possibility of their use in prophylactic regimens in mammals with a high risk of malignant neoplasms.
  • Another advantage of the present invention is the possibility of individual selection of the composition of the tumor cell polylysate for specific patients, depending on the likelihood of a particular type of cancer.
  • Another advantage of DCs loaded with a polylysate, and the vaccine based on them is the simultaneous protective effect against several types of tumors, which allows the use of this method for the prevention of cancer.
  • FIG. 1 Histograms reflecting expression levels of mouse DC surface markers. The abscissa axis is the signal intensity for this parameter. The ordinate axis represents the number of events.
  • FIG. IA Level of expression of MHC I.
  • FIG. IB MHC II expression level.
  • FIG. 1C Level of expression of CD80.
  • FIG. ID CD86 expression level.
  • FIG. IE CD34 expression level.
  • FIG. 2 Histograms reflecting expression levels of human DC surface markers.
  • the abscissa axis is the signal intensity for this parameter.
  • the ordinate axis represents the number of events.
  • FIG. 2B CDIa expression level.
  • FIG. 2C Level of expression of CD83.
  • FIG. 2D Level of expression of CD40.
  • FIG. 2E Level of expression of CD80.
  • FIG. 2F CD86 expression level.
  • FIG. 2G Level of expression of MHC I.
  • FIG. 2H Level of expression of MHC II.
  • FIG. 3 Dendritic cells, hematoxylin-eosin staining, 900 magnification.
  • FIG. 4 Electron micrograph of dendritic cells, magnification 9000.
  • mature dendritic cells refers to DCs that are capable of active presentation of immunogenic peptides and do not have pronounced phagocytic activity (Sallusto F., Nicolo C, De Mari R., Corpti S., Testi R. Sericide iptits drug apprpreceptatiop bu deppiti motherboard slls. - J. Exp. Med. 1996.- vol. 184.- N 6.- p. 2411-2416).
  • Mature DCs stably express on their surface the complexes of molecules of the main histocompatibility complex (MHC) with peptides (Cella M., Engering A., Pinet V., Pietras A., Lapzavessia A. Iplumata stulgauli IIcumisum II. - Nature. 1997.- vol. 388.- p. 782-787). They also differ from immature DCs in the expression of characteristic markers of mature DCs - CD83, in addition, the number of co-stimulating molecules increases significantly. On the surface of mature DCs, the number of adhesive molecules CD54 and CD58 increases, which promote interaction with T-lymphocytes (Keller R.
  • MHC main histocompatibility complex
  • peptides Cella M., Engering A., Pinet V., Pietras A., Lapzavessia A. Iplumata stulgauli IIcumisum II. - Nature. 1997.- vol. 3
  • the term “load” or “spray” refers to the contact of immature dendritic cells with tumor lysate, in which, after transformation into mature dendritic cells as a result of induced maturation, they become able to efficiently present tumor antigens on their surface and induce the development of T- cellular response to them.
  • an effective amount refers to the number of dendritic cells or vaccines of the present invention that is sufficient to provide the desired effect on the condition, in the connection with which they are introduced to the individual. The exact amount will depend on the specific circumstances and can be estimated by a person skilled in the art using known techniques. Typically, the amount should be able to have a prophylactic effect on the development of a malignant neoplasm or to prevent the development of a relapse of a malignant neoplasm after antitumor treatment. It will be clear to a specialist that the effective amount will depend on the type of cancer, the mode of administration, whether dendritic cells or the vaccine are administered on their own or in combination with other drugs, the general state of health of the individual.
  • pharmaceutically acceptable or“ physiologically acceptable) in the context of the present description refers to such a carrier, solvent, excipient, immunomodulator, adjuvant or any other targeted additive that does not cause any undesirable side effects to the individual to whom they are administered, as well as not negatively affect the viability of the dendritic cells of the present invention and do not interfere with their implementation of the target biological function - the presentation of tumor antigens to the immune system when introduced into hm of the individual.
  • pharmaceutically and physiologically acceptable means well known in the art (see, e.g., Remington's Rharmaseutisal Ssiepses 18 minutes editiop, AR Gepparo, Ed, Mask Rublishipg Somrapu - 1990;.. Napdbook ° F Rharmaseutisal Ehsiriepts, Z gd editiop, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutal Press - 2000).
  • a polylysate in the context of this application refers to a lysate obtained from at least two samples of tumors belonging to different types.
  • a polylysate may include, for example, a lysate obtained from tumor tissue of an ovarian cancer, and a lysate obtained from tumor tissue of a mammary gland.
  • the composition of the polylysate may include lysates obtained from 3, 4, 5 or more different types of tumors without limitation.
  • a standard method for producing dendritic cells suitable for use within the framework of the present invention is a two-stage method for producing from CD 14+ monocytes isolated from peripheral blood (Dhodarkar, MV, Bhardwaj, N. Active immunity with disease cells - J. Slip. Immol. 2000.- vol. 20.- p. 167-173).
  • monocytes develop in immature DC in the presence of granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • GM-KSF GM-KSF
  • Interleukin-4 IL-4
  • Isolation of MH leukocytes from peripheral blood can be carried out in various ways, for example, by centrifugation in a sucrose gradient, by centrifugation in a single-stage ficoll gradient.
  • the blood is stabilized with preservatives commonly used for these purposes, such as, for example, heparin, sodium citrate, EDTA.
  • Cultivation of MH leukocytes is carried out in a standard culture medium known to a person skilled in the art, for example in RPMI or DMEM with 10% human patient serum (or AB serum of the donor) in disposable plastic bottles, for example, 250 ml of CostaG company, or similar bottles other firms.
  • various cytokines can be used, for example, a combination of type 1 interferons (IFN-I) and GM-CSF (DC-IFN) or a combination of granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL -four).
  • IFN-I type 1 interferons
  • DC-IFN GM-CSF
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony-stimulating factor
  • IL -four interleukin-4
  • Preferred in accordance with the present invention is the use of a combination of GM-CSF and IL-4.
  • the method of obtaining DC from mononuclear leukocytes of peripheral blood is the most preferable, since it allows to obtain a sufficient amount of DC from 50-100 ml of peripheral blood, which greatly simplifies the procedure for collecting DC precursors by means of bone marrow puncture or hardware separation of blood.
  • dendritic cells of mammals can be obtained directly from the blood using gradient centrifugation (Hsu F. X, Wepike C, Fagnoni F., Liles TM, Czerwipski D., Taidi B., Englemann EG, Levu R. Vassiptiop schreibf rats with B-cell lumphoma uspg auto-logic aptpe-pulsed cells. - Nat. 1996.- vol. 392.- p. 245-252).
  • gradient centrifugation Hsu F. X, Wepike C, Fagnoni F., Liles TM, Czerwipski D., Taidi B., Englemann EG, Levu R. Vassiptiop *** rats with B-cell lumphoma uspg auto-logic aptpe-pulsed cells. - Nat. 1996.- vol. 392.- p. 245-252).
  • DCs can also be obtained from CD34 + bone marrow or blood precursors. Differentiation of DC from precursors occurs during rather long (about 2 weeks) incubation in the presence of GM-CSF and TNF- ⁇ (Saux C., Massaser S, Deserveter B., Jacquer B., D. Smith, Numap with Lapgerhaps Cells and Vitro Epom CD34 + Progapit Sap Rime CD4 + T Cells Apropos Complete Appl. - J. Immol. 1995.- 54, p. 155.
  • DC output can be increased by adding stem cell factor (FSK) or Flt- ⁇ L (Sauh S, Vapbervilet V., Massacer S, Dezutter-Damuap S, de
  • DCs can be obtained from mononuclear leukocytes of the spleen by means of its mechanical grinding and subsequent centrifugation in a density gradient of ficoll.
  • Obtaining a polylysate of tumors can be carried out in various ways. It is most preferable to obtain a lysate by repeating three times the freeze-thaw cycle in distilled water in a ratio of a suspension of tumor cells and water of about 1: 10 and subsequent filtration through a sterilizing filter.
  • the freezing is preferably carried out at a temperature of from about minus 50 ° C to about minus 96 0 C.
  • the thawing is preferably carried out at a temperature of about 20-25 ° C.
  • the filter can be used nitrocellulose, polyvinylidene difluoride, from cellulose acetate with a pore diameter of 0.22 ⁇ m. Possible homogenization in physiological saline (0.9% NaCl), sonication.
  • the ratio of tumor to saline is about 1: 5.
  • surgical material punctate, biopsy specimen, malignant effusions cultured in vitro strain of tumor cells can be used.
  • the material is preferably stored at a temperature of from about minus 5O 0 C to about minus 96 0 C until a lysate is obtained.
  • a polylysate is obtained by mixing lysates obtained from various individual types of tumors.
  • the polylysate contains at least two types of different histological variants of tumors selected from the group consisting of ovarian cancer, intestinal cancer, cancer of the esophagus, stomach cancer, breast cancer, melanoma, kidney cancer, lung cancer.
  • the prepared polylysate is stored at a temperature of from about minus 50 ° C to about minus 96 0 C.
  • the polylizate can also be stored in a freeze-dried state, which provides greater convenience in storage and transportation over long distances, as well as a longer shelf life. Lyophilized dried polylysate immediately before use is restored by adding a suitable solvent, for example, sterile water, saline, PBS or TBS.
  • a polylysate can also be prepared exterr from lysates obtained from individual tumors by mixing them.
  • a polylyzate is used at the rate of 0.1 cm 3 per lmn. DK. Incubation of DC with polylysate is carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C and 4.5% CO 2 for about 24 hours.
  • Maturation of DC can be induced under the influence of a number of factors: bacteria (living or dead), bacterial products (LPS), viruses, double-stranded RNA or its analogue field-I: C, heat shock protein gp9b, pro-inflammatory factors and their combinations ( ⁇ JI- l ⁇ , TNF- ⁇ , IL-b, prostaglandin-E2 (PGE-2)) and ligand CD40 (CD40L) (Dhodarkar MV, Steinman RM, Sarr M., Desai H., Fossella S, Krasovsku I, Donahoe SM, PR, Segapollo V., Nihop DF, Bhardwaj N.
  • DCs treated with a tumor antigen in the presence of factors that increase its immunogenicity are able to effectively present the antigen and cause the development of T-cell immune response to it, which was shown in a number of vitro studies, in animal experiments and in experiments on healthy volunteers (Schep Z., Dehm S., Bonham K., Kamencic H., Juulgipk B., Zhang X., Gordon JR, Xiang JS DNA arrau apd biological northh Vintageréesstansr perennial H., Juulgipk B., Zhang X., Gordon JR, Xiang JS DNA arrau apd biological northh Corporationreriest Foodr;taniop adopted .
  • proinflammatory factors IL-l ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6
  • PGE-2 prostaglandin-E2
  • Preferred in accordance with the present invention is the maturation under the influence of TNF- ⁇ , which is used at a concentration of about 20 ng / ml
  • DCs obtained from monocytes / macrophages of peripheral blood or mammalian bone marrow cells during incubation with growth factors have characteristic features of the morphological structure and ultrastructure.
  • DKs have a high antigen-presenting ability and antitumor vaccines can be obtained on their basis.
  • immature dendritic cells obtained under extracorporeal conditions among which no more than 30% express terminal differentiation markers and costimulatory molecules (CD83, CD86, CD80), are incubated with tumor lysate and DC maturation induction factors for about 1 day. and mature pulsed DCs with tumor antigens are obtained, among which at least 30% express markers CD83, CD86, CD80.
  • Mature dendritic cells of the present invention can be obtained ex tempore, i.e. before their introduction is planned to the individual in need of it.
  • the DC of the present invention can be obtained in advance and stored until they are used frozen at a temperature of from about minus 50 ° C to about minus 96 ° C.
  • additional agents for example, cryoprotectants, can be added to the cell suspension.
  • cryoprotectants it is preferable to use pharmaceutically acceptable agents such as dimethyl sulfoxide, glycerin. Frozen cells are stored in separate aliquots.
  • vaccines can be prepared by diluting them in physiologically acceptable solvents with the addition of preservatives and adjuvants.
  • Mammals to which the present invention extends are not limited to any particular species.
  • this invention relates primarily to people suffering from malignant tumors or in need of cancer prevention diseases.
  • the present invention provides a variety of veterinary applications. It is assumed that the most important species of mammals from the point of view of the implementation of this invention will be, but not limited to, such domestic animals as cats, dogs, horses.
  • the antitumor vaccines of the present invention may also contain physiologically acceptable solvents, excipients, excipients and other targeted additives.
  • physiologically acceptable solvents include substances for maintaining osmotic pressure, buffers, preservatives, cryoprotectants, chelating agents.
  • vaccines may contain tonicity agents such as sucrose, glucose, sodium chloride, polyglucin, reopoliglukin, as well as polyhydric sugar alcohols such as glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol, or mannitol.
  • tonicity agents such as sucrose, glucose, sodium chloride, polyglucin, reopoliglukin, as well as polyhydric sugar alcohols such as glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol, or mannitol.
  • the vaccines of the present invention may contain physiologically acceptable buffering agents, such as Heps, phosphate, citrate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate or histidine buffers, as well as combinations thereof.
  • physiologically acceptable buffering agents such as Heps, phosphate, citrate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate or histidine buffers, as well as combinations thereof.
  • cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide and glycerin, can be included in the composition of the vaccine.
  • EDTA As a chelating agent, for example, EDTA can be used.
  • Preservatives such as various antibiotics or mixtures thereof, such as gentamicin, a mixture of penicillin and streptomycin, may also be included in vaccines to prevent bacterial infection.
  • the vaccine may also contain various adjuvants and immunomodulators.
  • the vaccine of the present invention contains an immunomodulator and adjuvant such as polyoxidonium.
  • Vaccines intended for the administration of ip vivo should be in a sterile condition.
  • components such as solvents, fillers, excipients, other target additives, their sterilization can be carried out by methods known to those skilled in the art, such as, for example, autoclaving at elevated temperatures, sterilization by filtration through a filter with a pore diameter of 0.22 ⁇ m.
  • the cultivation of dendritic cells and all manipulations with them are carried out in compliance with all the necessary sterility requirements, as is known to a person skilled in the art.
  • the vaccine of the present invention is well tolerated.
  • the mature dendritic cells or vaccine of the present invention can be administered subcutaneously, intravenously, intraperitoneally, into healthy lymph nodes 3-5 times with an interval of 2 weeks.
  • Most preferred in the framework of the present invention is the intradermal administration of DCs, in which DCs most efficiently reach the lymph nodes (Morse MA, Coleman RE, Akabani G., Niehaus N., Coleman D., Lourl H. K. Migratiop hum humiditus sells aftere Ip raties with metastatis maligapapsi. - Sapser Res., 1999, vol. 59, p. 56-58).
  • a single dose for a person is from about 5 to about 100 million cells.
  • mice model animals
  • revaccination rate required to maintain a protective effect
  • Vaccination with dendritic cells loaded with tumor polylysate, or vaccines derived from them significantly increases the killer activity of mouse lymphocytes against the cells of the tumors from which the polylysate was obtained, and causes inhibition of tumor growth.
  • the maximum protective effect approaching 100%, is achieved only with a minimum tumor mass (after antitumor therapy, including chemotherapy, radiation therapy, surgical removal of the tumor focus) or in a preventive mode.
  • antitumor therapy including chemotherapy, radiation therapy, surgical removal of the tumor focus
  • the most appropriate is the prophylactic use of mature dendritic cells or vaccines of the present invention in individuals, in need of this, after radical operations to remove the primary focus in order to prevent relapse and to prevent the development of malignant neoplasms, in particular in individuals at risk and predisposed to “family forms” of cancer.
  • DC and vaccines of the present invention can be used for prophylactic purposes in individuals with familial forms of cancer, in regions with increased radiation: background and under other adverse environmental conditions and occupational hazards.
  • familial forms of cancer breast and ovarian cancer most often occur simultaneously, and binary vaccines based on tumor lysates of this localization should be used for this category of patients.
  • the present invention provides for the use of a polylyzate of at least two tumors of different localization.
  • the content of each of the types of malignant neoplasms should be at least 2 samples.
  • the introduction of DC loaded with polylysate and vaccines based on them can induce antitumor immunity in healthy subjects against the main types of tumors.
  • the main “risk” groups can be vaccinated: people over 50 years old, patients with chronic inflammatory and precancerous conditions, exposed to occupational hazards and living in adverse environmental conditions, people with genetic predispositions for malignant neoplasms, etc.
  • a bank can be created for these purposes.
  • various tumors including at least 80% of the main variants of malignant neoplasms.
  • specialized polylysates for the prevention of tumors of the female reproductive sphere, gastrointestinal tract, etc.
  • DK loaded with a polylyzate obtained on the basis of a bank of the main types of tumors, or vaccines based on such DK can be used prophylactically in individuals without signs of a tumor process. Repeated administration courses with an interval of 3-5 years can maintain an immune response for a long time.
  • the dendritic cells and vaccines of the present invention can be used to prevent the recurrence of cancer in mammals after carried out antitumor treatment, when there is no possibility of obtaining individual tumor material for pulsation of dendritic cells or the preparation of vaccines.
  • dendritic cells and vaccines of the present invention can also be used to prevent cancer in mammals with various forms of precancerous conditions (chronic inflammatory diseases).
  • Example 1 The selection of mononuclear leukocytes (MHJI) from peripheral blood
  • MHJI is isolated from heparin-stabilized (25 units / ml) peripheral blood on a single-stage ficoll gradient (density 1.077 g / cm 3 ) by centrifugation at 400 g for 30 minutes. Lymphoid cells forming an interphase ring are pipetted and washed three times in 199 medium. After each washing in a 10-fold volume of medium, the cells are pelleted by centrifugation at 200 g.
  • Example 2 Laboratory animals and the isolation of tumor cells, obtaining dendritic cells
  • mice weighing 20-23 g contained in vivarium conditions.
  • cells are implanted subcutaneously at a dose of 500 thousand / mouse.
  • tumor nodes were determined at the injection site; after a week, the mice were sacrificed by intravenous administration of hexenal in an apnetic dose.
  • the hair is plucked out, the skin is treated with 70% ethanol and cut with a sterile instrument.
  • the tumor node is removed and placed in a sterile Petri dish with Hanks medium.
  • the tumor is ground with scissors, and then thoroughly pipetted to obtain a cell suspension.
  • RPMI 1640 supplemented with (HEPES, L-glutamine, gentamicin) at a concentration of 1 million / ml. Some cells are transplanted into mice, and the rest are placed in culture bottles supplemented with 10% fetal serum and incubated in
  • the culture medium is replaced every 2 days.
  • Cultured melanoma B 16 cells are used to test the cytotoxic activity of mouse lymphocytes and implantation in mice. For these purposes, the culture medium is drained from the vials, melanoma cells adhering to the plastic are poured with a versene solution and placed in a CO 2 incubator for 10-15 minutes. Detached cells are washed twice in RPMI 1640 medium and used in a cytotoxic test or for administration to mice.
  • Dendritic cells are generated from the bone marrow and spleen of mice.
  • the femurs and spleen are removed (after administration of hexenal).
  • the bone marrow canal is washed with RPMI 1640 medium, the spleen is ground under sterile conditions.
  • the resulting cell suspension is layered on a density gradient of ficoll-verogarfin (or ficoll-cancer) 1,088 and centrifuged at 1,500 rpm for 30 minutes.
  • the resulting interphase ring of cells is harvested, washed twice by centrifugation and resuspended in complete culture medium with 10% fetal serum at a concentration of 1 million / ml.
  • GM-CSF and IL-4 are immediately added to the bone marrow MHJI, and the spleen MHK is incubated for 24 hours in a CO-incubator, then the non-adhering lymphocytes are drained. The adherent growth factors are added to adherent monocytes. Every 2 days medium is replaced and growth factors are added. For 6 days. Tumor lysate and full name OS are added to dendritic cells. The lysate is obtained by freezing and thawing the melanoma tumor cells three times. Spleen lymphocytes are used for a cytotoxic test.
  • Blb tumor cells and Ehrlich tumors are injected subcutaneously in mice at a dose of 50 thousand / mouse. Tumor nodes are removed and tumor cells are isolated as described in Example 2. Some cells are transplanted into mice, and the rest are placed in culture bottles with RPMI-1640 nutrient medium supplemented with 10% fetal serum and incubated in a CO 2 -incubator. The culture medium is replaced every 2 days. Cultured Blb melanoma cells and Ehrlich tumors are used to test the cytotoxic activity of mouse lymphocytes and implantation in mice. Dendritic cells are generated from the bone marrow and spleen of mice as described in Example 2 using growth factors and TNF- ⁇ . Tumor lysate is obtained by freezing and thawing melanoma tumor cells three times. Spleen lymphocytes are used for a cytotoxic test.
  • mice were immunized three times with an interval of 2 weeks with a vaccine. 2 months after immunization with a DC vaccine, mice are infected with cells of melanoma B-16 and ovarian cancer CaO-I (subcutaneous), Ehrlich carcinoma (intraperitoneal) at a dose of 50 and 100 thousand / mouse.
  • CaO-I subcutaneous
  • Ehrlich carcinoma intraperitoneal
  • Evaluation of the effect of the drug on tumor growth is carried out by recording differences in tumor growth rate.
  • the tumor growth rate is estimated by its volume.
  • the calculation of the tumor volume is carried out according to the formula:
  • V av 2 (srvc), where a is the largest tumor diameters in mm.
  • TPO Tumor growth inhibition
  • V counter where the K ontp V - is the volume of the tumor in the control, V 0n - tumor volume in the experimental group. Tumor volume is measured at 14 and 30 days. after transplantation.
  • the phenotype of dendritic cells is determined by flow cytometry on a cytometer manufactured by Vestop Dirivipsop, USA using FITC (fluorescein isothiocyanate) and / or PV (phycoerythrin) labeled antibodies from ⁇ ltag, USA.
  • Vaccination schedule Dendritic cells are injected intradermally in 200 ⁇ l of the medium three times every three days, after a week tumor cells are introduced.
  • the control group of animals is injected intradermally with a tumor lysate. Each group includes 8-10 animals.
  • NK activity is determined on line K-562.
  • Autologous tumor cells are used to determine the antitumor activity (cytotoxicity) of MHK. Tumor cells (1x10 4 in 1 ml) are incubated in a culture medium with MHK (1: 5 ratio) in flat-bottomed 96-well microplate 18 hours. Then, MTT vital dye is added to the wells, and the percentage of tumor cell lysis (percentage of cytotoxicity) is calculated from the optical density measured on a Miltisap MCC-340.
  • DCs are obtained in culture from peripheral blood MHK when they are incubated with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and Interleukin-4 (IL-4) in RPMI 1640 for 6 days.
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IL-4 Interleukin-4
  • 20 ng / ml IL-4 and 80 ng / ml GM-CSF were added.
  • 1 ml was collected and fresh medium containing cytokines was added.
  • cell cultures are washed with 199 medium. After each washing in a 10-fold volume of medium, cells are precipitated by centrifugation at 200 g.
  • DC were collected from a Petri dish and centrifuged for 10 minutes with 40Og. Then the cells were returned to the same Petri dish with fresh culture medium containing 20 ng / ml TNF- ⁇ and 250 ng / ml prostaglandin E 2 and cultured for another 2 days.
  • the expression of surface markers of MNL is determined using monoclonal antibodies against the corresponding antigens (Saltag Laboratories, USA), the results are taken into account by flow cytometry using a FACSap flow pytometer (Vestop Diskkshop, USA).
  • the levels of expression of the differentiating antigens CD3, CD4, CD8, CD 16 are examined; activation antigens CD25, CD38, HLA-DR; adhesion molecules CD57, CD58.
  • the gate (window) of the cell population is established based on a combination of direct and side light scattering and cell size. When taking into account the results, 10,000 events in the gate are counted.
  • Statistical processing of the results is carried out using the WINMDI 2.8 software package. (Figs. 1 and 2).
  • a population of adherent cells (monocytes, macrophages) is determined.
  • GM-CSF and JI-4 as described in Example 5, to 5-6 days.
  • large cells are generated with characteristic processes (immature dendritic cells).
  • TNF is added, DCs practically do not change their morphological properties, however, they lose their ability to proliferate.
  • Morphological studies show that human DCs are giant cells with a foamy cytoplasm filled with vacuoles, with an activated Golgi apparatus and a significant amount of mitochondria.
  • DCs have characteristic outgrowths on the cytoplasm - dendritic processes.
  • DCs have a characteristic phenotype: a low level of expression of CD14, and a high level of expression of co-stimulating molecules CD40, CD80, CD86, as well as expression of CD83 molecules characteristic of DC.
  • Fig. 4 large cells have round and irregular nuclei with diffuse chromatin and small single nucleoli.
  • the nuclei are located predominantly eccentrically.
  • the cytoplasm occupies the main part of the cell, contains vacuoles, mitochondria, ribosomes, structures of rough and smooth endoplasmic reticulum, lysosomes are found in single cells.
  • On the surface of the cells there are often long, rarely short, thin interwoven processes. Sometimes the processes form an irregular protrusion of the cytoplasm.
  • Next to some large cells are small single cells with hyperchromic nuclei and a process plasma membrane (monocytes).
  • the proliferative activity of DCs obtained as described in Example 5 from mononuclear cells is evaluated in a colorimetric test using the vital dye Alamar-Vlue under sterile conditions using a laminar box with a horizontal air flow (Juap VFS 906).
  • the cell suspension medium is added to the wells of a 96-well flat-bottom plate (Costar), 200 ⁇ l per well.
  • BP-4 in the concentration range from 3 to 20 ⁇ g / ml and / or cisplatin at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • the tablets are placed in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). Cells are incubated in the presence of these drugs for 72 hours.
  • the optical density is measured after a four-hour incubation at 37 ° C, 5% CO 2 on an MS 340 multiscan (Labystem, Finland) at a wavelength of 530 nm and 590 nm and is expressed in arbitrary units (cu) of optical density.
  • the stimulation index (IS) is calculated, which is the ratio of the proliferative activity of DC to the proliferative activity of inactive macrophages.
  • Spontaneous proliferative activity of human macrophages was 0.838 ⁇ 0.180 cu (Table 3, group 1).
  • growth factors IL-4 and GM-CSF were added to the culture medium, the proliferative activity of the generated DC cells increased to 1.682 cu (group 3).
  • TNF was added to DC, a decrease in the proliferative response was noted as a factor for their maturation.
  • Macrophages 10 b 0.838 ⁇ 0.180
  • HC - stimulation index the ratio of the proliferative activity of DC to the proliferative activity of intact macrophages. Reliability of the difference between the groups: * p ⁇ 0.05.
  • Example 11 The ability of dendritic cells to produce TNF and IL-12
  • cytokines The production of cytokines is determined by ELISA on Multisap MC-340 (Finland) using the test systems of the company BIOSourse. The level of cytokines is determined in the culture medium of intact macrophages, immature and mature DCs of humans and mice.
  • DCs are active producers of the chemotactic and regulatory peptide IL-12, which is able to recruit lymphocytes to a specific area, activate them, and trigger a proliferative response.
  • lymphocytes obtained from the spleen of mice at various stages of vaccination with pulsed lysate of melanoma B16 dendritic cells in doses from 100 thousand to 1 mln are used. Part of the mice are killed 3 days after each pulsation and before implantation of the tumor. Lymphocytes are isolated from the spleen and incubated with tumor cells to determine cytotoxic activity.
  • the optimal dose for vaccination is 1 million pulsed dendritic cells, a further increase in dose does not lead to an increase in the cytotoxic activity of lymphocytes, the maximum killer activity of lymphocytes is noted after 2-3 vaccinations.
  • Table 7 Cytotoxic activity of lymphocytes after vaccination of mice (%)
  • Example 13 Assessment of the effectiveness of vaccination doses of melanoma cells.
  • various vaccination doses of tumor cells are administered and the percentage of death of animals in each group is determined to determine the absolutely lethal dose of tumor cells.
  • Example 14 Evaluation of the activity of DC vaccines in mice inoculated with melanoma
  • a vaccine dose of 1 million dendritic cells / mouse was used, which, as demonstrated in Example 7, is the optimal dose, and various vaccination doses of tumor cells.
  • Example 15 Evaluation of the antitumor activity of a binary vaccine based on dendritic cells pulsed with a polylysate containing a mixture of lysates of tumor cells of melanoma B 16 and Ehrlich tumor
  • mice C57 Bl mice were injected with auto vaccine three times with an interval of 2 weeks, then after 2 weeks.
  • tumor cells are administered at a dose of 50 thousand / mouse (one group of Ehrlich tumor cells, the second - melanoma B16 and the control group - physiological saline).
  • spleens are removed in some mice, lymphocytes are isolated and their cytotoxicity is determined on tumor cells of melanoma and Ehrlich tumor.
  • lymphocytes of intact mice are used.
  • a vaccine (binary vaccine) based on dendritic cells pulsed with a polylysate containing a mixture of lysates of tumor cells of melanoma B16 and Ehrlich tumor significantly increases the antitumor killer activity of lymphocytes isolated from the spleen of vaccinated mice in relation to cells melanoma B 16 and Ehrlich tumors and practically does not affect the spontaneous cytotoxicity of lymphocytes in relation to ovarian cancer cells.
  • Example 16 Evaluation of the antitumor activity of a binary vaccine based on dendritic cells pulsed with a polylysate containing a mixture of lysates of Ehrlich tumor tumor cells and CaO-I ovarian cancer
  • Example 17 Evaluation of the delayed efficacy of a binary vaccine.
  • the delayed efficacy of a binary vaccine in mice with inoculated tumors of melanoma B-16 and Ehrlich carcinoma is assessed after 1-3 months. after the last vaccination.
  • the percentage of inhibition of tumor growth is determined on the 14th and 20th day after the inoculation of the tumor compared with the control, with different periods of introduction of tumor cells.
  • Table 13 The percentage inhibition of tumor growth after inoculation of the tumor compared with the control, after 1 month. after vaccination with a binary vaccine
  • Table 14 The percentage inhibition of tumor growth after inoculation of the tumor compared with the control, after 2 months. after vaccination with a binary vaccine
  • Table 15 The percentage inhibition of tumor growth at 14 and 20 days after inoculation of the tumor compared with the control, after 3 months. after vaccination with a binary vaccine
  • Table 16 The data obtained (Table 16) indicate that repeated vaccinations enhance the protective effect of the DC vaccine, which weakens by 3 months. after the first vaccination cycle.
  • the most optimal area of application of DC vaccines is the prevention of malignant neoplasms, in particular in risk groups, and the prevention of relapse of the disease after antitumor treatment.
  • the main problem for obtaining prophylactic vaccines is the absence or inaccessibility of autologous tumor material.
  • polylysates of those histological variants of cancer, the occurrence / relapse of which is most likely in a given patient or animal, can be used.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

ЗРЕЛЫЕ ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ, НАГРУЖЕННЫЕ ПОЛИЛИЗАТОМ ОПУХОЛЕЙ, И ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ ВАКЦИНА НА ИХ ОСНОВЕ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к областям медицины и ветеринарии, в частности — онкологии, и может быть использовано с целью профилактики онкологических заболеваний, в частности у «гpyпп pиcкa» и при «ceмeйныx формах)) рака, а также предупреждения рецидива злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, после проведенного противоопухолевого лечения.
Уровень техники
В последние годы исследователи различных специальностей уделяют большое внимание изучению противоопухолевого действия вакцин на основе дендритных клеток (ДК). Природа этого феномена связана со способностью ДК презентировать опухолевые антигены цитотоксическим Т-лимфоцитам. К настоящему времени изучены отдельные виды биологической активности ДК. Вместе с тем многие способы получения и противоопухолевые свойства вакцин на основе ДК остаются не до конца исследованными.
Зрелые ДК для противоопухолевых вакцин чаще всего получают из CD 14+ моноцитов по 2-cтaдийнoй методике. На первой стадии моноциты развиваются в незрелые ДК в присутствии гранулоцит/макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интepлeйкинa-4 (ИЛ-4). Незрелые ДК обладают высокой способностью захватывать антигены путем макропиноцитоза и фагоцитоза (Кеllеr, R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122). В морфологическом и фенотипическом плане незрелые ДК представляют собой крупные, неправильной формы слабо или не прилипающие к пластику клетки, значительно экспрессирующие костимулятор CD86 (B7-2), слабо экспрессирующие маркер моноцитов/макрофагов CD 14 и маркер зрелых ДК CD83 (Наsеbе, H., Nаgауаmа, H., Sаtо, К., Бпоmоtо, M., Таkеdа, Y., Таkаhаshi T. А., Наsшпi К., Еriguсhi M. Dуsfuпсtiопаl rеgulаtiоп оf thе dеvеlорmепt оf mопосуtе-dеrivеd dепdritiс сеlls iп сапсеr раtiепts. - Вiоmеd.&Рhаrmасоthеr. 2000.- vоl. 54.- р. 291-298; Моrsе M. А., Vrеdеriburgh J. J., Lуеrlу H. К. А соmраrаtivе studу оf thе gепеrаtiоп оf dепdritiс сеlls frоm mоbilizеd реriрhеrаl blооd рrоgепitоr сеlls оf раtiепts uпdеrgоiпg high dоsе сhеmоthеrару. - J. Неmаtоthеr. Stеm CeIl Rеs. 1999.- vоl. 8.- р. 577-584). В подавляющем большинстве экспериментов другой костимулятор CD80 (B7-1) экспрессируется много слабее, чем CD86, причем, уровень его экспрессии по данным разных авторов варьирует в значительных пределах 2-87%.
На второй стадии инициируется созревание ДК. По мере созревания ДК в значительной степени теряют способность эндоцитировать и процессировать антигены. Однако зрелые ДК сохраняют способность презентировать иммуногенные пептиды, не требующие предварительного процессинга внутри клетки (Sаllustо F., Niсоlо С, De Маriа R., Corinti S., Теsti R. Сеrашidе iпhibits апtigеп uрtаkе апd рrеsепtаtiоп bу dепdritiс сеlls. - X Ехр. Меd. 1996.- vоl. 184.- N б.- р. 2411-2416). Зрелые ДК стабильно экспрессируют на своей поверхности комплексы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) с пептидами (Сеllа M., Engering A., Pinet V., Рiеtrаs Т., Lапzаvессhiа А. Iпflашmаtоrу stimuli induce accumulation of MHC сlаss II соmрlехеs on dепdritiс сеlls. -Nаturе. 1997.- vоl. 388.- р. 782-787). От незрелых ДК они отличаются также экспрессией характерных маркеров зрелых ДК - CD83 и DC-LAMP - члена семейства мембранных гликопротеинов, ассоциированных с лизосомами, кроме того, в значительной степени возрастает количество костимулирующих молекул. На поверхности зрелых ДК увеличивается количество адгезивных молекул CD54 и CD58, способствующих взаимодействию с Т-лимфопитами (Кеllег R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113- 122). Созревание в различных условиях может значительно повлиять на существенные функциональные характеристики ДК, такие как секреция ИЛ- 12 (Еbпеr S., Rаtziпgеr G., Кrоsbасhеr В., Sсhmuth M., Wеiss А., Rеidеr D., Кrосzеk R. А., Неrоld M., Неuflеr С, Fritsсh Р., Romani N. Рrоduсtiоп оf IL-12 bу humап mопосуtе-dеrivеd dепdritiс сеlls is орtimаl whеп thе stimulus is givеп аt thе опsеt оf mаturаtiоп апd is furthеr епhапсеd bу IL-4. - J. Immuпоl. 2001. - vоl. 166 - р. 633-641) и способность мигрировать (Luft Т., Jеffоrd M., Luеtjепs Р., Тоу Т., Hochrein H., Masterman K. -А, Маliszеwski С, Shоrtmап К., Cebon J., Маrаskоvskу E. Fuпсtiопаllу distiпсt dепdritiс сеll (DC) рорulаtiопs iпduсеd bу рhуsiоlоgiс stimuli: рrоstаglапdiп E2 rеgulаtеs thе migrаtоrу сарасitу оf sресifiс DC subsеts. - Вlооd. 2002 - vоl. 100. - р. 1362-1372). Как CD40L, так и убитые бактерии в значительной степени стимулируют образование ИЛ-12, причем максимальное количество питокина продуцируется в начальные моменты созревания. В то же время среда, кондиционированная моноцитами, ведет к созреванию ДК, не синтезирующих функциональный ИЛ-12 (Еbпеr S., Rаtziпgеr G., Кrоsbасhеr В., Schmuth M., Wеiss А., Rеidеr D., Кrосzек R. А., Неrоld M., Неuflеr С, Fritsсh Р.,
Romani N. Рrоduсtiоп оf IL- 12 bу humап mопосуtе-dеrivеd dепdritiс сеlls is орtimаl whеп thе stimulus is givеп аt thе опsеt оf mаturаtiоп апd is furthеr епhапсеd bу IL-4. - J. Immuпоl. 2001. - vоl. 166 - р. 633-641).
В настоящее время считается, что для изготовления оптимальной противоопухолевой вакцины следует инкубировать незрелые ДК с опухолевыми антигенами (опухолевый лизат, специфичные для опухоли пептиды или белки, опухолевая РЕК и т.д.) в присутствие стимулов, ведущих к созреванию ДК (Dhоdарkаr, M. V., Вhаrdwаj, N. Асtivе imгаuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. Сliп. Imшuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173). Исследование на мышах показало, что лишь иммунизация полностью зрелыми ДК, нагруженными опухолевым антигеном, эффективно защищает при заражении низкоиммуногенной опухолью (выжило 8 из 8 мышей) (Сhеп Z., Dеhm S., Вопhаm К., Kamencic H., Juurliпk В., Zhang X., Gordon J. R., Xiang J. S. DNA аrrау апd biоlоgiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf thе imрасt оf thе mаturаtiоп stаtus оf mоusе dепdritiс сеlls оп thеir рhепоtуре апd апtitumоr vассiпаtiоп еffiсасу. - CeIl Immшiоl. 2001.- vоl. 214.- р. 60-71). В то же время в тех же условиях незрелые ДК не давали ни малейшей защиты (не выжило ни одной мыши из 8). Некоторыми авторами было показано, что введение мышам незрелых ДК, нагруженных антигеном, не только не вызывает эффективного иммунного ответа, а наоборот способствует подавлению или препятствует развитию иммунного ответа (Вlапkепstеiп T. & Sсhulеr T. Сrоss-рrimiпg vеrsus сrоss-tоlеrапсе: аrе twо sigпаls епоugh? - Тrепds iп Immuпоlоgу. 2002.- vоl. 23.- р. 171-173, Enk A. H. & Jоmιlеit H. Ноw dо dепdritiс сеlls рrеvепt аutоimmuпitу: whаt is а mаturе dепdritiс сеll iп thе mоusе? - Тrепds iп Immuпоlоgу. 2001.- vоl. 22.- р. 547, Enk A. H. & Jопulеit H. Ноw dо dепdritiс сеlls рrеvепt аutоimmuпitу: whаt is а mаturе dепdritiс сеll iп thе mоusе? - Тrепds iп Immuпоlоgу. 2001.- vоl. 22.- р. 547).
Использование ДК для лечения онкологических заболеваний стало особо привлекательным после обнаружения ряда опухоль ассоциированных антигенов (OAA) (Jеffоrd M., Маrаskоvskу E., Cebon J., Dаvis I. D. Thе usе оf dепdritiс сеlls iп сапсеr thеrару. - Lапсеt Опсоl. 2001.- vоl. 2.- р. 343-353, Раrmiапi G., Саstеlli С, Dаlеrbа Р., Моrtаriпi R., Rivоltiпi L., Маriпсоlа F. M., Апiсhiпi А. Сапсеr immuпоthеrару with рерtidе-bаsеd vассiпеs: whаt hаvе wе асhiеvеd? Whеrе аrе wе gоiпg? - J. Nаtl. Сапсеr Iпst. 2002.- vоl. 94.- р. 805-818). К OAA следует отнести, во-первых, антигены онкогенных вирусов (карцинома печени - вирусы гепатита В и С, рак шейки матки - вирус папилломы, лимфома Беркитта - вирус Эпштейна-Барр и т. д.), во-вторых, измененные белки, возникшие в результате соматических мутаций, в-третьих, не экспрессируемые в соматических тканях взрослого организма антигены (α- фетопротеин, теломераза), в-четвертых, нормальные антигены, гиперэкспессируемые опухолью (антигены меланомы и рака простаты). В настоящее время считается, что многие опухоли экспрессируют антигены, в той или иной степени распознаваемые иммунной системой (Fоss F. M. Immшюlоgiс mесhапisms оf апtitumоr асtivitу. - Sеmiп. Опсоl. 2002.- vоl. 29.- р. 5-11). Однако в большинстве случаев не развивается адекватный иммунный ответ, так как у опухолей и онкогенных вирусов существует целый спектр уловок, позволяющих ускользнуть от эффекторов иммунной системы. Большинство опухолевых антигенов, за исключением вирусных, сами по себе слабо иммуногенны.
Кроме типа используемых ДК, очевидно, важную роль также играют источник опухолевого антигена и способ введения ДК. В клинической практике до сих пор использовались главным образом белки и пептиды, а также, в несколько меньшей степени, опухолевые лизаты (Dhоdарkаr, M. V., Вhаrdwаj, N. Асtivе immuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. Сliп. Immuпоl. 2000.- vоl. 20,- р. 167-173; Кеllеr, R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immшюl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122). Недостаток вакцин на основе конкретных пептидов или белков заключается, во-первых, в том, что не все OAA уже идентифицированы. Кроме того, популяция клеток опухоли гетерогенна и часть клеток может не экспрессировать отдельный антиген (Dhоdарkаr, M. V., Вhаrdwаj, N. Асtivе immшiizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. Сliп. Iшmuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173). Опухолевый лизат, очевидно, содержит широкий спектр различных антигенов, в том числе и неизвестные OAA. Недавно появилось предварительное сообщение о применении ДК, трансфецированных тотальной опухолевой РНК, для лечения распространенных форм рака толстой кишки и легких (Nаir S. К., Моrsе M., Восzkоwski D., Curnming R. L, Vаsоviс L., Gilbоа E., Lуеrlу H. К. Iпduсtiоп оf tumоr-sресifiс суtоtохiс T lуmрhосуtеs iп сапсеr раtiепts Ъу аutоlоgоus tumоr RNА-trапsfесtеd dепdritiс сеlls. - Апп. Surg. 2002.- vоl. 235.- р. 540-549). ДК индуцировали развитие ЦТЛ, способных специфически лизировать опухоль. Способ введения ДК может влиять на их миграцию в лимфоидную ткань и их иммуногенность. Сравнительное исследование на мышах позволяет предположить, что ДК, введенные внутривенно, менее иммуногенны, чем те, что были введены подкожно (Lаррiп M. В., Wеiss J. M., Dеlаttrе V., Маi В., Dittmаr H., Маiеr С, Мапkе К., Gгаbbе S., Martin S., Simon J. С. Апаlуsis оf mоusе dепdritiс сеll migrаtiоп iп vivо uроп subсutапеоus апd iпtrаvепоus iпjесtiоп. - Immшюlоgу. 1999.- vоl. 98.- р. 181-188).
К данному моменту времени был проведен ряд клинических испытаний противоопухолевых вакцин на основе ДК. Нsu еt аl. (Нsu F. J., Benike C, Fagnoni F., Lilеs T. M., Сzеrwiпski D., Таidi В., Englemann E. G., Lеуу R. Vассiпаtiоп оf раtiепts with В-сеll lуmрhоmа usiпg аutоlоgоus апtigеп-рulsеd dепdritiс сеlls. - Nаturе. 1996.- vоl. 392.- р. 245-252) вводили 4 пациентам с фолликулярной лимфомой ДК крови, нагруженные специфичным для опухоли идиотипическим белком. Регрессия лимфомы наблюдалась у 3 пациентов. Nеstlе еt аl. использовали для лечения пациентов с распространенной формой меланомы ДК (Nеstlе F. О., Аlijаgiс S., Gilliеt M., Sшi Y., Gгаbbе S., Dшшαеr R., Вurg G., Schadendorf D. Vассiпаtiоп оf mеlапоmа раtiепts with рерtidе- от tumог lуsаtе-рulsеd dепdritiс сеlls. - Nаtur. Меd. 1996. - vоl. 2. - р. 328-332). В качестве опухолевого антигена были использованы либо определенные меланомные пептиды, либо опухолевый лизат. ДК были введены 16 пациентам в здоровые лимфатические узлы. У 11 пациентов наблюдалась реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ответ на ДК, нагруженные пептидами, а у 5 пациентов наблюдалась объективная регрессия опухоли. В другом исследовании участвовало 11 пациентов с распространенной формой меланомы на ГV стадии (Тhurпеr В., Haendle L, Rоdеr С, Dieckmann D., Кеikаvоussi Р., Jопulеit H., Bender A., Маszеk С, Schreiner D., vоп dеп Driеsh Р., Вrосkеr E.B., Stеiпmап R.M., Епk A., Kampgen E., Sсhulеr G., Vассiпаtiоп with mаgе-ЗАl рерtidе-рulsеd mаturе, mопосуtе dеrivеd dепdritiс сеll ехрапds sресifiс суtоtохiс T сеlls апd iпduсеs rеgrеssiоп оf sоmе mеtаstаsеs iп аdvапсеd stаgе ГV mеlапоmа. - J. Ехр. Меd. 1999. -vоl. 190. -р. 1669- 1678). Использовались зрелые ДК, полученные из моноцитов, нагруженные меланомным пептидом MAGE-ЗA1. ДК вводили 5 дозами: 3 - подкожно и 2 - внутривенно. Наблюдались развитие иммунных реакций на антиген и экспансия цитотоксических лимфоцитов (ЦТ JI), специфичных к MAGE-ЗA1. У 6 из 11 пациентов происходила регрессия отдельных метастазов. Имеются также сходные данные о перспективности применения ДК для лечения распространенных форм рака простаты, почек, щитовидной железы, молочной железы, толстой кишки, шейки матки, миеломы (Dhоdарkаr, M. V., Вhаrdwаj, N. Асtivе immuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. Сliп. Irшпuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173; Jеffоrd M., Маrаskоvskу В., Cebon J., Dаvis I. D. Тhе usе оf dепdritiс сеlls iп сапсеr thеrару. - Lапсеt Опсоl. 2001.- vоl. 2.- р. 343-353; Кеllеr R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122;).
В качестве ближайшего аналога настоящего изобретения может рассматриваться вакцина на основе ДК, полученная в результате пульсации зрелых ДК лизатом опухоли (Nоuri-Shirаzi M., Banchereau J., Fау J., Раluсkа К., Dепdritiс сеll bаsеd tumоr vассiпеs. - Irшпuпоl. Lеttеrs. 2000,- vоl. 74.- р. 5-10). Недостатком этого метода является необходимость получения опухолевого материала от конкретного больного для получения лизата, что не всегда является возможным. В частности, опухолевый материал может быть недоступен из-за особенностей локализации опухоли или при полной регрессией опухоли после успешно проведенного противоопухолевого лечения, например химио- или лучевой терапии. Кроме того, существующие методы не позволяют использовать ДК-вакцины, нагруженные опухолевым лизатом, для профилактики злокачественных новообразований, т.к. требуют наличия опухолевого материла пациента. Синтетические и генноинженерные опухоль-ассоциированные антигены могут быть специфичны лишь для ограниченного количества новообразований (меланома, рак печени и некоторые другие), что не может решить проблемы профилактики даже основных видов злокачественных новообразований. Кроме того, как отмечалось выше, гетерогенный пул злокачественно трансформированных клеток даже в пределах одного опухолевого узла может экспрессировать различные антигены. Наконец, известно, что у онкологических больных нарушена функция иммунной системы, а опухоль способна выделять ряд иммуносупрессивных факторов, что в значительной степени снижает эффективность иммунотерапии и иммунопрофилактики рака.
В то же время существует обширный контингент людей, относящихся к «гpyппe pиcкa» или предрасположенных к так называемым: «ceмeйным фopмaм» рака. Способы профилактики онкологических заболеваний у этой категории практически отсутствуют. Предлагаемые варианты профилактической химио- или гормонотерапии, а также хирургического лечения (в частности двусторонняя мастэктомия с удалением матки и придатков) у здоровых людей даже с высоким риском заболевания вряд ли можно считать адекватными.
Другим важным аспектом является предотвращение рецидивов после проведения противоопухолевой терапии, включая химиотерапию, лучевую терапию или радикальное хирургическое удаление первичного очага опухоли, когда опухолевая масса значительно уменьшается. К настоящему времени в экспериментах на мышах показана эффективность данного способа вакцинации для предотвращения рецидива карциномы печени после удаления первичного очага (Ноmmа S., Тоdа G., Gong X, Кufе D., Ohno T. Рrеvепtivе апtitumоr асtivitу аgаiпst hераtосеllulаr саrсiпоmа (HCC) iпduсеd bу immuпizаtiоп with шsiопs оf dendritic cells and HCC сеlls iп miсе. - J. Gаstrоепtеrоl. 2001.- vоl. 36.- р. 764-771).
Таким образом, существует острая потребность в разработке новых эффективных средств и подходов, предназначенных для лечения и профилактики развития злокачественных новообразований у индивидов, нуждающихся в этом, например людей, в частности относящихся к группе лиц, предрасположенных к «ceмeйным фopмaм» рака, а также у других млекопитающих, например домашних животных, и для предотвращения рецидивов после проведенного противоопухолевого лечения.
Раскрытие изобретения
В результате проведения обширных научных изысканий с использованием известных в данной области и хорошо охарактеризованных модельных систем и различных штаммов опухолей авторы неожиданно обнаружили, что зрелые дендритные клетки, нагруженные полилизатом, полученным из опухолей по меньшей мере двух различных типов, и вакцины на их основе обеспечивают средства и подходы, позволяющие преодолеть указанные выше недостатки.
В своем первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает зрелые дендритные клетки, характеризующиеся тем, что они получены из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагружены полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей.
В одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. В альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.
В одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
В своем следующем аспекте данное изобретение обеспечивает способ получения зрелых дендритных клеток из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, предусматривающий следующие стадии: а) выделение мононуклеарных лимфоцитов из индивида; б) инкубацию выделенных мононуклеарных лимфоцитов с ростовыми факторами для получения из них незрелых дендритных клеток; в) получение полилизата опухолей; г) обработку полученных незрелых дендритных клеток полилизатом опухолей; д) индукцию созревания незрелых дендритных клеток, обработанных полилизатом опухолей, в зрелые дендритные клетки, нагруженные полилизатом опухолей.
В одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. В альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.
В одном из воплощений мононуклеарные лейкоциты выделяют из периферической крови индивида.
В следующем воплощении в качестве ростовых факторов используют гранулоцит/макрофаг-колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интepлeйкин-4 (ИЛ-4).
В еще одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
В следующем воплощении полилизаты получают путем трехкратного повторения замораживания и размораживания измельченной опухоли в дистиллированной воде и последующего фильтрования через стерилизующий фильтр. В одном из воплощений индукцию созревания осуществляют при помощи
ФНО-α.
В своем следующем аспекте данное изобретение обеспечивает противоопухолевую вакцину, характеризующуюся тем, что она содержит в эффективном количестве зрелые дендритные клетки, полученные из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженные полилизатом опухолей различного происхождения, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, и физиологически приемлемые носители, наполнители или другие добавки.
В одном из воплощений противоопухолевая вакцина дополнительно содержит по меньшей мере один иммуномодулятор. В частном воплощении таким иммуномодулятором является полиоксидоний.
В одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. В альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.
В одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
В одном из воплощений изобретения противоопухолевая вакцина применяется для профилактики злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
В альтернативном воплощении противоопухолевая вакцина применяется для предупреждения рецидива злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, после противоопухолевого лечения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
В следующем альтернативном воплощении противоопухолевая вакцина применяется для профилактики злокачественного новообразования у индивида, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака, причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата.
Следующим аспектом данного изобретения является применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из аспектов данного изобретения, для изготовления лекарственного средства для профилактики злокачественного новообразования у индивида, нуждающегося в этом, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата. Должно быть понятно, что данный аспект по существу относится к способу профилактики злокачественного новообразования у нуждающегося в этом индивида - млекопитающего, который предусматривает введение эффективного количества дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов указанного индивида и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из рассмотренных выше аспектов данного изобретения, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
В одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. В альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.
В одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
Еще одним аспектом данного изобретения является применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из аспектов данного изобретения, для изготовления лекарственного средства для предупреждения рецидива злокачественного новообразования у указанного индивида, нуждающегося в этом, после противоопухолевого лечения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относятся к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата. Должно быть понятно, что данный аспект по существу относится к способу предупреждения рецидива злокачественного новообразования у нуждающегося в этом индивида - млекопитающего, который предусматривает введение эффективного количества дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов указанного индивида и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из рассмотренных выше аспектов данного изобретения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относятся к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
В одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком. В альтернативном воплощении млекопитающее является одним из домашних животных, таких как кошка, собака, лошадь.
В одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
Наконец, еще одним аспектом данного изобретения является применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из аспектов данного изобретения, для изготовления лекарственного средства для профилактики злокачественного новообразования у индивида, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака, причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата. Должно быть понятно, что данный аспект по существу относится к способу профилактики злокачественного новообразования у нуждающегося в этом индивида - млекопитающего, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака, который предусматривает введение эффективного количества дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов указанного индивида и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины, являющейся одним из рассмотренных выше аспектов данного изобретения, причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата.
В одном из воплощений изобретения млекопитающее, из которого получают дендритные клетки, является человеком.
В одном из воплощений опухоли, из которых получают полилизат, выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
Преимуществом зрелых ДК настоящего изобретения и противоопухолевой вакцины (поливакцины) на их основе по сравнению с существующими вариантами моновакцин является возможность их использования в профилактических режимах у млекопитающих с высоким риском заболевания злокачественными новообразованиями. Другое преимущество настоящего изобретения состоит в возможности индивидуального подбора состава полилизата опухолевых клеток для конкретных пациентов в зависимости от вероятности возникновения того или иного вида онкологического заболевания. Еще одним преимуществом ДК, нагруженных полилизатом, а таюке вакцины на их основе является одновременное протективное действие против нескольких видов опухолей, что позволяет применять данный метод для профилактики онкологических заболеваний.
Краткий перечень фигур
Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на фигуры, которые предназначены исключительно для иллюстрации и целей лучшего понимания сущности заявленного изобретения.
Фиг. 1. Гистограммы, отражающие уровни экспрессии поверхностных маркеров ДК мыши. Ось абсцисс - интенсивность сигнала для данного параметра. Ось ординат отражает количество событий. Фиг. IA —Уровень экспрессии MHC I. Фиг. IB - Уровень экспрессии MHC II. Фиг. 1С - Уровень экспрессии CD80. Фиг. ID - Уровень экспрессии CD86. Фиг. IE - Уровень экспрессии CD34.
Фиг. 2. Гистограммы, отражающие уровни экспрессии поверхностных маркеров ДК человека. Ось абсцисс - интенсивность сигнала для данного параметра. Ось ординат отражает количество событий. Фиг. 2A - Распределение ДК в Dоt Рlоt.
Фиг. 2В - Уровень экспрессии CDIa. Фиг. 2C - Уровень экспрессии CD83. Фиг. 2D - Уровень экспрессии CD40. Фиг. 2E - Уровень экспрессии CD80. Фиг. 2F - Уровень экспрессии CD86. Фиг. 2G - Уровень экспрессии MHC I. Фиг. 2H - Уровень экспрессии MHC II.
Фиг. 3. Дендритные клетки, окраска гематоксилин-эозином, увеличение 900.
Фиг. 4. Электронная микрофотография дендритных клеток, увеличение 9000.
Осуществление изобретения
Определения
В контексте настоящей заявки под «зpeлыми дендритными клeткaми» понимаются ДК, которые способны к активной презентации иммуногенных пептидов и не обладают выраженной фагоцитарной активностью (Sаllustо F., Niсоlо С, De Маriа R., Соriпti S., Теsti R. Сеrашidе iпhibits апtigеп uрtаkе апd рrеsепtаtiоп bу dепdгitiс сеlls. - J. Ехр. Меd. 1996.- vоl. 184.- N 6.- р. 2411-2416). Зрелые ДК стабильно экспрессируют на своей поверхности комплексы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) с пептидами (Сеllа M., Engering A., Pinet V., Рiеtrаs Т., Lапzаvессhiа А. Iпflаmmаtоrу stiгаuli iпduсе ассumulаtiоп оf MHC сlаss II соmрlехеs on dепdгitiс сеlls. - Nаturе. 1997.- vоl. 388.- р. 782-787). От незрелых ДК они отличаются также экспрессией характерных маркеров зрелых ДК - CD83, кроме того, в значительной степени возрастает количество костимулирующих молекул. На поверхности зрелых ДК увеличивается количество адгезивных молекул CD54 и CD58, способствующих взаимодействию с Т-лимфоцитами (Кеllеr R. Dепdгitiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Immuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122).
В контексте данной заявки под термином «нaгpyжaть» или «пyльcиpoвaть» понимается такое контактирование незрелых дендритных клеток с лизатом опухолей, при котором они после превращения в зрелые дендритные клетки в результате индуцированного созревания становятся способными эффективно презентировать на своей поверхности опухолевые антигены и индуцировать развитие Т-клеточного ответа на них.
В контексте данной заявки под «эффeктивным количеством)) понимается такое количество дендритных клеток или вакцины настоящего изобретения, которое является достаточным для оказания желаемого эффекта в отношении состояния, в связи с которым они вводятся индивиду. Точное количество будет зависеть от конкретных обстоятельств и может быть оценено специалистом в данной области с использованием известных методик. Обычно, количество должно быть способно оказывать профилактическое действие в отношении развития злокачественного новообразования или предупреждать развитие рецидива злокачественного новообразования после противоопухолевого лечения. Специалисту будет понятно, что эффективное количество будет iпtеr аliа зависеть от типа рака, режима введения, вводятся ли дендритные клетки или вакцина сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, общего состояния здоровья индивида.
Под «фapмaцeвтичecки приемлемым)) или «физиoлoгичecки приемлемым)) в контексте настоящего описания понимается такой носитель, растворитель, эксципиент, иммуномодулятор, адъювант или любая иная целевая добавка, которые не вызывают никаких нежелательных побочных эффектов у индивида, которому они вводятся, а также не сказываются отрицательно на жизнеспособности дендритных клеток настоящего изобретения и не препятствуют осуществлению ими целевой биологической функции — презентации опухолевых антигенов иммунной системе при введении в организм индивида. Такие фармацевтически и физиологически приемлемые средства хорошо известны в данной области (см., например, Rеmiпgtоп's Рhаrmасеutiсаl Sсiепсеs, 18й еditiоп, A.R. Gеппаrо, Ed., Масk Рublishiпg Соmрапу - 1990; Напdbооk оf Рhаrmасеutiсаl Ехсiрiепts, Згd еditiоп, А. Кibbе, Ed., Рhаrmасеutiсаl Press - 2000).
Под термином «πoлилизaт» в контексте настоящей заявки понимается лизат, полученный по меньшей мере из двух образцов опухолей, принадлежащих к различным типам. В качестве иллюстрации полилизат может включать в себя, например, лизат, полученный из опухолевой ткани рака яичника, и лизат, полученный из опухолевой ткани молочной железы. В состав полилизата могут входить лизаты, полученные из 3, 4, 5 и более различных типов опухолей без ограничения.
Стандартным способом получения дендритных клеток, пригодным для использования в рамках данного изобретения, является двухстадийный способ получения из CD 14+ моноцитов, выделяемых из периферической крови (Dhоdарkаr, M. V., Вhаrdwаj, N. Асtivе immuпizаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. Сliп. Immuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173). На первой стадии моноциты развиваются в незрелые ДК в присутствии гранулоцит/макрофаг колониестиму-лирующего фактора
(ГМ-КСФ) и интepлeйкинa-4 (ИЛ-4). На второй стадии инициируется созревание ДК.
Выделение MH лейкоцитов из периферической крови может быть осуществлено различными способами, например, центрифугированием в градиенте сахарозы, центрифугированием в одноступенчатом градиенте фиколла. Для предотвращения свертывания кровь стабилизируют обычно применяемыми для этих целей консервантами, такими как, например, гепарин, цитрат натрия, ЭДТА.
Культивирование MH лейкоцитов проводят в стандартной культуральной среде, известной специалисту в данной области, например в RPMI или DMEM с 10% человеческой сыворотки пациента (или AB сыворотки донора) в одноразовых пластиковых флаконах, например, объемом 250 мл фирмы «Costaг», или аналогичных флаконах других фирм. Для получения незрелых ДК могут быть использованы различные цитокины, например, комбинация интерферонов 1-го типа (ИФН-I) и ГМ- КСФ (ДК-ИФН) или комбинация гранулоцит/макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интepлeйкинa-4 (ИЛ-4). Предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением является использование комбинации ГМ-КСФ и ИЛ-4.
Способ получения ДК из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови является наиболее предпочтительным, поскольку позволяет получать достаточное количество ДК из 50-100 мл периферической крови, что значительно упрощает процедуру забора предшественников ДК посредством пункции костного мозга или проведения аппаратной сепарации крови.
Также дендритные клетки млекопитающих, в частности человека могут быть получены напрямую из крови при помощи градиентного центрифугирования (Нsu F. X, Вепikе С, Fagnoni F., Lilеs T. M., Сzеrwiпski D., Таidi В., Englemann E. G., Lеvу R. Vассiпаtiоп оf раtiепts with В-сеll lуmрhоmа usiпg аutоlоgоus апtigеп-рulsеd dепdritiс сеlls. - Nаturе. 1996.- vоl. 392.- р. 245-252).
ДК могут быть также получены из CD34+ предшественников костного мозга или крови. Дифференцировка ДК из предшественников происходит при довольно длительной (около 2 недель) инкубации в присутствии ГМ-КСФ и ФНО-α (Саuх С.,. Маssасriеr С, Dеzuttеr-Dаmbuуапt С, Vапbеrvilеt В., Jаquеt С, Sсhmitt D., Вапсhеrеаu J. Нumап dепdritiс Lапgеrhапs сеlls gепеrаtеd iп vitrо Ёrоm CD34+ рrоgепitоrs сап рrimе паivе CD4+ T сеlls апd рrосеss sоlublе апtigеп. - J. Imшιmоl. 1995.- vоl. 155.- р. 5427- 5435). Выход ДК может быть увеличен путем добавления фактора стволовых клеток (ФСК) или Flt-ЗL (Саuх С, Vапbеrvilеt В., Маssасriеr С, Dеzuttеr-DаmЪuуапt С, dе
Sаiпt-Vis В., Jаquеt С, Yoneda K., Imаmurа S., Sсhmitt D., Banchereau J. CD34+ hеmаtороiеtiс рrоgепitоrs frоm humап соrd blооd diffеrепtiаtе аlопg twо independent dепdritiс сеll раthwауs iп rеsропsе tо GМ-СSF+ЖFα. - J. Ехр. Меd. 1996.- vоl. 184.- р. 695-706).
ДК могут быть получены из мононуклеарных лейкоцитов селезенки, посредством ее механического измельчения и последующего центрифугирования в градиенте плотности фиколла.
Получение полилизата опухолей может быть осуществлено различными способами. Наиболее предпочтительным является получение лизата путем трехкратного повторения цикла замораживания-оттаивания в дистиллированной воде в соотношении взвесь опухолевых клеток и вода около 1: 10 и последующего фильтрования через стерилизующий фильтр. Замораживание предпочтительно проводят при температуре от около минус 50°C до около минус 960C. Размораживание предпочтительно проводят при температуре около 20-25°C. В качестве фильтра могут быть использованы нитроцеллюлозные, поливинилендифторидные, из ацетата целлюлозы с диаметром пор 0,22 мкм. Возможна гомогенизация в физиологическом растворе (0,9% NaCl), обработка ультразвуком. Соотношение опухоль - физиологический раствор составляет около 1:5. В качестве образца опухоли может использоваться, в частности, операционный материал, пунктат, биоптат, злокачественные выпоты, культивируемые в условиях iп vitrо штаммы опухолевых клеток. Материал до получения лизата предпочтительно хранят при температуре от около минус 5O0C до около минус 960C. Полилизат получают путем смешивания лизатов, полученных из различных индивидуальных типов опухолей. Предпочтительно, чтобы в состав полилизата входили по меньшей мере два типа различных гистологических вариантов опухолей, выбранных из группы включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого. Подготовленный полилизат хранят при температуре от около минус 50°C до около минус 960C. Полилизат может также храниться в лиофильно высушенном состоянии, что обеспечивает большее удобство в хранении и транспортировке на большие расстояния, а также более продолжительный срок хранения. Лиофильно высушенный полилизат непосредственно перед применением восстанавливают путем добавления подходящего растворителя, например стерильной воды, физиологического раствора, PBS или TBS. Полилизат может также готовиться ех tеmроrе из лизатов, полученных из индивидуальных опухолей, путем их смешивания. Для пульсирования ДК используется полилизат из расчета 0.1 см3 на lмлн. ДК. Инкубацию ДК с полилизатом проводят в CO2- инкубаторе при 37°C и 4,5% CO2 в течение около 24 ч.
Созревание ДК может быть индуцировано под воздействием целого ряда факторов: бактерий (живых или мертвых), бактериальных продуктов (ЛПС), вирусов, двунитевой РНК или ее аналога пoли-I:C, белка теплового шока gp9б, провоспалительных факторов и их комбинаций (ИJI-lβ, ФНО-α, ИЛ-б, пpocтaглaндинa-E2 (ПГE-2)) и лиганда CD40 (CD40L) (Dhоdарkаr M. V., Steinman R. M., Sарр M., Dеsаi H., Fоssеllа С, Кrаsоvskу I, Donahoe S. M., Dunbar P. R., Сегапdоlо V., Niхоп D. F., Вhаrdwаj N. Rарid gепеrаtiоп оf brоаd Т-сеll immuпitу iп humапs аftеr а siпglе iпjесtiоп оf mаturе dепdritiс сеlls. - J. Сliп. Iпvеst. 1999.- vоl. 104.- р. 173-180; Кеllеr R. Dепdritiс сеlls: thеir sigпifiсапсе iп hеаlth апd disеаsе. - Iшгаuпоl. Lеttеrs. 2001.- vоl. 78.- р. 113-122). ДК, обработанные опухолевым антигеном в присутствие факторов, повышающих его иммуногенность (ФНО-α; ИJI-lβ; CD40L; ЛПС; среда, кондиционированная моноцитами; аналог вирусной РНК - полиинозиновая- цитидиловая кислота), способны эффективно презентировать антиген и вызывать развитие Т-клеточного иммунного ответа на него, что было показано в ряде исследований iп vitrо, в экспериментах на животных и в опытах на здоровых добровольцах (Сhеп Z., Dеhm S., Bonham K., Kamencic H., Juuгliпk В., Zhang X., Gordon J. R., Xiang J. S. DNA аrrау апd biоlоgiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf thе imрасt оf thе mаturаtiоп stаtus оf mоusе dепdritiс сеlls оп thеir рhепоtуре апd апtitumоr vассiпаtiоп еffiсасу. - CeIl Immuпоl. 2001.- vоl. 214.- р. 60-71; Dhоdарkаr, M. V., Вhаrdwаj, N. Асtivе immuшzаtiоп оf humапs with dепdritiс сеlls. - J. Сliп. Immuпоl. 2000.- vоl. 20.- р. 167-173; Nоuri-Shirаzi M., Вапсhеrеаu J., Fау J., Раluсkа К., Dепdritiс сеll bаsеd tumоr vассiпеs. - Immuпоl. Lеttеrs. 2000.- vоl. 74.- р. 5-10; Sаllustо F., Lапzаvессhiа А. Еffiсiепt рrеsепtаtiоп оf sоlublе апtigеп bу сulturеd humап dепdritiс сеlls is mаiпtаiпеd bу grапulосуtе/mасrорhаgе соlопу-stimulаtiпg fасtоr рlus iпterleukiп-4 апd dоwпrеgulаtеd bу tumоr песrоsis fасtоr аlрhа. - J. Ехр. Меd. 1994.- vоl. 179.- р. 1109-1118).
В качестве иллюстрации для стимуляции созревания незрелых ДК в зрелые ДК могут быть использованы, например, провоспалительные факторы (ИЛ-lβ, ФНО-α, ИЛ-6) в концентрации около 10 нг/мл и их комбинации, пpocтaглaндин-E2 (ПГE-2) в концентрации около 250 нг/мл. Предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением является созревание под действием ФНО-α, который используют в концентрации около 20 нг/мл.
ДК, полученные из моноцитов/макрофагов периферической крови или клеток костного мозга млекопитающих при инкубации с ростовыми факторами, имеют характерные особенности морфологической структуры и ультраструктуры. ДК обладают высокой антигенпрезентирующей способностью и на их основе могут быть получены противоопухолевые вакцины. Для этих целей полученные в экстракорпоральных условиях незрелые дендритные клетки, среди которых не более 30% экспрессируют маркеры терминальной дифференцировки и костимулирующие молекулы (CD83, CD86, CD80) инкубируют с лизатом опухоли и факторами индукции созревания ДК в течение около 1 сут. и получают зрелые пульсированные опухолевыми антигенами ДК, среди которых не менее 30% экспрессируют маркеры CD83, CD86,CD80.
Зрелые дендритные клетки настоящего изобретения могут быть получены ех tеmроrе, т.е. перед тем, как планируется их введение индивиду, нуждающемуся в этом. В то же время, ДК настоящего изобретения могут быть получены заранее и храниться до момента их применения в замороженном виде при температуре от около минус 50°C до около минус 96°C. Для продолжительного хранения в замороженном состоянии к суспензии клеток могут быть добавлены дополнительные агенты, например криопротекторы. В качестве криопротекторов предпочтительно использовать такие фармацевтически приемлемые агенты, как диметилсульфоксид, глицерин. Хранят замороженные клетки в виде отдельных аликвот. Хранение ДК в замороженном состоянии позволяет получать одну партию клеток для каждого конкретного индивида и использовать ее многократно, например, когда требуется повторное введение ДК при ревакцинации. На основе дендритных клеток настоящего изобретения могут быть получены вакцины посредством их разведения в физиологически приемлемых растворителях с добавлением консервантов и адъювантов.
Млекопитающие, на которых распространяется настоящее изобретение, не ограничиваются какими-либо конкретными видами. Для специалиста будет очевидно, что данное изобретение относится в первую очередь к людям, страдающим злокачественными образованиями или нуждающимися в профилактике раковых заболеваний. В то же время настоящее изобретение предусматривает и разнообразные ветеринарные приложения. Предполагается, что наиболее важными видами млекопитающих с точки зрения реализации данного изобретения будут, но не ограничиваясь только ими, такие домашние животные, как кошки, собаки, лошади.
Помимо эффективного количества зрелых дендритных клеток, нагруженных полилизатом, полученным из по меньшей мере двух типов опухолей, противоопухолевые вакцины настоящего изобретения также могут содержать физиологически приемлемые растворители, эксципиенты, наполнители и другие целевые добавки. К таким агентам, в частности, относятся вещества для поддержания осмотического давления, буферы, консерванты, криопротекторы, хелатирующие агенты.
Для поддержания осмотического давления вакцины могут содержать такие регулирующие тоничность агенты, как сахароза, глюкоза, хлорид натрия, полиглюкин, реополиглюкин, а также многоатомные сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит или маннит.
Для поддержания физиологических значений рН вакцины настоящего изобретения могут содержать физиологически приемлемые буферные агенты, как, например, Нереs, фосфатный, цитратный, сукцинатный, тартратный, фумаратный, глюконатный, оксалатный, лактатный, ацетатный или гистидиновый буферы, а также их комбинации.
Для обеспечения высокой выживаемости дендритных клеток в составе вакцины при хранении ее в состоянии глубокой заморозки в состав вакцин могут входить криопротекторы, такие как диметилсульфоксид и глицерин.
В качестве хелатирующего агента может использоваться, например, ЭДТА.
Для предотвращения бактериального заражения в состав вакцин могут также входить консерванты, как, например, различные антибиотики или их смеси, такие как гентамицин, смесь пенициллина и стрептомицина.
Для стимуляции иммунного ответа и усиления Т-клеточной реакции в ответ на введение дентдритных клеток настоящего изобретения вакцина может также содержать различные адъюванты и иммуномодуляторы. Наиболее предпочтительно вакцина настоящего изобретения содержит такой иммуномодулятор и адъювант, как полиоксидоний. Вакцины, предназначенные для введения iп vivо, должны находиться в стерильном состоянии. Что касается таких компонентов, как растворители, наполнители, эксципиенты, прочие целевые добавки, то их стерилизацию можно проводить такими известными специалистам в данной области способами, как, например, автоклавирование при повышенной температуре, стерилизация фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Культивирование дендритных клеток и все манипуляции с ними проводят с соблюдением всех необходимых требований стерильности, как известно специалисту в данной области.
Вакцина настоящего изобретения хорошо переносится.
В зависимости от предполагаемой локализации опухоли зрелые дендритные клетки или вакцина настоящего изобретения могут вводиться подкожно, внутривенно, внутрибрюшинно, в здоровые лимфатические узлы 3-5 раз с интервалом в 2 недели. Наиболее предпочтительным в рамках настоящего изобретения является внутрикожное введение ДК, при котором ДК наиболее эффективно достигают лимфатических узлов (Моrsе M. A., Coleman R. E., Akabani G., Niеhаus N., Coleman D., Lуеrlу H. К. Мigrаtiоп оf humап dепdritiс сеlls аftеr iпjесtiоп iп раtiепts with mеtаstаtiс mаligпапсiеs. - Сапсеr Rеs., 1999, vоl. 59, р. 56-58). Разовая доза для человека составляет от около 5 до около 100 млн клеток. Опыты на модельных животных (мышах) свидетельствуют о том, что эффективность защиты вакцины ослабевает через 3 мес, в связи с чем может потребоваться ревакцинация. С учетом разницы в продолжительности жизни мыши и человека можно рекомендовать для последнего повторные вакцинации с интервалом в приблизительно 3-5 лет. Аналогичным образом в отношении других млекопитающих также может быть рассчитана частота ревакцинации, требующаяся для поддержания протективного эффекта.
Вакцинация дендритными клетками, нагруженными полилизатом опухолей, или вакцинами, полученными на их основе, достоверно повышает киллерную активность лимфоцитов мышей против клеток тех опухолей, из которых был получен полилизат, и вызывает торможение опухолевого роста. Максимальный протективный эффект, приближающийся к 100%, достигается только при минимальной опухолевой массе (после противоопухолевой терапии, включая химиотерапию, лучевую терапию, хирургическое удаление опухолевого очага) или в профилактическом режиме. Таким образом, наиболее целесообразным является профилактическое использование зрелых дендритных клеток или вакцин настоящего изобретения у индивидов, нуждающихся в этом, после проведения радикальных операций удаления первичного очага с целью предупреждения рецидива и для профилактики развития злокачественных новообразований, в частности у индивидов, относящихся к группе риска и предрасположенных к «ceмeйным фopмaм» онкологического заболевания.
ДК и вакцины настоящего изобретения могут быть использованы в профилактических целях у лиц с семейными формами рака, в регионах с повышенным радиационным: фоном и при иных неблагоприятных условиях внешней среды и профессиональных вредностях. В частности, при семейных формах рака чаще всего одновременно встречаются рак молочной железы и яичников, и для этой категории пациентов следует использовать бинарные вакцины на основе лизатов опухолей данной локализации.
Для целей профилактики различных форм рака настоящим изобретением предусматривается использование полилизата по меньшей мере двух опухолей различной локализации. В одном из предпочтительных воплощений содержание каждого из типов злокачественных новообразований должно составлять не менее 2 образцов. Введение ДК, нагруженных полилизатом, и вакцин на их основе может индуцировать противоопухолевый иммунитет у здоровых субъектов против основных видов опухолей. Вакцинации могут подвергаться основные группы «pиcкa»: лица старше 50 лет, пациенты с хроническими воспалительными и предраковыми состояниями, подвергающиеся воздействию профессиональных вредностей и проживающие в неблагоприятных экологических условиях, лица с генетическими предрасположенностями к злокачественным новообразованиям и др. Для данных целей может быть создан банк различных опухолей, включающий в себя не менее 80% основных вариантов злокачественных новообразований. При этом для отдельных категорий с высоким риском заболевания определенными формами рака могут быть созданы специализированные полилизаты (для профилактики опухолей женской репродуктивной сферы, желудочно- кишечного тракта и т.п.). ДК, нагруженные полилизатом, полученным на основе банка основных типов опухолей, или вакцины на основе таких ДК могут применяться в профилактическом режиме у лиц без признаков опухолевого процесса. Повторные курсы введения с интервалом 3-5 лет могут поддерживать иммунный ответ в течение длительного времени.
Дендритные клетки и вакцины настоящего изобретения могут быть использованы для профилактики рецидивов рака у млекопитающих после проведенного противоопухолевого лечения, когда отсутствует возможность получения индивидуального опухолевого материала для пульсации дендритных клеток или приготовления вакцин.
Дендритные клетки и вакцины настоящего изобретения могут также применять для профилактики рака у млекопитающих с различными формам предраковых состояний (хронических воспалительных заболеваний).
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами. Следует, однако, понимать, что приводимые примеры предназначены не для ограничения объема притязаний, а исключительно для целей лучшего понимания сущности заявленного изобретения.
Примеры.
Пример 1. Выделение мононуклеарных лейкоцитов (MHJI) из периферической крови
MHJI выделяют из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла (плотностью 1.077 г/см3), центрифугированием при 400 g в течение 30 минут. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирают пипеткой и трехкратно отмывают в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждают центрифугированием при 200 g.
Пример 2. Лабораторные животные и выделение опухолевых клеток, получение дендритных клеток
В работе использованы мыши, весом 20-23 г, содержащиеся в условиях вивария. Для поддержания опухолевых клеток меланомы В- 16, клетки имплантируют подкожно в дозе 500 тыс./мышь. На десятые сутки определялись опухолевые узлы в месте введения; через неделю мышей забивают посредством внутривенного введения гексенала в апноэтической дозе. Волосяной покров выщипывают, кожные покровы обрабатывают 70% этанолом и надрезают стерильным инструментом. Опухолевый узел удаляют и помещают в стерильную чашку Петри со средой Хенкса. Опухоль измельчают ножницами, а затем для получения клеточной взвеси тщательно пипетируют. Клетки подсчитывают, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в среде RPMI 1640 с добавками (HEPES, L-глютамин, гентамицин) в концентрации 1 млн./мл. Часть клеток перевивают мышам, а остальные помещают в культуральные флаконы, с добавлением 10% фетальной сыворотки и инкубируют в
СОг-инкубаторе. Культуральную среду заменяют через каждые 2 дня. Культивируемые клетки меланомы В 16 используют для тестирования цитотоксической активности лимфоцитов мышей и имплантации мышам. Для этих целей культуральную среду из флаконов сливают, прилипшие к пластику клетки меланомы заливают раствором версена и помещают на 10-15 мин в CO2 инкубатор. Отлипшие клетки дважды отмывают в среде RPMI 1640 и используют в цитотоксическом тесте или для введения мышам.
Дендритные клетки генерируют из костного мозга и селезенки мышей. У мышей удаляют бедренные кости и селезенку (после введения гексенала). Костномозговой канал кости промывают средой RPMI 1640, селезенку растирают в стерильных условиях. Полученную клеточную взвесь наслаивают на градиент плотности фиколл-верогарфин (или фиколл-рак) 1,088 и центрифугируют при 1500 об./мин 30 мин. Образовавшееся интерфазное кольцо клеток собирают, отмывают дважды центрифугированием и ресуспендируют в полной культуральной среде с 10% фетальной сыворотки в концентрации 1 млн./мл. К MHJI костного мозга сразу добавляют ГМ-КСФ и ИЛ-4, а MHK селезенки выдерживают в течение суток в СОг- инкубаторе, затем не прилипшие лимфоциты сливают. К прилипшим моноцитам добавляют те же ростовые факторы. Каждые 2 сут. среду заменяют, и добавляют ростовые факторы. На 6 сут. к дендритным клеткам добавляют лизат опухоли и ФИО- ос. Лизат получают трехкратным замораживанием и размораживанием опухолевых клеток меланомы. Лимфоциты селезенки используют для цитотоксического теста.
Пример 3. Оценка противоопухолевого действия на мышах с привитыми опухолями
Опухолевые клетки Вlб и опухоли Эрлиха вводят мышам подкожно в дозе 50 тыс./мышь. Опухолевые узлы удаляют и выделяют опухолевые клетки по описанной в Примере 2 методике. Часть клеток перевивают мышам, а остальные помещают в культуральные флаконы с питательной средой RPMI- 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки и инкубируют в CO2-инкyбaтope. Культуральную среду заменяют через каждые 2 дня. Культивируемые клетки меланомы Вlб и опухоли Эрлиха используют для тестирования цитотоксической активности лимфоцитов мышей и имплантации мышам. Дендритные клетки генерируют из костного мозга и селезенки мышей описанным в Примере 2 способом с использованием ростовых факторов и ФНО-α. Лизат опухоли получают трехкратным замораживанием и размораживанием опухолевых клеток меланомы. Лимфоциты селезенки используют для цитотоксического теста.
Исследование проводят на мышах-самцах линии C57B 1 и CBA и весом 20-22 г. Мышей трижды с интервалом в 2 недели иммунизируют вакциной. Через 2 месяца после иммунизации ДК-вакциной мышей заражают клетками меланомы B-16 и рака яичников CaO-I (подкожно), карциномы Эрлиха (внутрибрюшинно) в дозе 50 и 100 тыс/мышь.
Оценку действия препарата на рост опухоли проводят по регистрации различий в скорости роста опухоли. Скорость роста опухоли оценивают по ее объему. Расчет объема опухоли осуществляют по формуле:
V=aв2 (усл.ед), где а й в наибольшие диаметры опухоли в мм.
Торможение роста опухоли (TPO) рассчитывают по формуле:
V контр " Vоп
TPO= х 100%,
V контр где VKoнтp — это объем опухоли в контроле, V0n — объем опухоли в опытной группе. Объем опухоли измеряют на 14 и 30 сут. после перевивки.
Фенотип дендритных клеток определяют методом проточной цитофлюорометрии на цитометре фирмы Весtоп Diсkiпsоп, США с использованием меченных ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианатом) и/или ФЭ (фикоэритрином) антител фирмы Соltаg, США.
Схема вакцинации. Дендритные клетки вводят внутрикожно в 200 мкл среды трижды каждые три дня, через неделю вводят опухолевые клетки. Контрольной группе животных вводят внутрикожно лизат опухоли. Каждая группа включает 8-10 животных.
Пример 4. Цитотоксический тест
НК-активность определяют на линии K-562. Для определения противоопухолевой активности (цитотоксичности) MHK используют аутологические опухолевые клетки. Опухолевые клетки (1x104 в 1 мл) инкубируют в культуральной среде с MHK (в соотношении 1:5) в плоскодонных 96-лyнoчныx микропланшетах 18 часов. Затем в лунки добавляют витальный краситель MTT и по оптической плотности, измеряемой на Мiltisсап MCC-340, рассчитывают процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Пример 5. Культивирование ДК
ДК получают в культуре из MHK периферической крови при их инкубации с гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) и интepлeйкинoм-4 (ИЛ-4) в RPMI 1640 в течение 6 дней. Для культивирования ДК добавляли 20 нг/мл ИЛ-4 и 80 нг/мл ГМ-КСФ. На 3 и 5 день отбирали 1 мл и добавляли свежей среды, содержащей цитокины. Затем, клеточные культуры отмывают средой 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждают центрифугированием при 200 g.
Пример 6. Индукция созревания ДК
На 7 день культивирования в условиях, описанных в Примере 5, ДК собирали с чашки Петри и центрифугировали 10 минут 40Og. Затем клетки возвращали в ту же чашку Петри со свежей культуральной средой, содержащей 20 нг/мл ФНО-α и 250 нг/мл простагландина E2 и культивировали еще 2 дня.
Пример 7. Микроскопия
ДК, отмытые от питательной среды, фиксируют в 2% растворе глютарового альдегида в течение 40 минут. Затем центрифугируют при 400 g в течение 30-40 минут. Полученный осадок после фиксации в четырёхокиси осмия заключают в смолы (ЭПOH-812). Полутонкие и ультратонкие срезы готовят на ультрамикротоме ЛКБ-Ш (Швеция), просматривают и фотографируют ультратонкие срезы после окраски толуидиновым синим в световом микроскопе «Пoливap» (Австрия). Ультратонкие срезы после обработки уранил-ацетатом и цитратом свинца просматривают и фотографируют в электронном микроскопе ДЖЭOЛ-1200 CX II (Япония) (Фиг.4)
Пример 8. Проточная цитометрия (FАСS-анализ) и характеристика антител, используемых при проточной цитометрии
Определение экспрессии поверхностных маркеров МНЛ проводят при помощи моноклональных антител против соответствующих антигенов (Саltаg Lаbоrаtоriеs, США), результаты учитывают методом проточной цитофлюорометрии на проточном питометре FАСSсап (Весtоп Diсkшsоп, США). На МНЛ исследуют уровни экспрессии дифференцировочных антигенов СDЗ, CD4, CD8, CD 16; активационных антигенов CD25, CD38, HLA-DR; молекул адгезии CD57, CD58. Гейт (окно) популяции клеток устанавливают на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывают 10000 событий в гейте. Статистическую обработку результатов проводят при помощи программного пакета WINMDI 2.8. (Фиг. 1 и 2).
Пример 9. Иммунофенотипическая и морфологическая характеристика дендритных клеток
Через сутки инкубации MHJI крови определяется популяция прилипающих клеток (моноциты, макрофаги). При добавлении ГМ-КСФ и ИJI-4, как описано в Примере 5, к 5-6 сут. генерируются крупные клетки с характерными отростками (незрелые дендритные клетки). Эти ДК содержат две субпопуляции, отличающиеся степенью адгезии к пластику и способные к активной пролиферации. При добавлении ФНО ДК практически не изменяют своих морфологических свойств, однако теряют способность к пролиферации. Проведенные морфологические исследования показывают, что ДК человека представляют собой гигантские клетки с пенистой цитоплазмой, заполненной вакуолями, с активированным аппаратом Гольджи и значительным количеством митохондрий. ДК имеют характерные выросты на цитоплазме — дендритные отростки. ДК имеют характерный фенотип: низкий уровень экспрессии CD14, и высокий уровень экспрессии ко стимулирующих молекул CD40, CD80, CD86, а также характерную для ДК экспрессию молекул CD83.
Таблица 1. Иммунофенотип зрелых ДК человека
Figure imgf000027_0001
Таблица 2. Иммунофенотип зрелых ДК мыши, генерированных из костного мозга
Figure imgf000028_0001
При световой микроскопии (Фиг.З) в культуре обнаружены разрастания крупных округлых клеток со светлой или темной цитоплазмой, отростками и округлыми ядрами. Рядом с крупными клетками видны отдельные мелкие клетки.
При электронномикроскопическом исследовании (Фиг. 4) в крупных клетках имеются ядра округлой и неправильной формы с диффузным хроматином и мелкими единичными ядрышками. Ядра расположены, преимущественно, эксцентрично. Цитоплазма занимает основную часть клетки, содержит вакуоли, митохондрии, рибосомы, структуры шероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума, в единичных клетках встречаются лизосомы. На поверхности клеток имеются чаще длинные, реже короткие, тонкие переплетающиеся отростки. Иногда отростки образуют неправильной формы выпячивания цитоплазмы. Рядом с некоторыми крупными клетками располагаются мелкие единичные клетки с гиперхромными ядрами и отростчатой плазматической мембраной (моноциты).
Таким образом, большие размеры клеток, наличие развитой системы отростков, выраженная цитоплазма, характер ядер, отсутствие признаков фагоцитоза дают основание рассматривать крупные клетки как дендритные. Из 50 мл периферической крови человека может быть получено значительное количество ДК (5-12 млн.), достаточное для проведения профилактических курсов вакцинотерапии. Рекомендуемая доза для внутрикожного введения вакцины составляет 1-5 млн. ДК.
Пример 10. Оценка пролиферативной активности ДК здоровых доноров и мышей
Оценку пролиферативной активности ДК, полученных, как описано в Примере 5, из мононуклеарных клеток, проводят в колориметрическом тесте с использованием витального красителя АlаmаrВluе в стерильных условиях, используя ламинарный бокс с горизонтальным потоком воздуха (Juап VFS 906). Среду с клеточной взвесью вносят в лунки 96-лyнoчнoгo плоскодонного планшета (Соstаr) по 200 мкл на лунку. Затем добавляют BП-4 в диапазоне концентраций от 3 до 20 мкг/мл и/или цисплатин в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты помещают в CO2-инкyбaтop (370C, 5% CO2). Клетки инкубируют в присутствии этих препаратов в течение 72 часов. По окончании инкубации в лунки вносят краситель АlаmаrВluе (10 %) (Вiоsоurs, США). Оптическую плотность измеряют после четырехчасовой инкубации при 37° С, 5% CO2 на мультискане MS 340 (Lаbsуstеm, Финляндия) при длине волны 530 нм и 590 нм и выражают в условных единицах (у.е.) оптической плотности. Рассчитывают индекс стимуляции (ИС), представляющий собой отношение пролиферативной активности ДК к пролиферативной активности неактивированных макрофагов.
Аналогичное исследование было проведено на ДК мышей линии CBA. Контролем служили интактные макрофаги животных.
Спонтанная пролиферативная активность макрофагов человека составляла 0,838±0,180 у.е. (Таблица 3, группа 1). При добавлении в среду культивирования ростовых факторов ИЛ-4 и ГМ-КСФ происходило повышение пролиферативной активности генерируемых ДК клеток до 1,682 у.е. (группа 3). При добавлении к ДК ФНО, в качестве фактора их созревания отмечалось снижение пролиферативного ответа.
Таблица 3. Пролиферативная активность макрофагов и ДК (разной степени зрелости) здоровых доноров (п— 15) при коинкубации iп vitrо с ростовыми факторами
Концентрация клеток в Пролиферативная Пролиферативный
Объект среде культивирования активность, у.е. индекс
Макрофаги 10b 0,838±0,180
Незрелые ДК 10° 1,682 ±0,230 * 2,0
Зрелые ДК 10° 0,325±0,052* 0,4
Пролиферативную активность макрофагов и ДК мышей линии CBA изучали в аналогичных условиях. Через 6 сут после инкубации макрофагальных клеток мышей с ИЛ-4 и ГМ-КСФ их пролиферативная активность увеличивалась с 0,638±0,057 до 0,932±0,072 у.е. (Таблица 4). Внесение в среду культивирования ФНО оказывало выраженное угнетающее действие на пролиферацию зрелых ДК, что проявлялось в снижении пролиферативной активности в 5,2 раза, то есть до 0,123±0,029 у.е. Таблица 4. Пролиферативная активность макрофагов и ДК (разной степени зрелости) мышей (n=10) при коинкубации iп vitrо с ростовыми факторами
Figure imgf000030_0001
Примечание: HC — индекс стимуляции - отношение пролиферативной активности ДК к пролиферативной активности интактных макрофагов. Достоверность разности между группами: * р <0,05.
Полученные данные свидетельствуют о том, что дендритные клетки при коинкубации с ростовыми факторами активно пролиферируют, существенно превосходя по этому показателю интактные макрофаги (их предшественники), и теряют способность к пролиферации после созревания под воздействием ФНО. Эти результаты подтверждают, что выбранные режимы культивирования ДК являются оптимальными. Они позволяют нарастить в течение 6-7 суток достаточное количество незрелых клеток, а после пульсации полилизатом добавление ФНО прекращает их рост, что подтверждает зрелость ДК.
Пример 11. Способность дендритных клеток к продукции ФНО и ИЛ-12
Продукцию цитокинов определяют методом ИФА на Мultisсап MC-340 (Финляндия) с использование тест-систем фирмы Вiоsоurсе. Уровень цитокинов определяют в среде культивирования интактных макрофагов, незрелых и зрелых ДК человека и мышей.
Полученные данные представлены в табл. 5 и 6, соответственно.
Таблица 5. Продукция цитокинов макрофагами и ДК (разной степени зрелости) здо овых доноров n=15 п и коинк бации iп vitrо с остовыми акто ами
Figure imgf000030_0002
Достоверность различия по сравнению с макрофагами: *p <0,05. Таблица б. Продукция цитокинов макрофагами и ДК (разной степени зрелости) мышей (n=10) при коинкубации iп vitrо с ростовыми факторами
Figure imgf000031_0001
Достоверность различия по сравнению с макрофагами: * р <0,05
Представленные данные свидетельствуют о том, что ДК являются активными продуцентами хемотаксического и регуляторного пептида ИЛ-12, который способен рекрутировать в конкретную область лимфоциты, активировать их и запускать пролиферативный ответ.
Проведенные исследования фенотипа дендритных клеток, генерированных из костного мозга, свидетельствует о том, что среди них отсутствуют клетки предшественники CD34+. Высокий уровень костимулирующих молекул CD80 и CD86, а также экспрессия MHC I и II класса позволяет заключить, что данная популяция может быть отнесена к зрелым дендритным клеткам.
Пример 12. Оценка антигенпрезентирующей активности дендритных клеток
Для оценки антигенпрезентирующей активности дендритных клеток используют лимфоциты, полученные из селезенки мышей на различных этапах вакцинации пульсированными лизатом меланомы B16 дендритными клетками в дозах от 100 тыс. до lмлн. Часть мышей забивают через 3 дня после каждой пульсации и перед имплантацией опухоли. Лимфоциты выделяют из селезенки и инкубируют с опухолевыми клетками для определения цитотоксической активности.
Как следует из представленных в таблице 7 данных, оптимальной дозой для вакцинации является 1 млн. пульсированных дендритных клеток, дальнейшее увеличение дозы не приводит к повышению цитотоксической активности лимфоцитов, максимальная киллерная активность лимфоцитов отмечается после 2-3 прививки. Таблица 7. Цитотоксическая активность лимфоцитов после вакцинации мышей (%)
Figure imgf000032_0001
Достоверность различия по сравнению с контролем: *p <0,05
Пример 13. Оценка эффективности прививочных доз клеток меланомы В 16 Животным вводят различные прививочные дозы опухолевых клеток и определяют процент гибели животных в каждой группе для определения абсолютно- летальной дозы опухолевых клеток.
Представленные в таблице 8 данные позволяют сделать заключение, что доза в 50 тыс. опухолевых клеток вызывает образование опухоли и гибель животных в 100% случаев.
Таблица 8. Гибель животных после имплантации опухолевых клеток (%)
Figure imgf000032_0002
Пример 14. Оценка активности ДК-вакцины у мышей с привитой меланомой
B-16
В данном примере была использована доза вакцины, равная 1 млн. дендритных клеток/мышь, которая, как было продемонстрировано в Примере 7, является оптимальной дозой, и различные прививочные дозы опухолевых клеток.
Представленные в таблице 9 данные показывают, что полный защитный эффект от вакцинации наблюдается при прививочной дозе, не превышающей 50 тыс. опухолевых клеток. При более высоких прививочных дозах меланомы В 16 вакцина была менее эффективна, хотя при всех испытанных уровнях у провакцинированных животных опухолевые узлы верифицировались позднее, а гибель животных также наступала в более поздние сроки по сравнению с контрольной группой.
Таблица 9. Процент гибели вакцинированных мышей при различных прививочных дозах опухолевых клеток
Figure imgf000033_0001
Пример 15. Оценка противоопухолевой активности бинарной вакцины на основе дендритных клеток, пулъсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов опухолевых клеток меланомы В 16 и опухоли Эрлиха
Мышам линии C57 Bl трехкратно вводят аутовакцину с интервалом 2 недели, затем через 2 нед. после последней вакцинации вводят опухолевые клетки в дозе 50 тыс/мышь (одной группе клетки опухоли Эрлиха, второй — меланому B16 и контрольной группе — физиологический раствор). После вакцинации у части мышей удаляют селезенки, выделяют лимфоциты и определяют их цитотоксичность на опухолевых клетках меланомы и опухоли Эрлиха. В качестве контроля используют лимфоциты интактных мышей.
Как следует из данных, представленных в таблице 10, вакцина (бинарная вакцина) на основе дендритных клеток, пульсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов опухолевых клеток меланомы B16 и опухоли Эрлиха, достоверно повышает противоопухолевую киллерную активность лимфоцитов, выделенных из селезенки вакцинированных мышей, в отношении клеток меланомы В 16 и опухоли Эрлиха и практически не влияет на спонтанную цитотоксичность лимфоцитов по отношению к клеткам рака яичников. Эти результаты свидетельствуют о специфическом усилении противоопухолевой активности лимфоцитов по отношению к тем видам опухолей, к которым проводилась иммунизации. Таблица 10. Цитотоксическая активность лимфоцитов после вакцинации мышей (%)
Figure imgf000034_0001
*- достоверные изменения по сравнению с исходным уровнем (р <0,05).
Для определения протективных свойств бинарных вакцин у мышей линии C57B1 оценивали торможение роста меланомы и опухоли Эрлиха после введения дендритных клеток, пульсированных смесью антигенов указанных опухолевых клеток. Представленные в таблице 11 данные свидетельствуют о том, что бинарная вакцина в дозе 50 тыс. клеток вызывает выраженное торможение роста опухоли меланомы В 16 и опухоли Эрлиха и, следовательно, оказывает протективное действие.
Таблица 11. Торможение опухолевого роста на 30 сутки после перевивки опухоли (%)
Figure imgf000034_0002
Пример 16. Оценка противоопухолевой активности бинарной вакцины на основе дендритных клеток, пулъсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов опухолевых клеток опухоли Эрлиха и рака яичников CaO-I
На мышах линии CBA исследовали эффективность профилактической бинарной вакцины, полученной в результате пульсации дендритных клеток полилизатом, содержащим смесь лизатов опухоли Эрлиха и рака яичников CaO-I . Как следует из данных, представленных в табл. 12, бинарная вакцина вызывает выраженное торможение роста опухоли Эрлиха и CaO-I на 20 сут. после перевивки опухолей. Таким образом, вакцины на основе дендритных клеток, пульсированных полилизатом, содержащим смесь лизатов клеток опухоли Эрлиха и рака яичников CaO-I, оказывают противоопухолевое профилактическое действие. Таблица 12. Торможение опухолевого роста на 20 сутки после перевивки опухоли (%)
Figure imgf000035_0001
Пример 17. Оценка отсроченной эффективности бинарной вакцины Отсроченную эффективность бинарной вакцины у мышей с привитыми опухолями меланомы B-16 и карциномы Эрлиха оценивают через 1-3 мес. после последней вакцинации. Процент торможения опухолевого роста определяют на 14 и 20 сутки после перевивки опухоли по сравнению с контролем, при различных сроках введения опухолевых клеток.
Как следует из приведенных в таблице 13 данных, достоверных различий в эффективности вакцин по сравнению с приведенными выше результатами при трансплантации опухоли через 2 нед. после завершения вакцинации не отмечено. Это свидетельствует о сохранении профилактического действия вакцины по меньшей мере в течение 1 мес.
Таблица 13. Процент торможения опухолевого роста после перевивки опухоли по сравнению с контролем, через 1 мес. после вакцинации бинарной вакциной
Figure imgf000035_0002
Через 2 мес. после вакцинации защитное действие бинарной вакцины несколько ослабевало, однако эффект торможения превышал 50% (Таблица 14), что позволяет рассматривать его как значимый.
Таблица 14. Процент торможения опухолевого роста после перевивки опухоли по сравнению с контролем, через 2 мес. после вакцинации бинарной вакциной
Figure imgf000035_0003
Согласно данным, представленным в таблице 15, через 3 мес. после вакцинации торможение опухолевого роста более чем на 50% отмечается только в отношении меланомы В 16 на 14 сутки после имплантации опухоли. Следовательно, защитный эффект бинарной вакцины длится в течение 3 мес.
Таблица 15. Процент торможения опухолевого роста на 14 и 20 сут после перевивки опухоли по сравнению с контролем, через 3 мес. после вакцинации бинарной вакциной
Figure imgf000036_0001
Учитывая снижения защитного эффекта ДК-вакцины в течение 3 мес. в специальной серии экспериментов 8 мышам спустя 3 мес. вакцинации дважды с интервалом в 2 недели проводят повторный курс вакцинации ДК, пульсированными полилизатом, содержащим смесь лизатов меланомы и опухоли Эрлиха. Через две недели после перевивки опухоли оценивают величину образовавшихся узлов. Полученные данные (Таблица 16) свидетельствуют о том, что повторные вакцинации усиливают защитный эффект ДК-вакцины, который ослабевает к 3 мес. после первого цикла вакцинации.
Таблица 16. Процент торможения опухолевого роста на 20 сут после перевивки опухоли по сравнению с контролем, при повторной вакцинации
Figure imgf000036_0002
Таким образом, при использовании стандартных моделей для экспериментальной онкологии — мышей с привитыми опухолями, показано, что вакцины, содержащие дендритные клетки настоящего изобретения, пульсированные полилизатом, содержащим лизаты двух различных опухолей, оказывают профилактическое действие и защищают от развития опухоли при трансплантации животным опухолевых клеток в дозах, вызывающих 100% развитие опухоли. Представленные экспериментальные данные о низкой эффективности ДК-вакцин при имплантации мышам больших доз опухолевых клеток (более 300 тыс. клеток на мышь), свидетельствуют о том, что предлагаемые для клинического применения лечебные режимы вакцинации ДК будут мало эффективны. Эти результаты в целом не противоречат материалам клинических испытаний ДК-вакцин. Поэтому, наиболее оптимальной областью применения ДК-вакцин является профилактика злокачественных новообразований, в частности у групп риска, и профилактики рецидивов заболевания после противоопухолевого лечения. Основной проблемой для получения профилактических вакцин является отсутствие или недоступность аутологичного опухолевого материала. Для этих целей могут быть использованы полилизаты тех гистологических вариантов рака, возникновение/рецидив которых наиболее вероятен у данного пациента или животного.
Следует понимать, что специалистом могут быть сделаны различные модификации или усовершенствования настоящего изобретения, однако все они будут охватываться притязаниями, объем которых определяется следующей далее формулой изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Зрелые дендритные клетки, характеризующиеся тем, что они получены из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагружены полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей.
2. Дендритные клетки по п. 1, где млекопитающее является человеком.
3. Дендритные клетки по п. 1, где млекопитающее выбрано из группы, включающей кошку, собаку, лошадь.
4. Дендритные клетки по любому из предшествующих пунктов, где опухоли выбраны из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
5. Способ получения зрелых дендритных клеток из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, предусматривающий следующие стадии: а) выделение мононуклеарных лимфоцитов из индивида; б) инкубацию выделенных мононуклеарных лимфоцитов с ростовыми факторами для получения из них незрелых дендритных клеток; в) получение полилизата опухолей; г) обработку полученных незрелых дендритных клеток полилизатом опухолей; д) индукцию созревания незрелых дендритных клеток, обработанных полилизатом опухолей, в зрелые дендритные клетки, нагруженные полилизатом опухолей.
6. Способ по п. 5, в котором млекопитающее является человеком.
7. Способ по п. 5, в котором млекопитающее выбрано из группы, включающей кошку, собаку, лошадь.
8. Способ по п. 5, в котором мононуклеарные лейкоциты выделяют из периферической крови индивида.
9. Способ по п. 5, в котором в качестве ростовых факторов используют гранулоцит/макрофаг-колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интepлeйкин-4 (ИЛ-4).
10. Способ по п. 5, в котором полилизат опухолей получают из опухолей, выбранных из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
11. Способ по п. 5, в котором полилизаты получают путем трехкратного повторения замораживания и размораживания измельченной опухоли в дистиллированной воде и последующего фильтрования через стерилизующий фильтр.
12. Способ по п. 5, в котором индукцию созревания осуществляют при помощи ФНО-α.
13. Противоопухолевая вакцина, характеризующаяся тем, что она содержит в эффективном количестве зрелые дендритные клетки, полученные из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженные полилизатом опухолей различного происхождения, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, и физиологически приемлемые носители, наполнители или другие добавки.
14. Противоопухолевая вакцина по п. 13, дополнительно содержащая по меньшей мере один иммуномодулятор.
15. Противоопухолевая вакцина по п. 13, в которой иммуномодулятором является полиоксидоний.
16. Противоопухолевая вакцина по п. 13, где млекопитающее является человеком.
17. Противоопухолевая вакцина по п. 13, где млекопитающее выбрано из группы, включающей кошку, собаку, лошадь.
18. Противоопухолевая вакцина по п. 13, характеризующаяся тем, что полилизат получают из опухолей, выбранных из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
19. Противоопухолевая вакцина по любому из пп. 13-18, применяемая для профилактики злокачественного новообразования у указанного индивида, нуждающегося в этом, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
20. Противоопухолевая вакцина по любому из пп. 13-18, применяемая для предупреждения рецидива злокачественного новообразования у указанного индивида, нуждающегося в этом, после противоопухолевого лечения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
21. Противоопухолевая вакцина по любому из rm. 13-18, применяемая для профилактики злокачественного новообразования у указанного индивида, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака, причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата.
22. Применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины по любому из пп. 13-18 для изготовления лекарственного средства для профилактики злокачественного новообразования у указанного индивида, нуждающегося в этом, причем подлежащее профилактике злокачественное новообразование относится к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
23. Применение по п. 22, где млекопитающее является человеком.
24. Применение по п. 22, где млекопитающее выбрано из группы, включающей кошку, собаку, лошадь.
25. Применение по любому из пунктов 22-24, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
26. Применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины по любому из пп. 13-18 для изготовления лекарственного средства для предупреждения рецидива злокачественного новообразования у указанного индивида, нуждающегося в этом, после противоопухолевого лечения, причем подлежащее предупреждению рецидива злокачественное новообразование относятся к тому же типу, что и по меньшей мере одна из опухолей, использованных для получения полилизата.
27. Применение по п. 26, где млекопитающее является человеком.
28. Применение по п. 26, где млекопитающее выбрано из группы, включающей кошку, собаку, лошадь.
29. Применение по любому из пунктов 26-28, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
30. Применение зрелых дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов индивида, являющегося млекопитающим, и нагруженных полилизатом, полученным по меньшей мере из двух типов опухолей, или противоопухолевой вакцины по любому из пп. 13-18 для изготовления лекарственного средства для профилактики злокачественного новообразования у указанного индивида, относящегося к группе риска или предрасположенного к «ceмeйным фopмaм» рака, причем подлежащие профилактике формы рака относятся к тем же типам, что и опухоли, использованные для получения полилизата.
31. Применение по п. 30, где млекопитающее является человеком.
32. Применение по любому из пунктов 30-31, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей рак яичников, рак кишечника, рак пищевода, рак желудка, рак молочной железы, меланому, рак почки, рак легкого.
PCT/RU2005/000348 2005-06-23 2005-06-23 Cellules dendritiques matures chargees d'un polylysat de tumeurs, et vaccin antitumoral a base desdites cellules WO2007001200A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2005/000348 WO2007001200A1 (fr) 2005-06-23 2005-06-23 Cellules dendritiques matures chargees d'un polylysat de tumeurs, et vaccin antitumoral a base desdites cellules

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2005/000348 WO2007001200A1 (fr) 2005-06-23 2005-06-23 Cellules dendritiques matures chargees d'un polylysat de tumeurs, et vaccin antitumoral a base desdites cellules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007001200A1 true WO2007001200A1 (fr) 2007-01-04

Family

ID=37595373

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2005/000348 WO2007001200A1 (fr) 2005-06-23 2005-06-23 Cellules dendritiques matures chargees d'un polylysat de tumeurs, et vaccin antitumoral a base desdites cellules

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2007001200A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012110639A1 (de) * 2011-02-17 2012-08-23 Grammel Thomas Verfahren zur herstellung eines dc-vakzins gegen krebs
RU2589256C2 (ru) * 2010-12-03 2016-07-10 Санофи Пастер Лимитид Композиции и способы для иммунизации против streptococcus pneumoniae

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
JP2001181205A (ja) * 1999-11-12 2001-07-03 Jiu Ri 樹状細胞と腫瘍細胞を用いた腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方法
JP2002325570A (ja) * 2000-09-14 2002-11-12 Eppendorf Ag 樹枝状細胞と疾病組織細胞、特に腫瘍細胞とを融合する方法及びこの種の方法のための媒体
WO2004018659A1 (en) * 2002-08-16 2004-03-04 Glycotope Gmbh Process for the production of temperature-induced tumor cell lysates for use as immunogenic compounds
WO2004053072A2 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Northwest Biotherapeutics, Inc. Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2073031C1 (ru) * 1990-08-06 1997-02-10 Некрасов Аркадий Васильевич Производные поли-1,4-этиленпиперазина, обладающие иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностями
JP2001181205A (ja) * 1999-11-12 2001-07-03 Jiu Ri 樹状細胞と腫瘍細胞を用いた腫瘍特異的抗腫瘍細胞性ワクチンの製造方法
JP2002325570A (ja) * 2000-09-14 2002-11-12 Eppendorf Ag 樹枝状細胞と疾病組織細胞、特に腫瘍細胞とを融合する方法及びこの種の方法のための媒体
WO2004018659A1 (en) * 2002-08-16 2004-03-04 Glycotope Gmbh Process for the production of temperature-induced tumor cell lysates for use as immunogenic compounds
WO2004053072A2 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Northwest Biotherapeutics, Inc. Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2589256C2 (ru) * 2010-12-03 2016-07-10 Санофи Пастер Лимитид Композиции и способы для иммунизации против streptococcus pneumoniae
WO2012110639A1 (de) * 2011-02-17 2012-08-23 Grammel Thomas Verfahren zur herstellung eines dc-vakzins gegen krebs

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bonasio et al. Generation, migration and function of circulating dendritic cells
Wang et al. Eliciting T cell immunity against poorly immunogenic tumors by immunization with dendritic cell-tumor fusion vaccines
US8420078B2 (en) Methods and immunogenic cell preparations for treating antigen-associated diseases
US6251665B1 (en) Directed maturation of stem cells and production of programmable antigen presenting dentritic cells therefrom
CN110846281B (zh) 一种基于外泌体的抗肿瘤疫苗
EA004300B1 (ru) Клеточная везикула, называемая &#34;текзосома&#34;, ее получение и применение для стимуляции иммунного ответа
CN101511384A (zh) 采用GM-CSF和α干扰素制成的并装载热处理的且杀死的癌细胞的树突状细胞
ES2234928T3 (es) Generacion y uso de celulas dendriticas.
Kjaergaard et al. Electrofusion of syngeneic dendritic cells and tumor generates potent therapeutic vaccine
JP2006518219A (ja) 電気穿孔法による細胞への抗原の負荷方法
CA2322712A1 (fr) Methodes d&#39;activation de cellules tueuses naturelles (nk)
US6703016B1 (en) Apoptotic bodies, monocyte derived cells containing the same, a process for their preparation and their uses as vaccines
JP2008523067A (ja) 癌ワクチンアジュバントとしてのαサイモシンペプチド
CA2367590A1 (en) In vitro induction of antigen-specific t-cells using dendritic cell-tumor cell or dendritic cell-viral cell derived immunogens
JP6029677B2 (ja) 腫瘍免疫療法のためのワクチン
Liu et al. A novel multifunctional vaccine platform with dendritic cell-targeting and pH-responsive for cancer immunotherapy: Antigen-directed biomimetic fabrication of a cabbage-like mannatide-zinc-antigen hybrid microparticles
RU2749610C2 (ru) Способы, относящиеся к композициям активированных дендритных клеток и к иммунотерапевтическому лечению индивидуумов с прогрессирующим раком
KR100363587B1 (ko) 대식세포와 종양세포의 융합에 의한 항종양 세포성 치료제
Banchereau Dendritic cells: therapeutic potentials
RU2392946C2 (ru) Аутологичная вакцина для лечения онкологических заболеваний и способ ее получения
WO2007001200A1 (fr) Cellules dendritiques matures chargees d&#39;un polylysat de tumeurs, et vaccin antitumoral a base desdites cellules
AR Aleixo et al. Immunotherapy with dendritic cells as a cancer treatment: perspectives and therapeutic potential
RU2395572C1 (ru) Линия клеток меланомы человека ig, секретирующих рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
US20110250687A1 (en) Cell adhesion inhibitor (CAI) with combination growth factors mobilization of peripheral blood mononuclear cells for CAI derived dendritic cell (CdDC) preparation and dendritic cell vaccine preparations generated from CdDC
RU2395571C1 (ru) Линия клеток меланомы человека 26g, секретирующих рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008102736

Country of ref document: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05824892

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1