WO2006128877A1 - Verfahren zur verringerung der verdunstungsgeschwindigkeit von flüssigkeiten - Google Patents

Verfahren zur verringerung der verdunstungsgeschwindigkeit von flüssigkeiten Download PDF

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WO2006128877A1
WO2006128877A1 PCT/EP2006/062735 EP2006062735W WO2006128877A1 WO 2006128877 A1 WO2006128877 A1 WO 2006128877A1 EP 2006062735 W EP2006062735 W EP 2006062735W WO 2006128877 A1 WO2006128877 A1 WO 2006128877A1
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liquid
hydrophobin
barrier
water
hydrophobins
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PCT/EP2006/062735
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Thorsten Montag
Ulrich Karl
Ulf Baus
Claus Bollschweiler
Thomas Subkowski
Hans-Georg Lemaire
Marvin Karos
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Basf Aktiengesellschaft
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/68—Treatment of water, waste water, or sewage by addition of specified substances, e.g. trace elements, for ameliorating potable water
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/16—Preventing evaporation or oxidation of non-metallic liquids by applying a floating layer, e.g. of microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B65—CONVEYING; PACKING; STORING; HANDLING THIN OR FILAMENTARY MATERIAL
    • B65D—CONTAINERS FOR STORAGE OR TRANSPORT OF ARTICLES OR MATERIALS, e.g. BAGS, BARRELS, BOTTLES, BOXES, CANS, CARTONS, CRATES, DRUMS, JARS, TANKS, HOPPERS, FORWARDING CONTAINERS; ACCESSORIES, CLOSURES, OR FITTINGS THEREFOR; PACKAGING ELEMENTS; PACKAGES
    • B65D90/00—Component parts, details or accessories for large containers
    • B65D90/22—Safety features
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2103/00—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated
    • C02F2103/02—Non-contaminated water, e.g. for industrial water supply
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W90/00—Enabling technologies or technologies with a potential or indirect contribution to greenhouse gas [GHG] emissions mitigation
    • Y02W90/10—Bio-packaging, e.g. packing containers made from renewable resources or bio-plastics

Definitions

  • the invention relates to a method for reducing the evaporation rate of liquids in which at least one hydrophobin is used as auxiliary.
  • Industrial water is required for certain mining techniques, for example in the diamond, gold or silver mining in large quantities, in particular for processing and separation of recyclables from overburden.
  • Such mining areas are often in hot, arid or semi-arid areas where water is scarce and often has to be transported to the mining areas with great effort.
  • Industrial water is therefore usually used multiple times and stored between individual applications. As a rule, storage takes place in open liquid reservoirs such as reservoirs or the like.
  • Hydrophobins are small proteins of about 100 to 150 amino acids, which are characteristic of filamentous fungi, for example Schizophyllum commune.
  • Hydrophobins have a marked affinity for interfaces and are therefore suitable for coating surfaces.
  • Teflon can be coated by means of hydrophobins to obtain a hydrophilic surface.
  • Hydrophobins can be isolated from natural sources.
  • Our earlier application DE 102005007480.4 discloses a production process for hydrophobins.
  • WO 96/41882 proposes the use of hydrophobins as emulsifiers, thickeners, surface-active substances, for hydrophilicizing hydrophobic surfaces, for improving the water resistance of hydrophilic substrates, for producing oil-in-water emulsions or for water-in-oil emulsions.
  • pharmaceutical applications such as the production of ointments or creams as well cosmetic applications such as skin protection or the production of hair shampoos or hair rinses.
  • EP 1 252 516 discloses the coating of windows, contact lenses, biosensors, medical devices, containers for carrying out experiments or for storage, hull fumes, solid particles or frame or body of passenger cars with a solution containing hydrophobins at a temperature of 30 to 80 0 C. ,
  • WO 03/53383 discloses the use of hydrophobin for treating keratin materials in cosmetic applications.
  • WO 03/10331 discloses a hydrophobin-coated sensor, for example a measuring electrode, to which non-covalently further substances, e.g. electroactive substances, antibodies or enzymes are bound.
  • the object of the invention was to provide an improved method for reducing the evaporation rate of liquids, in particular liquids in open liquid reservoirs.
  • a method for reducing the evaporation rate of liquids (F) has been found by covering the surface of the liquid (F) with a barrier liquid (S) which is immiscible with the latter and which has a higher boiling point and a lower density than the liquid. wherein the liquid (F) and / or the barrier liquid (S) is added as auxiliary at least one hydrophobin.
  • the liquid (F) is water. It is preferably a liquid in an open liquid reservoir.
  • liquid reservoirs which have at least one liquid (F) and a barrier liquid (S) which has a higher boiling point and a lower density than the liquid (F) and is immiscible with the surface Cover liquid (F) covered, wherein the liquid reservoir further comprises at least one hydrophobin.
  • the use of hydrophobins has been found as a fluid barrier agent adjunct. Surprisingly, it has been found that the evaporation rate of the liquid (F) can be drastically reduced by the use of hydrophobins. In a typical embodiment of the invention, more than 60% of the original liquid was evaporated in an open liquid reservoir without the use of hydrophobins after 20 days. When using hydrophobins as additive vaporized in the same time only about 13 wt.% Of the originally existing liquid.
  • the liquid (F) to be protected from evaporation can be any desired aqueous or organic liquid. Of course, it can also be a mixture of different substances. However, it is preferably water, for example drinking water, process water, industrial water or seawater. As a rule, these are effluents or industrial waters that are to be reused from industrial, technical processes.
  • water should not be restricted to chemically pure water, but the water may also contain other components dissolved, dispersed or suspended, for example, the water may be dissolved salts or sludges, for example from Abraum or components of overburden or else containing water-miscible organic solvents.
  • the liquid can be arranged arbitrarily.
  • it may be water in seas or lakes or liquids filled in any devices.
  • the liquid is in an open liquid reservoir.
  • open liquid reservoir in the sense of this invention means a liquid reservoir which is not completely sealed off from the environment, but is still in contact with the environment, so that the liquid can in principle evaporate and get into the environment
  • it may be a tank that has an unclosed orifice, but it is usually a reservoir that does not cover the entire surface of the fluid, either natural or artificially created fluid reservoirs
  • Such open liquid reservoirs include storage lakes, reservoirs, cisterns, open storage tanks or so-called lagoons.
  • the surface of the liquid (F) is covered with a barrier liquid (S) immiscible therewith.
  • the barrier liquid may of course also be a mixture of different substances.
  • the term "immiscible" means that no significant quantities of the barrier liquid should dissolve in the liquid, and of course does not exclude traces or insignificant amounts could be solved.
  • the barrier liquid naturally has a lower density than the liquid whose evaporation is to be delayed.
  • the barrier liquid also has a higher boiling point or boiling range, as the liquid whose evaporation is to be delayed.
  • nonpolar or substantially nonpolar liquids have proven to be a barrier liquid.
  • examples include in particular hydrocarbons or mixtures of hydrocarbons.
  • the boiling point of hydrocarbons used is chosen by the person skilled in the art. Proven a boiling point of at least 150 0 C. In the case of mixtures having this figure refers to the UN teralia the boiling range, where possible contaminants are not considered with volatile compounds.
  • Such mixtures include high boiling paraffinic, naphthenic and aromatic mineral oils.
  • mineral oils are obtained by vacuum distillation from petroleum. Preference is given to high-boiling, essentially paraffinic and / or naphthenic mineral oils.
  • Such mineral oils are also referred to as white oils, with the person skilled in the art distinguishing between technical white oils which may still have a low aromatics content and medicinal white oils which are substantially free of aromatics.
  • Other examples include petroleum benzine or diesel oil.
  • oils examples include soybean oil, wood oil, tall oil, safflower oil, ricineal oil, rapeseed oil or linseed oil.
  • derivatives of such oils can also be used. Examples include esters such as rapeseed oil methyl ester or tall oil fatty acid esters.
  • the liquid surface is covered with the barrier liquid (S).
  • the quantity of barrier liquid is dimensioned by a person skilled in the art in such a way that, on the one hand, complete coverage of the liquid surface is ensured, but on the other hand an excessive amount of barrier liquid is avoided.
  • the thickness of the barrier layer should not be more than 2 mm, preferably not more than 1 mm, without higher thicknesses in principle being excluded therefrom.
  • layer thicknesses of from 0.1 to 1 mm, preferably from 0.2 to 0.9 mm and particularly preferably from 0.3 to 0.8 mm have proven useful.
  • at least one hydrophobin is added as auxiliary to the liquid (F) and / or the barrier layer. Of course, mixtures of different hydrophobins can be used.
  • hydrophobins in the context of this invention is intended below to mean proteins of the general structural formula (I)
  • X is selected for each of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, GIy) can stand.
  • X may be the same or different.
  • the indices standing at X each represent the number of amino acids
  • C stands for cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, wherein at least four of the amino acids C are cysteine
  • the indices n and m are independently natural Numbers from 0 to 500, preferably from 15 to 300.
  • the polypetides according to formula (I) are further characterized by the property that at room temperature, after coating a glass surface, they increase the contact angle of a water droplet by at least 20 °, preferably at least 25 ° and particularly preferably 30 °, respectively Contact angle of an equal drop of water with the uncoated glass surface.
  • the amino acids designated C 1 to C 8 are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least 5, more preferably at least 6 and in particular at least 7, of the positions C 1 to C 8 should consist of cysteines. Cysteines can either be reduced in the proteins used according to the invention or form disulfide bridges with one another. Particularly preferred is the intramolecular formation of CC bridges, in particular those with at least one, preferably 2, more preferably 3 and most preferably 4 intramolecular disulfide bridges. In the exchange of cysteines described above by amino acids of similar space filling, it is advantageous to exchange in pairs those C positions which are capable of forming intramolecular disulfide bridges with one another.
  • cysteines, serines, alanines, glycines, methionines or threonines are also used in the positions indicated by X, the numbering of the individual C-positions in the general formulas may change accordingly. Preference is given to hydrophobins of the general formula (II)
  • X, C and the indices standing at X and C are as defined above, however, the indices n and m are numbers from 0 to 300, and the proteins are further characterized by the above-mentioned contact angle change.
  • X, C and the indices standing at X and C have the above meaning
  • the indices n and m are numbers from 0 to 200
  • the proteins continue to be distinguished by the above-mentioned contact angle change, and further at least 6 of amino acids C is cysteine. Most preferably, all amino acids C are cysteine.
  • radicals X n and X m may be peptide sequences that are naturally linked to a hydrophobin. However, one or both residues may also be peptide sequences that are not naturally linked to a hydrophobin. Including such radicals X N and / or X are m to understand, in which a naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence is extended tidsequenz by a non-naturally occurring in a hydrophobin.
  • X n and / or X m are naturally non-hydrophobin-linked peptide sequences, such sequences are generally at least 20, preferably at least 35, more preferably at least 50, and most preferably at least 100 amino acids in length.
  • Such a residue, which is not naturally linked to a hydrophobin will also be referred to below as a fusion partner.
  • the proteins can consist of at least one hydrophobin part and one fusion partner, which do not occur together in nature in this form.
  • the fusion partner can be selected from a variety of proteins. It is also possible to link a plurality of fusion partners with a hydrophobin part, for example at the amino terminus (X n ) and at the carboxy terminus (X m ) of the hydrophobin part. However, it is also possible, for example, to link two fusion partner parts with a position (X n or X m ) of the protein according to the invention. Particularly suitable fusion partner parts are proteins which occur naturally in microorganisms, in particular in E. coli or Bacillus subtilis. Examples of such fusion partner parts are the sequences yaad (SEQ ID NO: 15 and 16), ya ae (SEQ ID NO: 17 and 18), and thioredoxin.
  • fragments or derivatives of said sequences which comprise only a part, preferably 70 to 99%, particularly preferably 80 to 98% of said sequences, or in which individual amino acids or nucleotides are changed with respect to said sequence, wherein the percentages in each case refers to the number of amino acids.
  • the fusion hydrophobin in addition to the fusion partner, also has a so-called affinity domain (affinity tag / affinity tail) as a group X n or X m .
  • affinity domains include (His) k, (Arg) k, (Asp) k,
  • (Phe) k or (Cys) k groups where k is generally a natural number from 1 to 10. It may preferably be a (His) k group, where k is 4 to 6.
  • proteins used according to the invention may also be modified in their polypeptide sequence, for example by glycosylation, acetylation or else by chemical crosslinking, for example with glutaraldehyde.
  • One property of the proteins used in the invention is the change in surface properties when the surfaces are coated with the proteins.
  • the change in the surface properties can be determined experimentally by measuring the contact angle of a water drop before and after the coating of the surface with the protein and determining the difference between the two measurements.
  • contact angle measurements is known in principle to the person skilled in the art.
  • the measurements refer to room temperature and water drops of 5 tf I.
  • the exact experimental conditions for an exemplary method for measuring the contact angle are shown in the experimental part.
  • the proteins used according to the invention have the property of increasing the contact angle by at least 20 °, preferably at least 25 °, particularly preferably at least 30 °, in each case compared with the contact angle of a water droplet of the same size with the uncoated glass surface.
  • the assembled membranes of class I hydrophobins are highly insoluble (even against 1% Na dodecyl sulfate (SDS) at elevated temperature) and can only be dissociated by concentrated trifluoroacetic acid (TFA) or formic acid.
  • the assembled forms of class II hydrophobins are less stable. They can already be redissolved by 60% ethanol or 1% SDS (at room temperature).
  • a comparison of the amino acid sequences shows that the length of the region between cysteine C 3 and C 4 in class II hydrophobins is significantly shorter than in class I hydrophobins.
  • Class II hydrophobins also have more charged amino acids than class I.
  • hydrophobins for carrying out the present invention are the hydrophobins of the type dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basF, basf2, which are structurally characterized in the sequence listing below. It may also be just parts or derivatives thereof. Also, several hydrophobin moieties, preferably 2 or 3, of the same or different structure can be linked together and linked to a corresponding suitable polypeptide sequence that is not naturally linked to a hydrophobin.
  • fusion proteins yaad-XadewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basfl-he (SEQ ID NO: 24 ) with the polypeptide sequences given in parentheses and the nucleic acid sequences coding therefor, in particular the sequences according to SEQ ID NO: 19, 21, 23.
  • proteins which, starting from the sequences shown in SEQ ID NO. 20, 22 or 24 represented by exchange, insertion or deletion of at least one, up to 10, preferably 5, particularly preferably 5% of all
  • Amino acids give, and still possess the biological property of the starting proteins to at least 50%, are particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is hereby understood as the change in the contact angle already described by at least 20 °.
  • Particularly suitable for carrying out the invention derivatives are from yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO : 24) residues derived by truncation of the yaad fusion partner.
  • yaad fusion partner SEQ ID NO: 16
  • a shortened yaad residue can be used.
  • the truncated residue should comprise at least 20, preferably at least 35, amino acids.
  • can a truncated radical having 20 to 293, preferably 25 to 250, more preferably 35 to 150 and for example 35 to 100 amino acids are used.
  • the proteins used according to the invention can be prepared chemically by known methods of peptide synthesis, for example by solid-phase synthesis according to Merri- field.
  • Naturally occurring hydrophobins can be isolated from natural sources by suitable methods. As an example, let Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) or WO 96/41882.
  • fusion proteins can preferably be carried out by genetic engineering methods in which a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular DNA sequence, are combined in such a way that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular DNA sequence are combined in such a way that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence.
  • Suitable host organisms (production organisms) for said production process may be prokaryotes (including archaea) or eukaryotes, especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (or related cells), and the like.
  • prokaryotes including archaea
  • eukaryotes especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium,
  • the invention furthermore relates to the use of expression constructs containing, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide used according to the invention, as well as vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • constructs employed include a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream, and optionally other common regulatory elements, each operably linked to the coding sequence.
  • Operaational linkage is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • operably linked sequences are targeting sequences as well as enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are for. In Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the abovementioned "enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence, and additional advantageous sequences may also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences additional regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids may be contained in one or more copies in the construct.
  • the construct may also contain further markers, such as antibiotic resistances or genes that complement xanthropy, optionally for selection on the construct.
  • Advantageous regulatory sequences for the process are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp, tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3 , gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda PR or imlambda P promoter, which find utility in gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are contained, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • the nucleic acid construct is advantageously inserted into a host organism for expression in a vector, such as a plasmid or a phage, which allows optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • all other vectors known to the person skilled in the art ie, z.
  • viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, Transposons.lS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA, as well as the Agrobacterium system to understand.
  • These vectors can be autonomously replicated in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention.
  • Suitable plasmids are described, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-III "3-B1, tgt11 or pBdCI, in Streptomycespl J101, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 or pBD214, in Corynebacterium for pSA77 or pAJ667, in fungi pALS1, pIL12 or pBB116, in yeasts 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 or pEMBLYe23 or in plants pLGV23, pGHIac +, p
  • nucleic acid construct for expression of the further genes contained additionally 3'- and / or 5'-terminal regulatory sequences to increase the expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • genes and protein expression are intended to allow the targeted expression of genes and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors may preferably have a positive effect on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the vector containing the nucleic acid construct or the nucleic acid can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA may consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or the nucleic acid.
  • nucleic acid sequences For optimal expression of heterologous genes in organisms, it is advantageous to modify the nucleic acid sequences according to the specific "codon usage" used in the organism.
  • the "codon usage” can be easily determined by computer evaluations of other known genes of the organism concerned.
  • the production of an expression cassette is carried out by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal. Common recombinant and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, EFFritsch and J.
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is inserted for expression in a suitable host organism, advantageously into a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and may be taken, for example, from "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector and can be used to produce the proteins used in the invention.
  • the recombinant constructs described above are introduced into a suitable host system and expressed.
  • Suitable systems are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Colard Spring Harbor Laboratory, Col. Spring Harbor Laboratory Press, Col. Spring Harbor, NY, 1989.
  • Homologously recombined microorganisms can also be produced.
  • a vector is prepared which contains at least a portion of a gene or a coding sequence to be used according to the invention, wherein optionally at least one amino acid deletion, addition or substitution has been introduced to alter the sequence, e.g. B. functionally disrupted ("knockout" - vector).
  • the introduced sequence can, for. Also be a homologue from a related microorganism or be derived from a mammalian, yeast or insect source.
  • the vector used for homologous recombination may be designed such that the endogenous gene is mutated or otherwise altered upon homologous recombination but still encodes the functional protein (eg, the upstream regulatory region may be altered such that expression the endogenous protein is changed).
  • the modified section of the invented The gene used according to the invention is in the homologous recombination vector.
  • suitable vectors for homologous recombination is e.g. As described in Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid or nucleic acid construct used according to the invention.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • Gram-positive or Gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, more preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium or Rhodococcus are used.
  • Microorganisms are usually in a liquid medium containing a carbon source usually in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese and magnesium salts and optionally vitamins, at temperatures between 0 and 100 0 C, preferably between 10 to 60 0 C attracted under oxygen fumigation.
  • a carbon source usually in the form of sugars
  • a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate
  • trace elements such as iron, manganese and magnesium salts and optionally vitamins
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is, regulated during the cultivation or not.
  • the cultivation can be done batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the enzymes may be isolated from the organisms by the method described
  • Proteins or functional, biologically active fragments thereof used according to the invention can be produced by means of a recombinant process in which a protein-producing microorganism is cultivated, optionally the expression of the proteins is induced and these are isolated from the culture.
  • the proteins can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant microorganism can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 0 C and a pH of 6 to 9. Specifically, suitable culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Colard Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are disrupted and the product is known Protein isolation method recovered from the lysate.
  • the cells can optionally by high-frequency ultrasound, by high pressure, such as. B. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods are digested.
  • Purification of the proteins used according to the invention can be achieved by known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and by other conventional methods, such as ultrafiltration, crystallization Salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Méen, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • vector systems or oligonucleotides for the isolation of the recombinant protein, which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus code for altered proteins or fusion proteins, which serve for example a simpler purification.
  • suitable modifications include so-called "tags" as anchors, such as the modification known as hexa-histidine anchors, or epitopes that can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988 , Antibodies: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor (NY) Press).
  • tags are e.g.
  • HA calmodulin BD
  • GST GST
  • MBD Chitin-BD
  • Steptavidin-BD-Avi-Tag Flag-Tag
  • T7 T7 etc.
  • anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as.
  • a polymer matrix serve, which may be filled for example in a chromatography column, or may be used on a microtiter plate or other carrier.
  • the corresponding purification protocols are available from the commercial affinity tag providers.
  • the proteins prepared as described can be used both directly as fusion proteins and after cleavage and separation of the fusion partner as "pure" hydrophobins.
  • a potential cleavage site (specific recognition site for proteases) in the fusion protein between the hydrophobin part and the fusion partner part.
  • Suitable cleavage sites are, in particular, those peptide sequences which are otherwise found neither in the hydrophobin part nor in the fusion partner part, which can easily be determined with bioinformatic tools. Particularly suitable are, for example, BrCN cleavage on methionine, or protease-mediated cleavage with factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV cleavage (Tobacco etch virus protease).
  • the choice of hydrophobins for carrying out the invention is not limited. The skilled person makes a suitable choice. Fusionproteins such as yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) or yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21) have proven particularly useful.
  • the hydrophobins can advantageously be used to carry out the invention as aqueous formulations.
  • preference may be given to using the aqueous solutions obtained in the synthesis and / or isolation.
  • water-miscible organic solvents can also be added to the aqueous formulations.
  • solvents include water-miscible alcohols, such as, for example, ethanol, propanol or ethylene glycol.
  • hydrophobins can also initially be isolated as a substance, for example by freeze-drying, and used as such or else dissolved in a nonaqueous solvent or corresponding formulations based on nonaqueous solvents.
  • hydrophobin formulations used according to the invention may also comprise further auxiliaries and additives.
  • auxiliaries and additives include surfactants, buffers, solvents, preservatives such as protease inhibitors, stabilizers such as proteins, sugars or sugar derivatives, alcohols or water-soluble polymers.
  • concentration of hydrophobins in the formulation is chosen by the skilled person. Proven concentrations have been from 0.001 ppm to 10%.
  • the hydrophobins can be added to the liquid (F) and / or the barrier layer. This can be done by simply mixing the hydrophobin or preferably a suitable hydrophobin formulation with the liquid and / or the barrier liquid.
  • the addition of hydrophobin can be done before covering the liquid surface with the barrier liquid, or only afterwards.
  • only the surface of the liquid can be treated with the hydrophobin. This can be done, for example, by spraying the surface, in particular a water surface, with a hydrophobin solution before covering it with the barrier liquid. It is also possible to spray a surface already covered with the barrier liquid with a hydrophobin formulation.
  • the hyrophobin is dissolved or suspended in the liquid before the barrier liquid is applied.
  • hydrophobins Even small amounts of hydrophobins are sufficient to effect evaporation delay according to the invention.
  • the amount of hydrophobins is from the Professional determined. Proven amounts of about 1 to 10 g / m 2 surface, preferably 3 to 8 g / m 2 have .
  • the invention is particularly suitable for protecting industrial water from evaporation, for example, water stored in reservoirs or the like for mining applications.
  • hydrophobins can preferably be used in biodegradable systems, for example by using a biologically readily degradable liquid, such as a naturally occurring, vegetable, animal or bacterial oil, as the barrier liquid.
  • a biologically readily degradable liquid such as a naturally occurring, vegetable, animal or bacterial oil
  • examples include rapeseed oil or so-called “bio-diesel”.
  • Part A Preparation and test of the hydrophobins used in the invention
  • Oligonucleotides Hal570 and Hal571 were used to perform a polymerase chain reaction.
  • the PCR fragment obtained contained the coding sequence of the gene yaaD / yaaE from Bacillus subtilis, and at the ends in each case an NcoI or BglII restriction cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonucleases NcoI and BglII.
  • This DNA fragment was used as an insert and cloned into the vector pQE60 from Qiagen, previously linearized with the restriction endonucleases NcoI and BglI.
  • the resulting vectors pQE60YAAD # 2 / pQE60YaaE # 5 can be used to express proteins consisting of, YAAD :: HISe and YAAE :: HIS 6 , respectively.
  • Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
  • Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac
  • Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg
  • Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
  • the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417 Using the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417, a polymerase chain reaction was carried out.
  • the template DNA used was genomic DNA of the mold Aspergillus nidulans.
  • the resulting PCR fragment contained the coding sequence of the hydrophobin gene dewA and an N-terminal factor Xa proteinase cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonuclease BamHI. This DNA fragment was used as an insert and cloned into the vector pQE60YAAD # 2 previously linearized with the restriction endonuclease BgIII.
  • the resulting vector # 508 can be used to express a fusion protein consisting of, YAAD :: Xa :: dewA :: HIS 6 .
  • KaM416 GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • plasmid # 513 The cloning of plasmid # 513 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 434 and KaM 435.
  • KaM434 GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
  • plasmid # 507 The cloning of plasmid # 507 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • Plasmid # 506 The cloning of plasmid # 506 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • Plasmid # 526 was analogous to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM464 and KaM465.
  • the template DNA used was Schyzophyllum commune cDNA (see Appendix).
  • KaM464 CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
  • KaM465 GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
  • 100 g cell pellet (100-500 mg hydrophobin) are made up to 200 ml total volume with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5 and resuspended.
  • the suspension is treated with an Ultraturrax type T25 (Janke and Kunkel, IKA-Labortechnik) for 10 minutes and then incubated for 1 hour at room temperature with 500 units of benzonase (Merck, Darmstadt, Order No. 1.01697.0001) to break down the nucleic acids.
  • filter with a glass cartridge P1.
  • two homogenizer runs are carried out at 1500 bar (Microfluidizer M-110EH, Microfluidics Corp.).
  • the homogenate is centrifuged (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C, 12,000 rpm, 23,000 g), the supernatant placed on ice and the pellet resuspended in 100 ml sodium phosphate buffer, pH 7.5 , Centrifugation and resuspension are repeated 3 times with the sodium phosphate buffer containing 1% SDS at the third repetition. After resuspension, stir for one hour and perform a final centrifugation (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C, 12,000 rpm, 23,000 g).
  • the hydrophobin is contained in the supernatant after the final centrifugation ( Figure 1).
  • the experiments show that the hydrophobin is probably contained in the form of inclusion bodies in the corresponding E. coli cells.
  • 50 ml of the hydrophobin-containing supernatant are applied to a 50 ml nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 column (Amersham) which has been equilibrated with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • the column is washed with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer and the hydrophobin is then eluted with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer containing 200 mM imidazole.
  • the solution is dialyzed against 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • Figure 1 shows the purification of the prepared hydrophobin
  • Lanes 3 - 5 OD 280 maxima of the elution fractions
  • the hydrophobin of Figure 1 has a molecular weight of about 53 kD.
  • the smaller bands partially represent degradation products of hydrophobin.
  • hydrophobin The purified according to Example 8 hydrophobin was used. Concentration of hydrophobin in the solution: 100 ug / ml, the solution further contained 50 mM Na-acetate buffer and 0.1% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Tween ® 20), pH of the solution: 4
  • the samples are air dried and the contact angle (in degrees) of a drop of 5 ⁇ l of water with the coated glass surface determined at room temperature.
  • the contact angle measurement was performed on a device Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). The measurement was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • hydrophobin solution In a beaker with a diameter of 10 cm, 6.56 g of the abovementioned hydrophobin solution were diluted with water to a total of 200 g (hydrophobin concentration 0.2 mg / ml, total amount 40 mg). The surface of the liquid (area: 78.5 cm 2 ) was covered with 3.5 g of diesel oil (density 0.83 g / ml) as a barrier liquid. The water surface was completely covered by this. The thickness of the barrier layer was about 0.54 mm.
  • Table 1 Total amount of liquid in the beaker as a function of the storage time
  • the examples and comparative examples demonstrate that the addition of hydrophobins significantly increases the evaporation-inhibiting effect of the barrier layer.
  • hydrophobin solution In a beaker with a diameter of 10 cm, 6.56 g of the abovementioned hydrophobin solution were diluted with water to a total of 200 g (hydrophobin concentration 0.2 mg / ml, total amount 40 mg). The surface of the liquid (area: 78.5 cm 2 ) was covered with 6.0 g of RME biodiesel as a barrier liquid. The water surface was completely covered by this. The thickness of the barrier layer was about 1, 0 mm.
  • Table 2 Total amount of liquid in the beaker as a function of the storage time
  • hydrophobin solution In a beaker with a diameter of 10 cm, 6.56 g of the abovementioned hydrophobin solution were diluted with water to a total of 200 g (hydrophobin concentration 0.2 mg / ml, total amount 40 mg). The surface of the liquid (area: 78.5 cm 2 ) was covered with 6.0 g rapeseed oil as a barrier liquid. The water surface was completely covered by this. The thickness of the barrier layer was about 1.0 mm.
  • Table 3 Total amount of liquid in the beaker as a function of the storage time

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Abstract

Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten in offenen Flüssigkeitsreservoiren bei dem man als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin verwendet.

Description

Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten bei dem man als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin verwendet.
Industriewasser wird für bestimmte Bergbautechniken, beispielsweise im Diamanten-, Gold- oder Silberbergbau in großen Mengen benötigt, insbesondere zur Aufarbeitung und Trennung der Wertstoffe vom Abraum. Derartige Bergbaugebiete liegen häufig in heißen, ariden oder semiariden Gebieten, in denen Wasser knapp ist und häufig mit hohem Aufwand in die Bergbaugebiete transportiert werden muss. Industriewasser wird daher in der Regel mehrfach verwendet und zwischen einzelnen Anwendungen zwischengelagert. In der Regel erfolgt die Lagerung in offenen Flüssigkeitsreservoiren wie beispielsweise Speicherseen oder Ähnlichem.
Um die Verluste an Wasser durch Verdunstung zu verringern, ist es bekannt, auf die Wasseroberfläche Sperrschichten aus hochsiedenden Kohlenwasserstoffen, beispielsweise Dieselöl, aufzubringen, welche die Verdunstung von Wasser verringern soll. Diese Sperrschicht ist aber häufig nicht flächendeckend und homogen. Häufig bilden sich „Fettaugen" anstelle einer homogenen Schicht. Die Flüssigkeitsverluste durch Verdampfen sind daher trotz der Sperrschicht hoch.
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteris- tisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind.
Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.
Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Unsere ältere Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart ein Herstellverfahren für Hydrophobine.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene An- Wendungen vorgeschlagen worden.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-in- Wasser-Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen.
EP 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiffrümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 800C.
WO 03/53383 offenbart die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Keratin- Materialien in kosmetischen Anwendungen.
WO 03/10331 offenbart einen mit Hydrophobin beschichteten Sensor, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Sub- stanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.
Die Verwendung von Hydrophobinen zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten in offenen Flüssigkeitsreservoiren ist bislang noch nicht offenbart worden.
Aufgabe der Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten, insbesondere Flüssigkeiten in offenen Flüssigkeitsreservoiren bereitzustellen.
Dementsprechend wurde ein Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten (F) gefunden, bei dem man die Oberfläche der Flüssigkeit (F) mit einer mit dieser nicht mischbaren Sperrflüssigkeit (S) bedeckt, welche einen höheren Siedepunkt sowie eine geringere Dichte aufweist als die Flüssigkeit, wobei man der Flüssigkeit (F) und/oder der Sperrflüssigkeit (S) als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin zusetzt. Bevorzugt handelt sich bei der Flüssigkeit (F) um Wasser. Bevorzugt handelt es sich um eine Flüssigkeit in einem offenen Flüssigkeitsreservoir.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wurden offene Flüssigkeitsreservoire gefunden, welche mindestens eine Flüssigkeit (F) sowie eine Sperrflüssigkeit (S), welche einen höheren Siedepunkt sowie eine geringere Dichte aufweist als die Flüssigkeit (F), mit dieser nicht mischbar ist und die Oberfläche der Flüssigkeit (F) bedeckt umfassen, wobei das Flüssigkeitsreservoir weiterhin mindestens ein Hydrophobin umfasst.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wurde die Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel für Flüssigkeitssperrschichten gefunden. Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich die Verdunstungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit (F) durch die Verwendung von Hydrophobinen drastisch vermindern lässt. In einem typischen Ausführungsbeispiel der Erfindung waren in einem offenen Flüssigkeitsreservoir ohne die Verwendung von Hydrophobinen nach 20 Tagen mehr als 60 % der ursprünglich vorhandenen Flüssigkeit verdampft. Bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz verdampften in der gleichen Zeit nur etwa 13 Gew. % der ursprünglich vorhandenen Flüssigkeit.
Zu der Erfindung ist im Einzelnen das Folgende auszuführen:
Bei der Flüssigkeit (F), die vor Verdunstung geschützt werden soll, kann es sich prinzipiell um beliebige wässrige oder organische Flüssigkeiten handeln. Selbstverständlich kann es sich auch um ein Gemisch verschiedener Stoffe handeln. Bevorzugt handelt es sich aber um Wasser, beispielsweise um Trinkwasser, Brauchwasser, Industriewas- ser oder Seewasser. In der Regel handelt es sich um Abwässer oder wieder zu verwendende Brauchwässer aus industriellen, technischen Prozessen. Der Begriff „Wasser" soll nicht auf chemisch reines Wasser beschränkt sein, sondern das Wasser kann auch noch weitere Bestandteile gelöst, dispergiert oder aufgeschlämmt enthalten. Beispielweise kann das Wasser gelöste Salze oder Schlämme, beispielsweise aus Ab- räum oder Komponenten von Abraum oder aber auch mit Wasser mischbare, organische Lösemittel enthalten.
Die Flüssigkeit kann hierbei beliebig angeordnet sein. Beispielsweise kann es sich um Wasser in Meeren oder Seen handeln oder auch in beliebigen Vorrichtungen abgefüllte Flüssigkeiten. Bevorzugt befindet sich die Flüssigkeit in einem offenen Flüssigkeitsreservoir.
Der Begriff „offenes Flüssigkeitsreservoir" in Sinne dieser Erfindung bedeutet ein Flüssigkeitsreservoir, welches nicht vollständig von der Umgebung abgeschlossen ist, son- dem noch im Kontakt mit der Umgebung steht, so dass die Flüssigkeit prinzipiell verdampfen und in Umgebung gelangen kann. Es kann sich hierbei beispielsweise um einen Tank handeln, der eine nicht verschlossene Öffnung aufweist. In der Regel handelt es sich aber um ein Reservoir, bei dem die gesamte Oberfläche der Flüssigkeit nicht bedeckt ist. Es kann sich um natürliche oder um künstlich angelegte Flüssigkeits- reservoire handeln. Beispiele derartiger offener Flüssigkeitsreservoire umfassen Speicherseen, Talsperren, Zisternen, offene Lagerbehälter oder sogenannte Lagunen.
Erfindungsgemäß wird die Oberfläche der Flüssigkeit (F) mit einer mit dieser nicht mischbaren Sperrflüssigkeit (S) bedeckt. Bei der Sperrflüssigkeit kann es sich selbst- verständlich auch um ein Gemisch verschiedener Stoffe handeln. Der Begriff „nicht mischbar" bedeutet, dass sich keine wesentlichen Mengen der Sperrflüssigkeit in der Flüssigkeit lösen sollen. Es schließt selbstverständlich nicht aus, dass Spuren oder unwesentliche Mengen gelöst werden könnten. Die Sperrflüssigkeit weist naturgemäß eine geringere Dichte auf, als die Flüssigkeit, deren Verdunstung verzögert werden soll. Die Sperrflüssigkeit weist weiterhin einen höheren Siedepunkt bzw. Siedebereich auf, als die Flüssigkeit, deren Verdunstung verzögert werden soll.
Der Fachmann trifft unter den prinzipiell möglichen Sperrflüssigkeiten (S) eine geeignete Auswahl.
Für den bevorzugten Fall, dass es sich bei der Flüssigkeit (F) um Wasser oder ein wässriges Flüssigkeitsgemisch handelt, haben sich unpolare oder im Wesentlichen unpolare Flüssigkeiten als Sperrflüssigkeit bewährt. Beispiele umfassen insbesondere Kohlenwasserstoffe bzw. Gemische von Kohlenwasserstoffen. Der Siedepunkt eingesetzter Kohlenwasserstoffe wird vom Fachmann gewählt. Bewährt hat sich ein Siedepunkt von mindestens 1500C. Bei Mischungen bezieht sich diese Angabe auf die Un- tergrenze des Siedebereiches, wobei mögliche Verunreinigungen mit leichtflüchtigen Verbindungen nicht berücksichtigt werden. Beispielsweise können Kohlenwasserstoffgemische mit einem Siedebereich von 150 bis 2500C, bevorzugt 200 bis 3000C und besonders bevorzugt 220 bis 3500C eingesetzt werden.
Beispiele derartiger Gemische umfassen hochsiedende paraffinische, naphthenische und aromatische Mineralöle. Derartige Mineralöle werden durch Vakuumdestillation aus Erdölen gewonnen. Bevorzugt sind hochsiedende im Wesentlichen paraffinische und/oder naphthenische Mineralöle. Derartige Mineralöle werden auch als Weißöle bezeichnet, wobei der Fachmann zwischen technischen Weißölen, die noch einen ge- ringen Aromatengehalt aufweisen können, sowie medizinischen Weißölen, die im Wesentlichen aromatenfrei sind, unterscheidet. Weitere Beispiele umfassen Petroleumbenzin oder Dieselöl.
Es können aber auch biologisch gut abbaubare, natürliche, insbesondere pflanzliche Öle eingesetzt werden. Beispiele umfassen Sojaöl, Holzöl, Tallöl, Distelöl, Ricinenöl, Rapsöl oder Leinöl. Weiterhin können auch Derivate derartiger Öle eingesetzt werden. Beispiele umfassen Ester wie Rapsölmethylester oder Tallölfettsäureester.
Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Flüssigkeitsoberfläche mit der Sperrflüssigkeit (S) bedeckt. Die Menge der Sperrflüssigkeit wird vom Fach- mann so bemessen, dass einerseits eine möglichst vollständige Bedeckung der Flüssigkeitsoberfläche gewährleistet ist, dass aber andererseits eine zu große Menge an Sperrflüssigkeit vermieden wird. Im Regelfalle sollte die Dicke der Sperrschicht nicht mehr als 2, bevorzugt nicht mehr als 1 mm betragen, ohne dass höhere Dicken damit prinzipiell ausgeschlossen sein sollten. Bewährt haben sich insbesondere Schichtdi- cken von 0,1 bis 1 mm, bevorzugt 0,2 bis 0,9 mm und besonders bevorzugt 0,3 bis 0,8 mm. Erfindungsgemäß wird der Flüssigkeit (F) und/oder der Sperrschicht als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin zugesetzt. Selbstverständlich können auch Gemische aus verschiedenen Hydrophobinen eingesetzt werden.
Unter dem Begriff „Hydrophobine" im Sinne dieser Erfindung sollen im Folgenden Proteine der allgemeinen Strukturformel (I)
Xn-C^Xi-so-C^Xo-s-C^XLioo-Ct-Xi-ioo-CS-Xi-so-Ce-Xo-s-C^Xvso-C^Xm (I)
verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, He Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der Aminosäuren C für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen von 0 bis 500, bevorzugt von 15 bis 300.
Die Polypetide gemäß Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergröße- rung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20° , bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Die mit C1 bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C1 bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäß verwendeten Proteinen entweder reduziert vorliegen oder mit- einander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern. Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C1-X3.25-C2-Xθ-2-C3-X5«rC4-X2-3S-C5-Xa.iβ-Cβ-Xo.2-C7-X3^s-C«J-Xm (II)
zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, jedoch stehen die Indizes n und m für Zahlen von 0 bis 300, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)
Xn-C1-X&.o-C^C3-XiM9-C4-X2^3-C5-X5β-Cβ-C7-Xβ.iβ-Cβ-Xm (III)
eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen von 0 bis 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der Aminosäuren C um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Aminosäuren C um Cystein.
Bei den Resten Xn und Xm kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste Xn und/oder Xmzu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptid- sequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz verlängert ist.
Falls es sich bei Xn und/oder Xm um natürlicherweise nicht mit Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartner bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.
Der Fusionspartner kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xm) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartnerteile mit einer Position (Xn oder Xm) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden. Besonders geeignete Fusionspartnerteile sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartnerteile sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16), ya- ae(SEQ ID NO: 17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, bevorzugt 70 bis 99%, besonders bevorzugt 80 bis 98% der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem Fusionspartner als eine Gruppe Xn oder Xm noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affinity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirkend können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k-, (Arg)k-, (Asp)k-,
(Phe)k- oder (Cys)k-Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht.
Die erfindungsgemäß verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidse- quenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.
Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Proteine ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschich- tung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 tf I. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Proteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Im Hydrophobinteil der bisher bekannten Hydrophobine sind die Positionen der polaren und unpolaren Aminosäuren konserviert, was sich in einem charakteristischen Hydrophobizitätsplot äußert. Unterschiede in den biophysikalischen Eigenschaften und in der Hydrophobizität führten zur Einteilung der bisher bekannten Hydrophobine in zwei Klassen, I und Il (Wessels et al. 1994, Ann. Rev. Phytopathol, 32, 413-437).
Die assemblierten Membranen aus Klasse I Hydrophobinen sind hochgradig unlöslich (selbst gegenüber 1 % Na-Dodecylsulfat (SDS) bei erhöhter Temperatur) und können nur durch konzentrierte Trifluoressigsäure (TFA), bzw. Ameisensäure wieder dissoziiert werden. Im Gegensatz dazu sind die assemblierten Formen von Klasse Il Hydrophobinen weniger stabil. Sie können bereits durch 60%iges Ethanol, bzw. 1 % SDS (bei Raumtemperatur) wieder aufgelöst werden.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, dass die Länge des Bereichs zwischen Cystein C3 und C4 bei Klasse Il Hydrophobinen deutlich kürzer ist, als bei Hydrophobinen der Klasse I. Klasse Il Hydrophobine weisen weiterhin mehr geladene Aminosäuren als Klasse I auf.
Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl , basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobinteile, bevor- zugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.
Erfindungsgemäß besonders geeignet sind weiterhin die Fusionsproteine yaad-Xa- dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl- his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21, 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deleti- on von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller
Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.
Besonders zur Ausführung der Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA- his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Reste. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürtzer yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Proteine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merri- field herstellen.
Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen.
Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist in unserer älteren Anmeldung DE 102005007480.4 offenbart.
Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfah- ren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschliesslich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula poly- morpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung von Expressionskonstrukten, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen, eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer "operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expressi- on der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie En- hancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer'-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.
Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Au- xotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das Verfahren sind beispielsweise in Promoto- ren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, Ipp-, lac-,lpp-lac-,laclq-T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulati- onssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1 ,MFalpha, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.
Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhaft- erweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons.lS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium- System zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,plN-lll"3-B1, tgt11 oder pBdCI, in StreptomycesplJ101 , plJ364,plJ702 oderplJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacteri- um pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'-und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Ge- nexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage"zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln. Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminatoroder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. etal., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. andWiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor inser- tiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen wer- den.
Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Proteine eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co- Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel etal., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäß zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu verändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockout"- Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfin- dungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder euka- ryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden grampositive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacte- riaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomy- ces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.
Die im Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und100 0C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 0C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH-Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch"-weise, "semi-batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kon- tinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.
Erfindungsgemäß verwendete Proteine oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon, können mittels eines rekombinanten Verfahrens hergestellt werden, bei dem man einen Proteine-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Proteine induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Proteine können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermen- tiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB-oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 400C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die erfindunsgemäß verwerdeten Proteine nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French- Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der erfindunsgemäß verwendeten Proteine kann mit bekannten, chromatographischen Verfah- ren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisati- on, Aussalzen, Dialyse und nativerGelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Proteine oder Fusionsproteine kodieren, die beispielsweise einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa- Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. CoId Spring Harbor (N. Y.) Press). Weitere geeignete Tags sind z.B. HA, Calmodulin-BD, GST, MBD; Chitin-BD, Steptavidin-BD-Avi-Tag, Flag-Tag, T7 etc. Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z. B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann. Die entsprechenden Reinigungsprotokolle sind von den kommerziellen Affinitäts-Tag-Anbietern erhältlich.
Die wie beschrieben hergestellten Proteine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.
Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen geeignet, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltlung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacco etch virus Protease). Die Auswahl der Hydrophobine zur Ausführung der Erfindung ist nicht beschränkt. Der Fachmann trifft eine geeignte Auswahl. Besonders bewährt haben sich Fusionsproteine, wie beispielsweise yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) oder yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21).
Die Hydrophobine können zur Ausführung der Erfindung vorteilhaft als wässrige Formulierungen eingesetzt werden. Hierzu können bevorzugt die bei der Synthese und/oder Isolierung erhaltenen wässrigen Lösungen eingesetzt werden. Den wässrigen Formulierungen können aber selbstverständlich auch noch mit Wasser mischbare, organische Lösemittel zugesetzt werden. Beispiele derartiger Lösemittel umfassen mit Wasser mischbaere Alkohole, wie beispielsweise Ethanol, Propanol oder Ethylengly- kol.
Selbstverständlich können die Hydrophobine aber auch zunächst als Substanz isoliert werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen, und als solche oder aber gelöst in einem nichtwässrigen Lösemittel bzw. entsprechende Formulierungen auf Basis nicht- wässriger Lösemittel zum Einsatz kommen.
Erfindungsgemäß verwendete Hydrophobin-Formulierungen können selbstverständlich noch weitere Hilfsstoffe und Additive umfassen. Beispiele umfassen Tenside, Puffer, Lösemittel, Konservierungsmittel wie Proteaseinhibitoren, Stabilisatoren wie beispielsweise Proteine, Zucker oder Zuckerderivate, Alkohole oder wasserlösliche Polymere.
Die Konzentration der Hydrophobine in der Formulierung wird vom Fachmann gewählt. Bewährt haben sich Konzentrationen von 0,001 ppm bis 10 %.
Erfindungsgemäß können die Hydrophobine der Flüssigkeit (F) und/oder der Sperrschicht zugegeben werden. Dies kann durch einfaches Mischen des Hydrophobins oder bevorzugt einer geeigneten Hydrophobin-Formulierung mit der Flüssigkeit und/oder der Sperrflüssigkeit erfolgen. Das Versetzen mit Hydrophobin kann vor dem Bedecken der Flüssigkeitsoberfläche mit der Sperrflüssigkeit erfolgen, oder auch erst danach. Bevorzugt kann auch nur die Oberfläche der Flüssigkeit mit dem Hydrophobin behandelt werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, indem man die Oberflä- che, insbesondere eine Wasseroberfläche, vor dem Bedecken mit der Sperrflüssigkeit mit einer Hydrophobinlösung besprüht. Es kann auch eine bereits mit der Sperrflüssigkeit bedeckte Oberfläche mit einer Hydrophobin-Formulierung besprüht werden. Vorzugsweise wird das Hyrophobin in der Flüssigkeit gelöst oder suspendiert, bevor die Sperrflüssigkeit aufgetragen wird.
Es sind schon geringe Mengen an Hydrophobinen ausreichend, um erfindungsgemäß Verdunstungsverzögerung zu bewirken. Die Menge an Hydrophobinen wird vom Fachmann bestimmt. Bewährt haben sich Mengen von ca. 1 bis 10 g/m2 Oberfläche, bevorzugt 3 bis 8 g/m2.
Die Erfindung eignet sich insbesondere zum Schutz von Industriewasser vor Verduns- tung, beispielsweise in Speicherseen oder dergleichen gespeichertes Wasser für Bergbauanwendungen.
Als natürliche Stoffe können Hydrophobine bevorzugt in biologisch abbaubaren Systemen engesetzt werden, beispielsweise, indem man als Sperrflüssigkeit eine biologisch gut abbaubare Flüssigkeit, wie beispielsweise ein natürlich vorkommendes, pflanzliches, tierisches oder bakterielles Öl einsetzt. Beispiele umfassen Rapsöl oder sogenannten „Bio-Diesel".
Es ist vorgeschlagen worden, zur Verhinderung oder zumindest zur Abschwächung von Hurrikans im Entstehungsgebiet des Hurrikans Öl auf das Wasser zu gießen, um hierdurch die Verdunstung des Wassers zumindest zu verzögern. Auch derartige Ölfilme können erfindungsgemäß mit Hydrophobinen weiter stabilisiert werden, um die Verdunstungsrate zu verringern. Hierzu bietet es sich insbesondere an, biologisch abbaubare Sperrflüssigkeiten zu verwenden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Teil A: Herstellung und Test der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine
Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-HiS6/ yaaE-His6
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine PoIy- merase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so enstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HISe bzw. YAAE::HIS6 verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
Beispiel 2 Klonierung von yaad-Hydrophobin DewA-HiS6
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.
Der so enstandene Vektor #508 kann zur Expressions eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS6 verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von yaad-Hydrophobin RodA-HiSß
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF1-HJS6
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417ICCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Beispiel 5
Klonierung von yaad-Hydrophobin BASF2-HJS6
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierung von yaad-Hydrophobin SC3-HJS6
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7 Fermentation des rekombinanten E. coli Stammes yaad-Hydrophobin DewA-HiS6
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-Hisβ expri- mierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 10Oμg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1 ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.
13.51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur (ODδooπm 1 :10 gegen H2O gemessen) animpfen. Bei einer ODβonm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel 8
Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins
(Reinigung von Hydrophobin-Fusionsproteinen, die ein C-terminales His6-tag besitzen)
100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschliessend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum ZeI- laufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert. Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschliessende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA- Rotor, 250 ml Zentrifugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g). Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im Überstand enthalten (Abbildung 1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E.coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin-enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Ni- ckel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschliessend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
Abbildung 1 zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins:
Spur 1 : Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1:10 Verdünnung)
Spur 2: Durchlauf = Eluat Waschschritt
Spuren 3 - 5: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen
Das Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
Beispiel 9 Charakterisierung des Hydrophobins durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat:
Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):
Es wurde das gemäß Beispiel 8 gereinigte Hydrophobin eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins in der Lösung: 100 μg/ml, die Lösung enthielt weiterhin 50 mM Na-Acetat-Puffer sowie 0,1% Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaureat (Tween® 20), pH-Wert der Lösung: 4
Eintauchen von Glasplättchen fn diese Lösung über Nacht (Temperatur 800C) Danach wird das mit Hydrophobin beschichtete Glasplättchen der Lösung entnommen und in destilliertem Wasser gewachen,
Danach Inkubation 10min / 800C / 1% SDS-Lösung in dest. Wasser Erneutes Waschen in dest. Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontäktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser mit der beschichteten Glasoberfläche bei Raumtemperatur bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäss den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°;
Das mit dem Hydrophobin gemäss Beispiel 8 (yaad-dewA-his6) beschichtete Glasplättchen ergab einen Kontaktwinkel von 75 ± 5°.
Zunahme des Kontaktwinkels: 45°
Teil B:
Verwendung der Hydrophobine zur Reduzierung der Verdunstungsgeschwindigkeit
Verwendete Lösung:
Für die anwendungstechnischen Versuche wurde eine Lösung des gemäß Beispiel 8 hergestellten Fusionsproteines yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) eingesetzt. Konzentration des Hydrophobins in Lösung: 6,1 mg/ml.
Nullversuch: Wasser ohne Sperrflüssigkeit
Durch Verdünnen mit Wasser wurde eine Lösung einer Konzentration von 1 mg/ml Hydrophobin erhalten. 100 g davon wurden in ein Becherglas von 10 cm Durchmesser eingefüllt. Zu Vergleichszwecken wurden 100 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz verwendet. Beide Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert. Es wurde kein signifikanter Unterschied bei der Verdunstung des Wassers bzw. der Hydrophobin-Lösung beobachtet. Bei beiden Proben waren nach 3 Tagen ca. 70 % des Wassers verdunstet.
Beispiel 10:
In einem Becherglas mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 6,56 g der oben erwähnten Hydrophobin-Lösung mit Wasser auf insgesamt 200 g verdünnt (Hydropho- bin-Konzentration 0,2 mg/ml, Gesamtmenge 40 mg). Die Oberfläche der Flüssigkeit (Fläche: 78,5 cm2) wurde mit 3,5 g Dieselöl (Dichte 0,83 g/ml) als Sperrflüssigkeit bedeckt. Die Wasseroberfläche wurde hiervon vollständig bedeckt. Die Dicke der Sperrschicht betrug ca. 0,54 mm.
Vergleichsbeispiel:
Zu Vergleichzwecken wurden 200 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz in der beschriebenen Art und Weise mit der Sperrflüssigkeit überschichtet.
Lagerung der Proben:
Die Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert. Die Gewichtsabnahme wurde über insgesamt 20 Tage jeweils durch Auswiegen bestimmt. Es wurden jeweils zwei Versuche und zwei Vergleichsversuche durchgeführt, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusam- mengefasst.
Figure imgf000023_0001
Tabelle 1 : Gesamte Flüssigkeitsmenge im Becherglas in Abhängigkeit von der Lagerdauer Die Beispiele und Vergleichsbeispiele demonstrieren, dass durch den Zusatz von Hydrophobinen die verdunstungshemmende Wirkung der Sperrschicht signifikant gesteigert wird.
Während ohne den Hydrophobin-Zusatz nach 20 Tagen trotz Sperrschicht mehr als 60 % des Wassers verdampfen, verdampfen bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz in der gleichen Zeit nur etwa 13 Gew. %. Die Qualität der Sperrschicht wird durch den Zusatz von Hydrophobin signifikant verbessert.
Beispiel 11 :
In einem Becherglas mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 6,56 g der oben erwähnten Hydrophobin-Lösung mit Wasser auf insgesamt 200 g verdünnt (Hydropho- bin-Konzentration 0,2 mg/ml, Gesamtmenge 40 mg). Die Oberfläche der Flüssigkeit (Fläche: 78,5 cm2) wurde mit 6,0 g RME-Biodiesel als Sperrflüssigkeit bedeckt. Die Wasseroberfläche wurde hiervon vollständig bedeckt. Die Dicke der Sperrschicht betrug ca. 1 ,0 mm.
Vergleichsbeispiel:
Zu Vergleichzwecken wurden 200 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz in der beschriebenen Art und Weise mit der Sperrflüssigkeit überschichtet.
Lagerung der Proben:
Die Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert. Die Gewichtsabnahme wurde über insgesamt 19 Tage jeweils durch Auswiegen bestimmt. Es wurden jeweils zwei Versuche und zwei Vergleichsversuche durchgeführt, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Figure imgf000025_0001
Tabelle 2: Gesamte Flüssigkeitsmenge im Becherglas in Abhängigkeit von der Lagerdauer
Die Beispiele und Vergleichsbeispiele demonstrieren, dass durch den Zusatz von Hydrophobinen die verdunstungshemmende Wirkung der Sperrschicht signifikant gesteigert wird.
Während ohne den Hydrophobin-Zusatz nach 19 Tagen trotz Sperrschicht mehr als 95 % des Wassers verdampfen, verdampfen bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz in der gleichen Zeit nur etwa 15 Gew. %.
Beispiel 12:
In einem Becherglas mit einem Durchmesser von 10 cm wurden 6,56 g der oben erwähnten Hydrophobin-Lösung mit Wasser auf insgesamt 200 g verdünnt (Hydropho- bin-Konzentration 0,2 mg/ml, Gesamtmenge 40 mg). Die Oberfläche der Flüssigkeit (Fläche: 78,5 cm2) wurde mit 6,0 g Rapsöl als Sperrflüssigkeit bedeckt. Die Wasseroberfläche wurde hiervon vollständig bedeckt. Die Dicke der Sperrschicht betrug ca. 1,0 mm.
Vergleichsbeispiel:
Zu Vergleichzwecken wurden 200 g Wasser ohne Hydrophobin-Zusatz in der beschriebenen Art und Weise mit der Sperrflüssigkeit überschichtet. Lagerung der Proben:
Die Proben wurden bei 22°C und 50 - 60 % relativer Feuchte in einem Klimaschrank gelagert. Die Gewichtsabnahme wurde über insgesamt 19 Tage jeweils durch Auswiegen bestimmt. Es wurden jeweils zwei Versuche und zwei Vergleichsversuche durch- geführt, und die erhaltenen Werte gemittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusam- mengefasst.
Figure imgf000026_0001
Tabelle 3: Gesamte Flüssigkeitsmenge im Becherglas in Abhängigkeit von der Lagerdauer
Die Beispiele und Vergleichsbeispiele demonstrieren, dass durch den Zusatz von Hydrophobinen die verdunstungshemmende Wirkung der Sperrschicht signifikant gesteigert wird.
Während ohne den Hydrophobin-Zusatz nach 19 Tagen trotz Sperrschicht mehr als 90 % des Wassers verdampfen, verdampfen bei Verwendung von Hydrophobinen als Zusatz in der gleichen Zeit nur etwa 35 Gew. %.
Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll
Figure imgf000027_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Verringerung der Verdunstungsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten
(F), bei dem man die Oberfläche der Flüssigkeit mit einer mit dieser nicht mischba- ren Sperrflüssigkeit (S) bedeckt, welche einen höheren Siedepunkt sowie eine geringere Dichte aufweist als die Flüssigkeit (F), dadurch gekennzeichnet, dass man der Flüssigkeit (F) und/oder der Sperrflüssigkeit (S) als Hilfsmittel mindestens ein Hydrophobin zusetzt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Flüssigkeit in einem offenen Flüssigkeitsreservoir befindet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Flüssigkeit (F) um Wasser handelt.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sperrflüssigkeit (S) um ein Kohlenwasserstoffgemisch handelt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sperrflüssigkeit (S) um eine biologisch abbaubare Flüssigkeit handelt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Sperrschicht nicht mehr als 1 mm beträgt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Hydrophobin um ein Fusionsprotein handelt.
8. Offenes Flüssigkeitsreservoir, mindestens umfassend eine Flüssigkeit (F) sowie eine Sperrflüssigkeit (S), welche einen höheren Siedepunkt sowie eine geringere Dichte aufweist als die Flüssigkeit (F), mit dieser nicht mischbar ist und die Oberfläche der Flüssigkeit (F) bedeckt, dadurch gekennzeichnet, dass das Flüssigkeitsreservoir weiterhin mindestens ein Hydrophobin umfasst.
9. Offenes Flüssigkeitsreservoir gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Flüssigkeit (F) um Wasser handelt.
10. Offenes Flüssigkeitsreservoir gemäß Anspruch 8 oder 9 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der der Sperrflüssigkeit (S) um ein Kohlenwasserstoffgemisch handelt.
11. Offenes Flüssigkeitsreservoir gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sperrflüssigkeit (S) um eine biologisch abbaubare Flüssigkeit handelt.
12. Offenes Flüssigkeitsreservoir gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Sperrschicht nicht mehr als 1 mm beträgt.
13. Offenes Flüssigkeitsreservoir gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Hydrophobin um ein Fusionsprotein handelt.
14. Verwendung von Hydrophobinen als Hilfsmittel zum Stabilisieren von Flüssigkeitssperrschichten.
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