KR101362119B1 - 항체가 고정된 진단용 소재 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게, 본 발명에 따른 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법은 a) 소재 표면을 초음파 세척하는 단계; b) 상기 소재 표면을 상온 및 상압에서 플라즈마 처리하는 단계; c) 상기 소재 표면에 에폭시 단량체를 그라프트 중합하는 단계; 및 d) 상기 소재 표면에 항체 단백질을 결합하는 단계;를 포함하여 수행되는 특징이 있다.

Description

항체가 고정된 진단용 소재 및 그 제조방법{Diagnostic Functional Surface Material Immobilizing Antibody and the Fabrication Method Thereof}
본 발명은 항체가 고정된 진단용 소재 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게, 본 발명은 상압 플라즈마를 이용하여 소재 표면에 반응 개시제를 형성한 후, 에폭시 단량체를 그라프트 중합(graft copolymerization)시키고, 항체를 소재 표면에 공유 결합시켜 항체가 고정된 진단용 소재를 제조하는 방법에 관한 것이다.
고체 소재의 표면 위에 단백질, 미생물, 효소 등의 생물고분자들을 고정화시키는 기술은 의약, 화학, 식품, 환경 등의 산업에 필수적인 기술로써, 최근 들어 많은 연구 및 개발이 진행되고 있다. 이 기술의 장점은 앞서 기술한 생물고분자들을 구조적으로 안정하고, 내구성이 있는 담체(고분자, 세라믹, 카본, 금속 등) 위에 고정함으로써 이들 물질들의 반응 및 전달에 안정성을 부여하고, 고가의 생물소재의 유실을 방지함으로써 생산 및 공정의 효율을 증대시킬 수 있다는 점이다.
생물 고분자를 고체 표면에 고정 시키는 기술을 응용한 제품인 진단용 튜브(tube) 및 96웰 플레이트(96 wall plate)가 개발 되어 시판 되고 있는데, 제품으로는 인간 면역 바이러스 테스트((HIV virus test), 가정용 임신 진단 테스트(home pregnancy test) 튜브 등이 있다.
이러한 진단 장비에는 즉 특정 단백질의 항원 항체를 검출 가능 하게 하는 생화학적 기술인 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)방법 등에 사용된다 (US2010/0221761A1, KR2010-0105974, KR2009-0118907, EP0820483). 이 방법은 고체 표면에 알려지지 않은 항원(생물 고분자)이 부착되어 있을 때 특정한 항체가 표면에 도입되면 항원-항체가 결합 할 수 있는 원리를 이용 한다. 도입된 항체에는 효소가 결합되어 있는데, 이 효소가 특정한 화학 물질에 의해서 색깔이 변화되며, 이것에 의해서 도입된 항체의 정성, 정량 분석이 가능 하다.
진단용 튜브를 만들기 위해 필요한 기술적 요소는 각 생물고분자(항원 또는 항체)들을 용도에 적합하게 소재 표면에 균일하고 안정하게 결합을 시키는 것이다. 결합방법에는 이온 결합, 공유 결합, 반데르발스 결합이 있는데 화학 결합인 앞서의 두 결합이 반데르발스 결합에 비하여 100배정도의 결합력을 갖고 있어 안정한 결합을 유지하기 위해서는 화학적인 결합으로 유도하는 것이 바람직하고 할 수 있다.
그러나, 많이 사용되는 폴리올레핀 고분자 담체 소재들의 경우에는 화학적으로 매우 안정하여 생물고분자들과의 화학결합을 유도하는데 어려움이 있다. 따라서, 각종 소재의 표면 위에 원하는 기능성 관능기를 용도에 적합하게 자유자재로 손쉽게 균일하게 도입할 수 있도록 이들 관능기들을 플라즈마 그라프팅 시키는 기술들이 최근 들어 활발히 보고되고 있다(KR2009-0118907, KR2007-0072897).
대표적인 표면 그라프트 중합 방법으로는 방사선 (Huh, M. W.; Kang, I.-K.; Lee, D.-H.; Kim, W. S.; Lee, D. H.; Park, L. S.; Min, K. E.; Seo, K. H. J. of Applied Polymer Science, 2001, 81, 2769), 플라즈마(Lee, S. D.;Hsiue, G.-H.; Chang, P. C.; Kao, C.-Y. Biomaterials, 1996, 17, 1599), 자외선(Loh, F. C.; Tan, K. L.; Kang, E. T.; Uyama, Y.; Ikada, Y. Polymer, 1995, 36, 21), 코로나 방전(Lei, J.; Liao, X. European Polymer Journal, 2001, 37, 77)등을 사용하여 표면에 고분자 중합의 개시제 역할을 할 수 있는 퍼옥사이드 등을 도입시키는 방법이 널리 사용되고 있다. 또한, 공기 또는 산소 존재 하에서 과산화물 (hydroperoxide)를 생성시킨 다음, 비교적 높은 온도에서 과산화물을 열분해 하여 단량체와 접촉하여 그래프팅 시키는 방법이 있다(Chen, Y.; Kang, E. T.; Neoh, K. G.; Tan, K. L. Polymer, 2000, 41, 327).
이들 표면개질 기술들이 갖는 대표적인 장점으로는 소재의 표면 특성만 변화시키기 때문에 전체(bulk) 특성은 본질적으로 그대로 유지되어 벌크가 갖고 있는 장점을 활용할 수 있다는 것이다(Hudis, M., in Techniques and Applications of Plasma Chemistry, eds. J. R. Hollahan and A. T. Bell, Ch. 3, 1974, Wiley, New York). 특히 플라즈마 처리는 다른 기술들에 비하여 소재의 표면 층에 국한하여 반응성 퍼옥사이드를 형성시키는 것으로 알려져 있다(Kulik, E. A.; Ivanchenko, M. I.; Kato, K.; Sano, S.; Ikada, Y. J. Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 1995, 33, 323).
플라즈마-유도 그라프트 공중합(plasma-induced graft co-polymerization)은 재료 표면에 여러 다른 관능기를 가진 고분자를 그라프트시키는데 널리 사용되었다(Kim, E. J.; Kang, I.-K.; Jang, M. K.; Park, Y. B. Biomaterials, 1998, 19, 239). 그라프트된 표면은 생물산업이나 생체의학 소재 산업에 직접 이용될 수 있고, 그라프트된 관능기는 PEO(Poly Ethylene Oxide)나 헤파린 같은 다른 고분자들을 다시 고정화하는데 활성점(active site, spacer)으로써의 역할을 한다.
일반적으로 상기 기술 내용에서와 같이 항체 표면 기능성 고정 진단용 소재 제조방법은 다양한 방법들이 시도되었으나, 항체 단백질과의 결합 효율이 낮으며, 제조 공정이 복잡하고, 제조 하는 방법에 있어 비용이 고가인 단점이 있어왔다.
본 발명 종래의 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 저 비용으로 높은 양산성을 가지며, 특히 항체의 효과적인 고정이 이루어지는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법을 제공하는 것이며, ELISA 방법을 이용한 진단용 튜브 및 플레이트인 바이오웰에 의한 진단 및 검출에 응용 가능한 항체가 고정된 진단용 소재를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법은 a) 소재 표면을 초음파 세척하는 단계; b) 상기 소재 표면을 상온 및 상압에서 플라즈마 처리하는 단계; c) 상기 소재 표면에 에폭시 단량체를 그라프트 중합하는 단계; 및 d) 상기 소재 표면에 항체 단백질을 결합하는 단계;를 포함하여 수행되는 특징이 있다.
상기 b) 단계에서, 상기 플라즈마 처리에 의해 상기 소재 표면에 중합 개시제의 역할을 수행하는 활성점(active site)이 형성되며, 상기 플라즈마 처리는 상기 소재 표면이 증류수, 다이아이오도메탄 및 에틸렌글리콜에서 선택된 하나 이상의 물질에 대해 0ㅀ 내지 5ㅀ의 접촉각을 갖도록 수행되는 특징이 있다.
상기 b) 단계의 플라즈마 처리는 100 내지 1000W의 파워, 1 내지 20LPM(ℓ/min)의 가스 주입속도 및 10 내지 1000초의 처리 시간으로 수행되는 특징이 있으며, 상기 가스는 아르곤, 헬륨, 산소, 암모니아 또는 이들의 혼합가스인 특징이 있다.
상기 b) 단계의 플라즈마 처리시, 상기 소재는 플라즈마 반응기 내에서 1 내지 500mm/sec의 속도로 이동하는 특징이 있다.
상기 c) 단계에서, 상기 에폭시 단량체의 그라프트 중합에 의해 상기 기판 표면에 항체를 기판에 고정시키는 관능기를 갖는 고분자가 형성되며, 상기 그라프트 중합의 중합도(GD)는 하기의 관계식 1을 만족하는 특징이 있다.
(관계식 1)
0.05 % ≤ GD(%)=(W-W0)/W0*100 ≤ 1.0 %
상기 관계식 1에서 W는 그라프트 중합 후 상기 소재의 중량이며, 상기 W0는 그라프트 중합 후 상기 소재의 중량이다.
상기 c) 단계의 상기 에폭시 단량체는 글리시딜 메타아크릴레이트(Glycidyl methacrylate), 글리시딜 아크릴레이트(Glycidyl acrylate), 1,2-에폭시-5-헥센(1,2-Epoxy-5-hexene), 1,2-에폭시-5-데센(1,2-Epoxy-9-decene), 3-메틸-2-옥시라닐-2-부틴올(3-Methyl-2-oxiranyl-2-butenol) 또는 이들의 혼합물인 특징이 있으며, 상기 c) 단계의 그라프트 중합은 10~30 부피%의 에폭시 단량체를 함유하는 단량체 용액을 이용하여 50 내지 90℃에서 0.5 내지 10시간동안 수행되는 특징이 있다.
상기 소재는 고분자 수지, 카본, 세라믹, 금속, 금속산화물 또는 이들의 혼합물인 특징이 있으며, 상기 고분자 수지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리메틸 메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리락틱 산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC) 또는 이들의 혼합물인 특징이 있다.
본 발명은 상술한 제조방법으로 제조된 항체가 고정된 진단용 소재를 포함하며, 상기 소재는 진단용 바이오웰(bio-well)의 튜브 또는 플레이트이며, ELISA 방법을 이용한 면역진단에 사용되는 소재인 특징이 있다.
본 발명은 기재 표면을 상압 플라즈마 처리한 후, 에폭시 단량체를 그라프트 중합시킴으로써, 대량의 활성점이 균일하게 형성 가능하며, 균일한 중합도를 갖는 에폭시 단량체의 중합체가 상기 소재에 공유 결합되어 고정되며, 그라프트 중합에 의해 기재 표면에 구비된 에폭시기에 의해 항체가 재현성 있게 높은 결합효율로 균일하게 결합하는 특징이 있다. 또한, 기재 표면에 아민기와 반응성이 우수한 에폭시 단량체를 그라프트 중합으로 결합하고 항체의 아민기와 반응시켜 항체를 보다 쉽게 고정화하여 면역 진단용으로 편리하게 사용할 수 있는 소재인 특징이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 제조방법을 도시한 일 공정도이며,
도 2는 반응시간에 따른 에폭시 단량체 그라프트 중합의 중합시간에 따른 소재 표면을 관찰한 주사전자현미경(SEM) 사진을 도시한 도면이며,
도 3은 본 발명의 제조방법으로 제조된 항체가 고정된 진단용 소재의 항체 결합을 확인하는 실시간 PCR 분석 결과를 도시한 도면이다.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*
100 : 소재 1 : 활성점
2 : 그라프트 중합된 고분자 3 : 항체
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 제조방법을 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다. 또한 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 출원인은 면역진단법에 사용 가능한 생화학물질이 구비된 기능성 소재를 제조하기 위해 다양한 소재 표면 처리 및 링커 형성에 대한 실험을 수행한 결과, 소재 표면을 특정 조건에서 플라즈마 처리한 후, 에폭시 단량체를 그라프트 중합시켜 링커로 사용하는 경우, 특히 항체의 결합력 및 결합 효율이 증대되며, 소재 표면에 극히 균일하게 항체가 결합되어 균질하게 기능화된 소재의 제조가 가능하며, 제조되는 기능성 소재의 제조 편차가 감소될 뿐만 아니라, 양산성 및 제조비용이 크게 절감되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
상세하게, 본 발명은 소재를 상온 및 상압에서 플라즈마 처리하여 반응성 개시제를 표면에 도입하고, 이 개시제를 이용하여 에폭시 단량체를 상기 소재 표면에 그라프트 공중합시켜 고분자를 형성한 후, 상기 에폭시 기능기에 항체를 화학적으로 결합시켜 항체가 고정된 진단용 소재를 제조하는 특징이 있다.
보다 상세하게, 본 발명에 제조방법은 본 발명에 따른 제조방법은 a) 소재 표면을 초음파 세척하는 단계, b) 상기 소재(100) 표면을 상온 및 상압에서 플라즈마 처리하는 단계, c) 상기 소재 표면에 에폭시 단량체를 그라프트 중합하는 단계 및 d) 상기 소재 표면에 항체 단백질을 결합하는 단계;를 포함하여 수행되는 특징이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법을 도시한 일 공정도로, 도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 제조방법은 소재(100) 표면을 초음파 세척한 후, 상기 소재(100) 표면을 상온 및 상압에서 플라즈마 처리하여 상기 소재(100) 표면에 퍼옥사이드, 옥시드, 히드록실, 아민, 히드라이드, 라디칼, 에폭시드 또는 그 밖의 화학적 잔기, 즉, 중합을 개시할 수 있는 관능기를 포함하는 활성점(active site, 1)을 형성한다. 이후, 상기 활성점(1)이 형성된 소재(100)에 에폭시 단량체를 함유하는 단량체 용액을 도포하거나, 상기 활성점(1)이 형성된 소재(100)를 단량체 용액에 침지하여 상기 소재 (100)표면에 에폭시 단량체를 그라프트 중합하여 에폭시기를 갖는 고분자를 형성한다. 이후, 상기 소재 표면의 에폭시기에 항체 단백질(아민기를 갖는 항체 단백질)을 화학적으로 결합시켜 본 발명에 따른 항체가 고정된 진단용 소재를 제조한다.
본 발명에 따른 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법에 있어서, 상기 플라즈마 처리하는 단계의 전단계로서 소재의 표면을 초음파 세척하는 단계가 수행되는데, 상기 초음파 세척 단계는 플라즈마 처리를 위한 소재의 표면에 포함된 불순물을 세척하여 소재 표면을 용이하게 플라즈마 처리할 수 있도록 하는 것으로서, 이러한 목적을 위한 소재의 표면 세척방법이라면 특별히 한정되지 않는다.
특정 양태로서, 상기 소재 표면을 세척하는 단계는 증류수를 이용하여 초음파 세척하거나, 유기용매를 이용하여 초음파 세척하거나 또는 증류수를 이용하여 초음파 세척한 후 유기용매를 이용하여 초음파 세척하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 세척에 사용되는 유기용매는 에틸 알코올을 포함한다.
상기 세척된 소재는 플라즈마 처리 전에 대기 중에 포함된 산소 및/또는 수분과의 접촉을 차단하기 위해 진공 상태로 보관하는 것이 바람직하다. 초음파 세척은 소재 표면에 이물질을 제거함으로써 플라즈마 처리시 원하지 않는 처리 부분이 생기는 것을 미연에 방지하는 기능을 하다.
본 발명에 따른 소재는 산업분야에서 사용되는 통상적인 소재라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 고분자 수지, 카본소재, 세라믹, 금속, 금속 산화물 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
여기서, 상기 고분자 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 고분자수지라면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 폴리올레핀류, 폴리스타이렌류, 폴리할로올레핀류, 폴리비닐류, 폴리아크릴레이트류, 폴리메타아크릴레이트류, 폴리디엔류, 폴리옥사이드류, 폴리설파이드류, 폴리에스테르류, 폴리아마이드류, 폴리카보네이트류 또는 이들의 혼합물; 보다 바람직하게는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리메틸 메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리락틱 산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC) 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
특정적으로, 상기 고분자 수지인 소재로서 폴리프로필렌(polyproplylene, PP)을 사용하는 것이 좋으나 반드시 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에 따른 플라즈마 처리는 상온 대기압(상압) 플라즈마를 사용하는 특징이 있다. 상기 상온 상압 플라즈마 처리에 의해 소재에 대량의 활성점이 균일하게 형성 가능하며, 균일한 중합도를 갖는 에폭시 단량체의 중합체가 상기 소재에 공유 결합되게 된다.
상기 플라즈마 처리는 100 내지 1000W의 파워, 1 내지 20LPM(ℓ/min)의 가스 주입속도 및 10 내지 1000초의 처리 시간으로 수행되는 특징이 있다. 사이 플라즈마 파워, 가스 주입속도와 소재 처리 시간이 너무 작으면 플라즈마 처리가 완전히 되지 않고, 너무 크면 공정 비용과 공정시간 증가에 의해 생산성이 떨어지는 문제점이 있다. 상기 주입가스는 소재, 예를 들면 고분자 수지, 카본소재, 세라믹, 금속, 금속산화물 또는 이들의 혼합물로 이루어진 소재의 종류에 따라 선택적으로 변경 가능하지만, 바람직하게는 아르곤, 헬륨, 산소, 암모니아 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
추가적으로, 상기 플라즈마 처리단계에서 처리되는 소재는 1 내지 500mm/sec의 속도로 이동할 수 있다. 상기 소재의 이동 속도는 플라즈마 반응기 내에서 소재가 이동하는 속도를 의미하는 것이다. 상기 소재의 이동 속도가 1 mm/sec보다 늦으면 공정시간으로 생산성이 떨어지며, 500 mm/sec 보다 빠르면 플라즈마 처리가 완전히 되지 않는 문제점이 있다. 이때, 상기 소재의 이동은 특정한 방향이 중요한 것이 아니라, 플라즈마가 발생하는 위치, 예를 들면 플라즈마 방전이 발생하는 위치가 고정될 경우 상기 플라즈마 소재의 표면에 골고루 플라즈마를 제공하기 위해 소재의 각 표면이 플라즈마가 발생하는 위치를 통과하도록 하기 위함이다.
특정 양태로서, 본 발명에 따른 플라즈마 처리를 위해 사용 가능한 플라즈마 처리장치는 직류 또는 교류 방식을 모두 포함하며, 10-8 내지 1000 토르(torr) 의 넓은 압력 범위에서 조작 가능하고, 플라즈마 발생시 주입가스의 온도가 300˚C 이상 상승하지 않는 장치를 포함한다. 또한, 소재의 플라즈마 처리를 위해서 사용하는 플라즈마 반응기는 플라즈마를 용이하게 발생시킬 수 있는 반응기라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 처리시간과 처리속도 및 플라즈마 처리시 시편 홀더와 글로우 방전(glow discharge) 사이의 높이 조절이 가능한 평판형 장치를 포함하도록 구성되는 것이 좋다.
본 발명에 있어, 상기 소재의 상기 플라즈마 처리시, 상기 소재 표면이 증류수, 다이아이오도메탄 및 에틸렌글리콜에서 선택된 하나 이상의 물질에 대해 0ㅀ 내지 5ㅀ의 접촉각을 갖도록 수행되는 특징이 있다.
상기 플라즈마 처리에 의해 상기 접촉각을 갖도록 소재가 표면처리됨에 따라, 상기 소재 표면에 균질하게 에폭시 단량체의 그라프트 중합 수행되는 특징이 있으며, 그라프트 중합 후 소재 표면에 구비된 에폭시기에 항체 단백질이 균일하게 결합되게 된다.
상기 그라프트 중합은 질소를 포함한 불활성 분위기 또는 진공중에서 수행되며, 상기 소재 표면의 활성점을 반응 개시제로 하여, 에폭시기를 함유하는 단량체인 에폭시 단량체를 그라프트 중합하는 특징이 있다. 상기 에폭시 단량체는 글리시딜 메타아크릴레이트(Glycidyl methacrylate), 글리시딜 아크릴레이트(Glycidyl acrylate), 1,2-에폭시-5-헥센(1,2-Epoxy-5-hexene), 1,2-에폭시-5-데센(1,2-Epoxy-9-decene), 3-메틸-2-옥시라닐-2-부틴올(3-Methyl-2-oxiranyl-2-butenol) 또는 이들의 혼합물인 특징이 있다.
상기 소재에 상기 에폭시 단량체를 그라프트 중합시킴으로써, 항체를 효과적으로 결합할 수 있게 한다. 상세하게, 상기 그라프트 중합에 의해 소재 표면에 에폭시기가 형성되며, 상기 에폭시기는 단백질의 아미노산 중 아민기와 반응하여 항체를 소재 표면에 고정시킨다. 상기 에폭시기는 아민기와 결합력이 매우 우수하여, 상기 소재 표면에 단시간에 매우 안정적으로 항체가 고정되며, 소재에 물리적/화학적 처리가 이루어지더라도 안정적으로 항체가 소재 표면에 고정될 수 있는 특징이 있다.
상기 그라프트 중합은 상온 대기압 플라즈마로 처리된 소재에 에폭시기를 함유하는 단량체가 용해된 단량체 용액을 도포하거나, 상기 소재를 상기 단량체 용액에 침지하여 수행되는 특징이 있으며, 상세하게, 상기 그라프트 중합은 10~30 부피%의 에폭시 단량체를 함유하는 단량체 용액을 이용하여 50 내지 90℃에서 0.5 내지 10시간동안 수행되는 특징이 있다.
상기 그라프트 중합의 중합도(GD(%))는 하기의 관계식 1을 만족하는 특징이 있으며, 소재가 상온 상압 플라즈마 처리에 의해 0° 내지 5°의 접촉각을 갖도록 표면처리 되고, 하기의 관계식 1을 만족하도록 중합됨으로써, 소재 표면에 그라프트 중합에 의해 형성된 에폭시기가 부착된 항체간 입체장애 없이 균일하게 항체와 결합하는 표면 밀도를 갖게 된다.
(관계식 1)
0.05 % ≤ GD(%)=(W-W0)/W0*100 ≤ 1.0 %
상기 관계식 1에서 W는 그라프트 중합 후 상기 소재의 중량이며, 상기 W0는 그라프트 중합 후 상기 소재의 중량이다.
본 발명에 따른 제조방법에서 사용 가능한 항체는 면역진단법에 사용하는 항체 또는 이들의 혼합물인 특징이 있으며, 보다 구체적으로는 HAV (Hepatitis A virus) 항체, HBV (Hepatitis B virus) 항체, HCV (Hepatitis C virus) 항체, HEV (Hepatitis E virus) 항체, 웨스트 나일 바이러스 (West Nile virus)항체, 아데노 바이러스(Adeno virus) 항체, 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pnewumoniae) 항체, 헤르페스 바이러스 (Herpes virus) 항체, HTLV-I, II (Human T lymphotropic virus) 항체, 파보 바이러스 B19 (Parvovirus B19) 항체, VZV (Varicella zoster virus) 항체, AFP (Alpha Feto Protein) 항체, CEA (Carcinoembryonic antigen) 항체를 포함한다.
상온 대기압 플라즈마 처리 및 에폭시 단량체의 그라프트 중합
소재로서 3cmㅧ3cm 크기로 자른 폴리프로필렌(PP) 바이오웰(bio-wall)을 2차 증류수에 넣은 후 초음파 세척기(US/B3510E-DTH, Branson, 미국)로 10분간 초음파 세척하였다. 세척된 PP 바이오웰을 에틸 알코올에 넣은 후 초음파 세척기로 1분간 초음파 세척하였다. 세척 후 PP 바이오웰 표면에 남아 있는 세척액을 제거하기 위해 진공 오븐(Model HST 501VS, 한백에스티, 대한민국) 내에서 1시간 동안 건조시켰다. 건조된 바이오웰 이 대기 중의 산소 및/또는 수분과 접촉하는 것을 방지하기 위해 상기 진공 오븐 안에서 감압 하에 보관하였다.
세척된 8 스트립(strip) PP 바이오웰을 대기압 플라즈마 장치(Model EPPs 2000, 창조엔지니어링, 대한민국)의 시료 고정대에 올려놓은 후 글로방전(glow discharge)의 하단부에 위치시켰다. 그 다음, 디지털 센서를 이용해 200W의 전력에서 아르곤(Ar) 주입가스를 6LPM으로 흘려주면서, 상온에서 2분 동안 플라즈마 처리하였다.
플라즈마 처리된 시편을 대기 중에서 5분간 노출시킨 후, 그라프트 중합반응에 사용하였다. 에폭시 단량체로 글리시딜 메타아크릴레이트를 사용하였으며, 단량체 용액의 용매로 에탄올을 사용하였으며, 하기의 표1에 따라 그라프트 중합을 수행하였다. 이때, 중합반응에 사용된 모든 용매와 단량체들은 내부 함유 산소를 제거하기 위해 디가싱(degassing)을 수행하였다.
(표 1) 중합 조건
Figure 112011036282995-pat00001
도 2는 중합시간에 따른 PP 바이오웰 표면을 관찰한 전자현미경(SEM) 사진으로, 도 2의 PP-biowell은 세척 후의 폴리프로필렌 소재를 의미하며, PP-plasma는 플라즈마 처리된 폴리프로필렌 소재를 의미하며, PP-GMA는 글리시딜 메타아크릴레이트가 그라프트 중합된 폴리프로필렌 소재를 의미하며, 1h at 60℃, 2h at 60℃ 및 3h at 60℃는 실시예 1 내지 3의 단량체 농도가 10 ~ 30 부피%인 단량체 용액을 이용하여 수행된 중합반응의 반응 시간(1h, 2h, 3h) 및 중합 온도(60℃)를 의미한다. 도2의 주사전자현미경 사진에서 흰 점들은 글리시딜 메타아크릴레이트가 그라프트 중합된 중합체이다.
진공 산소 플라즈마 처리 및 에폭시 단량체의 그라프트 중합
실시예 1~9과 동일한 방법으로 실시하되, 상온 대기압 플라즈마 대신 진공 산소플라즈마(Plasmart Co., 대한민국)를 사용하여 8 스트립 PP 바이오웰을 100W에서 1분 동안 처리하였다. 진공 산소플라즈마 처리된 PP 바이오웰을 하기의 표2에 따라 그라프트 중합을 수행하였다.
(표 2) 중합 조건
Figure 112011036282995-pat00002
표면 에폭시 관능기의 정량적 분석
실시예 1~9, 비교예 1~9에서 제조한 에폭시 함유 관능기가 표면에 균일 도입된 바이오웰을 이용하여 생물 활성물질의 흡착 성능 시험을 수행하기 위해서 바이오 웰 표면의 에폭시에 대한 아민-황-형광 DNA (amine dithiol fluorescein modification oligonucleotide; 이후 DNA로 표기함)을 이용하여 결합효율 (binding efficiency)을 측정하였다.
실시예 1~9, 비교예 1~9에서 제조된 PP 바이오웰(이하, PP-GMA 소재로 표기함) 각각에 바인딩 버퍼(binding Buffer; 100mM Sodium carbonate buffer)에 DNA를 넣은 용액 200μl를 첨가 한 후 (DNA 양:500 pmol) 상온에서 4시간 인큐베이션(Incubation)시켜 결합(binding) 시켰다. 이후, 상층액을 0.5ml 일반 튜브에 옮긴 후 빛을 차단하여 보관하였다. 용액을 제거한 PP-GMA 소재를 세척 버퍼(Washing Buffer; Phosphate buffered Saline containing 0.05%(v/v) TWEEN 20) 200μl를 사용하여 3회 세척한 후, 50℃ 오븐에서 건조시켰다. 각 PP-GMA 소재에 DTT(dithiothreitol) 용액 100mM(100μl/Tube)를 분주 후 상온에서 30분 반응시켰으며, 상층액을 Fluoroskan(96type 형광 측정 장비) 플레이트에 옮긴 후, Tris-HCl(pH8.0 100μl)를 첨가하여 490-520nm 파장에서 형광 측정에 의해서 결합효율(Binding efficiency)을 확인하였다. PP-GMA 소재의 에폭시와 DNA의 결합효율(Binding efficiency)은 표준 검정곡선을 이용하여 결정하였다.
PP-GMA 소재에 DTT(100mM) 처리 후 상층액을 회수하여 형광을 측정한 결과를 표 3에 도시하였다. 표 3에서 블랭크(blank)는 DNA를 포함하지 않은 초순수의 형광측정값을 의미한다.
(표 3) DTT 처리 후 회수된 용액으로부터 DNA측정에 의한 결합 효율
Figure 112011036282995-pat00003
대표적인 결과를 도시한 표 3에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따라 제조된 모든 PP-GMA 소재는 20% 이상의 매우 높은 결합 효율을 가지며, 시편들 간의 편차 또한 작음을 확인 할 수 있으며, 진공 플라즈마로 처리된 시편의 경우 결합효율이 매우 낮으며 시편간의 편차가 큰 것을 확인하였다.
항체의 고정
상기 실시예 1 내지 9에서 제조한 PP-GMA 소재에 항체를 결합하기 위하여, HBV(Hepatitis B virus)의 표준 항체를 PP-GMA 소재 표면에 화학적으로 결합시켜 항체가 고정된 진단용 소재를 제조하였다. HBV(Hepatitis B virus)는 B형 간염 바이러스로 급성 및 만성 간염을 일으키는 병원균으로 알려져 있다. 전 세계적으로 2억명이 감염 된 것으로 알려져 있으며, WHO 2009년 9월 발표 자료에 따르면 매년 60만명이 B형 간염으로 사망하는 것으로 알려져 있다.
HBV 항체를 0.1 ㎍/㎖ 농도로 완충용액(Phosphate Buffered Saline - PBS, pH=7.4)에 용해시킨 후, 상기 실시예 1 내지 9에서 제조한 PP-GMA 소재에 100ul씩 분주한 후 4℃에서 16시간 이상 고정시켰다. 그 후 PBS-T(PBS+0.1%Tween 20) 완충용액으로 고정되지 않은 항체를 세척하여 제거하고, PP-GMA 소재 내의 비특이적인 결합을 억제시키고자 1% BSA(Bovine serum albumin)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
PCR을 통한 항체 고정화 확인
비특이적 결합을 억제하기 위한 BSA 처리가 이루어진 후, HBV 항체가 고정된 PP-GMA 소재를 PBS-T 완충용액으로 세척한 후 100ng/㎖ 농도의 HBV 항원을 상온에서 1시간 동안 결합시키고, PBS-T 완충용액으로 결합하지 않은 항원을 세척하였다.
상기 결합된 HBV항원에 0.2ug/ml의 바이오틴이 결합된(biotinylation) 다른 HBV항체를 1시간 동안 상온에서 결합시키고, PBS-T 완충용액으로 결합하지 않은 항체를 세척하였다. 다시 0.1ug/ml의 스트랍타비딘(Streptavidin)을 1시간 동안 결합시키고, PBS-T 완충용액으로 결합하지 않은 항체를 세척하였다. 결합된 복합체 (complex)에 다시 1, 0.01, 0.0001ng/ml의 바이오틴이 결합된(biotinylation) DNA를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS-T 완충용액으로 3번 세척하였고, 다시 PBS 완충용액으로 5번 세척하였다. 이후 정량 PCR 반응을 수행하였다.
항체 표면 기능성의 항체 결합(binding) 효율을 보기 위한 정량 PCR 반응은 일반적인 PCR 반응과 같이 한 쌍의 프라이머를 사용하고, PCR 산물인 DNA를 검출하기 위하여 PCR반응 시에 붙어서 매 사이클마다 형광 값을 나타내는 택맨 프로브(TaqMan Probe)를 사용하여 수행하였다. 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 20초의 45회 반복으로 PCR을 수행하면서 각 사이클마다 신장기(extention)에 형광값을 판독하였다. PCR 반응이 끝나면 분석 프로그램으로 분석하였다. PCR 프로토콜은 95℃에서 10분, 95℃에서 30초, 55℃에서 20초 및 플레이트 판독(형광값 검출)이 순차적으로 수행되었으며, 이러한 프로토콜이 45회 반복 수행되었다. 그 결과, 도 3에서와 같이 실시예 8에서 제조한 PP-GMA 소재에서 형광 값이 검출 되는 것을 확인하였다. 이는 PP-GMA 소재에 항체가 잘 결합(binding)되었다는 것을 의미한다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 소재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 삭제
  2. a) 소재 표면을 초음파 세척하는 단계;
    b) 상기 소재 표면을 상온 및 상압에서 플라즈마 처리하는 단계;
    c) 상기 소재 표면에 에폭시 단량체를 그라프트 중합하는 단계; 및
    d) 상기 소재 표면에 항체 단백질을 결합하는 단계;
    를 포함하며,
    상기 b) 단계에서,
    상기 플라즈마 처리는 상기 소재 표면이 증류수, 다이아이오도메탄 및 에틸렌글리콜에서 선택된 하나 이상의 물질에 대해 0° 내지 5°의 접촉각을 갖도록 수행되는 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 C) 단계에서,
    상기 그라프트 중합의 중합도(GD)는 하기의 관계식 1을 만족하는 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
    (관계식 1)
    0.05 % ≤ GD(%)=(W-W0)/W0*100 ≤ 1.0 %
    (상기 관계식 1에서 W는 그라프트 중합 후 상기 소재의 중량이며, 상기 W0는 그라프트 중합 후 상기 소재의 중량이다.)
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 b) 단계의 플라즈마 처리는 100 내지 1000W의 파워, 1 내지 20LPM(ℓmin)의 가스 주입속도 및 10 내지 1000초의 처리 시간으로 수행되는 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 가스는 아르곤, 헬륨, 산소, 암모니아 또는 이들의 혼합가스인 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 c) 단계의 상기 에폭시 단량체는 글리시딜 메타아크릴레이트(Glycidyl methacrylate), 글리시딜 아크릴레이트(Glycidyl acrylate), 1,2-에폭시-5-헥센(1,2-Epoxy-5-hexene), 1,2-에폭시-5-데센(1,2-Epoxy-9-decene), 3-메틸-2-옥시라닐-2-부틴올(3-Methyl-2-oxiranyl-2-butenol) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 c) 단계의 그라프트 중합은 10~30 부피%의 에폭시 단량체를 함유하는 단량체 용액을 이용하여 50 내지 90℃에서 0.5 내지 10시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 소재는 고분자 수지, 카본, 세라믹, 금속, 금속산화물 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 고분자 수지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리메틸 메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리락틱 산(polylactic acid, PLA), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  10. 제 4항에 있어서,
    상기 소재는 플라즈마 반응기 내에서 1 내지 500mm/sec의 속도로 이동하는 것을 특징으로 하는 항체가 고정된 진단용 소재의 제조방법.
  11. 제 2항 내지 제10항에서 선택된 어느 한 항에 따라 제조된 항체가 고정된 진단용 소재.
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