KR101051336B1 - 생체물질 고정용 기판, 이의 제조방법 및 이를 구비한 바이오칩 - Google Patents

생체물질 고정용 기판, 이의 제조방법 및 이를 구비한 바이오칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체물질 고정용 기판, 이의 제조방법 및 이를 구비한 바이오칩에 에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 플라스틱 기판; 실리콘 질화물, 실리콘 산질화물, 또는 실리콘 산화물 박막 중에서 선택된 1종의 실리콘 박막; 및 친수성기를 갖는 자기조립박막이 순차적으로 적층된 구조를 갖는 생체물질 고정용 기판, 이의 제조방법 및 이를 구비한 바이오칩에 관한 것이다.
상기 생체물질 고정용 기판은 고밀도로 생체물질의 고정이 가능하여 신호대 잡음비가 향상되고, 높은 신뢰도로 분석이 가능한 저가의 플라스틱 바이오칩의 양산에 적합하다.
플라스틱, 자기조립박막, 생체물질, 바이오칩, 분석

Description

생체물질 고정용 기판, 이의 제조방법 및 이를 구비한 바이오칩{Substrate for supporting bioactive materials, fabrication method thereof, and biochip comprising the same}
본 발명은 고밀도로 생체물질의 고정이 가능하여 신호대 잡음비가 향상되고, 높은 신뢰도로 분석이 가능하며 저가인 플라스틱 바이오칩의 양산에 적합한 생체물질 고정용 기판, 이의 제조방법 및 이를 구비한 바이오칩에 관한 것이다.
바이오칩은 미세한 전기소자들이 모여 이뤄진 집적회로로서 생물의 유전자나 이 유전자를 이루는 DNA, 단백질, 항체 등이 무기물인 소형 박막에 부착된 구조를 갖는다. 상기 바이오칩은 고밀도의 생체분자(유전물질)들이 고체 표면에 집적화되어 있어 단시간에 많은 양의 생물정보에 대한 검색이 가능하다.
바이오칩의 종류로는 고체 위에 부착시키는 생체분자의 종류에 따라 DNA칩, 단백질칩, 세포칩 등으로 나뉘며, 이들 DNA, 단백질 또는 세포와 반응할 수 있는 항체, 수용기, 리간드, 핵산 및 탄수화물 등의 관련 물질을 단일 칩 상에 고밀도로 고정화시켜 DNA, 단백질 또는 세포에 대한 정보를 찾아낸다.
현재 바이오칩은 혈액 검사, 혈당 분석 등 여러 임상진단에 사용되며 유전자 분석과 신약개발에도 활용되고 있다. 나아가 수질 및 해양 오염도 측정이나 오염물질 검출, 생화학 무기 검출, 생체 인식 시스템 등에도 응용될 수 있다.
바이오칩의 기판 재질로는 고밀도로 생체물질을 고정화하고, 기판과 생체물질 간의 안정한 결합을 이루는 광학적으로 투명한 기판인 것이 가능하다.
이에 기판 재질로 소다 라임과 같은 유리 재질이 가장 널리 사용되고 있다. 유리 기판은 표면 개질이 용이하고, 우수한 광학 특성을 가질 뿐만 아니라 채널에서 유체의 흐름이 원활히 이루어져 각종 분석이 용이하다는 이점이 있다. 그러나 미세 공정이 실리콘에 비해 매우 까다로우며 공정(세정, 감광제 코팅, 사진 식각, 에칭, 세정) 비용이 매우 비싼 단점이 있다. 또한, 공정 중 에칭에 사용되는 용액이 강산, 강염기이므로 폐기물이 발생하는 등 환경오염과 같은 다양한 문제를 안고 있어 유리 기판을 이용한 바이오칩의 양산화가 용이하지 않다.
이에 유리 기판을 대체할 수 있도록 금속이나 무기재료 또는 플라스틱 재질 등 다양한 물질이 기판 재료로 제안되었다.
특히 플라스틱 재질의 경우 가공성, 광학 특성, 공정의 용이성, 대량 생산 비용 절감 등 많은 장점을 지니고 있어 상용화 재료로 많은 연구가 수행되고 있다. 플라스틱을 기판으로 사용하는 경우 사출 성형(Injection molding), 레이저 어블레이션(Laser ablation), 임프린팅(Imprinting), 핫엠보싱(Hot embossing)과 같은 다양한 방법 이용이 가능하여 가공에 대한 선택폭이 넓어지고, 유체 흐름에 유리한 표면을 형성할 수 있으며, 가격이 싸고 공정의 선택이 비교적 자유롭다는 장점이 있다.
그러나 이러한 이점에도 플라스틱 기판의 경우 분자 구조 내 소수성 관능기로 이해 소수성 표면을 갖는데(PMMA의 경우 76°접촉각), 이러한 표면 특성으로 인해 수용액의 낮은 젖음성을 유발하여 유체의 흐름이 원활하지 못한 문제점이 발생한다. 또한, 대부분의 생체물질이 소수성 표면과 소수성 결합 및 반데르발스 결합에 의하여 비특이적 흡착이 발생하여 유체칩으로 사용하는 경우 그 성능을 저하시킬 수 있다. 더욱이, 플라스틱 기판 표면에 생체물질의 고정이 어렵고 그 결과 분석 결과의 신뢰도가 크게 저하한다.
이를 해소하기 위해 플라스틱 기판의 표면에 극성 관능기를 도입하여 기판 표면의 젖음성(wettability)이나 부착성(adhesion) 등을 증가시킬 수 있는 다양한 개질 방법이 제안되었다.
플라스틱 기판의 개질은 크게 물리적 표면 개질 방법과 화학적 표면 개질 방법으로 나뉜다.
물리적 표면 개질 방법으로는 플레임(Flame)을 이용한 고분자 표면 처리하는 방법; 코로나 방전(Corona Discharge Treatment); 플라스마 처리(Plasma Treatment; Ablation and Transfor-mation); 자외선 조사(UV Irradiation) 등의 방법이 있다. 대표적인 플라스틱 기판인 PMMA 혹은 PC 등으로 제작된 미세 유체 채널의 경우는 자외선/오존 처리를 통하여 표면에 COOH, OH 관능기를 먼저 도입하는 방법이 알려져 있다. 그러나 이러한 물리적 표면 개질 방법은 처리 공정이 간편하나 플라스틱의 표면 개질이 일시적이고 장기간 사용시 소수성 성질로 다시 변환하거나, 일부 방법의 경우 장치가 고가인 문제가 있다.
또한, 화학적 표면 개질 방법으로는 금속 증착(Metalization); 플라즈마를 이용한 고분자 중합(Plasma Polymerization); 고분자 그라프팅(Polymer Grafting); 가수 분해(Hydrolysis); 자기조립박막 적층 방법(SAM deposition) 등 방법이 있다. 상기 화학적 표면 개질 방법은 개질이 영구적이라는 이점이 있으나 자기조립박막 등의 경우 기판과의 낮은 접착력을 갖고 공정의 민감성과 폐기물로 인한 양산적용의 한계가 있다.
상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 기판으로 플라스틱 재질을 사용하여 생체물질을 고정화하는 방법과 바이오칩의 양산에 대해 다각적으로 연구를 수행한 결과, 플라스틱의 물리적 표면 개질과 화학적 표면 개질 방법을 적절히 조합함으로써 플라스틱 기판의 친수성 개질이 영구적이면서도 환경에 무해할 뿐만 아니라 양산 적용이 가능함을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 친수성 관능기가 고밀도로 존재하여 생체물질이 고밀도로 고정될 수 있는 생체물질 고정용 기판을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 기판의 표면 개질이 장시간 동안 유지되고 양산 적용이 가능한 생체물질 고정용 기판의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 DNA, 단백질 및 항체를 포함하는 다양한 생체물질의 고정을 통해 높은 신뢰도로 분석이 가능한 바이오칩을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한 다.
또한, 본 발명은 DNA, 단백질 및 항체를 포함하는 다양한 생체물질의 고정화가 용이하며, 유체의 흐름이 용이한 친수성의 높은 젖음성을 통해 높은 신뢰도로 분석이 가능한 바이오칩을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 표면의 친수성 개질을 통해 생체물질이 소수성 표면과 소수성 결합 및 반데르발스 결합에 의한 비특이적 흡착을 방지함으로써, 신호대 잡음비(signal to noise ratio)를 향상시키는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
플라스틱 기판;
실리콘 질화물, 실리콘 산질화물, 또는 실리콘 산화물 박막 중에서 선택된 1종의 실리콘 박막; 및
친수성기를 갖는 자기조립박막이 순차적으로 적층된 구조를 갖는 생체물질 고정용 기판을 제공한다.
또한, 본 발명은
플라스틱 기판 상에 실리콘 질화물, 실리콘 산질화물, 또는 실리콘 산화물 박막 중에서 선택된 1종의 실리콘 박막을 형성하는 단계;
상기 실리콘 박막 표면의 수산기(-OH)의 밀도를 증가시키기 위해 산소 플라즈마 처리를 수행하는 단계; 및
상기 실리콘 박막 상에 친수성기를 갖는 자기조립박막을 형성하는 단계
를 포함하는 생체물질 고정용 기판의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생체물질 고정용 기판에 생체물질이 고정된 바이오칩을 제공한다.
본 발명에 따른 생체물질 고정용 기판은 소수성의 플라스틱 기판의 표면을 친수성으로 개질하고, 상기 친수성이 영구적으로 유지되어 고밀도의 생체물질 고정화가 가능하다.
상기 생체물질 고정용 기판은 단백질, DNA, RNA, 항원, 항체 또는 효소를 이용한 어레이칩이나 유체칩과 같은 다양한 바이오칩에 적용이 가능하다.
상기 바이오칩은 고밀도로 생체물질의 고정이 가능하여 신호대 잡음비가 향상되어 높은 신뢰도로 분석이 가능하다. 이러한 바이오칩은 플라스틱 기판을 사용함에 따라 다양한 공정 선택이 가능하여 저가의 플라스틱 바이오칩 양산을 가능케 한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 생체물질 고정용 기판을 보여주는 도면이다. 도 1을 참조하면, 생체물질 고정용 기판(10)은 플라스틱 기판(1); 실리콘 박막(3); 및 친수성기(R)를 갖는 자기조립박막(5)이 순차적으로 적층된 구조를 갖 는다.
플라스틱 기판(1)은 투명한 고분자로, 에스테르계 고분자, 실리콘 고분자, 아크릴계 고분자, 올레핀계 고분자, 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 1종의 재질을 포함한다. 바람직하기로는 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리실란, 폴리디메틸실록산, 폴리실라잔, 폴리아크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸아크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 사이클릭 올레핀 폴리머, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이미드, 폴리스타이렌, 폴리아세탈, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에스테르설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐리덴플로라이드, 퍼플루오로알킬 고분자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다. 더욱 바람직하기로 플라스틱 기판(1)으로는 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 사이클릭 올레핀 폴리머(COC) 또는 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)를 사용한다.
이때, 플라스틱 기판(1)은 도면상에는 시트 형의 기판으로 표시하였으나, 유연성 있는 필름, 복수 개의 마이크로웰을 구비한 시트형, 또는 유로 채널과 같은 패턴이 형성된 다양한 형태 및 구조를 갖는다. 일례로, 마이크로웰은 플라스틱 기판(1) 상에 동일 간격으로 종횡(縱橫)으로 배치되어 있어 어레이칩으로 적용이 가능하다. 상기 마이크로웰은 원통형, 다면체, 역원뿔형, 또는 역각뿔형의 다양한 형상을 가지며 기판 상에 10∼10000개가 형성되며, 그 수 및 크기는 적용 분야에 따라 다양하게 변화가 가능하다.
그러나 플라스틱 기판(1)은 소수성을 나타내 생체물질의 고정이 용이하지 않 으므로, 본 발명에서는 상기 플라스틱 기판(1) 상에 실리콘 박막(3)을 형성하여 생체물질 고정용 기판(10) 표면을 친수성으로 개질한다. 상기 실리콘 박막(3)은 실리콘 질화물, 실리콘 산질화물, 또는 실리콘 산화물 박막 중에서 선택된 1종이 가능하며, 바람직하기로는 실리콘 산화물을 사용한다.
대표적인 플라스틱 기판 재질인 PMMA의 경우 접촉각이 76°로 소수성을 나타내는 것에 반해 실리콘 산화물 박막의 경우 공기와 접촉하여 표면에 수산기(-OH)가 형성되어 이들 수산기에 의해 접촉각이 0°를 가져 극친수성을 갖는다. 그러나 실리콘 박막 표면에 형성된 수산기는 그 밀도가 낮아 효과적으로 생체물질의 고정이 어렵다. 이에 본 발명에서는 후속에서 설명하는 바와 같이 산소 플라즈마 처리를 통해 실리콘 박막(3)의 표면에 존재하는 수산기(-OH)의 2∼10배가량 밀도가 증가시킨다. 이렇게 고밀도의 수산기로 인해 후속에서 형성되는 자기조립박막의 밀도를 더욱 높일 수 있으며, 결과적으로 자기조립박막 내 친수성기와 결합하는 생체물질의 고정 밀도를 보다 증가시킬 수 있다. 바람직하기로 산소 플라즈마 처리 후에도 0°로 극친수성을 갖는다.
본 발명에 따른 실리콘 박막(3)의 두께는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으나, 플라스틱 기판(1)의 소수 특성을 충분히 개질할 수 있도록 1∼100nm, 바람직하기로 5∼50nm의 두께를 갖는 것이 바람직하다. 만약 그 두께가 상기 범위 미만이면 기판의 친수성 개질이 미비하고, 상기 범위를 초과하게 되면 크랙이 발생하는 등의 문제가 발생하므로, 상기 범위 내에서 적절히 형성한다.
상기 실리콘 박막(3) 상에 생체물질과의 결합을 위해 친수성기를 갖는 자기 조립박막(5)이 형성된다. 상기 자기조립박막(5)은 분자 구조 내 비교적 긴 알킬기를 갖고, 그 말단에 실리콘 박막(3)의 표면에 존재하는 다수의 수산기(-OH)와 상호작용하여 공유 결합이 가능한 관능기를 갖는 분자들로 이루어져, 실리콘 박막(3)의 표면에 2차원적으로 정렬하는 자기조립(self-assembly) 현상을 통해 단분자막(monolayer)을 형성한다. 이러한 자기조립박막(5, SAM)은 실리콘 박막(3)과 결합하지 않는 일측 말단에 친수성기로 친수성 관능기인 수산기(-OH), 아민기(-NH2), 알데하이드기(-C(=O)H), 카르복실기(-C(=O)OH) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함한다. 단백질이나 핵산의 경우 주요 구성 성분이 아미노산으로, 자기조립박막(5) 표면에 존재하는 친수성 관능기로 인해 분석하고자 하는 시료로 투입되는 단백질 등의 생체물질이 기판(10)에 안정적으로 고정된다.
본 발명에 따른 자기조립박막(5)은 매우 높은 결합력을 가지며 안정적이고 균일한 표면을 가져 생체활성 물질과 용이하게 결합하여 생체활성 물질을 고정하는 역할을 하며, 1∼10nm의 두께로 형성된다.
자기조립박막(5)을 구성하는 물질은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며 자기조립박막을 형성할 수 있는 재질이면 어느 것이든 가능하다. 바람직하기로, 상기 자기조립박막(5)은 하기 화학식 1로 표시되는 물질이 가능하다.
[화학식 1]
R1-(CH2)n-Si-(R2)3
(이때, R1=OH, NH2, COH, 또는 COOH이고, R2는 Cl 또는 OCmH2m+2의 알콕시(alkoxy), n은 1 내지 6이고, m은 1 내지 6이다)
상기 화학식 1의 화합물은 트리클로로실란 또는 트리알콕시실란이 가능하며, 더욱 바람직하기로 아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane), 아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane), 아미노트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), 아미노프로필디에톡시메틸실란(3-Aminopropyl(diethoxy)methylsilane), 트리에톡시실릴프로필써시닉언하이드라이드 ((3-triethoxysilylpropyl)succinic anhydride) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 1종이 가능하다.
상기 화학식 1의 화합물은 분자 내 Cl 또는 알콕시기인 OCmH2m+2과 실리콘 박막(3)의 수산기(-OH)와 화학적 결합을 통해 실리콘 박막(3)에 수직으로 고정되며, 고정되지 않는 일 말단은 수산기(-OH), 아민기(-NH2), 알데하이드기(-C(=O)H), 카르복실기(-C(=O)OH)는 기판 표면으로 노출되어 기판에 친수성을 부여한다.
또한, 분석하고자 하는 대상에 따라 자기조립박막(5)의 표면을 다른 적절한 친수성 관능기로 개질이 가능하다. 일례로, 본 발명의 실시예에서는 아미노프로필트리에톡시실란으로 표면이 아민기를 갖는 친수성 박막을 글루타알데하이드로 처리하여 상기 아민기와 글루타알데하이드를 반응시켜 표면이 알데하이드기를 갖도록 개질할 수 있다. 이러한 표면 처리를 위한 물질은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 일례로 글루타알데하이드, 아세트산 등 이 분야에서 공지된 바의 재질이면 어느 것이든 사용 가능하다.
이렇게 개질된 생체물질 고정용 기판(10)은 접촉각이 25∼48°의 친수성 특징을 지니며 이를 통해, 플라스틱 채널 상에서 유체의 원활한 흐름과 표면에 단백질 및 DNA와 같은 생체물질의 고정이 용이하고 영구적으로 표면 개질이 가능하다. 이뿐만 아니라, 플라스틱 기판 외에도 재료에 관계없이 모든 물질의 표면을 생체 안정성이 뛰어난 친수성 표면으로 개질이 가능하다.
전술한 바의 생체물질 고정용 기판의 제조는 다양한 증착 및 코팅 공정, 즉 건식 공정과 습식 공정의 수행을 통해 이루어진다.
본 발명의 구현예에 따른 생체물질 고정용 기판은
플라스틱 기판 상에 실리콘 질화물, 실리콘 산질화물, 또는 실리콘 산화물 박막 중에서 선택된 1종의 실리콘 박막을 형성하는 단계;
상기 실리콘 박막 표면의 수산기(-OH)의 밀도를 증가시키기 위해 산소 플라즈마 처리를 수행하는 단계; 및
상기 실리콘 박막 상에 친수성기를 갖는 자기조립박막을 형성하는 단계를 거쳐 제조된다.
이하 각 단계별로 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명한다. 도 2는 생체물질 고정용 기판의 제조 순서를 보여주는 도면이다.
먼저, 생체물질 고정용 기판을 제조하기 위해 소수성 플라스틱 기판(1)을 준 비한다(도 2a). 상기 플라스틱 기판(1)은 필요한 경우 사용 전에 이물질 또는 불순물 제거를 위해 초음파를 이용한 IPA 클리닝 공정을 수행한다.
상기 플라스틱 기판(1)은 시트, 필름, 마이크로웰, 유로 채널이 형성된 기판 등 유체칩 또는 어레이칩과 같은 바이오칩에 적용될 수 있는 다양한 형태의 것을 사용한다.
다음으로, 플라스틱 기판(1) 표면에 실리콘 질화물(SiN), 실리콘 산질화물(SiON) 및 실리콘 산화물(SiO)과 같은 실리콘 박막(3)을 형성한다(도 2b).
상기 실리콘 박막(3)의 형성은 통상의 건식 증착법 및 습식 증착법이 사용될 수 있으며, 일례로, 스퍼터링, 이온빔 증착법, 화학적 증착법, 및 플라즈마 증착법과 같은 건식 증착법, 또는 졸-겔 코팅, 딥 코팅, 닥터 블레이드법, 스핀 코팅(spin coating), 또는 스프레이 코팅과 같은 습식 코팅법이 가능하며, 바람직하기로는 플라즈마 증착법(PECVD)이 가능하다.
플라즈마 증착법을 통한 실리콘 박막(3)의 형성은 증착 공정 챔버 내에 플라스틱 기판(1)을 위치시키는 단계, 상기 플라스틱 기판(1) 상에 플라즈마 처리 공정을 수행하는 단계, 및 실리콘 함유 가스, NH3, 질소 함유 가스, 산소 함유 가스, 및 이들의 조합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 가스로 기판 상에 100℃ 이하의 온도에서 실리콘 박막(3)을 증착하는 단계의 연속 단계로 이루어진다.
이때 플라즈마 처리 가스 형태, 플라즈마 처리 가스 유량, 플라즈마 전력 레벨, 플라즈마 압력, 플라즈마 처리 시간의 조절을 통해 다양한 조성의 실리콘 박 막(3)의 형성이 가능하다.
실리콘 박막(3)으로 실리콘 산화물을 형성하는 경우 Ar, He, Xe, Kr 및 이들의 혼합 가스를 포함하는 불활성 가스를 이용하여 플라즈마를 처리한 다음, 5∼1000W의 RF 전력, 0.1∼5.0 토르의 압력 하에 40∼200℃(공정 온도는 플라스틱의 Tg점에 관련됨), 바람직하기로 80℃의 증착 온도 하에서 SiH4와 같은 실리콘 함유가스를 50∼600sccm의 유량으로, N2O와 같은 산소 함유 가스를 50∼1000sccm의 유량으로 유동시킴으로써 증착될 수 있다.
실리콘 질화물(SiN) 박막은 10∼1000W의 RF 전력을 인가하고 SiH4와 같은 실리콘 함유 가스를 100∼500sccm의 유량으로, NH3와 같은 질소 함유 가스를 100∼500sccm의 유량으로 주입하여 형성한다.
또한, 실리콘 산질화물(SiON) 박막은 5∼600W의 RF 전력, SiH4와 같은 실리콘 함유가스를 10∼500sccm의 유량으로, N2O와 같은 산소 함유 가스를 10∼1000sccm의 유량으로, 및/또는 N2와 같은 질소 함유 가스를 10∼1000sccm의 유량으로 유동시킴으로써 증착이 가능하다.
이러한 실리콘 박막(3)은 플라스틱 기판(1)에 대해 양호한 접착 특성이 있으며, 수십 나노 수준으로 증착되었기 때문에 플라스틱 기판(1)의 투명도를 어느 정도 유지할 수 있다.
다음으로, 실리콘 박막(3)을 산화 플라즈마 처리하여 실리콘 박막(3) 표면 내 수산기(-OH)의 밀도를 높인다(도 2c).
산화 플라즈마 처리는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 공지된 바의 방법이 가능하며, 기판으로 플라스틱 재질을 사용함을 고려하여 상온 상압에서 수행하는 것이 바람직하다.
일례로, 플라즈마 처리 장치의 챔버 내 실리콘 박막(3)이 형성된 플라스틱 기판(1)을 위치시킨 후 전압을 인가하여 비활성 가스 및 활성가스를 주입하여 플라즈마를 발생시켜 실리콘 박막(3) 표면 내 수산기(-OH)를 도입한다.
상기 비활성 가스는 아르곤(Ar) 또는 헬륨(He)을 사용하고, 활성가스는 수산기를 형성할 수 있도록 산소가 사용될 수 있으며, 이들은 99:1∼95:5 부피 비의 비활성 가스 및 관능기-함유 가스를 1∼20 ℓ/분의 유속으로 플라즈마 생성 장치로 주입하는 것이 바람직하다.
플라즈마 발생시의 인가 전압은 100∼600W, 바람직하게는 300W에서 수행하고, 플라즈마 처리는 0.1∼10 mm/초의 속도로 0.1∼5분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 이때 플라즈마 처리 속도나 처리시간이 상기 범위 미만이면 전극에서 스파크가 발생하게 되고, 상기 범위를 초과하면 플라즈마가 효과적으로 발생되지 않는 문제점이 있다.
이러한 공정에 따라 실리콘 박막(3) 표면에 극성 관능기인 수산기가 도입되어 상기 실리콘 박막(3)의 친수성을 더욱 높일 수 있다. 특히 본 발명에서와 같이 산소 플라즈마 처리 공정을 수행함에 따라 단순 PECVD나 일반 습식 코팅에 의해 형 성된 실리콘 박막 상에 존재하는 수산기의 밀도보다 2∼10배 정도 높아 후속에서 형성되는 자기조립박막의 밀도를 더욱 높일 수 있다.
다음으로, 고밀도의 수산기(-OH)기가 형성된 실리콘 박막(3) 상에 자기조립박막(5)을 형성한다(도 2d).
자기조립박막(5)은 수산기, 아민기, 알데하이드기, 카르복실기 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성기를 포함하는 용액을 이용하여 자기조립박막 방법을 이용하여 형성한다.
필요한 경우, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 자기조립박막(5)은 특정 개질 친수성기(R')를 갖도록 추가로 개질한다. 이때 개질 친수성기는 R'는 OH, NH2, COH, COOH, -CONH-, -SO3H -OSO3H -PO(OH)2 -NH- 등이 가능하다.
상기 자기조립박막(5)은 바이오칩은 이용하고자 하는 분야에서 요구되는 특정 친수성기를 포함한다.
구체적으로, 화학식 1의 실란 화합물을 희석 용매에 첨가하여 코팅 조성물로 제조한 다음, 실리콘 박막(3)에 습식 코팅법을 이용하여 코팅 후, 건조하여 박막을 형성한다.
상기 희석 용매는 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매가 가능하며, 상기 유기 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올, 메틸 셀루솔브, 에틸 셀루솔브, 디메틸포름아마이드, 디메틸포름아세테이트, 아세톤 등이 가능하다.
상기 자기조립박막의 관능기의 밀도는 이소티오시아네이트, 숙신이미드 에테르로 활성화시킨 FITC(fluorescein isothiocyanate), STN-TMR(tetraethylrhodamine isothiocyanate), SIE-숙신이미드(tetramethylrhodamine succinimide)과 같은 염색물질로 처리하여 라벨(label)화시켜 레이저빔을 연속적으로 조사하여 염색물질에서 유발되는 빛을 분속하여 알 수 있다. 밀도 분석 결과(표면 성분 분석) 본 발명에 따라 제조된 생체물질 고정용 기판은 매우 안정된 고정화 관능기를 높은 밀도로 균일하게 형성할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 생체물질 고정용 기판에 고정된 생체물질을 포함하는 바이오칩을 제공한다.
이러한 바이오칩은 다양한 분야, 즉 IT(Information Technology), BT(Bio Technology), ET(Environment Technology), NT(nano technology), AT(Agriculture Technology) 또는 이들의 융합 분야 등 다양한 분야에 적용이 가능하다. 일예로, 상기 고감도 어레이칩은 단백질이나 핵산 등의 생체분자 분석에 사용이 가능하다.
즉, 생체물질은 자기조립박막의 표면에 존재하는 친수성 관능기, 즉, 아민, 카르복실산 등과 반응하여 고정이 가능한 것이면 어느 것이든 가능하다. 일예로, 단백질, 펩타이드, DNA, RNA, 항원, 항체, 효소, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신 경세포인 어레이칩 또는 유체칩을 포함하는 바이오칩일 수 있다.
이러한 바이오칩은 표면의 친수성 개질을 통해 생체물질이 소수성 표면과 소수성 결합 및 반데르발스 결합에 의한 비특이적 흡착을 방지함으로써, 신호대 잡음비(signal to noise ratio)를 향상시킨다.
생체물질의 고정은 자기조립박막 표면의 관능기와 직접 반응할 수 있는 생체물질의 경우 생체물질을 PBS 버퍼 용액에 넣고 실온에서 1∼24시간 동안 교반을 통해 고정화한다. 그러나 직접 반응하는 관능기가 없는 경우 추가의 개질 공정을 거치는데, 일예로 아미노기가 결합된 생체물질 고정용 기판에 글루타알데하이드를 넣고 1∼24시간 동안 교반 후 세척하여 알데하이드기를 도입한 다음, 생체물질이 함유된 PBS 버퍼 용액에 넣고 실온에서 1∼24시간 동안 교반을 통해 고정화한다.
상기 생체물질이 기판에 고밀도로 고정이 가능하다. 또한, 마이크로미터 단위 미만의 평면도를 유지하여 칩 전체를 스캔하여 분석하는 경우에도 기존의 평면칩을 이용하는 경우와 동일하게 측정이 가능하다.
또한, 고가의 배열장치가 필요하지 않으며, 원하는 패턴에 쉽게 바이오 물질을 고정화할 수 있으므로, 사용자 친화적인 플랫폼 제작이 가능하다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예와 실험예를 제시한다. 그러나 하기한 예는 본 발명의 바람직한 일 예일 뿐 이러한 예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1
생체물질 고정용 기판 제조
PMMA 기판을 이소프로필알코올과 초음파를 이용하여 표면을 전처리한 다음, PECVD 챔버에 장착하였다. 5% SiH4/He를 150sccm(공정조건)과 N2O 가스를 700sccm 주입한 후 70℃, 1000mtorr, 30W에서 2분 20초 동안 반응시켜 2nm 두께의 실리콘 옥사이드 박막을 증착하였다.
이어서 상온 상압 하에 챔버 내 산소를 100sccm, 300 W 에서 1분 동안 주입하여 산소 플라즈마 처리를 수행하였다. 다음으로, APTES(아미노프로필트리에톡시실란) 용액(각각 3%, 6%)을 liquid self assembled monolayer(L-SAM)을 이용하여 질소 건조하여 2nm 두께의 자기조립 박막을 형성하여 PMMA/SiO2/아민 SAM층으로 구성된 생체물질 고정용 기판을 제조하였다(도 4a 참조).
단백질 고정
상기 PMMA/SiO2/아민 SAM층으로 이루어진 생체물질 고정용 기판을 글루타알데하이드 용액(25%)에 24시간 동안 침지시키고, 증류수로 세척한 후 표면에 존재하는 아민기를 알데하이드기로 개질하였다(도 4b 참조).
이어 CY5 형광 염색체가 표지된 BSA 단백질(CY5-BSA)을 PBS 완충 용액에 넣은 용액을 제조하고, 여기에 상기 기판을 침지시킨 후 실온에서 1시간 교반하여 상기 기판에 표지 단백질을 고정하였다.
XPS 분석
상기 제작된 생체물질 고정용 기판 내 SAM 계면의 화학결합상태를 알아보기 위해 XPS 분석(X-ray photonelectron spectroscopy)을 수행하였다.
도 5의 (a)는 PMMA, PMMA/SiO2, 생체물질 고정용 기판(APTES 3%), 생체물질 고정용 기판(APTES 6%)의 XPS 그래프 및 (b)는 이의 확대도이다. 도 5를 참조하면, 낮은 질량의 수소원소를 제외한 질소원소가 존재함을 알 수 있다. 또한, 확대도를 보면, APTES에서 유래된 N 원자의 함량이 4.52∼4.54% 수준으로, SiO2 박막 상에 단분자막(SAM)으로 형성됨을 알 수 있다.
실험예 2
접촉각 측정
생체물질 고정용 기판 제조시 APTES 농도를 각각 3%, 6%로 제조한 다음, 여기에 기판을 10분∼120분 동안 침지시켜 시간에 따른 접촉각 변화를 확인하여 친수화도 변화를 살펴보았다.
도 6은 APTES 용액의 농도 및 처리 시간에 따른 접촉각 변화를 보여주는 이미지로, 기판의 접촉각이 27°∼48°를 나타내 친수성 범위의 접촉각을 가짐을 알 수 있다.
형광강도 측정
상기 제조된 생체물질 고정용 기판에 형광염색물질 CY5로 라벨링하여 레이저 빔을 조사하고 발광되는 빛을 Scanarray (형광 스캐너)를 이용하여 발광 이미지를 검출 한 후 형광강도를 측정하였다.
도 7은 APTES 용액의 농도 및 처리 시간에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 이미지이다. 이때 도 6에서 제시한 형광 강도의 수치가 높을수록 표면에 고정된 아민기의 수가 많다는 것이고, 이러한 다수의 아민기의 존재는 그 하부의 SiO2의 표면에 OH기가 다수 존재하는 것을 의미한다.
도 7에서 나타낸 바와 같이, APTES의 농도 보다는 처리 시간이 길수록 기판의 친수성이 향상되고, 비교예 1의 PMMA 단독의 560과 SiO2의 840과 비교하여 볼 때 활성기인 아민기가 고밀도로 안정하게 유지됨을 알 수 있다.
실험예 3
상기 실험예 1에서 APTES(3%)로 120분간 처리하여 제조된 기판의 관능기의 안정성 시험을 수행하였다. 하기 표 1은 기판 제조 후 2주 동안 방치된 후 접촉각 변화를 보여준다.
1일 3일 7일 14일
접촉각 43° 47° 46° 46°
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 2주 후에도 접촉각이 큰 변화를 나타내지 않아 표면의 아민기가 SiO2 박막 상에 안정하게 고정되어, 친수 특성이 일시적이 아닌 영구적으로 유지됨을 알 수 있다.
Au 나노 입자 시험
도 8은 30일 후 Au 나노 입자 시험을 수행한 사진이다. 도 8에서와 같이, 30일이 지난 후에도 Au와 아민 표면의 전기적 결합(charge interaction)으로 인한 결합력을 가지며 아민기가 기판에 안정하게 고정됨을 알 수 있다.
실험예 4
형광 강도 측정
상기 산소 플라즈마 처리/미처리 기판 상에 3%의 APTES 용액으로 1시간 동안 처리하여 자기조립박막을 형성하고, 형광염색물질 CY5로 라벨링하여 레이저 빔을 조사하고 발광되는 빛을 Fluorescence Scanner (형광 스캐너)를 이용하여 형광 이미지를 검출 한 후 형광강도를 측정하였다.
그 결과 산소 플라즈마 처리된 기판의 경우 형광강도(a.u)가 11561인 것에 비해, 미처리 기판의 경우 984로 측정되었다. 이러한 수치는 산소 플라즈마를 통해 SiO2 박막 상에 고밀도의 수산기가 형성되고, 형성된 수산기에 결합된 아민기의 수가 높음을 의미하는 것으로, 산소 플라즈마 처리를 통해 기판의 친수화도를 향상시키고 바이오칩의 감도를 더욱 높일 수 있음을 알 수 있다.
실험예 5
본 발명에 따른 생체물질 고정용 기판을 이용하여 유체칩을 제조하고, 이를 이용한 유체 흐름성을 측정하였다. 이때 유체칩의 제조는 국방과학 연구소 과제로 주)SD 와 공동으로 진행하였다.
도 9는 PMMA로만 제조된 유체칩과, PMMA/SiO2/아민 SAM층이 증착된 기판으로 제조한 유체칩의 흐름성을 보여주는 도면이다.
도 9를 참조하면, 본 발명에 따라 SiO2/아민 SAM층으로 개질된 유체칩의 경우 흐름성이 좋고, 미개질된 유체칩의 경우 흐름성이 크게 저하됨을 알 수 있다.
실험예 6
플라스틱 기판으로 PMMA 대신 PET 및 COC를 이용하여 생체물질 고정용 기판을 제조한 다음, 그 표면에 CY5 형광 염색체가 표지된 BSA 단백질(CY5-BSA)을 고정하였다. 하기 표 2는 PMMA, COC 및 PET 기판에 Bare 기판과, SiO2/아민 SAM층으로 개질한 기판의 형광 강도를 보여주는 이미지이다.
형광강도(a.u) PMMA COC PET
미개질 기판 560 3402 785
개질 기판 13412 12376 14787
상기 표 2를 참조하면, 표면 개질된 기판의 경우 발광 강도가 훨씬 우수하여 더욱 많은 양의 단백질이 기판에 고정됨을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에서 제시된 방법으로 인해 플라스틱 기판의 소수성을 SiO2의 박막 형성 및 산소 플라즈마 처리를 통해 수산기의 밀도를 높여 친수성으로 보다 효과적으로 개질할 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 생체물질 고정용 기판은 바이오칩으로 적용하여 단백질이나 핵산 등의 생체분자 분석에 사용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 생체물질 고정용 기판을 보여주는 입체 단면도이다.
도 2의 (a) 내지 (d)는 생체물질 고정용 기판의 제조 순서를 보여주는 순서도이다.
도 3은 본 발명의 다른 구현예에 따른 생체물질 고정용 기판을 보여주는 입체 단면도이다.
도 4의 (a)는 실험예 1에서 생체물질 고정용 기판의 제조순서를 보여주는 이미지 도면이고, (b)는 단백질을 고정함을 보여주는 도면이다.
도 5의 (a)는 PMMA, PMMA/SiO2, 생체물질 고정용 기판(APTES 3%), 생체물질 고정용 기판(APTES 6%)의 XPS 그래프 및 (b)는 이의 확대도이다.
도 6은 APTES 용액의 농도 및 처리 시간에 따른 접촉각 변화를 보여주는 이미지이다.
도 7은 APTES 용액의 농도 및 처리 시간에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 이미지이다.
도 8은 30일 후 Au 나노 입자 시험을 수행한 사진이다.
도 9는 PMMA로만 제조된 유체칩과, PMMA/SiO2/아민 SAM층이 증착된 기판으로 제조한 유체칩의 흐름성을 보여주는 도면이다.

Claims (13)

  1. 플라스틱 기판;
    실리콘 질화물, 실리콘 산질화물, 또는 실리콘 산화물 박막 중에서 선택된 1종의 실리콘 박막; 및
    친수성기를 갖는 자기조립박막이 순차적으로 적층된 구조를 갖는 생체물질 고정용 기판.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플라스틱 기판은 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리실란, 폴리디메틸실록산, 폴리실라잔, 폴리아크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸아크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 사이클릭 올레핀 폴리머, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이미드, 폴리스타이렌, 폴리아세탈, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에스테르설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐리덴플로라이드, 퍼플루오로알킬 고분자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것인 생체물질 고정용 기판.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 실리콘 박막은 두께가 1∼100nm인 것인 생체물질 고정용 기판.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 친수성기는 수산기, 아민기, 알데하이드기, 카르복실기, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것인 생체물질 고정용 기판.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자기조립박막은 R1-(CH2)n-Si-(R2)3 (이때, R1=OH, NH2, COH, 또는 COOH이고, R2는 Cl 또는 OCmH2m+2의 알콕시(alkoxy)이고, n은 1 내지 6이고, m은 1 내지 6이다)로 표시되는 트리클로로실란 또는 트리알콕시실란인 것인 생체물질 고정용 기판.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 자기조립박막은 펜틸트리클로로시란(Phenethyltrichlorosilane: PETCS), 페닐트리클로로실란(Phenyltrichlorosilane: PTCS), 벤질트리클로로실란(Benzyltrichlorosilane: BZTCS), 토일트리클로로실란(Tolyltrichlorosilane: TTCS), 2-[(트리메톡시실일)에틸]-2-피리딘(2-[(trimethoxysilyl)ethl]-2-pyridine: PYRTMS)), 4-바이페닐일트리메톡시실란(4-biphenylyltrimethowysilane: BPTMS), 옥타데실트리클로로실란(Octadecyltrichlorosilane: OTS), 1-나프틸트리메톡시실란(1-Naphthyltrimehtoxysilane: NAPTMS), 1-[(트리메톡시실일)메틸]나프탈 렌(1-[(trimethoxysilyl)methyl]naphthalene: MNATMS) 및 (9-메틸안트라세닐)트리메톡시실란{(9-methylanthracenyl)trimethoxysilane: MANTMS}으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것인 생체물질 고정용 기판.
  7. 플라스틱 기판 상에 실리콘 질화물, 실리콘 산질화물, 또는 실리콘 산화물 박막 중에서 선택된 1종의 실리콘 박막을 형성하는 단계;
    상기 실리콘 박막 표면의 수산기(-OH)의 밀도를 증가시키기 위해 산소 플라즈마 처리를 수행하는 단계; 및
    상기 실리콘 박막 상에 친수성기를 갖는 자기조립박막을 형성하는 단계
    를 포함하는 생체물질 고정용 기판의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 실리콘 박막의 형성은 스퍼터링, 이온빔 증착법, 화학적 증착법, 및 플라즈마 증착법을 포함하는 건식 증착법, 또는 졸-겔 코팅, 딥 코팅, 닥터 블레이드법, 스핀 코팅(spin coating), 또는 스프레이 코팅을 포함하는 습식 코팅법 중 하나의 방법으로 수행하는 것인 생체물질 고정용 기판의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 플라즈마 증착법은 플라스틱 기판 상에 Ar, He, Xe, Kr 또는 이들의 혼합 가스를 포함하는 불활성 가스를 이용하여 플라즈마 처리 공정을 수행하는 단계, 및 실리콘 함유 가스, NH3, 질소 함유 가스, 산소 함유 가스, 및 이들의 조합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 가스 혼합물로 기판 상에 100℃ 이하의 온도에서 실리콘 박막을 증착하는 것인 생체물질 고정용 기판의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 산소 플라즈마 처리는 20∼100℃에서 Ar, He, Xe, Kr의 불활성 가스를 이용하여 플라즈마를 발생한 다음, 0.5∼5 torr 압력하에 산소를 50∼5000sccm의 유량으로 주입하여 1분 동안 수행하는 것인 생체물질 고정용 기판의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 자기조립박막은 수산기, 아민기, 알데하이드기, 카르복실기 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 친수성기를 포함하는 용액을 코팅 후 건조하여 제조하는 것인 생체물질 고정용 기판의 제조방법.
  12. 제1항의 생체물질 고정용 기판, 및
    상기 기판에 고정된 생체물질을 포함하는 바이오칩.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 생체물질은 단백질, DNA, RNA, 항원, 항체 또는 효소인 것인 바이오칩.
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