DE102005027956A1 - Hochattenuierte Poxvirusstämme, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen - Google Patents

Hochattenuierte Poxvirusstämme, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft hochattenuierte Tierpockenvirusstämme und deren Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen. Die erfindungsgemäßen Tierpockenstämme weisen durch das Verfahren der Hochattenuierung keinerlei virulente und immunisierende Eigenschaften mehr auf. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von solchen hochattenuierten Pockenvirusstämmen und deren Verwendung zur Induktion von Paramunität, d. h. zur Aktivierung des unspezifischen Immunsystems in Säugetieren und Menschen oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen zur spezifischen Immunisierung mit dem positiven Nebeneffekt einer Paramunisierung. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren eignen sich somit zur Vorbeugung und Behandlung von Immunschwäche-assoziierten Erkrankungen. Bevorzugte Ausführungsformen betreffen hochattenuierte Orthopox- (z. B. Kamelpockenviren), Leporipox- (z. B. Myxomaviren), Avipox-, Parapox- sowie andere Orthopoxvirusstämme, wie z. B. MVA, die hervorragende paramunisierende Eigenschaften aufweisen und bei denen die immunisierenden Eigenschaften verloren gegangen sind.

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft hochattenuierte Tierpockenviren, daraus hergestellte Paramunitätsinducer und Vektor-Vakzinen auf der Basis von hochattenuierten Tierpockenvirusstämmen. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren besitzen durch den Prozess der Hochattenuierung keinerlei virulente und immunisierende Eigenschaften. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von solchen hochattenuierten Tierpockenvirusstämmen und deren Verwendung als Paramunitätsinducer zur Induktion von Paramunität, d.h. zur Aktivierung des unspezifischen (paraspezifischen) Immunsystems bei Mensch und Tier oder als Vektor-Vakzine zur Immunisierung eines Säugetiers oder Menschen. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren eignen sich ferner zur Prophylaxe und Behandlung von multifaktoriellen, meist chronischen Erkrankungen. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen aus infizierten Tieren isolierte und durch Serienpassagen hochattenuierte Tierpockenvirusstämme sämtlicher Genera der Familie Poxviridae. Die erfindungsgemäßen Tierpockenstämme besitzen hervorragende paramunisierende Eigenschaften, wobei die virulenten und immunisierenden Eigenschaften durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Hochattenuierung verloren gegangen sind.
  • Das körpereigene Immunsystem von Säugetieren lässt sich in einen antigenspezifischen sowie einen antigenunspezifischen (paraspezifischen) Teil aufteilen. Zum antigenspezifischen Teil des Immunsystems gehören z.B. Antikörper oder spezifische Immunzellen. Die antigenspezifischen Mechanismen sind für die Etablierung einer spezifischen Immunität, die antigenunspezifischen für den Aufbau von Paramunität verantwortlich. Die paraspezifischen Aktivitäten des antigenunspezifischen Immunsystems (engt.: „innate immune system") umfassen nichtselektive zelluläre und lösliche Schutzelemente, wie zum Beispiel das Komplement-Lysozymsystem und die regulative Zytokinkaskade, sowie zelluläre Schutzelemente, wie zum Beispiel Granulozyten, Mikro- und Makrophagen, natürliche Killerzellen, nicht antigengeprägte T-Lymphozyten, dendritische Zellen u.a.
  • Unter Paramunität versteht man den Zustand eines gut regulierten und optimal funktionierenden unspezifischen Abwehrsystems, das dem Organismus einen schnell entstandenen, zeitlich limitierten, erhöhten Schutz gegenüber einer Vielzahl unterschiedlicher Erreger, Antigene und anderer Noxen verleiht.
  • Paraspezifische Aktivitäten sind im betreffend Organismus unmittelbar nach Kontakt mit Noxen, d.h. endogenen oder exogenen Schadstoffen sowie transformierten körpereigenen Zellen, nach etwa 2 bis 6 Stunden, nachzuweisen, während die Wirkungen des antigenspezifischen Immunsystems erst nach 5- 8 Tagen (zelluläre spezifische Immunität) oder gar nach Wochen (Antikörper) eintreten. Hierdurch wird zusätzliche Zeit gewonnen, um spezifische Abwehrreaktionen gegenüber den Antigenen aufzubauen, die durch die paramunisierenden Aktivitäten nicht neutralisiert werden konnten. Die paraspezifische Abwehr ermöglicht es daher dem Organismus, sich bei Konfrontation mit den unterschiedlichsten Fremdstoffen, Infektionserregern, Toxinen und transformierten körpereigenen Zellen sofort, d.h. ohne Zeitverlust zur Wehr zu setzen (Anton Mayr, „Paramunisierung: Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med., Aufl. 26(6): 256-261, 1997).
  • Die paraspezifische Immunabwehr ist somit ein physiologischer Vorgang und lässt sich als „primäre Barriere" bei der Auseinandersetzung mit einer schadstoffhaltigen Umwelt definieren. Diese Form der Abwehr ist nicht nur für die niederen Organismen, sondern insbesondere auch für die höher- und hochentwickelten Lebewesen unersetzlich. So zeigt sich, dass primäre kongenitale Defekte in diesem biologischen Abwehrsystem zu lebensbedrohenden Situationen führen können. Als Beispiel ist das „Chediak-Steinbrinck-Higashi-Syndrom" des Menschen zu nennen, das durch Granulozytendefekte und Dysfunktionen der natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) charakterisiert ist und in den meisten Fällen bis zur Vollendung des 10. Lebensjahrs zum Tode des Patienten führt.
  • Der Zustand der Paramunität ist durch eine erhöhte Phagozytoserate, eine erhöhte Funktion der spontanen zellvermittelten Zytotoxizität (NK-Zellen) und eine erhöhte Aktivität sonstiger nicht antigenspezifischer lymphoretikulärer Zellen gekennzeichnet. Gleichzeitig kommt es zur Freisetzung bestimmter Zytokine, die sowohl mit den zellulären Elementen wie auch untereinander stimulierend und/oder supprimierend (z.B. über Repressormechanismen), d.h. optimal regulierend wirken. Dieses eng vernetzte und stufenweise reagierende biologische System der Paramunität mit seinen unterschiedlichen Akzeptor-, Effektor- und Zielzellen sowie den signalübertragenden molekularen Botenstoffen (Zytokinen) ist daneben intensiv mit dem Hormon- und Nervensystem, teilweise sogar mit dem Gefäß- und Stoffwechselsystem verbunden. Es ist damit ein wichtiger Bestandteil der Kommunikation, Interaktion und Regulation des Abwehrnetzwerkes, das bei jedem Organismus von Geburt an natürlicherweise vorhanden ist. Die Natur hat damit in angepasster Weise alle Organismen von Anfang an geschützt. In der Phylogenese entwickelt sich anfangs nur das paraspezifische, d.h. unspezifische Abwehrsystem. Erst im späteren Verlauf der Evolution bildet sich schrittweise das spezifische Immunsystem aus.
  • Die Einleitung einer medikamentösen Paramunität erfolgt durch Paramunisierung mit sogenannten Paramunitätsinducern. Eine medikamentöse Paramunisierung erreicht man durch Aktivierung der zellulären Elemente des paraspezifischen Teils des Immunsystems und der damit verbundenen Bildung von Zytokinen, mit dem Ziel, Dysfunktionen zu beseitigen, den Erreger- und Antigen-unspezifischen Schutz eines Individuums schnell zu erhöhen (optimale Bioregulation), eine durch Stressfolgen oder anderweitig (z.B. medikamentös) entstandene Immunsuppression oder Immunschwäche zu beseitigen, Defizite zu reparieren und/oder regulatorisch zwischen Immun-, Hormon- und Nervensystem zu wirken (Anton Mayr, „Paramunisierung: Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med., Aufl. 26(6): 256-261, 1997). Dies bedeutet, dass je nach An der Paramunisierung und der Reaktionslage, wie zum Beispiel der Abwehrlage des Patienten, bestimmte unspezifische körpereigene Abwehrvorgänge gesteigert, ergänzt oder auch gedämpft werden können.
  • Der Paramunitätsinducer per se ist ein Protein, d.h. er ist weder mit einem Abwehrstoff, noch mit einer Chemikalie, einem Antibiotikum, Vitamin oder Hormon vergleichbar. Vielmehr aktiviert er wie ein Katalysator über einen stufenweisen Mechanismus das paraspezifische Immunsystem, so dass dieses ausreichend zelluläre und humorale Abwehrmechanismen mobilisiert. Paramunitätsinducer wirken hierbei hinsichtlich der Immunabwehr sowohl regulierend als auch reparierend. Bezüglich der Wirkungsweise von Paramunitätsinducern ist bekannt, dass sie von phagozytierenden Zellen (Akzeptorzellen) aufgenommen werden, die dadurch aktiviert werden und Mediatoren, wie z.B. Zytokine, freisetzen, welche wiederum Effektorzellen mobilisieren.
  • Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen zweier oder mehrerer konventionell attenuierter Tierpockenviruskomponenten, die sich aus unterschiedlichen Tierpockenvirusstämmen mit paramunisierenden Eigenschaften ableiten, sind in der europäischen Patentschrift EP 0 669 133 B1 beschrieben.
  • Die diesen Paramunitätsinducern zugrunde liegenden Tierpockenvirusstämme sind auf konventionelle Weise attenuiert worden, d.h. sie liegen in einem reduzierten Zustand vor, bei dem die virulenten und vor allem die immunisierenden Eigenschaften des Virus abgeschwächt, aber nicht vollständig verloren sind.
    •
  • In der vorliegenden wird erstmalig ein neues Verfahren Vorgestellt, welches die Virulenz und Immunogenität von einfach attenuierten Tierpockenvirusstämmen vollständig eliminiert. Dieses Verfahren wird im folgenden als „Hochattenuierung" bezeichnet.
  • Eine solche Hochattenuierung von Poxviren wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal anhand der Orthopoxviren Kamelpockenvirus (Orthopoxvirus cameli) und Ektromelievirus (Orthopoxvirus muris), dem Leporipoxvirus Myxomatosevirus (Leporipoxvirus myxomatosis), den Avipoxviren Hühnerpockenvirus (Avipoxvirus gallinae) und Kanarienpockenvirus (Avipoxvirus serinis) sowie dem Parapockenvirus Ecthyma (Parapoxvirus ovis) gezeigt.
  • Beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Hochattenuierung des Orthopoxvirusstammes. Kamelpockenvirus Stamm h-M 27 und des Leporipoxvirusstammes Myxomatosevirus Stamm h-M 2. Für diese Poxvirusstämme wurde bislang weder eine Attenuierung noch eine Hochattenuierung durchgeführt oder beschrieben. Andere bevorzugte Ausführungsformen betreffen weitere Orthopoxvirusstämme, sowie Stämme der Parapoxviren und Avipoxviren (siehe unten).
  • Eine einfache konventionelle Attenuierung wurde für das Genus Orthopoxvirus beim Vacciniavirus Ankara MVA durch A. Mayr, H. Stickl, H.K. Müller, K. Danner und H. Singer, 1978: „Der Pockenimpfstamm MVA", Zb1.Bakt.Hyg., I.Abt.Orig.B 167, 375-390; Mayr, A., 1999: „Geschichtlicher Überblick über die Menschenpocken (Variola), die Eradikation von Variola und den attenuierten Pockenstamm MVA", Berl.Münch.TierärztlWschr. 112, 322- 328; für das Genus Avipoxvirus HP 1 und KP 1 durch A. Mayr, F. Hartwig, und I. Bayr, 1965: „Entwicklung eines Impfstoffes gegen die Kanarienpocken auf der Basis eines attenuierten Kanarienpockenkulturvirus", Zbl.Vet.Med.B 12, 41-49; A. Mayr und K. Malicki, 1966: „Attenuierung von virulentem Hühnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus", Zb1.Vet.Med. B 13, 1-13; und für das Genus Parapoxvirus ORF-1701 durch A. Mayr und M. Büttner, 1990: „Ecthyma (ORF) virus": In: Z. Dinter und B. Morein (Hrsg.): Virus infections of vertebrates, vol. 3; Virus infections of ruminants, Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam, gezeigt.
  • Im folgenden werden einige der durch das erfindungsgemäße Verfahren hochattenuierten Tierpockenvirusstämme näher erläutert:
  • Kamelpockenvirus
  • Die Kamelpocken sind die Erreger einer gefährlichen, zyklisch-systemisch verlaufenden Viruserkrankung der Kameliden, die durch ein Exanthem bevorzugt der Haut und Schleimhaut im Kopf-, Nacken- und Halsbereich sowie den Extremitäten und der Inguinalgegend charakterisiert ist (Munz, E., 1999: „Pox and pox-like diseases in camels", Proc.lst Int. Camel Conf. 1, 43-46). Die Erkrankung tritt in zyklischer Weise alle 2 bis 3 Jahre auf, wenn eine genügend große sensible Population vorhanden ist. Von den Kamelpockenviren werden bevorzugt zwei Gattungen (Lama und Camelus) der Familie Camelidae befallen (Mayr, A. and Czerny C.P., 1990: „Camelpox virus", In: Dinter Z. und Morein B. (Hrsg.): „Virus infections of vertebrates", vol. 3: Virus infections of ruminants. Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam). Die Gattung Camelus umfasst das einhöckrige Dromedar (Camelus dromedarius) und das zweihöckrige Trampeltier (Camelus ferus bactrianus). Dromedare und Trampeltiere kommen hauptsächlich in den Ländern der sogenannten „Alten Welt" vor (Wüsten, Steppen von Nordafrika, Arabien, Mongolei), während das Lama bevorzugt in Südamerika beheimatet ist.
  • Das Kamelpockenvirus (Orthopoxvirus cameli) ist ein besonders enger Verwandter des Variola-Virus, dem Erreger der Pocken beim Menschen (Variola). Für den Menschen ist das Kamelpockenvirus nicht pathogen. Das Kamelpockenvirus ist wie alle klassischen Pockenviren quaderförmig und besitzt charakteristische Oberflächenproteine, die für die immunisierenden und paramunisierenden Eigenschaften des Virus bzw. dessen Bestandteile verantwortlich sind. Die durchschnittliche Größe beträgt je nach Genus bzw. Stamm in Längsrichtung 280 nm und in Querrichtung etwa 180 nm (Otterbein, C.K., 1994: „Phäno- und genotypische Untersuchungen zweier Kamelpockenvirus-Isolate vor und nach Attenuierung durch Zellkulturpassagen", Vet.Med.Diss. München). Das Genom des Kamelpockenvirus besteht aus einer linearen, doppelsträngigen DNA. Die beiden DNA-Stränge sind an den Genom-Enden kovalent miteinander gebunden, so dass die Virus-DNA eine durchgehende Polynukleotidkette bildet.
  • Myxomatosevirus
  • Myxomaviren sind die Erreger der Myxomatose, einer zyklisch verlaufenden, kontagiösen Virusallgemeinkrankheit der Wild- und Hauskaninchen, die durch generalisierte, teilweise hämorrhagische Unterhautödeme am Kopf und über den ganzen Körper, mit Bevorzugung der Analgegend, der Vulva und des Schlauches, wie keine andere Infektionskrankheit charakterisiert ist. Wird die Myxomatose in ein bisher seuchenfreies Land neu eingeschleppt, verläuft sie rasch und tödlich. Nach Sesshaftwerden des Virus verändert sich der Seuchencharakter bis hin zu klinisch inapparenten Infektionen (Mayr A.: Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, 7. Aufl., Enke-Verlag, Stuttgart, 2002).
  • Die Krankheit ist unter amerikanischen Baumwollschwanzkaninchen der Gattung Sylvilagus, die ausschließlich die neue Welt besiedeln, weit verbreitet. Diese Wildkaninchen bilden das einzige natürliche Reservoir der Seuche. Die Infektion verläuft bei ihnen in einer milden Form. Dagegen besitzt die Erkrankung bei europäischen Wild- und Hauskaninchen der Gattung Oryctolagus, die auch in Australien heimisch sind, eine fast 100%ige Sterblichkeit bei Neueinschleppung des Erregers.
  • Das natürliche Wirtsspektrum des Myxomavirus (Genus Leporipoxvirus) ist eng begrenzt. Im Allgemeinen vermehrt sich das Virus nur in amerikanischen Baumwollschwanzkaninchen und in europäischen Haus- und Wildkaninchen. Vereinzelt wurden allerdings auch Infektionen in europäischen Wildhasen beobachtet. Übertragungsversuche auf andere Tierarten und auf den Menschen verliefen negativ.
  • Avipoxvirus
  • Die durch Avipoxviren, insbesondere das Hühnerpockenvirus und das Kanarienpockenvirus, verursachten Infektionen verlaufen ähnlich. Hühnerpocken stammen aus Asien und sind seit Jahrtausenden bekannt. Sie sind weltweit verbreitet und sehr widerstandsfähig. Die Übertragung erfolgt durch das Eindringen über Hautverletzungen. Es können auch stechende Insekten an der Übertragung beteiligt sein. Die Inkubationszeit für die Krankheit beträgt 4 bis 14 Tage. Es gibt zwei Verlaufsformen, wobei zwischen der sogenannten Hautform und der Schleimhautform unterschieden wird. Die Hautform ist durch Bläschen oder schorfige Knoten an Kopf, Kamm, Hals und Füßen charakterisiert. Die Schleimhautform weist gelblich- weiße Beläge auf der Zunge, den Schleimhäuten des Schnabels, des Kehlkopfes, der Luftröhre und den Augen auf.
  • Die Inkubationszeit bei einer Infektion mit Kanarienpockenviren beträgt 3 bis 16 Tage. Nach Ausbruch der Krankheit stirbt ein Großteil des Bestandes innerhalb von nur wenigen Stunden ab. Die infizierten Tiere zeigen Knötchen an den Hornteilen und an den Schnabelwinkeln. Es kommt zu massiven Atemstörungen und die Vögel ersticken recht schnell an den durch das Virus verursachten käsigen Auflagerungen in den Atemwegen.
  • Attenuierte Stämme von Avipoxviren wurden durch sukzessive Passagen in Zellkulturen aus Hühnerembryo-Fibroblasten gewonnen und zur Vakzinierung von Hühner eingesetzt. Der am besten untersuchte und verfügbare Stamm ist der Stamm HP-1 (A. Mayr und K. Malicki, 1966: „Attenuierung von virulentem Hühnerpockenvirus in Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus", Zbt.Vet.Med. B 13, 1-13). Mehr als 200 Passagen in Hühnerembryo-Fibroblasten führen zu einem attenuierten, aber noch replizierfähigen Virus, jedoch mit verbleibender Pathogenität für Hühner bei intravenöser oder Aersol-Verabreichung. Viren die mehr als 400 mal passagiert wurden gelten als apathogen und werden als effziente und extrem sichere Vektoren für den Einsatz in Säugetieren angesehen. Eine Immunisierung konnte erreicht werden, ohne dass eine vollständige produktive Replikation des Virus stattfand.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die bislang durch eine konventionelle Attenuierung abgeschwächten Tierpockenvirusstämme führen zu einer Steigerung der paramunisierenden Eigenschaften und zu einer Verringerung der virulenten bzw. immunisierenden Eigenschaften der Viren bzw. deren Bestandteilen. Allerdings gehen bei der konventionellen Attenuierung nicht alle virulenten und immunisierenden Eigenschafen der Tierpockenstämme verloren. Immunreaktionen sind bei einfach attenuierten Tierpockenstämmen in Säugetieren noch immer vorhanden. Dies liegt vermutlich an der zu geringen Stabilität einer einfachen Attenuierung bzw. dem zu geringen Grad der Attenuierung bei den einfach attenuierten Tierpockenviren.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde Tierpockenstämme bereitzustellen, die stabil sind, einen hohen Attenuierungsgrad aufweisen und bei denen die Pockenviren derart verändert sind, dass sie ihre virulenten und immunisierenden Eigenschaften vollständig verloren haben und somit als unschädliche Paramunitätsinducer und Vektor-Vakzinen verwendbar sind.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Gegenstände der anhängenden Patentansprüche gelöst.
  • Überraschenderweise wurde festgestellt, dass einfach attenuierte Tierpockenstämme durch zusätzliche Attenuierungsschritte mit fortführenden Plaque-Endverdünnungs-Passagen in ausgewählten permissiven Zellkulturen derart verändert werden, dass sie ihre Virulenz und Immunisierungsfähigkeit vollständig verlieren, ohne in ihrer Vermehrungsfähigkeit beeinträchtigt zu sein. Auch sind die erfindungsgemäßen Tierpockenstämme in ihrem Wirtsspektrum weiter eingeschränkt. Die durch die Hochattenuierung entstehenden Deletionen im Virusgenom ermöglichen zudem die Einführung von Fremd-Antigenen.
  • Durch den durch die Hochattenuierung verursachten Verlust der immunisierenden Proteine werden zusätzliche paramunisiernde Proteine aktiv, welche die paramunisierende Wirksamkeit dieser Stämme in signifikanter Weise erhöhen. Auf diese Weise erhält man hoch wirksame und unschädliche Paramunitätsinducer, die auch bei kurzfristig wiederholten und häufigen Applikationen keine Allergien oder andere immunpathogenen Nebenwirkungen verursachen.
  • Daher eignen sich die durch das erfindungsgemäße Verfahren hochattenuierten Tierpockenstämme in hervorragender Weise als Paramunitätsinducer oder für die Herstellung von Vektor-Vakzinen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft hochattenuierte Tierpockenvirusstämmen und ihre Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen.
  • Besondere Ausführungsformen der hochattenuierten Tierpockenstämmne sind Stämme des Myxomatose- und des Kamelpockenvirus. Besonders bevorzugt ist der Kamelpockenvirusstamm h-M 27 mit der Hinterlegungsnummer 05040602 und der Myxomatosevirustamm h-M 2 mit der Hinterlegungsnummer 05040601. Die Hinterlegung der Viren erfolgte bei der Hinterlegungsstelle der Public Health Laboratory Service (PHLS), Centre for Applied Microbiology & Research (CAMR), European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, United Kingdom. Andere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Hochattenuierung des Kanarienpockenvirus (Avipoxvirus serinae), bevorzugt des Stammes KP1, des Ektromelievirus (Orthopoxvirus muris), bevorzugt des Stammes Mü 1 und des Hühnerpockenvirus (Avipoxvirus gallinae), bevorzugt des Stammes HP 1 und des Parapoxvirus (Parapoxvirus ovis).
  • Bei der erfindungsgemäß entdeckten Hochattenuierung von Tierpockenvirusstämmen gehen die Virulenz der Virusstämme und ihre immunisierenden Eigenschaften im Vergleich zu konventionell attenuierten Tierpockenstämmen vollständig verloren. Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenviren besitzen daher keine Rest-Virulenz oder -Immunität mehr. Somit eignen sich die hochattenuierten Tierpockenstämme insbesondere für die Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen.
  • Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen hochattenuierten Pockenvirusstämme. Bevorzugte Pockenvirusstämme sind Stämme, die dem Genus Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Leporipoxvirus und Parapoxvirus angehören.
  • Die Hochattenuierung von Pockenvirusstämmen wird erfindungsgemäß durch zusätzliche Plaque-Endverdünnungs-Passagen (d.h. Überimpfen und Weiterführen) von konventionell attenuierten Virusstämmen in optimierten, ausgewählten, permanenten Zelllinien (z.B. VERO-Zellen), in primären Zeltkulturen (z.B. Hühnerembryofibroblasten (FHE)-Zellkulturen), bebrüteten Hühnereiern oder in Versuchstieren erreicht. Es wurde überraschend festgestellt, dass durch diese zusätzliche Passagierung die Virulenz und Immunogenität der Tierpockenviren und deren Bestandteile im Vergleich zu konventionell attenuierten Stämmen verloren geht. Die Passagierung in den ausgewählten Zellsystemen oder -kulturen erfolgt so lange, bis die erwünschten Eigenschaften erreicht sind, d.h. bis die Tierpockenviren keinerlei Virulenz oder Immunogenität mehr aufweisen und stattdessen eine gesteigerte Aktivität des unspezifischen Immunsystems (Paramunität) aufweisen. Gewöhnlich lässt sich dies durch mindestens 300-500 Passagen in optimierten Zellsystemen, wie Zellkulturen von VERO-Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) erreichen. Solche optimierten Zellsysteme ergeben den erforderlich hohen Infektiositätstiter. Die weiteren erwünschten biologischen, genetischen und immunologischen Eigenschaften die aus einer Hochattenuierung von Tierpockenstämmen hervorgehen sind in Tabelle 3 aufgeführt.
  • Allgemein lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von hochattenuierten Tierpockenviren durch folgende Schritte definieren:
    • (a) Adaptierung der Tierpocken auf ein permissives Zellsystem, beispielsweise bestehend aus der Chorioallantoismembran 10 Tage alter Hühnerembryonen (CAM) oder Zeltkulturen.
    • (b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen.
    • (c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen.
    • (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft ist der hochattenuierte Orthopoxvirusstamm ein hochattenuiertes Kamelpockenvirus (Orthopoxvirus cameli), insbesondere der Stamm h-M 27. Ein bevorzugtes Verfahren zur Hochattenuierung von Kamelpockenviren umfasst die folgenden Schritte:
    • (a) Kultivierung des isolierten Kamelpockenvirus über etwa 2 Passagen in Lammnieren-Zellkulturen;
    • (b) Überimpfen und Kultivierung der Tierpockenviren über etwa 5 Passagen in VERO-Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection);
    • (c) Überimpfen und Kultivierung der Tierpockenviren über etwa 114 Passagen in MA-Zellen;
    • (d) Überimpfen und Kultivierung der Tierpockenviren über etwa weitere 267 Passagen in VERO-Zellen.
  • Die so erzeugten Tierpockenviren sind zur Herstellung von Paramunitätsinducern und Vektor-Vakzinen einsetzbar. Für die Herstellung von wird die vermehrungsfähige Virusernte verwendet.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft den hochattenuierten Leporipoxvirusstamm Myxomatosevirus (Leporipoxvirus myxomatosis), Stamm h-M 2.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Hochattenuierung eines solchen Myxomatosevirusstammes, bevorzugt des Stammes h-M 2, umfasst die folgenden Schritte:
    • (a) Isolierung aus erkrankten Tieren über die Chorioallantoismembran 10 Tage alter Hühnerembryonen (CAM) und Weiterführung in diesem System über mindestens 2 Passagen;
    • (b) Überimpfung und Weiterführung der isolierten Tierpockenviren für mindestens 120 Passagen in VERO-Zellkulturen;
    • (c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in AVIVER-Zellen für mindestens 24 Passagen;
    • (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 157 Passagen;
    • e) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in MA-Zellen über mindestens 114 Passagen;
    • f) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen über mindestens 179 Passagen.
  • Zur Herstellung von Paramunitätsinducern werden die Virusernten durch Behandlung mit beta-Propiolacton inaktiviert.
  • Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen oder mehre hochattenuierte Pockenstämme unterschiedlicher Herkunft in Kombination enthalten und denen gegebenenfalls ein pharmazeutischer Träger zugesetzt wird.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Verwendung eines oder mehrerer erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenstämme (z.B. in Kombination) oder Bestandteilen der hochattenuierten Tierpockenstämme zur Aktivierung des paraspezifischen Immunsystems in einem Säugetier oder im Menschen zur Prophylaxe und Therapie.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die hochattenuierten Tierpockenviren zur Herstellung von Vektor-Vakzinen eingesetzt, hierfür werden die vermehrungsfähigen Virusernten verwendet. Eine für ein Fremdantigen kodierende Nukleinsäure wird dabei in eine der durch die Hochattenuierung entstandenen Deletionen der Nukleinsäure des Vektors (Tierpockenvirus) eingebaut, so dass das Fremd-Gen durch den Vektor exprimiert werden kann. Die so entstandenen Fremdproteine stellen immunisierende Epitope bereit und stimulieren dadurch das körpereigene spezifische Abwehrsystem.
  • DEFINITIONEN
  • Unter dem Begriff Attenuierung (engl. „attenuate": abschwächen, mildern) eines Infektionserregers (z.B. Viren, Bakterien, Pilze) versteht man grundsätzlich die Verminderung seiner virulenten und immunisierenden Eigenschaften. Insbesondere handelt es sich, je nach Attenuierungsgrad, gentechnologisch um die Reduktion des Molekulargewichtes und damit die Verkürzung seiner Nukleinsäure, verbunden mit dem Auftreten von Deletionen, biologisch um die Reduzierung bzw. um den Verlust seiner pathogenen Eigenschaften bezüglich Virulenz und Kontagiosität, immunologisch um den Verlust der immunogenen Aktivitäten und die Erhöhung der paraspezifischen Potenzen sowie klinisch um die Einschränkung des Wirtsspektrum und um eine erhöhte Aktivität von paraspezifischen Abwehrreaktionen des Wirtes.
  • Unter Hochattenuierung versteht man die weitere Reduzierung von einfach attenuierten aber noch teilweise virulenten und immunisierenden Erregern, bis zu einem vollständigen Verlust der Virulenz und des immunisierende Potentials, wobei es durch die Hochattenuierung zu einer extremen Einengung des Wirtsspektrums kommt. Durch die Hochattenuierung wird das paramunisierende Potential stark erhöht. Bezüglich einer Reaktivierung ihrer verlorengegangenen virulenten und immunisierenden Eigenschaften sind die hochattenuierten Poxviren stabiler als konventionell attenuierte Stämme, d.h. eine Rückwandlung ist nicht möglich.
  • Die hochattenuierten Tierpockenstämme unterscheiden sich von den konventionell attenuierten Tierpockenstämmen gentechnologisch durch eine weitere Abnahme des Molekulargewichtes der Virusnukleinsäure und der Zunahme von Deletionen in der Nukleinsäure; biologisch durch den vollständigen Verlust der Virulenz und Kontagiosität, wobei diese Stämme gleichzeitig im permissiven Wirtssystem einen optimalen und im Vergleich zu konventionell attenuierten Stämmen hohe Infektiositätstiter erreichen; immunologisch durch den totalen Verlust der Immunogenität, und molekularbiologisch durch den Verlust von Zytokinrezeptoren, z.B. Rezeptoren für Interferon und bestimmte Interleukine.
  • Unter Vektor-Vakzinen (rekombinierte Vakzine, Hybridvakzine) versteht man Impfstoffe, die aus zwei Komponenten bestehen: einen mikrobiellen Träger (Vektor) und einem immunisierendes Antigen, dessen kodierende Nukleinsäure in den Vektor eingebaut wird. Als mikrobielle Träger eignen sich wegen ihrer zahlreichen Nukleinsäure-Deletionen und ihrer paramunisierenden Eigenschaften bevorzugt (hoch-)attenuierte Tierpockenviren. Die eingeführte Fremdgen-Nukleinsäure wird im Impfling durch den Vektor zur Expression gebracht, was zur Bildung von spezifisch immunisierenden Reaktionen führt.
  • Als Paramunitätsinducer (paraspezifische Vakzine) bezeichnet man bioregulative Präparate aus attenuierten, avirulenten und inaktivierten Tierpockenviren, die je nach Attenuierungsgrad nur noch Reste von (konventionell attenuiert) bzw. keine (hochattenuiert) immunisierenden Eigenschaften enthalten und dazu bestimmt sind, bei Mensch und Tier zur Paramunisierung angewendet zu werden. Sie werden wie die klassischen spezifischen Impfstoffe hergestellt und gleichen ihnen auch funktionell, jedoch mit dem Unterschied, dass sie überwiegend die paraspezifischen (unspezifischen) Abwehrmechansimen aktivieren und dabei durch ihre bioregulierenden Eigenschaften zu einer Homöodynamik der Abwehrsysteme führen.
  • DETALIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Allgemeines
  • Die Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass sich die Virulenz und die immunisierenden Eigenschaften von konventionell attenuierten Tierpockenvirusstämmen durch zusätzliche Plaque-Endverdünnungs-Passagen in permissiven Zellkulturen, bebrüteten Hühnereiern oder Versuchstieren bis zum völligen Verlust reduzieren lassen. Gegenüber einer potentiellen Reaktivierung dieser Eigenschaften sind derart hochattenuierte Stämme stabil. Dieser über eine einfache, konventionelle Attenuierung hinausgehende Prozess wird in der vorliegenden Erfindung als „Hochattenuierung" bezeichnet. Diese hochattenuierten Tierpockenvirusstämme sind gegenüber konventionell attenuierten Erregern deutlich verbessert. Insbesondere unterscheiden sich die hochattenuierten Tierpockenstämme, wie in Tabelle 3 zusammengefasst, von den konventionell attenuierten Tierpockenstämmen gentechnologisch durch die Abnahme des Molekulargewichtes der Virusnukleinsäure und der Zunahme von Deletionen in der Nukleinsäure; biologisch durch den Verlust der Virulenz und Kontagiosität; immunologisch durch den Verlust der Immunogenität, und molekularbiologisch durch den Verlust von Zytokinrezeptoren.
  • Unerwartet war die Entdeckung, dass sich sämtliche getesteten attenuierten Tierpockenstämme der Familie Poxviridae, gleichgültig welchem Genus sie angehören, konventionell attenuieren und anschließend mit einer hohen Stabilität weiter abschwächen lassen können (siehe Tabellen 1 und 2). Eine solche Hochattenuierung wird in dieser Erfindung beispielhaft mit Vertretern der Genera Orthopoxviren, Leporipoxviren und Avipoxviren gezeigt, wobei sie nicht auf diese Genera beschränkt zu sehen ist. Erstmals wird in der vorliegenden Erfindung auch eine Hochattenuierung mit einem Myxomatosevirus und einem Kamelpockenvirus beschrieben.
  • Experimentell kann man die Wandlungsfähigkeit von Infektionsserregern, sich gegebenen Umweltveränderungen, z.B. durch Vermehrung in Zellkulturen oder in nicht natürlichen Wirtssystemen anzupassen, nutzen, um den für eine Hochattenuierung notwendigen Zeitaufwand deutlich zu verkürzen. Dies gelingt bevorzugt durch Dauerpassagen in bestimmten permissiven Wirtssystemen, die normalerweise nicht zum natürlichen Wirtsspektrum gehören (z.B. Versuchstiere, Zellkulturen, Nährböden). Für eine Hochattenuierung von Pockenvirustämmen werden in der Regel etwa 15 bis 30 Jahre benötigt.
  • Hochattenuierte Poxvirusstämme verlieren durch das unten näher beschriebene Hochattenuierungsverfahren auch ihre spezifischen immunisierenden Kapazitäten während ihre paraspezifische Wirksamkeit gezielt verstärkt wird. Daher eignen sich die hochattenuierten Poxvirusstämme als Paramunitätsinducer oder für die Herstellung von Vektor-Vakzinen.
  • Die Verstärkung der paraspezifischen Eigenschaften ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass immunisierende und paramunisierende Proteine von Tierpockenviren miteinander interferieren. Durch den durch die Hochattenuierung verursachten Verlust der immunisierenden Proteine werden zusätzliche paramunisiernde Proteine aktiv, welche die paramunisierende Wirksamkeit dieser Stämme in signifikanter Weise erhöhen. Auf diese Weise erhält man hoch wirksame und unschädliche Paramunitätsinducer, die auch bei kurzfristig wiederholten und häufigen Applikationen keine Allergien oder andere immunpathogenen Nebenwirkungen verursachen.
  • In der Regel führt eine einfache, konventionelle Attenuierung zur Abnahme der Virulenz und der Kontagiosität sowie zur Einengung des Wirtsspektrums und zu geringen Veränderungen im Erreger-Genom bei gleichzeitiger Abnahme des Molekulargewichtes und dem Auftreten von Deletionen in den terminalen Bereichen des Virusgenoms. Daneben kommt es zu einer Abnahme der spezifisch immunisierenden Aktivitäten und zu einer Zunahme der paraspezifischen Wirksamkeit. Bei einer Hochattenuierung verstärken sich diese Effekte allerdings drastisch, so dass die erhaltenen hochattenuierten Viren bezüglich ihrer Stabilität, ihrer Wirtsspezifität, der fehlenden Virulenz und Immunogenität den konventionell attenuierten Viren überlegen sind (Tabellen 3 und 4).
  • Das Verfahren zur Hochattenuierung
  • Eine konventionelle Attenuierung (wie auch die ersten Schritte der Hochattenuierung) beginnt mit der Adaptierung von isolierten Tierpockenviren in homologen oder heterologen permissiven Zellsystemen, wie z.B. Zellkulturen, bebrüteten Hühnereiern oder in Versuchstieren. Darauf folgt eine Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen. Die zu jedem Virusstamm passenden permissiven Zellsysteme werden für jede Tierpockenvirusart spezifisch ausgewählt. Die Auswahl richtet sich nach dem Infektiositätstiter der Viren in dem jeweiligen Zellsystem. Dabei wird das Zellsystem zur Passagierung ausgewählt, das für die jeweilige Virusart den höchsten Infektiositätstiter ergibt. Dies entspricht zugleich auch dem optimalen Virus-Titer. Die Attenuierung wird fortgeführt, indem die Tierpockenviren für etwa 100-300 Passagen in diesen optimalen Zellsystemen weitergeführt werden. Darauf schließt sich eine Endphase an, die durch 3-5 Plaque-Endverdünnungspassagen gekennzeichnet ist. Dieses Material kann entsprechend der weiteren Verwendung weiterverarbeitet werden.
  • Alle hier beschriebenen Vertreter der Orthopox-, Leporipox-, Parapox- und Avipoxviren lassen sich auf konventionelle Weise attenuieren. Die anschließende Hochattenuierung erfolgte durch Fortführung der Passagen des einfach, konventionell attenuierten Virusstammes in homologen oder heterologen permissiven Wirtssystemen. Die Wahl des Wirtsystems ist wiederum abhängig von der Tierpockenart und wird nach den oben erwähnten Gesichtspunkten (Infektiositätstiter) ausgewählt. Eine Hochattenuierung erfolgt beispielsweise durch Fortführung der einfach atttenuierten Orthopoxviren in VERO-Zellen oder der einfach attenuierten Avipoxviren in embryonalen Hühnerembryofibroblasten (FHE)-Zellkulturen). Bevorzugt erfolgt eine Hochattenuierung von Poxviren (z.B. Ektromelievirus, Kamelpockenvirus) durch mindestens 60 bis 300 Passagen in Abhängigkeit des jeweiligen Virusstammes in VERO-Zellkulturen (beispielsweise 150 oder 260 Passagen). Der Stamm Leporipoxvirus myxomatosis wird durch etwa mindestens zusätzliche 150 bis 300 Passagen in MA- und VERO-Zellkulturen, bevorzugt 290 Passagen hochattenuiert. Der Stamm Avipoxvirus gallinae wird durch etwa 100 bis 150 zusätzliche Passagen, bevorzugt durch 98 Passagen, in FHE-Zellkulturen hochattenuiert. Der Parapoxvirusstamm wird durch weitere 100 bis 160, bevorzugt durch 164 Passagen hochattenuiert (Tabellen 3 und 4). Es ist bevorzugt, dass bei der Passagierung der Virusstämme (d.h. bei der Überführung und Animpfung) die sogenannten Plaque-Endverdünnungsmethode verwendet wird.
  • Im Allgemeinen werden für eine Hochattenuierung für das Genus Avipoxvirus primäre Hühnerembryofibroblastenkulturen (FHE) und für alle anderen Genera, wie Orthopoxvirus, Leporipoxvirus und Parapoxvirus permanente MA-104-Affennierenzellen (kurz: MA-Zellen) oder VERO-Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) u.a.m. verwendet. Für die Anzucht der MA- oder VERO-Zellkulturen wird vorzugsweise ein vollsynthetisches Medium eingesetzt, besonders bevorzugt ist das Medium MEM („minimal essential medium"), das 5% bis 20%, vorzugsweise 10% BMS (Serumersatzmedium) und 5% bis 20%, vorzugsweise 10% Lactalalbuminhydrolysat, enthält. Als Virusmedium wird nach dem Austausch mit dem Anzuchtmedium, vorzugsweise MEM-Medium, mit 5% bis 20%, vorzugsweise mit 10% Lactalalbuminhydrolysat, ohne BMS bzw. ohne fetales Kälberserum und ohne Antibiotika verwendet. Sämtliche Herstellungsverfahren werden vorzugsweise bei pH-Werten von 7.0 bis 8.0, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,25 durchgeführt. Virusernten mit Titer von 105 bis 108 TCID50/ml, vorzugsweise von mindestens 107.5 TCID50/ml, sind als Ausgangsmaterial für die Herstellung der hochattenuierten Tierpockenstämme bevorzugt.
  • Die Vermehrung der Poxviren führt in VERO-Zellen zu einem typischen cytopathischen Effekt, der zur Zerstörung der infizierten Zellen führt (Lyse). Bei einer primären Impfdosis von ca. 10 MOI („multiplicity of infection") kommt es nach einer kurzen Abkugelungsphase (1-2 Tage) für etwa 3 Tage zu netzartigen Zellstrukturen und nach etwa 5 Tagen zur Lyse der Zellen.
  • Die aus der letzten Passagierung gewonnen Virusernten können entsprechend ihrer Verwendung weiter verarbeitet werden. Beispielsweise können die in den Viren enthaltenen Nukleinsäuren zur Herstellung von Vektor-Vakzinen rekombinant kloniert werden. Oder die hochattenuierten Virusernten können lyophilisiert werden und beispielsweise durch Zusatz von 2,5% Gelatine bei 4°C zur weiteren Verwendung, beispielsweise als Paramunitätsinducer aufbewahrt werden. Für medizinische und therapeutische Indikationen kann das Lyophilisat auf dessen Unschädlichkeit und Wirksamkeit überprüft werden.
  • Hochattenuierung von Orthopoxviren
  • In einer bevorzugten Ausführungsform lassen sich die Orthopoxviren durch folgendes, beispielhaft mit Kamelpockenviren beschriebene Verfahren hochattenuieren:
  • Orthopoxvirus cameli, h-M 27
  • Kamelpockenviren, isoliert aus Pustelmaterial erkrankter Tiere, wie der Stamm M 27, werden in embryonale Lammnieren-Zellkulturen über etwa 2 Passagen angezüchtet. Die so gezüchteten Tierpockenviren werden durch eine geeignete Methode, bevorzugt durch die Plaque-Endverdünnungsmethode, in VERO-Zellen übertragen und dort für etwa 5 Passagen weitergeführt. Nach Passagierung in einer VERO-Zellkultur, wird die letzte Zellkulturpassage auf MA-Zellen (MA-104-Affennierenzellen) adaptiert und etwa 114 mal in Passagen weitergeführt. Die so erhaltene 121. Plaque-gereinigte MA-Passage (insgesamt 284 Passagen) hat sich als einfach attenuiert erwiesen. Bei Isolaten dieser Passage, d.h. bei einer einfachen Attenuierung, lässt sich bereits ein Rückgang der Virulenz für den homologen Wirt, eine Einengung des Wirtsspektrums, ein Anstieg des Infektiositätstiters, eine Abnahme der Riesenzellen beim cytopathischen Effekt in Zellkulturen und eine geringe Abnahme der spezifischen immunogenen Aktivitäten beobachten. Aufgrund der bei einer einfachen Attenuierung noch vorhandenen immunisierenden Eigenschaften der Tierpockenviren, eignen sich einfach attenuierte Kamelpockenviren auch für eine parenterale Impfung gegen Variola des Menschen oder als Impfstoff gegen Kamelpocken (O.-R. Kaaden, A. Walz, C.P. Czerny and U. Wernery, 1992: „Progress in the development of a camelpox vaccine", Proc.1th Int.Camel Conf., 1, 47-49).
  • Die Hochattenuierung des Kamelpockenvirusstamms M 27 wird durch Fortführung des attenuierten Stamms in VERO-Zellen erreicht. Hierzu müssen mindestens weitere 50-150 Passagen, bevorzugt 100 Plaque-gereinigte VERO-Passagen durchgeführt werden. Das auf diese Weise erhaltene hochattenuierte Kamelpockenvirus h-M 27 (h = hochattenuiert) erweist sich als äußerst stabil. Insgesamt sind also für die Herstellung des erfindungsgemäßen hochattenuierten Kamelpockenvirus etwa 384 Zellkulturpassagen notwendig. Die genaue Zahl der Passagen soll hierbei allerdings nicht als beschränkend aufgefasst werden. Der Fachmann wird erkennen, dass Modifikationen der hier beschriebenen Verfahren und der verwendeten Parameter insbesondere der Zellpassagenzahl oder Zelllinie zur Hochattenuierung eines Tierpockenvirusstamms innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen.
  • Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene hochattenuierte Kamelpockenvirus, Stamm h-M 27, weist einen totalen Verlust der Virulenz und Kontagiosität für den homologen Wirt und einen hohen Infektiositätstiter in VERO-Zellen (107. 25 KID5O/ml) auf. Es ist daher besonders für die Verwendung als paraspezifisches Vakzin (Paramunitätsinducer) geeignet. Dabei kann der auf hochattenuierten Tierpockenviren basierende Paramunitätsinducer sowohl in vermehrungsfähiger als auch in inaktivierter Form verwendet werden. In inaktivierter Form wird das hochattenuierte Virus, wie unten beschrieben, mit Beta-Propiolacton behandelt (V. Fachfinger, T. Schlapp, W. Strube, N. Schmeer and A. Saalmüller, 2000: „Pox-virus-induced immunostimulating effects on porcine leukocytes", J.Virology 74, 7943-7951; R. Förster, G. Wolf und A. Mayr, 1994: „Highly attenuated poxvirus induce functional priming of neutrophils in vitro", Arch.Virol. 136, 219-226; Mayr A., 1999: „Paraspezifischen Vaccinen aus Pockenviren (Paramunitätsinducer): „Eine neue Art von Impfstoff, Ärztezschr. Naturheilverf. 40, 550-557; Mayr, A., 2000: „Paraspezifische Vaccine – Eine neue Art von Impfstoffen zur Regulation von Dysfunktionen in verschiedenen Körpersystemen", Erfahrungsheilkunde (EHK) 49, 591-598).
  • Bei einer einfachen Attenuierung ist die Genomlänge des Virus durch auftretende Deletionen bereits deutlich vermindert. Die Genomlänge des Ausgangsvirus (Wildtyp) beträgt etwa 193 900 bp, während die Genomlänge des attenuierten M 27-Stammes etwa 172 400 bp beträgt. Durch die konventionelle Attenuierung kommt es somit zu einem deutlichen Verlust von Nukleotiden in der DNA. Ein Restriktionsverdau mit dem Restriktionsenzym HindIII zeigt, dass im Genom vier Restriktionsfragmente weniger im Analysegel vorhanden sind (Otterbein C.K., 1994, Vet.Med.Diss. München). Dabei befinden sich zwei Deletionen im rechten und zwei Deletionen im linken terminalen Abschnitt des Virusgenoms. Der zentrale, konservierte Bereich des Virusgenoms bleibt unverändert (C. Gubser, S. Hue, P. Kellam and G.L. Smith, 2004: „Poxvirus genomes: a phylogenetic analysis", J.Gen.Virol. 85, 105-117.) Die Länge des Virusgenoms verkürzte sich durch die Hochattenuierung weiter von 172 400 bp (attenuiertes Virus) auf 160 300 bp. Die Zahl der Deletionen stieg von 4 auf 5 (zwei im linken und 3 im rechten terminalen Abschnitt des Genoms), wobei der zentrale, konservierte Bereich des Virusgenoms stabil blieb. Weiter führte die Hochattenuierung zu einem Verlust von Interferon α- und γ- sowie weiteren Interleukin-Rezeptoren und überraschenderweise auch zu einer Aktivierung von hämatopoetischen Stammzellen.
  • Leporipoxvirus myxomatosis, Myxomatosevirus, h-M 2 In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde die Hochattenuierung mit dem Myxomatose-Virusstamm M 2 durchgeführt. Auch hier erfolgte eine Passagierung in CAM-Zellen, gefolgt von mehreren Passagen VERO- und AVIVER-Zellen und schließlich weitere Passagen in VERO-Zellen.
  • Das für die Attenuierung verwendete Myxomatosevirus wurde aus der ödematösen Subkutis (linkes Ohr) eines in typischer Weise an Myxomatose erkrankten europäischen Wildkaninchens (Gattung Oryctolagus) das Myxomavirus über die Anzüchtung auf der Chorioallantoismembran (CAM) 10 Tage bebrüteter Hühnereier (VALO-Eier) isoliert und dreimal nach dem Verfahren von Herrlich et al. auf der CAM in Passagen adaptiert (Herrlich A., Mayr A. und Munz E.: „Die Pocken", 2. Aufl., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). Die dritte CAM-Passage wurde in einer 1. Stufe auf VERO-Zellen über 120 Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection) adaptiert, in einer 2. Stufe durch 24 Zwischenpassagen in AVIVER-Zellkulturen vermehrt und in der 3. Phase in VERO-Zellen weitergezüchtet. Insgesamt sind etwa 300 Passagen mit dem Ziel der Attenuierung durchgeführt worden. Nach diesen kontinuierlichen Endverdünnungspassagen war das ursprünglich virulente Myxomavirus attenuiert.
  • Die Hochattenuierung des Myxomavirusstammes M 2 wird durch die Fortführung des attenuierten Stammes in VERO-Zellen erreicht. Hierzu hierzu müssen mindestens weitere 250 bis 350 Passagen, bevorzugt 300 Plaque-gereinigte Passagen in VERO-Zellen durchgeführt werden. Der auf diese Weise gewonnnene Virusstamm Myxoma h-M 2 (h = hochattenuiert) erweist sich wie der hochattenuierte Kamelpockenstamm als äußerst stabil. Er weist ebenfalls einen totalen Verlust der Virulenz und Kontagiosität für den homologen Wirt, einen hohen Infektiositätstiter (106,75 KID5O), völliger Verlust der Immunogenität, Erhöhung der paramunisierenden Wirksamkeit, weitere Einengung des Wirtsspektrums, weitere Deletionen im Genom und Verlust verschiedener Interferon und Interleukin-Rezeptoren auf.
  • Eigenschaften der hochattenuierten Orthopoxviren
  • Die erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenstämme sind wie folgt charakterisiert:
    • 1. erhöhte biologische Stabilität;
    • 2. Verlust der Virulenz und Kontagiosität, auch für 2-3 Tage alte Babymäuse (parenteral, intraperitoneal);
    • 3. Verlust der spezifischen Immunogenität nach parenteraler und intraperitonealer Applikation;
    • 4. vollständige Einengung des Wirtsspektrums;
    • 5. Erhöhung des Infektiositätstiters des attenuierten Virus in VERO-Zellen;
    • 6. starke paramunisierende Wirksamkeit (vermehrungsfähig und inaktiviert);
    • 7. Verkürzung der Genomlänge der attenuierten Tierpockenviren, entsprechende Abnahme des Molekulargewichtes;
    • 8. Erhöhung der Zahl der Deletionen im terminalen Bereich;
    • 9. Verlust des Interferon α- und γ-Rezeptors und anderer Interleukin-Rezeptoren;
    • 10. Aktivierung der hämatopoetischen Stammzellen.
  • Die Zahl der Zellpassagen und der Zellarten, die für eine konventionelle Attenuierung im Vergleich zu einer Hochattenuierung notwendig sind, sind in der Tabelle 3 zusammengestellt. In der Regel sind für eine Hochattenuierung mehr als 100 bis etwa 300 Passagen in verschiedenen permissiven Wirtssystemen notwendig. Für die gesamte Attenuierung ist ein Zeitraum von ca. 15-30 Jahren erforderlich.
  • Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigt einen Überblick über die biologischen und gentechnologischen Unterschiede zwischen einer konventionellen Attenuierung und einer erfindungsgemäßen Hochattenuierung am Beispiel des Vacciniavirus, Stamm MVA. So treten gehäuft Deletionen in den terminalen Bereichen des Virusgenoms (inverted terminal repeat) auf und das Molekulargewicht ist aufgrund geringerer Basenpaaren reduziert. Bei hochattenuierten Tierpockenviren fehlt etwa 20% des Ursprungsgenoms (was sie deshalb auch als Vektor-Vakzine so attraktiv macht, siehe unten). Weiter findet man einen Verlust von Rezeptoren, z.B. für IL-1β und TH 1-Zellen und eine Verstärkung der NK-Zell-Aktivierung und der Bildung von haematopoetischen Stammzellen sowie eine weitere Einengung des Wirtsspektrums in Zellkulturen. Ferner ist Interferon α und γ, IL-1, 2, 6, 12, sowie GM-CSA, TNF verstärkt. Schließlich besitzen die hochattenuierten Tierpockenstämme keine spezifische Immunogenität, jedoch aber eine erhöhte Aktivität des unspezifischen Immunsystems (Paramunität). Eine Virulenzgegenüber Mensch oder Tier fehlt völlig.
  • Weiterverarbeitung von hochattenuierten Parapoxviren zu Paramunitätsinducern
  • Bei der Herstellung von Paramunitätsinducern aus hochattenuierten Pockenvirusstämmen kann eine Inaktivierung durch chemische Behandlung mit Beta-Propiolacton bei einer Konzentration von 0,01%-1 % Beta-Propiolacton durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist hierbei eine Konzentration von 0,05% Beta-Propiolacton. Idealerweise wird eine Inaktivierung mit Beta-Propiolacton bei einem pH von 7,8 für etwa 1 Stunde bei 4° C unter Rühren und anschließender Inkubation bei 37° C für etwa 4 Stunden und über Nacht bei +4° C, durchgeführt. Eine Inaktivierung mit Beta-Propiolacton führt zu einem vollständigen Verlust der immunisierenden Eigenschaften bei einem gleichzeitigen starken Anstieg der paraspezifischen Wirksamkeit.
  • Bei der Herstellung von Paramunitätsinducern erfolgt die Reinigung der hochattenuierten Viruspartikel vorzugsweise mittels Zentrifugation bei niedriger Umdrehungszahl (z.B. 1000 UpM). Nach der Zentrifugation kann 0,5-10% succinylierte Gelatine (z.B. Polygeline, erhältlich von z.B. Firma Hausmann, St. Gallen/Schweiz), vorzugsweise 5% succinylierte Gelatine zugesetzt werden. Das resultierende Gemisch kann anschließend in Portionen von z.B. 1.5 ml in entsprechenden sterilen Glasfläschchen oder Ampullen lyophilisiert und bei Bedarf mit destilliertem Wasser (Aqua dest.) aufgelöst werden. Ein Volumen von 0,5-2 ml, vorzugsweise von 1,0 ml, des mit Aqua dest. aufgelösten Lyophilisats entspricht einer Impfdosis für den Menschen bei intramuskulärer Applikation (siehe auch Mayr A. und Mayr. B.: „Von der Empirie zur Wissenschaft", Tierärztl. Umschau, Aufl. 57: 583-587, 2002). Das lyophilisierte Präparat kann bei Temperaturen von etwa +4°C bis +8°C oder bei geringeren Temperaturen (z.B. -60°C) zeitlich unbegrenzt stabil gelagert werden.
  • Verwendung von hochattenuierten Tierpockenviren als Paramunitätsinducer
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von hochattenuierten Tierpockenvirusstämmen bzw. von Bestandteilen hochattenuierten Tierpockenstämme einzeln oder Kombinationen als Paramunitätsinducer. Beispiele sind vermehrungsfähige oder inaktivierte frisch isolierte Tierpockenviren, vermehrungsfähige oder inaktivierte rekombinante Tierpockenviren, die sich von frisch isolierten Tierpockenviren ableiten, Virushüllen, abgetrennte Hüllen sowie Spaltprodukte und aberrante Formen dieser Hüllen, einzelne native oder rekombinante Polypeptide oder Proteine, insbesondere Membran- und Oberflächenrezeptoren, die in isolierten Tierpockenviren vorkommen oder von einem genetisch modifizierten Pockenvirus oder einem Teil seiner genetischen Information rekombinant exprimiert werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es daher, verschiedene hochattenuierte Pockenstämme des gleichen oder eines anderen Genus zur Verwendung als Paramunitätsinducer zu kombinieren.
  • Wegen ihrer optimalen paramunisierende Eigenschaften eignen sich die hochattenuierten Tierpockenviren für folgende prophylaktische oder therapeutische Indikationen bei Mensch und Tier:
    • – Multifaktorielle infektiöse Faktorenkrankheiten und Mischinfektionen, chronische Manifestationen infektiöser Prozesse, hartnäckig rezidivierende Infektionen sowie chemotherapieresistente, bakterielle und virale Infektionen
    • – Abwehrschwächen beziehungsweise Dysregulationen im Abwehrsystem eines Organismus
    • – neonatale Infektionsbedrohung
    • – adjuvante Therapie bei bestimmten Tumorkrankheiten, z.B. Verhütung der Metastasierung, Minderung von Nebenwirkungen durch Chemo- und Strahlentherapie
    • – Verbesserung der Wundheilung, Vermeidung von Sekundärinfektionen nach chirurgischen Eingriffen bzw. durch Verletzungen
    • – Regulierung der Homöostase zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel-, Gefäß- und Nervensystem.
  • Durch die sofort einsetzende paramunisierende Wirkung, fördern die hochattenuierten Tierpockenviren die Unschädlichkeit gegenüber Erregern, wodurch Stresssymptome, latente Infektionen, Fieber, ein verminderter Allgemeinzustand u.a. Faktoren, die eine Impfung belasten können, neutralisiert werden.
  • Die erfindungsgemäßen Paramunitätsinducer auf der Basis von hochattenuierten Tierpockenstämme eignen sich somit zur Induktion des paraspezifischen Immunsystems und/oder zur Prophylaxe bzw. Behandlung von Defekten oder multikausale Infektionskrankheiten. Beispiele solcher Krankheiten sind Dysfunktionen des Immunsystem, Immunsuppression, Immunschwäche-Erkrankungen, Dysfunktionen der Homöostase zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel- und Nervensystem, neonatale Infektionsbedrohung, Tumorerkrankungen, Viruserkrankungen, bakterielle Erkrankungen, therapieresistente infektiöse Faktorenkrankheiten, virale und bakterielle Mischinfektionen, chronische Manifestationen infektiöser Prozesse, Leberkrankheiten unterschiedlicher Genese, chronische Hautkrankheiten, Herpeskrankheiten, chronische Hepatididen, grippale Infekte, Endotoxinschäden, Verbesserung der Wundheilung mit Verhütung von Sekundärinfektionen.
  • Eine Applikation der hier beschriebenen hochattenuierten Tierpockenstämme kann lokal oder parenteral erfolgen. Die lokale Verabreichung von Paramunitätsinducern stimuliert speziell die paraspezifischen Abwehrmechanismen in den Schleimhäuten und in der Haut. Daneben kommt es aber auch zu einer gewissen systemischen Wirkung. Dagegen beeinflussen parenteral angewendete Paramunisierungen die lokalen Abwehrmechanismen in der Haut und der Schleimhaut kaum. Bevorzugt ist hierbei eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen hochattenuierten Tierpockenstämme und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  • Ein solches Trägermittel oder Zusatzstoffe sind z.B. Polyethylenglycol, Dextrose, Sorbit, Mannit, Polyvinylpyrrolidon, Gelantine, Magnesiumstearat, Carboxylpolymethylen, Carboxylmethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylacetat.
  • Verwendung von hochattenuierten Tierpockenviren als Vektor-Vakzine
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der hochattenuierten Pockenvirusstämme zur Herstellung von Vektor-Vakzinen (Übersicht: Pastoret, P.-P. und Vanderplasschen, A., 2003). Im Vergleich zu konventionell attenuierten Stämmen eignen sich hochattenuierte Tierpockenvirusstämme noch besser als Vektoren für die Herstellung von Vektor-Vakzinen, da sie vollständig ihre immunisierende Eigenschaften durch die Hochattenuierung verloren haben. Da die Viren aufgrund ihres Infektiositätstiter passagiert werden, befinden sich die Deletionen in Bereichen, die für die Virusreplikation nicht erforderlich ist. Durch die im Vergleich zur konventionellen Attenuierung noch größer ausfallenden Deletionen in den terminalen Bereichen des Virusgenoms, bieten die hochattenuierten Tierpockenviren genügend Raum zur Insertion einer zu exprimierenden Fremd-Nukleinsäure (DNA) bzw. eines Fremd-Immunogens.
  • Die Fremd-Nukleinsäure kann für ein Peptid oder Protein kodieren, das immunisierende Epitope zur Verfügung stellt. Die Erfindung soll jedoch nicht auf ein bestimmtes Peptid oder Protein beschränkt werden. Der Fachmann wird erkennen, dass die Fremd-Gene entsprechend ihrer Größe in den passenden Deletionsbereich des Virus einkloniert werden kann. Die Expression des eingeführten Peptids oder Proteins kann durch Kontrollelemente wie einen Promotor und falls erforderlich durch Enhancer-Elemente gesteuert werden. Durch den Einbau einer Fremd-Nukleinsäure, die für ein Peptid oder Protein kodiert, kann eine starke, spezifische immunstimulatorische Eigenschaft gegen das Peptid oder Protein induziert werden. Dies lässt sich beispielsweise ausnützen, indem eine virale Nukleinsäuresequenz in das Vektorkonstrukt kloniert wird, deren Expression eine Immunantwort in dem transfizierten Wirt auslöst.
  • Die Klonierung von rekombinanten Tierpockenviren als Vektor-Vakzine erfolgt nach der letzten Plaque-Endverdünnungspassage. Die Virus-Nukleinsäure kann zur Klonierung mit geeigneten Restriktionsendonukleasen gespalten werden und mit den Fremd-Nukleinsäuresequenzen durch Standard-Ligationsverfahren ligiert werden.
  • Gegenüber konventionellen Impfstoffen bzw. Vektor-Vakzinen, für die andere mikrobielle Vektoren benutzt werden, haben die erfindungsgemäßen Vektor-Vakzinen den Vorteil, dass sie nicht allergisch wirken und dem eluierten spezifischen Antigen ein optimal reguliertes Immunsystem anbieten, was zu einem optimalen Impferfolg beiträgt. Auch sind die erfindungsgemäßen Vektor-Vakzinen frei von lokalen oder systemischen negativen Nebenwirkungen. Da sie die immunologische Lücke bis zur vollen Ausbildung der Immunität ausnützen, sind sie vor allem für Notimpfungen (z.B. bei akuter Infektionsgefahr, vor unerwarteten Reisen) geeignet.
  • Die Beobachtung, dass durch eine hervorragende paraspezifische Wirksamkeit des Vektors Tierpockenvirus der Impferfolg und die Unschädlichkeit der Vakzine beträchtlich gesteigert werden kann, ist neu und macht die Stämme für die Herstellung von Vektor-Vakzinen attraktiv. Vektor-Vakzinen, die auf hochattenuierten Tierpockenstämmen basieren, sind deshalb bezüglich ihrer Wirksamkeit und Unschädlichkeit konventionellen Vektor-Vakzinen überlegen.
  • TABELLENVERZEICHNIS
    • Tabelle 1: Gliederung der Familie Poxviridae
    • Tabelle 2: Systematik der Orthopockenviren (Genus Orthopoxvirus, OVP)
    • Tabelle 3: Unterschiede einer konventionellen Attenuierung und einer Hochattenuierung
    • Tabelle 4: Passagenzahlen einer konventionellen Attenuierung im Vergleich zu einer Hochattenuierung.
    • Tabelle 5: Applikationsschema zur Behandlung mit Paramunitätsinducer
    • Tabelle 6: Indikationen zur Paramunisierung mit dem hochattenuierten Myxomavirus h-M 2.
  • BEISPIELE
    •
  • Die nachfolgenden Beispiele sind bevorzugte Ausführungsformen und dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, die jedoch nicht auf diese beschränkt sein soll.
  • Beispiel 1
  • Als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Myxoma-Paramunitätsinducern (h-PIND-Myxo) wurde konventionell attenuiertes Myxomavirus M 2 (3 CAM-Passagen, 277 VERO-Passagen, 24 AVIVER-Passagen = 304 Passagen) über weitere 114 MA-Passagen und 179 VERO-Passagen, weiter passagiert (insgesamt 597 Passagen) und dadurch hochattenuiert (siehe Tabelle 4). Die VERO-Virusernten des hochattenuierten Leporipoxvirus myxomatosis h-M 2 haben einen Titer von mindestens 106,75KID5O/ml.
  • Die so erhaltenen hochattenuierten Leporipoxviren zeigten keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften und wurden folgendermaßen zum Paramunitätsinducer weiterverarbeitet:
  • Die Virusernten wurden mit Beta-Propiolacton 0,05% inaktiviert (pH 7.8, 1 Stunde bei +4° C (gerührt), für 4 Stunden bei einer Temperatur von +37° C bei einem pH von 7,8 gerührt (pH-Wert kontrollieren und wenn nötig auf pH 7.8 einstellen), über Nacht inkubiert (ca. 12 Stunden stationär bei einer Temperatur von +4° C) und anschließend durch grobtouriges Zentrifugieren (15 Min., ca. 4000g) gereinigt. Dem inaktivierten Virusmaterial wurde Polygeline (pH 7.8) für eine Gelatine-Gesamtkonzentration von 2,5% zugesetzt. Das so präparierte Virusmaterial wurde in sterile Fläschchen á 1,5 ml abgefüllt und lyophilisiert. Die Lyophilisate wurden bei einer Temperatur von + 4° C aufbewahrt. Vor Gebrauch wurden die Lyophilisate mit 1ml sterilem Aqua dest pro inj. aufgelöst und tief intramuskulär appliziert.
  • Die Applikationsfolgen und medizinischen Indikationen sind in der Tabelle 5 aufgelistet. Der Myxoma-Paramunitätsinducer eignet sich beispielsweise zur unterstützenden Behandlung von Herpes zoster (Modus 4) mittels Paramunisierung. Hierbei führt die Behandlung zur Abheilung der krankheitstypischen Pusteln nach 3-4 Tagen. Bei prä-grippalen Infekten beobachtete man bei der Anwendung der erfindungsgemäßen Paramunitätsinducer ein völliges Verschwinden der Symptome (Fieber, Abgeschlagenheit, Kopf- und Gliederschmerzen). Bei Patienten mit Wundverletzungen (z.B. nach Operationen) verzeichnete man mit den h-P1ND-MYXO eine ungewöhnlich rasche Wundheilung, ohne Sekundärinfektionen. Bei Stomatitis und den Läsionen nach einem Zahnarztbesuch kam es nach dem Einreiben des Lyophilisats zum Verschwinden der Apthen bzw. Läsionen nach 1-2 Stunden.
  • Beispiel 2
  • Konventionell attenuiertes Kamelpockenvirus M 27 (siehe Beschreibungsteil) wurde durch weitere 263 Passagen in VERO-Zellen hochattenuiert (insgesamt 384 Passagen). Virusernten über 107.0 KID50/ml dienten als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Paramunitätsinducern. Hierzu wurde die Virusernte in analoger Weise wie in Beispiel 1 inaktiviert, zentrifugiert und lyophilisiert. Der Modus der Applikationen wie auch die Indikationen sind analog denen von Beispiel 1. Die gewonnenen Viren zeigten aufgrund der Hochattenuierung keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften.
  • Beispiel 3
  • Konventionell attenuiertes Kanarienpockenvirus (Avipox serinae, KP1, 535. FHE-Passage) wurde durch weitere 67 Passagen in FHE hochattenuiert (siehe Tabelle 4). Die 602. FHE-Passage diente in analoger Weise wie Beispiel 1 und 2 als hochattenuiertes Kanarienpockenvirus für die Herstellung von Paramunitätsinducern. Die gewonnenen Viren zeigten aufgrund der Hochattenuierung keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften.
  • Beispiel 4
  • Konventionell attenuiertes Hühnerpockenvirus (Avipoxvirus gallinum, HP1, 444.FHE-Passage) wurde durch weitere 98. FHE-Passagen hochattenuiert. Ab der 542. FHE-Passage erwies sich das Hühnerpockenvirus HP 1 als hochattenuiert und wurde in analoger Weise wie in Beispiel 1 zur Herstellung von Paramunitätsinducer verwendet. Die gewonnenen Viren zeigten aufgrund der Hochattenuierung keinerlei virulente oder immunisierende Eigenschaften.
  • Beispiel 5
  • Analog zu den in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Verfahren, wurden auch Paramunitätsinducer auf der Basis von Myxomavirus (OPV muris) und Parapoxviren hergestellt.
  • Beispiel 6
  • Hochattenuierte Tierpockenstämme wurden zur Herstellung von Vektor-Vakzinen verwendet. Bei der Herstellung von Vektor-Vakzinen ist vor allem die Kontrolle des pH-Wertes nach jedem einzelnen Herstellungsschritt zu beachten. Der pH-Wert sollte etwa 7.8 betragen. Die Attenuierung und Hochattenuierung der zur Vektorherstellung verwendeten Viren erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Dabei können alle gängigen gentechnologischen Verfahren zur Insertion von Nukleinsäureabschnitten, die für spezifische Antigene kodieren, gegen die eine spezifische Impfreaktion, d.h. Immunitätsbildung erzielt werden soll, verwendet werden. Das Fremd-Gen wird standardmäßig mittels geeigneten Restriktionsenzymen in die durch die Hochattenuierung erzeugten deletierten Nukleinsäureregionen der erfindungsgemäßen Tierpockenstämme eingebaut. Dabei werden Standard-Restriktionsverdaus und -Klonierungstechniken verwendet.
  • Zur Isolierung von rekombinanten Viruskonstrukten können beliebige (Selektions-)Marker-Gene oder Selektionskassetten verwendet werden, wie beispielsweise das β-Galaktosidase-Gen, die unter der Kontrolle von geeigneten Kontrollsequenzen sind.
  • Beispielhafte Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren aus Tierpockenstämmen sind in der WO 00/69455 beschrieben. Die Offenbarung dieser Druckschrift und die darin enthaltene Lehre zur Herstellung von Vektorvakzinen ist hiermit ausdrücklich unter Bezugnahme eingeschlossen, Tabellen Tabelle 1: Gliederung der Familie Poxviridae
    Figure 00300001
    Tabelle 2: Systematik der Orthopockenviren (Genus Orthopoxvirus, OVP) (aktualisiert nach dem "7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", 2000)
    Figure 00310001
  • Anmerkung: nach dieser noch unvollständigen Nomenklatur entfallen folgende, früher geführten Spezies:
    • OPV bubali (Büffel, OPV elefanti (Elefant), OPV equi (Pferd),
    • OPV cuniculi (Kaninchen)
    Tabelle 3: Unterschiede zwischen konventionell attenuierten und hochattenuierten MVA-Stämmen (MVA=Modifiziertes Vacciniavirus Ankara) MVA-Original (572. Passage in primären Hühnerembryofibroblastenkulturen) und VERO-MVA (weitere 182 Passagen in permanenten VERO-Zellkulturen (WHO-ATCC, CCL-81))
    Figure 00320001
    Tabelle 4: Beispielhafte Passagenzahlen in verschiedenen selektionierten Zellkulturen bei der konventionellen Attenuierung im Vergleich zur Hochattenuierung verschiedener Tierpockenstämme
    Figure 00330001
    Tabelle 5: Applikationsschema zur Behandlung mit Paramunitätsinducer
    Figure 00340001
    Tabelle 6: Indikationen zur Paramunisierung mit dem hochattenuierten Myxomavirus h-M 2 (h-PIND-MYXO) (Fallbeispiele aus der Familie)
    Figure 00350001
  • LITERATURVERZEICHNIS
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Claims (30)

  1. Hochattenuiertes Tierpockenvirus basierend auf einem Tierpockenvirusstamm der Familie Poxviridae, dadurch gekennzeichnet, dass das Tierpockenvirus keine virulenten und immunisierenden Eigenschaften mehr besitzt und das hochattenuierte Tierpockenvirus ein geringeres Molekulargewicht der Virusnukleinsäure, häufigere Deletionen im terminalen Bereich und einen vermehrten Verlust von Zytokinrezeptoren im Vergleich zu konventionell attenuierten Tierpockenstämmen aufweist.
  2. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei das Tierpockenvirus einen Verlust von Zytokinrezeptoren für Interferon α und γ.
  3. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei das Virusgenom des Tierpockenvirus um etwa 20% kleiner ist als das Virusgenom des Wildtyps.
  4. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Pockenvirusstamm um einen Kamelpockenvirusstamm handelt.
  5. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Kamelpockenvirusstamm um den Stamm h-M 27 mit der Hinterlegungsnummer 05040602 (ECACC) handelt.
  6. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Pockenvirusstamm um einen Myxoma-Virusstamm handelt.
  7. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Myxoma-Virusstamm um den Stamm h-M 2 mit der Hinterlegungsnummer 05040601 (ECACC) handelt.
  8. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem hochattenuierten Pockenvirusstamm um den Hühnerpockenstamm h-HP 1 handelt.
  9. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem hochattenuierten Pockenvirusstamm um den Ektromeliestamm h-Mül handelt.
  10. Hochattenuiertes Tierpockenvirus nach Anspruch 1, wobei der hochattenuierte Tierpockenvirusstamm durch folgendes Verfahren erhältlich ist: (a) Adaptierung der Tierpocken auf ein permissives Zellsystem oder Zellkulturen. (b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen. (c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen. (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen.
  11. Paramunitätsinducer auf der Basis von Tierpockenvirusstämmen der Familie Poxviridae, dadurch charakterisiert, dass die Pockenvirusstämme hochattenuiert sind und keine virulenten und immunisierenden mehr Eigenschaften besitzen.
  12. Paramunitätsinducer nach Anspruch 11, basierend auf einem Tierpockenvirusstamm nach einem der Ansprüchen 1 bis 10.
  13. Verfahren zur Herstellung von Paramunitätsinducern aus hochattenuierten Tierpockenviren, umfassend: (a) Adaptierung der Tierpocken auf ein permissives Zellsystem oder Zellkulturen. (b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen. (c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Hochattenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen. (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen.
  14. Verfahren zur Herstellung von Paramunitätsinducern aus hochattenuierten Myxoma-Viren, umfassend: (a) Isolierung von Tierpockenviren aus erkrankten Tieren über die Chorioallantoismembran 10 Tage alter Hühnerembryonen (CAM) und Weiterführüng in diesem Zellsystem über mindestens 2 Passagen; (b) Überimpfung und Weiterführung der isolierten Tierpockenviren für mindestens 300 Passagen in AVIVER- und VERO-Zellkulturen aus 10 Tage bebrüteten Hühnerembryonen (FHE); (c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in MA-Zellen für mindestens 100 Passagen; (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 170 Passagen.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die erzeugten hochattenuierten Myxomaviren einen Infektiositätstiter von etwa 106,75 KID5O/ml aufweisen.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei es sich bei den Myxomaviren um den Myxomavirusstamm h-M 2 mit der Hinterlegungsnummer 05040601 (ECACC) handelt.
  17. Verfahren zur Herstellung von Paramunitätsinducer aus hochattenuierten Kamelpockenviren, umfassend: (a) Isolierung von Tierpockenvirus aus erkrankten Tieren durch Anzüchtung über die Chorioallantoismembran (CAM) 10 Tage alter Hühnerembryonen und Weiterführung des isolierten Kamelpockenvirus über etwa 2 Passagen in der CAM; (b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über etwa 120 Passagen in VERO-Zellen Passagen (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection); (c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über etwa 24 Passagen in AVIVER-Zellen; (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über etwa weitere 157 Passagen in VERO-Zellen; e) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über weitere 114 Passagen in MA-Zellen; f) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren über weitere 179 Passagen in VERO-Zellen;
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die erzeugten hochattenuierten Kamelpockenviren einen Infektiositätstiter von etwa 107 KID50/ml aufweisen.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei den Kamelpockenviren um den Kamelpockenstamm h-M 27 mit der Hinterlegungsnummer 05040602 (ECACC) handelt.
  20. Vektor-Vakzine, umfassend die deletierte Nukleinsäure eines hochattenuierten, nichtvirulenten, nichtimmunisierenden Tierpockenvirus nach einem der Ansprüche 1-10 und in deren Deletionen zur Expression eingefügte Nukleinsäuresequenzen eines immunisierenden Peptids oder Proteins.
  21. Vektor-Vakzinen nach Anspruch 20, wobei die deletierte Nukleinsäure des hochattenuierten, nichtvirulenten, nichtimmunisierenden Tierpockenvirus und die Nukleinsäuresequenzen des immunisierenden Peptids oder Proteins in einem Plasmid enthalten sind.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen oder mehrere Paramunitätsinducer nach einem der Ansprüche 11 bis 12.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 zur lokalen oder parenteralen Applikation.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 23, weiter umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  25. Verwendung eines Paramunitätsinducers nach einem der Ansprüche 11 bis 12 zur Aktivierung des paraspezifischen Immunsystems in einem Säugetier oder im Menschen.
  26. Verwendung eines Paramunitätsinducers nach einem der Ansprüche 11 bis 12 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prophylaxe und/oder Behandlung einer mit Immunschwäche-assoziierten Erkrankung.
  27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die Immunschwäche-assoziierte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dysfunktionen des Immunsystems, Immunsuppression, Immunschwäche-Erkrankungen, Dysfunktionen der Homöodynamik zwischen Hormon-, Kreislauf-, Stoffwechsel- und Nervensystem, neonataler Infektionsbedrohung, Tumorerkrankungen, Viruserkrankungen, bakteriellen Erkrankungen, therapieresistenten infektiösen Faktorenkrankheiten, viralen und bakteriellen Mischinfektionen, chronischen Manifestationen infektiöser Prozesse, Leberkrankheiten unterschiedlicher Genese, chronischen Hautkrankheiten, Herpeskrankheiten, chronischen Hepatitiden, grippalen Infekten, Endotoxinschäden.
  28. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die hochattenuierten Paramunitätsinducer in der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Unterstützung der Wundheilung, Verhütung von Sekundärinfektionen nach chirurgischen Eingriffen oder Verletzungen eingesetzt werden.
  29. Verwendung einer Vektor-Vakzine nach einem der Ansprüche 20-21 zum Auslösen einer paraspezifischen und spezifischen Immunantwort in einem Säugetier oder im Menschen.
  30. Verfahren zur Herstellung von hochattenuierten Tierpockenviren umfassend die Schritte: (a) Adaptierung der Tierpocken auf ein permissives Zellsystem oder Zellkulturen. (b) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung durch Dauerpassagen in verschiedenen permissiven Zellsystemen, die optimale Infektiositätstiter ermöglichen. (c) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren zur Attenuierung in einem optimalen Zellsystem für etwa 100-300 Passagen. (d) Überimpfung und Weiterführung der Tierpockenviren in VERO-Zellen für mindestens 90 Passagen.
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