WO2006088214A1 - 束化アクチンを用いたマイクロアクチュエータ - Google Patents

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WO2006088214A1
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actin
myosin
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microactuator
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Mizuki Hino
Kazuhiro Kohama
Ryoki Ishikawa
Akio Nakamura
Takashi Susai
Akiko Ohata
Kazuhiro Oiwa
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National Institute Of Information And Communications Technology, Incorporated Administrative Agency
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin

Definitions

  • the invention of this application relates to a substrate carrying myosin on the surface and carrying bundled actin thereon. More specifically, it relates to the microactu-yuyu using bundled actin.
  • myosin-actin microactuators immobilization of myosin is important.
  • myosin and its active site, HMM must be aligned on the substrate in a certain direction and at an appropriate density so that it can interact with the actin fiber while maintaining its enzymatic activity.
  • HMM active site
  • An object of the invention of this application is to provide an in vitro motility assay system on a substrate of bundled actin and a microactuator.
  • the invention of this application provides the following means in order to solve the above problems.
  • the invention of this application provides, firstly, a substrate carrying myosin on the surface and carrying bundled actin thereon.
  • the substrate according to the first invention wherein the substrate is made of glass.
  • the substrate surface There is provided a method for producing a substrate according to the second invention, wherein myosin is fixed after treatment with nitrocellulose.
  • the substrate according to the first aspect wherein the substrate is made of silicon.
  • the present invention provides a method for producing a substrate according to the fourth invention, wherein the substrate surface is treated with a nitrocell mouth and then myosin is fixed.
  • the sixth aspect of the present invention also provides a microphone outlet that uses a bundled actin obtained by processing a three-dimensional pattern on the substrate surface according to the first aspect of the invention.
  • the microactuator according to the sixth invention wherein the substrate is made of glass
  • the microactuator, according to the sixth invention wherein the substrate is made of silicon.
  • FIG. 1 is a photomicrograph of a motility assay of bundled actin on a glass substrate. Arrowheads indicate fluorescently labeled actin fibers.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of a motility assay of actin on a silicon substrate. Arrowheads indicate fluorescently labeled actin fibers.
  • FIG. 3 is a photomicrograph of a motility assay of bundled actin on a silicon substrate.
  • a known technique such as the focused ion beam processing method can be applied to create a three-dimensional pattern on the surface of the glass substrate.
  • the focused ion beam processing method accelerates gallium ions into an ion beam and narrows it down.
  • the This is a method of processing the sample surface by irradiating the sample surface and spattering it. This method has the feature that it can be processed with an accuracy of 0.1 m and can be processed while observing with a scanning ion microscope.
  • the glass substrate is coated with nitrocellulose.
  • the glass substrate is treated with 0.2 weight; 3 ⁇ 4 collodion solution before immobilization of myosin.
  • the collodion solution is preferably a solution in which the solute is piroxylin (nitrocellulose) and the solvent is isoamyl acetate (1-3-methylbutyl acetate).
  • the collodion solution is coated directly onto the glass substrate by pipetting, and immediately dried at 160.
  • a three-dimensional pattern on the surface of a silicon substrate can be produced by using a known technique applied in semiconductor production such as a reactive ion etching method.
  • a reactive ion etching method high-frequency power (for example, 13.56 MHz is common) is applied to the gas introduced into the apparatus to create a plasma state, and the + ions generated there are accelerated and collide with the substrate.
  • This is a method that promotes the etching reaction of carving grooves on the substrate surface through a physical chemical reaction.
  • the gas pressure is several Pa or less, the direction of ion movement is aligned. Therefore, processing in the direction perpendicular to the substrate is possible.
  • the introduced gas is preferably a compound containing a halogen such as fluorine or chlorine which easily reacts with the substrate material and easily generates a volatile substance.
  • the silicon substrate is coated with nitrocellulose before immobilization of myosin.
  • the silicon substrate is surface-treated with a sufficient amount of colloid solution.
  • the treatment is preferably carried out with a collodion solution of 0.02% by weight or more, more preferably 0.2% by weight, but the concentration of the collodion solution may be sufficient to treat the silicon substrate surface.
  • the collodion solution is preferably a solution in which the solute is piroxylin (nitrocellulose) and the solvent is isamyl acetate (acetic acid-3-methylptyl).
  • the collodion solution is pipetted directly onto the silicon substrate to coat, and immediately dried at 160.
  • Immobilization of myosin on the silicon substrate can be performed, for example, as follows.
  • cover the cover glass with petrolatum or double-sided tape as a spacer create a flow chamber, and fix it by directly acting myosin protein diluted in buffer solution here Turn into.
  • myosin opacactin of the invention of this application any actin and myosin can be used.
  • myosin for example, skeletal muscle myosin II purified from the rabbit back muscle can be used as recombinant myosin known in JP-A-2004-57152.
  • Mio Syn is not limited to full-length myosin, and only active sites such as HMM and SI may be used.
  • actin protein for example, actin purified from the rabbit back muscle or chicken breast muscle can be used. More preferably, a converged actin fiber known in J. Neurochem: 87 676-685 (2003) is used. The actin fibers are preferably converged by fascin, more preferably converged by brain-derived fascin. Purified actin can be stabilized and fluorescently labeled with Rhodamine-Firodin.
  • Ca 2+ activated myosin and Ca 2 + -suppressed myosin are immobilized on a silicon substrate by creating a concentration gradient.
  • the actin fiber moves to the side where the Ca 2+ activated myosin is arranged, and when the calcium ion concentration is lowered, the actin fiber moves to the side where the Ca 2+ inhibitory myosin is arranged.
  • actin fibers as a microactuator
  • the bundled fibers are moved in a groove constructed on a silicon substrate using the above-described method.
  • a plug having a size corresponding to the depth and width of the groove is placed at the end of the bundled cutin fiber in the traveling direction.
  • This plug moves when pressed by bundled actin fibers and functions as a microactuator.
  • the output is a linear motion, but the output can be turned into a rotational motion on the pinion-rack principle by processing a stopper and combining gears.
  • actin fibers In order to use actin fibers as a switching device, the movement (output) of actin fibers accompanying changes in calcium concentration (input) as fluorescence can be obtained using a motility assay system that can control movement by the above-mentioned force concentration. This can be done by detecting using a CCD camera.
  • motility assay A three-dimensional pattern was created on a glass substrate using the focused ion beam processing method.
  • the glass substrate was treated with 0.2 wt. 3 collodion solution and coated with nitrocellulose.
  • Myosin HMM was purified from Usagi skeletal muscle.
  • Actin was purified from chicken skeletal muscle and used as bundled lactin fiber by the action of rhodamine-phalloidin in the presence of brain-derived fascin.
  • Figure 1 shows the results.
  • the bundled actin fibers could be moved along a 3D pattern.
  • An in vitro motility assay using actin-myosin was attempted on a silicon substrate.
  • silicon substrate single crystal silicon for semiconductor was used.
  • Myosin was prepared from rabbit skeletal muscle.
  • Actin was prepared from chicken skeletal muscle and was fluorescently labeled with rhodamine-phalloidin.
  • the in vitro motility assay was performed using a fluorescence microscope in the same manner as in Example 1 according to a conventional method. As a result, regardless of the oxide removal process, the movement of actin on the silicon substrate is observed on the substrate coated with colloid. I was able to. For example, as shown in Fig. 2, it was confirmed that the actin fibers were moving over time.
  • Example 3 motility assay of bundled actin on a silicon substrate
  • the motility assay of actin fibers bundled with brain-derived fascin on a silicon substrate by the method of Example 2 was performed.
  • the movement of bundled actin was observed on a silicon substrate coated with collodion.
  • an in vitro motility assay system on a substrate of bundled actin and a microactuate overnight are realized.

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Abstract

表面にミオシンを担持させ、その上に束化アクチンを積載してタンパク質構成体を形成し、この表面を3次元加工して束化アクチンを作動部とするマイクロアクチュエータとする。束化アクチンの基板上でのinvitro　motility　assay系とマイクロアクチュエータを提供する。

Description

束化ァクチンを用いたマイクロアクチユエ一夕
【技術分野】
【0 0 0 1】
この出願の発明は、 表面にミオシンを担持し、 その上に束化ァクチン を積載した基板に関する。 より詳しくは、 束化ァクチンを用いたマイク ロアクチユエ一夕に関する。
[背景技術】
【0 0 0 2】
ミオシンーァクチン系のマイクロアクチユエ一ターでは、 ミオシンの 固相化が重要である。すなわち、ミオシンおよびその活性部位である HMM が酵素活性を維持したまま、 ァクチン繊維と相互作用を可能とするよう に一定の方向および適切な密度で基板上に整列配置されなければなら ないのである。 しなしながら、 基板上に直接的にミオシンを整列配置さ せても、 ァクチン繊維との相互作用は生じず、 規則的な整列およびミオ シン活性の維持が実現できなかった。
【発明の開示】
【 0 0 0 3】
この出願の発明は束化ァクチンの基板上での in vitro mot i l i ty assay系とマイクロアクチユエ一夕を提供することを課題とする。
この出願の発明は上記の課題を解決するために下記の手段を提供す る。
すなわち、 この出願の発明は、 第 1には、 表面にミオシンを担持し、 その上に束化ァクチンを積載した基板を提供する。 第 2には基板がガラ ス製である前記第 1発明にかかる基板を提供する。 第 3には基板表面を 二トロセルロースで処理した後にミオシンが固定されてなる前記第 2 発明にかかる基板の作成方法を提供する。
【0 0 0 4】
さらに、 この出願の発明は、 第 4には、 基板がシリコン製である前記 第 1発明にかかる基板を提供する。 第 5には、 基板表面をニトロセル口 ースで処理した後にミオシンが固定されてなる前記第 4発明にかかる 基板の作成方法を提供する。
【0 0 0 5】
また、 この出願の発明は、 第 6には、 前記第 1発明にかかる基板表面 を 3次元パターン加工してなる束化ァクチンを作動部とするマイク口 ァクチユエ一夕を提供する。 第 7には、 基板がガラス製である前記第 6 発明にかかるマイクロアクチユエ一夕を、 第 8には基板がシリコン製で ある前記第 6発明にかかるマイクロアクチユエ一夕をそれぞれ提供す る。
【図面の簡単な説明】
【0 0 0 6】
【図 1】 図 1は、 ガラス基板上での束化ァクチンの mot i l i ty assay の顕微鏡写真である。 矢じりは蛍光標識されたァクチン繊維を示す。
【図 2】 図 2は、 シリコン基板上でのァクチンの mot i l i ty assayの 顕微鏡写真である。 矢じりは蛍光標識されたァクチン繊維を示す。
【図 3】 図 3は、 シリコン基板上での束化ァクチンの mot i l i ty assay の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0 0 0 7】
この出願の発明において、 ガラス基板表面の 3次元パターンの作成は 収束イオンビーム加工法 （などの公知技術を適用できる。 収束イオンビ ーム加工法はガリウムイオンを加速してイオンビ一ムとし、 細く絞って サンプル面に照射し、 スパッ夕リングさせることでサンプル面を加工す る方法である。 この方法は 0. 1 mの精度での加工が可能であり、 また 、 走査型イオン顕微鏡による観察を行いながら加工することが可能であ るという特徵をもつ。
【0 0 0 8】
さらに、 ガラス基板は、 ニトロセルロースによる被覆処理を行う。 好 ましくはミオシン固定化の前に 0. 2重量; ¾のコロジオン溶液でガラス基 板を処理する。 コロジオン溶液は、 好ましくは溶質をピロキシリン （二 トロセルロース）、 溶媒を酢酸イソアミル （酢酸一 3—メチルブチル） と した溶液である。 コロジオン溶液をガラス基盤上に直接ピぺッ卜で滴下 して被覆し、 直ちに 160でで乾燥させる。
【0 0 0 9】
ガラス基板上へのミオシンの固定化は、 例えば次の通りとすることが できる。 すなわちガラス基盤はコロジオン溶液処理後、 ワセリンもしく は両面テープをスぺーサ一としてスライドグラスに被せ、 フローチャン パーを作成する。 ここに緩衝液中に希釈したミオシンタンパク質を直接 作用させることで固定化する。 ァクチン繊維の mo t i H ty as sayはこの チヤンバー内にゥシ血清アルブミン溶液、 蛍光標識ァクチン繊維の順で 緩衝液を還流し蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。 観察には、 好ま しくは高倍率 ·高開口数 （X 40 倍以上、 NA= 1 以上） の対物レンズを用 いる。
【0 0 1 0】
いっぽう、 シリコン基板表面の 3次元パターンの作成は反応性イオン エッチング加工法などの半導体作成において適用される公知技術を用 いることができる。 反応性イオンエッチング加工は、 装置に導入したガ スに高周波電力 （例えば 13. 56MHz が一般的である） を印加してプラズ マ状態とし、 そこで生じた +イオンを加速して基板に衝突させ、 物理化 学的反応を介して基板表面に溝を彫るエッチング反応を促進させる方 法である。 ガスの圧力を数 Pa以下にすると、 イオンの運動方向が揃う ので、 基板に対して垂直方向での加工が可能である。 エッチング反応を 生じさせるには、 被切削物質とガスが反応して揮発性物質が生成するこ とが必須である。 従って導入ガスは、 好ましくは基板材料と反応しやす く、 かつ、 揮発性物質を生じやすいフッ素、 塩素などのハロゲンを含む 化合物を用いることができる。
【0 0 1 1】
さらに、 シリコン基板は、 ミオシン固定化の前に、 ニトロセルロース による被覆処理を行う。 好ましくは、 シリコン基板を十分量のコロジォ ン溶液で表面処理する。好ましくは 0. 02重量 以上、より好ましくは 0. 2 重量％のコロジオン溶液で処理を行うが、 コロジオン溶液がシリコン基 板表面を処理するのに十分な濃度であればよい。 コロジオン溶液は、 好 ましくは溶質をピロキシリン （ニトロセルロース）、 溶媒を酢酸イソァ ミル （酢酸— 3—メチルプチル） とした溶液である。 コロジオン溶液を シリコン基板上に直接ピペットで滴下して被覆させ、 直ちに 160 で乾 燥させる。
【0 0 1 2】
シリコン基板へのミオシン固定化は、 例えば次の通りとすることがで きる。 すなわち、 シリコン基板はコロジオン処理後、 ワセリンもしくは 両面テープをスぺーサ一にしてカバーガラスを被せ、 フローチヤンバー を作成し、 ここに緩衝液中に希釈したミオシンタンパク質を直接作用さ せることで固定化する。 ァクチン繊維の mot i l i ty assayはこのチャン パー内にゥシ血清アルブミン溶液、 蛍光標識化ァクチン繊維の順番で緩 衝液を還流し、 蛍光顕微鏡を用いて行う。 観察には、 高倍率 ·高開口数 ( X 40倍以上、 NA= 1以上） の対物レンズを用いる。
【0 0 1 3】
この出願の発明のミオシンおょぴァクチンとしては、 任意のァクチン、 ミオシンを用いることができる。 好適なものとしては、 ミオシンとして は、 例えばゥサギ背筋より精製した骨格筋ミオシン I I ゃ特開 2004-57152号公報で公知の組換えミオシンを用いることができる。ミオ シンは全長ミオシンに限らず、 HMM、 SI等の活性部位のみを用いてもよ い。
【00 14】
ァクチンタンパク質としては、 例えばゥサギ背筋あるいはニヮトリ胸 筋より精製したァクチンを用いることができる。 より好ましくは J. Neurochem:87 676-685 (2003)で公知の収束化されたァクチン繊維を 用いる。 ァクチン繊維の収束化は好ましくはファシン、 より好ましくは 脳由来のフアツシンによつて収束化されたものを用いる。精製ァクチン はローダミンーフアイロジンを用いてファイバーの安定化と蛍光標識 を行うことができる。
【0 0 1 5】
Ca2+活性型ミオシンと Ca2+抑制ミオシンを用いて Ca2+濃度により動き を制御できる motility assayを実現することが可能である。この場合、 Ca2+活性型ミオシンと Ca2+抑制ミオシンを濃度勾配を作ってシリコン基 盤に固定化する。 カルシウムイオン濃度を高くすると Ca2+活性型ミオシ ンの並んだ側に、 カルシウムイオン濃度を低くすると Ca2+抑制ミオシン の並んだ側にァクチン繊維が動く。
【00 1 6】
さらに、 ァクチン繊維をマイクロアクチユエ一ターとして使用するに は上記の方法を用いて、 シリコン基板上に構築した溝の中で束化ァクチ ンの繊維の運動を行わせる。 その際、 束化クチン繊維の進行方向端に、 溝の深さと幅に応じた大きさの栓を置く。 この栓は束化ァクチン繊維に 押されて運動しマイクロアクチユエ一夕として機能する。 この例では出 力は直線運動であるが、 栓を加工し歯車を組み合わせることで、 ピニォ ン—ラックの原理で出力を回転運動にしてもよい。
【0 0 1 7】
ァクチン繊維をスィツチングデバイスとして使用するには、 上記の力 ルシゥム濃度により動きを制御できる motility assay系で、 カルシゥ ム濃度の変化 （入力） に伴うァクチン繊維の運動 （出力） を蛍光として CCDカメラを用いて検出することにより行うことができる。
以下に実施例を用いてこの出願の発明をさらに詳細に説明するが、 下 記実施例はこの出願の発明の一態様にすぎず、 この出願の発明の実施が 下記実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【0018】
〔実施例 1〕 ガラス基板上 3次元パターンでの束化ァクチンの
motility assay ガラス基板上に収束イオンビーム加工法を用いて 3次 元パターンを作成した。 ガラス基盤を 0.2重量 ¾のコロジオン溶液で処 理し、 ニトロセルロースで被覆した。 ミオシン HMMはゥサギ骨格筋より 精製したものを使用した。 ァクチンはニヮトリ骨格筋より精製し、 脳由 来のファシン存在下でローダミンーファロイジンを作用させ束化ァク チン繊維として使用した。 in vitro motility assayは定法に従い、 蛍 光顕微鏡 （Zeiss Axiovert 100、 対物レンズ X100、 NA=1.3) により行 つた。 この結果を図 1に示す。 束化ァクチン繊維を 3次元パターンに沿 つて運動させることができた。
【0019】
〔実施例 2〕 シリコン基板上でのァクチンの motility assay
ァクチン一ミオシンを用いた in vitro motility assayをシリコン基 板上で試みた。 シリコン基板は半導体用単結晶シリコンを使用した。 シ リコン基板は酸化膜の除去処理を行ったものと未処理のものそれぞれ について、 0.2%コロジオン溶液で 1分間コロジオンを表面に被覆する 処理を行ったものと未処理のもの、 計 4通りを使用した。 ミオシンはゥ サギ骨格筋より調製した。 ァクチンはニヮトリ骨格筋由来より調製し、 ローダミンーファロイジンで蛍光ラベルを施したものを使用した。 in vitro motility assayは定法に従い、 実施例 1と同様に蛍光顕微鏡によ り行った。 この結果、 酸化膜の除去処理の如何にかかわらず、 コロジォ ンで被覆された基板ではシリコン基板上でァクチンの動きを観察する ことができた。 例えば、 図 2に示す通り、 時間の経過とともにァクチン 繊維が移動している様子が確認できた。
【0020】
〔実施例 3〕 シリコン基板上での束化ァクチンの motility assay 上記実施例 2の手法でシリコン基板上で脳由来ファシンで束化した ァクチン繊維の motility assayを行った。 この結果、 図 3に示す通り、 コロジオンで被覆されたシリコン基板上で束化ァクチンの運動を観察 することができた。
【産業上の利用可能性】
この出願の発明により束化ァクチンの基板上での in vitro motility assay系、 および、 マイクロアクチユエ一夕が実現される。

Claims

請求の範囲 基板表面にミオシンを担持し、 その上に束化ァクチンを積載した タンパク質構成体。
基板がガラス製である請求項 1記載のタンパク質構成体。
基板表面をニトロセルロースで処理した後にミオシンが固定され てなる請求項 2記載のタンパク質構成体の作成方法。
基板がシリコン製である請求項 1記載の夕ンパク質構成体。
基板表面をニトロセルロースで処理した後にミオシンが固定され てなる請求項 4記載のタンパク質構成体の作成方法。
請求項 1記載の基板表面を 3次元パターン加工してなる束化ァク チンを作動部とするマイクロアクチユエ一夕。
基板がガラス製である請求項 6記載のマイクロアクチユエ一夕。 基板がシリコン製である請求項 6記載のマイクロアクチユエ一夕。
PCT/JP2006/303091 2005-02-15 2006-02-15 束化アクチンを用いたマイクロアクチュエータ WO2006088214A1 (ja)

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