WO2006115430A1 - Preparation biologique irilis a base de bacteries du genre bacillus contenant bacillus subtilis et bacillus licheniformis - Google Patents

Preparation biologique irilis a base de bacteries du genre bacillus contenant bacillus subtilis et bacillus licheniformis Download PDF

Info

Publication number
WO2006115430A1
WO2006115430A1 PCT/RU2005/000231 RU2005000231W WO2006115430A1 WO 2006115430 A1 WO2006115430 A1 WO 2006115430A1 RU 2005000231 W RU2005000231 W RU 2005000231W WO 2006115430 A1 WO2006115430 A1 WO 2006115430A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biological product
product according
strains
vkpm
irilis
Prior art date
Application number
PCT/RU2005/000231
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Irina Grigorievna Osipova
Irina Borisovna Sorokulova
Elena Aleksandrovna Vasilieva
Sergei Gennadievich Trofimov
Vera Franzevna Evlashkina
Elena Yurievna Haritonova
Sergei Eduardovich Sarkisov
Natalia Vasilievna Tereshkina
Yurii Igorevich Ostroumov
Aleksandr Nikolaevich Doronin
Marina Aleksandrovna Kulichizkaya
Aleksandr Aleksandrovich Matveev
Original Assignee
Irina Grigorievna Osipova
Irina Borisovna Sorokulova
Elena Aleksandrovna Vasilieva
Sergei Gennadievich Trofimov
Vera Franzevna Evlashkina
Elena Yurievna Haritonova
Sergei Eduardovich Sarkisov
Natalia Vasilievna Tereshkina
Yurii Igorevich Ostroumov
Aleksandr Nikolaevich Doronin
Kulichizkaya Marina Aleksandro
Matveev Aleksandr Aleksandrovi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Irina Grigorievna Osipova, Irina Borisovna Sorokulova, Elena Aleksandrovna Vasilieva, Sergei Gennadievich Trofimov, Vera Franzevna Evlashkina, Elena Yurievna Haritonova, Sergei Eduardovich Sarkisov, Natalia Vasilievna Tereshkina, Yurii Igorevich Ostroumov, Aleksandr Nikolaevich Doronin, Kulichizkaya Marina Aleksandro, Matveev Aleksandr Aleksandrovi filed Critical Irina Grigorievna Osipova
Priority to DE502005010458T priority Critical patent/DE502005010458D1/de
Priority to US11/919,356 priority patent/US8414878B2/en
Priority to EP05749360A priority patent/EP1894995B1/de
Priority to AT05749360T priority patent/ATE486122T1/de
Priority to PCT/RU2005/000231 priority patent/WO2006115430A1/ru
Publication of WO2006115430A1 publication Critical patent/WO2006115430A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis

Definitions

  • the invention relates to biotechnology and relates to the creation of new probiotic preparations based on bacteria of the genus VasShi, which can be used for the prevention and treatment of infectious diseases and dysbiosis of various etiologies of humans, farm animals and poultry.
  • Biological products based on bacteria of the genus Vasily are well known.
  • the composition of biological products - probiotics based on bacteria of the genus Vasillus includes strains with a different spectrum of antibacterial and antimycotic activity.
  • the effectiveness of the drugs is determined by the breadth of the spectrum and the strength of the antibacterial activity of the strains included in the drug.
  • Probiotic bacgisubtil (Mariop Merrell / France /) and its analogue flonivin BS (Galepika / Yugoslavia /) containing the culture of B. cereis strain IP 5832 (collection of the Pasteur Institute ( Paris).
  • the Vietnamese biosubtil preparation is known, which contains the B. sibtilis strain as the active component.
  • the basis of the enterohermine (Sapofi Wipphor, Italy) is the culture of B. cla ssii. Cereobiogen biopreparation (Xipg Lap, China) is also known. whose beginning is w Amm V. series DM-423 (BB Smirnov, CP.
  • Bakisporin for the treatment of a wide range of diseases, containing freeze-dried biomass of strain VasShi sibtilis ZN and a protective medium based on sucrose-gelatin mixture or lactose (Patent RU N ° 2130316, A61K 35/66, publ. 05.20.1999).
  • Bactisporin is not effective against a number of pathogens of acute intestinal infections, for example, caused by bacteria of the genus Pseudomopas spr. , Stertosossus spp., Epterosossus spp.
  • the biopharmaceutical drug “Deprecan-A” containing a recombinant strain of Vasyls sibtis, producing human alpha-2-interferon, a strain of Vaslis sorbidis and excipient.
  • a recombinant strain of Vaslis sibtpis VKPM NsB-7289 can be used as part of the preparation.
  • the drug has antibacterial, antiviral and immunomodulating activity and can be used in the treatment of various diseases of infectious and non-infectious nature (Patent RU N ° 2158134, A61K 35/74, publ. 09/20/2000).
  • the preparation “Deprecan-A” includes a recombinant strain containing a plasmid that determines antibiotic resistance (kanamycin), which does not meet WHO requirements.
  • VKPM NsB-2335 The well-known drug Biosporin for the prevention and treatment of human gastrointestinal diseases containing live cells of strains of Vaslis sibtilis 3 (VKPM NsB-2335) and Vasilis, lidhepiforis 31 (VKPM JNb B-2336) and filler (Patent RU JN ° 1722502, A61K 35/74, publ. 30.03.1992).
  • Biosporin is characterized by high antagonistic activity to a wide range of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms (Sorokulova I, B., 1997).
  • Biosporin The disadvantage of Biosporin is that the strains included in its composition are sensitive to antibiotics, therefore, the drug is not recommended for use in treatment with antibiotics.
  • the closest analogue is a preparation against viral and bacterial infections, containing a mixture of biomass of strains of Vasyls sibtilis VKPM N ° B-7092, Vasillis sibtilis VKPM NsB-7048, Vasillis, lysheptores VKPM MB-7038 in a spore form with a titer of at least 10 xlO , and the stabilizer is starch and sugar .. (Patent RU N ° 2142287, A61K 35/74, publ. 10.12.1999).
  • a disadvantage of the known drug is the use of a recombinant strain containing a plasmid that determines antibiotic resistance.
  • the strain Vasillis sibtilis X-15 is known, which is used for the prevention and treatment of endometritis in cows (Patent RU N ° 2180575, C12N 1/20, publ. 20.03.2002).
  • the disadvantage of the drug based on the strain Bacillus sibtilis X-15 is the limited spectrum of action, since it is active only against a narrow group of microorganisms that cause endometritis in cows. Also known is the probiotic preparation Cybtilis based on a liquid or freeze-dried culture of the strain Bacilli sisBt ⁇ lis BKM Ns B-2250 D.
  • the drug is intended for the prevention and treatment of gastrointestinal diseases of animals, poultry and fish, helps to increase the digestibility of feed, increase productivity and weight gain (Patent RU JCHs 2184774, C12N 1/20, publ. 07/10/2002).
  • Cybtilis is a limited spectrum of antagonistic activity.
  • the closest analogue is a complex probiotic preparation containing the following components, vol.%: A mixture of biomass Vasillis sibtilis BKQM - 4759 with a titer of IxIO 7 -1OxIO 9 living microbial cells and biomass Vasillis. Yshepifortis 2336/105 to -10x10 8 titer IxIO living microbial cells in 1 ml saline - 92 - 98%, and the stabilizer on the basis of blood serum of cattle, or milk, or mixtures thereof, of sucrose and gelatin - 2 - 8%.
  • the drug has both antibacterial and antiviral activities, is capable of prolonged synthesis of interferon in various parts of the open cavities of the body (Patent RU JYo 2159625, A61K 35/66, publ. 27.11.2000).
  • the objective of the invention is to obtain new strains of Bacillus sibtilis and Bacillis, lishepiforptis and the creation on their basis of a probiotic biological product, characterized by a more pronounced antagonistic activity against opportunistic microorganisms due to the high lysozyme, proteolytic and amylase activities included in the biological preparation different prescription forms.
  • the technical result of the invention is to increase the effectiveness of the prevention and treatment of infectious diseases of various etiologies and dysbiosis by expanding the spectrum of antagonistic activity of bacterial strains included in the biological product of Irilis, increasing the resistance of the biological product to the action of enzymes of the gastrointestinal tract, and ease of use.
  • the invention consists in the following:
  • B. sibtilis 07 VKPM Ns B - 8611
  • B. lishepifortis 09 VKPM N ° B - 8610
  • B. sibtilis 07 high proteolytic and amylase activity
  • B. lyshephiortis 09 pronounced ability to produce lysozyme
  • B. lyshephiortis 09 do not compete with each other hom, and enter into a synergistic relationship, which is manifested in an increase in the antagonistic effect of the biological product.
  • strains B. siblis 07 BKTM JNb B - 8611.
  • B. lishepiforis 09 VKPM N ° B - 8610 were isolated from a healthy wheat plant, deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms and are characterized by the following properties:
  • Cells are mobile, form aerobic spores of an oval shape, which are located centrally in the cell. When spore formation, the cells do not swell.
  • the cells are mobile, peritrichia, located mainly in the form of chains.
  • the spores are oval, located centrally in the cell. Cells do not swell during spore formation. After growth on glucose agar, inclusions of poly-p-hydroxybutyric acid are not detected in the protoplasm.
  • the culture forms catalase, characterized by the ability to grow on agar under anaerobic conditions. Gives a positive Foges-Proscauer reaction, grows at 7% NaCl. Hydrolyzes starch, casein, does not hydrolyze urea. Gelatin liquefies slowly. Ferments gluco memory, arabinose, xylose, mannitol with the formation of acid without gas. Reduces nitrates; under anaerobic conditions it forms gas from nitrates. It produces arginine dihydrolase, lysozyme. It does not have coagulase and lecithinase activity.
  • strains of B. sibt ⁇ lis VKPM JVb B-8611 and B. lishepiforpis VKPM JVb in -8610 are characterized by high antagonistic activity against a wide range of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms and resistance to a number of antibiotics
  • these strains can be used in various combinations, for example, in equal proportions (according to cell titer): biomass of strain B. sibtilis VKPM JVb B - 8611 in a titer of IxIO 9 CFU / ml and biomass of strain B. lishepifortis VKPM JVb B - 8610 in an IxIO titer of 9 CFU / ml or in any ratios within the range of (1-100): (100 - 1), for example, the biomass of strain B.
  • the biological product Irilis also contains a protective environment to ensure the safety of bacteria in the process of technological processing, obtaining the final prescription form and subsequent storage.
  • a protective medium it may contain, for example, sucrose gelatin medium, milk powder, gelatose, lactose, sucrose and the like.
  • the biological product Irilis may additionally contain a solvent.
  • a solvent for example, distilled or boiled water, physiological saline, and the like can be used.
  • the biological product Irilis may additionally also contain a filler, usually used in the manufacture of various prescription forms.
  • a filler usually used in the manufacture of various prescription forms.
  • it may contain, for example, dextrans, polyglucin, starch, polyvinylpyrrolidone, sucrose, lactose, calcium stearate, glucose, sodium hydrogen carbonate, aluminum hydroxide, methyl cellulose, talc, and the like.
  • a suppository or suppository as a filler, it contains, for example, confectionery fat, paraffin, lanolin, cocoa butter, aluminum hydroxide gel, and the like.
  • the biological product can be encapsulated or immobilized on various types of carriers or sorbents, for example, aerosil, cellulose, activated carbon, carboxymethyl cellulose, scroxyethyl cellulose, chitosan, etc.
  • the biological product can also be lyophilized.
  • Biological product "Iris” can be used for oral or vaginal or rectal or external use in the form of an aqueous suspension.
  • the mechanism of action of the biological product Irilis is based on the adhesive and antagonistic activity of probiotic bacteria that produce various physiologically active substances and displace pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms from the digestive tract of the macroorganism and have a stimulating effect on specific and non-specific protective reactions of the macroorganism.
  • the strains are cultivated individually in either solid or liquid culture media.
  • the strains are cultivated on dense agarized media in mattresses, or in glass bottles on a thermostatically controlled rocking chair at a temperature of 22 to 38 ° C for 12-16 hours to 7 days.
  • the biomass grown on the surface of the nutrient medium is washed off with a stabilizer, a protective medium containing a 5% lactose solution, brought together in a ratio of 10: 1, poured into bottles.
  • a biological product is obtained containing the biomass of strain B. sibtilis VKPM N ° B - 8611 in a titer of IxIO 1 CFU / ml and the biomass of strain B. lishepofortis VKPM ⁇ ⁇ - 8610 - IxIO 9 CFU / ml.
  • the strains are cultured in a reactor / fermenter with a culture medium at a temperature of 35-38 ° C for 10-18 hours. The process is considered complete if the cell concentration is 4-5 billion / ml and the ratio of spores and vegetative cells 1: 1.
  • separately grown cultures are brought together in a 1: 1 ratio and the sugar-gelatin protective medium is added and poured into vials.
  • a biological product is obtained containing the biomass of strain B. sibtilis VKPM JVb B - 8611 in a titer of 5xlO 9 CFU / ml and the biomass of strain B. lishephitis VKPM JVb B - 8610 - 5xlO 9 CFU / ml.
  • the strains are cultured in a reactor / fermenter with a culture medium at a temperature of 35-38 ° C for 10-18 hours. The process is considered complete if the cell concentration is 4-5 billion / ml and the ratio of spores and vegetative cells 1: 1.
  • separately grown cultures are brought together in a 2: 1 ratio and the stabilizer is added, poured into ampoules (vials) or stainless steel cassettes, after which they are frozen and dehydrated in a vacuum-drying unit or spray dried.
  • Cultured strains of B. sibtilis strain VKPM JYe B - 8611 and B. lishepofortis VKPM JVb B - 8610 after adding the components of the suspension medium, are dehydrated by vacuum drying or spray drying, combined with sugar granules, glidants (starch or calcium stearate) and pressed on rotary presses.
  • Bio product Irilis is characterized by harmlessness.
  • the contents of the vial are diluted in 0.5 ml of physiological saline and this dose is administered orally to mice.
  • this dose is administered orally to mice.
  • mice For each experiment, use at least 10 mice weighing 15 - 16 g. The drug is considered harmless if all the mice remain alive for 5 days of observation and none of them revealed a disease.
  • the biological product Irilis is characterized by a wide spectrum of antagonistic activity against test strains of cultures of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms.
  • Table 3 presents the characteristics of the antagonistic activity of the drug against pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms isolated in various infectious diseases and dysbiosis of various etiologies.
  • the antagonistic activity of the drug variants against clinical test cultures is examined. The study is carried out by the method of delayed antagonism. For this, the contents of the vial are dissolved in 1 ml of physiological solution. The resulting suspension is seeded with a stroke on the diameter of a Petri dish with agarized Gauze medium N ° 2.
  • Crops are incubated in an incubator at 37 ° C for 72 hours. Then, they are inoculated to the grown culture. micro-organisms by stroke (500-millionth suspension of daily cultures in physiological saline). The results are taken into account after 18 hours of incubation at 37 ° C according to the size of the zones of lack of growth of test cultures.
  • test cultures The growth control of test cultures is controlled by their parallel growth on plates with agarized Gauze medium N ° 2 without the studied culture
  • the optimal number of living cells in one dose of the drug is 1 - 5 x 10 9 .
  • a further increase in the number of microbial cells does not significantly alter the antagonistic activity of the drug in relation to test cultures of microorganisms.
  • Example 6 To determine the therapeutic efficacy obtained from example 1 or 2 or 3 of the probiotic Irilis, in comparison with the use of the drug pectosorbin, in comparison with the use of the drug pectosorbin, in In case of long-term gastrointestinal illness, piglets with a symptom complex of diarrhea form three groups of 81 piglets of 1-2 days of age with clinical signs of dyspepsia (diarrhea, feces are liquefied, feces had an acid smell, gas bubbles, appetite was absent, dryness and pallor of the color of visible mucous membranes, pulse is quickened, heart sounds are deaf, breathing is quickened).
  • piglets secrete large amounts of pathogenic Escherichia (10 8 -10 11 bacteria per 1 g), while Escherichia strains - normal representatives of the large intestine - are isolated only in 8 piglets (10 3 - 10 4 bacteria in 1 g).
  • Pathogenic Escherichia unlike normal representatives of the intestine, as a rule, do not ferment lactose, cause the death of white mice with intraperitoneal administration.
  • 11 strains are assigned to enteropathogenic serogroup 0141, the remaining 40 strains were not agglutinated with type-specific sera.
  • the research results indicate a violation of the microflora of the large intestine of patients with dyspepsia of piglets (dysbiosis), which is the cause of their incidence.
  • the probiotic Irilis provided high efficiency when applied in the amount of 4 doses 2 times a day. Recovery occurs after a 4-6-fold use of Irilis, subject to a dietary regimen. Normalization of intestinal microflora eliminates dehydration, which eliminates the need for rehydration measures. After discontinuation of the drug, the disease is not recorded.
  • Example 7 To determine the effectiveness of the drug Irilis in the treatment of calves with a symptom complex of diarrhea and to evaluate the preventive effect on animals before When they reach 2 months of age, three groups of 100 healthy newborn calves of 1-2 days of age, weighing 28-30 kg at birth, were formed.
  • Calves of all groups are fed in accordance with the recommendations on technology! cultivation: 1.5-2 liters of colostrum (milk) for each feeding three times] day. The first time they drink colostrum no later than 1.5 hours after birth.
  • the calves of the first two groups (40 goals each) in 20-30 minutes. before the second feeding for five days in two courses with a break of 3-4 days between it: give the drug Irilis inside 1 and 2 doses, respectively.
  • the contents of one ampoule (bottle) are dissolved in 100 ml of boiled and cooled to a temperature of 38-39 ° C water.
  • Calves of the first experimental group are given 50 ml each, calves of the second experimental group 100 ml each.
  • the third group is the control (20 goals), the drug Irilis does not receive.
  • Calves are weighed at birth and at 2 months of age. Daily take into account the physical condition, appetite and functioning of the digestive system (the nature of the stool, flatulence), the behavior of the animal.
  • blood samples were taken from five calves of each group for hematological studies.
  • the hemoglobin content is determined using a Sali hemometer, blood cells in the Goryaev counting chamber, the leukocyte formula by the conventional method, the concentration of total protein in the blood serum is refractometric, the content of immunoglobulins using the zinc sulfate test, the lysozyme content according to E.V. Ermolaeva, bactericidal activity according to S.V.Smirnova and Takyzminoy.
  • the research results are presented in table.5.
  • the use of the probiotic Irilis does not significantly affect the concentration of hemoglobin in the blood, the number of blood cells and the leukocyte formula.
  • the level of total protein in blood serum, immunoglobulins, lysozyme and bactericidal activity of blood serum increases significantly
  • Example 8 The effectiveness of the use of the drug Irilis for the prevention of gastrointestinal diseases with a symptom complex of diarrhea is determined in a farm that is long-term unsuccessful for these diseases, in comparison with pectosorbin and immunoglobulin preparations. Of 105 newborn calves, three groups of 35 goals are formed. in each. All animals are healthy, normally developed, and the difference between the groups in terms of average live weight does not exceed 2%.
  • the prevention course in groups is: in the first group - 10 days, in the second - 10 days, in the third - 50 days.
  • the observation period is 60 days.
  • Calves are weighed at birth, after one month and at the end of the observation period.
  • the clinical condition is taken into account daily, paying attention to the number of diseased animals, the course and outcome of the disease.
  • the research results are presented in table. 7
  • Example 9 Carry out tests to include in the traditional feeding scheme of the probiotic preparation Irilis in poultry when growing broiler chickens. 4 groups of chickens are formed, which receive:
  • the experimental preventive regimen according to the days of cultivation is as follows: 1 day - probiotics with food 1-3 days - fluoroquinolone
  • the data given in Table 8 indicate that the use of the Irilis preparation in the process of raising chickens allows to obtain a high result in the safety of the livestock, the Irilis preparation has a positive effect on the body of chickens, providing a greater increase in live weight compared to the control.
  • the tests of the drug Irilis showed the possibility and high efficiency of its use in growing animals and birds. It provides inhibition of pathogenic Escherichia, maintaining optimal microbial balance in the digestive tract, increasing non-specific resistance of animals, their safety and weight gain, has a preventive therapeutic effect in diseases accompanied by diarrhea and provides prevention of dysbiosis.
  • the advantage of the drug Irilis is the chromosomal resistance to antibiotics of its constituent strains, which makes it possible to use it in the complex of antimicrobial therapy.

Description

БИОПРЕПАРАТ «ИPИЛИC» НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА ВасШиs, ВХОДЯЩИХ В
НЕГО ВасШиs sιιbtilis И ВасШиs liсhепifоrтis'
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и касается создания новых пробиотических препаратов на основе бактерий рода ВасШиs, которые могут быть использованы для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии человека, сельскохозяйственных животных и птицы.
Предшествующий уровень техники
Биопрепараты на основе бактерий рода ВасШиs хорошо известны. В состав биопрепаратов - пробиотиков на основе бактерий рода Васillus входят штаммы, обладающие разным спектром антибактериальной и антимикозной активности. Эффективность препаратов определяется широтой спектра и силой антибактериальной активности входящих в препарат штаммов.
Широкое распространение в медицинской практике в странах Западной Европы получил пробиотик бакгисубтил (фирма "Маriоп Merrell» /Франция/) и его аналог флонивин БС (фирма "Gаlепikа" /Югославия/), содержащие культуру штамма В.сеrеиs IP 5832 (коллекция Института Пастера (Париж). Известен вьетнамский препарат биосубтил, который в качестве активного компонента содержит штамм В.sиbtilis. Основой энтерогермина (фирма "Sапоfi Wiпthгор", Италия) является культура В. сlаиsii. Известен также биопрепарат цереобиоген ("Хiпg Лап", Китай), действующим началом которого является штамм В.сеrеиs DM-423 (B.B. Смирнов, CP. Резник, И.Б. Сорокулова, B.A. Вьюницкая. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. Журн., 1992, т. 54, N->6, c.82-93).
Недостатком данных пробиотиков является ограниченность спектра действия, так как они направлены против узкой группы возбудителей заболеваний.
Известен лечебно-профилактический биопрепарат Бакrиспорин для лечения широкого круга заболеваний, содержащий лиофильно высушенную биомассу штамма ВасШиs sиbtilis ЗН и защитную среду на основе сахарозо-желатиновой смеси или лактозы (Патент RU N°2130316, A61K 35/66, опубл.20.05.1999).
Однако биопрепарат Бактиспорин не эффективен против ряда возбудителей острых кишечных инфекций, например, вызываемых бактериями рода Рsеudоmопаs sрр. , Strерtососсus sрр., Епtеrососсus sрр.. Известен также биофармацевтический препарат «Дeпpeкaн -A», содержащий рекомби- нантный штамм Васйlиs sиbtϊlis, продуцирующий альфа -2-интepфepoн человека, штамм Васпlиs lidгепifоrтis и наполнитель. В составе препарата может быть использован рекомбинантный штамм Васпlиs sиbtпis ВКПМ NsB-7289. Препарат обладает антибактериальной, антивирусной и иммуномодулирующей активностью и может быть использован при лечении различных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы (Патент RU N° 2158134, A61K 35/74, опубл. 20.09.2000).
Однако в состав препарата «Дeпpeкaн-A» входит рекомбинантный штамм, содержащий плазмиду, детерминируюпгую устойчивость к антибиотику (канамицину), что не удовлетворяет требованиям ВОЗ.
Известен препарат Биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живые клетки штаммов Васпlиs sиbtilis 3 (ВКПМ NsB-2335) и Васil- lиs, lidгепifоrтis 31 (ВКПМ JNb B-2336) и наполнитель (Патент RU JN° 1722502, A61K 35/74, опубл. 30.03.1992).
Биоспорин характеризуется высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов (Сорокулова И,Б., 1997).
Недостатком Биоспорина является то, что входящие в его состав штаммы чувствительны к антибиотикам, поэтому препарат не рекомендуется применять при лечении совместно с антибиотиками.
Наиболее близким аналогом является препарат против вирусных и бактериальных инфекций, содержащий смесь биомассы штаммов Васйlиs sиbtilis ВКПМ N°B-7092, Васillиs sиbtilis ВКПМ NsB-7048, Васillиs, liсhепifоrтis ВКПМ MB-7038 в споровой форме с титром не менее ЗхlО10 спор/г, и стабилизатор - крахмал и сахар.. (Патент RU N° 2142287, A61K 35/74, опубл. 10.12.1999).
Недостатком известного препарата является использование рекомбинантного штамма, содержащего плазмиду, детерминирующую устойчивость к антибиотикам.
Среди препаратов ветеринарного назначения известен штамм Васillиs sиbtilis X- 15, используемый для профилактики и лечения эндометритов у коров (Патент RU N° 2180575, C12N 1/20, опубл. 20.03.2002).
Недостатком препарата на основе штамма Васillиs sиbtilis X- 15 является ограниченность спектра действия, так как он активен только против узкой группы микроорганизмов, вызывающих эндометриты у коров. Известен также пробиотический препарат «Cyбтилиc» на основе жидкой или лио- фильно высушенной культуры штамма Васillиs sиЪtϊlis BKM Ns B-2250 Д. Препарат предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы, способствует увеличению усвояемости кормов, повышению продуктивности и привесов (Патент RU JЧs 2184774, C12N 1/20, опубл. 10.07.2002).
Недостатком препарата «Cyбтилиc» является ограниченный спектр антагонистической активности.
Наиболее близким аналогом является пробиотический препарат комплексного действия, содержащий следующие компоненты, oб.%: смесь биомассы Васillиs sиbtilis BKQM - 4759 с титром IxIO7 -1OxIO9 живых микробных клеток и биомассы Васillиs. Ысhепifоrтis 2336/105 с титром IxIO8 -10x10 живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора — 92 — 98 %, и стабилизатор на основе сыворотки крови крупного рогатого скота, или молока, или их смеси, сахарозы и желатина - 2 - 8 %.. Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способен к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма (Патент RU JYo 2159625, A61K 35/66, опубл. 27.11.2000).
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является получение новых штаммов Васillиs sиbtilis и Васillиs, liсhепifоrtпis и создание на их основе пробиотического биопрепарата, характеризующегося более выраженной антагонистической активностью в отношении условно-патогенных микроорганизмов за счет высокой лизоцимной, протеолитической и амилазной активностей входящих в биопрепарат штаммов, удобного в применении и имеющего разные рецептурные формы.
Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности профилактики и лечения инфекционных болезней различной этиологии и дисбиоза за счет расширения спектра антагонистической активности входящих в биопрепарат Ирилис штаммов бактерий, повышении устойчивости биопрепарата к действию ферментов желудочно-кишечного тракта, и удобстве применения.
Сущность изобретения заключается в следующем:
Входящие в состав биопрепарата Ирилис новые штаммы В.sиbtilis 07 (ВКПМ Ns В - 8611) и В.liсhепifоrtпis 09 (ВКПМ N° В - 8610) характеризуются широким спектром антагонистической активности, высокой протеолитической и амилазной активностью (В.sиbtilis 07) и выраженной способностью к продукции лизоцима (В. liсhепifоrтis 09), не конкурируют друг с дру- гом, а вступают в синергидные отношения, что проявляется в повышении антагонистического действия биопрепарата.
Штаммы В.sиbήlis 07 (BKTM JNb В - 8611.) и В.liсhепifоrтis 09 (ВКПМ N° В - 8610) выделены из здорового растения пшеницы, депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и характеризуются следующими свойствами:
Васϊllиs sиbtilis ВКПМ N° В - 8611 - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 2,7-0,6 х 0,8-0,7 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют в аэробных условиях споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются.
На среде Гаузе N°2 , сусло-агаре, среде Громыко штамм растет обильно, образует матовые складчатые колонии телесного цвета с изрезанными краями, легко снимаются петлей с агара.
В протоплазме штамма после роста на глюкозном агаре не обнаруживаются включения поли-р-оксимасляной кислоты. На МПБ культура образует пленку.
Не растет в анаэробных условиях, не гидролизует мочевину, не образует газ из нитратов в анаэробных условиях, не продуцирует аргининдигидролазу. Культура образует каталазу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет в присутствии 7 % NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обесцвечивает метиленовую синьку. Не обладает коагу- лазной и лецитиназной активностью, обладает высокой протеолитической и амилазной активностью.
Основные физико-биохимические свойства В.sиbήlis ВКПМ N° B - 8611 представлены в табл. 1 и табл.2.
Васϊllиs liсhепifоrтis ВКПМ Ns В - 8610 - грамположительные спорообразующие палочки, размером 2,6-0,7 х 0,5-06 мкм. Клетки подвижные, перитрихи, располагаются в основном в виде цепочек. Споры овальной формы, располагаются в клетке центрально. Клетки при спорообразовании не раздуваются. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения поли-р-оксимасляной кислоты.
На МПА образует колонии с тусклой грубой поверхностью, непрозрачные, плотно прикрепленные к агару: нередко на поверхности обнаруживается слизь. На МПБ образуется морщинистая пленка, иногда с кремовым оттенком.
Культура образует каталазу, характеризуется способностью расти на агаре в анаэробных условиях. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет при 7% NaCl. Гидролизует крахмал, казеин, не гидролизует мочевину. Желатин разжижает медленно. Ферментирует глюко- зу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, в анаэробных условиях из нитратов образует газ. Продуцирует аргининдигидролазу, лизоцим. Не обладает коагулазной и лецитиназной активностью.
Основные свойства штамма В.liсhеήifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 представлены в табл. 1 и табл. 2 .
Штаммы В. sиbtϊlis ВКПМ JVb В - 8611 и В.liсhепifоrпιis ВКПМ JVb в -8610 характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно - патогенных микроорганизмов и устойчивостью к ряду антибиотиков
В составе предлагаемого биопрепарата Ирилис указанные штаммы могут быть использованы в различных сочетаниях, например, в равных соотношениях (по титру клеток): биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре IxIO9 КОЕ/мл и биомасса штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 в титре IxIO9 КОЕ/мл или в любых соотношениях в пределах (1- 100 ): (100 - 1), например, биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре 5xlO9 КОЕ/мл и биомасса штамма В. liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 в титре IxIO9 КОЕ/мл, или биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ Jfe В - 8611 в титре IxIO10 КОЕ/мл и биомасса штамма В.liсliепifоrтis ВКПМ JNb В - 8610 в титре 5xlO9 КОЕ/мл, или биомасса штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре IxIO9 КОЕ/мл и биомасса штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 в титре IxIO7 КОЕ/мл и т.д.
Биопрепарат Ирилис содержит также защитную среду для обеспечения сохранности бактерий в процессе технологической переработки, получения конечной рецептурной формы и последующего хранения. В качестве защитной среды, он может содержать, например, сахарозо- желатиновую среду, сухое молоко, желатозу, лактозу, сахарозу и т.п.
Биопрепарат Ирилис может дополнительно содержать растворитель. В качестве растворителя может быть использована, например, дистиллированная или кипяченая вода, физиологический раствор и т.п.
Биопрепарат Ирилис может дополнительно также содержать наполнитель, обычно применяемый при изготовлении различных рецептурных форм. При формовании таблеток он может содержать, например, декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон, сахарозу, лактозу, стеарат кальция, глюкозу, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк и т.п. При получении суппозиторий или свечей в качестве наполнителя он содержит, например, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия и т.п.
Биопрепарат может быть инкапсулирован или иммобилизирован на различных типах носителей или сорбентах, например, на аэросиле, целлюлозе, активированном угле, карбоксиметил- целлюлозе, щцроксиэтилцеллюлозе, хитозане и т.п. Биопрепарат может также быть лиофилгоирован.
Биопрепарат «Иpилиc» может быть использован для перорального или вагинального или ректального или наружного применения в виде водной суспензии. Механизм действия биопрепарата Ирилис основан на адгезивной и антагонистической активности бактерий- пробиотиков, продуцирующих различные физиологически активные вещества и вытесняющих патогенные и условно-патогенные микроорганизмы из пищеварительного тракта макроорганизма, и оказывающих стимулирующее действие на специфические и неспецифические защитные реакции макроорганизма.
Лучшие варианты осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1 . Получение жидкого препарата.
Штаммы культивируют по отдельности или на плотных или на жидких питательных средах.
При стационарной технологии культивирование штаммов проводят на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38 °C в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончанию инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, стабилизатором - защитной средой, содержащей 5 % - ный раствор лактозы, сводят вместе в соотношении 10:1, разливают во флаконы. Получают биопрепарат с содержанием биомассы штамма В. sиbtilis ВКПМ N° В - 8611 в титре IxIO1 КОЕ/мл и биомассы штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ Ш В - 8610 - IxIO9 КОЕ/мл.
При промышленной технологии культивирование штаммов проводят в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35- 38 °C в течение от 10-18 ч. Процесс считают законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончанию инкубации раздельно выращенные культуры сводят вместе в соотношении 1:1 и добавляют сахарозе- желатиновую защитную среду, разливают во флаконы. Получают биопрепарат с содержанием биомассы штамма В. sиbtilis ВКПМ JVb В - 8611 в титре 5xlO9 КОЕ/мл и биомассы штамма В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 - 5xlO9 КОЕ/мл.
П р и м е р 2 . Получение препарата в форме лиофилизата.
При стационарной технологии культивирование штаммов проводят на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 3 8 ° С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончанию инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, защитной средой, содержащей 10 %- ный раствор глицерина, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум - сушильной установке или высушивают распылительным способом.
При промышленной технологии культивирование штаммов проводят в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38 °C в течение от 10-18 ч. Процесс считают законченным, если концентрация клеток составляет 4- 5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончанию инкубации раздельно выращенные культуры сводят вместе в соотношении 2: 1 и добавляют стабилизатор, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум - сушильной установке или высушивают распылительным способом.
П р и м е р 3 . Получение препарата в таблетированной форме.
Выращенные культуры штаммов В. sиbtilis ВКПМ JYe В - 8611 и В.liсhепifоrтis ВКПМ JVb В - 8610 после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум - сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с сахарным гранулятом, скользящими веществами (крахмалом или стеаратом кальция) и прессуют на ротационных прессах.
На стабильность изучено 10 экспериментально - производственных серий табле- тированного препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В. sиbtilis ВКПМ N° В -8611 и В.liсhепifоппis BKПMN° В - 8610 в таблетках составляет не менее 109"7- 10 8~б КОЕ/дозе (соответственно). После хранения таблеток на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже! О9"7- 108"6 КОЕ/дозе.
П р и м е р 4 . Получение препарата в форме суппозиториев.
Выращенные культуры штаммов В. sиbtilis ВКПМ N° В - 8611 и В.liсhепifоrтis ВКПМ Na B - 8610 после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум - сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с наполнителями (кондитерским жиром или парафином) и отливают на специальной установке суппозитории.
На стабильность изучено 10 экспериментально - производственных серий препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В. sиbtilis ВКПМ Ne В - 8611 и В.liсhепifоrтis ВКПМ N° В - 8610 в суппозито- риях составляет не менее 109"7 - 10 8~6 КОЕ/ суппозиторий (соответственно). После хранения суппозиториев на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 109"7 - 108"6 КОЕ/суппозиторий.
П р и м е р 5 . Все полученные по примерам 1 или 2 или 3 или 4 варианты и формы биопрепарата Ирилис проверяют на безвредность на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест - культур - представителей различных групп патогенных и условно - патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.
Биопрепарат Ирилис характеризуется безвредностью.
Для определения безвредности содержимое флакона разводят в 0,5 мл физиологического раствора и вводят эту дозу перорально мышам. Для каждого варианта опыта используют не меньше 10 мышей массой 15 - 16г. Препарат считают безвредным, если все мыши остаются живыми в течение 5 суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.
Биопрепарат Ирилис характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест - штаммов культур патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В таблице 3 представлена характеристика антагонистической активности препарата в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов, выделенных при различных инфекционных заболеваниях и дисбиоза различной этиологии. Для определения специфической активности исследуют антагонистическую активность вариантов препарата в отношении клинических тест -культур. Исследование осуществляют методом отсроченного антагонизма Для этого содержимое флакона растворяют в 1 мл физиологического раствора Полученную .взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованнй средой Гаузе N° 2. Посевы инкубируют в термостате при 37 °C в течении 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевают штрихом тест -микроорганизмы (500 - миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе) Учет результатов проводят через 18 часов инкубирования при 37 С по величине зон отсутствия роста тест - культур.
Контролем роста тест - культур служит параллельное выращивание их на чашках с агаризован- ной средой Гаузе N° 2 без исследуемой культуры
Из данных табл.3 следует, что оптимальным количеством живых клеток в одной дозе препарата является 1 - 5 х 109. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом антагонистическую активность препаратав отношении тест - культур микроорганизмов.
Пример 6. Для определения лечебной эффективности полученного по примеру 1 или 2 или 3 пробиотика Ирилис, в сравнении с применением препарата пектосорбин, в хо- зяйстве, длительно неблагополучном по желудочно-кишечным болезням поросят с симпто- мокомплексом диареи, формируют три группы из 81 поросят 1-2 дневного возраста с клиническими признаками диспепсии (диарея, кал разжижен, каловые массы имели кислый запах, содержали пузырьки газа, аппетит отсутствовал, сухость и бледность окраски видимых слизистых, пульс учащен, тоны сердца глухие, дыхание учащено).
После клинического обследования было установлено, что у 69 поросят -простая диспепсия, у 12 - токсическая.
При бактериологических исследованиях проб фекалий у всех больных поросят выделяют в больших количествах патогенные эшерихий (108 -1011 бактерий в 1 г), в то время как штаммы эшерихий - нормальных представителей толстого отдела кишечника выделяют только у 8 поросят (103 - 104 бактерий в 1 г).
Патогенные эшерихий, в отличие от нормальных представителей кишечника, как правило, не ферментируют лактозу, вызывают гибель белых мышей при внутрибрюшин- ном введении. При серотипировании выделенных от поросят штаммов - 11 штаммов относят к энтеропатогенной серогруппе 0141, остальные 40 штаммов не агглютинировались типос- пецифическими сыворотками. Результаты исследований свидетельствуют о нарушении микрофлоры толстого отдела кишечника больных диспепсией поросят (дисбактериозе), что является причиной их заболеваемости.
Поросятам первой и второй групп первый раз после 3-4 часовой водо-голодной диеты за 20-30 минут до кормления выпаивают Ирилис в количестве 2 и 4 доз соответственно 2 раза в день с интервалом 12 часов до клинического выздоровления. Поросятам третьей группы три раза в день до клинического выздоровления с молозивом применяют препарат Пектосорбин в дозе 0,26 г на кг живой массы в соответствии с инструкцией по применению. За поросятами ведут клинические наблюдения, учитывают количество выздоровевших животных, длительность лечения. О выздоровлении судят по исчезновению признаков диареи, патологических примесей в фекалиях, метеоризма, спазмов, улучшению общего состояния, появлению аппетита. Результаты представлены в табл.4.
Как видно из табл. 4, пробиотик Ирилис обеспечивал высокую эффективность при применении его в количестве 4 доз 2 раза в день. Выздоровление наступает после 4-6- кратного применения Ирилиса при соблюдении диетического режима. Нормализация кишечной микрофлоры устраняет обезвоживание, что исключает необходимость проведения регидратационных мероприятий. После отмены препарата заболевание не регистрируют.
Пример 7. Для определения эффективности препарата Ирилис при лечении телят с симптомокомплексом диареи и оценки профилактического действия на животных до достижения ими 2-х месячного возраста было сформировано три группы из 100 здоровых новорожденных телят 1-2 дневного возраста, весом при рождении 28-30 кг.
Телят всех групп кормят в соответствии с рекомендациями по технологи! выращивания: по 1,5-2 л молозива (молока) на каждое кормление три раза ] сутки. Первый раз молозиво выпаивают не позднее 1,5 ч после рождения Телятам первых двух групп (по 40 гол. каждая) за 20-30 мин. до второго кормления в течение пяти дней двумя курсами с перерывом 3-4 дня между ним: дают внутрь препарат Ирилис по 1 и 2 дозы соответственно. Перед введение препарата содержимое одной ампулы (флакона) растворяют в 100 мл кипячено и остуженной до температуры 38-39 °C воды. Телятам первой опытной группы выпаивают по 50 мл, телятам второй опытной группы - по 100 мл препарата. Третья группа - контрольная (20 гол), препарат Ирилис не получает.
Телят взвешивают при рождении и в 2-х месячном возрасте. Ежедневно учитывают физическое состояние, аппетит и функционирование пищеварительной системы (характер стула, метеоризм), поведение животного. В конце опыта от пяти телят каждой группы берут пробы крови для гематологических исследований. В крови определяют содержание гемоглобина с помощью гемометра Сали, форменных элементов крови в счетной камере Горяева, лейкоцитарную формулу общепринятым методом, концентрацию общего белка в сыворотке крови рефрактометрически, содержание иммуноглобулинов с помощью цинксульфатного теста, содержание лизопима по Э.В.Ермолаевой, бактерицидную активность по С.В.Смирновой и T.A.Kyзьминoй. Результаты исследований представлены в табл.5.
Как видно из табл. 5, применение пробиотика Ирилис не оказывает существенного влияния на концентрацию в крови гемоглобина, количество форменных элементов крови и лейкоцитарную формулу. Вместе с тем в крови у телят, получавших препарат, существенно возрастает уровень общего белка в сыворотке крови, иммуноглобулинов, лизопима и бактерицидной активности сыворотки крови
Было установлено, что Ирилис не оказывает отрицательного влияния на здоровье животных, а существенно повышает их резистентность к желудочно-кишечным болезням улучшает качество жизни телят, они не теряют в весе. (Табл.6).
Как видно из табл. 6, в контрольной группе, не получавшей Ирилис, заболело 15 из 20 телят, что составляет. 75 % от числа животных в группе, а в первой опытной группе (1 доза Ирилиса 1 раз в день) - 11 из 40 телят (27,5 %), во второй опытной группе (2 дозы Ирилиса 1 раз в день) - 7 из 40 телят (17,5 %). Профилактическая эффективность пробно- тика Ирилис составляет 72,5 % и 82,5 % соответственно. При этом телята контрольной группы заболевают уже на 2 и 9 дни, и болезнь протекает в основном в тяжелой форме, в результате отход составляет 30 % , а сохранность - 70 %. Применение препарата Ирилис в количестве не менее 2 доз нецелесообразно, что подтверждается высокими процентами сохранности телят и среднесуточного привеса массы тела, соответственно равных 95 % и 9 %.
Пример 8. Эффективность применения препарата Ирилис для профилактики желудочно-кишечных болезней с симптомокомплексом диарей определяют в условиях хозяйства, длительно неблагополучного по этим заболеваниям, в сравнении с препаратами пектосорбин и иммуноглобулином. Из 105 новорожденных телят формируют три группы по 35 гол. в каждой. Все животные здоровы, нормально развиты, а разница между группами по средней живой массе не превышает 2 %.
Телятам первой группы за 20-30 мин. до второй выпойки молозива дают препарат Ирилис (2 дозы), телятам второй группы - пектосорбин в соответствии с наставлением по его применению, телятам третьей группы вводят неспецифический иммуноглобулин внутримышечно согласно наставлению по его применению.
Курс профилактики по группам составляет: в первой группе - 10 дней, во второй - 10 дней, в третьей - 50 дней. Период наблюдения - 60 дней. Телят взвешивают при рождении, через один месяц и в конце периода наблюдения. Ежедневно учитывают клиническое состояние, обращая внимание на количество заболевших животных, течение и исход болезни. Результаты исследований представлены в табл. 7
Как видно из табл. 7, эффективность пробиотика Ирилис в сравнении с известными препаратами пектосорбином и иммуноглобулином, значительно выше, что подтверждается показателями сохранности и среднесуточного роста массы тела
Пример 9. Проводят испытания по включению в традиционную схему кормления пробиотического препарата Ирилис в птицеводстве при выращивании цыплят-бройлеров. Формируют 4 группы цыплят, которые получают:
1 гр. - препарат «Beтoм» производства НПФ-ИЦ «Koльцoвe»,
2 гр. - препарат Ирилис
3 гр. - препарат СТФ производства ООО «Биoaвтoмaтикa»,
4 гр. - препарат «Энтepocпopин»
Экспериментальная профилактическая схема по дням выращивания следующая: 1 сутки - пробиотики с кормом 1-3 сутки - фторхинолон
4-13 сутки - пробиотаки с кормом.
Далее - по действующей в хозяйствах профилактической схеме.
Учет результатов проводят по основным технологическим показателям: вес цыплят на 1,7,14,28,35 и 42-е сутки и при сдаче на убой; учет падежа каждую неделю и общий - при сдаче на убой. Результаты представлены в тaбл.8.
Данные, приведенные в табл.8 , свидетельствуют, что использование препарата Ирилис в процессе выращивания цыплят позволяет получить высокий результат по сохранности поголовья, препарат Ирилис оказывает положительное действие на организм цыплят, обеспечивая больший прирост живой массы по сравнению с контролем.
Таким образом, проведенные испытания препарата Ирилис показали возможность и высокую эффективность его применения при выращивании животных и птицы. Он обеспечивает ингибирование патогенных эшерихий, поддержание оптимального микробного баланса в пищеварительном тракте, повышение неспецифической резистентности животных, их сохранность и прирост массы тела, оказывает профилактический лечебный эффект при заболеваниях сопровождающихся диареей и обеспечивает профилактику дисбактериоза. Преимуществом препарата Ирилис является хромосомная резистентность к антибиотикам составляющих его штаммов, что делает возможным его применение в комплексе противомикроб- ной терапии.
Таблица 1
Культурально-морфологические и биохимические свойства
Figure imgf000015_0001
Таблица 2
Антибиотикочvвсτвiггельность штаммов рода Ваάllиs
Figure imgf000016_0001
Таблица 3
Антагонистическая активность вариантов биопрепарата Ирилис в отношении клинических штаммов патогенных и условно патогенных микроорганизмов
Figure imgf000017_0001
Таблица 4
Сравнительная эффективность применения Ирилиса и Пектосорбина для лечения желудочно-кишечных болезней поросят, вызванных патогенной микрофлорой
Figure imgf000018_0001
Таблица 5
Исследования основных показателей крови 2-месячных телят, после проведения профилактических мероприятий
Figure imgf000018_0002
Таблица 6 Профилактическая эффективность Ирилиса при выращивании телят-молочников
Figure imgf000019_0001
Таблица 7
Сравнительная эффективность применения Ирилиса и известных препаратов для профилактики желудочно-кишечных болезней, вызываемых <жлeвнoй» микрофлорой у новорожденных телят
Figure imgf000019_0002
Таблица 8
Результаты испытания препаратов-пробиотиков на цыплятах-бройлерах.
СО
Figure imgf000020_0001

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Биопрепарат медицинского и ветеринарного назначения для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии, содержащий живую микробную массу штаммов Васϊпиs sиbtϊlis, Васillиs liсhепifоппis и защитную среду, отличающийся тем, что из штаммов Васillиs sиbήlis он содержит штамм Васillиs sиbtilis BKQM N° В - 8611, а из штаммов Васillиs liсhепifоrтis - Васillиs liсhепifоппis ВКПМ N° В - 8610, взятые в эффективном количестве.
2. Биопрепарат по п.l, отличающийся тем, что дополнительно содержит наполнитель.
3. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве наполнителя он содержит протеин, органический полимер, молоко, сыворотку, альбумин., сахарозу, лактозу, стеарат кальция, глюкозу, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия.
4. Биопрепарат по п.З, отличающийся тем, что из органических полимеров он содержит декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон.
5. Биопрепарат по п.l, отличающийся тем, что дополнительно содержит растворитель.
6. Биопрепарат по п.5, отличающийся тем, что в качестве растворителя он содержит дистиллированную или кипяченую воду, физиологический раствор.
7. Биопрепарат по любому из пп. . 1 -6, отличающийся тем, что он лиофильно высушен.
8. Биопрепарат по любому из пп.. 1-6, отличающийся тем, что он гранулирован.
9. Биопрепарат по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что он заключен в полимерную капсулу.
10. Биопрепарат по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что он таблетирован.
11. Биопрепарат по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что он представлен в форме свечей или суппозиторий.
12. Биопрепарат по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что смешан с компонентами корма.
13. Штамм бактерий Васillиs sиbtilis ВКПМ Ns В - 8611 , используемый для изготовления биопрепарата для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии человека и животных и птицы.
14. Штамм бактерий Васillиs liсhепifоrтis ВКПМ Na В - 8610 , используемый для изготовления биопрепарата для профилактики и лечения инфекционньк болезней и дисбиоза различной этиологии человека и животных и птицы.
PCT/RU2005/000231 2005-04-28 2005-04-28 Preparation biologique irilis a base de bacteries du genre bacillus contenant bacillus subtilis et bacillus licheniformis WO2006115430A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE502005010458T DE502005010458D1 (de) 2005-04-28 2005-04-28 Irilis-biopräparation auf der basis von darin enthaltenen bacillus-bakterienstämmen bacillus subtilis und bacillus licheniformis
US11/919,356 US8414878B2 (en) 2005-04-28 2005-04-28 Irilis biopreparation based on bacillus-strain bacteria, bacillus subtilis and bacillus licheniformis contained therein
EP05749360A EP1894995B1 (de) 2005-04-28 2005-04-28 Irilis-biopräparation auf der basis von darin enthaltenen bacillus-bakterienstämmen bacillus subtilis und bacillus licheniformis
AT05749360T ATE486122T1 (de) 2005-04-28 2005-04-28 Irilis-biopräparation auf der basis von darin enthaltenen bacillus-bakterienstämmen bacillus subtilis und bacillus licheniformis
PCT/RU2005/000231 WO2006115430A1 (fr) 2005-04-28 2005-04-28 Preparation biologique irilis a base de bacteries du genre bacillus contenant bacillus subtilis et bacillus licheniformis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2005/000231 WO2006115430A1 (fr) 2005-04-28 2005-04-28 Preparation biologique irilis a base de bacteries du genre bacillus contenant bacillus subtilis et bacillus licheniformis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006115430A1 true WO2006115430A1 (fr) 2006-11-02

Family

ID=37214993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2005/000231 WO2006115430A1 (fr) 2005-04-28 2005-04-28 Preparation biologique irilis a base de bacteries du genre bacillus contenant bacillus subtilis et bacillus licheniformis

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8414878B2 (ru)
EP (1) EP1894995B1 (ru)
AT (1) ATE486122T1 (ru)
DE (1) DE502005010458D1 (ru)
WO (1) WO2006115430A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2454238C1 (ru) * 2010-12-08 2012-06-27 Общество с ограниченной ответственностью "АМИЛИС" Биопрепарат балис для профилактики и лечения инфекционных болезней
JP7416722B2 (ja) 2018-01-24 2024-01-17 オムニゲン リサーチ エルエルシー 動物への投与のためのバチルス菌の組み合わせ
CN115975878B (zh) * 2022-12-15 2023-07-07 鹤山市新的生物制品有限公司 一株特基拉芽孢杆菌菌株及其应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2130316C1 (ru) 1997-01-23 1999-05-20 Государственное предприятие НПО. "Иммунопрепарат" Лечебно-профилактический биопрепарат "бактиспорин"
RU2132196C1 (ru) * 1996-12-18 1999-06-27 Центр военно-технических проблем биологической защиты Научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны РФ Способ получения эубиотика биоспорина
RU2142287C1 (ru) 1997-12-16 1999-12-10 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов
RU2158134C1 (ru) 2000-03-10 2000-10-27 Унитарное Государственное "Московское Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины
RU2159625C1 (ru) 1999-05-25 2000-11-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Пробиотический препарат комплексного действия
RU2180575C2 (ru) 2000-02-21 2002-03-20 Губанов Данил Викторович Штамм bacillus subtilis x-15, используемый для профилактики и лечения эндометритов у коров
RU2182009C1 (ru) * 2000-11-23 2002-05-10 Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" Способ получения таблетированной формы препарата-пробиотика
RU2184774C1 (ru) 2001-09-21 2002-07-10 Закрытое акционерное общество "КУЛ" Штамм бактерий bacillus subtilis, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы
RU2219238C1 (ru) * 2002-05-08 2003-12-20 Закрытое акционерное общество "Продфарм" Штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов и биопрепарат биспорин для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов
US6723326B1 (en) * 1997-04-18 2004-04-20 Ganeden Biotech, Inc. Topical compositions containing probiotic Bacillus bacteria, spores, and extracellular products and uses thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1722502A1 (ru) 1989-02-06 1992-03-30 Институт Микробиологии И Вирусологии Им.Акад.Д.К.Заболотного Препарат биоспорин дл профилактики и лечени желудочно-кишечных заболеваний человека
RU2131258C1 (ru) 1996-11-27 1999-06-10 Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины Способ коррекции микрофлоры вагины
JP3260111B2 (ja) * 1997-10-09 2002-02-25 伊藤忠飼料株式会社 鳥類の給餌中止時の体重減少抑制方法及び腸内有害細菌減少方法
EP1472933A1 (en) * 2003-05-01 2004-11-03 Chr. Hansen A/S Improving health and/or nutritional status of an aquatic animal by aid of Bacillus licheniformis
EP1654348A4 (en) * 2003-08-14 2008-02-13 Bio Balance Corp BACTERIAL STRAINS, COMPOSITIONS AND PROBIOTIC USE THEREOF
RU2264453C2 (ru) 2003-12-30 2005-11-20 Ирина Борисовна Сорокулова Биопрепарат "ирилис" ветеринарного назначения
RU2264454C2 (ru) 2003-12-30 2005-11-20 Ирина Борисовна Сорокулова Биопрепарат "ирилис" на основе бактерий рода bacillus для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии и штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые для изготовления биопрепарата

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2132196C1 (ru) * 1996-12-18 1999-06-27 Центр военно-технических проблем биологической защиты Научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны РФ Способ получения эубиотика биоспорина
RU2130316C1 (ru) 1997-01-23 1999-05-20 Государственное предприятие НПО. "Иммунопрепарат" Лечебно-профилактический биопрепарат "бактиспорин"
US6723326B1 (en) * 1997-04-18 2004-04-20 Ganeden Biotech, Inc. Topical compositions containing probiotic Bacillus bacteria, spores, and extracellular products and uses thereof
RU2142287C1 (ru) 1997-12-16 1999-12-10 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов
RU2159625C1 (ru) 1999-05-25 2000-11-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Пробиотический препарат комплексного действия
RU2180575C2 (ru) 2000-02-21 2002-03-20 Губанов Данил Викторович Штамм bacillus subtilis x-15, используемый для профилактики и лечения эндометритов у коров
RU2158134C1 (ru) 2000-03-10 2000-10-27 Унитарное Государственное "Московское Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины
RU2182009C1 (ru) * 2000-11-23 2002-05-10 Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" Способ получения таблетированной формы препарата-пробиотика
RU2184774C1 (ru) 2001-09-21 2002-07-10 Закрытое акционерное общество "КУЛ" Штамм бактерий bacillus subtilis, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы
RU2219238C1 (ru) * 2002-05-08 2003-12-20 Закрытое акционерное общество "Продфарм" Штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов и биопрепарат биспорин для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиозов

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
W.W.SMIRNOW; S.R. RESNIK; I.B.SOROKULOWA; W.A.WJUNITSKAJA: "Dissussionsfragen der Entwicklung und Anwendung der bakteriellen Praparate fur die Korrektur der Mikroflora der warmblutigen", TIERE// MIKROBIOLOGIE ZEITSCHRIFT, vol. 54, no. S, 1992, pages 82 - 93

Also Published As

Publication number Publication date
EP1894995A1 (de) 2008-03-05
US20110142924A1 (en) 2011-06-16
US8414878B2 (en) 2013-04-09
ATE486122T1 (de) 2010-11-15
EP1894995B1 (de) 2010-10-27
EP1894995A4 (de) 2009-01-14
DE502005010458D1 (de) 2010-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100433300B1 (ko) 사료 생산물
CN110964657B (zh) 一种可提高免疫力的乳双歧杆菌bl-99及其应用
CN110205270B (zh) 一种缓解养殖动物便秘的副干酪乳杆菌l9的应用
CN110893193B (zh) 乳双歧杆菌bl-99的新应用
CN115287224B (zh) 一株改善本源动物肠道微生物发育的牦牛源罗伊氏乳杆菌及其应用
CN109486732B (zh) 一种长双歧杆菌及其应用
WO2010001509A1 (ja) イムノグロブリンａ誘導能の高い新規乳酸菌
RU2264453C2 (ru) Биопрепарат &#34;ирилис&#34; ветеринарного назначения
CN108295096A (zh) 菌株在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎制剂中的应用
CN109652334A (zh) 一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用
CN113862181A (zh) 一种具有肠道调节功能的乳双歧杆菌株rk-7782及其应用
RU2086248C1 (ru) Пробиотический препарат &#34;стрептобифид&#34; для животных
WO2006115430A1 (fr) Preparation biologique irilis a base de bacteries du genre bacillus contenant bacillus subtilis et bacillus licheniformis
CN106387314B (zh) 脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用
JPWO2010024413A1 (ja) 抗コクシジウム組成物
CN114164157B (zh) 用以抑制发炎缓解牙龈肿痛改善口腔菌群平衡的唾液乳杆菌菌株zk-88
RU2264454C2 (ru) Биопрепарат &#34;ирилис&#34; на основе бактерий рода bacillus для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии и штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus licheniformis, используемые для изготовления биопрепарата
CN113186118B (zh) 一种用于提高母猪生产性能的复合益生菌制剂及其制备方法
CN110892961B (zh) 一种含乳双歧杆菌bl-99的固体饮料及其应用
CN110079477B (zh) 一株防治鸡白痢沙门氏菌病的植物乳杆菌及其制剂和应用
CN114032200A (zh) 一种养殖动物的枯草芽孢杆菌饲料添加剂的制备方法
CN109517765A (zh) 一种粪链球菌及其应用
CN115595284B (zh) 一株植物乳杆菌y1和巴氏毕赤酵母y2及其益生菌制剂和应用
SU1722502A1 (ru) Препарат биоспорин дл профилактики и лечени желудочно-кишечных заболеваний человека
RU2491942C1 (ru) Способ профилактики микотоксикозов и желудочно-кишечных заболеваний животных

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005749360

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11919356

Country of ref document: US