WO2007001021A1 - 酵素活性の測定方法 - Google Patents

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WO2007001021A1
WO2007001021A1 PCT/JP2006/312889 JP2006312889W WO2007001021A1 WO 2007001021 A1 WO2007001021 A1 WO 2007001021A1 JP 2006312889 W JP2006312889 W JP 2006312889W WO 2007001021 A1 WO2007001021 A1 WO 2007001021A1
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protein
derivative
nah
enzyme
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PCT/JP2006/312889
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Koji Yamamoto
Kiyoshi Suzuki
Shuichi Miyaura
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Seikagaku Corporation
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C08B37/0081—Reaction with amino acids, peptides, or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a novel modified polysaccharide, a solid phase to which the polysaccharide is fixed, a method for detecting N-deacetylase activity, N-sulfotransferase activity, and N-deacetylase ZN sulfotransferase activity in a sample using the solid phase. And to these detection kits.
  • BS A bovine serum albumin
  • EDC 1-Ethyl 3- (3 Dimethylaminopropyl) carbodiimide (1-ethy ⁇ 3- (3-dimethnylaminopropyOcarbodnmide)
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • GlcN Gnorecosamine (glucosaminej
  • HRP Horseradish Penoleoxita, ⁇ ⁇ "tr (horseradish peroxidase)
  • immunoglobulin G immunoglobulin G
  • N-deacetylase NDST N-deacetylase ZN—snoleotransferase (N-deacetylase / N-sulfotransferase)
  • PAPS 5, phosphoadenosine 3, phosphoadenosine 3, phosphosulfate
  • PBS phosphate buffered saline
  • TBS Tris-HC1 buffered saline
  • TMB 3,3 ', 5,5' -tetramethylbenzidine (3,3,5,5, -tetramethylbenzidine)
  • NDST is an enzyme involved in the synthesis of HP and HS, and has both ND activity and ST activity.
  • NDST has four types of variants (NDST1, NDST2, NDST3, NDST4), and it has been reported that their substrate specificities are different.
  • NDST 3 has high ND activity and low ST activity.
  • NDST4 has weak ND activity and extremely high ST activity (Non-patent Document 1).
  • NDST1 knockout mice have been reported to be neonatal lethal.
  • ND ST2 knockout mice are not lethal, but changes such as decreased granule in mast cells, decreased HP negative charge, and decreased histamine content to 1Z170 have been reported (Non-Patent Document 2 to 8). Therefore, NDST force S may be involved in diseases caused by such in vivo phenomena.
  • NAH substrate
  • acetyl group in the GlcNAc residue is labeled with a radioisotope ()
  • a radioisotope is used to react with the NAH by enzymatic action.
  • the former measurement method is a force sandwich method that utilizes the reaction of the de-N-acetyl group generated by ND and the antibody JM403, and therefore requires at least two epitopes. In addition, this method cannot detect ST activity (Non-patent Document 11).
  • the latter measurement method is based on de-N-acetylenic acid produced by ND activity and ST activity.
  • This method is not suitable for methods of measuring the activity of multiple samples such as chromatography and screening (Patent Document 2, Non-Patent Document 17).
  • Patent Document 1 US Patent Application Publication No. 2003Z0109501
  • Patent Document 2 US Patent Application Publication No. 2004Z0043447
  • Non-Patent Document 1 Aika, J. et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276, 8, p. 5876—58 82
  • Non-Patent Document 2 Humphries, DE (Humphries, DE) et al., 1999, Nature 400, p. 769-772
  • Non-Patent Document 3 Forsberg, E (Forsberg, E.) et al., 1999, Nature, 400, p. 773-776
  • Non-Patent Document 4 Ringivall, M. et al., 2000, Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 34, p. 259 26-25930
  • Non-Patent Document 5 Vikas, DS (Pikas, D.E.) et al., 2000, Biochemistry, 39, p.4552-4558
  • Non-Patent Document 6 Fukuda, M. et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 51, p.47747—47750
  • Non-Patent Document 7 Esco, JD (Esko, JD) et al., 2001, Journal of Clinical Investigation, Vol. 108, p. 169-173
  • Non-Patent Document 8 Forsberg, E. et al., 2001, Journal of Clinical Investigation, 108, p. 17 5-180
  • Non-Patent Document 9 Van den Born, J et al., 1992, Kidney International, 41st, p. 115-123
  • Non-Patent Document 10 Van den Born, J et al., 1995, Journal of Biological Chemistry, No. 270, No. 52, p. 31303-31309
  • Non-Patent Document 11 Van den Born, J et al., 2003, Glycobiology, 13th, No. 1, p. 1-10
  • Non-Patent Document 12 Brandan, E (Brandan, E.) et al., 1988, Journal of Biological Chemistry, No. 263, No. 5, p. 2417-2422
  • Non-Patent Document 13 Baime, KJ (Bame, KJ) et al., 1991, Journal of Biological Chemistry, Vol. 266, No. 16, p. 10287-10293
  • Non-Patent Document 14 Baime, KJ et al., 1991, Journal of Biological Chemistry, Vol. 266, No. 19, p. 12461-12468
  • Non-Patent Document 15 Verdago, DE (Verdugo, D.E.) et al., 2002, Analytical Biochemistry, No. 307, p. 330—336
  • Non-Patent Document 16 Laboratory for New Chemistry Experiment 3, Carbohydrate II (Tokyo Kagaku Doujin, 1991) p49-62
  • Non-Patent Document 17 Saribas, AS (Saribas, AS) et al., 2004, Glycobiology ), No. 14, No. 12, p. 1217-1228
  • the present invention relates to a method and kit capable of measuring the activity of enzymes involved in the biosynthesis of HPZHS, in particular, ND, ST and NDST in a simple, rapid, highly sensitive, highly accurate and inexpensive manner, and these It is an object of the present invention to provide a screening method for a substance that changes the activity of an enzyme.
  • the inventors of the present invention newly produced a modified polysaccharide in which a specific substance is bound to NAH or its derivative, and when this was used, ND, ST and We found that the activity of NDST can be measured easily, quickly, with high sensitivity, high accuracy and low cost. Based on this, the present invention provides a method and kit that can measure ND, ST, and NDST activities simply, quickly, with high sensitivity, high accuracy, and low cost, and a screening method for substances that change the activities of these enzymes. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention provides a modified polysaccharide (hereinafter referred to as “the polysaccharide of the present invention”) characterized in that a substance having the following group power also selected is bound to NAH or a derivative thereof.
  • the polysaccharide of the present invention characterized in that a substance having the following group power also selected is bound to NAH or a derivative thereof.
  • This bond is preferably formed between the aforementioned substance and the reducing end of NAH or a derivative thereof.
  • the bond to the protein is preferably a covalent bond or an affinity bond.
  • This covalent bond is preferably an SS bond or an amide bond.
  • the affinity bond is a piotin'avidin bond.
  • the protein is preferably a soluble protein having a molecular weight of 150,000 to 200,000.
  • the “soluble protein having a molecular weight of 1.50,000 to 200,000” is preferably an immunoglobulin, avidin, protein A, protein G, albumin or casein. This albumin is preferably serum albumin or ovalbumin.
  • the NAH derivative is preferably a substance that can be selected from the following (1) to (3) group forces.
  • the present invention also provides a solid phase to which the polysaccharide of the present invention is fixed (hereinafter referred to as "the solid phase of the present invention").
  • the present invention also provides a method for detecting ND activity in a specimen (hereinafter referred to as “the ND detection method of the present invention”), which comprises at least the following steps (a) and (b).
  • This de-N-acetylation is detected by bringing the solid phase of the present invention into contact with "a protein that binds to a GlcN residue in NAH or a derivative thereof (ie, a GlcNAc residue de-N-acetylated)". Is preferably performed.
  • the “protein” that binds to the GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably an antibody.
  • the antibody that binds to the GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably monoclonal antibody JM403.
  • the present invention also provides a detection kit for ND activity in a specimen (hereinafter referred to as "the ND detection kit of the present invention") comprising at least the following components (A) and (B).
  • the polysaccharide of the present invention is preferably fixed to a solid phase.
  • NAH or its invitation The “protein” that binds to the GlcN residue in the conductor is preferably an antibody.
  • Antibodies that bind to GlcN residues in AH or its derivatives are monoclonal antibodies JM
  • the present invention also provides a method for detecting ST activity in a sample (hereinafter referred to as “the ST detection method of the present invention”), which comprises at least the following steps (c) and (d).
  • the detection of N-sulfation is preferably performed by bringing the solid phase of the present invention into contact with "a protein that binds to a GlcN residue that is ligated with N-sulfate in NAH or a derivative thereof".
  • the “protein” that binds to the N-sulfated GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably an antibody.
  • the antibody that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably monoclonal antibody F58-10E4 or monoclonal antibody HepSS-1. Of these, the monoclonal antibody F58-10E4 can be preferably used.
  • the present invention also provides a kit for detecting ST activity in a sample (hereinafter referred to as "the ST detection kit of the present invention") comprising at least the following components (A) and (C).
  • (C) A protein that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or its derivatives.
  • the polysaccharide of the present invention is preferably fixed to a solid phase.
  • the “protein” that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or its derivative is preferably an antibody.
  • the antibody that binds to the N-sulfated GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably monoclonal antibody F58-10E4 or monoclonal antibody HepSS-l. Of these, the monoclonal antibody F58-10E4 can be preferably used!
  • the present invention is characterized in that ND activity in a sample is detected by the ND detection method of the present invention, and ST activity in the sample is detected by the ST detection method of the present invention.
  • a method for detecting NDST activity (hereinafter referred to as “the NDST detection method of the present invention”) is provided.
  • the present invention also provides a detection kit for NDST activity in a specimen (hereinafter referred to as "the NDST detection kit of the present invention"), which comprises at least the following components (A), (B) and (C). provide.
  • (C) A protein that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or its derivatives.
  • the polysaccharide of the present invention is preferably fixed to a solid phase.
  • the “protein” that binds to the GlcN residue in NAH or its derivative is preferably an antibody.
  • the antibody that binds to the GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably monoclonal antibody JM403.
  • the "protein” that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably an antibody.
  • the antibody that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or a derivative thereof is preferably monoclonal antibody F58-10E4 or monoclonal antibody HepSS-1. Of these, the monoclonal antibody F58-10E4 can be preferably used.
  • the present invention also includes a screening method for a substance that alters the activity of one or more enzymes selected from the following enzyme group (hereinafter referred to as "the present invention") comprising at least the following steps (e) to (g).
  • a clear screening method ").
  • Enzyme group strength Select a test substance that changes the activity of one or more selected enzymes. Step to choose.
  • the polysaccharide of the present invention can be used as a material for the solid phase of the present invention and is extremely useful.
  • the solid phase of the present invention can be used in various detection methods and various detection kits of the present invention and is extremely useful.
  • the ND detection method of the present invention, the ST detection method of the present invention, and the NDST detection method of the present invention are all simple, rapid, specific, highly sensitive, highly accurate, and inexpensive in quantitatively measuring ND activity, ST activity, or ND ST activity. It can be detected with good reproducibility and is extremely useful.
  • the ND detection kit of the present invention, the ST detection kit of the present invention, and the NDST detection kit of the present invention are all very useful because they make the above detection method more simple and quick.
  • the screening method of the present invention is extremely useful because it can screen ND, ST, or a substance that changes the activity of NDST simply, rapidly, with high sensitivity, high accuracy and low cost. Furthermore, the present invention is extremely useful because it can be used for detection of diseases caused by abnormal enzyme activities such as NDST, detection of risks thereof, and understanding of disease states.
  • FIG. 1 is a graph showing dose dependency of ND activity when NAH-SS-BSA-immobilized plates are used.
  • FIG. 2 is a diagram showing the dose dependency of ND activity when NAH-COOH-BSA solid-phased plates are used.
  • FIG. 3 is a graph showing the reaction time dependence of ND activity when NAH-SS-BSA solid phase plates are used.
  • FIG. 4 is a graph showing the dose dependency and PAPS dependency of ST activity (NDST activity) when NAH-SS-BSA solid phase plates are used.
  • FIG. 5 shows the reaction time dependence of ST activity (NDST activity) and the effect of heat treatment when using NAH-SS-BSA solid-phase plates.
  • FIG. 6 is a graph showing the dose dependency of ND activity using a “plate on which NAH-piotine is fixed via avidin”.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of screening for inhibitors of ND activity using a “plate on which NAH-piotine is affixed via avidin”.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of detection of ND activity using sandwich ELIS A.
  • the polysaccharide of the present invention is a modified polysaccharide characterized in that a substance selected from the following group strength is bound to NAH or a derivative thereof.
  • the "protein” here is not particularly limited, but is preferably a soluble protein having a molecular weight of 150,000 to 200,000, and preferably a soluble protein having a molecular weight of 1.50,000 to 100,000. More preferable molecular weight 1. It is more preferable that the soluble protein has a molecular weight of 50,000 to 70,000.
  • “soluble” means that the protein can be dissolved in an aqueous solvent such as water, a physiological salt solution (such as physiological saline), or a buffer solution at room temperature.
  • Examples of the soluble protein having a molecular weight of 1.50,000 to 200,000 include immunoglobulin, avidin, protein A, protein G, albumin, and force zein.
  • Examples of the soluble protein having a molecular weight of 150,000 to 100,000 and a molecular weight of 150,000 to 70,000 include avidin, protein A, protein G, albumin, and casein. Of these, albumin or casein is preferable.
  • albumin serum albumin or ovalbumin can be exemplified.
  • NAH is not particularly limited as long as they are recognized as NAH in the art.
  • NAH is a sugar chain in which GlcA residues and GlcNAc residues are alternately glycosidically linked.
  • the bond between GlcA and GlcNAc residues is an
  • the general formula of ⁇ can be represented by the following (1) or (2).
  • NAH can be used as a raw material for the polysaccharide of the present invention. Its origin is not particularly limited. For example, it may be derived from a natural product, or may be synthesized enzymatically or chemically. Examples of those derived from natural products include those derived from bacteria that produce NAH. Examples of such bacteria include certain types of E. coli and Pasella species. Specifically, for example, Escherichia coli K5 strain and Pasturella multosida can be exemplified. NAH can be produced, for example, by the method described in JP-A-2004-18840.
  • NAH derivative means that the NAH sugar chain skeleton is maintained while other functional groups are held, or conversely NAH sugar chain skeleton. In this case, it means that all the functional groups that should be originally retained are modified, such as those in which functional groups to be lost are lost. Therefore, those in which the sulfate group is retained in NAH, those in which the acetyl group is eliminated from NAH, and those in which uronic acid is an epi isomer are all included in the concept of “derivatives of NAH”. However, it is not limited to these.
  • the term “derivative of NAH” in this application is a concept that includes not only NAH as a raw material but also those obtained by modifying NAH as a raw material.
  • NAH derivative is preferably a substance selected from the group consisting of the following (1) to (3).
  • N desulfation ⁇ HP refers to HP in which the sulfate group bonded to the 2-position amino group of GlcN residue in HP is desulfated
  • N desulfation ⁇ / N acetylyl ⁇ HP refers to HP in which the sulfate group bonded to the 2-position amino group of the GlcN residue in HP is desulfurized and the 2-position amino group of the GlcN residue is acetylated.
  • N desulfation ⁇ HS refers to HS in which the sulfate group bonded to the 2-position amino group of the GlcN residue in HS is desulfated
  • N desulfation ⁇ ZN acetylated HS Is linked to the 2-position amino group of the GlcN residue in HS.
  • HS in which the 2-position amino group of the GlcN residue is acetylated after the combined sulfate groups have been desulfurized.
  • De-N-acetylated NAH refers to NAH in which the GlcNAc residue in NAH is de-N-acetylated.
  • N-desulfated HP, N-desulfated HS, N-desulfated ZN-acetylated HP and N-desulfated ZN-acetylated HS are described in JP-A-2003-113090 using HP and HS as raw materials. Can be produced according to the methods described above.
  • “de-N-acetylated NAH” is obtained by using the method of Leali, D. et al. (J. Biol. Chem., 276, 41, 37900-37908 (2001)) or the method of Shaklee, PK et al. (Biochem. J., 217, 187-497 (1984)) and the like.
  • human ND ST prepared according to the method of Aikawa, J. et al. J. Biol. Chem., 274 (5), 2690-2695 (1999)
  • the weight average molecular weight of NAH or a derivative thereof that can be used as a raw material of the polysaccharide of the present invention is not particularly limited, and varies depending on the presence or absence of a sulfate group, a acetyl group, or the like, the presence or absence of addition of other compounds, and the like.
  • the value of 1,500 to 500,000 is preferable. More than 4,000 to 200,000, more preferably 10,000 to 200,000, more preferably 20,000 to 150,000, more preferably 20,000 to 100,000 More preferably, 20,000 to 80,000.
  • the polysaccharide of the present invention is characterized in that the substance selected for group power is bound to such NAH or a derivative thereof.
  • the mode of “binding” here is not particularly limited as long as the substance selected from the above group and NAH or a derivative thereof do not dissociate even in an aqueous solution and are bonds having a strength higher than the strength. Not. Examples of such bonds include two nuclear ⁇ , a covalent bond formed by sharing some electrons, and an affinity bond formed by affinity between two molecules.
  • bonds selected from the above group is a protein
  • examples of the covalent bond include an SS bond, an aminoalkyl bond, and an amide bond.
  • affinity bond examples include piotin 'avidin bond (bond between piotin and avidin).
  • avidin in the present application document naturally includes streptavidin.
  • the substance selected for group power is piotin, for example, NAH or a derivative thereof is used as a raw material, and the method of Osmond, RIW et al. (Anal. Biochem., 310, 199-207 (2002) ) To produce a pyotinated derivative of NAH or its derivatives. According to this method, it is possible to covalently bond piotin to the reducing end of NAH or its derivative.
  • the substance whose group power is also selected is an antigen substance
  • a method of binding to NAH or a derivative thereof can be selected according to the type of the antigen substance.
  • the antigenic substance is a peptide
  • the same method as that for binding the above-mentioned protein can be employed.
  • antigen substance means a substance (antigen substance) from which an antibody against the antigen is produced when it is used as an immunogen.
  • the polysaccharide of the present invention may be produced by producing NAH or a derivative thereof having a desired structure and then combining it with a substance selected by the above-mentioned group power.
  • the polysaccharide as a raw material may be preliminarily bound to a substance selected from the above group, and then the sugar chain portion may be modified to have a desired structure by the above-described various sugar chain modification methods. good.
  • such a polysaccharide of the present invention may be further bound to another substance.
  • protein A or protein G may be bound to NAH or a derivative thereof that may be bound to protein A or protein G via the immunoglobulin part.
  • the conjugated polysaccharide of the present invention may be bound to immunoglobulin via the protein A or protein G moiety.
  • avidin is bound to NAH or a derivative thereof, and the polysaccharide of the present invention may be bound to piotin via the avidin moiety.
  • the polysaccharide of the present invention may be bound to avidin via the piotin moiety.
  • polysaccharide of the present invention in which an antigenic substance is bound to NAH or a derivative thereof may be bound to an antibody against the polysaccharide through the antigenic substance part, and the antibody is bound to NAH or a derivative thereof.
  • the polysaccharide of the invention may be bound to the antigenic substance against this through the antibody part. Substances thus obtained are also included in the polysaccharide of the present invention. It is.
  • the ability to show an example of a method for covalently binding a protein and NAH is not limited to these.
  • Example (1) Reductively aminated NAH using sodium cyanoborohydride or the like, SPD P is added to obtain PDP-modified NAH, and dithiothreitol or the like is added thereto. Get SH—NAH. On the other hand, SPDP is added to the protein to obtain PDP-modified protein. Next, the proteins are brought into contact with the reducing end of NAH by bringing them into contact and conducting a conjugation reaction (both of them bind when SH-NAH is used as a reducing agent to reduce PDP protein). A method of sharing. The resulting covalent bond is an SS bond.
  • Example (2) “NAH reductively aminated using sodium cyanoborohydride” and EDC are added to the protein, and the conjugation reaction (EDC acts as an activator and both To covalently bond the carboxyl group of the protein and the amino group introduced at the reducing end of NAH. The resulting covalent bond is an amide bond.
  • Example (3) A method in which a formyl group at the reducing end of NAH and an amino group of a protein are reacted to form a Schiff base, which is then reduced using a reducing agent such as trimethylamine borane and covalently bonded. .
  • the covalent bond formed thereby is an aminoalkyl bond (—CH 2 —NH—).
  • Example (4) After reducing the reducing end of NAH, periodate is oxidized to introduce a free formyl group, and this is reacted with an amino group of a protein to form a Schiff base.
  • Illustration (5) A method of covalently binding NAH and an amino group of a protein using benzoquinone or the like.
  • a known method can be adopted as a method for forming the above-described utility bond. Examples of methods for binding a protein to NAH are shown below, but the method is not limited thereto.
  • Illustration (6) N by reductive amination using sodium cyanoborohydride or the like Piotin is bound to the amino group site at the reducing end of AH or the carboxyl group site of NAH.
  • a method of binding avidin to a protein and bringing them into contact with each other to effect affinity binding (piotine-avidin binding).
  • Example (7) A method of binding NAH to avidin by any one of Examples (1) to (5). Further, if necessary, by reacting a protein with a protein such as a piotin derivative (Pierce) that specifically binds to an amino group or carboxyl group, the protein is bound to the amino group or carboxyl group site, A method of making a bond (Piotin 'avidin bond) by contacting this with NAH to which avidin is bound
  • a protein such as a piotin derivative (Pierce) that specifically binds to an amino group or carboxyl group
  • Example (8) NAH is bound to various antigenic substances (eg, antigenic peptide (eg, vaccine) etc.) by any of the methods of Example (1) to Example (5). Next, a method of affinity binding (antigen-antibody binding) by bringing this into contact with an antibody against this antigenic substance.
  • antigenic substances eg, antigenic peptide (eg, vaccine) etc.
  • Illustrative (9) NAH is bound to various antibodies (for example, anti-BSA antibody etc.) by any of the illustrative (1) to illustrative (5) methods. Further, if necessary, a method of binding a protein (antigen / antibody binding) by bringing this into contact with an antigen protein for this antibody.
  • Example (10) NAH is bound to protein A (or protein G) by any of the methods of examples (1) to (5). In addition, if necessary, this is further contacted with an immunoglobulin (such as IgG) to effect affinity binding (protein A (or protein G) 'immunoglobulin binding).
  • an immunoglobulin such as IgG
  • Exemplification (11) NAH is bound to an immunoglobulin (IgG or the like) by any of the methods shown in Exemplifications (1) to (5). In addition, if necessary, this is further brought into contact with protein A (protein G) to effect affinity binding (protein A (or protein G) 'immunoglobulin binding).
  • protein A protein G
  • affinity binding protein A (or protein G) 'immunoglobulin binding
  • the "bond" in the polysaccharide of the present invention is formed between a substance selected from the above group and the reducing end of NAH or a derivative thereof.
  • the substance selected for group power By combining the substance selected for group power and NAH or a derivative thereof by such a method or the like, the substance selected for group power binds to NAH or a derivative thereof.
  • a modified polysaccharide (the polysaccharide of the present invention) can be produced.
  • the solid phase of the present invention is a solid phase to which the polysaccharide of the present invention is fixed.
  • the polysaccharide of the present invention is as described above.
  • the solid phase to which the polysaccharide of the present invention is fixed is not particularly limited as long as it can fix the polysaccharide of the present invention and is insoluble in water, a sample or a reaction solution.
  • Examples of the shape of the solid phase include plates (eg, microplate wells), tubes, beads, membranes, gels, particulate solid carriers (gelatin particles, kaolin particles, synthetic polymer particles such as latex, etc.), etc. Can do. Of these, microplates are desirable because of their accurate quantitativeness and ease of use.
  • solid phase material examples include polystyrene, polypropylene, polychlorinated butyl, nitrocellulose, nylon, polyacrylamide, polyallomer, polyethylene, glass, and agarose. Among these, a plate made of polystyrene is preferable.
  • a general method such as a physical adsorption method, an affinity binding method, a covalent binding method, an inclusion method, etc. (for example, immobilized fermentation) Moh, 1975, published by Kodansha, see pages 9 to 75).
  • the physical adsorption method is preferable because the operation is simple and frequently used.
  • a substance selected from the above group (contained in the molecule of the polysaccharide of the present invention) and a substance having a utility are fixed to a solid phase, and the polysaccharide of the present invention is fixed to the solid phase via this substance. It can be fixed to.
  • protein A or protein G
  • protein A or protein G
  • the biotin binds to the polysaccharide of the present invention via a biotin anchored to the solid phase.
  • the antigenic substance is bound to the polysaccharide of the present invention via an antibody against the antigenic substance fixed to the solid phase.
  • the antibody is bound via an antigen substance (antigen of the antibody) fixed to the solid phase.
  • Each of the polysaccharides of the present invention can be fixed to a solid phase.
  • a specific method of physical adsorption to the solid phase of the polysaccharide of the present invention or the above-mentioned substance having a group force and a substance having affinity for example, the polysaccharide of the present invention or "from the above group” 0 ° C to 10 ° by bringing a buffer solution (a buffer solution of pH 7-9 (eg, phosphate buffer, PBS, carbonate buffer, etc.)) into contact with the solid phase.
  • a buffer solution a buffer solution of pH 7-9 (eg, phosphate buffer, PBS, carbonate buffer, etc.)
  • a method of standing at about C preferably about 0 ° C to 5 ° C, for about 6 hours to 24 hours, preferably about 10 hours to 20 hours is exemplified.
  • the polysaccharide of the present invention is then added and the substance is bonded to the substance. Thereby, the solid phase of the present invention to which the polysaccharide of the present invention is fixed can be obtained.
  • the surface of the solid phase may be washed with a washing solution thereafter.
  • This washing is not particularly limited as long as it is carried out under the conditions that the polysaccharide of the present invention adheres to the solid phase and does not dissociate.
  • a buffer solution eg, Tris buffer solution, phosphate buffer solution, PBS, etc.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the blocking substance is subsequently brought into contact with the solid phase so that the polysaccharide of the present invention is fixed and the part is coated.
  • blocking substances include BSA, gelatin, casein, skim milk, ApplieDuo (trade name; manufactured by Seikagaku Corporation) and the like. These may be used as a single component or as two or more components.
  • a solution of ApplieDuo (trade name; manufactured by Seikagaku Corporation) is brought into contact with a solid phase, and about 0 ° C to 37 ° C, preferably 10 ° C to 30 ° C.
  • a method of standing for about 30 minutes to 2 hours is exemplified. If necessary, coexist preservatives in the blocking solution.
  • the plate may be washed with the washing liquid as described above. After this, the plate may be dried at about 10 ° C to 37 ° C.
  • the ND detection method of the present invention is a method for detecting ND activity in a sample, comprising at least the following steps (a) and (b).
  • the term "detection” means finding the target object in some form. Therefore, the term ⁇ detection '' in the present application document not only finds the existence (presence / absence) of the detection target, but also quantitatively finds the detection target (quantitative measurement of the detection target). It is a concept that also includes
  • Step (a) is a step of bringing the specimen into contact with the solid phase of the present invention.
  • the solid phase of the present invention is as described above.
  • the "specimen” only needs to contain or have a possibility of containing an enzyme having ND activity.
  • the enzyme having ND activity in this sample does not need to be subjected to a treatment such as isolation and purification in advance. That is, even if the sample contains an enzyme other than the enzyme that retains ND activity or other protein components, the ND activity can be specifically detected according to the ND detection method of the present invention.
  • the method for contacting the solid phase with the specimen is particularly limited as long as the polysaccharide molecule of the present invention fixed on the solid phase and the enzyme molecule having ND activity present in the specimen come into contact with each other.
  • the sample may be added to and contacted with the solid phase, or both may be added simultaneously to separate containers that may be contacted with the solid phase added to the sample.
  • the contact method is not limited to these, and can be appropriately determined by those skilled in the art according to the shape and material of the solid phase.
  • the incubation temperature is not particularly limited as long as the temperature at which the enzyme reaction occurs, and room temperature is exemplified as an example.
  • the incubation time is not particularly limited as long as both of the above react sufficiently, but is preferably about 15 to 120 minutes, more preferably 3 Examples are about 0 to 60 minutes.
  • the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the surface of the solid phase is preferably washed with a washing solution.
  • This washing is not particularly limited as long as the washing is performed under the condition that the polysaccharide of the present invention fixed to the solid phase is not dissociated.
  • the washing solution include a buffer solution containing a nonionic surfactant such as a Tween surfactant (for example, Tris-HCl buffer solution, phosphate buffer solution, PBS, etc.).
  • an enzyme having ND activity present in the specimen acts on the polysaccharide of the present invention fixed to the solid phase, and the polysaccharide (sugar chain moiety) )
  • Multiple GlcNAc residues are de-N-acetylated.
  • the higher the ND activity of the enzyme present in the sample the more GlcNAc residues present in the molecule (sugar chain portion) of the polysaccharide of the present invention fixed to the solid phase. N-acetylene will be removed.
  • Step (b) is a step of detecting de-N-acetylene in the polysaccharide of the present invention adhered to the solid phase.
  • step (a) If the enzyme present in the sample retains ND activity, the GlcNAc residue present in the molecule of the polysaccharide of the present invention (sugar chain moiety) immobilized on the solid phase in step (a) is removed. — Acetylated.
  • the higher the ND activity of the enzyme present in the sample the more GlcNAc residues will be de-N-acetylated.
  • step (b) the ND activity present in the sample is detected by detecting de-N-acetylyl residues in the polysaccharide of the present invention fixed to the solid phase that has undergone step (a). .
  • the method for detecting de-N-acetylyl in the polysaccharide of the present invention fixed to a solid phase is not particularly limited.
  • a physicochemical method for example, a chromatographic method
  • a chemical method for example, an amino group
  • biological methods for example, methods using biological affairs such as immunoassay
  • the solid phase of the present invention contains "GlcN residue (ie, de-N-acetylenic acid in NAH or its derivative).
  • GlcN residue ie, de-N-acetylenic acid in NAH or its derivative.
  • a protein that binds to the GlcNAc residue is preferably an antibody.
  • such detection is preferably performed by an immunoassay.
  • an immunoassay method any method exemplified by ELISA, RIA and the like can be adopted.
  • antibody includes not only the antibody itself but also a fragment of an antibody that retains its antigen binding site (Fab).
  • Fab antigen binding site
  • the “antibody” mentioned here may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is a monoclonal antibody in terms of specificity, homogeneity, reproducibility, large-scale and permanent productivity, etc. I prefer that.
  • monoclonal antibody JM403 can be used.
  • the monoclonal antibody JM403 can be produced by the method described in Kidney, Int., 41, pll5 (1992).
  • Monoclonal antibody JM403 is sold by Seikagaku Corporation and can be used.
  • step (a) The method of “contact” here is the same as that described in step (a).
  • the incubation temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which binding by biological affinity occurs, and is exemplified by about 2 ° C to 37 ° C, preferably about 4 ° C to 25 ° C.
  • the incubation time is not particularly limited as long as the two react sufficiently, and examples thereof include about 0.5 to 2 hours, preferably about 1 to 1.5 hours.
  • the solid phase and the liquid phase are separated. If necessary, the surface of the solid phase is preferably washed with a washing solution. This washing procedure is the same as the washing procedure after the enzyme reaction in step (a).
  • a protein that binds to a GlcN residue in NAH or a derivative thereof (that is, a de-N-acetylated G1 cNAc residue) is labeled with a labeling substance or labeled to facilitate detection. It may be done.
  • the labeling substance that can be used for labeling is not particularly limited as long as it can be used for labeling ordinary proteins.
  • enzymes peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, luciferase, Cetyl cholinesterase, such as glucose O Kishida over Ze), radioisotopes (125 1, 131 1, 3 ⁇ 4, etc.), fluorescent dyes (Full O receptacle in isothiocyanate Xia sulfonate (FITC), 7- Amino - 4 Mechiruku Marine - 3- acetic acid (AMCA), dichlorotriaziraminofluorescein (DTAF), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), lithamine rhodamine B (Lissamine Rhodamine B), Texas Red, phycoerythrin ( Phycoerythrin (PE), umbelliferone, europium, phycocyanin, tricolor, cyanine, etc., chemiluminescent substances (such as luminol),
  • a protein that binds to a GlcN residue in NAH or a derivative thereof is bound to the GlcN residue in the polysaccharide of the present invention fixed to a solid phase.
  • detection may be performed using a second protein (secondary antibody or the like) that binds to the protein.
  • This second protein (such as an antibody) is preferably pre-labeled with a labeling substance as described above.
  • a protein that binds to a GlcN residue that is, a de-N-acetylated GlcNAc residue
  • a second protein such as a secondary antibody
  • a known detection means can be appropriately selected according to the type of the labeling substance. For example, when one substance (for example, biotin) in a specific binding pair is used as a labeling substance, an enzyme (for example, peroxidase) to which the other substance (for example, streptavidin) that specifically binds to this substance is bound. To form a specific binding pair. Next, the enzyme substrate (for example, peroxyhydrogen (when the enzyme is peroxidase)) and a coloring substance (for example, TMB, diaminobenzidine, etc.) are added thereto, and the product of the enzyme reaction is added. The labeling substance can be detected by measuring the degree of coloration of the product by absorbance.
  • an enzyme for example, peroxidase
  • a coloring substance for example, TMB, diaminobenzidine, etc.
  • a radioisotope for example, a radioisotope, a fluorescent dye or a chemiluminescent substance is used as a labeling substance.
  • a method of measuring the radioactivity count, fluorescence intensity, fluorescence polarization, emission intensity, etc. is exemplified.
  • the presence or absence of detection of the labeled substance can be used as the detection result. If quantitative detection of ND activity (measurement of ND activity, concentration of enzyme having ND activity, etc.) is desired, absorbance, radioactivity count, fluorescence intensity, luminescence intensity, etc. can be used as is. Can be used as an indicator of the amount of It is also possible to prepare a calibration curve or a relational expression in advance using a standard solution of an enzyme having a known concentration having ND activity, and use this to determine the concentration of the enzyme having ND activity in the sample.
  • the ND detection kit of the present invention is a kit for detecting ND activity in a sample, comprising at least the following components (A) and (B).
  • the polysaccharide of the present invention is as described above.
  • the polysaccharide of the present invention may be fixed to a solid phase at the time of use, or may be fixed to a solid phase in advance! It is preferable that / ⁇ is fixed to the solid phase in advance.
  • a protein that binds to a GlcN residue in NAH or a derivative thereof (that is, a GlcNAc residue deN-acetylated) is as described above. Therefore, an antibody can be exemplified as such a protein, and a monoclonal antibody JM403 can be exemplified as such an antibody.
  • the ND detection kit of the present invention can be used according to the ND detection method of the present invention.
  • the ND detection kit of the present invention comprises, as long as it contains at least the above-described components, a standard product of an enzyme having a known concentration of ND activity, which serves as a standard for preparing a calibration curve or a relational expression, a detection reagent for a labeled substance, and the like. Can be added.
  • the blocking substance, the cleaning solution, the enzyme reaction stop solution, and the like may be included.
  • the ND detection kit of the present invention may contain a positive control (QC control) for keeping the execution level between detection batches at a constant level.
  • QC control positive control
  • These components can be stored in separate containers, for example, and stored as a kit that can be used in accordance with the ND detection method of the present invention at the time of use.
  • the ST detection method of the present invention is a method for detecting ST activity in a sample, comprising at least the following steps (c) and (d).
  • ND is "3”
  • De-N-acetylene is "N-sulfation”
  • GlcNAc residue ⁇ Group '' as ⁇ GlcN residue ''
  • Monoclonal antibody JM403J is the same as “monoclonal antibody F58-10E4 or monoclonal antibody HepSS-1”. Of these, monoclonal antibody F58-10E4 can be preferably used.
  • the monoclonal antibody F58-10E4 can be produced by the method described in J. Cell Biol, 119, p961 (1992). Monoclonal antibody 58-1 ( ⁇ 4 and monoclonal antibody 13 ⁇ 433-1 are both sold by Seikagaku Corporation and can also be used.
  • a "sulfuric acid group donor” must be used.
  • the sulfate group donor that can be used here is not particularly limited as long as it is a substance having an ability to donate a sulfate group to the polysaccharide of the present invention to be a sulfate group acceptor, but PAPS is preferable.
  • PAPS is preferable.
  • the ST detection kit of the present invention is a kit for detecting ST activity in a sample, comprising at least the following components (A) and (C).
  • (C) A protein that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or its derivatives.
  • the ST detection kit of the present invention can be used according to the ST detection method of the present invention.
  • N 0 in the above-mentioned ND detection kit of the present invention is "3"
  • protein that binds to GlcN residue in NAH or its derivative is "NAH”
  • the protein that binds to the N-sulfated GlcN residue in its derivatives is the same as“ Monoclonal antibody JM403J replaced with “Monoclonal antibody F58-10E4 or Monoclonal antibody HepSS-1”, respectively.
  • the monoclonal antibody F58-10E4 can be preferably used.
  • the ST detection kit of the present invention may further contain a sulfate group receptor as a constituent component. The explanation of the sulfate group acceptor is the same as that in the above-described ST detection method of the present invention.
  • the NDST detection method of the present invention is characterized by detecting ND activity in a sample by the ND detection method of the present invention, and detecting ST activity in the sample by the ST detection method of the present invention. It is a detection method.
  • the NDST detection method of the present invention may further include other steps as long as it includes at least the step of executing the ND detection method of the present invention and the ST detection method of the present invention.
  • the order of implementation of the ND detection method of the present invention and the ST detection method of the present invention is not particularly limited. That is, the former may be performed first, the latter may be performed first, or both may be performed simultaneously.
  • NDST activity is detected in the sample. It can be determined that there is sex. If only one of these activities is detected, determine that ND activity is present but ST activity is not present in the sample, or ST activity is present but ND activity is absent. Can do.
  • NDST has higher ST activity than the ND activity, or the NDST ND activity and ST activity are equivalent.
  • the NDST detection kit of the present invention is a detection kit for NDST activity in a sample, comprising at least the following components (A), (B) and (C).
  • (C) A protein that binds to the Nlc sulfated GlcN residue in NAH or its derivatives.
  • the polysaccharide of the present invention is as described above.
  • the polysaccharide of the present invention may be fixed to a solid phase at the time of use, or may be fixed to a solid phase in advance! It is preferable that / ⁇ is fixed to the solid phase in advance.
  • a protein that binds to a GlcN residue in NAH or a derivative thereof (that is, a GlcNAc residue deN-acetylated) is as described above. Therefore, an antibody can be exemplified as such a protein, and a monoclonal antibody JM403 can be exemplified as such an antibody.
  • a protein that binds to an N-sulfated glycated GlcN residue in NAH or a derivative thereof is as described above. Therefore, an antibody can be exemplified as such a protein, and as such an antibody, monoclonal antibody F58-10E4 or monoclonal antibody HepSS-1 can be exemplified. Of these, the monoclonal antibody F58-10E4 can be preferably used.
  • the ST detection kit of the present invention may further contain a sulfate group receptor as a constituent.
  • the explanation of the sulfate group receptor is the same as the explanation in the ST detection method of the present invention.
  • the NDST detection kit of the present invention can be used according to the NDST detection method of the present invention.
  • the NDST detection kit of the present invention as long as it contains at least the above components, further comprises a standard product of an enzyme having a known concentration of NDST activity, which is a standard for preparing a calibration curve or a relational expression, a detection reagent for a labeling substance, Can be added as a configuration.
  • a standard product of an enzyme having a known concentration of NDST activity which is a standard for preparing a calibration curve or a relational expression
  • a detection reagent for a labeling substance Can be added as a configuration.
  • the blocking substance, the washing solution, the enzyme reaction stop solution, and the like may be included.
  • the ND detection kit of the present invention may contain a positive control (QC control) for keeping the execution level between detection batches at a constant level.
  • QC control positive control
  • the screening method of the present invention is a screening method for a substance that changes the activity of one or more enzymes selected from the following group of enzymes, comprising at least the following steps (e) to (g).
  • Enzyme group power The step of selecting test substances that change the activity of one or more selected enzymes.
  • the screening method of the present invention is an application of the ND detection method of the present invention, the ST detection method of the present invention or the NDST detection method of the present invention to a screening method for a substance that changes the activity of ND, ST or NDST. is there.
  • step (e) a test substance that may change the activity of these enzymes is added to the test substance.
  • This is a step to coexist with an enzyme.
  • the mode of “coexistence” is not particularly limited as long as the molecule of the test substance in question and the molecule of the enzyme are in contact with each other.
  • the enzyme with which the test substance is allowed to coexist can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose of screening. For example, when screening for a substance that changes ND activity, it is sufficient to coexist a substance that may change the activity with ND. When screening for a substance that changes ST activity, the activity It is sufficient to coexist with a substance that can change NDST. When screening for a substance that changes NDST activity, it is sufficient to coexist a substance that may change the activity with NDST.
  • ND, ST, or NDST coexisting with the test substance are all, for example, Aikakawa, J (Aikawa, J.) et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, No. 276 ⁇ , No. 8, p. 5876-5882.
  • the type and origin of ND, ST, or NDST that coexists with the test substance can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • a medium-strength enzyme such as NDST1, NDST2, NDST3, or NDST4 can be appropriately selected according to the purpose.
  • enzymes can also be produced by known methods (for example, Genomics, 26 (2), p239-244 (1995), Biochem. J “332 (pt2), p303-307 (1998), J. Biol. Chem”). 274 (5), p2690-2695 (1999), J. Biol. Chem., 276 (8), p5876-5882 (2001), etc.).
  • an enzyme into which a mutation such as substitution, deletion, insertion, or rearrangement is introduced, an enzyme fused with another peptide, or the like may be used.
  • a sulfate group receptor is also allowed to coexist.
  • the explanation of the sulfate group acceptor is the same as that in the above-described ST detection method of the present invention.
  • the ND detection method of the present invention, the ST detection method of the present invention, and the NDST detection method of the present invention are prepared using the "coexisting substance of the test substance and the enzyme" obtained by step
  • Which detection method is adopted can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose of screening.
  • the present invention N The detection method of D of the present invention may be used when screening for substances that change ST activity, and the screening method of the present invention may be used when screening for substances that change NDST activity. . Thereby, the activity of the enzyme in the presence of the test substance can be detected.
  • step (g) the activity of the enzyme detected in step (f) (the activity of the enzyme in the presence of the test substance) and the enzyme used in step (e) are used as a sample.
  • the enzyme activity detected by the same method enzyme activity in the absence of the test substance
  • the activity of one or more selected enzymes is changed.
  • This is a step of selecting a substance.
  • ⁇ Enzyme activity detected in step (f) activity of enzyme in the presence of test substance) '' and ⁇ enzyme used in step (e) '' were detected by the same method as in step (f). If the difference is found to be ⁇ active enzyme activity (enzyme activity in the absence of test substance) '', the test substance may be selected as a substance that changes the enzyme activity. it can.
  • the substance should be selected as a substance that promotes enzyme activity. Can do. If the enzyme activity in the presence of the test substance is lower than the enzyme activity in the absence of the test substance, the substance can be selected as an inhibitor of the enzyme activity. If there is no difference between the two, the substance can be identified as a substance that does not affect the enzyme activity.
  • NDST used in this example was prepared as follows.
  • NDST2 Human-derived NDST2 was cloned using the method described in Biochem. J., 332 (pt2), p303-307 (1998). The cloned DNA encoding NDST2 is described in SEQ ID NO: 1. A protein (NDST2) having a base sequence and having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is encoded.
  • a protein that has an amino acid sequence ability represented by amino acid numbers 79 to 883 in SEQ ID NO: 2 (NDST2 from which the transmembrane region has been removed) by removing the portion encoding the transmembrane region on the N-terminal side. In order to express, the following operation was performed.
  • the plasmid DNA pCRhNDS T2 # 5 holding human NDST2 in a vector is placed in a vertical form and has 5′-GAGACAGCTCGAACTGAACCCGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) sequence.
  • BSA 200 ⁇ M dNTP in the presence of a thermal cycler, 95 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 30 seconds, 52.5 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 6 minutes for 30 cycles, 72 ° C for 10 minutes for 1 cycle, Specific amplification of a fusion DNA encoding the oral buster L21 sequence, gp67 signal peptide (39 amino acids) and 805 amino acids of human NDST2 (amino acids 79 to 883 in SEQ ID NO: 2) was performed.
  • Transformant colonies were selected. From the obtained colonies of Escherichia coli, plasmid DNA retained by Escherichia coli was recovered in 100 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl (pH 8.5). Analysis of the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the vector DNA was performed by a conventional method using short DNA specific for human NDST2.
  • the obtained colonies of E. coli were inoculated into 1.5 ml of Terific-Broth medium (Beckton Dickinson, USA) containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, followed by shaking culture at 37 ° C for 20 hours.
  • the obtained culture broth was transferred to an Eppendorf tube having a capacity of 1.5 ml, and then centrifuged at 8000 rpm at 4 ° C for 2 minutes using a refrigerated centrifuge to collect E. coli cells as a precipitate.
  • the supernatant was removed by centrifugation at 15000 rpm at 4 ° C for 5 minutes.
  • 150 mM of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 mM EDTA and 100 ⁇ g / ml RNase A was added, suspended, and reacted at 37 ° C for 20 minutes.
  • phenol Invitrogen, USA
  • 100 1 saturated in advance with TE buffer mix vigorously with a vortex mixer, and then use a refrigerated centrifuge at 15000 rpm at 4 ° C. The upper fraction was collected by centrifugation for 5 minutes.
  • Ethanol 250 1 and 3 ⁇ sodium acetate 101 were added to and mixed with 100 ⁇ l of the upper layer fraction, and the supernatant was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C using a refrigerated centrifuge. Next, after adding 1 ml of 70% (V / v) ethanol to the precipitate, the supernatant was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C using a cooling centrifuge. TE buffer 100 1 was added to the remaining precipitate and suspended. As a result, the DNA pFBl-GP67hNDST2SOL (79E) # 123 obtained in (4) above was introduced into E. coli DH10BAC, and the target clone (pFBl-GP67hNDS T2SOL (79E) # 123- I got 4).
  • the collected medium was centrifuged to remove cells, and the fraction was used as a culture supernatant.
  • a fraction having a molecular weight of 30,000 or more was collected by centrifugation using a cooling centrifuge with a Amicon Ultra-15 30000 MWCO (Millipore, U.S.A.) strength 4 cm, and used as a concentrated culture supernatant.
  • NDST2 a protein having an amino acid sequence ability represented by amino acid numbers 79 to 883 in SEQ ID NO: 2 (NDST2 from which the transmembrane region has been removed)
  • enzyme solution a protein having an amino acid sequence ability represented by amino acid numbers 79 to 883 in SEQ ID NO: 2 (NDST2 from which the transmembrane region has been removed)
  • NAH follows the method described in JP 2004-18840 using E. coli K5. Manufactured. The characteristics of the manufactured NAH are shown below.
  • 6-TNBS Biochemica et Biophysica Acta., 141, 358 (1967) measured free amino acid monole: 0.026 ⁇ M / mg
  • gel filtration chromatography was performed according to the method of Arai, M. et al. (Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992).
  • Sodium chondroitin sulfate with known molecular weight (weight average molecular weight 39, 100, 18,000, 8,050; all manufactured by Seikagaku Corporation) and sodium hyaluronate (weight average molecular weight 104,000; manufactured by Seikagaku Corporation)
  • the elution time of the sample in the equation obtained by analyzing the elution time in gel filtration chromatography using high performance liquid chromatography with the data analysis software (GPC-8020 Tosoh Corporation)
  • the weight average molecular weight and the number average molecular weight were determined by fitting.
  • TSK gel G4000PWXL, G3000PWXL and G2500P WXL (each ⁇ 7.8 X 300 mm, Tosoh Corporation) were used.
  • a 0.2 mol / L sodium chloride solution was used as the solvent, the flow rate was 0.6 ml / min, and a differential refractive index detector (RI-8020, Tosoh Corporation) was used as the detector.
  • NAH prepared in Example 1 50 mg was weighed and dissolved in 2 ml of 2M aqueous ammonium chloride solution. To this solution, 25 mg of sodium cyanoborohydride was added, and a reductive amination reaction was performed at 70 ° C for 2 days. 13 mg of sodium cyanoborohydride was added to the solution after this reaction, and the mixture was further reacted for 2 days under the same conditions. After cooling in an ice bath, the reaction was completely stopped by adding 400 1 acetic acid. [0145] The produced reductive amination NAH (hereinafter referred to as “RA-NAH”! was recovered by a solvent precipitation method using twice the amount of ethanol. The collected precipitate was washed with ethanol and then lyophilized. As a result, 39.5 mg of RA-NAH lyophilized product was obtained.
  • RA-NAH The produced reductive amination NAH
  • the produced SH-NAH was recovered by a solvent precipitation method using twice the amount of ethanol. The collected precipitate was washed with ethanol and then lyophilized. 8. 3 mg of SH-NAH lyophilizate was obtained.
  • NAH-piotine polysaccharide of the present invention
  • NAH—SS—BSA prepared in Example 1 was diluted with PBS (—) to: L gZmL. Add 100 ⁇ L of this diluted solution to each well of Maxisorp (registered trademark) 96-well microphone mouth plate (NALGE NU NC) and let stand at 4 ° C for 14-18 hours. As a result, a uniform coating was made on the surface of the well.
  • Maxisorp registered trademark
  • NALGE NU NC 96-well microphone mouth plate
  • the blocking substance was sufficiently removed and dried at 37 ° C for 2 hours to obtain a plate on which NAH-SS-BSA was fixed to the well.
  • the plate was enclosed in an aluminum laminate bag with a desiccant and stored refrigerated.
  • the solution containing NAH prepared in Example 1 and the solution containing BS A were each added with 0.1 M MES buffer (pH 5.5) to a concentration of 10 mg / ml. Prepared as solvent.
  • a lOOmgZml solution of EDC was prepared using 0.1 M MES buffer (pH 5.5) as a solvent.
  • NAH-COOH-BSAJ polysaccharide of the present invention
  • NAH—SS-BSA In place of “NAH—SS-BSA” in Example 2, “NAH—COOH—BS A” was used V to obtain a plate in which NAH—COOH—BSA was fixed to the well as in Example 2. The plate was enclosed in an aluminum laminate bag with a desiccant and stored refrigerated.
  • Enzyme Reaction Solution 1 (Hereinafter referred to as “Enzyme Reaction Solution 1”) (pH 6.5), add 50 L of each NDST enzyme solution diluted 10-fold to 5120-fold to each well at 37 ° C. The enzyme reaction was allowed to stand for 60 minutes.
  • reaction solution 1 g / mL in PBS (-) (hereinafter referred to as “reaction solution”) containing 20-fold diluted ApplieDuo (trade name; manufactured by Seikagaku Corporation) and 0.05% proclin 300 100 L of the monoclonal antibody JM403 (Seikagaku Corporation) prepared in the above was added to each well. Thereafter, the plate was allowed to stand for 60 minutes at room temperature (15 to 25 ° C.) for antigen-antibody reaction. A well containing only the reaction solution was used as a blank.
  • Monoclonal antibody JM403 recognizes a GlcN residue (ie, de-N-acetylated GlcNAc residue) moiety in the NAH molecule. If the ND activity is high, the de-N-acetylylated site in the solid-phased polysaccharide of the present invention is increased correspondingly. Therefore, by detecting this de-N-acetylated site with the monoclonal antibody JM403, de-N-- It can detect the degree of acetylene (ND activity). Therefore, in this example, the reactivity of the monoclonal antibody JM403 was expressed as ND activity.
  • GlcN residue ie, de-N-acetylated GlcNAc residue
  • This ND activity was calculated as a value obtained by subtracting the absorbance in the blank from the measured absorbance.
  • Fig. 1 shows the results using the plate with NAH-SS-BSA fixed to the well
  • Fig. 2 shows the results using the plate with NAH COOH BSA fixed to the well.
  • NDST-dependent ND activity (in inverse proportion to the dilution ratio of NDST enzyme solution) was observed.
  • ND activity can be confirmed even with an enzyme solution diluted 1280 times in a plate with NAH — SS — BSA immobilized with BSA bound to the reducing end of NAH ( Figure 1), and NAH—COOH—BSA is immobilized. It was shown that ND activity can be measured with higher sensitivity than phased plates ( Figure 2, ND activity confirmed at 320-fold dilution).
  • Example 2 The plate prepared in Example 2 (NAH-SS-BSA solid-phase plate) was washed 3 times with 300 L of washing solution, and then NDST enzyme solution diluted 160-fold with enzyme reaction solution 1 was added to each well. 50 L each. Thereafter, the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 0, 10, 20, 30, 40, or 60 minutes.
  • the plate prepared in Example 2 was washed with 300 L of washing solution three times.
  • Enzyme Reaction Solution 2 a solution obtained by diluting the NDST enzyme solution 2-fold to 128-fold was added to each flask. L was added and the enzyme reaction was allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes.
  • the plate was allowed to stand for 60 minutes at room temperature (15 to 25 ° C) to cause an antigen-antibody reaction.
  • a wall containing only the reaction solution was used as a blank.
  • Example 2 After the plate prepared in Example 2 (NAH-SS-BSA solid-phase plate) was washed 3 times with 300 L of washing solution, NDST enzyme solution diluted 8-fold with enzyme reaction solution 2 was added to each plate. Carried 50 L at a time. Thereafter, the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 0, 10, 20, 30, 40, or 60 minutes.
  • reaction time-dependent ST activity was observed.
  • the ST activity was inactivated by heat denaturation of the enzyme protein in the one boiled for 1 minute.
  • Example 7 directly detects ST activity.
  • NDST is an enzyme that causes N-sulfate after wake-up of de-N-acetylyl pupae.
  • the detection of ST activity means that de-N-acetylation was caused as a premise. Therefore, detection of ST activity by this method can simultaneously detect NDST activity including ND activity.
  • the NDST activity can be more reliably detected. it can.
  • Example 9 Production of the solid phase of the present invention (solid phase in which NAH-piotin is fixed to a plate via avidin)
  • Streptavidin JACKSON was diluted with PBS (-) to 20 / z g / mL. Add 50 ⁇ L of this diluted solution to each well of Maxisorp (registered trademark) 96-well microphone mouth plate (NALGE NUN C) and let stand at 4 ° C for 14-18 hours. Coating uniformly on the surface of the well.
  • the blocking substance was sufficiently removed and dried at 37 ° C for 2 hours to obtain a plate on which streptavidin was fixed to the well (streptavidin-immobilized plate).
  • Example 9 Using the plate produced in Example 9, the ND activity of the NDST enzyme was measured in the same manner as in Example 5.
  • human NDST2 DNA was incorporated, and the culture supernatant obtained by infecting only baculovirus was concentrated in the same manner as in Example (8). (mock).
  • the mock was diluted and measured in the same manner as the NDST enzyme solution. The result is shown in FIG. In FIG. 6, the black circles indicate the results using NDST enzyme, and the white circles indicate the results for mock.
  • NDST-dependent ND activity (inversely proportional to the dilution ratio of NDST enzyme solution) was observed. In this plate, ND activity could be confirmed even with an enzyme solution diluted 1280 times, indicating that ND activity can be measured with high sensitivity. It was also shown that ND activity can be measured more accurately by calculating the difference from mock.
  • Example 9 the ST activity of the NDST enzyme was measured in the same manner as in Example 7.
  • any one of the enzyme reaction solution 2 and the enzyme reaction solution adjusted to pH 6.5 using MES instead of HEPES in the enzyme reaction solution 2 was used.
  • the results are shown in FIG. In FIG. 7, the diamonds indicate the results using enzyme reaction solution 2 (pH 7.4), and the squares indicate the results using enzyme reaction solution adjusted to pH 6.5.
  • test substances were diluted to 200, 20, and 2 / z g / mL, respectively.
  • NDST enzyme solution diluted 40-fold with enzyme reaction solution 1 was added to each well in 25 ⁇ L. (The final concentration of each test substance was 100, 10, and 1 ⁇ g / m enzyme solution was diluted 80 times).
  • Hyaluronic acid derived from chicken crown (weight average molecular weight 1 OOKDa; HA)
  • Hushi kidney HS Hushi kidney HS (HSBK)
  • the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 60 minutes to cause an enzyme reaction.
  • only the enzyme reaction solution 1 was added to Ul without adding the test substance.
  • the well was washed 3 times with T-TBS, and 100 ⁇ L of a solution of the monoclonal antibody JM403 (Seikagaku Corporation) prepared to 1 ⁇ g / mL with TBS was added to each well. Thereafter, the plate was allowed to stand for 60 minutes at room temperature (15 to 25 ° C.) for antigen-antibody reaction.
  • the plate was washed 3 times with T-TBS, and 100 L of HRP-labeled goat anti-mouse immunoglobulin G + M antibody diluted 20000 times with TBS was added to each well. Thereafter, the plate was allowed to stand for 60 minutes at normal temperature for antigen-antibody reaction.
  • the plate was washed 3 times with T-TBS, and 100 ⁇ L of the TMB solution was added to each well, followed by reaction at room temperature for 30 minutes to develop color. Thereafter, 100 L of reaction stop solution was added to each flask to stop the reaction, and the absorbance was measured in the same manner as in Example 5. The rate of change (%) was calculated using the following formula.
  • Rate of change (%) 100 ⁇ (absorbance value when each test substance is not added-absorbance value when each test substance is added at each concentration) ⁇ absorbance value when each test substance is not added).
  • the monoclonal antibody JM403 binds to the GlcN residue in ⁇ (that is, the GlcNAc residue that has been de-N-acetylated)
  • the higher the detected absorbance value the more the GlcN residue in NAH This means that the number is large (ie, the number of de-N-acetylated GlcN Ac residues is large), that is, the ND activity is high.
  • the lower the absorbance value detected the smaller the number of GlcN residues in NAH (ie, the smaller the number of GlcNAc residues de-N-acetylated), that is, the lower the ND activity.
  • the above change rate (%) is a positive number. The higher the rate of change, the higher the test substance's ability to inhibit ND.
  • the results are shown in FIG. In Fig. 8, the white column shows the results when the final concentration of the test substance is 100 g / mL, the black column shows the results when the concentration is 10 g / mL, and the shaded column shows the results when the concentration is g / mL. Each is shown.
  • HP, NSDS—HP and HSBK has the highest inhibitory ability against ND activity, followed by HP and NSDS—HP, the lowest.
  • NAH could be selected.
  • a polysaccharide bound to the reducing end of SBK was prepared. This was then immobilized on a plate according to the method described in Example 9.
  • NAH was produced using the method described in Example 1 (1), and this was used to prepare N-deacetylated palarozan, which was then used for various lots of N —Parosan was prepared.
  • This N-deacetylated heparosan can be prepared by a method using an enzymatic reaction such as NDST2 or a method using a chemical reaction.
  • Chemical deglycosylation methods of glycosaminodarlicans include hydrazine decomposition (Patrick, N. and Conrad, HE, Bioche. J., 217, 1 87, (1984)) and alkaline hydrolysis (Leali, D. et al "J. Biol. Chem., 276, 37900 (2001)). This was prepared by the latter method. Specifically, NAH was added to a 2M sodium hydroxide solution at a final concentration. Was dissolved at 10 mg / ml and heated for 2 to 24 hours at 60 ° C. By adjusting the heating time, N-deacetylated parosan with different degrees of deacetylation was prepared.
  • N-deacetylated heparosan was then N-sulfated according to the method of Leali, D. et al. Described above to prepare the parosan to various lots of N-sulfate. Specifically, after neutralizing the N-deacetylated reaction solution of NAH (containing N-deacetylated heparosan), the final concentration of sodium carbonate and iothiopyridine complex (PSTC) was increased. Were added to 15 mM and 10 mM, respectively, and incubated at 40 ° C. After that, PSTC corresponding to 2.5 mM (final concentration) was added every 1 hour and reacted for 5 hours. This resulted in 9 lots of N-sulfate heparosan. These were used as test substances.
  • PSTC sodium carbonate and iothiopyridine complex
  • Mw and Mw / Mn are values obtained by the method described in Example 1 (1).
  • deNAc-0S in the N-sulfated heparosan molecule of each lot (disaccharide unit (GlcA-GlcN) that constitutes NAH is desulfated at the N position and retains the sulfate group.
  • N-sulfated heparosans in lots 4 and 5, which had a high ratio of deacetylated disaccharide (deNAc-OS), were again subjected to N-sulfate formation according to the above method.
  • the N-sulfate heparosans from lots 1, 3 and 4 were re-treated with the NDST enzyme solution by the following method;
  • NDST enzyme solution is a solution containing 50 mM HEPES (pH 7.5), 1% Triton X-100, ImM MnCl, lOmM MgCl, and 0. ImM PAPS.
  • monoclonal antibody F58-10E4 has an average weight molecular weight of 20 kDa or more and N sulfated structure (NS) of 45% or more. It was shown that norozan is recognized equivalent to heparan sulfate.
  • N-sulfated heparosan with a deacetylated structure (deNAc-0S) exceeding 30% is not recognized by the antibody even if NS is present in 60% or more, but it is N-sulfated by NDST. Improved the responsiveness (result of lot 3). In addition, the reactivity of lot 4 with deNAc-0S exceeding 30% is low.
  • N-sulfated with NDST or chemically re-sulfated with heparan sulfate It became equivalent. Therefore, N-acetyl used as a substrate (one to be immobilized) for measuring ST activity in the present invention It was shown that the heparosan derivative having an average weight molecular weight of 20 kDa or more and having a deacetylated structure exceeding 30% is preferable, and that a deacetylated cocoon structure exceeding 35% is more preferable.
  • the ND detection kit of the present invention having the following constitutional power was produced.
  • An ST detection kit of the present invention having the following constitution was produced.
  • An NDST detection kit of the present invention having the following constitution was produced.
  • the ND detection kit of the present invention was prepared.
  • the ST detection kit of the present invention was prepared.
  • the NDST detection kit of the present invention was prepared.
  • Monoclonal antibody JM403 (Seikagaku Corporation) was diluted to 20 ⁇ g ZmL with PBS ( ⁇ ). This diluted solution was added to the Maxisorp® 96-well microphone mouthplate (Seikagaku Corporation).
  • Each well of NALGE NUNC was coated with 50 ⁇ L and allowed to stand at 4 ° C. for 14 to 18 hours to uniformly coat the surface of the well.
  • Immunoassay stabilizer manufactured by Advanced Biotechnologies
  • Procrine (registered trademark) 300 manufactured by SUPELCO
  • Monoclonal antibody JM403 (Seikagaku Corporation) was dialyzed overnight against 0.1 M carbonate buffer (pH 8.5), recovered, and dissolved in 0.1 mg carbonate buffer to a concentration of lmgZmL LC-biotin (pierce The product was stirred at room temperature for 4 hours at a mass ratio of 80: 1 (monoclonal antibody JM403: LC-piotin). The solution after the reaction was dialyzed overnight against PBS (—). The solution after dialysis was collected, and azidosodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a concentration of 0.05% and stored refrigerated. As a result, a monoclonal antibody JM403 (hereinafter referred to as “Piotin standard miM403” t) labeled with piotin was obtained.
  • 30 ⁇ NDST enzyme stock solution 20 ⁇ l 1000 10 ⁇ L of distilled water dissolved in distilled water at a concentration of 1000, 500, 250, 125 or 62.5 ⁇ g ZmL and 40 ⁇ L of distilled water are added to the test tube. After stirring, the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes for enzyme reaction. As a blank, 10 L of distilled water was added instead of the NAH solution, and reacted in the same manner.
  • enzyme reaction stop solution 50 ⁇ L of 50 mM Tris solution (pH 9.0) containing 450 mM NaCl was added to stop the enzyme reaction (hereinafter referred to as “enzyme reaction stop solution”).
  • the sandwich ELISA plate was washed 3 times with 300 L of washing solution. Thereafter, 100 / zL of an enzyme reaction stop solution was added to each well and allowed to stand at 37 ° C for 60 minutes to form an antigen-immobilized antibody complex.
  • reaction solution 2 PBS (—) containing 1% BSA and 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
  • reaction solution 2 100 L of each solution was added to a solution of the piotin-labeled miM403 prepared to / zg / mL. Thereafter, the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 60 minutes to form an antibody-antigen-solid phase antibody sandwich complex.
  • Monoclonal antibody JM403 recognizes GlcN residues in NAH (ie, de-N-acetylated GlcNAc residues).
  • ND activity When ND activity is high, the de-N-acetylenic site in NAH increases, and this de-N-acetylenic site can be detected by sandwiching with monoclonal antibody J M403 and piotin-labeled miM403.
  • the degree of wrinkles (ND activity) can be detected. Therefore, in this test example, the reactivity detected by sandwiching the monoclonal antibody JM403 and the piotin-labeled miM403 was expressed as ND activity.
  • This ND activity was calculated as a value obtained by subtracting the absorbance in the blank from the measured absorbance. The results are shown in FIG.
  • the present invention can be used to detect ND activity, ST activity, or NDST activity.
  • the present invention can also be used for screening for substances that change the activity of ND, ST, or NDST, and thus can be used for searching for new pharmaceutical materials.
  • the present invention can also be used for detection of diseases caused by abnormal enzyme activities such as NDST, detection of their risks, and understanding of disease states.

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Abstract

　新規な修飾多糖、当該多糖が固着された固相、当該固相を利用した検体中のＮ－デアセチラーゼ活性、Ｎ－スルホトランスフェラーゼ活性及びＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ活性の検出方法並びにこれらの検出キット。

Description

明 細 書
酵素活性の測定方法
技術分野
[0001] 本発明は、新規な修飾多糖、当該多糖が固着された固相、当該固相を利用した検 体中の N デァセチラーゼ活性、 N スルホトランスフェラーゼ活性及び N デァセ チラーゼ ZN スルホトランスフェラーゼ活性の検出方法並びにこれらの検出キット に関する。
背景技術
[0002] 本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
BS A：ゥシ血清アルブミン (bovine serum albumin)
EDC : 1—ェチルー 3— (3 ジメチルァミノプロピル）カルボジイミド（1-ethy卜 3- (3- di metnylaminopropyOcarbodnmide)
EDTA:エチレンジァミン四酢酸 (ethylenediamine tetraacetic acid)
ELIS A:酵素結合免疫測疋法 enzyme- linked immunosorbent assay)
GlcA：グノレクロン酸 (glucuronic acid)
GlcN：グノレコサミン (glucosaminej
GlcNAc： N―ァセチノレグノレコサミン（N— acetylglucosamine)
HEPES : 2- [4- (2 ヒドロキシェチル） 1—ピペラジニル]—エタンスルホン酸（ 2-[4-(2-hydroxyet yl)-l-piperazinyl]etnanesulfonic acia)
HP :へパリン（heparin)
HPLC : t¾速肷体クロマトグフフィー (high— performance liquid chromatography)
HRP：ホースラディッシュ ·ぺノレオキシタ、、■ ~" tr (horseradish peroxidase)
HS：へパラン硫酸（heparan sulfate)
IgG :免疫グロブリン G (immunoglobulin G)
MES： 2—モルホリノエタンスルホン酸 (2-morpholinoethanesulfonic acid)
NAH： N―ァセチノレへノ ロサン (N— acetyl heparosan)
ND： N デァセチラーゼ（N- deacetylase) NDST： N -デァセチラーゼ ZN—スノレホトランスフェラーゼ（N- deacetylase/N- sulfo transferase;
PAPS : 5，—ホスホアデノシン 3，—ホスホリン酸（5，- phosphoadenosine 3，- phospho sulfate)
PBS :リン酸緩衝生理食塩液（phosphate buffered saline)
PCR:ホリメラーセ連鎖反 (polymerase chain reaction;
PDP : 2—ピリジルジスルフイドプロピオ-ル (2-pyridyldisulfidepropionyl)
RIA:フシ才 ムノゾッセ (radioimmunoassay)
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate)
SPDP： N—スクシンィミジル一 3 - (2 -ピリジルジチォ）プロピオネート (N-succinimi dyl-3-(2-pyridylthio)propionate)
SS結合：ジスルフイド結合（disulfide bond)
ST： N—スルホトランスフェラーゼ（N- sulfotransferase)
TBS :トリス塩酸緩衝生理食塩液（Tris- HC1 buffered saline)
TMB : 3,3 ' , 5,5 ' -テトラメチルベンチジン（3,3，，5,5， -tetramethylbenzidine)
[0003] NDSTは、 HPや HSの合成に関与する酵素であり、 ND活性と ST活性を併せ持つ 酵素である。 NDSTには 4種類のバリアント（NDST1、 NDST2、 NDST3、 NDST4 )が存在し、その基質特異性等が各々異なることが報告されている。例えば、 NDST 3の ND活性は高く ST活性は低レ、。一方で NDST4の ND活性は弱く ST活性は極 めて高い (非特許文献 1)。
[0004] NDST1ノックアウトマウスは新生児致死性であることが報告されている。一方、 ND ST2ノックアウトマウスでは致死性を示さないが、肥満細胞内での顆粒の減少、 HP 負電荷の減少、ヒスタミン含量が 1Z170に減少するなどの変化が報告されている（ 非特許文献 2〜8)。したがって、 NDST力 Sこのような生体内での現象に起因する疾 患に関与して 1、る可能性がある。
[0005] NDSTの活性測定方法としては、ラジオアイソトープで標識した基質を用いる測定 方法が知られている。この方法によれば、 GlcNAc残基におけるァセチル基がラジオ アイソトープ ( )で標識された NAH (基質)を用いて、酵素作用により当該 NAHより 遊離した CH C003H量を測定することで NDSTにおける ND活性を測定し、また、ラ
3
ジォアイソトープ (35S)で標識された PAPSと N—脱硫酸ィ匕 HPまたは N—脱硫酸ィ匕 HSを用い、酵素作用によって取り込まれた当該多糖の N—硫酸量 (35S)を測定する ことで NDSTの ST活性を測定する（非特許文献 1、 12〜15、特許文献 1)。
[0006] またラジオアイソトープを使用しない NDSTの活性測定方法も知られている力 モノ クローナル抗体 JM403 (非特許文献 9〜10)を用いたサンドイッチ ELIS A法と反応 生成物のへノリナーゼ消化物を用いた HPLC法が報告されて 、るのみである。
[0007] 前者の測定方法は NDにより生成した脱 N—ァセチル部位と抗体 JM403とが反応 することを利用した方法である力 サンドイッチ法であるため少なくとも 2つ以上のェピ トープを必要とする。また、この方法では ST活性を検出することができない（非特許 文献 11)。
[0008] 後者の測定方法は、 ND活性及び ST活性によって生成した脱 N—ァセチルイ匕 NA
H及び N—硫酸ィ匕 NAHをへノ^ナーゼ消化することによって得られる不飽和二糖を
、非特許文献 16に記載の「2 · 8グリコサミノダリカン分解酵素と HPLCを組み合わせ た構造解析」などを用 ヽて脱 N -ァセチルイ匕度や N -硫酸ィ匕度を算出する方法であ る力 クロマトグラフィーやスクリーニングなど多検体の活性を測定する方法には適さ ない (特許文献 2、非特許文献 17)。
[0009] ND、 ST及び NDSTの活性を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定するこ とができれば、このような酵素が関与する疾患やそのリスクの検知、病態把握等を容 易に行うことができるのみならず、当該酵素の活性に変化を与える物質 (阻害剤ゃ賦 活化剤など）のスクリーニング等も効率的に行うことができる。
特許文献 1 :米国特許出願公開第 2003Z0109501号明細書
特許文献 2：米国特許出願公開第 2004Z0043447号明細書
非特許文献 1：アイカヮ、 J (Aikawa, J.)ら、 2001年、ジャーナル ォブ バイオロジカ ル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 276卷、第 8号、 p. 5876— 58 82
非特許文献 2 :ハンフリーズ、 DE (Humphries, D.E.)ら、 1999年、ネイチヤー（Nature )、第 400卷、 p. 769- 772 非特許文献 3:フォースバーグ、 E(Forsberg, E.)ら、 1999年、ネイチヤー（Nature)、 第 400卷、 p. 773-776
非特許文献 4:リンギバル、 M(Ringivall, M.)ら、 2000年、ジャーナル ォブ バイオ ロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 275卷、第 34号、 p. 259 26-25930
非特許文献 5:ビカス、 DS (Pikas, D.E.)ら、 2000年、バイオケミストリー（Biochemistr y)、 第 39卷、 p.4552— 4558
非特許文献 6:フクダ、 M(Fukuda, M.)ら、 2001年、ジャーナル ォブ バイオロジカ ル ケミストリー (Journal of Biological Chemistry)、第 276卷、第 51号、 p.47747— 47750
非特許文献 7:エスコ、 JD(Esko, J.D.)ら、 2001年、ジャーナル ォブ タリ-カル ィ ンべスティゲーシヨン（Journal of Clinical Investigation) ,第 108卷、 p. 169— 173 非特許文献 8:フォースバーグ、 E(Forsberg, E.)ら、 2001年、ジャーナル ォブ タリ -カル インべスティゲーシヨン（Journal of Clinical Investigation)、第 108卷、 p. 17 5-180
非特許文献 9:バンデンボーン、 J (van den Born, J)ら、 1992年、キドニ一 インター ナショナル（Kidney International)、第 41卷、 p. 115— 123
非特許文献 10:バンデンボーン、 J (van den Born, J)ら、 1995年、ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリー (Journal of Biological Chemistry)、第 270卷、第 52号、 p . 31303-31309
非特許文献 11:バンデンボーン、 J (van den Born, J)ら、 2003年、グライコバイオロジ 一（Glycobiology)、第 13卷、第 1号、 p. 1— 10
非特許文献 12:ブランダン、 E(Brandan, E.)ら、 1988年、ジャーナル ォブバイオ口 ジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 263卷、第 5号、 p. 2417— 2422
非特許文献 13:ベィメ、 KJ(Bame, K. J.)ら、 1991年、ジャーナル ォブ バイオロジ カル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 266卷、第 16号、 p. 10287 -10293 非特許文献 14:ベィメ、 KJ (Bame, K. J.)ら、 1991年、ジャーナル ォブ バイオロジ カル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 266卷、第 19号、 p. 12461 - 12468
非特許文献 15 :ベルダゴ、 DE (Verdugo, D.E.)ら、 2002年、アナリティカル バイオ ケミストリー（Analytical Biochemistry) ,第 307卷、 p. 330— 336
非特許文献 16 :新生化学実験講座 3、糖質 II (東京化学同人刊、 1991年) p49-62 非特許文献 17 :サリバス、 AS (Saribas, A. S.)ら、 2004年、グライコバイオロジー（Gly cobiology)、第 14卷、第 12号、 p. 1217- 1228
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は、 HPZHSの生合成に関与する酵素群、特に、 ND、 ST及び NDSTの 活性を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定することができる方法及びキット 並びにこれらの酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法等を提供すること を課題とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、 NAH又はその誘 導体に特定の物質が結合した修飾多糖を新たに製造し、これを用いたところ ND、 S T及び NDSTの活性を簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価に測定できることを見 出した。そしてこれに基づいて、 ND、 ST及び NDSTの活性を簡便、迅速、高感度、 高精度かつ安価に測定することができる方法及びキット並びにこれらの酵素の活性 を変化させる物質のスクリーニング方法を提供するに至り、本発明を完成するに至つ た。
[0012] すなわち本発明は、下記の群力も選択される物質が、 NAH又はその誘導体に結 合していることを特徴とする、修飾多糖 (以下、「本発明多糖」という。）を提供する。 (群)蛋白質、ピオチン、抗原物質
[0013] この結合は、前記の物質と NAH又はその誘導体の還元末端との間に形成されて いるものが好ましい。またこのうち蛋白質との結合は、共有結合又はァフィユティー結 合であるものが好ま 、。この共有結合は SS結合又はアミド結合であるものが好まし ぐこのァフィユティー結合はピオチン'アビジン結合であるものが好ましい。また、こ の蛋白質は分子量 1. 5万〜 20万の可溶性の蛋白質であるものが好ましい。この「分 子量 1. 5万〜 20万の可溶性の蛋白質」は、免疫グロブリン、アビジン、プロテイン A、 プロテイン G、アルブミン又はカゼインであるものが好ましい。このアルブミンは、血清 アルブミン又は卵白アルブミンであるものが好ましい。また NAHの誘導体は、下記（1 )〜（3)力もなる群力も選ばれる物質であるものが好ま 、。
( 1 ) N—脱硫酸化 HP又は N -脱硫酸化 ZN -ァセチル化 HP
(2) N—脱硫酸化 HS又は N -脱硫酸化 ZN -ァセチル化 HS
(3)脱 N—ァセチノレ化 NAH
[0014] また本発明は、本発明多糖が固着された固相（以下、「本発明固相」という。）を提 供する。
[0015] また本発明は、下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含む、検体中の ND活性の検 出方法 (以下、「本発明 ND検出方法」という。）を提供する。
ステップ (a)：本発明固相に、検体を接触させるステップ
ステップ (b)：前記固相に固着された本発明多糖における、脱 N—ァセチルイ匕を検 出するステップ。
[0016] この脱 N—ァセチル化の検出は、本発明固相に「NAH又はその誘導体における G lcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕された GlcNAc残基）に結合する蛋白質」を 接触させることにより行われることが好ましい。また、 NAH又はその誘導体における G lcN残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、 NAH又はその 誘導体における GlcN残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体 JM403であること が好ましい。
[0017] また本発明は、下記の構成成分 (A)及び (B)を少なくとも含む、検体中の ND活性 の検出キット (以下、「本発明 ND検出キット」という。）を提供する。
(A)本発明多糖
(B) NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕された GlcNAc残基）に結合する蛋白質
[0018] この本発明多糖は、固相に固着されているものが好ましい。また、 NAH又はその誘 導体における GlcN残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、 N
AH又はその誘導体における GlcN残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体 JM
403であることが好ましい。
[0019] また本発明は、下記ステップ (c)及び (d)を少なくとも含む、検体中の ST活性の検 出方法 (以下、「本発明 ST検出方法」という。）を提供する。
ステップ (c)：本発明固相に、検体と硫酸基供与体とを接触させるステップ。
ステップ (d)：前記固相に固着された本発明多糖における、 N—硫酸化を検出す るステップ。
[0020] この N—硫酸化の検出は、本発明固相に「NAH又はその誘導体における N—硫 酸ィ匕されている GlcN残基に結合する蛋白質」を接触させることにより行われることが 好ましい。また、 NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に 結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、 NAH又はその誘導体にお ける N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体 F58— 10E4又はモノクローナル抗体 HepSS— 1であることが好ましい。なかでも、モノクロ ーナル抗体 F58— 10E4を好ましく用いることができる。
[0021] また本発明は、下記の構成成分 (A)及び (C)を少なくとも含む、検体中の ST活性 の検出キット (以下、「本発明 ST検出キット」という。）を提供する。
(A)本発明多糖
(C) NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する蛋 白質
[0022] この本発明多糖は、固相に固着されているものが好ましい。また、 NAH又はその誘 導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する「蛋白質」は、抗体である ことが好ましい。また、 NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残 基に結合する抗体は、モノクローナル抗体 F58— 10E4又はモノクローナル抗体 He pSS— lであることが好ましい。なかでも、モノクローナル抗体 F58— 10E4を好ましく 用!/、ることができる。
[0023] また本発明は、本発明 ND検出方法によって検体中の ND活性を検出し、かつ、本 発明 ST検出方法によって検体中の ST活性を検出することを特徴とする、検体中の NDST活性の検出方法 (以下、「本発明 NDST検出方法」という。）を提供する。
[0024] また本発明は、下記の構成成分 (A)、（B)及び (C)を少なくとも含む、検体中の N DST活性の検出キット（以下、「本発明 NDST検出キット」という。）を提供する。
(A)本発明多糖
(B) NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕された GlcNAc残基）に結合する蛋白質
(C) NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する蛋 白質
[0025] この本発明多糖は、固相に固着されているものが好ましい。また、 NAH又はその誘 導体における GlcN残基に結合する「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、 N AH又はその誘導体における GlcN残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体 JM 403であることが好ましい。
[0026] また、 NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する 「蛋白質」は、抗体であることが好ましい。また、 NAH又はその誘導体における N— 硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する抗体は、モノクローナル抗体 F58— 10E4又 はモノクローナル抗体 HepSS— 1であることが好ましい。なかでも、モノクローナル抗 体 F58— 10E4を好ましく用いることができる。
[0027] また本発明は、下記ステップ (e)〜(g)を少なくとも含む、下記の酵素群から選択さ れる 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法 (以下、「本発 明スクリーニング方法」と 、う。）を提供する。
ステップ (e) :下記の酵素群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる 可能性のある試験物質を、当該酵素と共存させるステップ。
ステップ (f)：ステップ (e)により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」を検 体とし、本発明 ND検出方法、本発明 ST検出方法及び本発明 NDST検出方法のい ずれかの方法によって、前記酵素の活性を検出するステップ。
ステップ ）：ステップ (f)により検出された酵素の活性と、ステップ (e)で用いた酵素 を検体としてステップ (f)と同一の方法によって検出される酵素の活性とを比較して、 下記の酵素群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる試験物質を選 択するステップ。
(酵素群） ND、 ST、 NDST
発明の効果
[0028] 本発明多糖は、本発明固相の素材とすることができ極めて有用である。本発明固 相は、本発明の各種検出方法や各種検出キットに用いることができ、極めて有用で ある。本発明 ND検出方法、本発明 ST検出方法及び本発明 NDST検出方法は、い ずれも簡便、迅速、特異的、高感度、高精度かつ安価に ND活性、 ST活性又は ND ST活性を定量性 ·再現性よく検出することができ、極めて有用である。また本発明 N D検出キット、本発明 ST検出キット及び本発明 NDST検出キットは、いずれも前記の 検出方法の実施をさらに簡便かつ迅速なものとすることから、極めて有用である。ま た本発明スクリーニング方法は、 ND、 ST又は NDSTの活性を変化させる物質を、 簡便、迅速、高感度、高精度かつ安価にスクリーニングすることができ、極めて有用 である。さらに本発明は、 NDST等の酵素活性の異常に起因する疾患の検知やその リスクの検知、病態把握等にも活用しうるものであり、極めて有用である。
図面の簡単な説明
[0029] [図 1]NAH— SS— BSA固相化プレートを用いた場合における、 ND活性の用量依 存性を示す図である。
[図 2]NAH— COOH— BSA固相化プレートを用いた場合における、 ND活性の用 量依存性を示す図である。
[図 3]NAH— SS— BSA固相化プレートを用いた場合における、 ND活性の反応時 間依存性を示す図である。
[図 4]NAH— SS— BSA固相化プレートを用いた場合における、 ST活性（NDST活 性)の用量依存性及び PAPS依存性を示す図である。
[図 5]NAH— SS— BSA固相化プレートを用いた場合における、 ST活性（NDST活 性)の反応時間依存性及び熱処理による影響を示す。
[図 6]「NAH—ピオチンがアビジンを介して固着されたプレート」を用いた、 ND活性 の用量依存性を示す図である。
[図 7]「NAH—ピオチンがアビジンを介して固着されたプレート」を用いた ND活性の 測定における、 pHの影響を示す図である。
[図 8]「NAH—ピオチンがアビジンを介して固着されたプレート」を用いた、 ND活性 の阻害剤のスクリーニングの結果を示す図である。
[図 9]サンドイッチ ELIS Aを用いた、 ND活性の検出結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0030] 以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
< 1 >本発明多糖
本発明多糖は、下記の群力 選択される物質が、 NAH又はその誘導体に結合し ていることを特徴とする、修飾多糖である。
(群)蛋白質、ピオチン、抗原物質
[0031] ここにいう「蛋白質」は特に限定されないが、分子量 1. 5万〜 20万の可溶性の蛋白 質であることが好ましぐ分子量 1. 5万〜 10万の可溶性蛋白質であることがより好ま しぐ分子量 1. 5万〜 7万の可溶性蛋白質であることがより好ましい。ここで、「可溶性 」とは、蛋白質が室温において水、生理的塩類溶液 (生理食塩水など）、緩衝液等の 水性溶媒に溶解可能であることを意味する。分子量 1. 5万〜 20万の可溶性の蛋白 質としては、免疫グロブリン、アビジン、プロテイン A、プロテイン G、アルブミン又は力 ゼインを例示することができる。また分子量 1. 5万〜 10万や分子量 1. 5万〜 7万の 可溶性蛋白質としては、アビジン、プロテイン A、プロテイン G、アルブミン又はカゼィ ンを例示することができる。なかでも、アルブミン又はカゼインが好ましい。
[0032] この「アルブミン」としては、血清アルブミン又は卵白アルブミンを例示することがで きる。
[0033] また、ここに!/、う「NAH」は、当技術分野にぉ 、て NAHであると認識されるものであ る限りにおいて特に限定されない。 NAHは、 GlcA残基と GlcNAc残基とが交互に グリコシド結合した糖鎖である。 GlcA残基と GlcNAc残基との間の結合は |8 1 , 4ダリ コシド結合であり、 GlcNAc残基と GlcA残基との間の結合は α 1 , 4グリコシド結合で ある。 ΝΑΗの一般式としては、以下の（1)又は（2)で表すことができる。
(4GlcA β l-4GlcNAc α l)n ( 1)
(4GlcNAc a 1- 4GlcA β l)n (2) (式中、 nは任意の整数を示す。 )
[0034] 本発明多糖の原料とする NAHは、公知のものを用いることができる。その由来も特 に限定されず、例えば天然物由来のものでも、酵素学的に又は化学的に合成したも のであってもよい。天然物由来のものとしては、 NAHを産生するバクテリア由来のも のを例示することができる。このようなバクテリアとしてはある種の大腸菌やパスッレラ 属細菌が上げられる。具体的には、例えば、大腸菌 K5株やパスッレラ マルトシダ（ Pasturella multosida)を例示することができる。 NAHは、例えば特開 2004— 18840 号公報に記載の方法で製造することができる。
[0035] また、本出願書類にお!/、て「NAHの誘導体」とは、 NAHの糖鎖骨格は維持しつつ 、さらに他の官能基を保持していたり、逆に NAHの糖鎖骨格において本来保持され て 、るべき官能基が失われて 、るものなど、何らかの修飾がなされて 、るものすベて を意味する。したがって、 NAHに硫酸基が保持されているもの、 NAHからァセチル 基が脱離したもの、ゥロン酸がェピ異性体となっているものなどは、いずれも「NAH の誘導体」の概念に包含されるが、これらに限定されるものではない。また本出願書 類における「NAHの誘導体」の用語は、 NAHを原材料としてこれを修飾することに より得られるものはもちろん、 NAHを原材料としな 、で得られるものも含む概念であ る。
[0036] 「NAHの誘導体」としては、なかでも下記（1)〜（3)からなる群から選ばれる物質が 好ましい。
( 1 ) N 脱硫酸化 HP又は N -脱硫酸化 ZN -ァセチル化 HP
(2) N 脱硫酸化 HS又は N -脱硫酸化 ZN -ァセチル化 HS
(3)脱 N ァセチノレ化 NAH
ここで「N 脱硫酸ィ匕 HP」とは、 HPにおける GlcN残基の 2位ァミノ基に結合した硫 酸基が脱硫酸化された HPをいい、「N 脱硫酸ィ匕/ N ァセチルイ匕 HP」とは、 HP における GlcN残基の 2位ァミノ基に結合した硫酸基が脱硫酸ィ匕された後、 GlcN残 基の 2位ァミノ基がァセチルイ匕された HPをいう。また「N 脱硫酸ィ匕 HS」とは、 HSに おける GlcN残基の 2位ァミノ基に結合した硫酸基が脱硫酸ィ匕された HSを 、、「N 脱硫酸ィ匕 ZN ァセチル化 HS」とは、 HSにおける GlcN残基の 2位ァミノ基に結 合した硫酸基が脱硫酸ィ匕された後、 GlcN残基の 2位ァミノ基がァセチルイ匕された H Sをいう。また「脱 N—ァセチル化 NAH」とは、 NAHにおける GlcNAc残基が脱 N— ァセチル化された NAHをいう。 N—脱硫酸化 HP、 N—脱硫酸化 HS、 N—脱硫酸化 ZN—ァセチル化 HP及び N—脱硫酸化 ZN—ァセチル化 HSは、 HPや HSを原料 として、特開 2003— 113090号公報に記載された方法に従って製造することができ る。また「脱 N—ァセチル化 NAH」は、 NAHを原料として、 Leali, D.らの方法 (J. Biol . Chem., 276, 41, 37900-37908 (2001))あるいは、 Shaklee, P. K.らの方法（Biochem. J., 217, 187-497 (1984))などに従って化学的に製造することができる。また、 Aikawa , J.らの方法 (J. Biol. Chem., 274(5), 2690-2695(1999))などに従って調製したヒト ND STを NAHに作用させて酵素的に製造することもできる。
[0037] 本発明多糖の原料とすることができる NAH又はその誘導体の重量平均分子量も 特に限定されず、硫酸基ゃァセチル基等の有無、他の化合物の付加の有無等によ つても変動しうるが、例えば、硫酸基等や他の化合物の付カ卩による影響を排除して純 粋に NAH糖鎖のみの重量平均分子量として換算した場合には、 1, 500〜50万の ものが好ましぐ 4, 000〜20万のもの力より好ましく、 1万〜 20万のものがより好まし く、 2万〜 15万のものがより好ましぐ 2万〜 10万のものがより好ましぐ 2万〜 8万のも のがさらに好ましい。
[0038] 本発明多糖は、前記の群力 選択される物質が、このような NAH又はその誘導体 に結合していることを特徴とする。ここにいう「結合」の様式は、前記の群から選択され る物質と NAH又はその誘導体とが水溶液中にぉ 、ても解離しな!、強度以上の強度 を有する結合である限りにおいて特に限定されない。このような結合としては、例えば 、 2個の原子力 ^、くつかの電子を共有してつくる共有結合や、 2個の分子間における 親和性により形成されるァフィユティー結合等を例示することができる。前記の群から 選択される物質が蛋白質である場合、共有結合としては、 SS結合、アミノアルキル結 合、アミド結合等が例示される。また前記の群力 選択される物質が蛋白質である場 合、ァフィユティー結合としては、ピオチン'アビジン結合 (ピオチンとアビジンとの間 の結合)を例示することができる。なお、本出願書類における「アビジン」の用語には、 ストレプトアビジンも当然に包含される。 [0039] このような結合を形成させる方法は、公知の方法を採用することができる。
[0040] また、前記の群力 選択される物質がピオチンである場合には、例えば NAH又は その誘導体を原料とし、 Osmond, R. I. W.らの方法（Anal. Biochem., 310, 199-207 ( 2002))に従って、 NAH又はその誘導体のピオチン化誘導体を製造することができる 。この方法によれば、 NAH又はその誘導体の還元末端にピオチンを共有結合させ ることがでさる。
[0041] また、前記の群力も選択される物質が抗原物質である場合には、その抗原物質の 種類に応じて、 NAH又はその誘導体との結合のさせ方を選択することができる。例 えば抗原物質がペプチドである場合には、前述の蛋白質を結合させる方法と同じ方 法を採用することができる。なお、本出願書類において「抗原物質」とは、これを免疫 原としたときにこれに対する抗体が産生される物質 (抗原となる物質)を意味する。
[0042] 本発明多糖は、所望の構造の NAH又はその誘導体を製造した後、これを前記の 群力 選択される物質と結合させることによって製造しても良ぐまた所望の NAH又 はその誘導体の原料となる多糖を予め前記の群から選択される物質と結合させ、そ の後、その糖鎖部分を前述の各種糖鎖修飾法等によって所望の構造となるよう改変 して製造しても良い。
[0043] また、このような本発明多糖をさらに別の物質と結合させても良い。例えば、 NAH 又はその誘導体に免疫グロブリンが結合している本発明多糖について、当該免疫グ ロブリン部分を介してプロテイン Aやプロテイン Gに結合させてもよぐ NAH又はその 誘導体にプロテイン Aやプロテイン Gが結合している本発明多糖について、当該プロ ティン A又はプロテイン G部分を介して免疫グロブリンに結合させてもよい。また、 NA H又はその誘導体にアビジンが結合して 、る本発明多糖にっ 、て、当該アビジン部 分を介してピオチンに結合させてもよぐ NAH又はその誘導体にピオチンが結合し て 、る本発明多糖にっ 、て、当該ピオチン部分を介してアビジンに結合させてもょ ヽ 。また、 NAH又はその誘導体に抗原物質が結合している本発明多糖について、当 該抗原物質部分を介してこれに対する抗体に結合させてもよぐ NAH又はその誘導 体に抗体が結合している本発明多糖について、当該抗体部分を介してこれに対する 抗原物質に結合させてもよい。このようにして得られる物質も、本発明多糖に包含さ れる。
[0044] 前記のような共有結合を形成させる方法は、公知の方法を採用することができる。
以下に、蛋白質と NAHとを共有結合させる方法についてその一例を示す力 これら に限定されるものではない。
[0045] 例示（1)：シァノ水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元アミノ化した NAHに、 SPD Pを添カ卩して PDP化 NAHを得、これにジチオスレィトール等を添カ卩して SH— NAH を得る。一方、蛋白質に SPDPを添加して PDP化蛋白質を得る。次いで、両者を接 触させてコンジユゲーシヨン反応（SH— NAHが還元剤となって PDP化蛋白質を還 元する際、両者が結合する。）を行うことにより、蛋白質を NAHの還元末端に共有結 合させる方法。これにより生じる共有結合は、 SS結合である。
[0046] 例示（2)：「シァノ水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元アミノ化した NAH」と蛋白 質に EDCを添加し、コンジユゲーシヨン反応 (EDCが活性化剤として作用して両者が 結合する。）を行うことにより、蛋白質のカルボキシル基と NAHの還元末端に導入さ れたァミノ基とを共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アミド結合であ る。
[0047] 例示（3)： NAHの還元末端のホルミル基と蛋白質のァミノ基とを反応させてシッフ 塩基を形成後、トリメチルァミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方 法。これにより形成される共有結合は、アミノアルキル結合 (-CH -NH-)である。
2
[0048] 例示 (4)： NAHの還元末端を還元した後、過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導 入し、これと蛋白質のァミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボ ラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法。これにより形成される共有結 合は、アミノアルキル結合 (-CH - NH- )である。
2
[0049] 例示（5)： NAHと蛋白質のァミノ基とをべンゾキノン等を用いて共有結合させる方 法。
[0050] また前記のようなァフィユティー結合を形成させる方法も、公知の方法を採用すること ができる。以下に、蛋白質と NAHとをァフィユティー結合させる方法についてその一 例を示すが、これらに限定されるものではない。
[0051] 例示（6)：シァノ水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元アミノ化することによって N AHの還元末端に生じたアミノ基部位又は NAHのカルボキシル基部位にピオチンを 結合させる。一方、蛋白質にアビジンを結合させ、両者を接触させることによりァフィ ユティー結合 (ピオチン ·アビジン結合)させる方法。
[0052] 例示（7)： NAHを例示（1)から例示（5)のいずれかの方法でアビジンと結合させる 方法。また必要に応じてさらに、アミノ基又はカルボキシル基に対して特異的に結合 するピオチン誘導体 (ピアス社)を蛋白質と反応させることによって、蛋白質のアミノ基 又はカルボキシル基部位にピオチンを結合させ、次いで、これをアビジンが結合した NAHと接触させることによりァフィユティー結合 (ピオチン'アビジン結合)させる方法
[0053] 例示（8)： NAHを例示（1)から例示（5)のいずれかの方法で各種抗原物質 (例え ば、抗原性ペプチド (例えばワクチン)等）と結合させる。次いで、これとこの抗原物質 に対する抗体とを接触させることによりァフィユティー結合 (抗原 ·抗体結合)させる方 法。
[0054] 例示（9)： NAHを例示（1)から例示（5)のいずれかの方法で各種抗体 (例えば、抗 BSA抗体等）と結合させる。また必要に応じてさらにこれとこの抗体に対する抗原蛋 白質とを接触させることによりァフィユティー結合 (抗原 ·抗体結合)させる方法。
[0055] 例示（10)： NAHを例示（1)から例示（5)のいずれかの方法でプロテイン A (又はプ 口ティン G)と結合させる。また必要に応じてさらにこれと免疫グロブリン (IgG等）とを 接触させることによりァフィユティー結合 (プロテイン A (又はプロテイン G) '免疫グロ ブリン結合)させる方法。
[0056] 例示（11)： NAHを例示（1)から例示（5)の 、ずれかの方法で免疫グロブリン (IgG 等）と結合させる。また必要に応じてさらにこれとプロテイン A (プロテイン G)とを接触 させることによりァフィユティー結合 (プロテイン A (又はプロテイン G) '免疫グロブリン 結合)させる方法。
[0057] また本発明多糖における「結合」は、前記の群から選択される物質と、 NAH又はそ の誘導体の還元末端との間に形成されて 、ることが好まし 、。
[0058] このような方法等で前記の群力 選択される物質と NAH又はその誘導体とを結合 させることにより、前記の群力 選択される物質が NAH又はその誘導体に結合して いることを特徴とする修飾多糖 (本発明多糖)を製造することができる。
[0059] < 2 >本発明固相
本発明固相は、本発明多糖が固着された固相である。本発明多糖については、前 記で説明した通りである。
[0060] 本発明多糖が固着される固相は、本発明多糖を固着させることができ、かつ、水、 検体や反応液に不溶性である限りにお 、て特に限定されな 、。固相の形状としては 、プレート（例えばマイクロプレートのゥエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、 微粒子状固相担体 (ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子 等)等を例示することができる。なかでも、正確な定量性と使用上の簡便性の点から、 マイクロプレートが望まし 、。
[0061] 固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビュル、ニトロセルロー ス、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、ァガロース等が 例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
[0062] このような固相の表面に本発明多糖を固着させる方法としては、物理的吸着法、ァ フィニティー結合法、共有結合法、包括法などの一般的な方法 (例えば、固定化酵 素、 1975年、講談社発行、第 9〜75頁参照）を応用することができる。
[0063] これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好まし い。
[0064] また、前記の群から選択される物質 (本発明多糖の分子に含有されている）とァフィ ユティーを有する物質を固相に固着させておき、これを介して本発明多糖を固相に 固着させても良 、。例えば本発明多糖にぉ 、て免疫グロブリンが結合して 、る場合 には固相に固着されたプロテイン A (又はプロテイン G)を介して、本発明多糖におい てプロテイン A (又はプロテイン G)が結合している場合には固相に固着された免疫グ ロブリンを介して、本発明多糖においてアビジンが結合している場合には固相に固着 されたピオチンを介して、本発明多糖においてピオチンが結合している場合には固 相に固着されたアビジンを介して、本発明多糖において抗原物質が結合している場 合には固相に固着された当該抗原物質に対する抗体を介して、本発明多糖に抗体 が結合している場合には固相に固着された抗原物質（当該抗体の抗原)を介して、そ れぞれ本発明多糖を固相に固着させることもできる。
[0065] 本発明多糖や「前記の群力 選択される物質とァフィユティーを有する物質」の固 相への物理的吸着の具体的方法の一例として、例えば、本発明多糖や「前記の群か ら選択される物質とァフィユティーを有する物質」の緩衝液溶液 (pH7〜9程度の緩 衝液 (例えばリン酸緩衝液、 PBS、炭酸緩衝液等)）を固相に接触させて 0°C〜10°C 程度、好ましくは 0°C〜5°C程度で、 6時間〜 24時間程度、好ましくは 10時間〜 20時 間程度静置する方法が例示される。「前記の群から選択される物質とァフィ二ティー を有する物質」を固相に接触させた場合には、その後、本発明多糖を加えて当該物 質とァフィユティー結合させる。これにより、本発明多糖が固着された本発明固相を 得ることができる。
[0066] また必要に応じて、この後に固相の表面を洗浄液で洗浄してもよい。この洗浄は、 固相に固着して 、る本発明多糖が解離しな 、条件で行われる限りにお 、て特に限 定されない。洗浄液としては緩衝液 (例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、 PBS等)等 を用いることができる。
[0067] また必要に応じて、この後にブロッキング物質を固相に接触させて、本発明多糖が 固着して!/ヽな 、部分を被覆しておくことが好ま ヽ。このようなブロッキング物質として は、 BSA、ゼラチン、カゼイン、スキムミルク、 ApplieDuo (商品名；生化学工業株式会 社製)等が例示される。これらは単独の成分で用いてもよぐ 2種以上の成分として用 いてもよい。ブロッキングの具体的方法の一例として、例えば、 ApplieDuo (商品名；生 化学工業株式会社製)の溶液を固相に接触させ、 0°C〜37°C程度、好ましくは 10°C 〜30°C程度で、 30分間〜 2時間程度静置する方法が例示される。必要に応じてブ ロッキング溶液に防腐剤等を共存させてもょ 、。
[0068] また必要に応じて、この後にブロッキング物質等を除去するために前記のような洗 浄液で洗浄してもよい。またこの後に、プレートを 10°C〜37°C程度で乾燥させてもよ い。
[0069] < 3 >本発明 ND検出方法
本発明 ND検出方法は、下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含む、検体中の ND 活性の検出方法である。 ステップ (a)：本発明固相に、検体を接触させるステップ
ステップ (b)：前記固相に固着された本発明多糖における、脱 N—ァセチルイ匕を検 出するステップ。
[0070] なお本出願書類において「検出」の用語は、その対象となるものを何らかのかたち で見つけ出すことを意味する。したがって、本出願書類における「検出」の用語は、そ の検出対象の存否 (有無)を見つけ出すことのみならず、その検出の対象を定量的 に見つけ出すこと (検出対象を定量的に測定すること)をも含む概念である。
[0071] 以下、ステップごとに説明する。
1.ステップ（a)
ステップ (a)は、本発明固相に、検体を接触させるステップである。本発明固相につ いては、前記で説明した通りである。
[0072] ここに 、う「検体」は、 ND活性を有する酵素が含有されて 、る力 又は含有されて いる可能性があるものであればよい。また、この検体中の ND活性を有する酵素は、 予め単離 '精製等の処理が施されている必要もない。すなわち、検体中に ND活性を 保持する酵素以外の酵素その他の蛋白質成分等が含有されていても、本発明 ND 検出方法によれば ND活性を特異的に検出することができる。
[0073] また、固相と検体との接触方法は、当該固相に固着された本発明多糖の分子と、検 体中に存在する ND活性を有する酵素の分子とが接触する限りにおいて特に限定さ れない。例えば、固相に検体を添加して接触させても良ぐまた検体に固相を添加し て接触させても良ぐ別体の容器に両者を同時に添加しても良い。接触の方法はこ れらに限定されるものではなぐ固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定す ることがでさる。
[0074] これら両者を接触させた後、固相に固着された本発明多糖の分子と検体中に存在 する ND活性を有する酵素の分子とを十分に反応させるためにインキュベートするこ とが好ましい。
[0075] インキュベートの温度は、酵素反応が起こる温度である限りにおいて特に限定され ず、その一例として室温が例示される。インキュベートの時間も、前記の両者が十分 に反応する限りにおいて特に限定されないが、 15〜120分間程度、より好ましくは 3 0〜60分間程度を例示することができる。
[0076] 反応後、固相と液相を分離する。必要に応じて、固相の表面を洗浄液で洗浄するこ とが好ましい。この洗浄は、固相に固着している本発明多糖が解離しない条件で行 われる限りにおいて特に限定されない。洗浄液としては、例えば、トウィーン (Tween) 系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液 (例えばトリス塩酸緩衝 液、リン酸緩衝液、 PBS等）を例示することができる。
[0077] 本発明固相と検体とを接触させることにより、検体中に存在する ND活性を有する 酵素が固相に固着された本発明多糖に作用して、当該多糖の分子中 (糖鎖部分）に 複数個存在する GlcNAc残基が脱 N—ァセチルイ匕される。そして、検体中に存在す る酵素の ND活性が高ければ高いほど、これに対応して、固相に固着された本発明 多糖の分子中（糖鎖部分）に存在する多くの GlcNAc残基が脱 N—ァセチルイ匕され ることになる。
[0078] 2.ステップ（b)
ステップ (b)は、前記固相に固着された本発明多糖における、脱 N—ァセチルイ匕を 検出するステップである。
[0079] 検体中に存在する酵素が ND活性を保持していれば、ステップ (a)において固相に 固着された本発明多糖の分子中（糖鎖部分）に存在する GlcNAc残基が脱 N—ァセ チル化される。また、検体中に存在する酵素の ND活性が高ければ、それだけ多くの GlcNAc残基が脱 N—ァセチル化されることになる。ステップ (b)では、このステップ（ a)を経た固相に固着された本発明多糖における脱 N—ァセチルイ匕を検出することに よって、検体中に存在する ND活性を検出せんとするものである。
[0080] 固相に固着された本発明多糖における脱 N—ァセチルイ匕の検出手法も特に限定さ れず、例えば物理ィ匕学的方法 (例えばクロマトグラフィー法など）、化学的方法 (例え ばァミノ基検出法)、生物学的方法 (例えば、免疫測定法などの生物学的なァフィ二 ティーを利用した方法)等によって行うことができる。なかでも、簡便性や迅速性等の 観点から、生物学的なァフィユティーを利用した方法によって行うことが好ましい。
[0081] 生物学的なァフィ二ティーによって脱 N—ァセチルイ匕を検出する場合には、本発明 固相に「NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕さ れた GlcNAc残基）に結合する蛋白質」を接触させることにより行うことができる。この ような蛋白質は、抗体であることが好ましい。
[0082] したがってかかる検出は、免疫測定法によって行うことが好ましい。免疫測定法とし ては、 ELISAや RIA等が例示される力 いずれの方法も採用することができる。
[0083] ここで用いる「抗体」の概念には、抗体自体はもちろん、その抗原結合部位 (Fab) を保持する抗体のフラグメントも包含される。またここにいう「抗体」は、ポリクローナル 抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよいが、特異性、均質性、再現性、大 量かつ永続的な生産性等の観点からすると、モノクローナル抗体であることが好まし い。
[0084] ここでは、例えばモノクローナル抗体 JM403を用いることができる。モノクローナル 抗体 JM403は、 Kidney, Int., 41, pll5 (1992)に記載の方法により製造することがで きる。また、モノクローナル抗体 JM403は、生化学工業株式会社から販売されており 、これを使用することちできる。
[0085] ここにおける「接触」の方法は、ステップ (a)における説明と同様である。
[0086] また、両者を接触させた後、生物学的なァフィ二ティーによる結合を十分にさせるた めにインキュベートすることが好ましい。インキュベートの温度は、生物学的なァフィ二 ティーによる結合が起こる温度である限りにおいて特に限定されず、 2°C〜37°C程度 、好ましくは 4°C〜25°C程度が例示される。インキュベートの時間は、前記両者が十 分に反応する限りにおいて特に限定されないが、 0. 5〜2時間程度、好ましくは 1〜 1. 5時間程度を例示することができる。
[0087] 反応後、固相と液相を分離する。必要に応じて、固相の表面を洗浄液で洗浄するこ とが好ましい。この洗浄の要領は、ステップ (a)における酵素反応後の洗浄の要領と 同様である。
[0088] 「NAH又はその誘導体における GlcN残基（すなわち、脱 N—ァセチル化された G1 cNAc残基）に結合する蛋白質」は、検出を容易とするために標識物質で標識されて いるか又は標識されるものであってもよい。標識に用いることができる標識物質は、通 常の蛋白質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素 (ぺ ルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 β ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ァ セチルコリンエステラーゼ、グルコースォキシダーゼなど）、放射性同位元素（1251、 1311 、 ¾など）、蛍光色素（フルォレセインイソチオシァネート (FITC)、 7-ァミノ- 4-メチルク マリン- 3-酢酸 (AMCA)、ジクロロトリアジ-ルァミノフルォレセイン (DTAF)、テトラメチ ルローダミンイソチオシァネート (TRITC)、リスアミンローダミン B(Lissamine Rhodamine B)、テキサスレッド (Texas Red),フィコエリスリン (Phycoerythrin;PE)、ゥンベリフエロン 、ユーロピウム、フィコシァニン、トリカラ一、シァニンなど）、化学発光物質 (ルミノール など）、ハプテン（ジニトロフルォロベンゼン、アデノシン一リン酸 (AMP)、 2, 4 ジ-ト ロア-リンなど）、特異的結合対 (ピオチンとアビジン類 (ストレプトアビジンなど）、レク チンと糖鎖、ァゴ-ストとァゴ-ストの受容体、 HPとアンチトロンビン ΠΙ(ΑΤΠΙ)のいず れか一方の物質等が例示される。
[0089] また、「NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N ァセチルイ匕さ れた GlcNAc残基）に結合する蛋白質」を、固相に固着された本発明多糖における GlcN残基に結合させた後、さらに当該蛋白質に結合する第 2の蛋白質 (二次抗体 等)を用いて検出してもよい。この第 2の蛋白質 (抗体等)は、前記のような標識物質 で予め標識されて 、ることが好ま 、。
[0090] このような「NAH又はその誘導体における GlcN残基（すなわち、脱 N ァセチル 化された GlcNAc残基）に結合する蛋白質」や、これに結合する第 2の蛋白質（二次 抗体等）に結合している標識物質を検出することによって、固相に固着された本発明 多糖における GlcNAc残基の脱 N—ァセチルイ匕を検出することができる。
[0091] 標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選 択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質 (例えばビ ォチン)を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質 (例えばストレプト アビジン)を結合させた酵素（例えばペルォキシダーゼ等）を添加して、特異的結合 対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質 (例えば過酸ィ匕水素 (酵素がペル ォキシダーゼの場合) )及び発色物質 (例えば TMBや、ジァミノベンチジン等）を添 カロして、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度で測定することによって、標 識物質を検出することができる。
[0092] また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用 した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方 法などが例示される。
[0093] このような標識物質の検出を介して、固相に固着された本発明多糖における GlcN Ac残基の脱 N—ァセチルイ匕を検出することができ、これによつて検体中の ND活性 を検出することができる。標識物質が多く検出されたとすれば、それだけ脱 N—ァセ チルイ匕の程度が高いこと、すなわち検体中の ND活性が高いこと意味することになる
[0094] ND活性の定性的な検出（ND活性の存否 (有無）の検出）を望む場合には、標識 物質の検出の有無をそのまま検出結果とすることができる。また、 ND活性の定量的 な検出 (ND活性の程度や、 ND活性を有する酵素の濃度の測定など)を望む場合に は、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度などをそのまま ND活性の量の 指標とすることができる。また、 ND活性を有する既知濃度の酵素の標準溶液を用い て予め検量線又は関係式を作成しておき、これを用 、て検体中の ND活性を有する 酵素の濃度を求めることもできる。
[0095] <4>本発明 ND検出キット
本発明 ND検出キットは、下記の構成成分 (A)及び (B)を少なくとも含む、検体中 の ND活性の検出キットである。
(A)本発明多糖
(B) NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕された GlcNAc残基）に結合する蛋白質
[0096] 本発明多糖については、前記で説明した通りである。本発明多糖は、使用時に固 相に固着させるものであってもよぐ予め固相に固着されて 、るものであってもよ！/ヽが 、予め固相に固着されているものが好ましい。
[0097] また、「NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕さ れた GlcNAc残基）に結合する蛋白質」ついても、前記で説明した通りである。したが つて、このような蛋白質として抗体を例示することができ、このような抗体としてモノクロ ーナル抗体 JM403を例示することができる。
[0098] 本発明 ND検出キットは、本発明 ND検出方法に従って用いることができる。 本発明 ND検出キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて、さらに検量 線や関係式作成の標準となる既知濃度の ND活性を有する酵素の標準品や、標識 物質の検出試薬等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に、前記 のブロッキング物質、前記の洗浄液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さら に本発明 ND検出キットには、検出バッチ同士の実施レベルを一定水準に保っため の陽性コントロール (QCコントロール）を含有させることもできる。
[0099] これらの構成成分は、例えばそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発 明 ND検出方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
[0100] < 5 >本発明 ST検出方法
本発明 ST検出方法は、下記ステップ (c)及び (d)を少なくとも含む、検体中の ST 活性の検出方法である。
ステップ (c)：本発明固相に、検体と硫酸基供与体とを接触させるステップ。
ステップ (d)：前記固相に固着された本発明多糖における、 N—硫酸化を検出す るステップ。
[0101] 本発明 ST検出方法の説明については、前記の本発明 ND検出方法における「ND 」を「3丁」に、「脱 N—ァセチルイ匕」を「N—硫酸化」に、「GlcNAc残基」を「GlcN残基 」に、「NAH又はその誘導体における GlcN残基に結合する蛋白質」を「NAH又は その誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する蛋白質」に、「モノク ローナル抗体 JM403Jを「モノクローナル抗体 F58— 10E4又はモノクローナル抗体 HepSS— 1」にそれぞれ読み替えたものと同じである。なかでも、モノクローナル抗体 F58— 10E4を好ましく用いることができる。モノクローナル抗体 F58— 10E4は、 J. C ell Biol, 119, p961 (1992)に記載の方法で製造することができる。また、モノクローナ ル抗体 58— 1(^4及びモノクローナル抗体1¾ 33— 1は、いずれも生化学工業株 式会社から販売されており、これを使用することもできる。
[0102] なお、本発明 ST検出方法においては「硫酸基供与体」を用いる必要がある。ここで 用いることができる硫酸基供与体は、硫酸基受容体となる本発明多糖に対して硫酸 基を供与する能力を有する物質である限りにおいて特に限定されないが、 PAPSが 好ましい。 [0103] < 6 >本発明 ST検出キット
本発明 ST検出キットは、下記の構成成分 (A)及び (C)を少なくとも含む、検体中の ST活性の検出キットである。
(A)本発明多糖
(C) NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する蛋 白質
[0104] 本発明 ST検出キットは、本発明 ST検出方法に従って用いることができる。
[0105] 本発明 ST検出キットの説明については、前記の本発明 ND検出キットにおける「N 0」を「3丁」に、「NAH又はその誘導体における GlcN残基に結合する蛋白質」を「N AH又はその誘導体における N—硫酸ィヒされている GlcN残基に結合する蛋白質」 に、「モノクローナル抗体 JM403Jを「モノクローナル抗体 F58 - 10E4又はモノクロ ーナル抗体 HepSS— 1」にそれぞれ読み替えたものと同じである。なかでも、モノクロ ーナル抗体 F58— 10E4を好ましく用いることができる。また、本発明 ST検出キットは 、さらに硫酸基受容体を構成成分として含んでいてもよい。硫酸基受容体の説明は、 前記の本発明 ST検出方法における説明と同じである。
[0106] < 7>本発明 NDST検出方法
本発明 NDST検出方法は、本発明 ND検出方法によって検体中の ND活性を検出 し、かつ、本発明 ST検出方法によって検体中の ST活性を検出することを特徴とする 、検体中の NDST活性の検出方法である。
[0107] このように、本発明 ND検出方法と本発明 ST検出方法を組み合わせて用いること により、 ND活性と ST活性を併せ持つ NDSTの活性を検出することができる。
本発明 NDST検出方法は、少なくとも本発明 ND検出方法と本発明 ST検出方法と を実施するステップが含まれて ヽればよぐ他のステップをさらに含んで 、てもよ!/、。 また本発明 NDST検出方法における、本発明 ND検出方法と本発明 ST検出方法の 実施の順番も特に限定されない。すなわち、前者を先に実施しても良ぐ後者を先に 実施してもよぐ両者を同時に実施してもよい。
[0108] そして、本発明 ND検出方法によって検体中に ND活性が検出され、かつ、本発明 ST検出方法によって検体中に ST活性が検出された場合には、検体中に NDST活 性が存在すると判定することができる。またこれらの活性のうち一方のみが検出され た場合には、検体中に ND活性は存在するが ST活性は存在しない、又は ST活性は 存在するが ND活性は存在しな 、、と判定することができる。
[0109] また、 ND活性と ST活性を定量的に検出することによって、検体中に存在する ND ST活性の特性 (例えば、当該 NDSTは ND活性に比して ST活性が高いとか、当該 NDSTは ND活性と ST活性が同等であるとか)をも検出することができる。
[0110] く 8 >本発明 NDST検出キット
本発明 NDST検出キットは、下記の構成成分 (A)、（B)及び (C)を少なくとも含む 、検体中の NDST活性の検出キットである。
(A)本発明多糖
(B) NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕された GlcNAc残基）に結合する蛋白質
(C) NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合する蛋 白質
[0111] 本発明多糖については、前記で説明した通りである。本発明多糖は、使用時に固 相に固着させるものであってもよぐ予め固相に固着されて 、るものであってもよ！/ヽが 、予め固相に固着されているものが好ましい。
[0112] また、「NAH又はその誘導体における GlcN残基 (すなわち、脱 N—ァセチルイ匕さ れた GlcNAc残基）に結合する蛋白質」についても、前記で説明した通りである。した がって、このような蛋白質として抗体を例示することができ、このような抗体としてモノ クローナル抗体 JM403を例示することができる。
[0113] また、「NAH又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されている GlcN残基に結合す る蛋白質」についても、前記で説明した通りである。したがって、このような蛋白質とし て抗体を例示することができ、このような抗体としてモノクローナル抗体 F58— 10E4 又はモノクローナル抗体 HepSS— 1を例示することができる。なかでも、モノクローナ ル抗体 F58— 10E4を好ましく用いることができる。
[0114] また、本発明 ST検出キットは、さらに硫酸基受容体を構成成分として含んでいても よい。硫酸基受容体の説明は、前記の本発明 ST検出方法における説明と同じであ る。
[0115] 本発明 NDST検出キットは、本発明 NDST検出方法に従って用いることができる。
[0116] 本発明 NDST検出キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて、さらに 検量線や関係式作成の標準となる既知濃度の NDST活性を有する酵素の標準品や 、標識物質の検出試薬等を構成として加えることができる。また、これらの構成の他に 、前記のブロッキング物質、前記の洗浄液、酵素反応停止液等が含まれていてもよ い。さらに本発明 ND検出キットには、検出バッチ同士の実施レベルを一定水準に保 つための陽性コントロール (QCコントロール）を含有させることもできる。
[0117] これらの構成成分は、例えばそれぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発 明 NDST検出方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
[0118] < 9 >本発明スクリーニング方法
本発明スクリーニング方法は、下記ステップ (e)〜(g)を少なくとも含む、下記の酵素 群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法 である。
ステップ (e) :下記の酵素群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる 可能性のある試験物質を、当該酵素と共存させるステップ。
ステップ (f)：ステップ (e)により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」を検 体とし、本発明 ND検出方法、本発明 ST検出方法及び本発明 NDST検出方法のい ずれかの方法によって、前記酵素の活性を検出するステップ。
ステップ ）：ステップ (f)により検出された酵素の活性と、ステップ (e)で用いた酵素 を検体としてステップ (f)と同一の方法によって検出される酵素の活性とを比較して、 下記の酵素群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる試験物質を選 択するステップ。
(酵素群） ND、 ST、 NDST
[0119] 本発明スクリーニング方法は、本発明 ND検出方法、本発明 ST検出方法又は本発 明 NDST検出方法を、 ND、 ST又は NDSTの活性を変化させる物質のスクリーニン グ方法に応用したものである。
[0120] ステップ (e)は、これらの酵素の活性を変化させる可能性がある試験物質を、当該 酵素と共存させるステップである。この「共存」の様式は、当該可能性がある試験物質 の分子と、当該酵素の分子とが接触する状態にある限りにおいて特に限定されない 。試験物質をどの酵素と共存させるかは、スクリーニングの目的に応じて当業者が適 宜選択することができる。例えば、 ND活性を変化させる物質のスクリーニングを行う 場合には当該活性を変化させる可能性がある物質を NDと共存させればよぐ ST活 性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には当該活性を変化させる可能性が ある物質を STと共存させればよぐ NDST活性を変化させる物質のスクリーニングを 行う場合には当該活性を変化させる可能性がある物質を NDSTと共存させればよい
[0121] ここで、試験物質と共存させる ND、 ST又は NDSTは、いずれも、例えばアイカヮ、 J (Aikawa, J.)ら、 2001年、ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第 276卷、第 8号、 p. 5876— 5882に記載の方法で製造す ることができる。試験物質と共存させる ND、 ST又は NDSTの種類や由来等は、目的 に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、ヒト由来の NDSTを用いる場 合には、その目的に応じて NDST1、 NDST2、 NDST3、 NDST4等の中力 用い る酵素を適宜選択することができる。またこれらの酵素も、公知の方法 (例えば、 Geno mics, 26(2), p239- 244 (1995)、 Biochem. J" 332 (pt2), p303- 307 (1998)、 J. Biol. Che m" 274(5), p2690-2695 (1999)、 J. Biol. Chem., 276(8), p5876- 5882 (2001)等参照) で製造することができる。また置換、欠失、挿入、転位等の変異が導入された酵素や 、他のペプチド等と融合させた酵素等を用いてもよい。
[0122] なお、酵素として ST又は NDSTを選択する場合には、さらに硫酸基受容体も共存 させることになる。硫酸基受容体の説明は、前記の本発明 ST検出方法における説明 と同じである。
[0123] ステップ (f)は、ステップお）により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」 を検体として、本発明 ND検出方法、本発明 ST検出方法及び本発明 NDST検出方 法のいずれかの方法によって、前記酵素の活性を検出するステップである。どの検 出方法を採用するかは、スクリーニングの目的に応じて当業者が適宜選択することが できる。例えば、 ND活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には本発明 N D検出方法を、 ST活性を変化させる物質のスクリ一ユングを行う場合には本発明 ST 検出方法を、 NDST活性を変化させる物質のスクリーニングを行う場合には本発明 NDST方法をそれぞれ採用すればよい。これにより、前記試験物質の存在下におけ る前記酵素の活性を検出することができる。
[0124] ステップ (g)は、ステップ (f)により検出された酵素の活性 (試験物質の共存下にお ける酵素の活性）と、ステップ (e)で用いた酵素を検体としてステップ (f)と同一の方法 によって検出される酵素の活性 (試験物質の非共存下における酵素の活性)とを比 較して、前記の酵素群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる試験 物質を選択するステップである。「ステップ (f)により検出された酵素の活性 (試験物 質の共存下における酵素の活性)」と「ステップ (e)で用いた酵素を検体としてステツ プ (f)と同一の方法によって検出される酵素の活性 (試験物質の非共存下における 酵素の活性)」との間に差が見出された場合には、当該試験物質は前記酵素の活性 を変化させる物質であるとして選択することができる。
[0125] 例えば、試験物質の共存下における酵素の活性が、試験物質の非共存下におけ る酵素の活性よりも高い場合には、当該物質は酵素活性の促進物質であるとして選 択することができる。また試験物質の共存下における酵素の活性が、試験物質の非 共存下における酵素の活性よりも低い場合には、当該物質は酵素活性の阻害物質 であるとして選択することができる。両者間に差がない場合には、当該物質は酵素活 性に対して影響を及ぼさない物質として同定することができる。
[0126] また、試験物質の共存下における酵素の活性と、試験物質の非共存下における酵 素の活性との間に差が見いだされた場合には、その差の程度を定量的に調べること により、酵素活性の促進物質又は阻害物質としての能力の指標としてもよい。
実施例
[0127] 以下、本発明を実施例により具体的に詳説するが、本発明はこれら何ら限定される ものではない。
なお本実施例にぉ 、て使用した NDSTは、以下の通り調製した。
[0128] Biochem. J., 332 (pt2), p303- 307 (1998)に記載の方法でヒト由来の NDST2をクロ 一ユングした。クロー-ングされた NDST2をコードする DNAは配列番号 1に記載の 塩基配列を有し、配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質 (NDST2)をコ ードしている。
[0129] この塩基配列力 N末端側の膜貫通領域をコードする部分を除去し、配列番号 2に おけるアミノ酸番号 79〜883で示されるアミノ酸配列力もなる蛋白質 (膜貫通領域が 除去された NDST2)を発現させるために、以下の操作を行った。
[0130] (1) 25 1の反応系で、バキュロウィルスの gp67シグナルペプチドをコードする配列 を保持するベクター DNA、 pAcSecG2T (Pharmingen社、 U.S.A.) 250ngを铸型にして 5'
(配列番号 3)の配列を有する短鎖 DNA5pmolと 5'- CACGGGTTCAGTTCGAGCTG TCTCCGCAAAGGCAGAATGCGCCGC-3' (配列番号 4)の配列を有する短鎖 DNA 5pmol、 Pyrobest (Takara社、 日本） 1.25unitsを用いた PCRを、 20mM Tris- HCl (pH8.3 ) , 10mM KC1、 6mM(NH )SO
4 4、 2mM MgSO
4、 0.1%Triton X— 100、 0.001 %BSA, 200
/z M dNTPの存在下、サーマルサイクラ一を用いて、 95°C2分を 1サイクル、 95°C30秒 52.5°C30秒 72°C1分を 10サイクル、 72°C10分を 1サイクル行わせ、ロブスター L21 配列（AACTCCTAAAAAACCGCCACC) (配列番号 5)と gp67シグナルペプチド（39 アミノ酸)をコードする DNAの特異的増幅を行った。
[0131] (2) 25 μ 1の反応系で、ベクター中にヒト NDST2を保持するプラスミド DNA pCRhNDS T2#5 250ngを铸型にして 5'- GAGACAGCTCGAACTGAACCCGTGG- 3' (配列番号 6)の配列を有する短鎖 DNA 5pmolと 5'- CTGGTATGGCGGCCGCAATTGTCAGC CCAGACTGGAATGCTGCAGTTC-3' (配列番号 7)の配列を有する短鎖 DNA 5pm ol、 Pyrobest (Takara社、 日本） 1.25unitsを用いた PCRを、 20mM Tris- HCl (pH8.3)、 1 OmM KCl,6mM(NH )SO、 2mM MgSO、 0.1%Triton X- 100、 0.001 %BSA, 200 μ M
4 4 4
dNTPの存在下、サーマルサイクラ一を用いて、 95°C2分を 1サイクル、 95°C30秒 52 .5°C30秒 72°C5分を 20サイクル、 72°C10分を 1サイクル行わせ、ヒト NDST2の 805ァ ミノ酸 (配列番号 2におけるアミノ酸番号 79〜883)をコードする DNAの特異的増幅を 行った。
[0132] (3) 25 μ 1の反応系で、上記（1)で得られた反応液 2 μ 1と上記（2)で得られた反応 液 0.5 μ 1中の DNAを铸型にして、 5'- GATCGGATCCAACTCCTAAAAAACCGCCA C-3' (配列番号 8)の配列を有する短鎖 DNA5pmolと 5'- CTGGTATGGCGGCCGCA ATTGTCAGCCCAGACTGGAATGCTGCAGTTC-3' (配列番号 7)の配列を有する 短鎖 DNA5pmol、 Pyrobest (Takara社、 日本） 1.25unitsを用いた PCRを 20mM Tris- H Cl (pH8.3)、 10mM KC1、 6mM(NH )SO、 2mM MgSO、 0.1 %Triton X— 100
4 4 4 、 0.001 %
BSA、 200 μ M dNTP存在下、サーマルサイクラ一を用いて、 95°C2分を 1サイクル、 95 °C30秒 52.5°C30秒 72°C6分を 30サイクル、 72°C10分を 1サイクル行わせ、口ブス ター L21配列、 gp67シグナルペプチド（39アミノ酸）とヒト NDST2の 805アミノ酸（配列番 号 2におけるアミノ酸番号 79〜883)をコードする融合 DNAの特異的増幅を行った。
[0133] (4)前記（3)で得られた融合 DNAを含む反応液 10 μ 1及びベクター DNA、 pFastBac -1 (Invitrogen社、 U.S.A.) 1 μ gに、制限酵素 BamHIと Notlを lOunitsずつ加え、 37°C で 2時間反応させた。反応産物を TAEァガロース電気泳動に付し、 目的の大きさの D NA断片を Geneclean II kitを用いて精製し、 TE緩衝液 10 1中に回収した。得られた DNA1 μ 1ずつを、 DNA Ligation Kit ver.2 (Takara社、 日本）を用いた 4°C、 20時間、 1 0 μ 1の反応系で、 BamHIと Notlで同時に消化した pFastBac-1に、 BamHIと Notlで同時 に消化したロブスター L21配列、 gp67シグナルペプチド（39アミノ酸）及びヒト NDST2 8 05アミノ酸 (配列番号 2におけるアミノ酸番号 79〜883)をコードする融合 DN Aをライ ゲーシヨンした。反応液 2 1を用いて、常法により大腸菌 DH5 aコンビテントセル (Invi trogen社、 U.S.A.) 40 μ 1を形質転換し、 50 μ g/mlアンピシリンを含む 1.5%寒天含有 L B培地上で、形質転換体のコロニーを選択した。得られた大腸菌のコロニーから、大 腸菌が保持するプラスミド DNAを、 10mM Tris- HCl (pH8.5) 100 μ 1に回収した。ベクタ 一 DNAに挿入された DNA断片の塩基配列の解析を、常法によってヒト NDST2に特異 的な短鎖 DNAを用いて行った。
[0134] その結果、ロブスター L21配列、 gp67シグナルペプチド（39アミノ酸)及びヒト NDST2 805アミノ酸（配列番号 2におけるアミノ酸番号 79〜883)をコードする融合 DNAを Ba mHI及び Notlで消化した断片 2577bpと、 BamHI及び Notlで消化した pFastBac-Ιとの ライゲーシヨン産物で形質転換した大腸菌 128クローンより、 目的の DNA断片を保持 すると考えられる 2クローン（pFBl- GP67hNDST2SOL(79E)#5及び pFBl- GP67hNDST 2SOL(79E)#123)を同定した。 DNAの塩基配列解析を行い、前記 2クローンが予想さ れる DNAの塩基配列と完全に一致することを確認した。
[0135] (5)前記（4)で得られた DNAを大腸菌 DH10BAC (Invitrogen社、 U.S.A.)に導入し、 Invitrogen社のプロトコールに従い、 50 μ g/mlカナマイシン、 7 μ g/mlゲンタマイシン、 10 g/mlテトラサイクリンを含む 1.5%寒天含有 LB培地上で、形質転換体のコロニー を選択した。
[0136] 得られた大腸菌のコロニーを 50 μ g/mlカナマイシンを含有する Terific-Broth培地（ Beckton Dickinson社、 U.S.A.) 1.5mlに接種し、 37°C20時間の振盪培養を行った。得 られた培養液を容量 1.5mlのエツペンドルフチューブに移した後、冷却遠心機を用い て、 4°Cにて 8000回転で、 2分間遠心して大腸菌菌体を沈澱として回収した。この菌 体を 10mM EDTA、 100 μ g/ml RNaseAを含有する 50mM Tris- HCl (pH8.0) 150 μ 1に 懸濁したのち、 l% (w/v) SDSを含む 200mM NaOH 150 1を加え、緩やかに混和し 室温で 5分間静置した。次に、 3.0M酢酸カリウム (pH5.5) 150 1をカ卩え、良く混和し た後、冷却遠心機を用いて、 4°Cにて 15000回転で、 10分間遠心して上清画分を回 収した。上清 450 μ 1にあらかじめ ΤΕ緩衝液で飽和されているフエノール（Invitrogen社 、 U.S.A.) 450 1をカ卩えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機 を用いて、 4°Cにて、 15000回転で、 5分間遠心して上層画分を回収した。上層画分 4 00 1にエタノール lmlを加えて混和した後、室温で 10分間静置した。その後、冷却 遠心機を用いて、 4°Cにて、 15000回転で、 5分間遠心して上清を除去した後、沈澱 に 70% (v/v)エタノール lmlを加え混和した後、冷却遠心機を用いて、 4°Cにて 15000 回転で、 5分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、 10mM EDTA、 100 ^ g/ml R NaseAを含む 50mM Tris- HCl (pH8.0) 150 μ 1を加え、懸濁したのち、 37°Cで 20分間 反応させた。次に、あらかじめ TE緩衝液で飽和されているフエノール（Invitrogen社、 U.S.A.) 100 1をカ卩えて、ボルテックスミキサーにより激しく混和した後、冷却遠心機を 用いて、 4°Cにて 15000回転で、 5分間遠心して上層画分を回収した。上層画分 100 μ 1にエタノール 250 1と 3Μ酢酸ナトリウム 10 1を加え混和した後、冷却遠心機を用 いて、 4°Cにて、 15000回転で、 5分間遠心して上清を除去した。次に、沈澱に 70% (V /v)エタノール lmlをカ卩ぇ混和した後、冷却遠心機を用いて、 4°Cにて 15000回転で、 5分間遠心して上清を除去した。残った沈澱に、 TE緩衝液 100 1を加え、懸濁した。 [0137] その結果、前記（4)で得られた DNA pFBl-GP67hNDST2SOL(79E)#123を大腸菌 D H10BACに導入し、薬剤耐性及び PCR法を指標に目的のクローン (pFBl- GP67hNDS T2SOL(79E)#123- 4)を得た。
[0138] (6)まず、ョトウガ S19細胞 100万個を SF-900II無血清培地（Invitrogen社、 U.S.A.) 2 mlに懸濁した後、 6ゥエルのプレートに移し、 28°Cで 1時間静置し、細胞をプレートに 接着させた。次に、前記（5)で得られた DNA (バキュロウィルスゲノム DNAに組み込ま れたロブスター L21配列、 gp67シグナルペプチド及びヒト NDST2 805アミノ酸） 10 gを Sf- 900II無血清培地 200 μ 1に希釈したものと、 cellfectin dnvitrogen社、 U.S.A.) 6 1を Sf-900II無血清培地 200 /z lに希釈したものとを混和し、室温で 30分間静置した。あら 力じめプレートに接着させた S19細胞を Sf-900II無血清培地 2mlで洗浄した後、 DNAと cellfectinの混和液 200 μ 1に Sf-90011無血清培地 800 μ 1を混ぜたものをカ卩えた。 28°C で 5時間静置した後、培地を吸引除去して、新しい Sf-900II無血清培地 2mlを加えて 、さらに 28°Cで 3日間培養したのち、培養上清を回収し、バキュロウィルスのストック液 とした。
[0139] (7) 1000万個の Sf21細胞を SF-900II (血清含有培地） 10mlに懸濁した後、 T-75フラ スコにまき、 1時間静置した。培地 2mlを残して吸引除去し、前記（6)で得られたバキ ュロウィルスのストック液 lmlを添カ卩し 1時間ゆるやかに震盪させることによってウィル スストック液を Sf21 (血清含有培地）に感染させた。その後、 SF-900IK血清含有培地）
8mlをカ卩え、 28°Cで 3日間培養した。
[0140] (8)回収した培地を遠心して、細胞を除!、た画分を培養上清とした。培養上清をァ ミコン Ultra- 15 30000MWCO (Millipore社、 U.S.A.)〖こ力 4ナ、冷却遠心機を用いた遠 心により分子量 3万以上の画分を回収し、濃縮培養上清とした。
[0141] これによつて得られた NDST2 (配列番号 2におけるアミノ酸番号 79〜883で示され るアミノ酸配列力 なる蛋白質 (膜貫通領域が除去された NDST2) )を含有する溶液 を、以下「NDST酵素液」という。
[0142] (実施例 1) 本発明多糖の製造
(l) NAHの製造
NAHは、大腸菌 K5を用いて特開 2004— 18840号に記載されている方法に従つ て製造した。製造された NAHの特徴を以下に示す。
•ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した重量平均分子量 (Mw)： 44,710 •ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した数平均分子量 (Mn)： 36,714
•分子量分散度 (Mw/Mn) : 1.212
•臭化工チジゥム（EtBr)比色定量法により測定した核酸含量: 0.09%
•ローリー法 (J. Biol. Chem. 193, 265(1951))により測定した蛋白質含量： 2.38%
2,4,6-トリ-トロベンゼンスルホン酸（2,4,6- trinitrobenzene sulfonic acid ; 2,4,
6- TNBS)法（Biochemica et Biophysica Acta., 141, 358(1967))によって測定した遊離 ァミンのモノレ数： 0.026 μ M/mg
[0143] ここで、ゲルろ過クロマトグラフィーは、 Arai, M.らの方法（Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992)に従って行った。分子量が既知のコンドロイチン硫酸ナトリウム（ 重量平均分子量 39, 100、 18,000、 8,050 ;いずれも生化学工業株式会社製）およびヒ アルロン酸ナトリウム (重量平均分子量 104,000；生化学工業株式会社製)を標準品と して、高速液体クロマトグラフィーを用いたゲルろ過クロマトグラフィーでのそれらの溶 出時間をデータ解析ソフトウェア（GPC-8020 東ソー株式会社)で解析することによ つて得られる式に、試料の溶出時間を当てはめることにより重量平均分子量及び数 平均分子量を決定した。カラムは、 TSK gel G4000PWXL, G3000PWXL及び G2500P WXL (各 φ 7.8 X 300mm,東ソー株式会社）を連結したものを用いた。溶媒として 0.2m ol/L塩ィ匕ナトリウム溶液を用い、流速は 0.6ml/分とし、検出器は示差屈折率検出器（ RI-8020,東ソー株式会社)を用いた。
[0144] (2)蛋白質 (BSA)が NAHの還元末端に共有結合 (SS結合)した本発明多糖の製 造
(2—l)チォプロピォ-ルNAH (以下、「SH— NAH」という。）の調製
実施例 1で調製した NAHを 50mg秤量し、 2mlの 2M塩化アンモ-ゥム水溶液に溶 解した。この溶液に 25mgのシァノ水素化ホウ素ナトリウムを添カ卩し、 70°Cで 2日間、 還元アミノ化反応を行った。この反応後の溶液に、 13mgのシァノ水素化ホウ素ナトリ ゥムを添加して、さらに 2日間同一の条件で反応させた。氷浴中で冷却した後、 400 1の酢酸を添加することによって反応を完全に停止させた。 [0145] 生成した還元アミノ化 NAH (以下、「RA— NAH」と!、う。）を 2倍量のエタノールを 用いた溶媒沈殿法で回収した。回収した沈殿をエタノールで洗浄した後、凍結乾燥 した。これにより、 39. 5mgの RA— NAH凍結乾燥品を得た。
[0146] 得られた RA— NAHを 10. 4mg秤量し、 2mlの 0. 1M塩化ナトリウム— 0. 1Mリン酸 緩衝液 (PH7. 5)に溶解した。この溶液に 80 1の 5mM SPDP (SIGMA社）（エタノ ール溶液)を添加して、室温で 30分間、 PDP化反応を行った。その後、過剰の SPD Pを除くために、この反応液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥した。これ により、 9. 5mgの 2—ピリジルジスルフイドプロピオ-ル化 NAH (以下、「PDP— NA H」という。）凍結乾燥品を得た。
[0147] 得られた PDP— NAHを 9. 5mg秤量し、 1mlの 0. 1M塩化ナトリウム— 0. 1M酢 酸ナトリウム緩衝液 (PH4. 5)に溶解した。この溶液に終濃度が 25mMとなるようにジ チオスレィトールを添カ卩して、室温で 60分間、還元反応を行った。
[0148] 生成した SH— NAHを 2倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法で回収した。回収し た沈殿をエタノール洗浄した後、凍結乾燥した。 8. 3mgの SH— NAH凍結乾燥物 を得た。
[0149] (2— 2) 2—ピリジルジスルフイドプロピオ-ル化 BSA (以下、「PDP— BSA」という） の調製
BSA(100mg、 SIGMA社）を終濃度 2. 5mgZmlになるように 0. 1M塩化ナトリウム —0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 5)に溶解した。この溶液に終濃度が 238 Mになるよ うに 5mM SPDP (エタノール溶液）を添カ卩した後、室温で 30分間、 PDP化反応を行 つた。過剰の SPDPを除くために、この反応液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍 結乾燥した。これにより、 104. 2mgの 2—ピリジルジスルフイドプロピオ-ル化 BSA( 以下、「PDP— BSA」という。）凍結乾燥品を得た。
[0150] (2- 3)共有結合 (SS結合)の形成 (本発明多糖の調製）
前記において調製した SH—NAH (1. 5mg)と PDP— BSA(0. 75mg)とを、 1mlの 0. 1M塩ィ匕ナトリウム— 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH7. 5)に溶解し、室温で 2時間、コ ンジユゲーシヨン反応を行った。反応により生成するピリジルー 2—チオンを除くため 、反応後の溶液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥した。これにより、蛋白 質 (BSA)が NAHの還元末端に共有結合 (SS結合)して 、る本発明多糖 (以下、「N AH— SS— BSA」という）を 1. 9mg得た。
[0151] (3)ピオチンが NAHの還元末端に結合した本発明多糖の製造
前記で得られたRA—NAH (10mg)を0. 5mlの 0. 1M炭酸水素ナトリウム溶液に溶 解し、次いで 3mgの sulfo- NHS- LC -ピオチン（ピアス社製）を添カ卩して、 4°Cでー晚ィ ンキュペートした。その後蒸留水に対して一晩透析した後、透析内液を凍結乾燥して 、ピオチンが NAHの還元末端に結合している本発明多糖 (以下、「NAH—ピオチン 」という）を得た (8mg)。
[0152] (実施例 2) 本発明固相（NAH— SS— BSAが固着された固相）の製造
実施例 1で製造した NAH— SS— BSAを、 PBS (—）で: L gZmLに希釈した。こ の希釈後の溶液を、マキシソープ（登録商標） 96ウェルマイク口プレート（NALGE NU NC社製）の各ゥエルに 100 μ Lずつ添カ卩して、 4°Cで 14〜18時間静置することによ つてゥエルの表面上に均一にコーティングした。
[0153] このプレートを PBS (—）で 2回洗浄した後、ブロッキング物質として ApplieDuo (商品 名；生化学工業株式会社製)を 5倍希釈した溶液を、また防腐剤として 0. 05%プロク リン (登録商標） 300 (SUPELCO社製)を含有するリン酸緩衝液 (上記 PBS (一）のうち 、塩化ナトリウム、塩化カリウムを含有しないもの。 pH7.2〜7.5 ;以下「PB」という。）を それぞれ添加し、常温で 2時間静置した。
[0154] 静置後、ブロッキング物質を十分に除去し、 37°Cで 2時間乾燥させることによって、 N AH— SS— BSAがゥエルに固着されたプレートを得た。プレートは乾燥剤とともにァ ルミラミネート袋に封入して、冷蔵保存した。
[0155] (実施例 3) 蛋白質 (BSA)力 NAHのカルボキシル基に共有結合 (アミド結合)して いる本発明多糖の製造
実施例 1で調製した NAHを含有する溶液、及び BS A (Serologicals Proteins社製） を含有する溶液を、それぞれ、濃度 10mg/mlとなるように 0. 1M MES緩衝液 (pH 5. 5)を溶媒として調製した。また、 EDC (PIERCE社製）の lOOmgZml溶液を、 0. 1M MES緩衝液 (pH5. 5)を溶媒として調製した。
[0156] 前記の NAH溶液 (300 μ 1)及び BSA溶液（150 μ 1)を混合した。混合液に 4 μ 1の Ε DC溶液を添カ卩した後、室温で 20時間、コンジユゲーシヨン反応を行った。
反応後の溶液を蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥した。これにより、蛋白質 (BSA)力 NAHのへキスロン酸残基に保持されているカルボキシル基に共有結合（ アミド結合)して 、る本発明多糖 (以下、「NAH - COOH - BSAJという）凍結乾燥 物を 3. 5mg得た。
[0157] (実施例 4) 本発明固相（NAH— COOH— BSAが固着された固相）の製造
実施例 2における「NAH -SS- BSA」の代わりに「NAH - COOH - BS A」を用 V、て、実施例 2と同様に NAH - COOH - BSAがゥエルに固着されたプレートを得 た。プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入して、冷蔵保存した。
[0158] (実施例 5) ND活性の測定
実施例 2および 4で調製したプレートを、 0. 05%ポリオキシエチレン (20)ソルビタン モノラウレート (ICI社の商標 Tween20に相当する製品；和光純薬工業株式会社製） を含有する PBS (―) (以下、「洗浄液」という） 300 Lで 3回洗浄した。
その後、 0. 05M MES、 10mM MnCl及び 1% Triton X— 100を含有する溶液（
2
以下、「酵素反応液 1」という） (pH6. 5)を用いて、 NDST酵素液を 10倍から 5120 倍に倍々で希釈した溶液を各ゥエルに 50 Lずつ添カ卩し、 37°Cで 60分間静置して 酵素反応させた。
[0159] 酵素反応終了後、ゥエルを洗浄液で 3回洗浄した。その後、 ApplieDuo (商品名；生 化学工業株式会社製)を 20倍希釈した溶液及び 0. 05%プロクリン 300とを含有す る PBS (―) (以下、「反応液」という）で 1 g/mLに調製したモノクローナル抗体 JM40 3 (生化学工業株式会社)の溶液を、各ゥエルに 100 Lずつ添加した。その後、プレ ートを常温（15〜25°C)で 60分間静置して抗原抗体反応させた。反応液のみを含有 するゥエルをブランクとした。
[0160] 反応後、ゥエルを洗浄液で 3回洗浄し、反応液で 20000倍に希釈した HRP標識ャ ギ抗マウス免疫グロブリン G + M抗体 (JACKSON社製）の溶液を各ゥエルに 100 μ L ずつ添加した。その後、プレートを常温で 60分間静置して抗原抗体反応させた。
[0161] 反応後、このプレートを洗浄液で 3回洗浄し、ペルォキシダーゼの基質として ΤΜΒ 溶液 (BIOFX社製)を各ゥエルに 100 Lずつ添加し、常温で 30分間反応させ、発色 させた。その後、反応停止液 (BIOFX社製)を各ゥエルに 100 /z Lずつ添加して反応 を停止させた後、波長 450應 (対照波長 630應）における TMB分解物の吸光度を ゥエルリーダー SK603 (登録商標；生化学工業株式会社販売)で測定した。
[0162] モノクローナル抗体 JM403は、 NAH分子における GlcN残基（すなわち、脱 N—ァ セチルイ匕された GlcNAc残基)部分を認識する。 ND活性が高ければ、その分、固相 化された本発明多糖における脱 N ァセチルイ匕部位が増加することから、この脱 N ァセチルイ匕された部分をモノクローナル抗体 JM403で検知することにより、脱 N— ァセチルイ匕の程度 (ND活性)を検知することができる。したがって本実施例では、モ ノクローナル抗体 JM403の反応性を ND活性として表すこととした。
[0163] この ND活性は、測定された吸光度から、ブランクにおける吸光度を差し引いた値と して算出した。 NAH— SS— BSAがゥェルに固着されたプレートを用ぃた結果を図1 に、 NAH COOH BSAがゥエルに固着されたプレートを用 、た結果を図 2にそ れぞれ示す。
[0164] 図 1及び図 2から、いずれも NDSTの用量依存的な（NDST酵素液の希釈率に反 比例した) ND活性が観察された。また、 NAHの還元末端に BSAを結合した NAH — SS— BSAを固相化したプレートでは 1280倍希釈した酵素液でも ND活性を確認 することができ（図 1)、 NAH— COOH— BSAを固相化したプレート（図 2、 320倍希 釈率で ND活性を確認）に比して、 ND活性を高感度に測定できることが示された。
[0165] (実施例 6) ND活性の反応時間の依存性
実施例 2で調製したプレート（NAH— SS— BSA固相化プレート）を 300 Lの洗 浄液で 3回洗浄した後、酵素反応液 1を用いて 160倍に希釈した NDST酵素液を各 ウエノレに 50 Lずつ添カロした。その後 37°Cで 0、 10、 20、 30、 40又 ίま 60分 [¾静置 して酵素反応させた。
[0166] 反応終了後、ゥエルを洗浄液で 3回洗浄し、反応液で 1 μ g/mLに調製したモノクロ ーナル抗体 JM403 (生化学工業株式会社)の溶液を各ゥエルに 100 μ Lずつ添加し た。その後、プレートを常温（15〜25°C)で 60分間静置して抗原抗体反応させた。 反応液のみを含有するゥエルをブランクとした。
[0167] なお、酵素反応液 1における pHを 8. 0に調製したもの、又は、 NDST酵素液に代 えて予め 1分間煮沸した NDST酵素液を用いたものにっ ヽても同様に実験した。
[0168] 以後は、実施例 5と同じ方法で HRP標識ャギ抗マウス免疫グロブリン G + M抗体を 反応させ、次いで TMB溶液で発色させ、次いで吸光度を測定して、 ND活性を算出 した。結果を図 3に示す。なお図 3中の黒菱形印は酵素反応液 1として pH6. 5のもの を用いた実験、黒正方形印は酵素反応液 1として pH8. 0のものを用いた実験、白三 角印は予め 1分間煮沸した NDST酵素液を用いた実験のデータをそれぞれ示す。
[0169] 図 3から、 pH6. 5及び pH8. 0の酵素反応液 1を用いた場合、いずれも時間依存 的に ND活性が認められた。また pH6. 5の酵素反応液 1は、 pH8. 0の酵素反応液 1を用いた場合よりもさらに反応性が高力つた。なお、 1分間煮沸した NDST酵素液 では ND活性が失活することが確認された。このことから、 ND活性を測定する際の酵 素反応時の溶液の pHは 6〜7とすることが好ましいことが示された。
[0170] (実施例 7) ST活性の測定
実施例 2で調製したプレート（NAH— SS— BSA固相化プレート）を 300 Lの洗 浄液で 3回洗浄した。
[0171] その後、 50mM HEPES、 1% TritonX— 100、 ImM MnCl、 lOmM MgCl
2 2 及び 0. ImM PAPSを含有する pH7. 4の溶液 (以下、「酵素反応液 2」という）を用 いて、 NDST酵素液を 2倍から 128倍に倍々希釈した溶液を各ゥ ルに 50 Lずつ 添加し、 37°Cで 30分間静置して酵素反応させた。
[0172] 酵素反応終了後、ゥエルを洗浄液で 3回洗浄した。その後、反応液で 1 μ g/mLに調 製したモノクローナル抗体 F58— 10E4 (生化学工業株式会社)の溶液を、各ゥエル に 100 Lずつ添カロした。
[0173] その後、プレートを常温（15〜25°C)で 60分間静置して抗原抗体反応させた。反 応液のみを含有するゥヱルをブランクとした。
[0174] なお、 PAPSを含有しない酵素反応液 2を用いたものについても同様に実験した。
以後は、実施例 5と同じ方法で HRP標識ャギ抗マウス免疫グロブリン G + M抗体を 反応させ、次いで TMB溶液で発色させ、次いで吸光度を測定して、 ST活性を算出 した。結果を図 4に示す。
[0175] 図 4から、 NDSTの用量依存的な (NDST酵素液の希釈率に反比例した） ST活性 が観察された。また PAPSの非存在下では、 ST活性は検知できず、この酵素反応は PAPS依存性の酵素反応であることも確認された。
[0176] (実施例 8) ST活性の反応時間の依存性
実施例 2で調製したプレート（NAH— SS— BSA固相化プレート）を 300 Lの洗 浄液で 3回洗浄した後、酵素反応液 2を用いて 8倍に希釈した NDST酵素液を各ゥ ェノレに 50 Lずつ添カロした。その後 37°Cで 0、 10、 20、 30、 40又 ίま 60分 [¾静置し て酵素反応させた。
[0177] 反応終了後、ゥエルを洗浄液で 3回洗浄し、反応液で 1 μ g/mLに調製したモノクロ ーナル抗体 F58— 10E4 (生化学工業株式会社)の溶液を各ゥエルに 100 μ Lずつ 添加した。その後、プレートを常温（15〜25°C)で 60分間静置して抗原抗体反応さ せた。反応液のみを含有するゥエルをブランクとした。
[0178] なお、 NDST酵素液に代えて予め 1分間煮沸した NDST酵素液を用いたものにつ いても同様に実験した。
[0179] 以後は、実施例 5と同じ方法で HRP標識ャギ抗マウス免疫グロブリン G + M抗体を 反応させ、次いで TMB溶液で発色させ、次いで吸光度を測定して、 ST活性を算出 した。結果を図 5に示す。なお図 5中の黒菱形印は煮沸処理していない NDST酵素 液を用いた実験、黒正方形印は予め 1分間煮沸した NDST酵素液を用いた実験の データをそれぞれ示す。
[0180] 図 5から、反応時間依存的な ST活性が認められた。なお、 1分間煮沸したものでは 酵素蛋白質の熱変性により ST活性が失活することが確認された。
[0181] また、実施例 7は直接的には ST活性を検出しているものである力 NDSTが、脱 N ァセチルイ匕を弓 Iき起こした後に N 硫酸ィ匕を引き起こす酵素であることを考慮すれ ば、 ST活性が検知されたということは、その前提として脱 N ァセチル化が引き起こ されたことを意味しているといえる。したがって、この方法による ST活性の検出は、 N D活性をも含めた NDST活性の検出をも同時に行うことができるものである。
[0182] また、本発明 ND検出方法によって検体中の ND活性を検出し、更に、本発明 ST 検出方法によって検体中の ST活性を検出することにより、より確実に NDST活性の 検出を行うこともできる。 [0183] (実施例 9) 本発明固相（NAH—ピオチンが、アビジンを介してプレートに固着され た固相）の製造
ストレプトアビジン (JACKSON社製）を、 PBS (―)で 20 /z g/mLに希釈した。この 希釈後の溶液を、マキシソープ（登録商標） 96ウェルマイク口プレート（NALGE NUN C社製）の各ゥエルに 50 μ Lずつ添カ卩して、 4°Cで 14〜18時間静置することによって ゥエルの表面上に均一にコ一ティングした。
[0184] このプレートを PBS (—）で 2回洗浄した後、ブロッキング物質として ApplieDuo (商品 名；生化学工業株式会社製)を 5倍希釈した溶液を、また防腐剤として 0. 05%プロク リン (登録商標） 300 (SUPELCO社製)を含有する PBをそれぞれ添加し、常温で 2時 間静置した。
[0185] 静置後、ブロッキング物質を十分に除去し、 37°Cで 2時間乾燥させることによって、 ストレプトアビジンがゥエルに固着されたプレートを得た (ストレプトアビジン固相化プ レート)。
[0186] このストレプトアビジン固相化プレートを 0. 05%ポリオキシエチレン (20)ソルビタン モノラウレート (ICI社の商標、 Tween20に相当する製品；和光純薬工業株式会社製） を含有する TBS (以下、「T— TBS」という） 300 /z Lで 3回洗浄した。その後、実施例 1で製造した NAH—ピオチンを ApplieDuo (商品名；生化学工業株式会社製)を 20 倍希釈した溶液及び 0. 05%プロクリン 300とを含有する TBSで 1 μ g/mLに希釈し、 各ゥエルに 100 Lずつ添カ卩し、 37°Cで 30分間静置して反応させた。
反応後、ゥエルを T—TBSで 3回洗浄して、「NAH—ピオチンがアビジンを介してプ レートに固着された固相」を製造した。
[0187] (実施例 10) ND活性の測定
実施例 9で製造したプレートを用いて、実施例 5と同様に NDST酵素の ND活性を 測定した。なお本実施例においては、陰性対照として、ヒト NDST2 DNAを組み込ん で 、な 、バキュロウィルスのみを感染させて得られた培養上清を前記実施例（8)と同 様に濃縮したものを使用した (mock)。 mockは NDST酵素液と同様に希釈して測定 した。結果を図 6に示す。なお、図 6中の黒丸印は NDST酵素を用いた結果を、白丸 印は mockについての結果をそれぞれ示す。 [0188] 図 6から、 NDSTの用量依存的な (NDST酵素液の希釈率に反比例した) ND活性 が観察された。また、本プレートでは 1280倍希釈した酵素液でも ND活性を確認す ることができ、 ND活性を高感度に測定できることが示された。また、 mockとの差を算 出することにより、より正確に ND活性を測定できることが示された。
[0189] (実施例 11) ST活性の測定
実施例 9で製造したプレートを用いて、実施例 7と同様に NDST酵素の ST活性を 測定した。なお本実施例においては、酵素反応液 2、及び酵素反応液 2中の HEPE Sに代えて MESを用いて pH6. 5に調整したものの何れか一方の酵素反応液を用い た。結果を図 7に示す。なお、図 7中の菱形印は酵素反応液 2 (pH7. 4)を用いた結 果を、正方形印は pH6. 5に調整した酵素反応液を用いた結果をそれぞれ示す。
[0190] 図 7から、酵素反応液の pHを 6. 5に調整したものを用いた方力 ST活性をより高感 度に測定できることが示された。このことから、 ST活性を測定する際の酵素反応時の 溶液の pHは 6〜7とすることが好ましいことが示された。
[0191] (実施例 12) 酵素活性 (ND活性）に影響を与える物質のスクリーニング
酵素反応液 1を用いて以下の 6種類の試験物質をそれぞれ 200、 20、 2 /z g/mLに 希釈した。これらを実施例 9で製造した固相（プレート）の各ゥエルに 25 μ Lずつ添加 した後すぐに「酵素反応液 1で 40倍に希釈した NDST酵素液」を各ゥエルに 25 μ L ずつ添加した (各試験物質の最終濃度 100、 10、 1 μ g/m 酵素液の最終希釈倍 率 80倍)。
[0192] (試験物質）（括弧内は、図 8中における略号を示す。 )
•NAH
•ブタ小腸由来 HP (HP)
• N -硫酸化 Z完全脱 O -硫酸化 HP (NSDS-HP)
•鶏冠由来ヒアルロン酸（重量平均分子量 1 OOKDa； HA)
•部分的脱 N—ァセチル化 NAH (PDNAC-NAH)
•ゥシ腎臓由来 HS (HSBK)
[0193] その後 37°Cで 60分間静置して酵素反応させた。なお、試験物質を添加しな 、ゥ ルは酵素反応液 1のみを添加した。 反応終了後、ゥエルを T— TBSで 3回洗浄し、 TBSで 1 μ g/mLに調製したモノクロ一 ナル抗体 JM403 (生化学工業株式会社)の溶液を各ゥエルに 100 μ Lずつ添加した 。その後、プレートを常温（15〜25°C)で 60分間静置して抗原抗体反応させた。 反応後、 T— TBSで 3回洗浄し、 TBSで 20000倍に希釈した HRP標識ャギ抗マウス 免疫グロブリン G + M抗体を各ゥエルに 100 Lずつ添カ卩した。その後、プレートを常 温で 60分間静置して抗原抗体反応させた。
[0194] 反応後、このプレートを T—TBSで 3回洗浄し、 TMB溶液を各ゥエルに 100 μ Lず つ添加し、常温で 30分間反応させ、発色させた。その後、反応停止液を各ゥ ルに 1 00 Lずつ添加して反応を停止させ、実施例 5と同じ方法で吸光度を測定した。 また変化率 (％)は、以下の計算式によって算出した。
変化率（％) = 100χ (各試験物質を添加しない場合における吸光度の値-各試験 物質を各濃度添加した場合における吸光度の値) Ζ各試験物質を添加しな 、場合 における吸光度の値)。
[0195] なお、モノクローナル抗体 JM403は、 ΝΑΗにおける GlcN残基（すなわち、脱 N— ァセチルイ匕された GlcNAc残基）に結合することから、検出された吸光度の値が高い ほど NAHにおける GlcN残基の数が多い（すなわち、脱 N—ァセチル化された GlcN Ac残基の数が多い）、すなわち ND活性が高いことを意味する。逆に、検出された吸 光度の値が低いほど NAHにおける GlcN残基の数が少ない（すなわち、脱 N—ァセ チルイ匕された GlcNAc残基の数が少ない）、すなわち ND活性が低いことを意味する
[0196] そして、もし試験物質が ND活性を阻害するものであれば、上記の変化率（％)は正 の数となる。そしてその変化率の値が高ければ高いほど当該試験物質の NDに対す る阻害能が高いこととなる。結果を図 8に示す。なお図 8中、白色のカラムは試験物質 の最終濃度が 100 g/mLの場合の結果、黒色のカラムは同じく 10 g/mLの場合の 結果、斜線のカラムは同じく: g/mLの結果をそれぞれ示す。
[0197] 図 8力ら、 NAH、 HP、 NSDS— HP及び HSBKは、濃度依存的に ND活性を阻害 する作用を有することが示された。一方、 HA及び PDNAC— NAHは、 ND活性を 阻害する作用をほとんど有していなかった。 [0198] 以上の結果から、 ND活性を阻害する物質 (NDの阻害剤）として NAH、 HP、 NSD
S— HP及び HSBKを選択することができた。
また、 NAH、 HP、 NSDS— HP及び HSBKのなかでも、 ND活性に対する阻害能 が最も高いものとして HSBKを、次いで HP及び NSDS— HPを、最も低いものとして
NAHを選択することができた。
[0199] (実施例 13) ST活性測定用の基質の検討
NAHに代えて HSBKを用い、実施例 1 (3)に記載の方法に従って、ピオチンが H
SBKの還元末端に結合している多糖を調製した。次いで、これを実施例 9に記載の 方法に従ってプレートに固相化した。
[0200] また、実施例 1 (1)に記載の方法を用いて NAHを製造し、これを用いて N—脱ァセ チルイ匕へパロザンを調製し、次いでこれを用いてさまざまなロットの N—硫酸ィ匕へパ ロザンを調製した。
[0201] この N—脱ァセチル化へパロザンは、 NDST2等の酵素反応を用いた方法や化学 反応を用いた方法で調製することができる。化学的なグリコサミノダリカンの脱ァセチ ル化方法として、ヒドラジン分解法（Patrick, N. and Conrad, H. E., Bioche. J., 217, 1 87, (1984))とアルカリ加水分解法（Leali, D. et al" J. Biol.Chem., 276, 37900 (2001) )が知られている力 ここでは後者の方法で調製した。具体的には、 NAHを 2M水酸 化ナトリウム溶液に終濃度が lOmg/mlになるように溶解し、 60°Cで 2から 24時間加熱 した。加熱時間を調整することによって、脱ァセチルイ匕度の異なった N—脱ァセチル 化へパロザンを調製した。
[0202] 次いで、この N—脱ァセチル化へパロザンを上記の Leali, D.らの方法に従って N— 硫酸化することにより、さまざまなロットの N—硫酸ィ匕へパロザンを調製した。具体的 には、 NAHの N—脱ァセチル化反応終了液 (N—脱ァセチル化へパロザンを含有 する）を中和した後、炭酸ナトリウムと三酸化ィォゥ 'ピリジン複合体 (PSTC)を終濃 度がそれぞれ 15mMと 10mMになるように添カ卩し、 40°Cでインキュベートした。その 後 1時間ごとに 2. 5mM (終濃度)相当の PSTCを添加し、 5時間反応を行った。これ により、 9ロットの N—硫酸ィ匕へパロザンが得られた。これらを被験物質として用いた。
[0203] HSBKが固相化されたプレートに、モノクローナル抗体 F58— 10E4 (終濃度： 1 μ g/ml)と 9ロットの N—硫酸化へパロザン（20 μ g/ゥエル；力ルバゾール法によるゥロン 酸含量をもとに補正した値)を添加して実施例 7に記載の条件で抗原抗体反応させ、 実施例 7に記載の方法で吸光度を測定した。これは、いわゆる阻害法による測定で ある。抗原抗体反応液中の N—硫酸化へパロザンの濃度が 0であれば、モノクローナ ル抗体 F58— 10E4は実質的に全て固相化された HSBKに結合し、検出される吸光 度が高くなる。一方、抗原抗体反応液中に過剰濃度の N—硫酸化へパロザンが存在 すれば、モノクローナル抗体 F58— 10E4は実質的に全て抗原抗体反応液中の N— 硫酸ィ匕へパロザンに結合し（固相化された HSBKには実質的に結合せず）、検出さ れる吸光度が低くなる。
[0204] 抗原抗体反応液中の N—硫酸化へパロザン濃度が 0の場合の吸光度を「阻害率 0 %」、抗原抗体反応液中に N—硫酸化へパロザンが過剰濃度で存在する場合の吸 光度を「阻害率 100%」として、 9ロット分の N—硫酸ィ匕へパロザンについて阻害率を 算出した。結果を表 1に示す。なお、 N—硫酸ィ匕へパロザンに代えて HSBKを用いた 結果も併せて示す。
[0205] なお表 1中の「Mw」及び「Mw/Mn」は、実施例 1 (1)に記載の方法で求めた数値で ある。また、各ロットの N—硫酸化へパロザン分子における「deNAc- 0S」（NAHを構 成する二糖単位 (GlcA-GlcN)において、 N位が脱硫酸ィ匕されておりかつ硫酸基を保 持しないもの）、 「OS」（NAHを構成する二糖単位 (GlcA-GlcN)において、硫酸基を 保持しないもの）、及び「NS」（NAHを構成する二糖単位（GlcA- GlcN)において、 N 位が硫酸ィ匕されているもの）の質量比（％)は、イオン交換クロマトグラフィーによって 求めた。イオン交換クロマトグラフィーの条件等は以下の通りである；
[0206] 硫酸化多糖および低分子化硫酸化多糖の分解酵素 (へパリチナーゼ、へパリチナ ーゼ I及びへパリチナーゼ II (V、ずれも生化学工業株式会社製)の混合物）による消化 を行った後の溶液 50 1を、 HPLC (医理化、モデル 852型）を用いて分析した。強ァ -オン交換体力ラム（ダイォネックス社、 CarboPac PA-1カラム 4.0mm X 250mm)を使 用し、 232 nmでの吸光度を測定した。 4〜12糖スタンダードを基準とし (Yamada, et al. , J.Biol.Chem., 270,8696-8706,(1995))、流速 1 ml/分で、塩化リチウムを用いたグラ ジェント系（50 mM→2.5 M)を用いる方法に準拠した（Kariya, et al., Comp.Biochem. Physiol, 103B,473,(1992)) o
[0207] なお、脱ァセチル化ニ糖（deNAc-OS)の割合が高かったロット 4及び 5の N 硫酸 化へパロザンについては、上記方法に従って再度 N—硫酸ィ匕した。また、ロット 1、 3 及び 4の N 硫酸ィ匕へパロザンについては、以下の方法により NDST酵素液で処理 することで再度 N 硫酸ィ匕した；
[0208] N—硫酸化へパロザンに、 NDST酵素液を 50mM HEPES (pH7. 5)、 1% Trit onX— 100、 ImM MnCl、 lOmM MgCl及び 0. ImM PAPSを含有する溶液で
2 2
10倍希釈した溶液を添加し、 37°Cで 1時間インキュベートする。
[0209] これらの物質についても、同様に阻害率を算出した。 NDST酵素液によって再度 N
—硫酸ィ匕したものを用いた結果を表 1中の「NDST」に、三酸化ィォゥ 'ピリジン複合 体 (PSTC)によって再度硫酸ィ匕したものを用いた結果を表 1中の「再 NS」に、それぞ れ示す。
[0210] [表 1]
Figure imgf000046_0001
HSBK 99
[0211] 表 1のロット 2、 6、 7、 8及び 9の結果から、モノクローナル抗体 F58— 10E4は、平 均重量分子量 20kDa以上で、かつ N 硫酸化構造 (NS)が 45%以上の N 硫酸化へ ノロザンをへパラン硫酸と同等に認識することが示された。また、脱ァセチル化構造 ( deNAc-0S)が 30%を超えた N—硫酸化へパロザンは NSがたとえ 60%以上存在しても 、当該抗体によって認識されないが、 NDSTにより N—硫酸ィ匕されることによって反 応性が向上した（ロット 3の結果)。さらに、 deNAc-0Sが 30%を超えたロット 4の当該抗 体に対する反応性は低力つた力 その反応性は NDSTによる N—硫酸化もしくは、 化学的な再 N 硫酸ィ匕によってへパラン硫酸と同等になった。このことから、本発明 における ST活性を測定する際の基質（固相化させるもの）として用いる N ァセチル 化へパロザン誘導体は、平均重量分子量 20kDa以上で、脱ァセチル化構造が 30% を超えたものが好ましぐさらに脱ァセチルイ匕構造が 35%を超えたものがより好ましい ことが示された。
[0212] (実施例 14) 本発明 ND検出キットの作製
以下の構成力もなる本発明 ND検出キットを作製した。
1.実施例 2で製造した NAH— SS— BSA固相化プレート 1枚
2.モノクローナル抗体 JM403 1本
3. HRP標識ャギ抗マウス免疫グロブリン G + M抗体 1本
4. TMB溶液 1本
5.実施例 5に記載の反応停止液 1本
6.実施例 5に記載の酵素反応液 1 1本
7.実施例 5に記載の洗浄液 1本
8. NDST標準溶液 1セット
[0213] (実施例 15) 本発明 ST検出キットの作製
以下の構成カゝらなる本発明 ST検出キットを作製した。
1.実施例 2で製造した NAH— SS— BSA固相化プレート 1枚
2.モノクローナル抗体 F58— 10E4 1本
3. HRP標識ャギ抗マウス免疫グロブリン G + M抗体 1本
4. TMB溶液 1本
5.実施例 5に記載の反応停止液 1本
6.実施例 7に記載の酵素反応液 2 1本
7.実施例 5に記載の洗浄液 1本
8. NDST標準溶液 1セット
[0214] (実施例 16) 本発明 NDST検出キットの作製
以下の構成カゝらなる本発明 NDST検出キットを作製した。
1.実施例 2で製造した NAH— SS— BSA固相化プレート 1枚
2.モノクローナル抗体 JM403 1本
3.モノクローナル抗体 F58— 10E4 1本 4. HRP標識ャギ抗マウス免疫グロブリン G + M抗体 1本
5. TMB溶液 1本
6.実施例 5に記載の反応停止液 1本
7.実施例 5に記載の酵素反応液 1 1本
8.実施例 7に記載の酵素反応液 2 1本
9.実施例 5に記載の洗浄液 1本
10. NDSTI票準溶液 1セット
[0215] (実施例 17) 本発明 ND検出キットの作製
実施例 14における「実施例 2で製造した NAH— SS— BSA固相化プレート」を「実 施例 9で製造した NAH—ピオチンがアビジンを介して固着されたプレート」に代えて
、本発明 ND検出キットを作製した。
[0216] (実施例 18) 本発明 ST検出キットの作製
実施例 15における「実施例 2で製造した NAH -SS - BS A固相化プレート」を「実 施例 9で製造した NAH—ピオチンがアビジンを介して固着されたプレート」に代えて
、本発明 ST検出キットを作製した。
[0217] (実施例 19) 本発明 NDST検出キットの作製
実施例 16における「実施例 2で製造した NAH -SS - BS A固相化プレート」を「実 施例 9で製造した NAH—ピオチンがアビジンを介して固着されたプレート」に代えて
、本発明 NDST検出キットを作製した。
[0218] (試験例 1) サンドイッチ ELISAを用いた ND活性の測定
(1)サンドイッチ ELISA用プレートの製造
モノクローナル抗体 JM403 (生化学工業株式会社)を、 PBS (―)で 20 μ gZmLに 希釈した。この希釈後の溶液を、マキシソープ (登録商標） 96ウェルマイク口プレート（
NALGE NUNC社製）の各ゥエルに 50 μ Lずつ添カ卩して、 4°Cで 14〜18時間静置す ることによってゥエルの表面上に均一にコーティングした。
[0219] このプレートを PBS (—）で 2回洗浄した後、ブロッキング物質として防腐剤として 0.
05%プロクリン（登録商標） 300 (SUPELCO社製）を含有させた Immunoassaystabilize r (Advanced Biotechnologies社製）をそれぞれ添カ卩し、常温で 2時間静置した。 静置後、ブロッキング物質を十分に除去し、 37°Cで 2時間乾燥させることによって、モ ノクローナル抗体 JM403がゥエルに固着されたプレートを得た。プレートは乾燥剤と ともにアルミラミネート袋に封入して、冷蔵保存した。
[0220] (2)ピオチン標 miM403の製造
モノクローナル抗体 JM403 (生化学工業株式会社)を 0. 1M炭酸緩衝液 (pH8. 5) で一晩透析後、回収し、 0. 1M炭酸緩衝液で lmgZmLの濃度に溶解した LCービ ォチン（pierce社製）を質量比 80： 1 (モノクローナル抗体 JM403： LC -ピオチン）の 割合で、室温、 4時間撹拌反応させた。反応後の溶液を PBS (—）で一晩透析した。 透析後の溶液を回収し、 0. 05%の濃度になるようにアジィ匕ナトリウム (和光純薬社製 )を加え、冷蔵保存した。これによりピオチン標識されたモノクローナル抗体 JM403 ( 以下、「ピオチン標 miM403」 t 、う）を得た。
[0221] (3)サンドイッチ ELISAによる ND活性の測定
0. 05M MES、 10mM MnCl及び 1% Triton X— 100を含有する pH6. 5の溶
2
液を 30 μ NDST酵素原液を 20 μレ ΝΑΗを 1000、 500、 250、 125又は 62. 5 μ gZmLの濃度に蒸留水で溶解した溶液を 10 μ Lおよび蒸留水 40 μ Lを試験管に 添加し、撹拌後 37°Cで 60分間静置して酵素反応させた。ブランクとして NAH溶液 の代わりに蒸留水を 10 L添加し、同様に反応させた。
[0222] 反応後、 450mM NaClを含有する 50mM Tris溶液 (pH9. 0)を 50 μ Lカロえ、酵 素反応を停止させた (以下、「酵素反応停止液」という)。
上記サンドイッチ ELISA用プレートを、洗浄液 300 Lで 3回洗浄した。 その後、酵素反応停止液を各ゥエルに 100 /z Lずつ添加し、 37°Cで 60分間静置し て抗原-固相化抗体の複合体を形成させた。
[0223] 反応後、ゥエルを洗浄液で 3回洗浄し、 1% BSAおよび 0. 05%ポリオキシェチレ ン (20)ソルビタンモノラウレートを含む PBS (—）（以下、「反応液 2」という）で 1 /z g/mL に調製したピオチン標 miM403の溶液を、各ゥエルに 100 Lずつ添カ卩した。その 後、プレートを 37°Cで 60分間静置して抗体—抗原—固相化抗体のサンドイッチ状の 複合体を形成させた。
[0224] 反応後、ゥエルを洗浄液で 3回洗浄し、反応液 2で 1000倍に希釈した HRP標識ス トレプトアビジン（Pierce社製）の溶液を各ゥエルに 100 Lずつ添カ卩した。その後、プ レートを常温で 30分間静置してピオチン標識サンドイッチ状複合体—ストレプトアビ ジンの複合体を形成させた。
[0225] 反応後、このプレートを洗浄液で 3回洗浄し、ペルォキシダーゼの基質として TMB 溶液 (MOSS社製)を各ゥエルに 100 Lずつ添加し、 37°Cで 15分間反応させ、発色 させた。その後、 1M HC1 (和光純薬工業株式会社製)を各ゥエルに 100 Lずつ添 加して反応を停止させた後、波長 450應 (対照波長 630應）における TMB分解物 の吸光度をゥエルリーダー SK603 (登録商標；生化学工業株式会社販売)で測定し た。
モノクローナル抗体 JM403は、 NAHにおける GlcN残基（すなわち、脱 N—ァセチ ル化された GlcNAc残基）を認識する。 ND活性が高ければ、 NAHにおける脱 N— ァセチルイ匕部位が増加し、この脱 N—ァセチルイ匕された部分はモノクローナル抗体 J M403とピオチン標 miM403とでサンドイッチすることにより検知できることから、脱 N —ァセチルイ匕の程度 (ND活性)を検知することができる。したがって本試験例では、 モノクローナル抗体 JM403とピオチン標 miM403でサンドイッチされて検知された 反応性を ND活性として表すこととした。
[0226] この ND活性は、測定された吸光度から、ブランクにおける吸光度を差し引いた値と して算出した。結果を図 9に示す。
[0227] 図 9から、 ND活性は観察されたものの、 NAHの用量依存的な (NAHの濃度に比 例した) ND活性は観察されなカゝつた。またその吸光度は、 NAH— SS— BSA固相 化プレート又は NAH— COOH— BSA固相化プレートを用いた場合に比して低かつ たことから (0. 6〜0. 7程度）、サンドイッチ ELISA法による ND活性の検出は感度が 低いことが示された。
[0228] 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲 を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明ら かである。
本出願は、 2005年 6月 28日出願の日本特許出願 (特願 2005-188973)に基づくもの であり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は 全体として取り込まれる。
産業上の利用可能性
本発明は、 ND活性、 ST活性又は NDST活性の検出に利用することができる。ま た本発明は、 ND、 ST又は NDSTの活性を変化させる物質のスクリーニングにも利 用することができ、これにより新たな医薬素材等の探索等にも利用することができる。 また本発明は、 NDST等の酵素活性の異常に起因する疾患の検知やそのリスクの 検知、病態把握等にも活用しうる。

Claims

請求の範囲
[I] 下記の群力 選択される物質力 N—ァセチルへパロサン又はその誘導体に結合 していることを特徴とする、修飾多糖。
(群)蛋白質、ピオチン、抗原物質
[2] 結合が、前記の物質と、 N—ァセチルへパロサン又はその誘導体の還元末端との 間に形成されて ヽることを特徴とする、請求項 1に記載の修飾多糖。
[3] 蛋白質との結合力 共有結合又はァフィユティー結合である、請求項 1又は 2に記 載の修飾多糖。
[4] 共有結合が、ジスルフイド結合、アミノアルキル結合又はアミド結合である、請求項 3 に記載の修飾多糖。
[5] ァフィユティー結合が、ピオチン'アビジン結合である、請求項 3に記載の修飾多糖
[6] 蛋白質が、分子量 1. 5万〜 20万の可溶性の蛋白質である、請求項 1〜5のいずれ 力 1項に記載の修飾多糖。
[7] 分子量 1. 5万〜 20万の可溶性の蛋白質力 免疫グロブリン、アビジン、プロテイン
A、プロテイン G、アルブミン又はカゼインである、請求項 6に記載の修飾多糖。
[8] アルブミンが、血清アルブミン又は卵白アルブミンである、請求項 7に記載の修飾多 。
[9] N—ァセチルへパロサンの誘導体力 下記（1)〜（3)からなる群から選ばれる物質 である、請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の修飾多糖。
( 1) N—脱硫酸化へパリン又は N -脱硫酸化 ZN -ァセチルイ匕へパリン
(2) N—脱硫酸化へパラン硫酸又は N—脱硫酸化 ZN—ァセチルイ匕へパラン硫酸
(3)脱 N—ァセチル化へパロサン
[10] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の修飾多糖が固着された固相。
[II] 下記ステップ (a)及び (b)を少なくとも含む、検体中の N—デァセチラーゼ活性の検 出方法。
ステップ (a)：請求項 10に記載の固相に、検体を接触させるステップ
ステップ (b) :前記固相に固着された請求項 1〜9のいずれ力 1項に記載の修飾多 糖における、脱 N—ァセチルイ匕を検出するステップ。
[12] 脱 N—ァセチル化の検出が、請求項 10に記載の固相に「N—ァセチルへパロサン 又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する蛋白質」を接触させることによ り行われる、請求項 11に記載の検出方法。
[13] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する「蛋 白質」が、抗体である、請求項 12に記載の検出方法。
[14] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する抗 体力 モノクローナル抗体 JM403である、請求項 13に記載の検出方法。
[15] 下記の構成成分 (A)及び (B)を少なくとも含む、検体中の N—デァセチラーゼ活性 の検出キット。
(A)請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の修飾多糖
(B) N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する 蛋白質
[16] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の修飾多糖力 固相に固着されていることを特 徴とする、請求項 15に記載の検出キット。
[17] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する「蛋 白質」が、抗体である、請求項 15又は 16に記載の検出キット。
[18] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する抗 体力 モノクローナル抗体 JM403である、請求項 17に記載の検出キット。
[19] 下記ステップ（c)及び (d)を少なくとも含む、検体中の N—スルホトランスフェラーゼ 活性の検出方法。
ステップ ）：請求項 10に記載の固相に、検体と硫酸基供与体とを接触させるステ ップ。
ステップ (d) :前記固相に固着された請求項 1〜9のいずれ力 1項に記載の修飾多 糖における、 N—硫酸ィ匕を検出するステップ。
[20] N—硫酸化の検出が、請求項 10に記載の固相に「N—ァセチルへパロサン又はそ の誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコサミン残基に結合する蛋白質」を接 触させることにより行われる、請求項 19に記載の検出方法。
[21] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコサミ ン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項 20に記載の検出方法。
[22] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコサミ ン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体 F58— 10E4又はモノクローナル抗体
HepSS— lである、請求項 21に記載の検出方法。
[23] 下記の構成成分 (A)及び (C)を少なくとも含む、検体中の N—スルホトランスフェラ 一ゼ活'性の検出キット。
(A)請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の修飾多糖
(C) N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコ サミン残基に結合する蛋白質
[24] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の修飾多糖力 固相に固着されていることを特 徴とする、請求項 23に記載の検出キット。
[25] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコサミ ン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項 23又は 24に記載の検出キット。
[26] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコサミ ン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体 F58— 10E4又はモノクローナル抗体
HepSS— 1である、請求項 25に記載の検出キット。
[27] 請求項 11〜14のいずれか 1項に記載の方法によって検体中の N—デァセチラ一 ゼ活性を検出し、かつ、請求項 19〜22のいずれか 1項に記載の方法によって検体 中の N—スルホトランスフェラーゼ活性を検出することを特徴とする、検体中の N—デ ァセチラーゼ /N—スルホトランスフェラーゼ活性の検出方法。
[28] 下記の構成成分 (A)、（B)及び (C)を少なくとも含む、検体中の N—デァセチラ一 ゼ /N—スルホトランスフェラーゼ活性の検出キット。
(A)請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の修飾多糖
(B) N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する 蛋白質
(C) N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコ サミン残基に結合する蛋白質
[29] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の修飾多糖力 固相に固着されていることを特 徴とする、請求項 28に記載の検出キット。
[30] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する「蛋 白質」が、抗体である、請求項 28又は 29に記載の検出キット。
[31] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体におけるダルコサミン残基に結合する抗 体力 モノクローナル抗体 JM403である、請求項 30に記載の検出キット。
[32] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコサミ ン残基に結合する「蛋白質」が、抗体である、請求項 28〜31のいずれか 1項に記載 の検出キット。
[33] N—ァセチルへパロサン又はその誘導体における N—硫酸ィ匕されているダルコサミ ン残基に結合する抗体が、モノクローナル抗体 F58— 10E4又はモノクローナル抗体 HepSS— 1である、請求項 32に記載の検出キット。
[34] 下記ステップ (e)〜 (g)を少なくとも含む、下記の酵素群力も選択される 1又は 2以 上の酵素の活性を変化させる物質のスクリーニング方法。
ステップ (e) :下記の酵素群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる 可能性のある試験物質を、当該酵素と共存させるステップ。
ステップ (f)：ステップ (e)により得られる「前記試験物質と前記酵素との共存物」を検 体とし、請求項 11〜14、請求項 19〜22及び請求項 27のいずれか 1項に記載の方 法によって、前記酵素の活性を検出するステップ。
ステップ ）：ステップ (f)により検出された酵素の活性と、ステップ (e)で用いた酵素 を検体としてステップ (f)と同一の検出方法によって検出される酵素の活性とを比較 して、下記の酵素群力 選択される 1又は 2以上の酵素の活性を変化させる試験物 質を選択するステップ。
(酵素群） N—デァセチラーゼ、 N—スルホトランスフェラーゼ、 N—デァセチラーゼ Z N—スルホトランスフェラーゼ
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