KR20090093039A

KR20090093039A - 당단백질 분석용 바이오칩 세트

Info

Publication number: KR20090093039A
Application number: KR1020080018342A
Authority: KR
Inventors: 김학성; 김영필; 박선영; 오은규
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2008-02-28
Filing date: 2008-02-28
Publication date: 2009-09-02
Also published as: KR100970584B1

Abstract

본 발명은 FRET 현상을 응용한 당단백질 분석용 바이오칩 세트 및 이를 이용한 당단백질 분석방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 (A) ① 비금속성 재질의 지지체 ② 상기 지지체의 표면에 형성된 자기조립 단층막 ③ 상기 자기조립 단층막의 말단기와 렉틴이 코팅된 렉틴-양자점의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 렉틴-양자점 단층막을 포함하는 칩과 (B) 상기 렉틴과 결합하는 당으로 코팅된, 당-에너지수용체를 구성요소로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트 및 그의 이용방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 소량의 당단백질이라도 그 당쇄 성분을 신속하게 동정하고 정성/정량분석할 수 있게 된다.

Description

당단백질 분석용 바이오칩 세트{Nanoparticle-based biochip set for detecting glycoproteins}

본 발명은 FRET 현상을 응용한 당단백질 분석용 바이오칩 세트 및 이를 이용한 당단백질 분석방법에 관한 것이다.

당단백질은 당(탄수화물)이 부착된 단백질의 총칭으로서, 생체 내에서 직접 합성되어 면역반응, 세포성장, 질병관련 다양한 생물학적 기능에 연계되어 있는 것으로 확인되고 있다. 대표적인 당단백질로는 콜라겐(collagens), 뮤신(mucins), 트랜스페린(transferrin) 등이 있으며 암표지자로 알려진 α-Fetoprotein(AFP), haptoglobin, γ-glutamyltranspeptidase (γ-GTP), α-1-antitrypsin, carcinoembryonic antigen (CEA), erythropoietin 등도 당단백질로 알려져 있다. 당단백질에 구성된 당쇄의 종류로는 푸코오스(fucose), 시알산(sialic acid), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 만노오스 (mannose), N-아세틸글루코사민(GlcNAc, N-acetylglucosamine), N-아세틸갈락토사민(GalNAc, N-acetylgalactosamine) 등 다양한 당들이 알려져 있다.

이들의 생화학적 역할에 비추어, 당단백질의 동정과 정성/정량분석이 이들에 의한 생체 내에서의 다양한 상호작용을 이해하는 데 핵심적인 요소가 되고 있다. 당단백질을 분석하기 위해서는 먼저 당단백질에 부착된 당의 종류와 수를 결정하여 당단백질을 동정하고, 동정된 당단백질의 농도에 따른 결합 반응 양상을 분석하는 일이 선행되어야 한다.

종래 주로 알려진 당단백질 분석방법으로는 당단백질을 렉틴 친화형 컬럼으로 추출한 후 당단백질의 당 부분을 가수분해하여 생성된 산물을 HPLC법(J Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1998, 715, 153), 모세관 전기영동-질량분석법(Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry; J. Electrophoresis 2004, 25, 1949), 표면 플라즈몬 공명 분광분석법(Surface Plasmon Resonance Spectroscopy; J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10575) 등에 의해 측정하는 것이었다. 그러나 이러한 방법들은 전처리 과정이 복잡하고 시간이 많이 소요되어 다양한 당단백질을 동시에 분석하기가 어려울 뿐만 아니라, 당단백질의 구조에 대한 정보를 얻을 수 없다는 단점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위해, 최근에 탄수화물 및 렉틴을 이용하여 제작한 마이크로칩을 활용한 당단백질 분석방법(Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 3607; Chembiochem 2005, 6, 985)이 널리 사용되고 있다. 마이크로칩의 경우 보다 효과적인 대량분석이 가능하지만 당단백질을 검출하기 위해 렉틴이나 항체를 교대로 여러 번 사용해야 하는 번거로움이 있고, 표지자로서 렉틴이나 항체 등에 유기 형광물질을 별도로 부착하여 이용하기 때문에 형광자체의 감쇠현상(photobleaching)으로 측정의 정확성이 크게 떨어질 수 있다는 문제가 있다.

한편, 형광 공명에너지 전이(FRET; Fㆆrster resonance energy transfer) 현상을 이용하면 특정한 생체분자간의 상호 결합을 효과적으로 측정할 수 있음이 확인된 바 있다(J. Am . Chem . Soc . 2004, 126, 301). FRET이란 에너지 공여체(donor; 통상 양자점QD이라 한다)와 수용체(acceptor)가 소정의 거리 이내에 근접해 있을 때, 공여체가 여기상태에서 바닥상태로 전환될 때 에너지가 직접 공여체 특유 파장의 형광으로 방출되지 않고, 공명현상에 의해 비-복사에너지(non-radiative energy)가 수용체로 전달됨으로써 궁극적으로 수용체 특유의 장파장 형광이 방출(emission)되는 원리를 말한다. 따라서 이러한 원리를 활용하여, 특정 생체분자간의 결합반응을 보다 정확하게 측정할 수가 있게 되는 것이다.

본 발명자들이 밝힌 바에 의하면 특히, 에너지 수용체로 금 나노입자를 사용하게 되면 공여체(양자점)에서 발생하는 에너지가 매우 효율적으로 전이되기 때문에 생체물질간의 반응결합을 보다 효과적으로 측정할 수 있는 시스템 구현이 가능하다(Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7959; KR Patent No. 10-0704011). 이는 금 나노입자를 이용하는 경우 일반적인 FRET 현상에서 나타나는 쌍극자-쌍극자(dipole-dipole) 간의 에너지 전이 현상과는 달리, 공여체와 수용체간의 거리가 20nm 까지에서도 FRET 현상이 발생(J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3115; Nano. Lett. 2007, 7, 3157)할 수 있기 때문인 것으로 판단된다.

그러나 FRET 법이 가지는 위와 같은 장점에도 불구하고, 공여체 및 수용체 나노입자들이 수용액에서 쉽게 응집(aggregation)되기 때문에 재현성 있는 측정이 어렵고, 1회 측정 시 최소 수십 μL~수 mL 이상의 나노입자가 소모되어 비용 대비 실용성 낮으며, 실험과정이 복잡하여 전문성을 요한다는 등의 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 나노입자간 에너지 전이 현상을 이용하여 소량의 용액만으로도 당단백질을 신속정확하게 분석할 수 있는 바이오칩 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 동시에 다량의 당단백질을 신속정확하게 분석할 수 있는 바이오칩 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 바이오칩 세트를 이용하여 당단백질을 신속정확하게 분석할 수 있는 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 과제를 해결하기 위한 본 발명은, FRET 현상을 이용한 것으로서, ① 한 종류의 렉틴과 한 종류의 양자점이 적용된 단순형 바이오칩 세트, ② 복수 종류의 렉틴과 복수 종류의 양자점이 적용된 복합형 바이오칩 세트, ③ 복수 종류의 렉틴이 적용되고 복수개의 웰이 형성된 복합-웰형 바이오칩 세트 및 ④ 상기 바이오칩 세트의 사용방법에 관한 것이다.

본 발명은, 렉틴과 당이 특이적 결합되는 경우에는 FRET에너지공여체(양자점)의 고유 발광파장이 발광되며, 렉틴과 당이 결합되지 않는 경우에는 FRET에너지수용체 고유의 발광파장이 발광되도록 하는 기법을 기반으로 한 것이다.

(1) 제1발명 : 단순형 바이오칩 세트 (제1항~제7항)

본 발명자에 의한 제1발명은 (A) ① 비금속성 재질의 지지체 ② 상기 지지체의 표면에 형성된 자기조립 단층막 ③ 상기 자기조립 단층막의 말단기와 렉틴이 코팅된 렉틴-양자점의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 렉틴-양자점 단층막을 포함하는 칩과 (B) 상기 렉틴과 결합하는 당으로 코팅된, 당-에너지수용체를 구성요소로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트에 관한 것이다.

① 본 발명에서 상기 지지체가 금, 은, 알루미늄, 티타늄과 같은 금속성 재질인 경우 양자점의 형광 발생에 왜곡이 일어날 수 있으므로, 상기 지지체는 유리, 실리콘 또는 플라스틱 재질인 것이 바람직하다.

② 본 발명에서 상기 자기조립 단층막(Self-assembled monolayers, SAMs)은 지지체의 표면에 입혀진 규칙적으로 정렬된 유기 분자 박막이다. 상기 자기조립 단층막을 이루는 화합물들은 지지체에 결합하는 반응기와 규칙적인 분자 막 형성을 가능하게 하는 몸통부분의 긴 알칸사슬 및 분자막의 기능을 좌우하는 말단부분의 작용기(이하 "말단기"라 함)로 구성된다. 자기조립 단층막은 지지체와 이온결합을 이루는 알칸산(alkanoic acid)이나, 공유결합을 이루는 유기규소(organosilicon) 화합물을 사용하여 구축될 수 있다. 구체적인 예로는, C3-25인 n-alkanoic acid 또는 alkyl silane류, 예컨대 alkylchlorosilanes, alkylalkoxysilanes, alkylaminosilanes 등이 사용될 수 있다.

상기 말단기로는 알킬기, 아민기, 티올기, 카르복실기, 알데하이드기, 에폭시기, 말레이마이드기, NHS(N-hydroxyl succinimide)기, 말레이마이드(maleimide) 중 하나 혹은 두개 이상의 혼합형태로 사용하는 것이 바람직하다. 양자점이 여기되는 영역에서 형광을 내는 기능기를 사용하는 경우 양자점의 발광 신호가 심하게 저해 받을 수 있으므로 본 발명에 적용하기에 적합하지 않다.

본 실시예에서 사용한 NHS-하이드로젤(N-hydroxyl succinimide hydrogel)이 처리된 유리기판(Nexterion^TM Slide H, Schott, Germany)처럼 상용화된 자기조립 단층막이 형성된 유리기판을 사용할 수도 있다. 직접 제작하는 경우는 다음과 같이 할 수 있다. 유리 재질의 지지체를 황산/과산화수소의 피라나(Pirana)용액으로 5~10분간 처리하여 표면의 산화층을 제거한다. 이어서 2mM~10mM 농도의 알칸산(alkanoic acid) 또는 유기규소(organosilicon) 화합물 용액에 상기 지지체를 침지한다. 이때 반응 중 산소에 의한 산화반응을 차단시키기 위해 질소분위기 하에서 수행하는 것이 바람직하다. 자기조립 단층막의 제조는 상온에서 2~24시간 반응시키는 것이 바람직하나 반응시간이 24시간을 넘는다고 하여도 자기조립 단층막 형성에 문제가 발생하는 것은 아니다. 보다 빠른 반응을 유도하기 위해서는 30~40℃에서 2시간만 반응시켜도 무방하다.

③ 상기 렉틴-양자점은 양자점이 렉틴에 의해 코팅된 것이다. 양자점은 FRET 반응에서 에너지 공여체의 역할을 하여 양자점의 종류와 특성에 따라 다양한 파장의 단파장(에너지)이 방출될 수 있다. 상기 양자점은 이미 다양한 크기가 상품화 (Invitrogen 혹은 Evident Technologies)되어 있으며 최대 발광 파장이 500~900nm 범위인 것을 선택하는 것이 바람직하다. 양자점의 표면은 렉틴과의 결합을 위해 아민기, 카르복실기, 티올기, 알데하이드기, 에폭시기, 말레이마이드기, NHS(N-hydroxyl succinimide) 중 어느 하나로 치환된 것이 바람직하다.

양자점 표면을 코팅하는 생체분자인 렉틴(lectin)은 특정 탄수화물 사슬과 특이적으로 결합하는 탄수화물 결합 단백질의 총칭으로 주로 식물에서 발견되고 있으나, 척추동물, 미생물, 바이러스 등 다양한 유래에서도 발견된다. 식물로부터 유래된 렉틴 중 대표적인 예로 mannose를 인식하는 콘카나발린 A(Concanavalin A), sialic acid를 인식하는 Maackia seed agglutinin(MAA), N-acetylgalactosamine (GalNAc)을 인식하는 Ricinus communis agglutinin(RCA), L-fucose를 인식하는 Aleuria aurantia lectin(AAL), N,N-diacetyl chitobios(di-GlcNAc)를 인식하는 wheat germ agglutinin(WGA) 등이 있다. 본 발명의 실시예에서는 콘카나발린 A가 코팅된 반도체 나노입자인 카드뮬-셀레니엄/황화아연 (CdSe/ZnS) 계열의 양자점(QD, Invitrogen)을 사용하였다.

상기 렉틴-양자점 단층막은 자기조립 단층막의 구성 후 렉틴-양자점을 자기조립 단층막 표면에 결합시키는 것에 의해 형성된다. 이러한 결합은 자기조립 단층막의 말단기와 양자점에 코팅된 생체분자의 표면 작용기간의 공유결합에 의해 이루어진다. 렉틴-양자점 단층막은 렉틴-양자점 용액을 자기조립단층막 위에 (필요한 경우 소정의 영역에) 직접 떨어뜨려서 결합반응시키거나, 마이크로 컨택프린팅 (microcontact printing) 혹은 마이크로어레이어(microarrayer) 방법에 의해 형성될 수 있다. 반응은 통상 상온에서 30분~2시간이며, 반응 후 표면을 증류수로 세척한다.

한편, 상기 렉틴-양자점이 부착된 지지체에서 주위에 노출된 자기조립 단층막이 존재할 경우 추후 이차반응에서 비특이적인 흡착을 야기할 수 있다. 즉, 자기조립 단층막의 말단기가 렉틴-양자점과 결합하지 않은 채 노출되어 있는 경우 다른 단백질의 흡착이 일어날 수 있다. 따라서 양자점 주위의 공간을 메워 비특이적 결합을 방지하는 것이 바람직하다. 상기 충진제(비특이적 결합억제자)는 화학적 폴리머로서 에틸렌글리콜아민, 에틸렌글리콜티올, NHS(N-hydroxysuccinimide)-에틸렌글리콜, 말레이미드-에틸렌글리콜 등의 에틸렌글리콜 계열의 화합물과 폴리에틸렌글리콜 아민, 폴리에틸렌글리콜 티올, (NHS)-폴리에틸렌글리콜, 말레이미드-폴리에틸렌글리콜 등의 폴리에틸렌글리콜 계열의 화합물, 혹은 생물학적 화합물로서 카르보하이드레이트 단위체 결합에 기초한 폴리머, 단백질 disulfide isomerase, bovine serum albumin (BSA) 중의 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물인 것이 바람직하다.

상기 양자점 주위의 충진은 렉틴 양자점의 단층막을 구성한 후 상기 화합물의 용액을 뿌려주거나 침지하거나 흘려주는 것에 의해 이루어진다. 상기 화합물의 반응성 및 용해도에 따라 사용되는 용매, pH, 완충용액 등은 적절히 선택할 수 있으나, 표면에 부착된 양자점에 영향을 주지 않는 범위 내에서 유기용매보다는 pH 5~9 범위의 완충용액이 적절하며 화합물의 농도는 0.1 mM~10mM의 조건을 유지하는 것이 바람직하다.

④ 당(탄수화물)으로 코팅된 당-에너지수용체 나노입자는 상기 렉틴-양자점과 결합반응을 하게 된다. 상기 당은 전술한 렉틴과 가역적으로 결합할 수 있는 임의의 당(단당 또는 올리고당)으로서, 예컨대 일반적으로 당단백질에 널리 존재하는 푸코오스(fucose), 시알산(sialic acid), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 만노오스 (mannose), N-아세틸글루코사민(GlcNAc, N-acetylglucosamine), N-아세틸갈락토사민(GalNAc, N-acetylgalactosamine) 또는 덱스트란 등이 선택될 수 있다. 하기 실시예에서는 렉틴과 느슨한 결합력(결합친화력상수, K _A 10⁶~10⁷)을 가진 덱스트란 또는 mannose 단당체를 선정하였으나, 이에 한정되는 것이 아님은 당연하다.

상기 에너지수용체(FRET 에너지수용체)는 상기 양자점(FRET 에너지공여체)과 FRET 반응의 쌍을 이루는 것으로서, 금속, 형광물질(fluorescent dye) 또는 형광 억제자(fluorescent quencher)로서 최대직경이 1~100nm인 나노입자인 것이 바람직하다. 에너지수용체는 양자점과 소정의 거리 이내에 있게 되면, 양자점에서의 발광에너지를 흡수(전이)하여 양자점의 발광을 억제하고 자기 고유의 장파장의 빛을 방출하게 된다. 본 실시예에서는 에너지 수용체로 금 나노입자(gold nanoparticle, AuNP)만을 예시하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 TAMRA (carboxytetramethylrhodamine), Alexa^TM, Cy^TM 등의 형광물질(fluorescent dye)이나, 금, 백금, 은 등의 나노입자 또는 QSY^TM, BHQ^TM, DABCYL^TM 등의 형광 억제자(fluorescent quencher)를 사용할 수 있다.

FRET 에너지공여체(양자점)와 에너지수용체 쌍에 따라 에너지 전이가 발생할 수 있는 유효거리가 다르므로, 선택되는 공여체-수용체 쌍에 따라 양자의 거리를 조절해야 함은 당업자에게 있어 당연할 것이다. 예컨대 금 나노입자를 사용하면 20 nm까지 양자점까지의 거리가 유지되어도 무방하지만 이외의 것을 사용할 경우 양자점과의 거리가 10 nm 이내로 유지되어야 한다.

본 발명에 의한 바이오칩 세트는 다음과 같이 작용된다. 당단백질이 존재하지 않거나, 당단백질의 당이 상기 렉틴과 특이결합하지 않는 경우에 상기 당으로 코팅된 에너지수용체가 렉틴과 특이적으로 결합하여 렉틴-양자점 단층막 위에 당-에너지수용체층이 형성된다. 이에 따라 양자점의 발광이 억제되고 에너지수용체 특유의 파장으로 발광된다. 렉틴과 특이결합하는 당을 가진 당단백질이 존재하게 되면 당단백질에 존재하는 당과 당-에너지수용체가 경쟁적으로 렉틴과 결합하게 되므로 양자점 고유의 발광신호가 발생하게 되는 것이다(도 1).

즉, 칩 표면위에서 특정 당단백질의 존재를 검증하고자 할 때 당단백질을 처리한 것과 처리하지 않은 것의 표면 발광능력을 측정, 비교하여 당단백질을 처리한 것의 발광이 관찰된다면 상기 당단백질은 사용한 렉틴에 특이적인 당쇄를 갖고 있음을 확인할 수 있다.

본 발명에 의한 바이오칩 세트를 사용하여 여러 종류의 당단백질을 분석해 본 결과, 양자점 표면에 구성된 렉틴과 특이적으로 결합하는 당단백질에서만 양자점의 발광신호가 현저하게 나타나는 것을 확인하였다. 이로서 본 발명에 의한 바이오칩 세트를 사용하면 당단백질을 효과적으로 선별할 수 있음을 확인하였다.

또한 본 발명에 의한 바이오칩 세트를 이용하여 당단백질을 선별할 경우 당단백질의 농도가 증가할수록 양자점의 발광 신호가 증가하므로 당단백질 농도를 확인하는 정량분석에 효과적으로 사용될 수 있음도 확인하였다. 즉, 당단백질의 농도에 따른 양자점의 발광신호 크기를 표준 곡선(standard curve)으로 작성한 후 미지 농도의 당단백질의 발광신호를 측정한 후 표준 곡선과 비교하는 것에 의해 당 단백질의 농도를 정량할 수 있다.

또한 본 발명에 의한 바이오칩 세트를 이용하는 경우, 당량이 많을수록 양자점 표면의 렉틴과의 결합력이 증대되므로 발광신호가 증가하는 것에 의해 특정 당단백질에서 당량의 수를 예측하는 것이 가능하다. 그러나, 당단백질의 종류와 크기, 렉틴과의 친화력, 결합되는 위치, 양자점과 금속나노입자간의 거리, 양자점 및 금속나노입자의 크기 등에 따라 양자점의 발광신호 정도가 다를 수 있으므로 항시 동일한 측정 조건에서 발광신호의 회복정도를 비교하여 판단하여야 한다. 따라서, 이 경우에는 모든 조건을 동일하게 둔 상태에서, 당단백질에서 나오는 발광신호 값에서 당을 완전히 제거한 기준단백질(농도는 당단백질과 동일)에서 발생하는 발광신호 값을 보정할 필요가 있다.

(2) 제2발명 : 복합형 바이오칩 세트 (제8항)

본 발명자에 의한 제2발명은 (A) ① 비금속성 재질의 지지체 ② 상기 지지체의 표면에 형성된 자기조립 단층막 ③ 상기 자기조립 단층막의 말단기와, 결합특성이 다른 복수개의 렉틴이 발광특성이 다른 복수개의 양자점에 개별적으로 코팅되어 있는 다수종의 렉틴-양자점의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 렉틴-양자점 단층막;을 포함하는 칩과 (B) 상기 복수개 렉틴 모두와 결합하는 당의 조합으로 코팅된, 당-에너지수용체를 구성요소로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트에 관한 것이다.

즉, 상기 렉틴-양자점 단층막에서 다수종의 렉틴을 서로 다른 특성(상이한 최대 발광파장)을 가진 양자점과 결합시킨 후 칩 표면에 고정화하고, 당-에너지수용체를 각 렉틴과 특이적으로 결합될 수 있는 서로 다른 당으로 구성함으로써 다양한 당단백질을 동시에 분석하는 것이 가능하다. 본 발명에 의한 바이오칩 세트를 활용하는 경우, 렉틴-양자점과 당-에너지수용체로 구성된 다양한 쌍에서 특정한 당단백질 처리에 따른 특이적 신호를 분석함으로써 당단백질에 붙어 있는 당들을 신속하게 스크리닝 해 낼 수 있다. 이론적으로는 양자점을 5종류이상 사용할 수 있으나, 최대 발광파장의 간격, 에너지수용체와의 조합을 고려하면, 5개 이하인 것이 바람직하다.

본 제2발명에서 지지체, 자기조립 단층막, 렉틴, 양자점, 당, 에너지수용체, 충진제 등은 모두 상기 제1발명에서와 동일하다.

(3) 제3발명 : 복합-웰형 바이오칩 세트 (제9항, 제10항)

본 발명자에 의한 제3발명은 (A) ① 하나 또는 복수개의 웰 구조로 이루어져 있는 비금속성 재질의 지지체 ② 상기 지지체 웰 내부의 표면에 형성된 자기조립 단층막 ③ 상기 자기조립 단층막의 말단기와 렉틴이 코팅된 렉틴-양자점의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 렉틴-양자점 단층막을 포함하는 칩과 (B) 상기 렉틴과 결합하는 당으로 코팅된, 당-에너지수용체를 구성요소로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 웰의 규격 및 갯수는 필요에 따라 임의로 정할 수 있다. 상기 웰 구조로 된 지지체는, 예를 들면, 금형(mold)에 통상의 열가소성수지 또는 열경화성수지를 사출(injection molding)하여 제작할 수도 있고, 종래 반도체 공정에서 사용되는 단결정 실리콘 또는 단결정 게르마늄을 적용할 수도 있으며, 평평한 표면에 얇은 격자형 부재를 접합하여 제작할 수도 있다.

본 발명에 의한 상기 지지체의 웰에는 각 웰마다 고유번호를 부여하여 관련장비들이 필요위치로 이동하는 것을 자동으로 제어할 수 있는 기준을 마련하는 것이 바람직하다. 이에 의해 각 웰마다 요구되는 반응조건 및 분석을 동시에 독립적으로 처리할 수 있게 된다.

한편, 본 발명에서 상기 웰이 복수개인 경우, 결합특성이 다른 복수개의 렉틴이 양자점에 코팅되어 있는 다수종의 렉틴-양자점이 각 웰 마다 각각 적용되고, 상기 당-에너지수용체를 이루는 당은 상기 복수개 렉틴 모두와 결합할 수 있는 조합으로 구성되도록 할 수 있다. 이때, 반응결과는 웰에 의해 공간적으로 분리되므로, 양자점은 모두 동일한 것이어도 관계없다.

본 제3발명은 지지체가 웰 구조로 되어 있는 점을 제외하고는 지지체, 자기조립 단층막, 렉틴, 양자점, 당, 에너지수용체, 충진제 등은 모두 상기 제1발명에서와 동일하다.

(4) 제4발명 : 바이오칩 세트의 사용방법 (제11항, 제12항)

본 발명자에 의한 제4발명은, 전술한 본 발명에 의한 바이오칩 세트를 이용한 것으로서, (A) 상기 당-에너지수용체와 분석대상 당단백질을 혼합하는 단계 (B) 단계 A의 혼합물을 상기 칩의 렉틴-양자점과 반응시키는 단계 및 (C) 반응종료 후 상기 칩의 양자점 발광을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 정성/정량 분석방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 바이오칩 세트를 이용방법은 다음과 같다.

먼저 당-에너지수용체와 분석대상이 되는 당단백질의 혼합용액을 만든 후 이 혼합용액을 바이오칩에 적가하고 반응시킨 후 양자점 발광(발광 유무, 발광의 정도 등)을 측정하는 것이다. 당-에너지수용체 용액을 먼저 반응시킨 후 당단백질 용액을 추후 반응시키게 되면 렉틴-당, 렉틴-당단백질과의 반응결합상수가 비슷하기 때문에 당단백질에 대한 발광신호 분석을 측정하기가 어렵게 된다. 당단백질 용액을 먼저 바이오칩에 떨어뜨린 후 당-에너지수용체 용액을 나중에 반응시키는 방법은 혼합하여 반응시킨 것과 비슷한 결과를 얻을 수 있으나 시간이 많이 소요되는 단점이 있다. 반응 온도와 시간은 당단백질과 렉틴의 특성에 따라 조절될 수 있음은 당연하나, 보통은 상온에서 1시간 반응시킨 후 칩 표면을 완충용액 및 증류수로 씻어내어 반응을 중지시키는 것으로 충분하다. 시료 등이 흘러내리지 않도록 얇은(1~5 mm) 실리콘막 등과 같은 박막으로 칩 표면에 덮는 것도 좋다.

한편, 칩표면에 반응하는 당-에너지수용체의 수(농도)가 높을수록 비특이적 결합 가능성이 커지고, 이러한 비특이적 흡착은 양자점과 에너지수용체 사이의 FRET 반응에 큰 영향을 주므로 당-에너지수용체를 적정한 수준으로 처리해야 한다. 당-에너지수용체 입자의 처리량은 상기 렉틴-양자점에 비해 10~50배의 몰비인 것이 바람직하다. 몰비가 50배 초과인 경우에는 당단백질 처리 시에도 비특이적 흡착으로 인하여 발광신호가 미약하게 검출되고, 10 미만인 경우 양자점의 발광신호의 억제효과가 미비하였다(결과 미도시).

전술한 본 발명에 의한 바이오칩 세트에 의하면, 칩 표면에서 양자점과 에너지수용체 사이의 FRET(에너지 전이)현상을 이용하여 소량의 당단백질이라도 그 당쇄 성분을 신속하게 동정하고 정성/정량분석할 수 있게 된다.

또한 서로 다른 특성의 양자점에 다양한 렉틴을 부착시키고 에너지수용체에 다양한 당을 부착킴으로써 다수의 당단백질을 동시에 분헉할 수 있게 된다.

새로운 당단백질의 발굴과정의 초기단계에서 빠르게 후보군을 선정하기 위하여 본 발명에 의한 바이오칩 세트가 광범위하게 사용될 수 있을 것이므로, 신약개발의 후보군으로서 널리 알려진 당단백질을 대상으로 하는 연구에도 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 나노입자 기반의 바이오칩을 이용한 당단백질의 측정법을 보여주는 모식도.

도 2는 본 발명에 의한 나노입자 기반의 바이오칩을 사용하여 특이적 당단백질의 측정방법을 보여주는 형광이미지.

도 3은 본 발명에 의한 나노입자 기반의 바이오칩을 사용하여 당단백질의 농도에 대한 발광신호를 분석한 이미지와 그래프.

도 4은 본 발명에 의한 나노입자 기반의 바이오칩을 사용하여 당량에 따른 당단백질에 대한 발광신호를 분석한 이미지와 그래프.

이하 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

하기 실시예에서는 상용화된 '자기조립 단층막부착 지지체' (Nexterion^TM Slide H, Schott, Germany)를 이용하였으나, 직접 지지체에 자기조립 단층막을 형성시킬 수도 있음은 당연할 것이다.

실시예 1 : 본 발명에 의한 바이오칩 세트의 제조

(1) 렉틴이 부착된 양자점(렉틴-QD)의 제조

렉틴으로서 ConA를, 양자점으로 QD605 및 QD525를 사용하여 렉틴-QD를 제조하였다. (QD605와 QD525는 종류만 다를 뿐 동일한 방법으로 합성이 가능하므로 이하 QD605만을 설명한다.)

표면이 카르복실기(carboxylic acid group)로 구성된 양자점(QD605, Invitrogen, 8 μM) 6.25 μL와 증류수에 녹인 EDC(Pierce, 50 mM) 5 μL를 EP tube에 섞은 후 증류수 238.75 μL를 더해 최종 부피를 250 μL로 맞추었다(QD:EDC=1:5000, 몰수비). 상온에서 30분간 방치한 후 양자점과 결합에 참여하지 않은 EDC를 제거하기 위해 마이크로필터(Microcon YM-50, 50 kDa cut-off)를 사용하여 10,000 rpm에서 15분간 원심분리를 하고 필터에 남아있는 결합체에 HEPES 용액(50 mM, pH 7.4) 200 μL를 넣어 회수하였다. 양자점과 ConA를 반응시키기 위하여, 회수한 용액 (EDC가 결합되어 있는 양자점 용액) 200 μL에 ConA 용액 40 μL를 가하여 상온에서 1시간 동안 방치하였다. ConA용액은 HEPES 용액(50 mM, pH 7.4)에 50 μM의 농도로 녹여 미리 준비해두었다.

양자점과 ConA의 반응시 참여하지 않은 부분에 비특이적 흡착을 막기 위해 동일한 HEPES 용액에 250 μM로 녹인 PEG-아민(mPEG-NH₂, MW 5000, Nektar Inc.) 10 μL를 상기 혼합물에 주입한 후 추가적으로 상온에서 30분간 방치하였다. 반응 후 반응에 참여하지 않고 과도하게 남아있는 ConA와 PEG-아민을 분리하기 위해 마이크로필터(Pall Filtron, 300kDa cut-off)를 사용하여 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 증류수세척-원리분리를 3회 반복한 후 최종적으로 50 mM HEPES 용액에 회수하여 최종농도 (QD기준) 200 nM로 맞춘 다음 4℃ 에 보관하였다.

ConA가 결합된 양자점(이하 ConA-QD)의 농도는 488 nm에서의 양자점 고유의 흡광계수 (여기서 사용한 carboxyl QD605의 경우 1.1 × 10⁶M^-1 cm^-1)를 사용하여 정량적으로 확인하였다. 즉, 양자점 용액의 흡광도를 UV-분광기(UV-2550, Shimadzu)로 측정하여 흡광도를 구한 후 상기 흡광계수로 나누어서 그 농도를 산정하였다.

(2) 렉틴-양자점(렉틴-QD) 단층막의 제조

양자점을 부착시키기 위한 기판으로, NHS-하이드로젤(N-hydroxyl succinimide hydrogel)이 처리된 유리기판(Nexterion^TM Slide H, Schott, Germany)을 사용하였다.

기판위에 지름 3mm, 두께 1mm의 웰로 구성된 실리콘판(chambered silicon cover-slip, Sigma)을 덮고 각 웰에 렉틴-QD을 고정하였다. 렉틴-QD로 실시예 1(1)에서 제조한 HEPES 용액에 녹아있는 ConA-QD605 10 nM 용액 10 μL를 떨어뜨린 후 상온 및 70% 습도가 유지되는 챔버에서 약 1시간 정도 방치하였다.

이후 spot 내부 혹은 주위에 남아있는 NHS기를 blocking하기 위해 2% BSA가 함유된 완충용액(50 mM borate buffer, pH 8.5)을 각 웰에 동일하게 10 μL씩 피펫으로 떨어뜨린 후 같은 조건에서 추가로 1시간 동안 방치하였다. 반응이 끝난 이후에는 증류수로 유리 기판을 3회 세척 후에 질소가스로 천천히 건조시켰다. ConA-QD525도 상기와 같은 방법으로 동일하게 준비하였다.

(3) 당-에너지수용체 입자의 제조

당으로는 덱스트란, FRET 에너지수용체로는 금나노입자를 선택하여 덱스트란이 코팅된 금나노입자(이하 Dex-AuNP)를 제조하였다. 금나노입자는 시트레이트(citrate)에 의해 환원된 지름이 5 nm인 금나노입자(Ted Pella, Inc.)를 사용하였다. 상기 금나노입자의 최초 농도는 83 nM (5×10¹² particles mL^-1)였다. 아민기가 달린 덱스트란(덱스트란 아민, Dextran-NH₂, Invitogen)에 2-이미노티올래인(2-imminothiolane, Sigma)을 혼합하여 아민기를 티올기로 치환하여 금나노입자와 반응시켰다. 티올기는 금나노입자 표면에 강하게 흡착되기 때문에 안정한 Dex-AuNP를 얻을 수 있다.

이를 위해 먼저 증류수에 녹인 덱스트란 아민(1 mM) 250 μL와 증류수에 녹인 2-이미노티올래인 (20 mM) 250 μL을 섞어 상온에서 1시간 동안 방치하였다 (덱스트란:2-이미노티올래인=1:20, 몰수비). 투석(Slide-A-Lyzer Mini Dialysis, 7 kDa cut-off, Pierce)을 이용하여 상온에서 16시간 동안 결합되지 않은 2-이미노티올래인을 제거하였다.

티올기로 치환된 상기 덱스트란 용액과 금나노입자, mPEG-SH (MW 5000, Nektar Inc.)를 각각 250 μL (0.5 mM), 2.5 mL (83 nM), 250 μL(0.1 mM)의 부피로 혼합하였다. 최종적으로 덱스트란과 금나노입자와 mPEG-SH의 몰수비는 600:1:120 이었다. 이후, 5시간 동안 상온, 암상태에서 천천히 교반하며 반응시켰다. 마이크로필터 (Microcon YM-50, 50 kDa cut-off)를 사용하여 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 반응에 참여하지 않은 티올-덱스트란과 mPEG-SH를 제거하였다. 필터에 남은 반응산물을 증류수 세척과 상기와 동일한 원심분리를 2회 수행한 후 최종적으로 HEPES 용액 (50 mM, pH 7.4)을 약 100 μL를 넣고 농도를 측정하였다. 최종 농도는 금나노입자의 흡광계수값 (1.0ㅧ10⁷ M^-1 cm^-1 at 513 nm)를 이용하여 정량적인 농도를 산출하였다.

실시예 2 : 본 발명에 의한 바이오칩 세트를 활용한 당단백질 분석

(1) 테스트를 위한 신규 당단백질 (neoglycoproteins)의 합성

본 발명에 의한 바이오칩 세트의 검증을 위해 ConA가 특이적으로 인식하는 만노즈(mannose)의 결합수를 다양하게 BSA(Sigma) 표면에 결합시킨 당단백질을 합성하였다.

BSA의 라이신 잔기에 α-D-mannopyranosyl-phenyl-isothiocyanate(MPI, Sigma)의 NCS 잔기를 공유결합으로 연결시킨 후, MPI와 BSA의 몰수 비를 다양하게 반응시킴으로써 (MPI:BSA=1.5:1~150:1) 서로 다른 수의 만노즈가 붙은 BSA를 제조하였다(Man-BSA). MPI를 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹여 준비한 후 sodium bicarbonate용액 (50 mM, pH 9.0)에 희석하여 사용하였다. 동일한 농도의 BSA에 대해서 서로 다른 농도의 MPI 용액(20% DMSO 수용액)을 각각 혼합한 후 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 용액에서 남아있는 MPI를 제거하기 위해 마이크로필터 (Microcon YM-10, 10 kDa cut-off, Millipore Corp.)를 사용하여 10,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 HEPES 용액으로 회수하여 MPI가 붙은 신규 당단백질만을 분리하였다.

상기 몰수비로 합성된 신규 당단백질 (man-BSA)에서 BSA당 만노즈의 수를 확인하기 위해 Bio-LC DX-600 (Dionex, USA)를 이용한 결과, 제조된 Man-BSA에는 BSA 1개당 각각 0, 1.5, 2.8, 5.8, 10, 12.6, 15, 21.4, 22개의 만노즈가 결합되어 있음을 확인하였다(결과 미도시).

BSA에 만노즈 대신 갈락토오즈가 부착된 샘플은 22개의 갈락토오즈가 결합되어 있는 BSA (Gal-BSA)를 Sigma로부터 구입하여 실험에 이용하였다.

(2) 여러 종류의 당단백질에 대한 ConA-QD의 발광신호 분석

Dex-금나노입자 (실시예 1에서 제조)와 당단백질(혹은 기준 단백질)을 1:1의 부피로 혼합하여 실시예 1에서 제조된 칩에 가하고 반응을 수행하였다.

실시예 2(1)에서 제조한 두 가지 종류의 신규 당단백질 (Man-BSA와 Man-Gal) 이외에 당이 붙지 않은 기준 단백질로서 BSA와 salic acid가 붙어있는 Fetuin(Sigma)을 추가적으로 사용하였다.

즉, A, B, C, D, E 5개의 튜브속에 250 nM Dex-금나노입자 4 μL를 모두 넣은 다음, A 튜브에는 HEPES 용액 5 μL, B 튜브에는 HEPES용액에 녹인 1 μM BSA 용액 5 μL, C튜브에는 HEPES 용액에 녹인 1 μM Man-BSA 5 μL, D튜브에는 HEPES 용액에 녹인 1 μM Gal-BSA 5 μL, E튜브에는 HEPES 용액에 녹인 1 μM Fetuin 5 μL을 순차적으로 넣고 각 tube의 최종 부피가 9 μL가 되도록 하였다, 이후 즉시 당쇄부분과 렉틴과의 반응을 촉진시키기 위해 HEPES 용액 속에 각기 1 mM CaCl₂, MnCl₂, MgCl₂의 메탈 혼합용액 1 μL를 넣어 최종 부피가 10 μL가 되도록 하였다 (각 메탈이온의 최종 농도는 100 μM). 각 튜브를 보텍서로 빠르게 혼합한 후 바로 ConA-QD605가 고정되어 있는 실리콘 기판위의 각 웰에 떨어뜨려 반응시켰다. 상온에서 1시간 방치한 후, 반응용액을 피펫으로 조심스럽게 제거한 다음 각 웰을 HEPES용액으로 3회, 증류수로 2회 세척 후 질소가스로 천천히 건조시켰다. 실제 기판위에서 사용된 ConA-QD, Dex-AuNP, 당단백질의 최종농도는 각각, 10, 100, 500 nM이었다. 상기와 동일한 방법으로 QD-525가 고정된 칩 표면위에서도 수행하였다.

이와 같은 반응과정을 거친 후에 상기 바이오 칩을 ArrayWoRx^e (Applied Precision, USA) 슬라이드 스캐너에 삽입한 후 형광분석을 실시하였다. 상기 스캐너는 백색광원을 사용하여 형광필터를 장착한 것으로 QD605의 경우에는 460nm (ex)/605nm(em) 필터를 QD525의 경우에는 460nm(ex)/525nm(em)의 필터를 장착하여 동시에 두 영역에서 스캔하였다. 획득한 형광이미지를 도 2에 도시하였다. 도면에서 보는 바와 같이, Dex-AuNP만 있는 시료에서는 공여체인 QD의 발광신호가 수용체인 AuNP로의 에너지 전이에 의해 급속히 감소된 반면 Dex-AuNP내에 Man-BSA이 혼합되어 있을 경우에만 특이적으로 QD의 발광신호가 강하게 검출되었다. 이 결과로부터 QD표면에 존재하는 ConA와 Mannose의 결합이 특이적으로 반응하고 있음을 확인할 수 있었고, QD605와 QD525가 비슷한 결과로 나타나는 사실로부터 다양한 QD를 본 발명에서 활용할 수 있음이 검증되었다.

(3) 당단백질 농도에 다른 ConA-QD의 발광신호 분석

분석대상이 되는 당단백질의 농도를 달리하여 본 발명에 의한 바이오칩 세트로 분석하였다.

당단백질의 농도에 따른 발광신호를 확인하기 위한 것으로서 Dex-AuNP에 넣어주는 당단백질의 종류 및 농도만 다를 뿐 실험방법은 상기 (2)의 과정과 동일하였다. 보다 구체적으로 다음과 같이 실험하였다.

4개의 만노즈가 붙은 BSA (4-man-BSA)와 22개의 만노즈가 붙은 BSA (22-man-BSA)를 사용하는 각각 2개의 실험군에서 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K로 구성된 서로 다른 11개의 튜브에 50 nM Dex-금나노입자 4 μL를 각각 넣은 다음 아래와 같이 구성된 용액과 섞어주었다.

상기 용액을 넣어준 이후 HEPES 용액속에 각기 1 mM로 녹아있는 CaCl₂, MnCl₂, MgCl₂의 메탈 혼합용액 1 μL를 추가적으로 넣어 최종 부피가 10 μL가 되도록 하였다. 상기 용액을 전술한 (2)와 동일한 방법으로 ConA-QD605가 고정된 바이오칩에 반응~건조시켰다. 서로 다른 당량을 가진 Man-BSA의 최종 반응농도는 각 실험군에서 0 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM 순이었다.

전술한 (2)에서와 동일하게 슬라이드 칩 스캐너(ArrayWoRx^e)를 이용하여 형광 이미지를 형광 분석용 소프트웨어(GenePix Pro 4.0, Axon)를 사용하여 각 웰에서의 형광신호값을 산출하였다. 당량에 의한 발광신호를 정량화하기 위해서, 당이 붙은 단백질에서 나오는 발광세기에서 순수 HEPES 용액에서 나온 형광세기를 빼준 후에 상대적 증가정도를 산출하였다. 독립적으로 같은 조건에서 수행한 2번의 실험으로부터 각 신호세기의 평균 및 표준편차를 측정하여 그 결과를 도 3에 도시하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 각 당단백질의 농도에 따른 ConA-QD의 발광신호는 농도가 증가함에 따라 함께 증가함을 확인하였다. 특히 당단백질의 당량이 높은 것일수록 보다 낮은 농도에서 발광신호가 손쉽게 검출될 수 있음을 확인하였다. 사용된 당단백질의 IC₅₀ 값(최대 발광신호의 1/2 지점의 당단백질의 농도)을 산출해본 결과 4-man-BSA의 경우 39 μM, 22-man-BSA의 경우에는 820 nM였다. 따라서, 본 발명에 의한 바이오칩 세트에 의해서 당단백질의 농도를 대략적으로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 당량에 따라서 검출되는 농도범위가 다르게 나타나고 있기 때문에 당단백질의 농도변화에 따른 발광신호의 세기를 탐지함으로써 대략적인 당량을 파악할 수 있게 된다.

(4) 당단백질의 당량에 따른 ConA-QD의 발광신호 분석

ConA-QD의 발광신호가 당단백질의 당량의 변화에 의해 직접적으로 영향을 받는지를 보다 구체적으로 확인하였다.

실험은 당단백질의 종류만 달리하고 전술한 (2)와 동일하게 수행하였다.

A, B, C, D, E, F, G, H로 구성된 8개의 튜브에 50 nM Dex-금나노입자 4 μL를 각각 넣은 다음 전술한 (1)에서 제조된 서로 다른 당량을 가진 man-BSA를 아래와 같은 순서로 넣어 주었다.

상기 용액을 넣어준 이후에는 HEPES 용액속에 각기 1 mM로 녹아있는 CaCl₂, MnCl₂, MgCl₂의 메탈 혼합용액 1 μL를 추가적으로 넣어 최종 부피가 10 μL가 되도록 하였다. 이후 각 튜브를 보텍서로 빠르게 재혼합한 후 ConA-QD605가 고정된 각 실리콘 웰에 상기 혼합용액을 떨어뜨려 반응시켰다. 상온에서 1시간 방치한 후, 반응용액을 피펫으로 조심스럽게 제거한 다음 피펫을 사용하여 HEPES용액으로 3회 증류수로 세척하고 증류수로 2회 세척 후 질소가스로 천천히 건조시켰다. 형광 이미지는 슬라이드 칩 스캐너(ArrayWoRx^e)를 이용하여 얻은 후 형광분석용 소프트웨어(GenePix Pro 4.0, Axon)를 사용하여 각 well에서의 형광 신호값을 산출하였다. 당량에 의한 발광신호를 정량화하기 위해서, 당이 붙은 단백질에서 나오는 발광세기에서 당이 붙이 않은 기준 BSA에서 나온 형광세기를 빼준 후에 상대적 증가정도를 산출하였다. 독립적으로 같은 조건에서 수행한 2번의 실험으로부터 각 신호세기의 평균 및 표준편차를 측정하여 그 결과를 도 4에 도시하였다.

실험 결과, 만노즈의 결합수가 증가함에 따라 형광세기가 증가함을 확인하였는데, 이는 ConA-QD에 대한 Man-BSA의 결합력이 증가하므로 Dex-AuNP가 부착되는 것을 방지하기 때문인 것이라 해석할 수 있다.

따라서 본 발명에 의한 바이오칩 세트를 이용하면 동일한 당단백질의 농도에서 당량에 차이를 검출 가능함을 알 수 있다.

이상과 같은 실시예의 결과로부터 본 발명에 의한 바이오칩 표면에서 QD과 AuNP간의 에너지 전이에 의해 특이적 당단백질의 검출이 가능함을 확인하였고, 당단백질의 농도에 따른 발광신호를 분석함으로써 당단백질에 부착된 당량을 예측할 수 있음을 확인하였다. 특히, 당단백질의 당량분석에도 효과적임을 알 수 있었다.

또한 소량의 당단백질만으로도 효과적으로 당단백질의 선별 및 농도분석, 당량분석을 빠르게 수행할 수 있음을 확인하였다.

Claims

FRET 현상을 이용한 것으로서,

(A) 비금속성 재질의 지지체;

상기 지지체의 표면에 형성된 자기조립 단층막;

상기 자기조립 단층막의 말단기와 렉틴이 코팅된 렉틴-양자점의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 렉틴-양자점 단층막;을 포함하는 칩:과

(B) 상기 렉틴과 결합하는 당으로 코팅된, 당-에너지수용체:

를 구성요소로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 1 항에 있어서,

상기 지지체는 유리, 실리콘 또는 플라스틱 재질인 것을 특징으로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 1 항에 있어서,

상기 자기조립 단층막의 말단기는 알킬기, 아민기, 티올기, 카르복실기, 알데하이드기, 에폭시기, 말레이마이드기, NHS(N-hydroxyl succinimide)기 및 말레이마이드(maleimide)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합인 것을 특징으로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 1 항에 있어서,

상기 양자점은 최대 발광 파장 영역이 500~900nm이며, 표면의 기능기가 렉틴과 결합할 수 있는 아민기, 카르복실기, 티올기, 알데하이드기, 에폭시기, 레이마이드기 및 NHS(N-hydroxyl succinimide)로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상으로 치환된 것을 특징으로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 1 항에 있어서,

상기 에너지수용체는 상기 양자점과 FRET 반응의 쌍을 이루는 것으로서, 금속, 형광물질(fluorescent dye) 또는 형광 억제자(fluorescent quencher)로서 최대직경이 1~100nm인 나노입자인 것을 특징으로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 5 항에 있어서,

상기 금속은 금, 은 또는 백금 나노입자인 것을 특징으로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 1 항에 있어서,

상기 렉틴-양자점 단층막에서, 인접한 렉틴-양자점 사이의 공간이 에틸렌글리콜아민, 에틸렌글리콜티올, NHS(N-hydroxysuccinimide)-에틸렌글리콜, 말레이미드-에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 아민, 폴리에틸렌글리콜 티올, (NHS)-폴리에틸렌글리콜, 말레이미드-폴리에틸렌글리콜, 카르보하이드레이트 단위체 결합에 기초한 폴리머, 단백질 disulfide isomerase 또는 bovine serum albumin으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 화합물에 의해 충진된 것을 특징으로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
FRET 현상을 이용한 것으로서,

(A) 비금속성 재질의 지지체;

상기 지지체의 표면에 형성된 자기조립 단층막;

상기 자기조립 단층막의 말단기와, 결합특성이 다른 복수개의 렉틴이 발광특성이 다른 복수개의 양자점에 개별적으로 코팅되어 있는 다수종의 렉틴-양자점의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 렉틴-양자점 단층막;을 포함하는 칩:과

(B) 상기 복수개 렉틴 모두와 결합하는 당의 조합으로 코팅된, 당-에너지수용체:

를 구성요소로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
FRET 현상을 이용한 것으로서,

(A) 하나 또는 복수개의 웰 구조로 이루어져 있는 비금속성 재질의 지지체;

상기 지지체 웰 내부의 표면에 형성된 자기조립 단층막;

상기 자기조립 단층막의 말단기와 렉틴이 코팅된 렉틴-양자점의 결합에 의해 자기조립 단층막 위에 형성된 렉틴-양자점 단층막;을 포함하는 칩:과

(B) 상기 렉틴과 결합하는 당으로 코팅된, 당-에너지수용체:

를 구성요소로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 9 항에 있어서,

상기 웰이 복수개인 경우,

결합특성이 다른 복수개의 렉틴이 양자점에 코팅되어 있는 다수종의 렉틴-양자점이 각 웰 마다 각각 적용되고,

상기 당-에너지수용체를 이루는 당은 상기 복수개 렉틴 모두와 결합할 수 있는 조합으로 구성된 것을 특징으로 하는 당단백질 분석용 바이오칩 세트.
제 1 항에 의한 바이오칩 세트를 이용한 당단백질의 정성/정량 분석방법으로서,

(A) 상기 당-에너지수용체와 분석대상 당단백질을 혼합하는 단계;

(B) 단계 A의 혼합물을 상기 칩의 렉틴-양자점과 반응시키는 단계; 및

(C) 반응종료 후 상기 칩의 양자점 발광을 측정하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 당단백질의 정성/정량 분석방법.
제 11 항에 있어서,

상기 렉틴-양자점과 당-에너지수용체의 농도비율이 1:10~50 (mol/mol)인 것을 특징으로 하는 당단백질의 정성/정량 분석방법.