WO2006133947A1 - Hochattenuierte poxvirusstämme, verfahren zur ihrer herstellung und deren verwendung als paramunitätsinducer oder zur herstellung von vektor-vakzinen - Google Patents

Hochattenuierte poxvirusstämme, verfahren zur ihrer herstellung und deren verwendung als paramunitätsinducer oder zur herstellung von vektor-vakzinen Download PDF

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    • C12N2710/24061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/24064—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

Definitions

  • the present invention relates to highly attenuated animal poxviruses, paramunity inducers derived therefrom, and vector vaccines based on highly attenuated animal pox virus strains.
  • the highly attenuated animal poxviruses according to the invention have no virulent and immunizing properties by the process of high attenuation.
  • Another aspect of the invention relates to methods of producing such highly attenuated animal pox virus strains and their use as paramunity inducers to induce paramunity, i. for activation of the nonspecific (paraspecific) immune system in humans and animals or as a vector vaccine for immunizing a mammal or human.
  • the highly attenuated animal pox viruses according to the invention are also suitable for the prophylaxis and treatment of multifactorial, usually chronic diseases.
  • Preferred embodiments of the invention relate to animal pox virus strains isolated from infected animals and highly attenuated by serial passages of all genera of the family Poxviridae.
  • the animal pox strains according to the invention have excellent paramunizing properties, the virulent and immunizing properties having been lost by the method of high attenuation according to the invention.
  • the body's immune system of mammals can be divided into an antigen-specific and an antigen-unspecific (paraspecific) part.
  • the antigen-specific part of the immune system includes, for example, antibodies or specific immune cells.
  • the antigen-specific mechanisms are responsible for the establishment of a specific immunity, the antigen-specific for the building of paramunity.
  • the parasitic activities of the antigen-immune system include nonselective cellular and soluble protective elements, such as the complement lysozyme system and the regulatory cytokine cascade, as well as cellular protective elements, such as granulocyte, micro and macrophages, natural killer cells, non-antigenic T-lymphocytes, dendritic cells and others
  • nonselective cellular and soluble protective elements such as the complement lysozyme system and the regulatory cytokine cascade
  • cellular protective elements such as granulocyte, micro and macrophages, natural killer cells, non-antigenic T-lymphocytes, dendritic cells and others
  • Paramunity is the state of a well-regulated and optimally functioning nonspecific defense system, which gives the organism a rapid, temporally limited, increased protection against a multiplicity of different pathogens, antigens and other noxae.
  • Paraspecific activities are present in the organism immediately after contact with noxa, i. after about 2 to 6 hours, while the effects of the antigen-specific immune system occur only after 5-8 days (cellular specific immunity) or even weeks (antibodies). This provides additional time to build up specific defense responses to the antigens that could not be neutralized by the paramunizing activities.
  • the paraspecific defense therefore allows the organism to encounter immediately upon confrontation with a wide variety of foreign substances, infectious agents, toxins and transformed endogenous cells, i. to put up with no loss of time (Anton Mayr, "Paramunization: Empiricism or Science", Biol. Med., Aufl. 26 (6): 256-261, 1997).
  • the paraspecific immune defense is thus a physiological process and can be defined as a "primary barrier” in dealing with a pollutant-containing environment. This form of defense is irreplaceable not only for the lower organisms, but especially for the higher and highly developed organisms It can be shown that primary congenital defects in this biological defense system can lead to life-threatening situations, for example the "Chediak-Steinbrinck-Higashi-syndrome" of humans, caused by granulocyte defects
  • NK cells natural killer cells
  • the state of paramunity is characterized by increased phagocytosis rate, increased function of spontaneous cell-mediated cytotoxicity (NK cells), and increased activity of other non-antigen-specific lymphoreticular cells.
  • certain cytokines release, which stimulate and / or suppress (eg via repressor mechanisms) both with the cellular elements and with one another, ie have an optimally regulating effect.
  • This tightly networked and stepwise reactive biological System of paramunity with its different acceptor, effector and target cells and the signal-transmitting molecular messengers (cytokines) is also intensively linked to the hormone and nervous system, sometimes even with the vascular and metabolic system.
  • a drug-based paramunization can be achieved by activation of the cellular elements of the paras-specific part of the immune system and the associated formation of cytokines, with the aim to eliminate dysfunctions, to quickly increase the pathogen and antigen-unspecific protection of an individual (optimal bioregulation) to eliminate immunosuppression or immunodeficiency, to repair deficits and / or to act as regulator between immune, hormone and nervous system (Anton Mayr, "Paramunization: Empiricism or Science", Biol.
  • the paramunity inducer per se is a protein, i. it is not comparable to an antibody, a chemical, an antibiotic, vitamin or hormone. Rather, like a catalyst, it activates the paraspecific mechanism via a stepwise mechanism
  • Paramunity inducers act both in regulating and repairing the immune defense.
  • phagocytic cells acceptor cells
  • mediators e.g. Release cytokines
  • the animal poxvirus strains underlying these paramunity inducers have been attenuated in a conventional manner, i. they are in a reduced state in which the virulent and especially the immunizing properties of the virus are attenuated but not completely lost.
  • Such high attenuation of poxviruses is in the present invention for the first time on the basis of the Orthopoxviruses Camelpox virus (Orthopoxvirus cameli) and Ektromelievirus (Orthopoxvirus muris), the leporipox virus Myxomatosevirus (Leporipoxvirus myxomatosis), avipoxvirus chickenpox virus (Avipoxvirus gallinae) and canarypox virus (Avipoxvirus serinis) and the Parapox virus Ecthyma (Parapoxvirus ovis).
  • Orthopoxviruses Camelpox virus (Orthopoxvirus cameli) and Ektromelievirus (Orthopoxvirus muris)
  • the leporipox virus Myxomatosevirus Leporipoxvirus myxomatosis
  • avipoxvirus chickenpox virus Avipoxvirus gallinae
  • Exemplary embodiments of the invention relate to the high attenuation of the Orthopoxvirus strain.
  • Other preferred embodiments relate to other strains of orthopoxvirus, as well as strains of the parapoxviruses and avipoxviruses (see below).
  • the Camelpocken are the causative agents of a dangerous, cyclic-systemic virus disease of the camelids, which is characterized by an exanthema of the skin and mucosa of the head, neck and neck, as well as the extremities and Inguinalministerd (Münz, E., 1999: " pox and pox-like diseases in cameis "Proc.l st Int. Camel Conf. 1, 43-46). the disease occurs cyclically every 2 to 3 years if a sufficiently large sensitive population is present. of the Camelpox viruses are preferably infested with two genera (Lama and Camelus) of the family Camelidae (Mayr, A.
  • Camelus comprises the single-humped dromedary ⁇ Camelus dromedarius) and the two-humped camouflage ⁇ Camelus ferus bactrianus), mainly of dromedaries and bactids in the countries of the so-called "Old World” (deserts, steppes of North Africa, Arabia, Mongolia), while the Lama is favored in South America.
  • the camelpox virus ⁇ Orthopoxvirus camel ⁇ is a particularly close relative of the variola virus, the causative agent of human smallpox (variola). For humans, camelpox virus is not pathogenic. Like all classical pox viruses, the camelpox virus is cuboid and has characteristic surface proteins that are responsible for the immunizing and paramunizing properties of the virus or its constituents.
  • the average size is 280 nm in the longitudinal direction, depending on the genus or strain, and about 180 nm in the transverse direction (Otterbein, CK., 1994: “Pheno- and genotypic studies of two camelpox virus isolates before and after attenuation by cell culture passages ", Vet.Med.Diss, Kunststoff.)
  • the camelpox virus genome consists of a linear, double-stranded DNA, the two DNA strands being covalently bound together at the genome ends, such that the viral DNA forms a continuous polynucleotide chain.
  • Myxomaviruses are the causative agents of myxomatosis, a cyclical, contagious viral disease of the wild and domestic rabbits, characterized by generalized, partial hemorrhagic subcutaneous edema of the head and the whole body, with preference of the anal site, the vulva and the tube, like no other infectious disease is. If myxomatosis is reintroduced into a previously disease-free country, it will be rapid and fatal. After the virus has settled, the epidemic character changes to clinically inapparent infections (Mayr A .: Medical Microbiology, Infection and Epidemiology, 7th ed., Erike Verlag, Stuttgart, 2002).
  • the disease is widespread among American cottontail rabbits of the genus Sylvilagus, which colonize exclusively the New World. These wild rabbits are the only natural reservoir of the disease. The infection is mild in their form. In contrast, the disease has in European wild and domestic rabbits of the genus Oryctolagus, which are also native to Australia, a nearly 100% mortality at Neueinschleppung the pathogen.
  • the natural host range of the myxomavirus (genus Leporipoxvirus) is very limited. In general, the virus only reproduces in American cottontail rabbits and European domestic and wild rabbits. Occasionally, however, infections were observed in European wild hares. Transmission attempts to other species and to humans were negative.
  • Chickenpox comes from Asia and has been known for millennia. They are worldwide and very resistant. Transmission occurs through penetration via skin lesions. It can also be piercing Insects involved in the transmission. The incubation period for the disease is 4 to 14 days. There are two forms of progression, whereby a distinction is made between the so-called skin shape and the mucous membrane form.
  • the skin's shape is characterized by vesicles or scabrous nodes on the head, crest, neck and feet.
  • the mucous membrane shows yellowish-white deposits on the tongue, the mucous membranes of the beak, the larynx, the trachea and the eyes.
  • the incubation period for canarypox virus infection is 3 to 16 days. After the outbreak of the disease, a large part of the stock dies within just a few hours. The infected animals show nodules on the horn parts and at the beak angles. It comes to massive respiratory problems and the birds stifle quite quickly to the caused by the virus cheesy deposits in the airways.
  • Attenuated strains of avipoxviruses were obtained by successive passages in cell cultures from chicken embryo fibroblasts and used to vaccinate chickens.
  • the best studied and available strain is Strain HP-I (A. Mayr and K. Malicki, 1966: "Attenuation of Virulent Chickenpox Virus in Cell Cultures and Properties of the Attenuated Virus", Zbl.Vet.Med.B 13, 1-13
  • More than 200 passages in chick embryo fibroblasts result in an attenuated but still replicable virus, but with residual pathogenicity to chickens on intravenous or Aersol administration, viruses more than 400 times passaged are considered to be non-pathogenic and are considered to be efficacious and extremely safe Vectors were considered for use in mammals Immunization could be achieved without complete productive replication of the virus.
  • the object of the present invention is therefore to provide animal pox strains which are stable, have a high degree of attenuation and in which the poxviruses are modified in such a way that they have completely lost their virulent and immunizing properties and thus can be used as harmless paramunity inducers and vector vaccines.
  • the highly attenuated by the inventive method animal pox strains are outstandingly suitable as Paramunticiansinducer or for the production of vector vaccines.
  • the invention relates to highly attenuated animal pox virus strains and their use as paramunity inducers or for the production of vector vaccines.
  • Particular embodiments of highly attenuated animal pox strains are strains of myxomatosis and camelpox virus. Particularly preferred is the Camel pollen virus strain hM 27 with accession number 05040602 and myxomatosis virus strain hM 2 with accession number 05040601. The virus was deposited at the Public Health Laboratory Service (PHLS) Center for Applied Microbiology & Research (CAMR), European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom.
  • PHLS Public Health Laboratory Service
  • AMR Public Health Laboratory Service
  • ECACC European Collection of Animal Cell Cultures
  • Porton Down Salisbury, Wiltshire, United Kingdom.
  • inventions relate to the high attenuation of the canarypox virus (Avipoxvirus serinae), preferably of the strain KP1, of the ectomelie virus (Orthopoxvirus muris), preferably of the strain Mü 1 and chickenpox virus (Avipoxvirus gallinae), preferably of the strain HPI and of the parapoxvirus (Parapoxvirus ovis) ,
  • the virulence of the virus strains and their immunizing properties are completely lost in comparison to conventionally attenuated animal pox strains.
  • the highly attenuated animal pox viruses according to the invention therefore no longer have any residual virulence or immunity.
  • the highly attenuated animal pox strains are particularly suitable for use as paramunity inducers or for the production of vector vaccines.
  • the invention further relates to processes for the preparation of the highly attenuated poxvirus strains according to the invention.
  • Preferred poxvirus strains are strains belonging to the genus orthopoxvirus, avipoxvirus, leporipoxvirus and parapoxvirus.
  • High attenuation of poxvirus strains is achieved by additional plaque final dilution passages (ie, inoculation and propagation) of conventionally attenuated virus strains in optimized, selected, permanent cell lines (eg, VERO cells) in primary cell cultures (eg, chicken embryo fibroblast (FHE) cell cultures). incubated chicken eggs or reached in experimental animals. It was surprisingly found that this virginity and immunogenicity of the animal poxviruses and their constituents is lost as compared to conventionally attenuated strains by this additional passaging.
  • optimized, selected, permanent cell lines eg, VERO cells
  • primary cell cultures eg, chicken embryo fibroblast (FHE) cell cultures
  • the passage in the selected cell systems or cultures is continued until the desired properties are achieved, ie until the animal poxviruses no longer exhibit any virulence or immunogenicity and instead have an increased activity of the unspecific immune system (paramunity).
  • this can be achieved by at least 300-500 passages in optimized cell systems, such as cell cultures of VERO-cell passages (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection).
  • optimized cell systems give the required high infectivity titer.
  • the other desirable biological, genetic and immunological properties that result from high attenuation of animal pox strains are listed in Table 3.
  • the method according to the invention for the production of highly attenuated animal poxviruses can be defined by the following steps:
  • Infectivity titers in particular AVIVER or VERO cells
  • the highly attenuated orthopoxvirus strain is a highly attenuated camelopardal virus, in particular strain h-M 27.
  • a preferred method for high attenuation of camelpox viruses comprises the steps of: (a) culturing the isolated camelpox virus for about 2 to 4 passages in
  • Cells preferably plaque final dilution passages.
  • the animal poxviruses thus produced can be used for the production of paramunity inducers and vector vaccines.
  • For the production of the reproducible virus harvest is used.
  • a further embodiment of the present invention relates to the highly attenuated leporipoxvirus strain Myxomatosevirus ⁇ Leporipoxvirus myxomatosis), strain h-M 2.
  • a preferred method for high attenuation of such a myxomatosis virus strain comprises the following steps:
  • the virus harvests are inactivated by treatment with beta-propiolactone.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions which contain one or more highly attenuated smallpox strains of different origin in combination and to which, if appropriate, a pharmaceutical carrier is added.
  • a further aspect of the invention therefore relates to the use of one or more highly attenuated animal pox strains according to the invention (for example in combination) or components of the highly attenuated animal pox strains for activating the paraspecific immune system in a mammal or in humans for prophylaxis and therapy.
  • the highly attenuated animal poxviruses are used for the production of vector vaccines, for this purpose the replicable virus harvests are used.
  • a nucleic acid coding for a foreign antigen is thereby incorporated into one of the deletions of the nucleic acid of the vector (animal poxvirus), which is the result of the high attenuation, so that the foreign gene can be expressed by the vector.
  • the resulting foreign proteins provide immunizing epitopes and thereby stimulate the body's own specific defense system.
  • Attenuation (English: attenuate) of an infectious agent (e.g., viruses, bacteria, fungi) is basically understood the reduction of its virulent and immunizing properties.
  • infectious agent e.g., viruses, bacteria, fungi
  • High attenuation means the further reduction of simply attenuated but still partially virulent and immunizing pathogens, up to a complete loss of virulence and the immunizing potential, whereby the high attenuation leads to an extreme narrowing of the host range paramunizing potential greatly increased Reactivation of their lost virulent and immunizing properties, the highly attenuated poxviruses are more stable than conventionally attenuated strains, ie reconversion is not possible.
  • the highly attenuated animal pox strains are genetically engineered to differ from the conventionally attenuated animal pox strains by further decreasing the molecular weight of the virus nucleic acid and increasing deletions in the nucleic acid; biologically by the complete loss of virulence and contagiousness, these strains simultaneously achieving in the permissive host system an optimal and compared to conventionally attenuated strains high infectivity titers; immunologically by the total loss of immunogenicity, and molecular biologically by the loss of cytokine receptors, e.g. Receptors for interferon and certain interleukins.
  • cytokine receptors e.g. Receptors for interferon and certain interleukins.
  • Virulence refers to the degree of pathogenic properties of a particular strain of a pathogenic type of pathogen in a given host under defined infection conditions. The degree of virulence can vary considerably within the strains of a species. There are strong, weak and non-virulent (avirulent) strains. If host and environmental conditions are changed, the virulence of the strain may change as well, but it may also remain unchanged. Thus, the host's defenses, the anatomical and physiological conditions of the host flora, the environmental temperature, the humidity, etc., can be synergistic or antagonistic.
  • the presence of virulence or the loss of virulence can be evaluated in the test system known to the person skilled in the art and relevant for the particular animal pox virus.
  • the animal poxviruses of the present invention show no virulence in human hosts.
  • pathogenicity refers to the property of an infectious agent or metazoan parasite, after penetration, adherence and identical multiplication in a host to lead to a local or general impairment of performance (functio laesa) and create an infectious disease Since the emergence of an infectious disease depends on the pathogen and the host the pathogenicity not only the pathogen, but the pathogen-host system.
  • the pathogenicity is related to the species of a pathogen, not to a variant, a strain or a colony. It is a basic property, a potency that can work but does not have to. A pathogenic species related to a particular host-host system can not become non-pathogenic in nature, since this basic ability of an entire species is not lost.
  • Immunogenicity of an animal pox virus refers to the ability of the animal pox virus in a vertebrate, preferably in the natural host of the virus or in humans, to elicit a cellular specific and / or humoral immune response, e.g. Stimulate T-cell proliferation and / or the generation of antibodies.
  • the loss of immunogenicity of the highly attenuated animal pox strains of the present invention is associated with the loss of this ability. The immunogenicity or the loss of these can be tested in test system, which are known in the art.
  • Vector vaccines are understood to be vaccines consisting of two components: a microbial carrier (vector) and an immunizing antigen whose coding nucleic acid is incorporated into the vector Nucleic acid deletions and their paramunizing properties are preferably (highly) attenuated animal poxviruses. [Fremd.] The introduced foreign gene nucleic acid is expressed in the vaccine by the vector, resulting in the formation of specific immunizing reactions.
  • Paraspecific vaccines refers to bioregulative preparations of attenuated, avirulent and inactivated animal poxviruses, depending on Attenu réellesgrad only residues of (conventional attenuated) or no (highly attenuated) immunizing
  • the invention is based on the surprising discovery that the virulence and immunizing properties of conventionally attenuated animal poxvirus strains can be reduced to complete loss by additional plaque final dilution passages in permissive cell cultures, incubated chicken eggs or experimental animals. In contrast to a potential reactivation of these properties, such highly attenuated strains are stable.
  • high attenuation This process, which goes beyond simple, conventional attenuation, is referred to in the present invention as "high attenuation.”
  • These highly attenuated animal poxvirus strains are markedly improved over conventionally attenuated pathogens
  • the highly attenuated animal pox strains as summarized in Table 3, are genetically engineered from the conventionally attenuated animal pox strains by the decrease of the molecular weight of the virus nucleic acid and the increase of deletions in the nucleic acid, biologically by the loss of virulence and contagiousness, immunologically by the loss of immunogenicity, and molecular biologically by the loss of cytokine receptors.
  • Avipoxviren shown, where it is not limited to this genera.
  • a high attenuation with a myxomatosis virus and a camelpox virus is described in the present invention.
  • Highly attenuated poxvirus strains also lose their specific immunizing capacity through the high attenuation procedure described below, while their parasite specificity is purposefully enhanced. Therefore, the highly attenuated poxvirus strains are suitable as paramunity inducers or for the production of vector vaccines.
  • the enhancement of paraspecific properties is probably due to the fact that immunizing and paramunizing proteins of animal poxviruses interfere with each other.
  • the loss of immunizing proteins caused by high attenuation activates additional paramagnetizing proteins which significantly increase the paramunizing efficacy of these strains. In this way, one obtains highly effective and harmless paramunity inducers, which cause no allergies or other immunogenic side effects even in short-term repeated and frequent applications.
  • the present invention relates to a highly attenuated animal poxvirus based on an animal poxvirus strain of the family Poxviridae, characterized in that the animal poxvirus no longer possesses virulent and immunizing properties and the highly attenuated animal poxvirus has a lower molecular weight of the virus nucleic acid, more frequent deletions in the terminal region and has an increased loss of cytokine receptors compared to conventionally attenuated animal pox strains.
  • Known attenuated animal poxviruses have between 0 and 3 deletions in one or both terminal regions of the virus genome.
  • the number of deletions in different strains of merely attenuated animal poxviruses varies so that the highly attenuated animal poxviruses of the present invention taken together have 1, 2, 3, 4, 5 or more deletions in the terminal regions of the virus genome than those in the merely attenuated animal poxviruses.
  • the highly attenuated animal poxviruses of the present invention have a total of 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more deletions in the terminal regions. preferably have more frequent deletions, preferably at least 2 deletions in the right and at least 2 deletions in the left.
  • the virus genome has a loss of cytokine receptors for interferon ⁇ and ⁇ . It is particularly preferred that the Tiepockenvirus also has a loss of receptors for IL-1 ß and / or TH 1 cells.
  • the virus genome of the animal pox virus is 16%, 17%, 18%, 19%, and more preferably about 20% smaller than the wild-type virus genome.
  • the deletions are in one or both terminal regions of the animal poxvirus genome.
  • the highly attenuated animal pox virus of the present invention is obtainable by the following method:
  • at least 100, preferably at least 110, at least 120, at least 130 or more VERO cell passages are performed followed by at least 20, preferably at least 24 intermediate passages in AVIVER cell cultures and other VERO cell passages;
  • AVIVER cells especially for 200 to 300 passages.
  • inoculation and continuation of the animal poxviruses in VERO cells for at least 90 passages, preferably for at least 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 or more passages.
  • plaque purified passages are performed.
  • Attenuation begins with the adaptation of isolated animal poxviruses in homologous or heterologous permissive cell systems, e.g. Cell cultures, incubated chicken eggs or in experimental animals. This is followed by attenuation through continuous passages in various permissive cell systems.
  • the permissive cell systems appropriate for each virus strain are specifically selected for each species of animal pox virus. The selection depends on the infectivity titre of the viruses in the respective cell system.
  • the cell system is selected for passenger, which gives the highest In Stammiösticianstiter for each virus species.
  • Such a cell system, in particular cell line can be determined by those skilled in the art by methods known in the art.
  • This also corresponds to the optimal virus titer.
  • the attenuation is continued by removing the animal pox viruses for about 100-300, in particular 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 , 290 or 300 passages in these optimal cell systems.
  • This is followed by a final phase characterized by 3-5 plaque final dilution passages. This material can be further processed according to further use.
  • a high attenuation of poxviruses by at least 60 to 300 passages depending on the respective virus strain in VERO cell cultures (for example, 150 or 260 passages).
  • the strain Leporipoxvirus myxomatosis is highly attenuated by approximately at least an additional 150 to 300 passages in MA and VERO cell cultures, preferably 290 passages.
  • the strain Avipoxvirus gallinae is highly attenuated by about 100 to 150 additional passages, preferably by 98 passages, in FHE cell cultures.
  • the parapoxvirus strain is highly attenuated by an additional 100 to 160, preferably 164 passages (Tables 3 and 4). It is preferred that in the passage of the virus strains (ie in the transfer and inoculation) the so-called plaque final dilution method is used.
  • a fully synthetic medium is preferably used, particularly preferably the medium MEM, which is 5% to 20%, preferably 10% BMS (serum replacement medium) and 5% to 20% %, preferably 10% lactalalbumin hydrolyzate is used as the virus medium after exchange with the culture medium, preferably MEM medium, with 5% to 20%, preferably 10% lactalalbumin hydrolyzate, without BMS or without fetal calf serum and without antibiotics
  • Production processes are preferably carried out at pH values of 7.0 to 8.0, preferably at a pH of 7.25.
  • Virus crops with titers of 10 s to 10 8 TCID 50 / ml, preferably of at least 10 7 5 TCID 5 0 / ml are preferred as starting material for the production of highly attenuated animal pox strains.
  • the proliferation of poxviruses in VERO cells leads to a typical cytopathic effect, which leads to the destruction of the infected cells (lysis).
  • a primary vaccine dose of about 10 MOI ("multiplicity of infection") after a short period of inactivation (1-2 days), reticulated cell structures are formed for about 3 days and, after about 5 days, the cells are lysed.
  • the virus harvests obtained from the last pass can be further processed according to their use.
  • the nucleic acids contained in the viruses for the production of vector vaccines can be recombinantly cloned.
  • the highly attenuated virus crops can be lyophilized and stored for example by the addition of 2.5% gelatin at 4 ° C for further use, for example as Paramunticiansinducer.
  • the lyophilizate can be tested for its harmlessness and effectiveness.
  • the orthopoxviruses can be highly attenuated by the method described by way of example with camelpox viruses:
  • Orthopoxyirus cameli, hM27 camelpox viruses isolated from the pustular material of diseased animals, such as strain M27, are grown in embryonic lamb kidney cell cultures for about 2 passages.
  • the thus bred animal poxviruses are transferred by a suitable method, preferably by the plaque final dilution method in VERO cells and continued there for about 5 passages.
  • the last cell culture passage is adapted to MA cells (monkey kidney MA-104 cells) and continued approximately 114 times in passages.
  • the resulting 121st plaque-purified MA passage (total 284 passages) has been found to be simply attenuated.
  • the highly attenuated camelpox virus, strain hM 27, obtained by the method of the invention has a total loss of virulence and contagiousness for the homologous host and a high infectivity titer in VERO cells (10 7> 25 KID 50 / ml). It is therefore particularly suitable for use as a paraspecific vaccine (paramunity inducer).
  • the paramunity inducers based on highly attenuated animal poxviruses can be used in both replicable and inactivated form. In inactivated form, the highly attenuated virus is treated with beta-propiolactone as described below (V. frainger, T. Schlapp, W. Strube, N. Schmeer and A.
  • the genome length of the virus is already significantly reduced by occurring deletions.
  • the genome length of the parent virus wild-type
  • the genome length of the attenuated M27 strain is about 172,400 bp.
  • Conventional attenuation thus results in a significant loss of nucleotides in the DNA.
  • Restriction digestion with the restriction enzyme HindIII shows that in the genome four restriction fragments are present less in the analysis gel (Otterbein CK., 1994, Vet.Med.Diss.Munich).
  • the central, conserved region of the viral genome remains unchanged (C. Gubser, S. Hue, P.
  • Leporipoxy virus mvxomatosis, Mvxomatosevirus, h-M 2 was carried out with the myxomatosis virus strain M 2. Again, a pass in CAM cells was followed by several passages of VERO and AVIVER cells and finally further passages in VERO cells.
  • the method of producing paramunity inducers from highly attenuated myxoma viruses comprises the steps of:
  • the myxomatosis virus used for attenuation from the edematous subcutis (left ear) of a typical European wild rabbit (genus Oryctolagus) suffering from myxomatosis was infected with myxoma virus by culturing on the chorioallantoic membrane (CAM) 10 days of incubated chicken eggs (VALO). Eggs) and three times by the method of Herrlich et al. Adapted on the CAM in passages (Herrlich A., Mayr A.
  • the third CAM passage was in a 1st stage on VERO cells were adapted over 120 passages (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection), amplified in a second step through 24 intermediate passages in AVIVER cell cultures, and further bred in VERO cells in the 3rd phase Passages with the aim of attenuation were carried out after these continuous final dilution passages, the originally virulent myxomavirus was attenuated.
  • High attenuation of the myxomavirus strain M 2 is achieved by the continuation of the attenuated strain in VERO cells. For this purpose, at least another 250 to 350 passages, preferably 300 plaque-cleaned passages in VERO cells must be performed.
  • Table 3 and Table 4 shows an overview of the biological and genetic engineering differences between a conventional attenuation and a high attenuation according to the invention using the example of the vaccinia virus, strain MVA.
  • deletions occur more frequently in the terminal regions of the virus genome (inverted terminal repeat) and the molecular weight is reduced due to lower base pairs.
  • Highly attenuated animal poxviruses lack about 20% of the original genome (which makes them attractive as vector vaccines, see below).
  • receptors eg for IL-1 ⁇ and TH 1 cells
  • an enhancement of NK cell activation and the formation of haematopoietic stem cells as well as a further narrowing of the host range in cell cultures.
  • interferon is ⁇ and ⁇ , IL-I, 2, 6, 12, and GM-CSA, TNF amplified.
  • highly attenuated animal pox strains have no specific immunogenicity, but an increased activity of the unspecific immune system (paramunity). A virulence towards humans or animals is completely missing. Further processing of highly attenuated parapoxyiren to paramunity inducers
  • Concentration of 0.01% -l% beta-propiolactone can be performed. Particularly preferred here is a concentration of 0.05% beta-propiolactone. Ideally, one will
  • the highly attenuated virus particles are preferably purified by means of low-speed centrifugation (eg 1000 rpm). After centrifugation, 0.5-10% succinylated gelatin (eg, polygeline, available from, for example, Hausmann Company, St. Gallen / Switzerland), preferably 5% succinylated gelatin, may be added.
  • succinylated gelatin eg, polygeline, available from, for example, Hausmann Company, St. Gallen / Switzerland
  • the resulting mixture can then be lyophilized in portions of, for example, 1.5 ml in corresponding sterile glass vials or ampoules and, if necessary, dissolved with distilled water (distilled water). A volume of 0.5-2 ml, preferably 1.0 ml, of the distilled water.
  • dissolved lyophilisate corresponds to a vaccine dose for humans in intramuscular administration (see also Mayr A. and Mayr B .: “From Empiricism to Science", Veterinary Surgery, Aufl., 57: 583-587, 2002.)
  • the lyophilized preparation can be stored at temperatures of about + 4 ° C to +8 0 C or at lower temperatures (eg -60 ° C) stable indefinitely.
  • a further aspect of the invention relates to the use of highly attenuated animal pox virus strains or components of highly attenuated animal pox strains individually or combinations as paramunity inducers.
  • Examples are replicable or inactivated freshly isolated animal poxviruses, replicable or inactivated recombinant animal poxviruses derived from freshly isolated animal poxviruses, viral envelopes, separated envelopes, and cleavage products and aberrant forms of these envelopes, single native or recombinant polypeptides or proteins, especially membrane and surface receptors occur in isolated animal poxviruses or from one genetically modified smallpox virus or part of its genetic information can be recombinantly expressed.
  • Another aspect of the present invention is therefore to combine various highly attenuated pox strains of the same or a different genus for use as paramunity inducers.
  • the highly attenuated animal poxviruses are suitable for the following prophylactic or therapeutic indications in humans and animals:
  • Deficiencies or dysregulations in the immune system of an organism Deficiencies or dysregulations in the immune system of an organism; neonatal infection threat; adjuvant therapy for certain tumor diseases, e.g. Prevention of
  • the paramunity inducers based on highly attenuated animal pox strains according to the invention are thus suitable for inducing the paras-specific immune system and / or for the prophylaxis or treatment of defects or multicausal infectious diseases.
  • diseases are dysfunctions of the immune system, immunosuppression, immunodeficiency diseases, dysfunctions of homeostasis between hormone, circulatory, metabolic and nervous system, neonatal Infection threat, tumor diseases, viral diseases, bacterial diseases, therapy-resistant infectious factor diseases, viral and bacterial mixed infections, chronic manifestations of infectious processes, liver diseases of various origins, chronic skin diseases, herpes diseases, chronic hepatitis, influenza infections, endotoxin damage, improvement of wound healing with prevention of secondary infections.
  • the highly attenuated animal pox strains described herein can be local or parenteral.
  • the local administration of paramunity inducers specifically stimulates the paraspecific defense mechanisms in the mucous membranes and in the skin.
  • parenterally applied paramunizations hardly influence the local defense mechanisms in the skin and the mucous membrane.
  • a pharmaceutical composition comprising one or more of the highly attenuated animal pox strains of the invention and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such carrier or additives are e.g. Polyethylene glycol, dextrose, sorbitol, mannitol, polyvinyl pyrrolidone, gelatin, magnesium stearate, carboxyl polymethylene, carboxymethyl cellulose, cellulose acetate phthalate or polyvinyl acetate.
  • a further aspect of the invention relates to the use of the highly attenuated poxvirus strains for the production of vector vaccines (review: Pastoret, P. -P. and Vanderplasschen, A., 2003).
  • highly attenuated animal poxvirus strains are even better suited as vectors for the production of vector vaccines, since they have completely lost their immunizing properties due to high attenuation. Because the viruses are passaged due to their infectious titre, the deletions are located in areas that are not required for viral replication.
  • the highly attenuated animal poxviruses provide sufficient space for the insertion of a foreign nucleic acid (DNA) or a foreign immunogen to be expressed.
  • the foreign nucleic acid may encode a peptide or protein that provides immunizing epitopes.
  • the invention is not intended to a particular peptide or Be restricted protein.
  • the foreign genes can be cloned into the appropriate deletion region of the virus according to their size.
  • the expression of the entrained peptide or protein can be controlled by control elements such as a promoter and, if necessary, enhancer elements.
  • control elements such as a promoter and, if necessary, enhancer elements.
  • the cloning of recombinant animal poxviruses as vector vaccines occurs after the last plaque final dilution passage.
  • the virus nucleic acid can be cleaved for cloning with suitable restriction endonucleases and ligated to the foreign nucleic acid sequences by standard ligation techniques.
  • the vector vaccines according to the invention have the advantage that they do not have an allergic effect and offer the eluted specific antigen an optimally regulated immune system, which contributes to optimal vaccination success. Also, the vector vaccines of the invention are free of local or systemic negative side effects. Since they take advantage of the immunological gap until the full development of immunity, they are particularly suitable for emergency vaccination (for example, acute danger of infection, unexpected travel).
  • vector poxvirus The observation that the excellent parasite-specific activity of the vector poxvirus can significantly increase the vaccination success and the harmlessness of the vaccine is novel and makes the strains attractive for the production of vector vaccines.
  • Vector vaccines based on highly attenuated animal pox strains are therefore superior in their efficacy and safety to conventional vector vaccines.
  • Table 2 System of orthopoxviruses (genus orthopoxvirus, OVP) Table 3: Differences between conventional attenuation and high attenuation Table 4: Passenger numbers of a conventional attenuation compared to a high attenuation.
  • Table 5 Application scheme for treatment with paramunity inducers
  • Table 6 Indications for paramunization with the highly attenuated myxomavirus h-M 2.
  • myxoma paramunity inducers h-PIND-Myxo
  • the VERO virus harvests of the highly attenuated leporipox virus myxomatosis hM 2 have a titer of at least 10 > 75 KID 50 / ml.
  • the highly attenuated leporipox viruses thus obtained showed no virulent or immunizing properties and were further processed as paramunity inducers as follows:
  • the virus harvests were inactivated with beta-propiolactone 0.05% (pH 7.8, 1 h at + 4 ° C (stirred), stirred for 4 hours at a temperature of + 37 ° C at a pH of 7.8 (pH - Check the value and if necessary adjust to pH 7.8), incubate overnight (about 12 hours stationary at a temperature of + 4 ° C) and then purified by coarse-speed centrifugation (15 min, about 4000g) virus material polygeline (pH 7.8) for a total gelatin concentration was added by 2.5%.
  • the thus prepared viral material was dissolved in sterile vials ä ml bottled 1.5 and lyophilized.
  • the lyophilized compositions were stored at a temperature of + 4 0 C Before use, the lyophilizates were dissolved with ImI sterile distilled water per inj and administered deeply intramuscularly.
  • the myxoma paramunity inducer is useful for, for example, the adjunctive treatment of Herpes zoster (mode 4) by means of paramunization. Hiebei leads the treatment to cure the disease-typical pustules after 3-4 days. In the case of pre-flu infections, a complete disappearance of the symptoms (fever, fatigue, headache and pain in the limbs) was observed when using the paramunity inducers according to the invention. In patients with wound injuries (eg after operations) h-PIND-Myxo showed an unusually rapid wound healing without secondary infections. Stomatitis and the lesions during a visit to the dentist caused the disappearance of the apthene or lesions after rubbing in of the lyophilisate after 1-2 hours.
  • Attenuated canarypox virus (Avipox serinae, KPI, 535th FHE passage) was highly attenuated by another 67 passages in FHE (see Table 4).
  • the 602nd FHE passage served as a highly attenuated canarypox virus in an analogous manner to Examples 1 and 2 for the production of paramunity inducers.
  • the recovered viruses showed no virulent or immunizing properties due to the Hochattenu réelle.
  • Attenuated chickenpox virus (Avipoxvirus gallinum, HPI, 444.FHE passage) was highly attenuated by further 98th FHE passages. From the 542nd FHE pass, the chicken pox virus HPI proved to be highly attenuated and was used in an analogous manner as in Example 1 for the preparation of paramunity inducers. The recovered viruses showed due to the Hochattenu réelle no virulent or immunizing properties.
  • Example 5 Analogous to the methods described in the preceding examples, paramunity inducers based on myxomavirus (OPV muris) and parapoxviruses were also prepared.
  • Example 6 Highly attenuated animal pox strains are used to produce vector vaccines.
  • the pH should be about 7.8.
  • the attenuation and high attenuation of the viruses used for vector production are carried out as described in Example 1.
  • all common genetic engineering methods for the insertion of nucleic acid segments encoding specific antigens against which a specific vaccination reaction, i. Immunity formation is to be achieved.
  • the foreign gene is inserted by default by means of suitable restriction enzymes into the deleted nucleic acid regions of the animal pox strains according to the invention produced by the high attenuation. Standard restriction digestion and cloning techniques are used.
  • any (selection) marker genes or selection cassettes may be used, such as the ⁇ -galactosidase gene, which are under the control of appropriate control sequences.
  • Poxvirus genomes a phylogenetic analysis. J. Gen.. Virol. 85, 105-117.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft hochattenuierte Tierpockenvirusstämme und deren Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen. Die erfindungsgemäßen Tierpockenstämmen weisen durch das Verfahren der Hochattenuierung keinerlei virulenten und immunisierenden Eigenschaften mehr auf. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von solchen hochattenuierten Pockenvirusstämmen und deren Verwendung zur Induktion von Paramunität, d.h. zur Aktivierung des unspezifischen Immunsystems in Säugetieren und Menschen oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen zur spezifischen Immunisierung mit dem positiven Nebeneffekt einer Paramunisierung. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren eignen sich somit zur Vorbeugung und Behandlung von Immunschwäche-assoziierten Erkrankungen. Bevorzugte Ausführungsformen betreffen hochattenuierte Orthopox- (z.B. Kamelpockenviren), Leporipox- (z.B. Myxomaviren), Avipox-, Parapox- sowie andere Orthopoxvirusstämme, wie z.B. MVA, die hervorragende paramunisierende Eigenschaften aufweisen und bei denen die immunisierenden Eigenschaften verloren gegangen sind.

Description

Hochattenuierte Poxvirusstämme, Verfahren zur ihrer Herstellung und deren Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von
Vektor- Vakzinen
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft hochattenuierte Tierpockenviren, daraus hergestellte Paramunitätsinducer und Vektor-Vakzinen auf der Basis von hochattenuierten Tierpockenvirusstämmen. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren besitzen durch den Prozess der Hochattenuierung keinerlei virulente und immunisierende Eigenschaften. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von solchen hochattenuierten Tierpockenvirusstämmen und deren Verwendung als Paramunitätsinducer zur Induktion von Paramunität, d.h. zur Aktivierung des unspezifischen (paraspezifischen) Immunsystems bei Mensch und Tier oder als Vektor- Vakzine zur Immunisierung eines Säugetiers oder Menschen. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren eignen sich ferner zur Prophylaxe und Behandlung von multifaktoriellen, meist chronischen Erkrankungen. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen aus infizierten Tieren isolierte und durch Serienpassagen hochattenuierte Tierpockenvirusstämme sämtlicher Genera der Familie Poxviridae. Die erfindungsgemäßen Tierpockenstämme besitzen hervorragende paramunisierende Eigenschaften, wobei die virulenten und immunisierenden Eigenschaften durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Hochattenuierung verloren gegangen sind.
Das körpereigene Immunsystem von Säugetieren lässt sich in einen antigenspezifischen sowie einen antigenunspezifischen (paraspezifischen) Teil aufteilen. Zum antigenspezifischen Teil des Immunsystems gehören z.B. Antikörper oder spezifische Immunzellen. Die antigenspezifischen Mechanismen sind für die Etablierung einer spezifischen Immunität, die antigenunspezifischen für den Aufbau von Paramunität verantwortlich. Die paraspezifischen Aktivitäten des antigenunspezifischen Immunsystems (engl.: „innate immune System") umfassen nichtselektive zelluläre und lösliche Schutzelemente, wie zum Beispiel das Komplement-Lysozymsystem und die regulative Zytokinkaskade, sowie zelluläre Schutzelemente, wie zum Beispiel Granulozyten-, Mikro- und Makrophagen, natürliche Killerzellen, nicht antigengeprägte T-Lymphozyten, dendritische Zellen u.a. Unter Paramunität versteht man den Zustand eines gut regulierten und optimal funktionierenden unspezifischen Abwehrsystems, das dem Organismus einen schnell entstandenen, zeitlich limitierten, erhöhten Schutz gegenüber einer Vielzahl unterschiedlicher Erreger, Antigene und anderer Noxen verleiht.
Paraspezifische Aktivitäten sind im betreffenden Organismus unmittelbar nach Kontakt mit Noxen, d.h. endogenen oder exogenen Schadstoffen sowie transformierten körpereigenen Zellen, nach etwa 2 bis 6 Stunden, nachzuweisen, während die Wirkungen des antigenspezifischen Immunsystems erst nach 5-8 Tagen (zelluläre spezifische Immunität) oder gar nach Wochen (Antikörper) eintreten. Hierdurch wird zusätzliche Zeit gewonnen, um spezifische Abwehrreaktionen gegenüber den Antigenen aufzubauen, die durch die paramunisierenden Aktivitäten nicht neutralisiert werden konnten. Die paraspezifische Abwehr ermöglicht es daher dem Organismus, sich bei Konfrontation mit den unterschiedlichsten Fremdstoffen, Infektionserregern, Toxinen und transformierten körpereigenen Zellen sofort, d.h. ohne Zeitverlust zur Wehr zu setzen (Anton Mayr, „Paramunisierung: Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med., Aufl. 26(6): 256-261, 1997).
Die paraspezifische Immunabwehr ist somit ein physiologischer Vorgang und lässt sich als „primäre Barriere" bei der Auseinandersetzung mit einer schadstoffhaltigen Umwelt definieren. Diese Form der Abwehr ist nicht nur für die niederen Organismen, sondern insbesondere auch für die höher- und hochentwickelten Lebewesen unersetzlich. So zeigt sich, dass primäre kongenitale Defekte in diesem biologischen Abwehrsystem zu lebensbedrohenden Situationen führen können. Als Beispiel ist das „Chediak-Steinbrinck- Higashi-Syndrom" des Menschen zu nennen, das durch Granulozytendefekte und
Dysfunktionen der natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) charakterisiert ist und in den meisten
Fällen bis zur Vollendung des 10. Lebensjahrs zum Tode des Patienten fuhrt.
Der Zustand der Paramunität ist durch eine erhöhte Phagozytoserate, eine erhöhte Funktion der spontanen zellvermittelten Zytotoxizität (NK-Zellen) und eine erhöhte Aktivität sonstiger nicht antigenspezifischer lymphoretikulärer Zellen gekennzeichnet. Gleichzeitig kommt es zur Freisetzung bestimmter Zytokine, die sowohl mit den zellulären Elementen wie auch untereinander stimulierend und/oder supprimierend (z.B. über Repressormechanismen), d.h. optimal regulierend wirken. Dieses eng vernetzte und stufenweise reagierende biologische System der Paramunität mit seinen unterschiedlichen Akzeptor-, Effektor- und Zielzellen sowie den signalübertragenden molekularen Botenstoffen (Zytokinen) ist daneben intensiv mit dem Hormon- und Nervensystem, teilweise sogar mit dem Gefäß- und Stoffwechselsystem verbunden. Es ist damit ein wichtiger Bestandteil der Kommunikation, Interaktion und Regulation des Abwehrnetzwerkes, das bei jedem Organismus von Geburt an natürlicherweise vorhanden ist. Die Natur hat damit in angepasster Weise alle Organismen von Anfang an geschützt. In der Phylogenese entwickelt sich anfangs nur das paraspezifische, d.h. unspezifische Abwehrsystem. Erst im späteren Verlauf der Evolution bildet sich schrittweise das spezifische Immunsystem aus.
Die Einleitung einer medikamentösen Paramunität erfolgt durch Paramunisierung mit sogenannten Paramunitätsinducern. Eine medikamentöse Paramunisierung erreicht man durch Aktivierung der zellulären Elemente des paraspezifischen Teils des Immunsystems und der damit verbundenen Bildung von Zytokinen, mit dem Ziel, Dysfunktionen zu beseitigen, den Erreger- und Antigen-unspezifischen Schutz eines Individuums schnell zu erhöhen (optimale Bioregulation), eine durch Stressfolgen oder anderweitig (z.B. medikamentös) entstandene Immunsuppression oder Immunschwäche zu beseitigen, Defizite zu reparieren und/oder regulatorisch zwischen Immun-, Hormon- und Nervensystem zu wirken (Anton Mayr, „Paramunisierung: Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med., Aufl. 26(6): 256-261, 1997). Dies bedeutet, dass je nach Art der Paramunisierung und der Reaktionslage, wie zum Beispiel der Abwehrlage des Patienten, bestimmte unspezifische körpereigene Abwehrvorgänge gesteigert, ergänzt oder auch gedämpft werden können.
Der Paramunitätsinducer per se ist ein Protein, d.h. er ist weder mit einem Abwehrstoff, noch mit einer Chemikalie, einem Antibiotikum, Vitamin oder Hormon vergleichbar. Vielmehr aktiviert er wie ein Katalysator über einen stufenweisen Mechanismus das paraspezifische
Immunsystem, so dass dieses ausreichend zelluläre und humorale Abwehrmechanismen mobilisiert. Paramunitätsinducer wirken hierbei hinsichtlich der Immunabwehr sowohl regulierend als auch reparierend. Bezüglich der Wirkungsweise von Paramunitätsinducern ist bekannt, dass sie von phagozytierenden Zellen (Akzeptorzellen) aufgenommen werden, die dadurch aktiviert werden und Mediatoren, wie z.B. Zytokine, freisetzen, welche wiederum
Effektorzellen mobilisieren. Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen zweier oder mehrerer konventionell attenuierter Tierpockenviruskomponenten, die sich aus unterschiedlichen Tierpockenvirusstämmen mit paramunisierenden Eigenschaften ableiten, sind in der europäischen Patentschrift EP 0 669 133 Bl beschrieben.
Die diesen Paramunitätsinducern zugrunde liegenden Tierpockenvirusstämme sind auf konventionelle Weise attenuiert worden, d.h. sie liegen in einem reduzierten Zustand vor, bei dem die virulenten und vor allem die immunisierenden Eigenschaften des Virus abgeschwächt aber nicht vollständig verloren sind.
In der vorliegenden Erfindung wird erstmalig ein neues Verfahren vorgestellt, welches die Virulenz und Immunogenität von einfach attenuierten Tierpockenvirusstämmen vollständig eliminiert. Dieses Verfahren wird im folgenden als „Hochattenuierung" bezeichnet.
Eine solche Hochattenuierung von Poxviren wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal anhand der Orthopoxviren Kamelpockenvirus (Orthopoxvirus cameli) und Ektromelievirus (Orthopoxvirus muris), dem Leporipoxvirus Myxomatosevirus (Leporipoxvirus myxomatosis), den Avipoxviren Hühnerpockenvirus (Avipoxvirus gallinae) und Kanarienpockenvirus (Avipoxvirus serinis) sowie dem Parapockenvirus Ecthyma (Parapoxvirus ovis) gezeigt.
Beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Hochattenuierung des Orthopoxvirusstammes. Kamelpockenvirus Stamm h-M 27 und des Leporipoxvirusstammes Myxomatosevirus Stamm h-M 2. Für diese Poxvirusstämme wurde bislang weder eine Attenuierung_noch eine Hochattenuierung durchgeführt oder beschrieben. Andere bevorzugte Ausführungsformen betreffen weitere Orthopoxvirusstämme, sowie Stämme der Parapoxviren und Avipoxviren (siehe unten).
Eine einfache konventionelle Attenuierung wurde für das Genus Orthopoxvirus beim Vacciniavirus Ankara MVA durch A. Mayr, H. Stickl, H.K. Müller, K. Danner und H. Singer, 1978: „Der Pockenimpfstamm MVA", Zbl.Bakt.Hyg., I.Abt.Orig.B 167, 375-390; Mayr, A., 1999: „Geschichtlicher Überblick über die Menschenpocken (Variola), die Eradikation von Variola und den attenuierten Pockenstamm MVA", Berl.Münch.TierärztlWschr. 1 12, 322- 328; für das Genus Avipoxvirus HPl und KPl durch A. Mayr, F. Hartwig, und I. Bayr, 1965: „Entwicklung eines Impfstoffes gegen die Kanarienpocken auf der Basis eines attenuierten Kanarienpockenkulturvirus", Zbl.Vet.Med.B 12, 41-49; A. Mayr und K. Malicki, 1966: „Attenuierung von virulentem Hühnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus", Zbl.Vet.Med. B 13, 1-13; und für das Genus Parapoxvirus ORF-1701 durch A. Mayr und M. Büttner, 1990: „Ecthyma (ORF) virus": In: Z. Dinter und B. Morein (Hrsg.): Virus infections of vertebrates, vol. 3; Virus infections of ruminants, Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam, gezeigt.
Im folgenden werden einige der durch das erfindungsgemäße Verfahren hochattenuierten Tierpockenvirusstämme näher erläutert:
Kamelpockenvirus
Die Kamelpocken sind die Erreger einer gefährlichen, zyklisch-systemisch verlaufenden Viruserkrankung der Kameliden, die durch ein Exanthem bevorzugt der Haut und Schleimhaut im Kopf-, Nacken- und Halsbereich sowie den Extremitäten und der Inguinalgegend charakterisiert ist (Münz, E., 1999: „Pox and pox-like diseases in cameis", Proc.lst Int. Camel Conf. 1, 43-46). Die Erkrankung tritt in zyklischer Weise alle 2 bis 3 Jahre auf, wenn eine genügend große sensible Population vorhanden ist. Von den Kamelpockenviren werden bevorzugt zwei Gattungen (Lama und Camelus) der Familie Camelidae befallen (Mayr, A. and Czerny C. P., 1990: „Camelpox virus", In: Dinter Z. und Morein B. (Hrsg.): „Virus infections of vertebrates", vol. 3: Virus infections of ruminants. Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam). Die Gattung Camelus umfasst das einhöckrige Dromedar {Camelus dromedarius) und das zweihöckrige Trampeltier {Camelus ferus bactrianus). Dromedare und Trampeltiere kommen hauptsächlich in den Ländern der sogenannten „Alten Welt" vor (Wüsten, Steppen von Nordafrika, Arabien, Mongolei), während das Lama bevorzugt in Südamerika beheimatet ist.
Das Kamelpockenvirus {Orthopoxvirus camelϊ) ist ein besonders enger Verwandter des Variola- Virus, dem Erreger der Pocken beim Menschen (Variola). Für den Menschen ist das Kamelpockenvirus nicht pathogen. Das Kamelpockenvirus ist wie alle klassischen Pockenviren quaderförmig und besitzt charakteristische Oberflächenproteine, die für die immunisierenden und paramunisierenden Eigenschaften des Virus bzw. dessen Bestandteile verantwortlich sind. Die durchschnittliche Größe beträgt je nach Genus bzw. Stamm in Längsrichtung 280 nm und in Querrichtung etwa 180 nm (Otterbein, CK., 1994: „Phäno- und genotypische Untersuchungen zweier Kamelpockenvirus-Isolate vor und nach Attenuierung durch Zellkulturpassagen", Vet.Med.Diss. München). Das Genom des Kamelpockenvirus besteht aus einer linearen, doppelsträngigen DNA. Die beiden DNA-Stränge sind an den Genom-Enden kovalent miteinander gebunden, so dass die Virus-DNA eine durchgehende Polynukleotidkette bildet.
Mvxomatosevirus
Myxomaviren sind die Erreger der Myxomatose, einer zyklisch verlaufenden, kontagiösen Virusallgemeinkrankheit der Wild- und Hauskaninchen, die durch generalisierte, teilweise hämorrhagische Unterhautödeme am Kopf und über den ganzen Körper, mit Bevorzugung der Analgegend, der Vulva und des Schlauches, wie keine andere Infektionskrankheit charakterisiert ist. Wird die Myxomatose in ein bisher seuchenfreies Land neu eingeschleppt, verläuft sie rasch und tödlich. Nach Sesshaftwerden des Virus verändert sich der Seuchencharakter bis hin zu klinisch inapparenten Infektionen (Mayr A.: Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, 7. Aufl., Erike- Verlag, Stuttgart, 2002).
Die Krankheit ist unter amerikanischen Baumwollschwanzkaninchen der Gattung Sylvilagus, die ausschließlich die neue Welt besiedeln, weit verbreitet. Diese Wildkaninchen bilden das einzige natürliche Reservoir der Seuche. Die Infektion verläuft bei ihnen in einer milden Form. Dagegen besitzt die Erkrankung bei europäischen Wild- und Hauskaninchen der Gattung Oryctolagus, die auch in Australien heimisch sind, eine fast 100%ige Sterblichkeit bei Neueinschleppung des Erregers.
Das natürliche Wirtsspektrum des Myxomavirus (Genus Leporipoxvirus) ist eng begrenzt. Im Allgemeinen vermehrt sich das Virus nur in amerikanischen Baumwollschwanzkaninchen und in europäischen Haus- und Wildkaninchen. Vereinzelt wurden allerdings auch Infektionen in europäischen Wildhasen beobachtet. Übertragungsversuche auf andere Tierarten und auf den Menschen verliefen negativ.
Avipoxyirus
Die durch Avipoxviren, insbesondere das Hühnerpockenvirus und das Kanarienpockenvirus, verursachten Infektionen verlaufen ähnlich. Hühnerpocken stammen aus Asien und sind seit Jahrtausenden bekannt. Sie sind weltweit verbreitet und sehr widerstandsfähig. Die Übertragung erfolgt durch das Eindringen über Hautverletzungen. Es können auch stechende Insekten an der Übertragung beteiligt sein. Die Inkubationszeit für die Krankheit beträgt 4 bis 14 Tage. Es gibt zwei Verlaufsformen, wobei zwischen der sogenannten Hautform und der Schleimhautform unterschieden wird. Die Hautform ist durch Bläschen oder schorfige Knoten an Kopf, Kamm, Hals und Füßen charakterisiert. Die Schleimhautform weist gelblich- weiße Beläge auf der Zunge, den Schleimhäuten des Schnabels, des Kehlkopfes, der Luftröhre und den Augen auf.
Die Inkubationszeit bei einer Infektion mit Kanarienpockenviren beträgt 3 bis 16 Tage. Nach Ausbruch der Krankheit stirbt ein Großteil des Bestandes innerhalb von nur wenigen Stunden ab. Die infizierten Tiere zeigen Knötchen an den Hornteilen und an den Schnabelwinkeln. Es kommt zu massiven Atemstörungen und die Vögel ersticken recht schnell an den durch das Virus verursachten käsigen Auflagerungen in den Atemwegen.
Attenuierte Stämme von Avipoxviren wurden durch sukzessive Passagen in Zellkulturen aus Hühnerembryo-Fibroblasten gewonnen und zur Vakzinierung von Hühner eingesetzt. Der am besten untersuchte und verfügbare Stamm ist der Stamm HP-I (A. Mayr und K. Malicki, 1966: „Attenuierung von virulentem Hühnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus", Zbl.Vet.Med. B 13, 1-13). Mehr als 200 Passagen in Hühnerembryo- Fibroblasten fuhren zu einem attenuierten aber noch replizierfähigen Virus, jedoch mit verbleibender Pathogenität für Hühner bei intravenöser oder Aersol-Verabreichung. Viren die mehr als 400 mal passagiert wurden gelten als apathogen und werden als effziente und extrem sichere Vektoren für den Einsatz in Säugetieren angesehen. Eine Immunisierung konnte erreicht werden, ohne dass eine vollständige produktive Replikation des Virus stattfand.
Aufgabe der Erfindung
Die bislang durch eine konventionelle Attenuierung abgeschwächten Tierpockenvirusstämme fuhren zu einer Steigerung der paramunisierenden Eigenschaften und zu einer Verringerung der virulenten bzw. immunisierenden Eigenschaften der Viren bzw. deren Bestandteilen. Allerdings gehen bei der konventionellen Attenuierung nicht alle virulenten und immunisierenden Eigenschafen der Tierpockenstämme verloren. Immunreaktionen sind bei einfach attenuierten Tierpockenstämmen in Säugetieren noch immer vorhanden. Dies liegt vermutlich an der zu geringen Stabilität einer einfachen Attenuierung bzw. dem zu geringen Grad der Attenuierung bei den einfach attenuierten Tierpockenviren. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde Tierpockenstämme bereitzustellen, die stabil sind, einen hohen Attenuierungsgrad aufweisen und bei denen die Pockenviren derart verändert sind, dass sie ihre virulenten und immunisierenden Eigenschaften vollständig verloren haben und somit als unschädliche Paramunitätsinducer und Vektor- Vakzinen verwendbar sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Gegenstände der anhängenden Patentansprüche gelöst.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass einfach attenuierte Tierpockenstämme durch zusätzliche Attenuierungsschritte mit fortführenden Plaque-Endverdünnungs-Passagen in ausgewählten permissiven Zellkulturen derart verändert werden, dass sie ihre Virulenz und Immunisierungsfähigkeit vollständig verlieren, ohne in ihrer Vermehrungsfähigkeit beeinträchtigt zu sein. Auch sind die erfindungsgemäßen Tierpockenstämme in ihrem Wirtsspektrum weiter eingeschränkt. Die durch die Hochattenuierung entstehenden Deletionen im Virusgenom ermöglichen zudem die Einführung von Fremd-Antigenen.
Durch den durch die Hochattenuierung verursachten Verlust der immunisierenden Proteine werden zusätzliche paramunisiernde Proteine aktiv, welche die paramunisierende Wirksamkeit dieser Stämme in signifikanter Weise erhöhen. Auf diese Weise erhält man hoch wirksame und unschädliche Paramunitätsinducer, die auch bei kurzfristig wiederholten und häufigen Applikationen keine Allergien oder andere immunpathogenen Nebenwirkungen verursachen.
Daher eignen sich die durch das erfindungsgemäße Verfahren hochattenuierten Tierpockenstämme in hervorragender Weise als Paramunitätsinducer oder für die Herstellung von Vektor-Vakzinen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG Die Erfindung betrifft hochattenuierte Tierpockenvirusstämmen und ihre Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen.
Besondere Ausführungsformen der hochattenuierten Tierpockenstämme sind Stämme des Myxomatose- und des Kamelpockenvirus. Besonders bevorzugt ist der Kamelpockenvirusstamm h-M 27 mit der Hinterlegungsnummer 05040602 und der Myxomatosevirusstamm h-M 2 mit der Hinterlegungsnummer 05040601. Die Hinterlegung der Viren erfolgte bei der Hinterlegungsstelle der Public Health Laboratory Service (PHLS), Centre for Applied Microbiology & Research (CAMR), European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom. Andere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Hochattenuierung des Kanarienpockenvirus (Avipoxvirus serinae), bevorzugt des Stammes KPl, des Ektromelievirus (Orthopoxvirus muris), bevorzugt des Stammes Mü 1 und des Hühnerpockenvirus (Avipoxvirus gallinae), bevorzugt des Stammes HPl und des Parapoxvirus (Parapoxvirus ovis).
Bei der erfindungsgemäß entdeckten Hochattenuierung von Tierpockenvirusstämmen gehen die Virulenz der Virusstämme und ihre immunisierenden Eigenschaften im Vergleich zu konventionell attenuierten Tierpockenstämmen vollständig verloren. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren besitzen daher keine Rest- Virulenz oder -Immunität mehr. Somit eignen sich die hochattenuierten Tierpockenstämme insbesondere für die Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen hochattenuierten Pockenvirusstämme. Bevorzugte Pockenvirusstämme sind Stämme, die dem Genus Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Leporipoxvirus und Parapoxvirus angehören.
Die Hochattenuierung von Pockenvirusstämmen wird erfindungsgemäß durch zusätzliche Plaque-Endverdünnungs-Passagen (d.h. Überimpfen und Weiterführen) von konventionell attenuierten Virusstämmen in optimierten, ausgewählten, permanenten Zelllinien (z.B. VERO-Zellen), in primären Zellkulturen (z.B. Hühnerembryofϊbroblasten (FHE)- Zellkulturen), bebrüteten Hühnereiern oder in Versuchstieren erreicht. Es wurde überraschend festgestellt, dass durch diese zusätzliche Passagierung die Virulenz und Immunogenität der Tierpockenviren und deren Bestandteile im Vergleich zu konventionell attenuierten Stämmen verloren geht. Die Passagierung in den ausgewählten Zellsystemen oder -kulturen erfolgt so lange, bis die erwünschten Eigenschaften erreicht sind, d.h. bis die Tierpockenviren keinerlei Virulenz oder Immunogenität mehr aufweisen und stattdessen eine gesteigerte Aktivität des unspezifischen Immunsystems (Paramunität) aufweisen. Gewöhnlich lässt sich dies durch mindestens 300-500 Passagen in optimierten Zellsystemen, wie Zellkulturen von VERO- Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) erreichen. Solche optimierten Zellsysteme ergeben den erforderlich hohen Infektiositätstiter. Die weiteren erwünschten biologischen, genetischen und immunologischen Eigenschaften die aus einer Hochattenuierung von Tierpockenstämmen hervorgehen sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Allgemein lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von hochattenuierten Tierpockenviren durch folgende Schritte definieren:
(a) Adaption der Tierpocken auf ein permissives Zellsystem beispielsweise bestehend aus der Chorioallantoismembran 10 Tage alter Hühnerembryonen (CAM) oder Zellkulturen, z.B. Lammnierenzellkulturen; (b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch
Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale
Infektiositätstiter ermöglichen, insbesondere AVIVER- oder VERO-Zellen;
(c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300, z.B. 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220,
225, 230, 235, 240 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295 oder 300
Passagen, vorzugsweise in VERO-, AVIVER- oder MA-Zellen, wobei es bevorzugt ist, dass das in (c) verwendete Zellsystem sich von dem in (b) verwendeten Zellsystem unterscheidet; (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90, z.B. 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300 oder mehr Passagen, vorzugsweise Plaque- Endverdünnungs-Passagen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der hochattenuierte Orthopoxvirusstamm ein hochattenuiertes Kamelpockenvirus {Orthopoxvirus camelϊ), insbesondere der Stamm h- M 27. Ein bevorzugtes Verfahren zur Hochattenuierung von Kamelpockenviren umfasst die folgenden Schritte: (a) Kultivierung des isolierten Kamelpockenvirus über etwa 2 bis 4 Passagen in
Lammnieren-Zellkulturen;
(b) Überimpfen und Kultivierung der Tierpockenviren über etwa 5 bis 10 Passagen in VERO-Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection); (c) Überimpfen und Kultivierung der Tierpockenviren über etwa 114 bis etwa 150 Passagen in MA-Zellen;
(d) Überimpfen und Kultivierung der Tierpockenviren über etwa weitere 267 oder mehr, z.B. 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 oder mehr Passagen in VERO-
Zellen, vorzugsweise Plaque-Endverdünnungs-Passagen.
Die so erzeugten Tierpockenviren sind zur Herstellung von Paramunitätsinducern und Vektor- Vakzinen einsetzbar. Für die Herstellung von wird die vermehrungsfähige Virusernte verwendet.
Eine weitere Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft den hochattenuierten Leporipoxvirusstamm Myxomatosevirus {Leporipoxvirus myxomatosis), Stamm h-M 2.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Hochattenuierung eines solchen Myxomatosevirusstammes, bevorzugt des Stammes h-M 2, umfasst die folgenden Schritte:
(a) Isolierung aus erkrankten Tieren über die Chorioallantoismembran 10 Tage alter Hühnerembryonen (CAM) und Weiterführung in diesem System über mindestens 2 oder mehr, z.B. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 oder mehr Passagen; (b) Überimpfung und Weiterführung der isolierten Tierpockenviren für mindestens 120 oder mehr, z.B. 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180 oder mehr Passagen in VERO-Zellkulturen; (c) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren in AVIVER-Zellen für mindestens 24 oder mehr, z.B. 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 oder mehr Passagen; (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 157 bis 200 Passagen: e) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in MA-Zellen über mindestens 114 bis 150 Passagen; f) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren in VERO-Zellen über mindestens 179 Passagen.
Zur Herstellung von Paramunitätsinducern werden die Virusernten durch Behandlung mit beta-Propiolacton inaktiviert. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen oder mehre hochattenuierte Pockenstämme unterschiedlicher Herkunft in Kombination enthalten und denen gegebenenfalls ein pharmazeutischer Träger zugesetzt wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Verwendung eines oder mehrerer erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenstämme (z.B. in Kombination) oder Bestandteilen der hochattenuierten Tierpockenstämme zur Aktivierung des paraspezifischen Immunsystems in einem Säugetier oder im Menschen zur Prophylaxe und Therapie.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die hochattenuierten Tierpockenviren zur Herstellung von Vektor-Vakzinen eingesetzt, hierfür werden die vermehrungsfähigen Virusernten verwendet. Eine für ein Fremdantigen kodierende Nukleinsäure wird dabei in eine der durch die Hochattenuierung entstandenen Deletionen der Nukleinsäure des Vektors (Tierpockenvirus) eingebaut, so dass das Fremd-Gen durch den Vektor exprimiert werden kann. Die so entstandenen Fremdproteine stellen immunisierende Epitope bereit und stimulieren dadurch das körpereigene spezifische Abwehrsystem.
DEFINITIONEN
Unter dem Begriff „Attenuierung" (engl, „attenuate": abschwächen, mildern) eines Infektionserregers (z.B. Viren, Bakterien, Pilze) versteht man grundsätzlich die Verminderung seiner virulenten und immunisierenden Eigenschaften. Insbesondere handelt es sich, je nach Attenuierungsgrad, gentechnologisch um die Reduktion des Molekulargewichtes und damit die Verkürzung seiner Nukleinsäure, verbunden mit dem Auftreten von Deletionen, biologisch um die Reduzierung bzw. um den Verlust seiner pathogenen Eigenschaften bezüglich Virulenz und Kontagiosität, immunologisch um den Verlust der immunogenen Aktivitäten und die Erhöhung der paraspezifischen Potenzen sowie klinisch um die Einschränkung des Wirtsspektrum und um eine erhöhte Aktivität von paraspezifischen Abwehrreaktionen des Wirtes.
Unter „Hochattenuierung" versteht man die weitere Reduzierung von einfach attenuierten aber noch teilweise virulenten und immunisierenden Erregern, bis zu einem vollständigen Verlust der Virulenz und des immunisierende Potentials, wobei es durch die Hochattenuierung zu einer extremen Einengung des Wirtsspektrums kommt. Durch die Hochattenuierung wird das paramunisierende Potential stark erhöht. Bezüglich einer Reaktivierung ihrer verlorengegangenen virulenten und immunisierenden Eigenschaften sind die hochattenuierten Poxviren stabiler als konventionell attenuierte Stämme, d.h. eine Rückwandlung ist nicht möglich.
Die hochattenuierten Tierpockenstämme unterscheiden sich von den konventionell attenuierten Tierpockenstämmen gentechnologisch durch eine weitere Abnahme des Molekulargewichtes der Virusnukleinsäure und der Zunahme von Deletionen in der Nukleinsäure; biologisch durch den vollständigen Verlust der Virulenz und Kontagiosität, wobei diese Stämme gleichzeitig im permissiven Wirtssystem einen optimalen und im Vergleich zu konventionell attenuierten Stämmen hohe Infektiositätstiter erreichen; immunologisch durch den totalen Verlust der Immunogenität, und molekularbiologisch durch den Verlust von Zytokinrezeptoren, z.B. Rezeptoren für Interferon und bestimmte Interleukine.
Die Begriffe „Virulenz" und „virulente Eigenschaften" werden in der vorliegenden Erfindung synonym verwendet. Virulenz bezeichnet den Grad der krankmachenden Eigenschaften eines bestimmten Stammes aus einer pathogenen Erregerart in einem bestimmten Wirt unter definierten Infektionsbedingungen. Der Virulenzgrad kann innerhalb der Stämme einer Art erheblich schwanken. Man unterscheidet stark, schwach und nicht virulente (avirulente) Stämme. Werden Wirt und Umweltbedingungen geändert, kann sich die Virulenz des Stammes gleichfalls verändern, sie kann aber auch unverändert bleiben. So können die Abwehrkräfte des Wirts, die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten der Wirtsflora, die Umwelttemperatur, die Luftfeuchtigkeit usw. synergistisch oder antagonistisch Jede an und für sich pathogene Erregerart kommt in der Natur in zahlreichen Stämmen unterschiedlicher Virulenz vor. Das Vorliegen von Virulenz bzw. der Verlust der Virulenz kann in dem Fachmann bekannten und für das jeweilige Tierpockenvirus einschlägige Testsystem evaluiert werden. Die Tierpockenviren der vorliegenden Erfindung zeigen insbesondere keinerlei Virulenz in menschlichen Wirten.
Der Begriff „Pathogenität" (pathos = Leiden) bezeichnet die Eigenschaft eines Infektionserregers oder metazoischen Parasiten, nach dem Eindringen, dem Haften und der identischen Vermehrung in einem Wirt zu einer lokalen oder allgemeine Störung des Leistungsvermögens (functio laesa) zu führen und eine Infektionskrankheit erzeugen zu können. Da das Entstehen einer Infektionskrankheit vom Erreger und Wirt abhängt, betrifft der Pathogenitätsbegriff nicht allein den Erreger, sondern das Erreger-Wirts-System. Die Pathogenität ist auf die Art (Spezies) eines Erregers bezogen, nicht auf eine Variante, einen Stamm oder eine Kolonie. Sie ist eine Grundeigenschaf, eine Potenz, die wirken kann, aber nicht muss. Eine pathogene Art, bezogen auf ein bestimmtes Erreger- Wirts-System, kann in der Natur nicht apathogen werden, da diese Grundfähigkeit einer ganzen Art nicht verloren geht.
Die Begriffe „Immunogenität" und „immunisierende Eigenschaften" werden in der vorliegenden Erfindung synonym verwendet. Immunogenität eines Tierpockenvirus bezeichnet die Fähigkeit des Tierpockenvirus in einem Wirbeltier vorzugsweise im natürlichen Wirt des Virus oder im Menschen eine zelluläre spezifische und/oder humorale Immunantwort auszulösen, z.B. T-Zellproliferation und/oder die Erzeugung von Antikörpern anzuregen. Der Verlust der Immunogenität der hochattenuierten Tierpockenstämme der vorliegenden Erfindung geht mit dem Verlust dieser Fähigkeit einher. Die Immunogenität bzw. der Verlust dieser kann in Testsystem untersucht werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Unter „Vektor-Vakzinen" (rekombinierte Vakzine, Hybridvakzine) versteht man Impfstoffe, die aus zwei Komponenten bestehen: einen mikrobiellen Träger (Vektor) und einem immunisierendes Antigen, dessen kodierende Nukleinsäure in den Vektor eingebaut wird. Als mikrobielle Träger eignen sich wegen ihrer zahlreichen Nukleinsäure-Deletionen und ihrer paramunisierenden Eigenschaften bevorzugt (hoch-)attenuierte Tierpockenviren. Die eingeführte Fremdgen-Nukleinsäure wird im Impfling durch den Vektor zur Expression gebracht, was zur Bildung von spezifisch immunisierenden Reaktionen führt.
Als „Paramunitätsinducer" (paraspezifische Vakzine) bezeichnet man bioregulative Präparate aus attenuierten, avirulenten und inaktivierten Tierpockenviren, die je nach Attenuierungsgrad nur noch Reste von (konventionell attenuiert) bzw. keine (hochattenuiert) immunisierenden
Eigenschaften enthalten und dazu bestimmt sind, bei Mensch und Tier zur Paramunisierung angewendet zu werden. Sie werden wie die klassischen spezifischen Impfstoffe hergestellt und gleichen ihnen auch funktionell, jedoch mit dem Unterschied, dass sie überwiegend die paraspezifischen (unspezifischen) Abwehrmechansimen aktivieren und dabei durch ihre bioregulierenden Eigenschaften zu einer Homöodynamik der Abwehrsysteme fuhren. DETALIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Allgemeines
Die Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass sich die Virulenz und die immunisierenden Eigenschaften von konventionell attenuierten Tierpockenvirusstämmen durch zusätzliche Plaque-Endverdünnungs-Passagen in permissiven Zellkulturen, bebrüteten Hühnereiern oder Versuchstieren bis zum völligen Verlust reduzieren lassen. Gegenüber einer potentiellen Reaktivierung dieser Eigenschaften sind derart hochattenuierte Stämme stabil. Dieser über eine einfache, konventionelle Attenuierung hinausgehende Prozess wird in der vorliegenden Erfindung als „Hochattenuierung" bezeichnet. Diese hochattenuierten Tierpockenvirusstämme sind gegenüber konventionell attenuierten Erregern deutlich verbessert. Insbesondere unterscheiden sich die hochattenuierten Tierpockenstämme, wie in Tabelle 3 zusammengefasst, von den konventionell attenuierten Tierpockenstämmen gentechnologisch durch die Abnahme des Molekulargewichtes der Virusnukleinsäure und der Zunahme von Deletionen in der Nukleinsäure; biologisch durch den Verlust der Virulenz und Kontagiosität; immunologisch durch den Verlust der Immunogenität, und molekularbiologisch durch den Verlust von Zytokinrezeptoren.
Unerwartet war die Entdeckung, dass sich sämtliche getesteten attenuierten Tierpockenstämme der Familie Poxviridae, gleichgültig welchem Genus sie angehören, konventionell attenuieren und anschließend mit einer hohen Stabilität weiter abschwächen lassen können (siehe Tabellen 1 und 2). Eine solche Hochattenuierung wird in dieser
Erfindung beispielhaft mit Vertretern der Genera Orthopoxviren, Leporipoxviren und
Avipoxviren gezeigt, wobei sie nicht auf diese Genera beschränkt zu sehen ist. Erstmals wird in der vorliegenden Erfindung auch eine Hochattenuierung mit einem Myxomatosevirus und einem Kamelpockenvirus beschrieben.
Experimentell kann man die Wandlungsfähigkeit von Infektionsserregern, sich gegebenen Umweltveränderungen, z.B. durch Vermehrung in Zellkulturen oder in nicht natürlichen Wirtssystemen anzupassen, nutzen, um den für eine Hochattenuierung notwendigen Zeitaufwand deutlich zu verkürzen. Dies gelingt bevorzugt durch Dauerpassagen in bestimmten permissiven Wirtssystemen, die normalerweise nicht zum natürlichen Wirtsspektrum gehören (z.B. Versuchstiere, Zellkulturen, Nährböden). Für eine Hochattenuierung von Pockenvirustämmen werden in der Regel etwa 15 bis 30 Jahre benötigt.
Hochattenuierte Poxvirusstämme verlieren durch das unten näher beschriebene Hochattenuierungsverfahren auch ihre spezifischen immunisierenden Kapazitäten während ihre paraspezifische Wirksamkeit gezielt verstärkt wird. Daher eignen sich die hochattenuierten Poxvirusstämme als Paramunitätsinducer oder für die Herstellung von Vektor- Vakzinen.
Die Verstärkung der paraspezifischen Eigenschaften ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass immunisierende und paramunisierende Proteine von Tierpockenviren miteinander interferieren. Durch den durch die Hochattenuierung verursachten Verlust der immunisierenden Proteine werden zusätzliche paramunisiernde Proteine aktiv, welche die paramunisierende Wirksamkeit dieser Stämme in signifikanter Weise erhöhen. Auf diese Weise erhält man hoch wirksame und unschädliche Paramunitätsinducer, die auch bei kurzfristig wiederholten und häufigen Applikationen keine Allergien oder andere immunpathogenen Nebenwirkungen verursachen.
In der Regel führt eine einfache, konventionelle Attenuierung zur Abnahme der Virulenz und der Kontagiosität sowie zur Einengung des Wirtsspektrums und zu geringen Veränderungen im Erreger-Genom bei gleichzeitiger Abnahme des Molekulargewichtes und dem Auftreten von Deletionen in den terminalen Bereichen des Virusgenoms. Daneben kommt es zu einer
Abnahme der spezifisch immunisierenden Aktivitäten und zu einer Zunahme der paraspezifischen Wirksamkeit. Bei einer Hochattenuierung verstärken sich diese Effekte allerdings drastisch, so dass die erhaltenen hochattenuierten Viren bezüglich ihrer Stabilität, ihrer Wirtsspezifität, der fehlenden Virulenz und Immunogenität den konventionell attenuierten Viren überlegen sind (Tabellen 3 und 4).
Die hochattenuierten Tierpokenviren In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein hochattenuiertes Tierpockenvirus basierend auf einem Tierpockenvirusstamm der Familie Poxviridae, dadurch gekennzeichnet, dass das Tierpockenvirus keine virulenten und immunisierenden Eigenschaften mehr besitzt und das hochattenuierte Tierpockenvirus ein geringeres Molekulargewicht der Virusnukleinsäure, häufigere Deletionen im terminalen Bereich und einen vermehrten Verlust von Zytokinrezeptoren im Vergleich zu konventionell attenuierten Tierpockenstämmen aufweist. Bekannte attenuierte Tierpockenviren weisen zwischen 0 und 3 Deletionen in einem oder beiden terminalen Bereichen des Virusgenoms auf. Die Anzahl der Deletionen in verschiedenen Stämmen lediglich attenuierter Tierpockenviren variiert jedoch, so dass die hochattenuirten Tierpockenviren der vorliegenden Erfindung zusammengenommen wischen 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Deletionen in den terminalen Bereichen des Virusgenoms aufweisen, als die im lediglich attenuierten Tierpockenviren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die hochattenuierten Tierpockenviren der vorliegenden Erfindung insgesamt 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Deletionen in den terminalen Bereichen auf. weisen vorzugsweise Häufigere Deletionen, vorzugsweise mindestens 2 Deletionen im rechten und mindestens 2 Deletionen im linken Bereich.
In einer bevorzugten Ausführungsform des hochattenuierten Tierpockenvirus der vorliegenden Erfindung weist das Virusgenom einen Verlust von Zytokinrezeptoren für Interferon α und γ auf. Es ist besonders bevorzugt, dass das Tiepockenvirus darüber hinaus auch einen Verlust der Rezeptoren für IL-I ß und/oder TH 1 -Zellen aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Virusgenom des Tierpockenvirus um 16%, 17%, 18%, 19% und besonders bevorzugt um etwa 20% kleiner ist als das Virusgenom des Wildtyps. Vorzugsweise liegen die Deletionen in einem oder beiden terminalen Bereichen des Tierpockenvirusgenoms .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das hochattenuierte Tierpockenvirus der vorliegenden Erfindung durch folgendes Verfahren erhältlich ist:
(a) Adaption der Tierpocken in einem permissiven Zellsystem oder Zellkulturen, insbesondere Lammnierenzellen oder CAM-Zellen;
(b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen, z.B. in VERO-Zellen, insbesondere für etwa 5 bis 10 Passagen; im Falle von Myxomatoasevirus; werden vorzugsweise mindestens 100, vorzugsweise mindestens 110, mindestens 120, mindestens 130 oder mehr VERO-Zell-Passagen durchgeführt gefolgt von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 24 Zwischenpassagen in AVIVER-Zellkulturen und weiteren VERO-Zellpassagen;
(c) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren zur Attenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen, z.B. in MA-104-Zellen, VERO-Zellen oder
AVIVER-Zellen, insbesondere für 200 bis 300 Passagen; und
(d) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen, vorzugsweise für mindestens 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 oder mehr Passagen.
Vorzugsweise werden bei einem oder mehreren der Schritte (b), (c), oder (d) Plaque- gereinigte Passagen durchgeführt.
Das Verfahren der Hochattenuierung
Eine konventionelle Attenuierung (wie auch die ersten Schritte der Hochattenuierung) beginnt mit der Adaptierung von isolierten Tierpockenviren in homologen oder heterologen permissiven Zellsystemen, wie z.B. Zellkulturen, bebrüteten Hühnereiern oder in Versuchstieren. Darauf folgt eine Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen. Die zu jedem Virusstamm passenden permissiven Zellsysteme werden für jede Tierpockenvirusart spezifisch ausgewählt. Die Auswahl richtet sich nach dem Infektiösitätstiter der Viren in dem jeweiligen Zellsystem. Dabei wird das Zellsystem zur Passagierung ausgewählt, das für die jeweilige Virusart den höchsten Infektiösitätstiter ergibt. Eine solches Zellsystem, insbesondere Zelllinie kann der Fachmann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmen. Dies entspricht zugleich auch dem optimalen Virus- Titer. Die Attenuierung wird fortgeführt, indem die Tierpockenviren für etwa 100-300, insbesondere 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 oder 300 Passagen in diesen optimalen Zellsystemen weitergeführt werden. Darauf schließt sich eine Endphase an, die durch 3-5 Plaque-Endverdünnungspassagen gekennzeichnet ist. Dieses Material kann entsprechend der weiteren Verwendung weiterverarbeitet werden.
Alle hier beschriebenen Vertreter der Orthopox-, Leporipox- , Parapox- und Avipoxviren lassen sich auf konventionelle Weise attenuieren. Die anschließende Hochattenuierung erfolgte durch Fortführung der Passagen des einfach, konventionell attenuierten Virusstammes in homologen oder heterologen permissiven Wirtssystemen. Die Wahl des Wirtsystems ist wiederum abhängig von der Tierpockenart und wird nach den oben erwähnten Gesichtspunkten (Infektiositätstiter) ausgewählt. Eine Hochattenuierung erfolgt beispielsweise durch Fortführung der einfach atttenuierten Orthopoxviren in VERO-Zellen oder der einfach attenuierten Avipoxviren in embryonalen Hühnerembryofibroblasten (FHE)- Zellkulturen). Bevorzugt erfolgt eine Hochattenuierung von Poxviren (z.B. Ektromelievirus, Kamelpockenvirus) durch mindestens 60 bis 300 Passagen in Abhängigkeit des jeweiligen Virusstammes in VERO-Zellkulturen (beispielsweise 150 oder 260 Passagen). Der Stamm Leporipoxvirus myxomatosis wird durch etwa mindestens zusätzliche 150 bis 300 Passagen in MA- und VERO-Zellkulturen, bevorzugt 290 Passagen hochattenuiert. Der Stamm Avipoxvirus gallinae wird durch etwa 100 bis 150 zusätzliche Passagen, bevorzugt durch 98 Passagen, in FHE-Zellkulturen hochattenuiert. Der Parapoxvirusstamm wird durch weitere 100 bis 160, bevorzugt durch 164 Passagen hochattenuiert (Tabellen 3 und 4). Es ist bevorzugt, dass bei der Passagierung der Virusstämme (d.h. bei der Überführung und Animpfung) die sogenannten Plaque-Endverdünnungsmethode verwendet wird.
Im Allgemeinen werden für eine Hochattenuierung für das Genus Avipoxvirus primäre Hühnerembryofibroblastenkulturen (FHE) und für alle anderen Genera, wie Orthopoxvirus, Leporipoxvirus und Parapoxvirus permanente MA-104-Affennierenzellen (kurz: MA-Zellen) oder VERO-Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) u.a.m. verwendet. Für die Anzucht der MA- oder VERO-Zellkulturen wird vorzugsweise ein vollsynthetisches Medium eingesetzt, besonders bevorzugt ist das Medium MEM („minimal essential medium"), das 5% bis 20%, vorzugsweise 10% BMS (Serumersatzmedium) und 5% bis 20%, vorzugsweise 10% Lactalalbuminhydrolysat, enthält. Als Virusmedium wird nach dem Austausch mit dem Anzuchtmedium, vorzugsweise MEM-Medium, mit 5% bis 20%, vorzugsweise mit 10% Lactalalbuminhydrolysat, ohne BMS bzw. ohne fetales Kälberserum und ohne Antibiotika verwendet. Sämtliche Herstellungsverfahren werden vorzugsweise bei pH-Werten von 7,0 bis 8,0, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,25 durchgeführt. Virusernten mit Titer von 10s bis 108 TCIDso/ml, vorzugsweise von mindestens 107 5 TCID5o/ml, sind als Ausgangsmaterial für die Herstellung der hochattenuierten Tierpockenstämme bevorzugt. Die Vermehrung der Poxviren führt in VERO-Zellen zu einem typischen cytopathischen Effekt, der zur Zerstörung der infizierten Zellen führt (Lyse). Bei einer primären Impfdosis von ca. 10 MOI („multiplicity of infection") kommt es nach einer kurzen Abkugelungsphase (1-2 Tage) für etwa 3 Tage zu netzartigen Zellstrukturen und nach etwa 5 Tagen zur Lyse der Zellen.
Die aus der letzten Passagierung gewonnen Virusernten können entsprechend ihrer Verwendung weiter verarbeitet werden. Beispielsweise können die in den Viren enthaltenen Nukleinsäuren zur Herstellung von Vektor- Vakzinen rekombinant kloniert werden. Oder die hochattenuierten Virusernten können lyophilisiert werden und beispielsweise durch Zusatz von 2,5% Gelatine bei 4°C zur weiteren Verwendung, beispielsweise als Paramunitätsinducer aufbewahrt werden. Für medizinische und therapeutische Indikationen kann das Lyophilisat auf dessen Unschädlichkeit und Wirksamkeit überprüft werden.
Hochattenuierung von Orthopoxyiren
In einer bevorzugten Ausführungsform lassen sich die Orthopoxviren durch folgendes, beispielhaft mit Kamelpockenviren beschriebene Verfahren hochattenuieren:
Orthopoxyirus cameli, h-M 27 Kamelpockenviren, isoliert aus Pustelmaterial erkrankter Tiere, wie der Stamm M 27, werden in embryonale Lammnieren-Zellkulturen über etwa 2 Passagen angezüchtet. Die so gezüchteten Tierpockenviren werden durch eine geeignete Methode, bevorzugt durch die Plaque-Endverdünnungsmethode, in VERO-Zellen übertragen und dort für etwa 5 Passagen weitergeführt. Nach Passagierung in einer VERO-Zellkultur, wird die letzte Zellkulturpassage auf MA-Zellen (MA-104-Affennierenzellen) adaptiert und etwa 114 mal in Passagen weitergeführt. Die so erhaltene 121. Plaque-gereinigte MA-Passage (insgesamt 284 Passagen) hat sich als einfach attenuiert erwiesen. Bei Isolaten dieser Passage, d.h. bei einer einfachen Attenuierung, lässt sich bereits ein Rückgang der Virulenz für den homologen Wirt, eine Einengung des Wirtsspektrums, ein Anstieg des Infektiositätstiters, eine Abnahme der Riesenzellen beim cytopathischen Effekt in Zellkulturen und eine geringe Abnahme der spezifischen immunogenen Aktivitäten beobachten. Aufgrund der bei einer einfachen Attenuierung noch vorhandenen immunisierenden Eigenschaften der Tierpockenviren, eignen sich einfach attenuierte Kamelpockenviren auch für eine parenterale Impfung gegen Variola des Menschen oder als Impfstoff gegen Kamelpocken (O.-R. Kaaden, A. Walz, CP. Czerny and U. Wernery, 1992: „Progress in the development of a camelpox Vaccine", Proc.lth Int.Camel Conf, 1, 47-49).
Die Hochattenuierung des Kamelpockenvirusstamms M 27 kann durch Fortführung des attenuierten Stamms in VERO-Zellen erreicht werden. Hierzu müssen mindestens weitere 50- 150 Passagen, bevorzugt 100 Plaque-gereinigte VERO-Passagen durchgeführt werden. Ein auf diese Weise erhaltene hochattenuierte Kamelpockenvirus h-M 27 (h = hochattenuiert) erweist sich als äußerst stabil. Insgesamt sind also für die Herstellung des erfindungsgemäßen hochattenuierten Kamelpockenvirus etwa 384 Zellkulturpassagen notwendig. Die genaue Zahl der Passagen soll hierbei allerdings nicht als beschränkend aufgefasst werden. Der Fachmann wird erkennen, dass Modifikationen der hier beschriebenen Verfahren und der verwendeten Parameter insbesondere der Zellpassagenzahl oder Zelllinie zur Hochattenuierung eines Tierpockenvirusstamms innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene hochattenuierte Kamelpockenvirus, Stamm h-M 27, weist einen totalen Verlust der Virulenz und Kontagiosität für den homologen Wirt und einen hohen Infektiositätstiter in VERO-Zellen (107>25 KID50/ml) auf. Es ist daher besonders für die Verwendung als paraspezifisches Vakzin (Paramunitätsinducer) geeignet. Dabei kann der auf hochattenuierten Tierpockenviren basierende Paramunitätsinducer sowohl in vermehrungsfähiger als auch in inaktivierter Form verwendet werden. In inaktivierter Form wird das hochattenuierte Virus, wie unten beschrieben, mit Beta-Propiolacton behandelt (V. Fachinger, T. Schlapp, W. Strube, N. Schmeer and A. Saalmüller, 2000: „Pox-virus-induced immunostimulating effects on porcine leukocytes", J.Virology 74, 7943-7951; R. Förster, G. Wolf und A. Mayr, 1994: „Highly attenuated poxvirus induce fünctional priming of neutro- phils in vitro", Arch.Virol. 136, 219-226; Mayr A., 1999: „Paraspezifischen Vaccinen aus Pockenviren (Paramunitätsinducer): „Eine neue Art von Impfstoff, Ärztezschr. Naturheilverf. 40, 550-557; Mayr, A., 2000: „Paraspezifische Vaccine - Eine neue Art von Impfstoffen zur Regulation von Dysfunktionen in verschiedenen Körpersystemen", Erfahrungsheilkunde (EHK) 49, 591-598).
Bei einer einfachen Attenuierung ist die Genomlänge des Virus durch auftretende Deletionen bereits deutlich vermindert. Die Genomlänge des Ausgangsvirus (Wildtyp) beträgt etwa 193 900 bp, während die Genomlänge des attenuierten M 27-Stammes etwa 172 400 bp beträgt. Durch die konventionelle Attenuierung kommt es somit zu einem deutlichen Verlust von Nukleotiden in der DNA. Ein Restriktionsverdau mit dem Restriktionsenzym HindIII zeigt, dass im Genom vier Restriktionsfragmente weniger im Analysegel vorhanden sind (Otterbein CK., 1994, Vet.Med.Diss. München). Dabei befinden sich zwei Deletionen im rechten und zwei Deletionen im linken terminalen Abschnitt des Virusgenoms. Der zentrale, konservierte Bereich des Virusgenoms bleibt unverändert (C. Gubser, S. Hue, P. Kellam and G.L. Smith, 2004: „Poxvirus genomes: a phylogenetic analysis", J.Gen. Virol. 85, 105-117.) Die Länge des Virusgenoms verkürzte sich durch die Hochattenuierung weiter von 172 400 bp (attenuiertes Virus) auf 160 300 bp. Die Zahl der Deletionen stieg von 4 auf 5 (zwei im linken und 3 im rechten terminalen Abschnitt des Genoms), wobei der zentrale, konservierte Bereich des Virusgenoms stabil blieb. Weiter führte die Hochattenuierung zu einem Verlust von Interferon α- und γ- sowie weiteren Interleukin-Rezeptoren und überraschenderweise auch zu einer Aktivierung von hämatopoeti sehen Stammzellen.
Leporipoxyirus mvxomatosis, Mvxomatosevirus, h-M 2 In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde die Hochattenuierung mit dem Myxomatose- Virusstamm M 2 durchgeführt. Auch hier erfolgte eine Passagierung in CAM- Zellen, gefolgt von mehreren Passagen VERO- und AVIVER-Zellen und schließlich weitere Passagen in VERO-Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von Paramunitätsinducern aus hochattenuierten Myxoma- Viren die Schritte:
(a) Isolierung aus erkrankten Tieren über die Chorioallantoismembran 10 Tage alter Hühnerembryonen (CAM) und Weiterführung in diesem System über mindestens 2 oder mehr, z.B. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 oder mehr Passagen;
(b) Überimpfung und Weiterführung der isolierten Tierpockenviren für mindestens 120 oder mehr, z.B. 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180 oder mehr Passagen in VERO-Zellkulturen;
(c) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren in AVIVER-Zellen für mindestens 24 oder mehr, z.B. 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 oder mehr Passagen;
(d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 157 bis 200 Passagen: e) Überimpfiing und Weiterfuhrung der Tierpockenviren in MA-Zellen über mindestens 114 bis 150 Passagen;
f) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren in VERO-Zellen über mindestens 179 Passagen.
In einer weiteren Ausführungsform wurde das für die Attenuierung verwendete Myxomatosevirus aus der ödematösen Subkutis (linkes Ohr) eines in typischer Weise an Myxomatose erkrankten europäischen Wildkaninchens (Gattung Oryctolagus) das Myxomavirus über die Anzüchtung auf der Chorioallantoismembran (CAM) 10 Tage bebrüteter Hühnereier (VALO-Eier) isoliert und dreimal nach dem Verfahren von Herrlich et al. auf der CAM in Passagen adaptiert (Herrlich A., Mayr A. und Münz E.: „Die Pocken", 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Die dritte CAM-Passage wurde in einer 1. Stufe auf VERO-Zellen über 120 Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) adaptiert, in einer 2. Stufe durch 24 Zwischenpassagen in AVIVER-Zellkulturen vermehrt und in der 3. Phase in VERO-Zellen weitergezüchtet. Insgesamt sind etwa 300 Passagen mit dem Ziel der Attenuierung durchgeführt worden. Nach diesen kontinuierlichen Endverdünnungspassagen war das ursprünglich virulente Myxomavirus attenuiert.
Die Hochattenuierung des Myxomavirusstammes M 2 wird durch die Fortführung des attenuierten Stammes in VERO-Zellen erreicht. Hierzu hierzu müssen mindestens weitere 250 bis 350 Passagen, bevorzugt 300 Plaque-gereinigte Passagen in VERO-Zellen durchgeführt werden. Der auf diese Weise gewonnene Virusstamm Myxoma h-M 2 (h = hochattenuiert) erweist sich wie der hochattenuierte Kamelpockenstamm als äußerst stabil. Er weist ebenfalls einen totalen Verlust der Virulenz und Kontagiosität für den homologen Wirt, einen hohen Infektiositätstiter (1O6'75 KID50), völliger Verlust der Immunogenität, Erhöhung der paramunisierenden Wirksamkeit, weitere Einengung des Wirtsspektrums, weitere Deletionen im Genom und Verlust verschiedener Interferon und Interleukin-Rezeptoren auf.
Eigenschaften der hochattenuierten Orthopoxyiren
Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenstämme sind wie folgt charakterisiert:
1. erhöhte biologische Stabilität; 2. Verlust der Virulenz und Kontagiosität, auch für 2-3 Tage alte Babymäuse (parenteral, intraperitoneal);
3. Verlust der spezifischen Immunogenität nach parenteraler und intraperitonealer Applikation; 4. vollständige Einengung des Wirtsspektrums;
5. Erhöhung des Infektiositätstiters des attenuierten Virus in VERO-Zellen;
6. starke paramunisierende Wirksamkeit (vermehrungsfähig und inaktiviert);
7. Verkürzung der Genomlänge der attenuierten Tierpockenviren, entsprechende Abnahme des Molekulargewichtes; 8. Erhöhung der Zahl der Deletionen im terminalen Bereich;
9. Verlust des Interferon α- und γ-Rezeptors und anderer Interleukin-Rezeptoren;
10. Aktivierung der hämatopoetischen Stammzellen.
Die Zahl der Zellpassagen und der Zellarten, die für eine konventionelle Attenuierung im Vergleich zu einer Hochattenuierung notwendig sind, sind in der Tabelle 3 zusammengestellt. In der Regel sind für eine Hochattenuierung mehr als 100 bis etwa 300 Passagen in verschiedenen permissiven Wirtssystemen notwendig. Für die gesamte Attenuierung ist ein Zeitraum von ca. 15-30 Jahren erforderlich.
Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigt einen Überblick über die biologischen und gentechnologischen Unterschiede zwischen einer konventionellen Attenuierung und einer erfindungsgemäßen Hochattenuierung am Beispiel des Vacciniavirus, Stamm MVA. So treten gehäuft Deletionen in den terminalen Bereichen des Virusgenoms (inverted terminal repeat) auf und das Molekulargewicht ist aufgrund geringerer Basenpaaren reduziert. Bei hochattenuierten Tierpockenviren fehlt etwa 20% des Ursprungsgenoms (was sie deshalb auch als Vektor- Vakzine so attraktiv macht, siehe unten). Weiter findet man einen Verlust von Rezeptoren, z.B. für IL-I ß und TH 1 -Zellen und eine Verstärkung der NK-Zell-Aktivierung und der Bildung von haematopoetischen Stammzellen sowie eine weitere Einengung des Wirtsspektrums in Zellkulturen. Ferner ist Interferon α und γ, IL-I, 2, 6, 12, sowie GM-CSA, TNF verstärkt. Schließlich besitzen die hochattenuierten Tierpockenstämme keine spezifische Immunogenität, jedoch aber eine erhöhte Aktivität des unspezifischen Immunsystems (Paramunität). Eine Virulenz gegenüber Mensch oder Tier fehlt völlig. Weiterverarbeitung von hochattenuierten Parapoxyiren zu Paramunitätsinducern
Bei der Herstellung von Paramunitätsinducern aus hochattenuierten Pockenvirusstämmen kann eine Inaktivierung durch chemische Behandlung mit Beta-Propiolacton bei einer
Konzentration von 0,01%-l% Beta-Propiolacton durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist hierbei eine Konzentration von 0,05% Beta-Propiolacton. Idealerweise wird eine
Inaktivierung mit Beta-Propiolacton bei einem pH von 7,8 für etwa 1 Stunde bei 4° C unter
Rühren und anschließender Inkubation bei 37° C für etwa 4 Stunden und über Nacht bei
+4° C, durchgeführt. Eine Inaktivierung mit Beta-Propiolacton führt zu einem vollständigen
Verlust der immunisierenden Eigenschaften bei einem gleichzeitigen starken Anstieg der paraspezifischen Wirksamkeit.
Bei der Herstellung von Paramunitätsinducern erfolgt die Reinigung der hochattenuierten Viruspartikel vorzugsweise mittels Zentrifugation bei niedriger Umdrehungszahl (z.B. 1000 UpM). Nach der Zentrifugation kann 0,5-10% succinylierte Gelatine (z.B. Polygeline, erhältlich von z.B. Firma Hausmann, St. Gallen/Schweiz), vorzugsweise 5% succinylierte Gelatine zugesetzt werden. Das resultierende Gemisch kann anschließend in Portionen von z.B. 1.5 ml in entsprechenden sterilen Glasfläschchen oder Ampullen lyophilisiert und bei Bedarf mit destilliertem Wasser (Aqua dest.) aufgelöst werden. Ein Volumen von 0,5-2 ml, vorzugsweise von 1,0 ml, des mit Aqua dest. aufgelösten Lyophilisats entspricht einer Impfdosis für den Menschen bei intramuskulärer Applikation (siehe auch Mayr A. und Mayr. B.: „Von der Empirie zur Wissenschaft", Tierärztl. Umschau, Aufl. 57: 583-587, 2002). Das lyophilisierte Präparat kann bei Temperaturen von etwa +4°C bis +80C oder bei geringeren Temperaturen (z.B. -60°C) zeitlich unbegrenzt stabil gelagert werden.
Verwendung von hochattenuierten Tierpockenviren als Paramunitätsinducer
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von hochattenuierten Tierpockenvirusstämmen bzw. von Bestandteilen hochattenuierten Tierpockenstämme einzeln oder Kombinationen als Paramunitätsinducer. Beispiele sind vermehrungsfähige oder inaktivierte frisch isolierte Tierpockenviren, vermehrungsfähige oder inaktivierte rekombinante Tierpockenviren, die sich von frisch isolierten Tierpockenviren ableiten, Virushüllen, abgetrennte Hüllen sowie Spaltprodukte und aberrante Formen dieser Hüllen, einzelne native oder rekombinante Polypeptide oder Proteine, insbesondere Membran- und Oberflächenrezeptoren, die in isolierten Tierpockenviren vorkommen oder von einem genetisch modifizierten Pockenvirus oder einem Teil seiner genetischen Information rekombinant exprimiert werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es daher, verschiedene hochattenuierte Pockenstämme des gleichen oder eines anderen Genus zur Verwendung als Paramunitätsinducer zu kombinieren.
Wegen ihrer optimalen paramunisierende Eigenschaften eignen sich die hochattenuierten Tierpockenviren für folgende prophylaktische oder therapeutische Indikationen bei Mensch und Tier:
Multifaktorielle infektiöse Faktorenkrankheiten und Mischinfektionen, chronische
Manifestationen infektiöser Prozesse, hartnäckig rezidivierende Infektionen sowie chemotherapieresistente, bakterielle und virale Infektionen;
Abwehrschwächen beziehungsweise Dysregulationen im Abwehrsystem eines Organismus; neonatale Infektionsbedrohung; adjuvante Therapie bei bestimmten Tumorkrankheiten, z.B. Verhütung der
Metastasierung, Minderung von Nebenwirkungen durch Chemo- und Strahlentherapie;
Verbesserung der Wundheilung, Vermeidung von Sekundärinfektionen nach chirurgischen Eingriffen bzw. durch Verletzungen;
Regulierung der Homöostase zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel-, Gefäß- und
Nervensystem.
Durch die sofort einsetzende paramunisierende Wirkung, fordern die hochattenuierten Tierpockenviren die Unschädlichkeit gegenüber Erregern, wodurch Stresssymptome, latente Infektionen, Fieber, ein verminderter Allgemeinzustand u.a. Faktoren, die eine Impfung belasten können, neutralisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Paramunitätsinducer auf der Basis von hochattenuierten Tierpockenstämme eignen sich somit zur Induktion des paraspezifischen Immunsystems und/oder zur Prophylaxe bzw. Behandlung von Defekten oder multikausale Infektionskrankheiten. Beispiele solcher Krankheiten sind Dysfunktionen des Immunsystem, Immunsuppression, Immunschwäche-Erkrankungen, Dysfunktionen der Homöostase zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel- und Nervensystem, neonatale Infektionsbedrohung, Tumorerkrankungen, Viruserkrankungen, bakterielle Erkrankungen, therapieresistente infektiöse Faktorenkrankheiten, virale und bakterielle Mischinfektionen, chronische Manifestationen infektiöser Prozesse, Leberkrankheiten unterschiedlicher Genese, chronische Hautkrankheiten, Herpeskrankheiten, chronische Hepatididen, grippale Infekte, Endotoxinschäden, Verbesserung der Wundheilung mit Verhütung von Sekundärinfektionen.
Eine Applikation der hier beschriebenen hochattenuierten Tierpockenstämme kann lokal oder parenteral erfolgen. Die lokale Verabreichung von Paramunitätsinducern stimuliert speziell die paraspezifischen Abwehrmechanismen in den Schleimhäuten und in der Haut. Daneben kommt es aber auch zu einer gewissen systemischen Wirkung. Dagegen beeinflussen parenteral angewendete Paramunisierungen die lokalen Abwehrmechanismen in der Haut und der Schleimhaut kaum. Bevorzugt ist hierbei eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenstämme und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Ein solches Trägermittel oder Zusatzstoffe sind z.B. Polyethylenglycol, Dextrose, Sorbit, Mannit, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Magnesiumstearat, Carboxylpolymethylen, Carboxylmethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylacetat.
Verwendung von hochattenuierten Tierpockenviren als Vektor- Vakzine
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der hochattenuierten Pockenvirusstämme zur Herstellung von Vektor-Vakzinen (Übersicht: Pastoret, P. -P. und Vanderplasschen, A., 2003). Im Vergleich zu konventionell attenuierten Stämmen eignen sich hochattenuierte Tierpockenvirusstämme noch besser als Vektoren für die Herstellung von Vektor-Vakzinen, da sie vollständig ihre immunisierende Eigenschaften durch die Hochattenuierung verloren haben. Da die Viren aufgrund ihres Infektiositätstiter passagiert werden, befinden sich die Deletionen in Bereichen, die für die Virusreplikation nicht erforderlich ist. Durch die im Vergleich zur konventionellen Attenuierung noch größer ausfallenden Deletionen in den terminalen Bereichen des Virusgenoms, bieten die hochattenuierten Tierpockenviren genügend Raum zur Insertion einer zu exprimierenden Fremd-Nukleinsäure (DNA) bzw. eines Fremd-Immunogens.
Die Fremd-Nukleinsäure kann für ein Peptid oder Protein kodieren, das immunisierende Epitope zur Verfügung stellt. Die Erfindung soll jedoch nicht auf ein bestimmtes Peptid oder Protein beschränkt werden. Der Fachmann wird erkennen, dass die Fremd-Gene entsprechend ihrer Größe in den passenden Deletionsbereich des Virus einkloniert werden kann. Die Expression des eingerührten Peptids oder Proteins kann durch Kontrollelemente wie einen Promotor und falls erforderlich durch Enhancer-Elemente gesteuert werden. Durch den Einbau einer Fremd-Nukleinsäure, die für ein Peptid oder Protein kodiert, kann eine starke, spezifische immunstimulatorische Eigenschaft gegen das Peptid oder Protein induziert werden. Dies lässt sich beispielsweise ausnützen, indem eine virale Nukleinsäuresequenz in das Vektorkonstrukt kloniert wird, deren Expression eine Immunantwort in dem transfizierten Wirt auslöst.
Die Klonierung von rekombinanten Tierpockenviren als Vektor-Vakzine erfolgt nach der letzten Plaque-Endverdünnungspassage. Die Virus-Nukleinsäure kann zur Klonierung mit geeigneten Restriktionsendonukleasen gespalten werden und mit den Fremd- Nukleinsäuresequenzen durch Standard-Ligationsverfahren ligiert werden.
Gegenüber konventionellen Impfstoffen bzw. Vektor- Vakzinen, für die andere mikrobielle Vektoren benutzt werden, haben die erfindungsgemäßen Vektor- Vakzinen den Vorteil, dass sie nicht allergisch wirken und dem eluierten spezifischen Antigen ein optimal reguliertes Immunsystem anbieten, was zu einem optimalen Impferfolg beiträgt. Auch sind die erfindungsgemäßen Vektor-Vakzinen frei von lokalen oder systemischen negativen Nebenwirkungen. Da sie die immunologische Lücke bis zur vollen Ausbildung der Immunität ausnützen, sind sie vor allem für Notimpfungen (z.B. bei akuter Infektionsgefahr, vor unerwarteten Reisen) geeignet.
Die Beobachtung, dass durch eine hervorragende paraspezifϊsche Wirksamkeit des Vektors Tierpockenvirus der Impferfolg und die Unschädlichkeit der Vakzine beträchtlich gesteigert werden kann, ist neu und macht die Stämme für die Herstellung von Vektor- Vakzinen attraktiv. Vektor- Vakzinen, die auf hochattenuierten Tierpockenstämmen basieren, sind deshalb bezüglich ihrer Wirksamkeit und Unschädlichkeit konventionellen Vektor- Vakzinen überlegen.
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1 : Gliederung der Familie Poxviridae
Tabelle 2: Systematik der Orthopockenviren (Genus Orthopoxvirus, OVP) Tabelle 3 : Unterschiede einer konventionellen Attenuierung und einer Hochattenuierung Tabelle 4: Passagenzahlen einer konventionellen Attenuierung im Vergleich zu einer Hochattenuierung.
Tabelle 5: Applikationsschema zur Behandlung mit Paramunitätsinducer Tabelle 6: Indikationen zur Paramunisierung mit dem hochattenuierten Myxomavirus h-M 2.
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele sind bevorzugte Ausführungsformen und dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, die jedoch nicht auf diese beschränkt sein soll.
Beispiel 1
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Myxoma-Paramunitätsinducern (h-PIND- Myxo) wurde konventionell attenuiertes Myxomavirus M 2 (3 CAM-Passagen, 277 VERO- Passagen, 24 AVIVER-Passagen = 304 Passagen) über weitere 114 MA-Passagen und 179 VERO-Passagen, weiter passagiert (insgesamt 597 Passagen) und dadurch hochattenuiert (siehe Tabelle 4). Die VERO- Virusernten des hochattenuierten Leporipoxvirus myxomatosis h-M 2 haben einen Titer von mindestens 10 >75KID50/ml.
Die so erhaltenen hochattenuierten Leporipoxviren zeigten keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften und wurden folgendermaßen zum Paramunitätsinducer weiterverarbeitet:
Die Virusernten wurden mit Beta-Propiolacton 0,05% inaktiviert (pH 7,8, 1 Stunde bei +4° C (gerührt), für 4 Stunden bei einer Temperatur von +37° C bei einem pH von 7,8 gerührt (pH- Wert kontrollieren und wenn nötig auf pH 7,8 einstellen), über Nacht inkubiert (ca. 12 Stunden stationär bei einer Temperatur von +4° C) und anschließend durch grobtouriges Zentrifugieren (15 Min., ca. 4000g) gereinigt. Dem inaktivierten Virusmaterial wurde Polygeline (pH 7,8) für eine Gelatine-Gesamtkonzentration von 2,5% zugesetzt. Das so präparierte Virusmaterial wurde in sterile Fläschchen ä 1,5 ml abgefüllt und lyophilisiert. Die Lyophilisate wurden bei einer Temperatur von + 40 C aufbewahrt. Vor Gebrauch wurden die Lyophilisate mit ImI sterilem Aqua dest pro inj. aufgelöst und tief intramuskulär appliziert.
Die Applikationsfolgen und medizinischen Indikationen sind in der Tabelle 5 aufgelistet. Der Myxoma-Paramunitätsinducer eignet sich beispielsweise zur unterstützenden Behandlung von Herpes zoster (Modus 4) mittels Paramunisierung. Hiebei fuhrt die Behandlung zur Abheilung der krankheitstypischen Pusteln nach 3-4 Tagen. Bei prä-grippalen Infekten beobachtete man bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Paramunitätsinducer ein völliges Verschwinden der Symptome (Fieber, Abgeschlagenheit, Kopf- und Gliederschmerzen). Bei Patienten mit Wundverletzungen (z.B. nach Operationen) verzeichnete man mit den h-PIND-Myxo eine ungewöhnlich rasche Wundheilung, ohne Sekundärinfektionen. Bei Stomatitis und den Läsionen bei einem Zahnarztbesuch kam es nach dem Einreiben des Lyophilisats zum Verschwinden der Apthen bzw. Läsionen nach 1-2 Stunden.
Beispiel 2
Konventionell attenuiertes Kamelpockenvirus M 27 (siehe Beschreibungsteil) wurde durch weitere 263 Passagen in VERO-Zellen hochattenuiert (insgesamt 384 Passagen). Virusernten über 1O7'0 KID50/ml dienten als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Paramunitätsinducern. Hierzu wurde die Virusernte in analoger Weise wie in Beispiel 1 inaktiviert, zentrifugiert und lyophilisiert. Der Modus der Applikationen wie auch die Indikationen sind analog denen von Beispiel 1. Die gewonnenen Viren zeigten aufgrund der Hochattenuierung keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften.
Beispiel 3
Konventionell attenuiertes Kanarienpockenvirus (Avipox serinae, KPl, 535. FHE-Passage) wurde durch weitere 67 Passagen in FHE hochattenuiert (siehe Tabelle 4). Die 602. FHE- Passage diente in analoger Weise wie Beispiel 1 und 2 als hochattenuiertes Kanarienpockenvirus für die Herstellung von Paramunitätsinducern. Die gewonnenen Viren zeigten aufgrund der Hochattenuierung keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften.
Beispiel 4
Konventionell attenuiertes Hühnerpockenvirus (Avipoxvirus gallinum, HPl, 444.FHE- Passage) wurde durch weitere 98. FHE-Passagen hochattenuiert. Ab der 542. FHE-Passage erwies sich das Hühnerpockenvirus HPl als hochattenuiert und wurde in analoger Weise wie in Beispiel 1 zur Herstellung von Paramunitätsinducer verwendet. Die gewonnenen Viren zeigten aufgrund der Hochattenuierung keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften.
Beispiel 5 Analog zu den in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Verfahren, wurden auch Paramunitätsinducer auf der Basis von Myxomavirus (OPV muris) und Parapoxviren hergestellt.
Beispiel 6 Hochattenuierte Tierpockenstämme werden zur Herstellung von Vektor- Vakzinen verwendet. Bei der Herstellung von Vektor- Vakzinen ist vor allem die Kontrolle des pH- Wertes nach jedem einzelnen Herstellungsschritt zu beachten. Der pH- Wert sollte etwa 7.8 betragen. Die Attenuierung und Hochattenuierung der zur Vektorherstellung verwendeten Viren erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Dabei können alle gängigen gentechnologischen Verfahren zur Insertion von Nukleinsäureabschnitten, die für spezifische Antigene kodieren, gegen die eine spezifische Impfreaktion, d.h. Immunitätsbildung erzielt werden soll, verwendet werden. Das Fremd-Gen wird standardmäßig mittels geeigneten Restriktionsenzymen in die durch die Hochattenuierung erzeugten deletierten Nukleinsäureregionen der erfindungsgemäßen Tierpockenstämme eingebaut. Dabei werden Standard-Restriktionsverdaus und -Klonierungstechniken verwendet.
Zur Isolierung von rekombinanten Viruskonstrukten können beliebige (Selektions-)Marker- Gene oder Selektionskassetten verwendet werden, wie beispielsweise das ß-Galaktosidase- Gen, die unter der Kontrolle von geeigneten Kontrollsequenzen sind.
Beispielhafte Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren aus Tierpockenstämmen sind in der WO 00/69455 beschrieben. Die Offenbarung dieser Druckschrift und die darin enthaltene Lehre zur Herstellung von Vektorvakzinen ist hiermit ausdrücklich unter Bezugnahme eingeschlossen. Gleichermaßen sind alle anderen hierin zitierten Publikationen durch Bezugnahme aufgenommen. Tabellenübersicht
Tabelle 1 :
Gliederung der Familie Poxviridae
Figure imgf000033_0001
Tabelle 2:
Systematik der Orthopockenviren (Genus Orthopoxvirus, OVP)
(aktualisiert nach dem "7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", 2000)
Figure imgf000034_0001
Anmerkung: nach dieser noch unvollständigen Nomenklatur entfallen folgende, früher geführten Spezies:
OPV bubali (Büffel, OPV elefanti (Elefant), OPV equi (Pferd), OPV cuniculi (Kaninchen) Tabelle 3:
Unterschiede zwischen konventionell attenuierten und hochattenuierten MVA-Stämmen
(MVA=Modifiziertes Vacciniavirus Ankara)
MVA-Original (572. Passage in primären Hühnerembryofibroblastenkulturen) und VERO-MVA (weitere 182 Passagen in permanenten
VERO-Zellkulturen (WHO-ATCC, CCL 81))
Figure imgf000035_0001
Tabelle 4:
Beispielhafte Passagenzahlen in verschiedenen selektionierten Zellkulturen bei der konventionellen Attenuierung im Vergleich zur Hochattenuierung verschiedener Tierpockenstämme
Figure imgf000036_0001
Tabelle 5:
Applikationsschema zur Behandlung mit Paramunitätsinducer
Figure imgf000037_0001
Tabelle 6:
Indikationen zur Paramunisierung mit dem hochattenuierten Myxomavirus h-M 2 (h-PIND-MYXO)
(Fallbeispiele aus der Familie)
Figure imgf000038_0001
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Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Hochattenuiertes Tierpockenvirus basierend auf einem Tierpockenvirusstamm der Familie Poxviridae, dadurch gekennzeichnet, dass das Tierpockenvirus keine virulenten und immunisierenden Eigenschaften mehr besitzt und das hochattenuierte Tierpockenvirus ein geringeres Molekulargewicht der Virusnukleinsäure, häufigere Deletionen im terminalen Bereich und einen vermehrten Verlust von Zytokinrezeptoren im Vergleich zu konventionell attenuierten Tierpockenstämmen aufweist.
2. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei das Tierpocken virus einen Verlust von Zytokinrezeptoren für Interferon α und γ aufweist.
3. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei das Virusgenom des Tierpockenvirus um etwa 20% kleiner ist als das Virusgenom des Wildtyps.
4. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Pockenvirusstamm um einen Kamelpockenvirusstamm handelt.
5. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 4, wobei des sich bei dem Kamelpockenvirusstamm um den Stamm h-M 27 mit der Hinterlegungsnummer 05040602 (ECACC) handelt.
6. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Pockenvirusstamm um einen Myxoma- Virusstamm handelt.
7. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Myxoma- Virusstamm um den Stamm h-M 2 mit der Hinterlegungsnummer 05040601 (ECACC) handelt.
8. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem hochattenuierten Pockenvirusstamm um den Hühnerpockenstamm h-HPl handelt.
. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem hochattenuierten Pocken virusstamm um den Ektromeliestamm h-Mül handelt.
10. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei der hochattenuierte Tierpockenvirusstamm durch folgendes Verfahren erhältlich ist:
(a) Adaption der Tierpocken in einem permissiven Zellsystem oder Zellkulturen;
(b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen;
(c) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren zur Attenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen;
(d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen.
11. Paramunitätsinducer auf der Basis von Tierpockenvirusstämmen der Familie Poxviridae, dadurch charakterisiert, dass die Pockenvirusstämme hochattenuiert sind und keine virulenten und immunisierenden mehr Eigenschaften besitzen.
12. Paramunitätsinducer nach Anspruch 11, basierend auf einem Tierpockenvirusstamm nach einem der Ansprüchenl bis 10.
13. Verfahren zur Herstellung von Paramunitätsinducern aus hochattenuierten Tierpockenviren, umfassend:
(a) Adaptierung der Tierpocken auf ein permissives Zellsystem oder Zellkulturen;
(b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen; (c) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren zur Hochattenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen;
(d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen.
14. Verfahren zur Herstellung von Paramunitätsinducern aus hochattenuierten Myxoma- Viren, umfassend:
(a) Isolierung von Tierpockenviren aus erkrankten Tieren über die Chorioallantoismembran 10 Tage alter Hühnerembryonen (CAM) und Weiterfuhrung in diesem Zellsystem über mindestens 2 Passagen;
(b) Überimpfung und Weiterführung der isolierten Tierpockenviren für mindestens 300 Passagen in AVIVER- und VERO-Zellkulturen aus 10 Tage bebrüteten Hühnerembryonen (FHE);
(c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in MA-Zellen für mindestens 100 Passagen;
(d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 170 Passagen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die erzeugten hochattenuierten Myxomaviren einen Infektiositätstiter von etwa 106'75 KIDso/ml aufweisen.
16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei es sich bei den Myxomaviren um den Myxomavirusstamm h-M 2 mit der Hinterlegungsnummer 05040601 (ECACC) handelt.
17. Verfahren zur Herstellung von Paramunitätsinducer aus hochattenuierten Kamelpockenviren, umfassend: (a) Isolierung von Tierpockenvirus aus erkrankten Tieren durch Anzüchtung über die Chorioallantoismembran (CAM) 10 Tage alter Hühnerembryonen und Weiterführung des isolierten Kamelpockenvirus über etwa 2 Passagen in der CAM;
(b) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren über etwa 120 Passagen in VERO-Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection);
(c) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren über etwa 24 Passagen in AVIVER-Zellen;
(d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über etwa weitere 157 Passagen in VERO-Zellen;
e) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über weitere 1 14 Passagen in MA-Zellen;
f) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über weitere 179 Passagen in VERO-Zellen;
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die erzeugten hochattenuierten Kamelpockenviren einen Infektiositätstiter von etwa 107 KIDso/ml aufweisen.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei den Kamelpockenviren um den Kamelpockenstamm h-M 27 mit der Hinterlegungsnummer 05040602 (ECACC) handelt.
20. Vektor-Vakzin, umfassend die deletierte Nukleinsäure eines hochattenuierten, nichtvirulenten, nichtimmunisierenden Tierpockenvirus nach einem der Ansprüche 1- 10 und in deren Deletionen zur Expression eingefügte Nukleinsäuresequenzen eines immunisierenden Peptids oder Proteins.
21. Vektor-Vakzin nach Anspruch 20, wobei die deletierte Nukleinsäure des hochattenuierten, nichtvirulenten, nichtimmunisierenden Tierpockenvirus und die Nukleinsäuresequenzen des immunisierenden Peptids oder Proteins in einem Plasmid enthalten sind.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen oder mehrere Paramunitätsinducer nach einem der Ansprüche 11 bis 12.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 zur lokalen oder parenteralen Applikation.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 23, weiter umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
25. Verwendung eines Paramunitätsinducers nach einem der Ansprüche 11 bis 12 zur Aktivierung des paraspezifischen Immunsystems in einem Säugetier oder im Menschen.
26. Verwendung eines Paramunitätsinducers nach einem der Ansprüche 11 bis 12 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe und/oder Behandlung einer mit Immunschwäche-assoziierten Erkrankung.
27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die Immunschwäche-assoziierte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dysfunktionen des Immunsystems, Immunsuppression, Immunschwäche-Erkrankungen, Dysfunktionen der Homöodynamik zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel- und Nervensystem, neonataler Infektionsbedrohung, Tumorerkrankungen, Viruserkrankungen, bakteriellen Erkrankungen, therapieresistenten infektiösen Faktorenkrankheiten, viralen und bakteriellen Mischinfektionen, chronischen Manifestationen infektiöser Prozesse, Leberkrankheiten unterschiedlicher Genese, chronischen Hautkrankheiten, Herpeskrankheiten, chronischen Hepatididen, grippalen Infekten, Endotoxinschäden.
28. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die hochattenuierten Paramunitätsinducer in der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Unterstützung der Wundheilung, Verhütung von Sekundärinfektionen nach chirurgischen Eingriffen oder Verletzungen eingesetzt werden.
29. Verwendung einer Vektor-Vakzine nach einem der Ansprüche 20-21 zum Auslösen einer paraspezifischen und spezifischen Immunantwort in einem Säugetier oder im Menschen.
30. Verfahren zur Herstellung von hochattenuierten Tierpockenviren umfassend die Schritte:
(a) Adaptierung der Tierpocken auf ein permissives Zellsystem oder Zellkulturen.
(b) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen.
(c) Überimpfung und Weiterfuhrung der Tierpockenviren zur Attenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen.
(d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen.
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