WO2006129036A2 - Biomarqueur a emission luminescente - Google Patents

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WO2006129036A2
WO2006129036A2 PCT/FR2006/050482 FR2006050482W WO2006129036A2 WO 2006129036 A2 WO2006129036 A2 WO 2006129036A2 FR 2006050482 W FR2006050482 W FR 2006050482W WO 2006129036 A2 WO2006129036 A2 WO 2006129036A2
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Pierre-Yves Renard
Anthony Romieu
Marc Massonneau
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Quidd
Universite De Rouen
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to novel compounds capable of emitting a detectable luminescent signal, to their use in a method for detecting and / or quantifying a physical, chemical or biological phenomenon, in particular enzymatic, as well as to a kit enabling the implementation of the method.
  • bioluminescent or chemiluminescent compounds that is to say whose luminescence is generated at the same time. from a chemical or biological reaction (LAXMAN et al., Proc Natl Acad Sci.
  • Chemiluminescent compounds their preparations and their uses have been known for a long time. These molecules called “high energies” contain enough energy to generate carbonyl groups in an excited electronic state, responsible for the phenomenon of chemiluminescence observed.
  • chemiluminescent compounds As representative of chemiluminescent compounds, mention may be made of compounds derived from dioxetane and more particularly derivatives of 1,2-dioxetane. These compounds are thermally labile and can decompose over a wide temperature range by emitting a light signal. In general, these compounds have the following general formula:
  • each R substituent corresponds to a hydrocarbon radical optionally comprising one or more heteroatoms, and two adjacent R's or an R adjacent to Ar-XW and one of the other two R or Ar may be joined, X may be O, S or N and W can represent a detachable group, if necessary loaded.
  • 1,2-dioxetane derivatives have been synthesized, among which compounds comprising a 3-bonded spiroadamantyl radical, already used as chemiluminescent substrates. Such derivatives are in particular described in the documents WO 96/24849, WO 90/07511 and US 5,330,900. These 1,2-dioxetane derivatives may comprise a recognition site for an enzyme and may be activated by an enzyme recognizing this site to generate a luminescent signal.
  • Phenol, in itself, as well as its esters with carboxylic acids are the most commonly used precursors for generating an oxygen anion
  • the object of the present invention is to propose new compounds derived from 1,2-dioxetane capable of generating, directly or by fluorescence energy transfer at intramolecular resonance (FRET), a luminescent signal that can be detectable through of a layer of biological tissue layers.
  • FRET fluorescence energy transfer at intramolecular resonance
  • Another object of the present invention is to provide compounds derived from 1,2-dioxetane which can be activated by any chemical, physical or biological phenomenon, and in particular enzymatic activity.
  • the invention thus has the advantage of translating information resulting from this activation, for example a hydrolysis-type information in the context of an enzymatic activity, into the appearance of a phenolate or a thiophenate, and to confer on the derived from spectroscopic properties distinct from those originally assigned to them.
  • Another object of the present invention is to provide compounds derived from 1,2-dioxetane which can be administered in vivo in order to be used in medical imaging methods.
  • the inventors thus observed, against all odds, that it was possible to associate with a 1,2-dioxetane backbone, as defined previously, a reagent arm activated by a physical, chemical or biological phenomenon, and especially by a enzymatic activity, without prejudicing the emission of a light signal.
  • the reactive arm considered according to the invention ensures, thanks to an intramolecular rearrangement, the transfer of the electrons necessary for the activation of the light signal.
  • the present invention relates to a compound of general formula (I):
  • S represents a labile structure activatable by a physical, chemical or biological phenomenon
  • - B is a reactive arm whose chemical structure is such that the activation of the labile structure S induces its intramolecular rearrangement in a form conducive to the release of a molecule A "
  • A is a chromophore of the general formula (IIa)
  • R 1 , R 2 and R 3 represent, independently of each other, a radical as defined below, such as, for example, a hydrogen atom or an alkyl radical; an alkoxy radical, an aryl radical, a hydroxyl radical, an oxo unit, an amino group, a silyl group, a halogen atom, b) R 2 and R 3 may form an oxo unit, c) R 1 and R 2 can be bonded to form a condensed ring with the dioxetane ring, as defined below, d) R 2 and R 3 or R 1 and Ar can be linked to form a spiro ring with the carbon of the dioxetane entity that carry them, as defined below,
  • Ar represents an arylene radical as defined in particular below,
  • X is O, N or S, and derivatives thereof, such as salts, esters or derivatives obtained by functionalizing a compound of general formula (I) with at least one targeting moiety.
  • the present invention relates to a compound of general formula (Va):
  • S is a labile structure and X, Ar, R 1 , R 2 , R 3 , R 5 and R 6 are as defined below.
  • the present invention relates to a compound derived from the functionalization of a compound according to the invention by at least one structural unit favoring, for example, targeting to a particular cell or tissue.
  • the present invention relates to a use for the purpose of detecting and / or quantifying a physical, chemical or biological phenomenon of at least one compound according to the present invention in which S is a structure labile activatable by said phenomenon.
  • the present invention relates to the use of a compound according to the invention, and in particular of general formula (Va), for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the implementation of an in vivo diagnostic method.
  • the present invention relates to a kit for the detection and / or quantification of a biological entity, in particular an enzyme, comprising a compound of general formula (I), and in particular of general formula
  • the present invention relates to a method for detecting and / or quantifying a biological entity, in particular an enzyme, comprising at least the steps of: contacting at least one effective amount of at least one compound of general formula (I), and in particular of general formula (Va), in which S is a labile structure activatable by said biological entity, in particular an enzyme, to detect and / or quantify in a medium presumed to contain said biological entity, and
  • the present invention relates to an in vivo diagnostic method, in particular for medical imaging purposes, comprising the detection and / or the quantification of a biological entity, in particular an enzyme, by means of of a compound of general formula (I), and in particular of general formula (Va) in which S is a labile structure activatable by said biological entity to be detected and / or quantified.
  • alkyl radical is intended to mean a linear, branched or cyclic, condensed or non-condensed, saturated or unsaturated hydrocarbon radical containing from 1 to 20 carbon atoms, preferably from 2 to 12 carbon atoms, and more preferably 3 to 6 carbon atoms and more particularly 4 carbon atoms, may be substituted by radicals as defined below.
  • radicals such as methyl, ethyl, isopropyl, n-butyl, t-butyl, t-butylmethyl, n-propyl, pentyl, n-hexyl, 2-ethylbutyl, heptyl, octyl , nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl or icosanyl.
  • cyclic alkyl radical means an alkylene ring of 4 to 10 carbon atoms, such as cyclopropyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexylmethyl or cycloheptyl.
  • polycyclic alkyl radical means a polycyclic alkylene of 4 to 20 carbon atoms, in particular of 6 to 12 carbon atoms, optionally substituted with one to 10 radicals independently chosen from a C 1 -C 10 alkyl radical, in particular C 2 -C 6 alkoxy radical C 1 -C 10, especially C 2 -C 6 alkylamino C 1 -C 10, especially C 2 -C 6 alkylthio C 1 -C 10 , especially C 2 -C 6 , a halogen atom and a C 1 -C 10 haloalkyl radical, especially C 2 -C 6 .
  • a polycyclic radical that is suitable for the implementation of the invention, mention may be made of the adamantyl radical or the bicyclo [2.2.1] heptyl radical.
  • alkoxy radical means a radical - OR in which the alkyl radical is a linear, branched or cyclic hydrocarbon radical, condensed or not, saturated or unsaturated, as defined above.
  • the hydrocarbon chain of the aforementioned radicals can be interrupted by one or more heteroatoms chosen from O, N and S, to form, for example, a heteroalkyl radical such as an alkyl ether radical, an alkyl ester radical or a heterocycle.
  • heterocyclic radical is understood to mean, for example, and without limitation, a furanyl radical, a thiophenyl radical, a pyrolyl radical, an oxazolyl radical, an isoxazolyl radical, a thiazolyl radical or a radical. isothiazolyl, an imidazolyl radical, a pyrazolyl radical, a furazanyl radical, a pyranyl radical, a pyridinyl radical, a pyridadinyl radical, a pyrimidinyl radical or a pyradinyl radical.
  • aryl radical means an aromatic ring comprising from 1 to 5 aromatic rings, optionally fused, of 6 to 30 carbon atoms, in particular of 6 to 10 carbon atoms, optionally comprising one or more heteroatoms chosen from O, N and S.
  • aryl radicals suitable for the implementation of the invention it is possible to mention the phenyl radical, the naphthyl radical, the anthryl radical, and all the aromatic rings comprising a plurality of heteroatoms selected from O, N and S, such as for example pyridine, thiophene, pyrrole, furan, quinoline.
  • arylene radical means an aryl radical, as defined above, which is divalent.
  • substituents which may be used for substituting the abovementioned radicals, mention may be made of a hydroxyl radical, an oxo unit, a thio group, an amino group, a halogen atom, a alkyl radical, a carboxy radical, an acyl radical, an amido radical, an alkoxy radical, an alkyl- or dialkylamino radical, an alkylthio radical or a haloalkyl radical such as, for example, perfluoroalkyl, a alkyl-, dialkyl- or trialkyl-silyl radical, an alkyl-, dialkyl- or trialkyl-siloxy radical, an aryl radical, as defined above.
  • halogen atom an F, Cl, Br or I atom.
  • halogen atoms advantageously used in the present invention are fluorine and chlorine.
  • haloalkyl radical means an alkyl radical as defined previously substituted with one or more halogen atoms as defined above, and in particular, by way of non-limiting example, perfluoromethyl.
  • S-B-A and include derivatives thereof, such as salts, esters or derivatives functionalized with structural elements, especially for targeting purposes.
  • B is different from a simple chemical bond and represents a reactive hydrocarbon arm whose chemical structure is such that the activation of the labile structure S by a chemical phenomenon, physical or biological causes the intramolecular rearrangement of B in a form conducive to the release of a molecule A " .
  • Advantageously B is represented by an alkyl radical C 1 -C 8 , in particular C 2 -C 6 , and in particular C 3 -C 4 , optionally interrupted by a C 6 -C 14 arylene radical, especially C 6 -C 10 and / or by one or more heteroatoms chosen from O, N, and S, and optionally substituted by one or more substituents as defined above and in particular selected from a hydroxyl radical, an oxo unit, an amino group, a halogen, an alkyl radical, an alkoxy radical, a carboxy radical, an alkylamino radical, a dialkylamino radical, an aryl radical or an aryloxy radical.
  • the alkyl radical comprises two carbon atoms.
  • the arylene radical may also be substituted with one or more substituents as defined above.
  • the arylene radical is chosen from a phenylene or a naphthylene.
  • the positions of the two bonds of the radical may be in ortho, meta or para.
  • the reactive arm B can be chosen from: a benzylidene radical,
  • R 4 is a C 1 -C 20 hydrocarbon-based chain, in particular C 2 -C 12 and in particular C 3 -C 6 , optionally interrupted by one or more heteroatoms and / or unit (s) -CO and / or -N (alkyl) -, placed in ortho, meta or para of the radical D- (CH 2 ) J-, and in particular chosen from radicals - (CH 2 ) k -O, - (CH 2 ) k -C (O) -O, -CH 2 -OC (O) -N (CH 3 ) - (CH 2 ) 2 -N (CH 3 ) -C (O) -O, where k is 1 or 2, and advantageously 1,
  • R 5 and R 6 are, independently of one another, a hydrogen atom or a linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated C 1 -C 20 , especially C 2 -C 12 , hydrocarbon-based chain, and in particular C 3 -C 6 chosen from an alkyl radical, an alkoxy radical, an alkyl- or dialkylamino radical, an alkylthio radical, or an aromatic C 6 -C 30 , especially C 6 -C 10 ring chosen from an aryl radical; , an aryloxy radical, an arylamino radical, an arylthio radical, especially as defined above.
  • the radicals R 5 and R 6 are, independently of one another, chosen from: a hydrogen atom, a C 1 -C 6 alkyl radical, an alkenyl radical,
  • C 2 -C 6 a C 3 -C 6 alkinyl radical, branched or unbranched, a C 3 -C 6 cycloalkyl radical, which may or may not be substituted with one or more substituents as defined above and chosen in particular from an atom of halogen, an alkyl radical, an alkoxy radical, an aryl radical such as, for example, a benzyloxy radical or a benzyl radical, a cyclic, aliphatic, aromatic or heteroaromatic hydrocarbon-based chain, comprising one or more heteroatoms chosen from O, N and S, C 3 -C 8 , in particular C 4 -C 7 , optionally substituted with one or more substituents as defined above and in particular selected from a halogen atom, an alkyl radical, an alkoxy radical and an aryl radical such as, for example, a benzyloxy radical, a benzyl radical, a phenyl radical or a naphthy
  • the reagent arm B may be as defined in US Pat. No. 6,271,345, the content of which is incorporated herein by reference.
  • the intramolecular rearrangement of B leads to the formation of a lactam or a lactone.
  • Chromophore A in the general formula (I) compounds derived from 1,2-dioxetane according to the invention, the chromophore A is represented by the general formula (IIa):
  • R 1 , R 2 and R 3 represent, independently of one another, a hydrogen atom, a hydroxyl radical, an amino radical, a thio radical, a halogen atom or a C 1 hydrocarbon-based chain; -C 20 , especially C 2 -C 12 , and in particular C 3 -C 6 selected from an alkoxy radical, an alkyl radical, a heteroalkyl radical, a cycloalkyl radical, a heterocycloalkyl radical, an ether radical, an alkenyl radical; an alkynyl radical, an alkylamino radical, a dialkylamino radical, an alkyl-, dialkyl- or trialkyl-silyl radical, an alkyl-, dialkyl- or trialkyl-siloxy radical, an alkylthio radical, a haloalkyl radical or a C aromatic ring; 6 -C 30 , in particular C 6 -C 10
  • Ar represents a C 6 -C 30 arylene radical, in particular C 6 -C 10 arylene, and being optionally substituted with one or more substituents chosen in particular from a hydroxyl radical, a halogen atom, an oxo unit, an amino radical, an alkylamino radical, a dialkylamino radical, a thio radical, an alkyl-, dialkyl- or trialkylsilyl radical, an alkyl-, dialkyl- or trialkyl-siloxy radical, an alkyl radical, an alkoxy radical, an alkylthio radical or a radical; carboxy, a formyl radical, an alkyl ester radical, an alkyl ketone radical, a haloalkyl radical, an aryl radical, an arylester radical, an arylketone radical, an arylamino radical, a diarylamino radical, and
  • X can represent O, NH or S.
  • X can represent O.
  • the compound A " generated following the activation of the S-labile structure and the intramolecular rearrangement of the reactive arm B is unstable and reacts by emitting a light signal through a chemiluminescence reaction.
  • R 1 may be a fluorescent radical or an alkyl radical, as defined above, substituted by a fluorescent radical.
  • Ar may be substituted by a fluorescent radical or a radical capable of imparting a fluorescent character to the entire structure or a radical capable of modifying its fluorescent properties.
  • Ar and R 1 and / or R 2 and R 3 may be combined to form a cyclic or polycyclic or spiro-fused alkyl radical which may: either comprise at least one double bond or at least one triple bond in the ring or in a side chain, and optionally one or more heteroatoms selected from O, N and S, be connected to, or condensed with, a substituted aromatic ring or not.
  • Ar may be an aryl radical, such as a phenyl, naphthyl or anthryl radical, where appropriate substituted, in particular with radicals as defined previously and R 1 may be such that previously defined.
  • aryl radical such as a phenyl, naphthyl or anthryl radical
  • R 2 and R 3 are linked together to form an adamantyl radical spiro carbon dioxetane ring which carries them, optionally substituted, in particular by the radicals R 8 and R 9 defined below .
  • R 1 and R 2 may be linked together to form a ring fused with the dioxetane ring, and optionally comprising one or more heteroatoms selected from O, N, and S.
  • R 1 and R 2 form an oxacyclopentane condensed with dioxetane.
  • Such compounds are in particular described in application EP 1 342 724, the content of which is also incorporated herein by reference.
  • R 1 and R 2 may be linked together to form a polycyclic ring fused with dioxetane.
  • dioxetane such compounds are described in JP 2004-262817, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • the chromophore A is represented by the general formula (IIb):
  • R 1 is as defined above.
  • R 1 may be chosen from an alkyl radical, a fluorescent group and an alkyl radical substituted by a fluorescent group.
  • the alkyl radical is as defined above.
  • R 1 may be a linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated C 1 -C 6 alkyl or alkoxy radical, optionally comprising one or more heteroatoms chosen from O, N and S, and optionally substituted.
  • R 1 may be substituted with radicals as defined above.
  • R 1 is a C 1 -C 3 alkyl or alkoxy radical, preferably a methyl or methoxy radical.
  • R 8 and R 9 are, independently of one another, a hydrogen atom or an electroactive radical
  • X represents O, N or S.
  • X represents O
  • Ar represents an arylene radical, as defined previously, or a radical of general formula (IVa):
  • ⁇ symbolizes the covalent bond with X and symbolizes the covalent bond with the dioxetane ring.
  • ⁇ and * can be arranged in ortho, meta or para.
  • ⁇ and * may be arranged in meta,
  • R 10 represents a hydrogen atom, an electroactive radical or a fluorescent radical.
  • the electroactive radical may be able to modify the fluorescent properties of the radical Ar in the image, for example, of an alkyl-, dialkyl- or trialkyl-silyl radical, a radical NO 2 , an anthryl radical or a naphthyl radical. (see for example MATSUMOTO et al., Tetrahedron Lett, 2002, 43: 8955-58).
  • R 11 is chosen from a hydrogen atom or an aryl radical, for example C 6 -C 10 , condensed with the phenylene radical, in particular a phenyl radical to form a naphthylene radical.
  • the term "electroactive group” is intended to mean an electroacceptor or electron donor group
  • the chromophore A is such that at least one of the groups R 8, R 9 or R 10 is an electroactive radical promoting the solubilization of the compound of general formula (I) according to the invention in an aqueous solution.
  • R 8 and R 9 are, independently of one another, an electroactive radical chosen from a hydroxyl radical, a halogen atom, a cyano radical, an amide radical or an alkoxy radical, a halogenated alkyl radical, a phenyl radical, an alkoxyphenyl radical.
  • R 10 is a hydrogen atom or an electroactive radical advantageously chosen from a halogen atom, especially a chlorine, a fluorine, a cyano radical, a nitro radical or a mono or disubstituted amide radical.
  • R 8 , R 9 and R 10 are advantageously a hydrogen atom.
  • R 1 or R 10 may be a fluorescent radical in order to modify, by intramolecular FRET, the emission wavelength of the luminescent compound according to the invention.
  • these fluorescent radicals may be chosen, in a non-limiting manner, from phenyl and its derivatives, naphthalene and its derivatives such as 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonic acid and hydroxynaphthalenes, acrrhrenes and its derivatives such as 9,10-diphenylanthracene, 9-methylanthracene, pyrene and its derivatives such as N- (1-pyrene) iodoacetamide, hydroxypyrenes, biphenyl and its derivatives, acridine and its derivatives such as hydroxyacridines and 9 methylacridine, coumarin and its derivatives such as 7-dialkylamino-4-methylcoumarin, 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin, xanthene and its derivatives, phthalocyanine and its derivatives, stilbene and its derivatives such as 6, 6'-dibromostilbene and hydroxystilbenes, furan
  • R 1 and R 10 can advantageously be chosen from molecules whose fluorescence emission wavelength is in the range from 400 to 900 nanometers, in particular ranging from 500 to 900, and more particularly ranging from
  • nanometers such as rhodamine and its derivatives, BODIPY and its derivatives, cyanines and derivatives or quantum dots.
  • the compounds in accordance with the present invention may be of general formula (Va):
  • S is a labile structure
  • X, Ar, R 1 , R 2 , R 3 , R 5 and R 6 are as defined above.
  • R 2 and R 3 are bonded to form an adamantyl radical in spiro with the carbon of the dioxetane ring which carries them, optionally substituted by radicals as defined above, in particular by radicals such as R 8 and R 9 .
  • R 1 , R 5 and R 6 are methoxy radicals.
  • the compounds in accordance with the present invention may be of general formula (Vb): in which,
  • S is a labile structure
  • Ar, R 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 6 , R 10 and R 11 are as defined above.
  • R 2 and R 3 are fused to form an adamantyl radical in spiro with the carbon of the dioxetane ring which carries them, optionally substituted with radicals as defined above, in particular with radicals such as R 8 and R 9 .
  • R 1 , R 5 and R 6 are methoxy radicals.
  • R 10 and R 11 are advantageously a hydrogen atom, or R 10 and a hydrogen atom and R 11 forms with the phenylene radical a naphthylene radical.
  • the compounds in accordance with the present invention may be of general formula (Vc):
  • S represents a labile structure activatable by a phenomenon or a chemical, physical, or biological entity.
  • physical phenomenon is meant for the purposes of the present invention, for example, a temperature variation, a pressure variation.
  • chemical phenomenon is meant for the purpose of the present invention a phenomenon involving a chemical entity modifying the chemical properties of the environment, such as, for example, a pH variation by an increase or decrease in protons, a variation salinity by an increase or decrease in the salt content (s), a variation of the redox potential, an appearance or disappearance of chemical species, for example ions such as F “ , S " , and ions of alkaline earth metals such as Ca 2+ .
  • S represents a labile structure activatable by a chemical phenomenon
  • S may advantageously be, for example an ammonium, an amide, an amine, an ester, a silylane, a thiol, a carbamate, or a carbonate.
  • biological phenomenon is intended to denote a phenomenon involving the activity of a biological entity, for example an enzymatic activity, such as, for example, a hydrolysis, a transfer of an amino group, an isomerization.
  • the compounds are subjected to the action of a biological entity.
  • a biological entity capable of activating the compounds according to the invention, mention may be made, in a nonlimiting manner, of enzymes, ribozymes and abzymes.
  • transferases such as aminotransferases
  • hydrolases such as esterases (alkaline phosphatase for example), glucosidases, proteases (trypsin, metalloproteinases or caspases, for example)
  • Isomerases When S is a structure activatable by a biological entity, S may advantageously be of general formula (VI):
  • L represents an oxygen, a sulfur, a nitrogen unit, a carbonyl or a -CO-Q- function, with Q being O, S or NH.
  • S may represent a labile structure by the action of an enzyme, and especially by the action of a hydrolase.
  • L represents -CO-Q, with Q being NH
  • P represents a substrate recognized by a protease, such as for example a peptide or pseudopeptide residue.
  • proteases that may be suitable for the implementation of the present invention, mention may be made, without limitation, of caspases such as caspase-3, acylaminoacyl peptidase, Faminopeptidase M, penicillinase G acylase, thermolysin, cathepsins B, G, L, metalloproteinases, elastase, subtilisin, plasminogen activator, urokinase.
  • P when P is a peptide residue, it comprises at least two amino acid residues, in particular at least four, in particular at month six and more particularly at least eight amino acid residues.
  • amino acids can be of L or D configuration, natural or synthetic.
  • These peptides can be obtained by chemical synthesis or molecular biology according to the usual methods of those skilled in the art.
  • a peptide residue suitable for the implementation of the present invention mention may be made of the tetrapeptide sequence DEVD (amino acid written in a one-letter code) which is selectively hydrolyzed after the last aspartate residue, by the caspase-3.
  • S may represent a labile structure by the action of an esterase hydrolase, such as a carboxyesterase, a phosphatase or a lipase.
  • an esterase hydrolase such as a carboxyesterase, a phosphatase or a lipase.
  • L may represent -CO-Q with Q being O
  • P representing a carbon residue (of the alkyl chain type such that the PL group constitutes a carboxylic acid residue, in particular a fatty acid residue).
  • P representing a carbon residue (of the alkyl chain type such that the PL group constitutes a carboxylic acid residue, in particular a fatty acid residue).
  • an esterase or glucosidase enzyme or a phosphate group recognized by a phosphatase enzyme recognized by an esterase or glucosidase enzyme or a phosphate group recognized by a phosphatase enzyme.
  • M + represents a cation such as an alkali metal, such as Na + or K + , an ammonium, or an N (R) 4 + quaternary ammonium cation in which each R can be an alkyl C 1 -C 2 , aralkyl, such as benzyl, or form part of a heterocycle, such as pyridinium.
  • R represents a cation such as an alkali metal, such as Na + or K + , an ammonium, or an N (R) 4 + quaternary ammonium cation in which each R can be an alkyl C 1 -C 2 , aralkyl, such as benzyl, or form part of a heterocycle, such as pyridinium.
  • R can be an alkyl C 1 -C 2 , aralkyl, such as benzyl, or form part of a heterocycle, such as pyridinium.
  • Such structures are advantageously hydrolysed by an alka
  • S may represent a labile structure by the action of a glucosidase type enzyme.
  • L may advantageously be an oxygen atom and P represents a substrate recognized by a glucosidase, such as a sugar.
  • S may represent a labile structure by action of an aminotransferase.
  • L may represent a carbonyl and P may represent a substrate recognized by an enzyme such as, for example, and without limitation, an alanine aminotransferase or an aspartate aminotransferase.
  • a compound according to the invention may further comprise, at the level of the labile structure S, a targeting structure D.
  • a compound may have the following general formula (VII):
  • the targeting structure D is an element capable of recognizing or binding preferentially cells expressing a particular cellular element, such as, for example, and in a nonlimiting manner, a receptor, an enzyme, a structural protein, a glycoprotein, a sugar, a lipid or a phospholipid.
  • a particular cellular element such as, for example, and in a nonlimiting manner, a receptor, an enzyme, a structural protein, a glycoprotein, a sugar, a lipid or a phospholipid.
  • the cellular element is a membrane element, preferably having a part of its structure arranged in the extracellular medium.
  • this cellular element may be specific for a physiological or pathological state of the cell or tissue surrounding the cell or organ comprising the cell.
  • the cellular element may be specific for the cell's growth state, the position in the cell cycle, an inflammatory response of the cell or tissue, an apoptosis, tissue degeneration.
  • the expression "preferentially recognize or bind” aims to indicate that the targeting structure D has a particular affinity for the cells or tissues under consideration, even if a non-specific or less important binding with other cells or other tissues does not occur. can be totally excluded in vivo or ex vivo.
  • the preferential bond allows targeting of the compounds according to the invention to the sites of interest, reducing the dissemination of the compound according to the invention to tissues and / or cells of lesser interest.
  • the targeting structure D can be chosen, for example and without limitation, from a lectin, an antibody or a fragment thereof recognizing an element present on the surface of cells such as for example a protein, a sugar a lipid; a ligand of a cellular receptor such as, for example, a peptide such as neuropeptide Y, a catecholamine such as adrenaline, an antagonist such as, for example, a ⁇ -adrenergic receptor antagonist such as propranolol, a growth factor, an acid amine or a derivative thereof, such as, for example, glutamate, a cytokine such as, for example, interleukin, interferon or TNF, a hormone, a vitamin, an apolipoprotein, cholesterol; a ligand capable of interacting with a membrane lipid or phospholipid such as, for example, an annexin; a ligand capable of interacting with a sugar present on the surface of the cells.
  • a lectin an antibody or a
  • cellular receptor is intended to denote any cellular element capable of transducing information from the outside to the inside of the cell.
  • the targeting structure D may be a ligand, for example a polypeptide, capable of binding to the surface of cells typically or specifically present in a particular tissue or pathology.
  • Targeting structure D can also bind to the surface of tumor cells or present in tumor tissue, or on the surface of cells present in inflammatory tissue.
  • the targeting structure D may, for example, bind to the surface of cells involved in an apoptosis process, which expose negatively charged lipids, such as phosphatidylserine, on their surface.
  • the targeting structure D can be a protein or a fragment of a protein such as a peptide or a polypeptide or a pseudopeptide.
  • proteins capable of binding to the membranes exhibiting negatively charged lipids mention may be made, in a nonlimiting manner, of the family of Annexins, families of proteins comprising a Cl or C2 domain, such as blood coagulation factors V and VIII, protein families comprising a PH domain or a FYVE domain, or proteins comprising an identical domain or homologous to the domain ⁇ 2-glycoproteins-I ( ⁇ GP-I). These proteins or domains derived from their sequences can be used as a targeting structure in compounds according to the invention.
  • a targeting structure D may be fixed one or more compounds of general formula (I), in order to increase, in particular, the intensity of the emitted signal.
  • at least one, especially at least two, in particular at least 3, in particular at least 4, and more particularly at least 5 compounds of formula S-B-A may be fixed per targeting element D.
  • the subject of the present invention is also the use, for the purposes of detection and / or quantification of a chemical, physical or biological phenomenon, as specified above, of at least one compliant compound. to the invention, wherein S is a labile structure activatable by said phenomenon.
  • the compound according to the invention used in this use may be of general formula (Va) or (Vb) as defined above.
  • the present invention aims to also provide a method for detecting and / or quantifying a biological entity.
  • the process according to the invention comprises at least the steps of contacting at least one effective amount of at least one compound according to the present invention, and in particular of general formula (Va) or (Vb) in which S a labile structure activatable by said biological entity to be detected and / or quantified with a presumed medium comprises said entity and the measurement of the generated luminescent signal.
  • the method according to the invention can be conducted in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the activation of the structure S leads to the emission of a luminescent signal.
  • the biological phenomenon to be detected / quantified may be an activity of a biological entity, in particular an enzyme.
  • the labile structure S is a substrate recognized by said enzyme.
  • the action of the enzyme on the substrate S, especially on the L group of the general formula (II), under conditions conducive to the reactivity of the enzyme leads to the emission of a luminescent signal.
  • the medium which may be suitable for carrying out the process according to the present invention may be a biological, synthetic or natural medium such as a sample of biological fluid.
  • fluorescein fluorescein, bovine albumin, human albumin, and quaternary onium polymer salts such as polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride (TMQ), polyvinylbenzyltributylammonium (TBQ) chloride (Sapphire-II TM), polyvinylbenzyldimethylammonium chloride (BDMQ) (Sapphire-I TM), polyvinylbenzyltributylphosphonium chloride, polyvinylbenzyltributylsulfonium chloride, poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride, a sodium salt, fluorescein sodium (Emerald TM), poly (benzyltributyl) ammonium, and fluorescein sodium salt (Emerald II TM).
  • TMQ polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride
  • TBQ polyvinylbenzyltributylammonium chlor
  • the detection of the fluorescence signal can be done by any apparatus usually used by those skilled in the art in this field.
  • a sample placed in contact with a compound according to the invention may, optionally after an incubation period, be subjected to an analytical method comprising or not a step of separating the elements making up the sample, for example by chromatography (For example a high performance liquid chromatography, HPLC), and a spectral analysis step (for example by UV spectroscopy) of the different fractions from the separation step.
  • chromatography For example a high performance liquid chromatography, HPLC
  • spectral analysis step for example by UV spectroscopy
  • the detection and measurement of the specific spectroscopic signal of a compound according to the invention may be correlated with the presence, and / or the intensity / quantity of the phenomenon. to detect, such as for example the presence, quantity, and / or kinetic activity of an enzyme.
  • the method and the use according to the present invention can also be advantageously implemented in vivo.
  • the compounds according to the present invention may be previously administered to a living being, such as for example an animal or a human being, and then the detection of the fluorescence signal can be carried out in vivo according to the means usually used in the field.
  • the implementation in vivo of a use according to the invention makes it possible to establish images of the tissues or organs likely in which said phenomenon to be detected / quantified is likely to occur.
  • the method according to the invention can be implemented in medical imaging methods.
  • the method according to the invention is an in vivo diagnostic method comprising the detection and / or the quantification of a biological entity, in particular an enzyme, by means of a compound of general formula (Va) or
  • the method according to the invention can be applied, for example and without limitation, to medical, experimental, clinical or pre-clinical diagnostic targets in humans or in animals such as laboratory animals or animals used. in agriculture, such as rat, mouse, guinea pig, non-human primate, guinea pig, or pig.
  • the biological entity capable of being detected and / or quantified by a method according to the invention may be an enzyme, chosen in particular, in a non-limiting manner, from an aminotransferase or a hydrolase, such as esterase, protease or glucosidase.
  • the enzyme to be detected and / or to be quantified is a protease
  • it may advantageously be chosen, in a non-limiting manner, from caspases, penicillinases, carboxypeptidases, trypsin, acylaminoacylpeptidase, aminopeptidases, cathepsins, metalloproteinases, elastase, subtilisin, thermolysin, plasminogen activator, urokinase, isomerases.
  • the compounds in accordance with the invention may be shaped so as to be suitable for oral, or parenteral, in particular intravenous, intraarterial, intracardiac, intracerebroventricular, and intraperitoneal administration. , intratumoral, or for pulmonary, nasal, ophthalmic and possibly rectal, vaginal or topical administration.
  • the compounds in accordance with the invention can thus be used in a formulation adapted to the detection method to be carried out and to the chosen administration voice.
  • the compounds according to the invention may be prepared in the form of a tablet, a capsule or an aqueous solution, concentrated or otherwise. This aqueous solution can be advantageously sterile.
  • the compounds in accordance with the invention may be in solid form, for example in powder form, and be prepared in aqueous solution, advantageously sterile, just before their administration.
  • the present invention also relates to the use of a compound according to the invention, in particular of general formula (Va) or (Vb) for the manufacture of a pharmaceutical composition intended for use in in vivo diagnostic method, including a medical imaging method.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least an effective amount of at least one compound according to the present invention, in particular of general formula (Va) or (Vb).
  • the implementation of a compound according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition may be in the form of a derivative, such as a pharmaceutically acceptable salt or ester.
  • the present invention also relates to the salts and esters of the compounds according to the invention.
  • an ester of a compound according to the invention mention may be made of a succinate, a hemisuccinate, a malate, a tartrate, a glycolate of a compound according to the invention.
  • a salt of a compound according to the invention mention may be made of a sulfate, a phosphate, a sodium salt or a calcium salt of a compound according to the invention.
  • the adjustment of the appropriate effective amounts of the compound (s) according to the invention, to be implemented in a method or a use according to the invention, depends on the phenomenon, or the entity, to be detected / quantified (chemical, physical , biological) and the environment in which the method according to the invention is conducted (in vitro, ex vivo or in vivo).
  • the effective amounts can also be adjusted according to the size, the weight of the individual to whom the process according to the invention is applied, or in which the use according to the invention is implemented, as well as depending on the organ or tissue targeted.
  • the term "effective amount" means the quantity necessary and sufficient to obtain the desired effect, namely the detection and / or quantification of a chemical, physical or biological phenomenon, or a biological entity.
  • the present invention relates to a kit for detecting and / or quantifying by generating a luminescent signal of a chemical, physical or biological phenomenon, said kit comprising at least one compound according to the present invention wherein S is a labile structure activatable by said physical, chemical or biological phenomenon to detect and / or quantify.
  • the present invention relates to a kit for the detection and / or quantification of a biological entity, in particular an enzyme, comprising a compound according to the present invention, and in particular of general formula (Va). or (Vb), wherein S is a labile structure activatable by said biological entity to be detected and / or quantified.
  • the kit according to the present invention may also comprise at least one light amplifier as defined above.
  • - System B reverse phase HPLC (Cl 8, Nucelosil, 5 ⁇ , 10 ⁇ 250) in a demineralized water and acetonitrile mixture [75% water (5 min), then 25 to 55% linear gradient (15 min and 55-90% (70 min) acetonitrile] at a flow rate of 5.0 ml / min. UV detection was performed at 260 nm.
  • - System C reverse phase HPLC (C 18, HYPERSIL GOLD, 5 ⁇ , 4.6 x
  • LiAlH 4 (800 mg) was slowly added to a suspension of TiCl 3 (THF) 3 (16.5 g, 44.6 mmol) in dry THF (15 mL) at 0 ° C. After 10 minutes at 0 ° C, triethylamine (3.5 mL) was added and the mixture was refluxed for one hour. A solution of 2-adamantanone (822 mg, 5.47 mmol) and methyl benzoate ester 4b previously prepared (1.2 g, 444.50 mmol) in anhydrous THF (10 mL) was added dropwise. drop by drop to the mixture. The reaction mixture was refluxed for 3 hours.

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Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux dérivés du 1,2-dioxétane de formule générale définie, aptes à émettre un signal luminescent détectable, à leur utilisation dans un procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique, notamment enzymatique, ainsi qu'à un kit permettant la mise en oeuvre du procédé.

Description

Biomarqueur à émission luminescente
La présente invention se rapporte à de nouveaux composés aptes à émettre un signal luminescent détectable, à leur utilisation dans un procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique, notamment enzymatique, ainsi qu'à un kit permettant la mise en œuvre du procédé.
De nombreux procédés de détection utilisés en biochimie, ou en biologie cellulaire, reposent sur la génération d'un signal lumineux, par exemple de fluorescence.
Ainsi, de nombreux tests chromogéniques, fluorescents ou luminescents sont décrits in vitro pour détecter les activités de diverses enzymes. La plupart de ces tests repose sur l'utilisation de couples donneur/accepteur ou donneur/quencheur de transfert d'énergie de fluorescence à la résonance (FRET) ou de l'utilisation d'entités pro- fluorophores.
Malheureusement, ce mode de détection satisfaisant sur le plan de l'analyse in vitro ne s'avère généralement pas exploitable en analyse in vivo. Ainsi, en application in vivo, il est nécessaire de fournir une excitation dans le proche infrarouge. Le choix de couples donneur/accepteur ou donneur/quencheur pour lesquels les excitations ne se recouvrent pas devient alors extrêmement plus limité (FUNOVICS et al., Anal. Bioanal. Chem., 2003, 377:956-963).
Dans la perspective de s'affranchir de cette nécessité d'exciter le donneur de fluorescence dans le proche infrarouge, il a été proposé d'utiliser des composés bioluminescents ou chimioluminescents, c'est-à-dire dont la luminescence est générée à l'issue d'une réaction chimique ou biologique (LAXMAN et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 2002, 99 : 16551-16555).
Les composés chimioluminescents, leurs préparations et leurs utilisations sont connus depuis longtemps. Ces molécules dites de "hautes énergies" renferment suffisamment d'énergie pour générer des groupes carbonyles dans un état électronique excité, responsables du phénomène de chimio luminescence observé.
A titre représentatif de composés chimioluminescents, on peut citer les composés dérivés du dioxétane et plus particulièrement les dérivés du 1,2-dioxétane. Ces composés sont labiles thermiquement et peuvent se décomposer dans une large gamme de température en émettant un signal lumineux. De manière générale ces composés sont de formule générale suivante :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle chaque substituant R correspond à un radical hydrocarboné comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, et deux R adjacents ou un R adjacent à Ar-X-W et un des deux autres R ou Ar peuvent être joints, X peut représenter O, S ou N et W peut représenter un groupe détachable, le cas échéant chargé.
De nombreux dérivés du 1,2-dioxétane ont été synthétisés, parmi lesquels les composés comprenant un radical spiroadamantyle lié en position 3, déjà utilisés comme substrats chimioluminescents. De tels dérivés sont notamment décrits dans les documents WO 96/24849, WO 90/07511 et US 5,330,900. Ces dérivés du 1,2-dioxétane peuvent comprendre un site de reconnaissance pour une enzyme et peuvent être activés par une enzyme reconnaissant ce site pour générer un signal luminescent.
Plus récemment ont également été développés d'autres dérivés du dioxétane, décrits dans JP 2002-02038, EP 1 342 724, et US 2004/0077018, dans lesquels divers radicaux sont mis en œuvre pour stabiliser le cycle dioxétane.
Le principe de la réaction de chimioluminescence de ces composés repose sur un échange d'électrons (CIEEL, Chemically Induced Electron Exchange Luminescence) entre la fonction phénolate et le cycle dioxétane tendu situé en para du cycle aromatique du phénol (MATSUMOTO, J. Photochem. Photobiol. C : Photochem. Rev., 2004, 5 :27-53). La génération d'un composé comprenant un phénolate, instable, entraîne la rupture du motif 1,2-dioxétane tendu, stabilisé par les radicaux R, à la suite d'un échange d'électron avec le phénolate par le phénomène de CIEEL, pour aboutir à l'apparition d'un ester activé revenant à l'état fondamental en émettant un signal luminescent.
Le phénol, en lui-même, de même que ses esters avec des acides carboxyliques sont les précurseurs les plus couramment utilisés pour générer un anion d'oxygène
(oxyanion) du phénol dans une solution aqueuse alcaline. Toutefois, il a également été synthétisé d'autres dérivés de ce type du 1,2-dioxétane dans lesquels ce même atome d'oxygène a été remplacé par un groupement thiol, un groupement aminé ou un carbone
(MATSUMOTO, J. Photochem. Photobiol. C: Photochem. Rev., 2004, 5:27-53 ; SABELLE et al, J Am Chem Soc, 2002, 124(17) ; 4874-4880; MATSUMOTO et al.,
Tetrahedron Lett, 2004, 45 : 3779-82 ; WO 96/24849 ; WO 00/44719). Cependant, ces derniers dérivés ont un rendement quantique nettement plus faible et ne sont pas utilisables en pratique.
La présente invention vise pour sa part à proposer de nouveaux composés dérivés du 1,2-dioxétane susceptibles de générer directement, ou par transfert d'énergie de fluorescence à la résonance (FRET) intramoléculaire, un signal luminescent susceptible d'être détectable au travers d'une épaisseur de couches de tissus biologiques.
Un autre objet de la présente invention est de proposer des composés dérivés du 1,2-dioxétane qui puissent être activés par tout phénomène chimique, physique ou biologique, et en particulier une activité enzymatique. L'invention a ainsi pour avantage de traduire une information résultant de cette activation, par exemple une information de type hydrolyse dans le cadre d'une activité enzymatique, en l'apparition d'un phénolate ou d'un thiophénate, et de conférer aux dérivés des propriétés spectroscopiques distinctes de celles dont ils sont dotés à l'origine.
Un autre objet de la présente invention est de proposer des composés dérivés du 1,2-dioxétane susceptibles d'être administrés in vivo afin de pouvoir être utilisés dans des méthodes d'imagerie médicale.
Les inventeurs ont ainsi observé, contre toute attente, qu'il était possible d'associer à un squelette de type 1,2-dioxétane, tel que défini précédemment un bras réactif activable par un phénomène physique, chimique ou biologique, et notamment par une activité enzymatique, sans porter préjudice à l'émission d'un signal lumineux.
Le bras réactif considéré selon l'invention assure grâce à un réarrangement intramoléculaire le transfert des électrons, nécessaire à l'activation du signal lumineux.
Ainsi, selon un de ses premiers objets, la présente invention concerne un composé de formule générale (I) :
S-B-A dans laquelle
S représente une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique, - B est un bras réactif, dont la structure chimique est telle que l'activation de la structure labile S induit son réarrangement intramoléculaire sous une forme propice à la libération d'une molécule A", A est un chromophore de formule générale (lia)
Figure imgf000005_0001
dans laquelle
O symbolise le lien covalent à B, a) R1, R2 et R3, représentent indépendamment l'un de l'autre, un radical tel que défini par la suite, comme par exemple un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical aryle, un radical hydroxyle, un motif oxo, un radical amino, un radical silyle, un atome d'halogène, b) R2 et R3 peuvent former un motif oxo, c) R1 et R2 peuvent être liés de manière à former un cycle condensé avec le cycle dioxétane, tel que défini par la suite, d) R2 et R3 ou R1 et Ar peuvent être liés de manière à former un cycle spiro avec le carbone de l'entité dioxétane qui les portent, tel que défini par la suite,
Ar représente un radical arylène tel que notamment défini par la suite,
X représente O, N ou S, et ses dérivés, tels que des sels, des esters ou des dérivés obtenus par fonctionnalisation d'un composé de formule générale (I) avec au moins un motif à vocation de ciblage. Selon encore un autre objet, la présente invention concerne un composé de formule générale (Va) :
Figure imgf000005_0002
dans laquelle, - S figure une structure labile et X, Ar, R1, R2, R3, R5 et R6 sont tels que définis par la suite.
Selon un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à un composé dérivant de la fonctionnalisation d'un composé selon l'invention par au moins un motif structural favorisant, par exemple, le ciblage vers une cellule ou un tissu particulier.
Selon encore un autre de ses objets, la présente invention concerne une utilisation à des fins de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique d'au moins un composé conforme à la présente invention dans lequel S figure une structure labile activable par ledit phénomène. Selon encore un autre objet, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'un composé conforme à l'invention, et notamment de formule générale (Va), pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vivo.
Selon encore un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à un kit pour la détection et/ou la quantification d'une entité biologique, notamment une enzyme, comprenant un composé de formule générale (I), et en particulier de formule générale
(Va), dans laquelle S figure une structure labile activable par ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier.
Selon encore un autre de ses objets, la présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification d'une entité biologique, notamment une enzyme, comprenant au moins les étapes de : mise en contact d'au moins une quantité efficace d'au moins un composé de formule générale (I), et en particulier de formule générale (Va), dans laquelle S figure une structure labile activable par ladite entité biologique, notamment une enzyme, à détecter et/ou quantifier dans un milieu présumé contenir ladite entité biologique, et
- mesure du signal luminescent généré.
Selon encore un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à un procédé de diagnostic in vivo, notamment à des fins d'imagerie médicale, comprenant la détection et/ou la quantification d'une entité biologique, notamment une enzyme, au moyen d'un composé de formule générale (I), et notamment de formule générale (Va) dans laquelle S figure une structure labile activable par ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier. DÉFINITIONS
Au sens de la présente invention, on entend par "radical alkyle", un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 2 à 12 atomes de carbone et mieux encore de 3 à 6 atomes de carbone et plus particulièrement de 4 atomes de carbone, susceptible d'être substitué par des radicaux tels que définis ci-après.
A titre d'exemple, sont inclus dans cette définition des radicaux tels que méthyle, éthyle, isopropyle, n-butyle, t-butyle, t-butylméthyle, n-propyle, pentyle, n- hexyle, 2-éthylbutyle, heptyle, octyle, nonyle, décyle, undécyle, dodécyle, tétradécyle, pentadécyle, hexadécyle, heptadécyle, octadécyle, nonadécyle ou icosanyle.
Au sens de la présente invention, on entend par "radical alkyle cyclique", un cycle alkylène de 4 à 10 atomes de carbone, tel que le cyclopropyle, le cyclopentyle, le cyclohexyle, le cyclohexylméthyle ou le cycloheptyle.
On entend par "radical alkyle polycyclique", un alkylène polycyclique de 4 à 20 atomes de carbone, en particulier de 6 à 12 atomes de carbone, éventuellement substitué par un à 10 radicaux indépendamment choisis parmi un radical alkyle en C1-C10, notamment en C2-C6, un radical alkoxy en C1-C10, notamment en C2-C6, un radical alkylamino en C1-C10, notamment en C2-C6, un radical alkylthio en C1-C10, notamment en C2-C6, un atome d'halogène et un radical haloalkyle en C1-C10, notamment en C2-C6. A titre d'exemple de radical polycyclique convenant à la mise en œuvre de l'invention, on peut mentionner le radical adamantyle ou le radical bicyclo[2.2.1]heptyle.
Au sens de la présente invention, on entend par "radical alkoxy", un radical - OR dans lequel le reste alkyle est un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, tel que défini ci-dessus.
On peut citer, à titre d'exemple, les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy, butoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, n-pentoxy, isopentoxy, sec-pentoxy, t-pentoxy, hexyloxy, méthoxyéthoxy, méthoxypropoxy, éthoxyéthoxy, éthoxypropoxy et analogues.
Au sens de la présente invention, on entend par "radical acyle", un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, comprenant une fonction C=O et ayant de 1 à 20 atomes de carbone, en particulier de 2 à 12 atomes de carbone et de préférence de 3 à 6 atomes de carbone et plus particulièrement de 4 atomes de carbone par exemple, un radical formyle, un radical acétyle, un radical succinyle, un radical benzoyle, un radical 1-naphtoyle ou 2-naphtoyle.
La chaîne hydrocarbonée des radicaux précités peut être interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, pour former par exemple un radical hétéroalkyle comme un radical alkyléther, un radical alkylester ou un hétérocycle.
Au sens de la présente invention, on entend par "radical hétérocyclique", par exemple, et de manière non limitative, un radical furanyle, un radical thiophènyle, un radical pyrolyle, un radical oxazolyle, un radical isoxazolyle, un radical thiazolyle, un radical isothiazolyle, un radical imidazolyle, un radical pyrazolyle, un radical furazanyle, un radical pyranyle, un radical pyridinyle, un radical pyridadinyle, un radical pyrimidinyle ou un radical pyradinyle.
Au sens de la présente invention, on entend par "radical aryle", un cycle aromatique comprenant de 1 à 5 noyaux aromatiques, éventuellement fusionnés, de 6 à 30 atomes de carbone, notamment de 6 à 10 atomes de carbone, comprenant optionnellement un plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S. A titre d'exemple de radicaux aryle convenant à la mise en œuvre de l'invention il est possible de mentionner le radical phényle, le radical naphtyle, le radical anthryle, et tous les cycles aromatiques comprenant un plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, tel que par exemple la pyridine, le thiophène, le pyrrole, le furanne, la quinoléine. Au sens de la présente invention, on entend par "radical arylène", un radical aryle, tel que défini précédemment, qui est bivalent.
A titre d'exemples de substituants susceptibles d'être utilisés pour substituer les radicaux précités, il peut être fait mention d'un radical hydroxyle, un motif oxo, un radical thio, un radical amino, un atome d'halogène, d'un radical alkyle, un radical carboxy, un radical acyle, un radical amido, un radical alkoxy, un radical alkyl- ou dialkyl-amino, un radical alkylthio, un radical halogénoalkyle tel que par exemple le perfluoroalkyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-silyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-siloxy, un radical aryle, tel que défini précédemment.
Au sens de la présente invention, on entend par "atome d'halogène", un atome de F, Cl, Br ou I. Les atomes d'halogène avantageusement mis en œuvre dans la présente invention sont le fluor et le chlore.
Au sens de la présente invention, on entend par "radical halogénoalkyle", un radical alkyle tel que défini précédemment substitué par un plusieurs atomes d'halogène tel que défini précédemment, et notamment, à titre d'exemple non limitatif, le perfluorométhyle.
DERIVES DU 1.2-DIOXÉTANE
Les composés selon la présente invention sont de formule générale (I)
S-B-A et comprennent ses dérivés, tels que des sels, des esters ou des dérivés fonctionnalisés avec des éléments structuraux, notamment à des fins de ciblage.
Bras réactif B
Dans la formule générale (I) des composés conformes à l'invention, B est différent d'une simple liaison chimique et représente un bras réactif hydrocarboné dont la structure chimique est telle que l'activation de la structure labile S par un phénomène chimique, physique ou biologique induit le réarrangement intramoléculaire de B sous une forme propice à la libération d'une molécule A".
Avantageusement B est représenté par un radical alkyle en C1-C8, notamment en C2-C6, et en particulier en C3-C4, éventuellement interrompu par un radical arylène en C6-C14, notamment en C6-C10 et/ou par un plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, et S, et optionnellement substitué par un ou plusieurs substituants tels que définis précédemment et notamment choisis parmi un radical hydroxyle, un motif oxo, un radical amino, un atome d'halogène, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical carboxy, un radical alkylamino, un radical dialkylamino, un radical aryle, un radical aryloxy. Avantageusement, le radical alkyle comprend deux atomes de carbone.
Le radical arylène peut être également substitué par un ou plusieurs substituants tels que définis précédemment. Selon une variante de réalisation le radical arylène est choisi parmi un phénylène ou un naphtylène. Sur le radical phénylène, les positions des deux liaisons du radical peuvent être en ortho, meta ou para. Avantageusement elles sont en ortho. Selon un mode de réalisation, le bras réactif B peut être choisi parmi : - un radical benzylidène,
- un radical D-N(CH3)-(CH2)2-N(CH3)-C(O)-0, dans lequel D et 0 symbolisent respectivement la liaison covalente avec la structure labile S et le chromophore A, ou un dérivé représenté par la formule générale (III) :
Figure imgf000010_0001
dans laquelle
D et 0 symbolisent, respectivement, la liaison covalente avec la structure labile S et le chromophore A, j est un entier allant de 0 à 2, et avantageusement est égal à 1, R4 est une chaîne hydrocarbonée en C1-C20, notamment C2-C12 et en particulier C3-C6, le cas échéant interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes et/ou motif(s) -CO et/ou -N(alkyle)-, placée en ortho, meta ou para du radical D-(CH2)J-, et notamment choisie parmi les radicaux -(CH2)k-0, -(CH2)k-C(O)-0, -CH2-O-C(O)-N(CH3)- (CH2)2-N(CH3)-C(O)-0, avec k étant égal à 1 ou 2, et avantageusement égal à 1,
R5 et R6 sont, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée en C1-C20, notamment C2-C12 et en particulier C3-C6 choisie parmi un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical alkyl- ou dialkyl-amino, un radical alkylthio, ou un cycle aromatique en C6-C30, notamment C6-C10 choisi parmi un radical aryle, un radical aryloxy, un radical arylamino, un radical arylthio, notamment tels que définis précédemment. Selon un mode particulier de réalisation, les radicaux R5 et R6 sont, indépendamment l'un de l'autre, choisis parmi : un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C6, un radical alcényle en
C2-C6, un radical alcinyle en C3-C6, ramifiés ou non, un radical cycloalkyle en C3-C6, substitués ou non par un ou plusieurs substituants tels que définis précédemment et notamment choisis parmi un atome d'halogène, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical aryle tel que par exemple un radical benzyloxy ou un radical benzyle, une chaîne hydrocarbonée cyclique, aliphatique, aromatique ou hétéroaromatique, comprenant un ou plusieurs hétéroatome(s), choisi(s) parmi O, N et S, en C3-C8, en particulier en C4-C7, éventuellement substituée par un ou plusieurs substituants tels que définis précédemment et notamment choisis parmi un atome d'halogène, un radical alkyle, un radical alkoxy, et un radical aryle tel que par exemple un radical benzyloxy, un radical benzyle, un radical phényle ou un radical naphtyle.
Selon un mode particulier de réalisation, lorsque R4 est choisi parmi -(CH2)k- C(O)-O et -CH2-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)2-N(CH3)-C(O)-0, alors R4 est en para avec le radical D-(CH2)r, j=k=l et R5=R6=H.
Selon un autre mode particulier de réalisation, R4 peut être représenté par - (CH2)k-0, positionné en ortho avec le radical D-(CH2)j-, et j=k=l et R5=R6= -OCH3.
Avantageusement, le bras réactif B peut être tel que défini dans le brevet US 6,271,345 dont le contenu est incorporé ici par référence.
Selon un mode particulier de réalisation, le réarrangement intramoléculaire de B conduit à la formation d'un lactame ou d'une lactone.
Chromophore A Dans la formule générale (I) des composés dérivés du 1,2-dioxétane conformes à l'invention, le chromophore A est représenté par la formule générale (lia) :
0-0
O — X-Ar R3
dans laquelle
O symbolise la liaison covalente avec B, a) R1, R2 et R3, représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical hydroxyle, un radical amino, un radical thio, un atome d'halogène, une chaîne hydrocarbonée en C1-C20, notamment en C2-C12, et en particulier en C3-C6 choisie parmi un radical alkoxy, un radical alkyle, un radical hétéroalkyle, un radical cycloalkyle, un radical hétérocycloalkyle, un radical éther, un radical alcènyle, un radical alcynyle, un radical alkylamino, un radical dialkylamino, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-silyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-siloxy, un radical alkylthio, un radical halogénoalkyle, un cycle aromatique en C6-C30, notamment en C6-C10, choisi parmi un radical aryle, et un radical hétéroaryle, le cas échéant substitué, b) R2 et R3 peuvent figurer ensemble un motif oxo, c) R1 et R2 peuvent être liés de manière à former un cycle en C4-C8 condensé avec le cycle dioxétane, le cas échéant interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et pouvant être substitué par un ou plusieurs radicaux tels que définis précédemment en a) pour R1, R2 et R3, d) R2 et R3 ou R1 et Ar peuvent être liés de manière à former un cycle spiro en C4-C20, notamment en C6-C10, avec le carbone de l'entité dioxétane qui les portent, ce cycle pouvant être monocyclique ou polycyclique, saturé ou insaturé, aromatique, condensé ou non, et le cas échéant incorporer un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S et être éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux tels que définis précédemment en a) pour R1, R2 et R3,
Ar représente un radical arylène en C6-C30, notamment en C6-C10, et étant optionnellement substitué par un ou plusieurs substituants notamment choisis parmi un radical hydroxyle, un atome d'halogène, un motif oxo, un radical amino, un radical alkylamino, un radical dialkylamino, un radical thio, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl- silyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-siloxy, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical alkylthio, un radical carboxy, un radical formyle, un radical alkylester, un radical alkylcétone, un radical halogénoalkyle, un radical aryle, un radical arylester, un radical arylcétone, un radical arylamino, un radical diarylamino, et
X peut représenter O, NH ou S. Avantageusement, X peut représenter O. Le composé A" généré suite à l'activation de la structure labile S et au réarrangement intramoléculaire du bras réactif B est instable et réagit en émettant un signal lumineux par le biais d'une réaction de chimio luminescence.
Selon un mode de réalisation particulier, R1 peut être un radical fluorescent ou un radical alkyle, tel que défini précédemment, substitué par un radical fluorescent.
Selon un autre mode de réalisation, Ar peut être substitué par un radical fluorescent en soit, ou un radical apte à conférer un caractère fluorescent à l'ensemble de la structure ou un radical apte à en modifier les propriétés fluorescentes.
Selon un autre mode particulier de réalisation, Ar et R1 et/ou R2 et R3 peuvent être associés pour former un radical alkyle cyclique ou polycyclique ou spiroiusionné qui peut : soit comprendre au moins une double liaison ou au moins une triple liaison dans le cycle ou dans une chaîne latérale, et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, soit être relié à, ou condensé avec, un noyau aromatique substitué ou non. Lorsque Ar et R1 ne sont pas liés entre eux, Ar peut être un radical aryle, tel qu'un radical phényle, naphtyle, anthryle, le cas échéant substitué, notamment par des radicaux tels que définis précédemment et R1 peut être tel que défini précédemment. De tels composés sont décrits plus en détail dans la demande US 2004/0077018 dont le contenu est incorporé dans la présente demande par référence.
Selon un autre mode de réalisation, R2 et R3 sont liés entre eux pour former un radical adamantyle en spiro du carbone du cycle dioxétane qui les portent, le cas échéant substitué, notamment par les radicaux R8 et R9 définis ci-après. Selon un autre mode de réalisation, R1 et R2 peuvent être liés entre eux pour former un cycle condensé avec le cycle dioxétane, et comprenant, éventuellement, un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, et S. Avantageusement, R1 et R2 forment un oxacyclopentane condensé avec le dioxétane. De tels composés sont notamment décrits dans la demande EP 1 342 724 dont le contenu est également incorporé ici par référence. Selon un autre mode de réalisation, R1 et R2 peuvent être liés entre eux pour former un noyau polycyclique condensé avec le dioxétane. De tels composés sont décrits dans la demande JP 2004-262817, dont le contenu est incorporé ici par référence. Selon une variante particulière de réalisation, le chromophore A est représenté par la formule générale (Ilb) :
Figure imgf000014_0001
dans laquelle :
O symbolise la liaison covalente avec B, et
R1 est tel que défini précédemment. Avantageusement, R1 peut être choisi parmi un radical alkyle, un groupe fluorescent et un radical alkyle substitué par un groupe fluorescent. Le radical alkyle est tel que défini précédemment. Avantageusement, R1 peut être un radical alkyle ou alkoxy en C1-C6, linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et optionnellement substitué. R1 peut être substitué par des radicaux tels que définis précédemment. Avantageusement R1 est un radical alkyle ou alkoxy en C1 à C3, de préférence un radical méthyle ou méthoxy.
R8 et R9 sont, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un radical électroactif,
X représente O, N ou S. Avantageusement X représente O, et Ar représente un radical arylène, tel que défini précédemment, ou un radical de formule générale (IVa) :
Figure imgf000014_0002
dans laquelle Δ symbolise le lien covalent avec X et * symbolise le lien covalent avec le cycle dioxétane. Δ et * peuvent être disposés en ortho, meta ou para. Avantageusement Δ et * peuvent être disposés en meta,
R10 représente un atome d'hydrogène, un radical électroactif ou un radical fluorescent. Avantageusement, le radical électroactif peut être apte à modifier les propriétés fluorescentes du radical Ar à l'image, par exemple, d'un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-silyle, un radical NO2, un radical anthryle, un radical naphtyle (voir par exemple MATSUMOTO et al., Tetrahedron Lett, 2002, 43 : 8955-58).
R11 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou figure un radical aryle, par exemple en C6-C10, condensé avec le radical phénylène, notamment un radical phényle pour former un radical naphtylène.
On entend, au sens de la présente invention, par "groupement électroactif', un groupement électroaccepteur ou électrodonneur. Selon une variante particulière, le chromophore A est tel qu'au moins l'un des groupes R8 ou R9 ou R10 est un radical électroactif favorisant la solubilisation du composé de formule générale (I) conforme à l'invention dans une solution aqueuse.
A titre d'exemple de groupes favorisant la solubilisation du composé de formule générale (I) dans une solution aqueuse, il peut être fait mention des radicaux ammonium, phosphonium, sulfonium, acide carboxylique, acide sulfonique, trifluorométhylsulfonyle, méthyl-sulfonyle, cyano et hydroxy.
Selon un autre mode de réalisation, R8 et R9 sont, indépendamment l'un de l'autre, un radical électroactif choisi parmi un radical hydroxyle, un atome d'halogène, un radical cyano, un radical amide, un radical alkoxy, un radical alkyle halogène, un radical phényle, un radical alkoxyphényle.
Selon encore une autre variante de réalisation, R10 est un atome d'hydrogène ou un radical électroactif avantageusement choisi parmi un atome d'halogène, notamment un chlore, un fluor, un radical cyano, un radical nitro, un radical amide mono ou disubstitué, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical trialkylammonium, un radical alkylamido, un radical alkylcarbamoyle, un radical ester, un radical alkylsulfonamido, un radical triflurorométhyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkylsilyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkylsiloxy, un radical alkylamidosulfonyle, un radical alkylsulfonyle, un radical un alkylthioether, un radical halogénoalkyle, un radical en C6-C10 choisi parmi un radical aryloxy, un radical arylamido, un radical arylcarbamoyle, un radical arylsulfonamido, un radical aryle, un radical hétéroaryle, un radical triaryl- ou alkylaryl-silyle, un radical triarylsiloxy, un radical arylamidosulfonyle, un radical arylsulfonyle et un radical arylthioether.
Selon un mode particulier de réalisation, R8, R9 et R10 sont avantageusement un atome d'hydrogène.
Selon un autre mode particulier de réalisation, R1 ou R10 peuvent être un radical fluorescent afin de modifier, par FRET intramoléculaire, la longueur d'onde d'émission du composé luminescent selon l'invention.
Par exemple, ces radicaux fluorescents peuvent être choisis, de manière non limitative, parmi le phényle et ses dérivés, le naphtalène et ses dérivés tels que l'acide 5- diméthylaminonaphtalène-1-sulfonique et les hydroxynaphtalènes, Fanthracène et ses dérivés tels que le 9,10-diphénylanthracène, le 9-méthylanthracène, le pyrène et ses dérivés tels que le N-(l-pyrène)iodoacétamide, les hydroxypyrènes, le biphényle et ses dérivés, l'acridine et ses dérivés tels que les hydroxyacridines et la 9-méthylacridine, la coumarine et ses dérivés tel que la 7-dialkylamino-4-méthylcoumarine, la 4-bromométhyl-7- methoxycoumarine, le xanthène et ses dérivés, la phtalocyanine et ses dérivés, le stilbène et ses dérivés tels que le 6,6'-dibromostilbène et les hydroxystilbènes, le furane et ses dérivés, l'oxazole et ses dérivés, l'oxadiazole et ses dérivés, le nitrobenzoxadiazole et ses dérivés tels que les hydroxynitrobenzoxadiazoles, le benzothiazole et ses dérivés, la fluorescéine et ses dérivés tels que la 5-iodoacétamidofluorescéine, la fluorescéine-5-maléimide, la rhodamine et ses dérivés tels que la tetraméthylrhodamine, la tétraéthylrhodamine, les rhodols, le BODIPY et ses dérivés, l'éosine et ses dérivés, l'érythrosine et ses dérivés tels que les hydroxyérythrosines, la 5-iodocétamidoérythrosine, la résorufine et ses dérivés tels que les hydroxyrésorufines, la quinoléine et ses dérivés tels que la 6-hydroxyquinoléine et la 6-aminoquinoléine, le carbazole et ses dérivés tels que le N-méthylcarbazole, les cyanines fluorescentes et dérivés telles que les hydroxycyanines, la carbocyanine et ses dérivés tels que la phénylcarbocyanine, les sels de pyridinium et dérivés tels que l'iodate de 4(4-dialkyldiamidostyryl)-N-méthylpyridinium, un complexe fluorescent de lanthanides et ses dérivés, les protéines fluorescentes, telle que la protéine verte fluorescente (ou Green Fluorescent Protein, GFP) et ses mutants ou les quantum dots.
Avantageusement, R1 et R10 peuvent être avantageusement choisis parmi des molécules dont la longueur d'ondes d'émission de fluorescence est dans la plage allant de 400 à 900 nanomètres, notamment allant de 500 à 900, et plus particulièrement allant de
600 à 900 nanomètres, comme par exemple la rhodamine et ses dérivés, le BODIPY et ses dérivés, les cyanines et dérivées ou les quantum dots.
Selon un autre mode particulier de réalisation, les composés conformes à la présente invention peuvent être de formule générale (Va) :
Figure imgf000017_0001
dans laquelle, - S figure une structure labile, et X, Ar, R1, R2, R3, R5 et R6 sont tels que définis précédemment.
Avantageusement, R2 et R3 sont liés pour former un radical adamantyle en spiro avec le carbone du cycle dioxétane qui les portent, le cas échéant substitué par des radicaux tels que définis précédemment, notamment par des radicaux tels que R8 et R9. Avantageusement, R1, R5 et R6 sont des radicaux méthoxy.
Selon un autre mode particulier de réalisation, les composés conformes à la présente invention peuvent être de formule générale (Vb) :
Figure imgf000018_0001
dans laquelle,
- S figure une structure labile, et Ar, R1, R2, R3, R5, R6, R10 et R11 sont tels que définis précédemment.
Avantageusement, R2 et R3 sont fusionnés pour former un radical adamantyle en spiro avec le carbone du cycle dioxétane qui les portent, le cas échéant substitué par des radicaux tels que définis précédemment, notamment par des radicaux tels que R8 et R9.
Avantageusement, R1, R5 et R6 sont des radicaux méthoxy.
R10 et R11 sont avantageusement un atome d'hydrogène, ou R10 et un atome d'hydrogène et R11 forme avec le radical phénylène un radical naphtylène.
Selon un autre mode particulier de réalisation, les composés conformes à la présente invention peuvent être de formule générale (Vc) :
Figure imgf000018_0002
dans laquelle S figure la structure labile et R1, R5, R6, R8, R9, R10 et R11 sont tels que définis précédemment.
Selon un autre mode particulier de réalisation, les composés conformes à la présente invention peuvent être représentés par la formule générale (Vc) dans laquelle R8 = R9 = R10 = R11 = H et R1 = R5= R6 = -OCH3.
Structure labile S
Dans la formule générale (I) des composés conformes à l'invention, S représente une structure labile activable par un phénomène ou une entité chimique, physique, ou biologique.
Par "phénomène physique", on entend désigner au sens de la présente invention, par exemple, une variation de température, une variation de pression.
Par "phénomène chimique", on entend désigner au sens de la présente invention un phénomène faisant intervenir une entité chimique modifiant les propriétés chimiques de l'environnement, comme par exemple, une variation de pH par une augmentation ou une diminution de protons, une variation de la salinité par une augmentation ou une diminution de la teneur en sel(s), une variation du potentiel redox, une apparition ou une disparition d'espèces chimiques, par exemple des ions tels que F", S", et des ions de métaux alcalino-terreux tels que Ca2+. Lorsque S représente une structure labile activable par un phénomène chimique, S peut avantageusement être, par exemple un ammonium, une amide, une aminé, un ester, un silylanne, un thiol, un carbamate, ou un carbonate.
Par "phénomène biologique", on entend désigner au sens de la présente invention un phénomène iàisant intervenir l'activité d'une entité biologique, par exemple une activité enzymatique, à l'image par exemple d'une hydrolyse, d'un transfert d'un groupement aminé, d'une isomérisation.
Ainsi, lors de l'activation des composés selon l'invention par un phénomène biologique, les composés sont soumis à l'action d'une entité biologique. A titre d'illustration d'une entité biologique susceptible d'activer les composés selon l'invention, on peut mentionner, de manière non limitative, les enzymes, les ribozymes, les abzymes. A titre d'exemple d'enzymes susceptibles d'activer les composés conformes à l'invention, il peut être fait mention des transférases, telles que les aminotransférases ; les hydrolases telles que les estérases (phosphatase alcaline par exemple), les glucosidases, les protéases (trypsine, métalloprotéinases ou caspases par exemple) ; les isomérases Lorsque S est une structure activable par une entité biologique, S peut être avantageusement de formule générale (VI) :
P-L-D dans laquelle :
D symbolise le lien covalent avec B, - P figure un substrat reconnaissable par ladite entité,
L représente un oxygène, un soufre, un motif azoté, un carbonyle ou une fonction -CO-Q-, avec Q étant O, S ou NH.
Selon un mode de réalisation, S peut représenter une structure labile par action d'une enzyme, et notamment par action d'une hydrolase.
Avantageusement, lorsque S représente une structure labile par action d'une hydrolase de type protéase, L représente -CO-Q, avec Q étant NH, et P représente un substrat reconnu par une protéase, tel que par exemple un reste peptidique ou pseudopeptidique. A titre d'exemple de protéases susceptibles de convenir à la mise en œuvre de la présente invention, il peut être fait mention, non limitativement, des caspases telles que la caspase-3, de l'acylaminoacyl peptidase, de Faminopeptidase M, de la pénicillinase G acylase, de la thermolysine, des cathepsines B, G, L, des métalloprotéinases, de l'élastase, de la subtilisine, de l'activateur du plasminogène, de l'urokinase. Selon un mode de réalisation, lorsque P est un reste peptidique, il comprend au moins deux résidus acides aminés, en particulier au moins quatre, en particulier au mois six et plus particulièrement au moins huit résidus acides aminés.
Ces acides aminés peuvent être de configuration L ou D, naturels ou synthétiques. Ces peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique ou biologie moléculaire selon les méthodes usuelles de l'homme de l'art. A titre d'exemple de reste peptidique convenant à la mise en œuvre de la présente invention, il peut être fait mention de la séquence tétrapeptidique DEVD (aminoacide écrit en code à une lettre) qui est hydrolyse sélectivement après le dernier résidu aspartate, par la caspase-3.
Selon une autre variante de réalisation, S peut représenter une structure labile par action d'une hydrolase de type estérase, telle qu'une carboxyestérase, une phosphatase ou une lipase.
Dans ce cas, L peut représenter -CO-Q avec Q étant O, et P représentant un résidu carboné (de type chaîne alkyle de manière à ce que l'ensemble P-L constitue un reste d'acide carboxylique, notamment d'acide gras) reconnu par une enzyme de type estérase ou glucosidase ou un groupement phosphate reconnu par une enzyme de type phosphatase.
Lorsque P est un groupement phosphate, il peut être de formule (VII)
O
I I — P-O M+ l _ ° M+ dans laquelle M+ représente un cation tel un métal alcalin, comme Na+ ou K+, un ammonium, ou un cation ammonium quaternaire N(R)4 + dans lequel chaque R peut être un alkyle en C1-C2, un aralkyle, comme un benzyle, ou former une partie d'un hétérocycle, comme un pyridinium. De telles structures sont avantageusement hydrolysées par une phosphatase alcaline.
Selon une autre variante de réalisation, S peut représenter une structure labile par action d'une enzyme de type glucosidase. Dans ce cas, L peut être avantageusement un atome d'oxygène et P représente un substrat reconnu par une glucosidase, tel qu'un sucre.
A titre d'exemple de sucre susceptible de convenir à la mise en œuvre de l'invention, on peut mentionner l'α-D- ou le β-D-galactoside, l'α-D- ou le β-D-glucoside, l'α-D- ou le β-D-mannoside et l'α-D ou le β-D-fructofuranoside. Selon un autre mode de réalisation S peut représenter une structure labile par action d'une aminotransférase.
Dans ce cas L peut représenter un carbonyle et P peut représenter un substrat reconnu par une enzyme telle que par exemple, et de manière non limitatif, une alanine aminotransférase ou une aspartate aminotransférase.
CIBLAGE
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut comprendre, en outre au niveau de la structure labile S, une structure de ciblage D. Ainsi, un composé peut être de formule générale (VII) suivante :
D-S-B-A dans laquelle :
D figure une structure de ciblage, et S, B et A sont tels que définis précédemment. La structure de ciblage D, ou ligand, est un élément susceptible de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules exprimant un élément cellulaire particulier, tel que par exemple, et de manière non limitative, un récepteur, une enzyme, une protéine de structure, une glycoprotéine, un sucre, un lipide ou un phospholipide. Avantageusement l'élément cellulaire est un élément membranaire, de préférence possédant une partie de sa structure disposé dans le milieu extracellulaire.
Selon un mode de réalisation, cet élément cellulaire peut être spécifique d'un état physiologique ou pathologique de la cellule ou du tissu environnant la cellule ou de l'organe comprenant la cellule. Ainsi, et de manière non limitative, l'élément cellulaire peut être spécifique de l'état de croissance de la cellule, de la position dans le cycle cellulaire, d'une réponse inflammatoire de la cellule ou du tissu, d'une apoptose, d'une dégénérescence tissulaire.
L'expression "reconnaître ou de lier préférentiellement" vise à indiquer que la structure de ciblage D possède une affinité particulière pour les cellules ou tissus considérés, même si une liaison non spécifique ou moins importante avec d'autres cellules ou d'autres tissus ne peut être totalement exclue in vivo ou ex vivo. La liaison préférentielle permet toutefois un ciblage des composés conformes à l'invention vers les sites d'intérêt, réduisant la dissémination du composé selon l'invention vers les tissus et/ou les cellules de moindres intérêts.
Ainsi, la structure de ciblage D peut être choisi, par exemple et de manière non limitative, parmi une lectine, un anticorps ou un fragment de celui-ci reconnaissant un élément présent à la surface des cellules tel que par exemple une protéine, un sucre, un lipide ; un ligand d'un récepteur cellulaire telle que par exemple un peptide comme le neuropeptide Y, une catécholamine telle que l'adrénaline, un antagoniste comme par exemple un antagoniste de récepteurs β-adrénergiques tel que le propranolol, un facteur de croissance, un acide aminé ou un dérivé de celui-ci tel que par exemple le glutamate, une cytokine tel que par exemple une interleukine, un interféron ou un TNF, une hormone, une vitamine, une apolipoprotéine, le cholestérol ; un ligand susceptible d'interagir avec un lipide ou phospholipide membranaire tel que par exemple une annexine ; un ligand susceptible d'interagir un sucre présent à la surface des cellules.
On entend désigner par "récepteur cellulaire" tout élément cellulaire capable de transduction d'une information de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule.
Il relève des connaissances de l'homme de l'art de déterminer la nature de la structure D appropriée au ciblage désiré, le cas échéant en faisant appel à des méthodes d'essais habituellement pratiquées dans le domaine.
Selon un mode de réalisation, la structure de ciblage D peut être un ligand, par exemple un polypeptide, capable de se lier à la surface de cellules présentes de façon caractéristique ou spécifique dans un tissu particulier ou présentant une pathologie.
La structure de ciblage D peut également se lier à la surface de cellules tumorales ou présentent dans un tissu tumoral, ou à la surface de cellules présentes dans un tissu inflammatoire. La structure de ciblage D peut, par exemple, se lier à la surface des cellules engagées dans un processus d'apoptose, qui exposent à leur surface des lipides chargés négativement, comme par exemple la phosphatidylsérine.
Selon une variante de réalisation la structure de ciblage D peut être une protéine ou un fragment de protéine tel qu'un peptide ou un polypeptide ou un pseudopeptide.
Parmi les protéines susceptibles de se lier aux membranes exposant des lipides chargés négativement, on peut mentionner, de manière non limitative, la famille des Annexines, les familles des protéines comportant un domaine Cl ou C2, telles que les facteurs V et VIII de la coagulation sanguine, les familles des protéines comportant un domaine PH ou un domaine FYVE, ou encore les protéines comportant un domaine identique ou homologue du domaine 5 des β2-glycoprotéines-I (βGP-I). Ces protéines ou des domaines issus de leurs séquences peuvent être utilisés comme structure de ciblage dans des composés conformes à l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, à une structure de ciblage D peuvent être fixés un ou plusieurs composés de formule générale (I), afin d'augmenter, notamment, l'intensité du signal émis. Ainsi, il peut être fixé par élément de ciblage D, au moins une, notamment au moins deux, en particulier au moins 3, en particulier au moins 4, et plus particulièrement au moins 5 composés de formule S-B-A.
PROCÉDÉ DE DÉTECTION Comme précisé précédemment, la présente invention a également pour objet l'utilisation, à des fins de détection et/ou de quantification d'un phénomène chimique, physique ou biologique, tel que précisé précédemment, d'au moins un composé conforme à l'invention, dans lequel S figure une structure labile activable par ledit phénomène.
Avantageusement, le composé selon l'invention mis en œuvre dans cette utilisation peut être de formule générale (Va) ou (Vb) comme défini précédemment.
Notamment, la présente invention vise à proposer également un procédé de détection et/ou de quantification d'une entité biologique.
Le procédé conforme à l'invention comprend au moins les étapes de mise en contact d'au moins une quantité efficace d'au moins un composé conforme à la présente invention, et notamment de formule générale (Va) ou (Vb) dans lequel S figure une structure labile activable par ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier avec un milieu présumé comprendre ladite entité et la mesure du signal luminescent généré. Le procédé selon l'invention peut être conduit in vitro, ex vivo ou in vivo.
Lors de la mise en présence d'un milieu, dans lequel un phénomène chimique, physique ou biologique est susceptible de se produire, avec une quantité efficace d'au moins un composé selon l'invention dont l'entité S figure une structure labile activable par ledit phénomène, dans des conditions propices à la réalisation dudit phénomène, l'activation de la structure S conduit à l'émission d'un signal luminescent.
En détectant la présence ou l'absence du signal luminescent, il est possible de mettre en évidence la présence ou l'absence dudit phénomène et en mesurant l'intensité du signal, l'ampleur du phénomène peut également être déterminée.
Selon un mode de réalisation particulier, le phénomène biologique à détecter/quantifier peut être une activité d'une entité biologique, notamment, une enzyme.
Dans cette mise en œuvre particulière, la structure S labile figure un substrat reconnu par ladite enzyme. L'action de l'enzyme sur le substrat S, notamment sur le groupe L de la formule générale (II), dans des conditions propices à la réactivité de l'enzyme conduit à l'émission d'un signal luminescent.
Ainsi, dans le cadre par exemple d'une hydrolase, l'hydrolyse d'un groupement enzymatiquement hydrolysable, notamment figuré par L dans la formule générale (II), dans des conditions propices à la réactivité de l'enzyme, conduit à l'émission d'un signal luminescent.
En détectant la présence ou l'absence de signal lumineux, il est possible de mettre en évidence la présence ou l'absence de l'enzyme et en mesurant l'intensité du signal, la concentration et/ou les caractéristiques cinétiques peuvent également être déterminées.
Avantageusement, le milieu pouvant convenir à la mise en œuvre du procédé selon la présente invention peut être un milieu biologique, synthétique ou naturel à l'image d'un échantillon de fluide biologique.
II peut être avantageux d'utiliser, in vitro, ou le cas échéant ex vivo, conjointement à un composé conforme à l'invention, au moins un amplificateur de lumière susceptible d'augmenter le signal luminescent résultant de la dégradation dudit composé conforme à l'invention.
De tels composés sont déjà connus. A titre d'exemple de ces amplificateurs, il peut être fait mention de la fluorescéine, de l'albumine bovine, de l'albumine humaine, et des sels de polymère d'onium quaternaires tels que le chlorure de polyvinylbenzyltriméthylammonium (TMQ), le chlorure de polyvinylbenzyltributylammonium (TBQ) (Sapphire-II™), le chlorure de polyvinylbenzyldiméthylammonium (BDMQ) (Sapphire-I™), le chlorure de polyvinylbenzyltributylphosphonium, le chlorure de polyvinylbenzyltributylsulfonium, le chlorure de poly(benzyldiméthylvinylbenzyl)ammonium, un sel de sodium de la fluoresceine (Emerald ™), le poly(benzyltributyl)ammonium et le sel de sodium de fluoresceine (Emerald II™).
Lorsque le procédé conforme à l'invention est mis en œuvre in vitro, la détection du signal de fluorescence peut se faire par tout appareil habituellement mis en œuvre par l'homme de l'art dans ce domaine. Par exemple un échantillon mis en contact avec un composé selon l'invention peut, éventuellement après une période d'incubation, être soumis à une méthode analytique comprenant, ou non, une étape de séparation des éléments composant l'échantillon, par exemple par chromatographie (par exemple une chromatographie liquide haute performance, HPLC), et une étape d'analyse spectrale (par exemple par spectroscopie UV) des différentes fractions issues de l'étape de séparation. La détection et la mesure du signal spectroscopique spécifique d'un composé selon l'invention (par exemple la hauteur et la surface d'un pic de chromatographie) peuvent être corrélées à la présence, et/ou à l'intensité/quantité du phénomène à détecter, tel que par exemple la présence, la quantité, et/ou l'activité cinétique d'une enzyme.
Le procédé, et l'utilisation, conformes à la présente invention peuvent être également avantageusement mis en œuvre in vivo.
Les composés conformes à la présente invention peuvent être préalablement administrés à un être vivant, tel que par exemple un animal ou un être humain, puis la détection du signal de fluorescence peut être réalisée in vivo selon les moyens usuellement mis en œuvre dans le domaine.
Avantageusement, la mise en œuvre in vivo d'une utilisation conforme à l'invention permet d'établir des images des tissus ou organes susceptibles dans lesquels ledit phénomène à détecter/quantifier est susceptible de se produire. Selon un mode particulier de réalisation il est possible d'établir des images des tissus ou organes susceptibles d'exprimer une entité biologique, et notamment une enzyme, à détecter et/ou à quantifier. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre dans des méthodes d'imagerie médicale.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est un procédé de diagnostic in vivo comprenant la détection et/ou la quantification d'une entité biologique, notamment une enzyme, au moyen d'un composé de formule générale (Va) ou
(Vb) dans laquelle S figure une structure labile activable par ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier.
Le procédé conforme à l'invention peut être appliqué, par exemple et de manière non exhaustive, à des visées diagnostiques médicales, expérimentales, cliniques ou pré-cliniques chez des êtres humains ou chez des animaux tels que des animaux de laboratoires ou des animaux utilisés dans l'agriculture, tels que le rat, la souris, le cobaye, le primate non humain, le cochon d'inde, ou le cochon.
Selon un mode particulier de réalisation, l'entité biologique susceptible d'être détectée et/ou quantifiée par un procédé selon l'invention peut être une enzyme, choisie notamment, de manière non limitative, parmi une aminotransférase ou une hydrolase, telle qu'une estérase, une protéase ou une glucosidase.
Selon un autre mode de réalisation, lorsque l'enzyme à détecter et/ou à quantifier est une protéase, elle peut être avantageusement choisie, de manière non limitative, parmi des caspases, des pénicillinases, des carboxypeptidases, la trypsine, l'acylaminoacylpeptidase, des aminopeptidases, des cathepsines, des métalloprotéinases, l'élastase, la subtilisine, la thermolysine, l'activateur du plasminogène, l'urokinase, des isomérases.
Dans le cadre de la mise en œuvre in vivo, les composés conformes à l'invention peuvent être mis en forme afin d'être adaptés à une administration par voie orale, ou parentérale, notamment intraveineuse, intraartérielle, intracardiaque, intracérébro- ventriculaire, intrapéritonéale, intratumorale, ou pour une administration par voie pulmonaire, nasale, ophtalmique et éventuellement rectale, vaginale ou topique.
Les composés conformes à l'invention peuvent être ainsi mis en œuvre dans une formulation adaptée au procédé de détection à réaliser et à la voix d'administration choisie. Par exemple, les composés conformes à l'invention peuvent être préparés sous la forme d'un comprimé, d'une gélule ou d'une solution aqueuse concentrée ou non. Cette solution aqueuse peut être avantageusement stérile.
Selon un autre mode de réalisation, les composés conformes à l'invention peuvent être sous forme solide, par exemple en poudre, et être préparés en solution aqueuse, avantageusement stérile, juste avant leur administration.
Ainsi, selon un de ses aspects la présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un composé conforme à l'invention, notamment de formule générale (Va) ou (Vb) pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vivo, notamment une méthode d'imagerie médicale.
Ainsi selon un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte également à une composition pharmaceutique comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé conforme à la présente invention, notamment de formule générale (Va) ou (Vb). Avantageusement, la mise en œuvre d'un composé selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique peut se faire sous la forme d'un dérivé, tel qu'un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable. Ainsi, la présente invention se rapporte également aux sels et esters des composés conformes à l'invention. A titre d'exemple d'ester d'un composé selon l'invention, on peut mentionner un succinate, un hémisuccinate, un malate, un tartrate, un glycolate d'un composé selon l'invention. A titre d'exemple de sel d'un composé selon l'invention, on peut mentionner un sulfate, un phosphate, un sel de sodium, un sel de calcium d'un composé selon l'invention.
L'ajustement des quantités efficaces adéquates du ou des composés conformes à l'invention, à mettre en œuvre dans un procédé ou une utilisation selon l'invention, dépend du phénomène, ou de l'entité, à détecter/quantifier (chimique, physique, biologique) et de l'environnement dans lequel le procédé selon l'invention est conduit (in vitro, ex vivo ou in vivo).
In vivo, les quantités efficaces peuvent, également, être ajustées selon la taille, le poids de l'individu à qui le procédé selon l'invention est appliqué, ou chez qui l'utilisation selon l'invention est mise en œuvre, ainsi que selon l'organe ou le tissu ciblé.
Les ajustements peuvent être réalisés par toutes méthodes usuellement pratiquées par l'homme de l'art. Au sens de la présente invention, on entend par "quantité efficace", la quantité nécessaire et suffisante pour obtenir l'effet désiré, à savoir la détection et/ou la quantification d'un phénomène chimique, physique ou biologique, ou d'une entité biologique. Selon un autre mode particulier de réalisation, la présente invention se rapporte à un kit pour la détection et/ou la quantification par génération d'un signal luminescent d'un phénomène chimique, physique ou biologique, ledit kit comprenant au moins un composé conforme à la présente invention dans lequel S figure une structure labile activable par ledit phénomène physique, chimique ou biologique à détecter et/ou quantifier.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention se rapporte à un kit pour la détection et/ou la quantification d'une entité biologique, notamment une enzyme, comprenant un composé conforme à la présente invention, et notamment de formule générale (Va) ou (Vb), dans laquelle S figure une structure labile activable par ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier.
Selon une mise en œuvre particulière, le kit conforme à la présente invention peut également comprendre au moins un amplificateur de lumière tel que défini précédemment.
La présente invention sera mieux comprise d'après les exemples suivants.
Ces exemples sont présentés à titre d'illustrations de l'invention et ne doivent pas être interprétés comme pouvant limiter la portée de la présente invention.
SECTION EXPERIMENTALE
Séparation par chromatographie liquide haute performance (CLHP) Plusieurs systèmes chromatographiques ont été utilisés pour les expériences analytiques et les étapes de purification :
- Système A : CLHP en phase inversée (C 18, HYPERSIL GOLD, 5 μ, 4,6 x 150) dans un tampon acétate de triéthylammonium et d'acétonitrile (TEAA 100 mm, pH 7, 0) [75 % TEAA (2 min), puis gradient linéaire de 25 à 100 % (30 min) d'acétonitrile] à un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV a été réalisée à 254 et 285 nm. - Système B : CLHP en phase inversée (Cl 8, NUCLEOSIL, 5 μ, 10 x 250) dans un mélange eau déminéralisée et acétonitrile [75 % d'eau (5 min), puis gradient linéaire de 25 à 55 % (15 min) et de 55 à 90 % (70 min) d' acétonitrile] à un débit de 5,0 ml/min. Une détection UV a été réalisée à 260 nm. - Système C : CLHP en phase inversée (C 18, HYPERSIL GOLD, 5 μ, 4,6 x
150) dans un tampon acétate de triéthylammonium et d'acétonitrile (TEAA 100 mm, pH 7,0) [90 % TEAA (2 min), puis gradient linéaire de 10 à 90 % (40 min) d'acétonitrile] à un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV a été réalisée à 254 et 285 nm.
Exemple 1 : Bras réactif
Synthèse de l'acide 4,5-diméthoxy-2-[(phénylacétamino)méthyl] phénylacétique (7).
Figure imgf000030_0001
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De l'hydroxyde de potassium (2 g, 36 mmol), finement pulvérisé a été ajouté à une solution de phénylacétonitrile 13 (2 ml, 17 mmol) dans de l'alcool tert-butylique (20 ml) sous agitation. Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 45 min, puis refroidi à température ambiante et versé dans une solution aqueuse de chlorure de sodium
(50 ml). Le produit est extrait par du chloroforme (CHCl3). La phase organique est séchée sur du MgSO4 et concentrée sous pression réduite pour donner du phénylacétamide 12 (2,1 g, 94 %) sous la forme d'une poudre blanche. Mp 152°C. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ
7.40-7.10 (m, 5H), 5.88 et 5.39 (br s, NH2), 3.50 (s, 2H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ
173.8, 134.9, 129.5, 129.1, 127.5, 43.4.
Un mélange de phénylacétamide 12 (2 g, 15 mmol) dans une solution de carbonate de potassium (4 % ; 2 ml ; 0,6 mmol) et d'une solution aqueuse de formaldéhyde (37 %, 2 ml, 20 mmol) a été chauffé à reflux pendant 15 min (jusqu'à dissolution complète). Le mélange a été refroidi et extrait avec du CH2Cl2 (2 x 30 ml). Les phases organiques combinées ont été séchées sur du MgSO4 et ont été concentrées sous pression réduite pour donner un produit brut (1,35 g), une recristallisation dans le toluène (20 ml) donne du iV-hydroxyméthylphénylacétamide 11 (1,1 g, 44 %) sous forme d'une poudre blanche. Mp 78°C. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 7.50-7.20 (m, 5H), 6.48 (br s, NH), 4.69 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.67 (t, J = 7 Hz, OH), 3.60 (s, 2H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ 172.9, 134.4, 129.5, 129.0, 127.5, 64.2, 43.6.
Une solution d'acide homovanillique 10 (2 g, 11 mmol), d'acide sulfurique (500 ml, 9,4 mmol) dans du méthanol (100 ml) a été chauffée à reflux pendant 3 heures. Après refroidissement, une solution de bicarbonate de sodium a été ajoutée au mélange réactionnel. Le produit a été extrait avec du CH2CI2 (2 x 50 ml). Les phases organiques combinées ont été séchées sur du MgSO4 et concentrées sous pression réduite pour donner du 4-hydroxy-3-méthoxy-phénylacétate de méthyle 9 (2 g, 94 %), sous forme d'une huile incolore. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 7.00-6.70 (m, 3H), 5.82 (br s, OH), 3.87 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.56 (s, 2H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ 172.6, 146.6, 144.8, 125.7, 122.1, 114.5, 111.8, 55.9, 52.1, 40.8.
Du carbonate de césium (6,6g ; 20,2 mmol) et du sulfate de diméthyle (2 ml ; 21 mmol) ont été ajoutés à une solution de 4-hydroxy-3-méthoxyphénylacétate de méthyle 9_(2 g ; 10,2 mmol) dans du DMF anhydre (80 ml). Le mélange réactionnel a été chauffé à 90 °C pendant trois heures. Apres refroidissement, de l'eau (20 ml) a été ajoutée au mélange et le produit a été extrait avec du diéthylether (2 x 50 ml).
Les phases organiques combinées ont été lavées avec une solution aqueuse de NaCl (20 ml), séchées sur du MgSO4 et concentrées sous pression réduite. Une chromatographie sur gel de silice en utilisant comme mélange éluant du cyclohéxane/acétate d'éthyle (1/1) a donné du 2-(3,4-diméthoxyphényl)acétate de méthyle 8 (1,7 g ; 80 %) sous la forme d'une huile incolore. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 6.80- 6.50 (m, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.40 (s, 2H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ 172.2, 148.8, 148.0, 126.4, 121.3, 112.3, 111.1, 55.8, 55.7, 51.9, 40.6. Une solution d'acide acétique (20 ml) et d'acide sulfurique (730 μl ; 14 mmol) prérefroidie a été ajoutée à un mélange de iV-hydroxyméthylphénylacétamide 11 et de 2- (3,4-diméthoxyphényl)acétate de méthyle 8 (1,5 g ; 7,2 mmol). La suspension a été agitée pendant 2 heures à 0 °C puis à température ambiante pendant 12 heures. Le mélange réactionnel a été neutralisé avec une solution d'hydroxyde de sodium 5M à 0 °C. Le produit a été extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 30 ml). Les phases organiques combinées ont été séchées sur du MgSO4 et concentrées pour donner du 4,5-diméthoxy-2- [(phénylacétamino)méthyl]phénylacétate de méthyle 6 (2 g ; 78 %) sous la forme d'une huile incolore qui a cristallisé. Mp 118°C. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 7.40-7.15 (m, 5H), 6.68 (s, IH), 6.59 (s, IH), 6.24 (br s, NH), 4.28 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.57 (s, 3H), 3.51 (s, 2H), 3.47 (s, 2H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ 172.8, 170.8, 148.4 (2C), 135.0, 129.7 (2C), 129.2, 127.5 (2C), 124.9, 113.8, 113.2, 56.3 (2C), 52.7, 44.2, 41.7, 38.3. IR (CHCl3) 3017, 1732, 1660, 1520, 1466, 1275. Anal. Calculée pour C20H23NO5: C, 67.21; H, 6.49; N, 3.92. Mesurée : C, 66.88; H, 6.56; N, 3.97.
Une solution aqueuse d'hydroxyde de lithium (0,5 M ; 56 ml ; 28 mmol) a été ajoutée à une solution de 4,5-diméthoxy-2-[(phénylacétamino)méthyl]phénylacétate de méthyle 6 (2 g ; 5,6 mmol) dans du méthanol (50 ml). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 12 heures, puis neutralisé avec une solution aqueuse d'HCl (2N) et une précipitation du produit a été observée. Une filtration a donné de l'acide 4,5- diméthoxy-2-[(phénylacétamino)méthyl]phénylacétique 7 (1,5 g ; 78 %) sous la forme d'une poudre blanche. Mp 186°C. RMN 1H ((CD3)2SO, 300 MHz) δ 8.40 (br s, IH), 7.30- 7.20 (m, 6H), 6.80 (s, IH), 6.73 (s, IH), 4.18 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 3.55 (s, 2H), 3.44 (s, 2H). RMN 13C ((CD3)2SO, 75 MHz) δ 172.8, 170.0, 147.4, 147.3, 136.6, 129.9, 129.0 (2C), 128.3 (2C), 126.4, 125.2, 114.6, 111.9, 55.6, 55.4, 42.5, 39.6, 37.5. Anal. Calculée pour C19H21NO5: C, 66.46; H, 6.16; N, 4.08. Mesurée : C, 66.52; H, 5.92; N, 4.06.
Exemple 2 : Précurseur du dioxétane
Synthèse du 2-[l-(3-hydroxy)phényle)-l-méthoxyméthylène]tricyclo[3.3.1.1s'7] décane (3a)
Figure imgf000032_0001
Du chlorure de tert-butyldiméthylsilyle (2,7 g ; 18 mmol) a été ajouté à une solution de 3-hydroxybenzoate de méthyle 4a (2,3 g ; 15 mmol), et d'imidazole (2,6 g ; 37,5 mmol) dans du DMF anhydre (5 ml). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 14 heures sous une atmosphère d'argon. Le mélange a été dilué avec de l'eau (20 ml) et le produit a été extrait avec du /z-pentane (2 x 20 ml). Les phases organiques combinées ont été séchées sur du MgSO4 et concentrées sous pression réduite. Une chromatographie sur gel de silice utilisant comme mélange éluant du cyclohéxane/acétate d'éthyle (v/v : 95/5) a donné l'ester de méthyle et d'acide 3-(tert- butyldiméthylsilyloxy)benzoïque 4b (3,7 g ; 93 %). RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 7.42 (d, J= 8 Hz, IH), 7.28 (t, J= 2 Hz, IH), 7.07 (t, J= 8 Hz, IH), 6.81 (dd, J = 8 Hz, 2 Hz, IH), 3.68 (s, 3H), 0.78 (s, 9H), 0.1 (s, 6H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ 166.9, 155.8, 131.6,
129.4, 124.9, 122.7, 121.1, 52.2, 25.7, 18.2, -4.4.
Du LiAlH4 (800 mg) a été lentement ajouté à une suspension de TiCl3 (THF)3 (16,5 g ; 44,6 mmol) dans du THF anhydre (15 ml) à 0 °C. Après 10 minutes à 0 °C, de la triéthylamine (3,5 ml) a été ajoutée et le mélange a été chauffé à reflux pendant une heure. Une solution de 2-adamantanone 5 (822 mg ; 5,47 mmol) et d'ester de benzoate de méthyle 4b précédemment préparé (1,2 g ; 444,50 mmol) dans du THF anhydre (10 ml) a été ajoutée goutte à goutte au mélange. Le mélange réactionnel a été chauffé à reflux pendant 3 heures. De l'eau a été ajoutée avec précaution au mélange à 0 °C, qui a ensuite été dilué avec du diéthyléther. La phase organique a été lavée avec une solution saturée de NaCl, puis séchée sur du MgSO4 et concentrée sous pression réduite. Une chromatographie sur gel de silice en utilisant comme mélange éluant du cyclohéxane/EtOAc (v/v : 99/1) a permis d'obtenir du 2-[l(3-tert-butyldiméthylsilyloxy)phényl)-l- méthoxyméthylène]tricyclo[3.3.1.1]décane 3b (796 mg ; 66 %) sous forme d'une huile incolore. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 7.09 (t, J= Hz, IH), 6.81 (d, J= Hz, IH), 6.70 (m, 2H), 3.20 (s, 3H), 3.14 (br s, IH), 2.54 (br s, IH), 1.87-1.67 (m, 12H), 0.91 (s, 9H), 0.14 (s, 6H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ 155.5, 143.6, 136.9, 131.2, 129.0, 122.6, 121.2,
119.5, 57.6, 39.3, 39.2, 38.9, 37.4, 32.9, 30.5, 25.8, 18.3, -4.70.
Une solution de W-Bu4NF dans du THF (2,1 ml ; 2,1 mmol ; 1,0M) a été ajoutée a une solution de 2-[l(3-tert-butyldiméthylsilyloxy)phényl)-l- méthoxyméthylène]tricyclo[3.3.1.13'7]décane 3b (740 mg ; 1,91 mmol) dans du THF sec
(12 ml). Le mélange réactionnel a été agité pendant 15 minutes à température ambiante. Le mélange a été dilué dans du diéthyléther (30 ml) et lavé avec une solution saturé de NaCl.
La phase organique a été séchée sur du MgSO4 et concentrée sous pression réduite pour donner comme produit brut du 2-[l-(3-hydroxy)phényl)-l- méthoxyméthylène]tricyclo[3.3.1.13'7]décane 3a sous forme d'une huile jaune. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 7.19-6.67 (m, 4H), 3.67 (s, 3H), 3.30 (br s, IH), 3.1 (br s, IH), 2.50 (br s, 2H), 1.87-1.64 (m, 10H).
Exemple 3: Dioxétane
Synthèse du dérivé chiomioluminescent selon l'invention (1)
Figure imgf000034_0001
Du 2-[l-(3-hydroxy)phényl)-l-méthoxyméthylène]tricyclo[3.3.1.13'7]décane 3a (520 mg), de la triéthylamine (800 μl) et de Fhéxafluorophosphate de benzotriazol-1- yloxytris(diméthylamino)phosphonium (BOP) (950 mg) ont été ajoutés à une solution d'acide 4,5-diméthoxy-2-[(phénylacétamino)méthyl]phénylacétique 7 (656 mg ; 1,91 mmol) dans du DMF anhydre (10 ml). Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 6 heures. Le mélange a été concentré sous vide. Une chromatographie sur gel de silice en utilisant comme éluant du cyclohéxane/EtOAc (v/v : 40/60) a donné l'ether d'énol ester 3-(adamantan-2-ylidene-methoxy-methyl)-phenylique de l'acide [4,5- dimethoxy-2-(phenylacetylamino-methyl)-phenyl] -acétique 2 (606 mg ; 53 %) sous forme d'une poudre blanche. M.p. 95°C. RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 7.21 (t, J= 7.9 Hz, IH), 7.15-7.00 (m, 6H), 6.91 (t, J = 2.3 Hz, IH), 6.84 (ddd, J = 7.9 Hz, 2.3 Hz, 0.8 Hz, IH), 6.80 (s, IH), 6.77 (s, IH), 4.44 (d, J= 5.3 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.85 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.53 (s, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.25 (br s, IH), 2.66 (br s, IH), 1.90-1.55 (m, 12H). RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) δ 150.6, 148.6, 148.5, 142.6, 137.3, 134.9, 132.9, 129.4, 129.1, 128.9, 127.3, 127.1, 124.1, 122.1, 120.4, 113.5, 112.9, 58.0, 56.1, 56.0, 43.9, 41.4, 39.3, 39.1, 38.3, 37.2, 32.2, 30.3, 28.3. MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z 634.27 [M+K]+, 618.30 [M+Na]+. Anal. Calculée pour C37H4!NO6: C, 74.60; H, 6.94; N, 2.35. Mesurée : C, 74.25; H, 7.09; N, 2.41. On a fait barboter de l'ozone dans une solution refroidie (- 78 °C) de phosphite de triphényle fraîchement distillé (37 μl, 0,14 mmol) dans 9 ml de CH2CI2 anhydre jusqu'à apparition d'une légère coloration bleue . Le milieu réactionnel a été ensuite purgé avec de l'argon jusqu'à ce que la coloration bleue disparaisse. L'éther d'énol 2 précédemment synthétisé (21 mg ; 0,035 mmol) dissout dans 1 ml de CH2CI2 anhydre a été ajouté à - 78 °C. Le mélange réactionnel obtenu a été agité à - 30 °C pendant 1,5 heure et laissé réchauffer à température ambiante pendant 2 heures. Après une CLHP de contrôle (système A), le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu huileux obtenu a été purifié par CLHP semi-préparative (système B). Les fractions contenant le produit (temps de rétantion TR 48-50 min) ont été partiellement évaporées puis lyophilisée pour donner le dioxétane 1 sous forme d'une poudre blanche (environ 1 mg, rendement 5 %). CLHP (système C) TR 23,8 min. UV (enregistré pendant l'analyse CLHP) Xm8x 235 et 281 nm. MS (ESI, mode positif m/z 650.0 (M+Na)+ (poids moléculaire calculé : 627,74 pour C37H41NO8).

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé de formule générale (I) :
S-B-A dans laquelle - S représente une structure labile activable par une entité chimique ou biologique,
B est un bras réactif, dont la structure chimique est telle que l'activation de la structure labile S induit son réarrangement intramoléculaire sous une forme propice à la libération d'une molécule A", - A est un chromophore de formule générale (lia) :
0-0
R R2
0 — X-Ar R3
dans laquelle - 0 symbolise la liaison covalente avec B, a) R1, R2 et R3, représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un radical hydroxyle, un radical amino, un radical thio, un atome d'halogène, une chaîne hydrocarbonée en C1-C20, notamment en C2-C12, et en particulier en C3-C6 choisie parmi un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical hétéroalkyle, un radical cycloalkyle, un radical hétérocycloalkyle, un radical éther, un radical alcènyle, un radical alcynyle, un radical alkylamino, un radical dialkylamino, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-silyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-siloxy, un radical alkylthio, un radical halogénoalkyle, un cycle aromatique en C6-C30, notamment en C6-C10, choisi parmi un radical aryle, un radical hétéroaryle, un radical aralkyle, le cas échéant substitué, b) R2 et R3 peuvent figurer ensemble pour un motif oxo, c) R1 et R2 peuvent être liés de manière à former un cycle en C4-C8 condensé avec le cycle dioxétane, le cas échéant interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et pouvant être substitué par un ou plusieurs radicaux tels que définis précédemment en a) pour R1, R2 et R3, d) R2 et R3 ou R1 et Ar peuvent être liés de manière à former un cycle spiro en C4-C20, notamment en C6-C10, avec le carbone de l'entité dioxétane qui les portent, ce cycle pouvant être monocyclique ou polycyclique, saturé ou insaturé, aromatique, condensé ou non, et le cas échéant incorporer un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S et être éventuellement substitué par un ou plusieurs substituants tels que définis précédemment en a) pour R1, R2 et R3,
Ar représente un radical arylène en C6-C30, notamment en C6-C10, et étant optionnellement substitué par un ou plusieurs substituants notamment choisis parmi un radical hydroxyle, un atome d'halogène, un motif oxo, un radical amino, un radical alkylamino, un radical dialkylamino, un radical thio, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkylsilyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkylsiloxy, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical alkylthio, un radical carboxy, un radical formyle, un radical alkylester, un radical alkylcétone, un radical halogénoalkyle, un radical aryle, un radical arylester, un radical arylcétone, un radical arylamino, un radical diarylamino, et - X représente O, NH ou S, et leurs dérivés.
2. Composé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que R1 est un radical fluorescent.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel B est représenté par un radical alkyle en C1-C8, notamment en C2-C6, et en particulier en C3-C4, éventuellement interrompu par un radical arylène en C6-C14, notamment en C6-C10 et/ou par un plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N, et S, et optionnellement substitué par un ou plusieurs substituants choisis parmi un radical hydroxyle, un motif oxo, un radical amino, un atome d'halogène, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical carboxy, un radical alkylamino, un radical dialkylamino, un radical aryle et un radical aryloxy.
4. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel B est représenté par la formule générale (III) :
Figure imgf000038_0001
dans laquelle :
D et 0 symbolisent, respectivement, la liaison covalente avec la structure labile S et le chromophore A, j est un entier allant de 0 à 2, et avantageusement est égal à 1,
R4 est une chaîne hydrocarbonée en C1-C20, notamment C2-C12 et en particulier C3-C6, le cas échéant interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes et/ou motif(s) -CO et/ou -N(alkyle)-, placée en ortho, meta ou para du radical D-(CH2)J-, et notamment choisie parmi les radicaux -(CH2)k-0, -(CH2)k-C(O)-0, -CH2-O-C(O)-N(CH3)- (CH2)2-N(CH3)-C(O)-0, avec k étant égal à 1 ou 2, et avantageusement égal à 1,
R5 et Ré sont, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou une chaîne hydrocarbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée en C1-C20, notamment C2-C12 et en particulier C3-C6 choisie parmi un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical alkyl- ou dialkyl-amino, un radical alkylthio, ou un cycle aromatique en C6-C30, notamment C6-C10 choisi parmi un radical aryle, un radical aryloxy, un radical arylamino et un radical arylthio.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel Ar représente un radical arylène de formule générale (IVa) :
Figure imgf000038_0002
dans laquelle : Δ symbolise le lien covalent avec X et * symbolise le lien covalent avec le cycle dioxétane,
R10 représente un atome d'hydrogène, un radical électroactif, ou un radical fluorescent, et R11 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou figure un radical aryle en C6-
C10, condensé avec le radical phénylène.
6. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel R1 est un radical alkyle ou alkoxy en C1-C6, linéaire, ramifié ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant éventuellement un plusieurs atomes choisis parmi O, N et S, et optionnellement substitué.
7. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel lorsque R1 et/ou R10 sont un radical fluorescent, ils sont choisis parmi le phényle et ses dérivés, le naphtalène et ses dérivés, l'anthracène et ses dérivés, le pyrène et ses dérivés, le biphényle et ses dérivés, l'acridine et ses dérivés, la coumarine et ses dérivés, le xanthène et ses dérivés, la phtalocyanine et ses dérivés, le stilbène et ses dérivés, le furane et ses dérivés, l'oxazole et ses dérivés, l'oxadiazole et ses dérivés, le nitrobenzoxadiazole et ses dérivés, le benzothiazole et ses dérivés, la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, le BODIPY et ses dérivés, l'éosine et ses dérivés, l'érythrosine et ses dérivés, la résorufine et ses dérivés, la quinoléine et ses dérivés, le carbazole et ses dérivés, les cyanines fluorescentes et dérivés, la carbocyanine et ses dérivés, les sels de pyridinium et dérivés, un complexe fluorescent de lanthanides et ses dérivés, les protéines fluorescentes et les quantum dots.
8. Composé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 dans lequel R4 est représenté par le radical -(CH2)Ic-O positionné en ortho avec le radical D-(CH2)J-, et j=k=l et R5=R6= -O-CH3.
9. Composé selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 dans lequel R10 est un radical électroactif choisi parmi un atome d'halogène, un radical cyano, un radical nitro, un radical amide mono ou disubstitué, un radical alkyle, un radical alkoxy, un radical trialkylammonium, un radical alkylamido, un radical alkylcarbamoyle, un radical ester, un radical alkylsulfonamido, un radical triflurorométhyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-silyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-siloxy, un radical alkylamidosulfonyle, un radical alkylsulfonyle, un radical un alkylthioether, un radical halogénoalkyle, un radical en C6-C10 choisi parmi un radical aryloxy, un radical arylamido, un radical arylcarbamoyle, un radical arylsulfonamido, un radical aryle, un radical hétéroaryle, un radical triaryl ou alkylarylsilyle, un radical triarylsiloxy, un radical arylamidosulfonyle, un radical arylsulfonyle et un radical arylthioether.
10. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel X représente O.
11. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il répond à la formule générale (Va) :
Figure imgf000040_0001
dans laquelle :
S, X, Ar, R1, R2, R3, R5, et R6 sont tels que définis selon l'une quelconque des revendications précédentes.
12. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes de formule générale (Vb) :
Figure imgf000040_0002
dans laquelle S, R1, R2, R3, R5, R6, Rio et Rn sont tels que définis selon l'une quelconque des revendications précédentes.
13. Composé selon la revendication précédente dans lequel Ri0 = Rn = H, R1 = R5= R6 = -OCH3, et R2 et R3 sont liés pour former un radical adamantyle en spiro avec le carbone du cycle dioxétane qui les portent, le cas échéant substitué.
14. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lorsque S est une structure activable par une entité biologique, S est de formule générale (VI) :
P-L-D dans laquelle :
D symbolise le lien covalent avec B, P figure un substrat reconnaissable par ladite entité,
L représente un oxygène, un soufre, un azote, un carbonyle ou une fonction -CO-Q-, avec Q étant O, S ou NH.
15. Composé selon la revendication précédente dans lequel S représente une structure labile par action d'une enzyme.
16. Composé selon la revendication précédente dans lequel lorsque S représente une structure labile par action d'une protéase, L représente -CO-Q, avec Q étant NH, et P représente un substrat reconnu par ladite protéase.
17. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dérivé de formule générale (VII) :
D-S-B-A dans laquelle
- D figure une structure de ciblage, et - S, B et A sont tels que définis dans les revendications précédentes.
18. Composé selon la revendication précédente dans laquelle, la structure D de ciblage peut être choisi parmi une lectine, un anticorps ou un fragment de celui-ci ; un ligand d'un récepteur cellulaire ; un ligand susceptible d'interagir avec un lipide ou phospholipide membranaire ; un ligand susceptible d'interagir un sucre présent à la surface des cellules.
19. Composition pharmaceutique comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
20. Utilisation à des fins de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique d'au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 dans lequel S figure une structure labile activable par ledit phénomène.
21. Procédé de détection et/ou de quantification d'une entité biologique comprenant au moins les étapes de : mise en contact d'au moins une quantité efficace d'au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 dans lequel S figure une structure labile activable par ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier avec un milieu présumé comprendre ladite entité, et mesure du signal luminescent généré.
22. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ledit composé est tel que défini en revendications 11 à 18.
23. Procédé selon la revendication 21 ou 22 réalisée in vitro comprenant l'étape d'ajouter un amplificateur de lumière choisi parmi la fluorescéine, l'albumine bovine, l'albumine humaine, des sels de polymère d'onium quaternaires tels que le chlorure de polyvinylbenzyltriméthylammonium (TMQ), le chlorure de polyvinylbenzyltributylammonium (TBQ), le chlorure de polyvinylbenzyldiméthylammonium (BDMQ), le chlorure de polyvinylbenzyltributylphosphonium, le chlorure de polyvinylbenzyltributylsulfonium, le chlorure de poly(benzyldiméthylvinylbenzyl)ammonium, un sel de sodium de la fluorescéine, poly(benzyltributyl)ammonium et le sel de sodium de fluorescéine.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 dans lequel ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier est une enzyme et en ce que S du composé de formule générale (I) figure un substrat activable par ladite enzyme.
25. Kit pour la détection et/ou la quantification par détection d'une entité biologique comprenant au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 dans lequel S figure une structure labile activable par ladite entité biologique à détecter et/ou quantifier.
26. Utilisation d'un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vivo.
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