WO2006085534A1 - 移植用細胞の機能を活性化する方法 - Google Patents

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WO2006085534A1
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cells
transplantation
storage
bone marrow
electrostatic field
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PCT/JP2006/302086
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Satoshi Okoso
Masayuki Aso
Siro Jimi
Motohiko Sato
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Mebix.Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations

Definitions

  • the present invention relates to a method for activating cells for transplantation. More specifically, the present invention relates to a method for activating transplanted cells, which comprises placing the transplanted cells in an electrostatic field atmosphere.
  • Bone marrow transplantation is becoming a treatment practiced in patients with leukemia, lymphoma, Hodgkin's disease and hematological malignancies such as solid cancers, particularly melanoma and breast cancer. In recent years, it has been used for treatment of IMF (Idiopathic Multiple Bone Marrow Fibrosis) and bone marrow hypertrophy disease. In addition, bone marrow transplantation can be used to treat AIDS, aplastic anemia, and autoimmune diseases.
  • IMF Idiopathic Multiple Bone Marrow Fibrosis
  • the purpose of bone marrow transplantation is to replace host hematopoietic stem cells (totipotent and possibly totipotent) that have been damaged by chemotherapy, irradiation or disease.
  • hematopoietic stem cells engraft and proliferate in the bone marrow of the host, and replicate and differentiate repeatedly, so that all types of cells present in the blood, namely erythrocytes, lymphocytes, monocytes and White blood cells, including neutrophils, are made.
  • Resident macrophages and osteoclasts are also induced by hematopoietic totipotent stem cells.
  • Bone marrow transplantation uses bone marrow cells, umbilical cord blood cells, and stem cells thereof. Cells collected from donors are stored frozen in a solution containing DMSO and thawed as needed.
  • Umbilical cord blood which has been attracting attention in recent years, has about 10 times the amount of hematopoietic stem cells compared to that of blood, and because it is easy to collect, it is compatible with many HLA (human histocompatibility antigens) and is suitable for organ transplantation and bone marrow transplantation. Includes the possibility of being useful. However, there are insufficient amounts of hematopoietic stem cells for transplantation for adults. Disclosure of the invention
  • this invention consists of the following.
  • a method for activating the function of transplanted cells characterized by placing the transplanted cells in an electrostatic field atmosphere.
  • Cell force for transplantation The method according to any one of 1 to 4 above, which is a cell for bone marrow transplantation.
  • Activation of the function of cells for transplantation is the engraftment rate and proliferation rate of cells for transplantation in the transplanted tissue.
  • the engraftment rate and proliferation rate of the cells for transplantation in the non-transplanted tissue can be improved, and the transplantation efficiency can be increased.
  • the cells can be activated without freezing even at o ° c or lower, and can be activated in a good state even at temperatures of o ° c or higher. be able to. Therefore, the method of the present invention can be a very useful means in a transplant area, a regenerative medicine area, a gene therapy area, a basic experiment area, and the like.
  • FIG. 1 is a transverse central cross-sectional view of an apparatus used in the present invention.
  • FIG. 2 is a front central sectional view of an apparatus used in the present invention.
  • FIG. 3 is a shelf drawing of the apparatus used in the present invention. 4] A cross-sectional view of the apparatus used in the present invention.
  • the electrostatic field atmosphere of the present invention can be obtained, for example, by placing a closed or open container in an electrostatic field state.
  • Various means are known for creating an electrostatic field atmosphere. For example, this can be achieved by simply placing an electrode plate in an insulated state on the bottom of the container.
  • a normal household or commercial refrigerator can be easily converted into an electrostatic field refrigerator.
  • it is composed of a horizontal plate made of an insulating material (PVC plate), side plates that can be assembled to both sides of the horizontal plate via hinges, and a bottom plate that closes the bottom of the electric field box. Then, the front and upper surfaces are opened to open and close the refrigerator door, and the object can be easily moved in and out.
  • a high voltage is applied to one of the metal rods, etc. by a connecting line or high voltage generator, and an electrostatic field atmosphere is formed.
  • a container provided with an electrode for forming an electrostatic field atmosphere, and an AC or DC voltage applied to the electrode
  • a device provided with a power supply for generating an electrostatic field and a cooling device capable of holding, for example, cells for transplantation at a refrigerated temperature can be exemplified.
  • a conductive curtain may be provided.
  • This curtain is made by attaching a conductive paint to the surface of a flexible cloth, plastic or the like, or making the curtain itself thin aluminum. You may form by using a board etc.
  • the curtain is connected to the high voltage generator via a rail or the like.
  • An apparatus used in the present invention includes an electrostatic field generator and a cooling device.
  • the apparatus is divided into at least two sections, and a storage section and a cooling section for microorganisms, animal organs, their slices, or cells (hereinafter referred to as cells and the like) are distinguished and Z or separated. Both compartments have at least some communication parts, and air circulation is achieved through these communication parts.
  • the position of the communication part is not particularly limited, but is preferably in the lower part. If air convection control measures are taken, it is not necessary to limit it to the lower part!
  • the storage compartment for cells and the like can be at least an electrostatic field atmosphere and is separated so that it does not have a cooling function.
  • Cooling of storage compartments such as cells is achieved by distinguishing between storage compartments such as cells and cooling compartments, and by cooling the air through the convection of air due to the temperature difference between them. This is done by slowly flowing into the storage compartment.
  • the cooling compartment (16 in the figure) is cooled by a chiller, resulting in a temperature difference between the storage compartment and the cooling compartment.
  • the air is circulated by the action of a fan (4 in the figure), the chilled air is convected through the communication section and mixed with the slightly raised air, allowing the storage compartment to cool slowly.
  • the storage stability of cells and the like was significantly increased.
  • the device used in the present invention is provided with a sensor for linking the temperature in the device and the operation of the cooler.
  • the sensor operates and stops the cooler in conjunction with the thermostat.
  • the desired temperature is -5 to -3, and if it is -5 or less, it is switched off, and if it is -3 or more, it is switched on.
  • the installation position of this sensor is preferably around the communication part. Alternatively, in order to sense the temperature of the entire storage compartment, it can be installed at the center of the storage compartment or at the deepest part of the air flow.
  • a preferred embodiment of the apparatus used in the present invention is a structure in which the convection air does not directly reach cells or the like.
  • what is shown in the embodiment is a structural design in which air convection occurs only from the lower side of a storage shelf for cells and the like.
  • the air cooled by the cooler also generates force only from the lower part of the storage compartment (17 in the figure) to the lower side of the storage shelf such as cells, etc., through the communication part (19) installed in the lower part.
  • This structural design significantly increased the storage stability of cells and the like.
  • the air convection is not limited to this, and even if the upper force or the lateral force is applied to the cooling compartment, even if it flows into the storage compartment, the air inflow directly hits the cells etc. using a certain shielding plate. It can be used unless the cells are rapidly cooled.
  • Such an embodiment is also an apparatus that can be used in the present invention.
  • Storage shelves for cells or the like installed in a storage compartment of a storage device for cells or the like are installed vertically in a plurality of stages.
  • This storage shelf has a number of air gaps (14 in the figure) for the passage of air.
  • the air gap is preferably a right-angle smooth surface and not an oblique cut.
  • the diameter of the air gap is 5mm-30mm.
  • the shelf may have a net structure. In other words, the same purpose can be achieved with a network structure that is formed by voids.
  • the ratio of clear parts is generally 20 to 90%, preferably 30 to 70%.
  • the shelf shall have an inner layer, for example, a metal wall (7 in the figure) and a gap of about 0 to 15 mm.
  • the front and rear are 0 mm and the left and right are about 15 mm. Air convects in the storage compartment through these gaps and shelf gaps, and slowly saves the cells, etc.
  • the shelf is cooled and the stored items are cooled in an electrostatic field atmosphere.
  • This storage shelf is made of a conductive material, for example metal.
  • the storage section of the storage shelf such as cells of the apparatus used in the present invention is in an electrostatic field atmosphere.
  • the storage compartment consists of a part of the door for entering and exiting cells (13 in the figure), a lower opening (8 in the figure), conductive materials (for example, stainless steel, aluminum foil, conductive paint, conductive rubber, conductive tape,
  • conductive materials for example, stainless steel, aluminum foil, conductive paint, conductive rubber, conductive tape
  • the material may be a material coated with a known conductive material such as a conductive ink, or may be itself.
  • the conductive material means the same in the following.
  • Edge material for example, polycarbonate, ABS resin, ceramic, Teflon (registered trademark), plastic, vinyl chloride resin, insulating glass, PBS, silicon, wood, paper, or other material coated with a known insulating material may be used.
  • the insulating material has the same meaning.
  • And is constituted by a partition wall formed of an outer layer portion (6 in the figure).
  • the storage compartment and the cooling compartment are distinguished and Z or separated by the partition of the inner layer (7 in the figure) and the outer layer (6 in the figure), and communicate with each other through the communication part (19).
  • the contact part between the partition wall and the cooling compartment is made of an insulator (for example, polycarbonate, ABS resin, ceramic, Teflon (registered trademark), plastic, chlorinated resin, insulating glass, PBS, silicon, wood, paper, etc.
  • a material covered with a known insulating material may be used, or it may be itself.
  • the insulating material has the same meaning in the present invention.
  • the inside of the container is in an electrostatic field state.
  • electrostatic field state Various means are known in order to obtain an electrostatic field atmosphere. For example, this can be achieved by simply placing the electrode plate in an isolated state on a specific portion in the storage compartment. Alternatively, this can be achieved by connecting a high voltage generator (1 in the figure) to the inner layer, for example, a metal wall (7 in the figure) with a high voltage cable (2 in the figure).
  • the storage section of the storage shelf for cells and the like of the apparatus used in the present invention can be created by installing the storage section in a cooling section (cooling device) in a semi-open manner (opening only through the communicating portion).
  • the cooling compartment consists of an inner layer part (10 in the figure) made of heat insulating material, an outer wall (9 in the figure) made of protective material, a part of the door (12 in the figure), and a fan for air circulation (in the figure). 4)
  • the cooler including the evaporator and compressor (11 in the figure) is included in the components. Ordinary household or commercial refrigerators can be easily used.
  • a storage section with an electrostatic field atmosphere that satisfies the above conditions may be installed in the refrigerator-freezer.
  • the obstructing side plates on both sides and the electric field box Only the communication between the upper plate and the electric field box that closes the upper part is opened, and a storage shelf force with many gaps is formed.
  • the front side is open, and the object can be easily put in and out when the refrigerator door is opened.
  • a high voltage generator a high voltage is applied to a conductive material such as one of metal bars to form an electrostatic field atmosphere.
  • a strength of about 1 to 5 mZs is sufficient for the air circulation fan.
  • the electrostatic field atmosphere of the present invention is formed by applying an AC or DC voltage of 100 to 10,000 V, preferably 500 to 8000 V, more preferably 1000 to 6000 V, and still more preferably 2000 to 4000 V to the electrodes.
  • the voltage to be applied can be appropriately selected depending on the storage object and its storage state. In particular, the voltage to be applied can be selected depending on the storage solution and the material of the storage container.
  • the current may be either alternating current or direct current.
  • the time for activating the transplanted cells is 1 to 4 days, preferably 2 to 3 days, more preferably 2 days.
  • the temperature that can be applied to the method for activating cells for transplantation of the present invention is -30 to 40 ° C, preferably -20 to 5 ° C, more preferably -10 to -1 ° C, and still more preferably. -7 to -3 ° C.
  • the temperature can be appropriately selected depending on the storage object and its storage state.
  • the cells for transplantation can be activated without freezing due to the supercooling phenomenon.
  • the supercooling phenomenon is a phenomenon in which a substance does not freeze even at a temperature below the freezing point, which is the temperature just before the liquid begins to freeze. Even at a temperature below the freezing point, it is considered that in the electrostatic field atmosphere of the present invention, the temperature is transmitted to the substance and at the same time, micro-vibration energy occurs, the aqueous solution does not freeze, and the cells do not freeze.
  • the activity of transplanted cells in the method of the present invention can be carried out by immersing the transplanted cells in an aqueous solution.
  • Immersion refers to a state in which cells for transplantation are immersed in an aqueous solution in a metal or plastic container.
  • aqueous solution generally known preservation solutions for all cells and the like, and preservation solutions to be developed in the future can be used.
  • Typical preservation solutions include, for example, Ringer's solution, Eurocollins solution, UW solution, SLS solution, H-L solution, HTK solution, etc., which are used in transplantation today, and commercially available products such as LATATECH (manufactured by Otsuka Pharmaceutical). ).
  • the activity of the transplanted cell in the method of the present invention is obtained by subjecting the transplanted cell to an electrostatic field atmosphere. It can be carried out by leaving it in the air. Leaving it in an electrostatic field atmosphere means that transplanted cells are placed in an electrostatic field atmosphere without being placed in an aqueous solution. The substance itself is stored in a container such as metal or plastic. ! It ’s okay.
  • the method of the present invention can be applied to cells for transplantation used in a transplant area, a regenerative medicine area, a gene therapy area, and a basic experiment area.
  • a transplantation area bone marrow, heart, lung, liver, kidney, spleen, spleen, intestine, small intestine, heart valve, skin, blood vessel, cornea, eyeball, dura mater, bone, trachea, ear bone, etc., umbilical cord blood cells, etc.
  • hematopoietic stem cells hematopoietic stem cells, ES cells (embryonic stem cells), neural stem cells, and the like can be mentioned.
  • ES cells embryonic stem cells
  • neural stem cells and the like.
  • the gene therapy area cells into which genes and drugs have been introduced can be mentioned.
  • Examples thereof include cells obtained by vitality.
  • One embodiment of the present invention is the activity of the function of cells for bone marrow transplantation.
  • bone marrow transplantation cells include bone marrow cells, umbilical cord blood cells, and stem cells thereof.
  • Bone marrow cells can be obtained by any mammalian force according to methods known in the art. For example, bone marrow can be gained donor power by inserting a needle into the medullary cavity and aspirating the bone marrow.
  • the cells for transplantation used in the present invention must be living (eg, nucleated).
  • the cells used can also be harvested from the mammal to which it is returned, or another Z different mammalian force of the same or different (donor) and introduced into the recipient.
  • the cells can also be collected from pigs and introduced into humans.
  • mammals used in the present invention include humans and other primates (monkeys, chimpanzees, etc.), rodents (rats, mice, guinea pigs, etc.) and ruminants (ussi, pigs, horses, etc.). It is.
  • the donor means a mammal that is a natural source of cells for transplantation.
  • the donor is preferably a healthy mammal.
  • a recipient means a non-transplanted mammal of cells for transplantation.
  • it is desirable that the donor and recipient are compatible for histocompatibility.
  • donors and recipients can Combined Gene Complex (MHC) (Human Leukocyte Antigen) (HLA) Desirable to be compatible with Class I and Class II antigens U ,. Histocompatibility between donor and recipient is determined by methods known in the art.
  • MHC Human Leukocyte Antigen
  • HLA Human Leukocyte Antigen
  • IMDM Iscove modifi ed Dulbesso medium
  • mice overexpressing GFP Green Fluorescent protein
  • GFP Green Fluorescent protein
  • Recipient mice were treated with 9-week-old male C57BL / 6 and 750 1 intraperitoneally administered 86.5 mM 5-FU (5-fluorouradl) on the day before transplantation for pretreatment for bone marrow suppression. Transplant those day, Nembutal was intraperitoneally administered, slow intravenous injection in in heparinized syringes from the subclavian vein of mice subjected to general anesthesia f the lxlO 7/200 ⁇ 1 bone marrow cells.
  • the number of fluorescent platelets and fluorescent cells after bone marrow transplantation were collected with 751 heparinized heparinized orbital blood samples and expressed in flow cytometry (FACS) per 100,000 million cells. Two time points were examined, 7 days after transplantation (early transplantation) and 15 days (transplantation period).
  • Fluorescence-containing blood cells are detected by flow cytometry per 100,000 cells, and the number is expressed as the number of successful transplants.
  • Administer green mouse bone marrow cells intravenously Then, the peripheral blood circulates in the number of several tens of units, but disappears from the peripheral blood in several hours.
  • fluorescent cells transplanted in the bone marrow appear in the peripheral blood on the 4th day and increase until the 7th day (early transplantation). After that, when rejection occurs, almost all of the fluorescent-containing cells disappear in peripheral blood force on the 15th day (transplant establishment stage), but when the bone marrow transplant is established through the rejection, the value shifts to almost that value. I will do it.
  • Bone marrow cells stored on the day of bone marrow collection (Oday) and in an antifreeze supercooled incubator for 1, 2, 4, and 7 days were administered intravenously to mice that had been myelosuppressed with 5-FU the day before (one mouse each).
  • the storage period exceeded 4 days cell aggregation was observed, and when the storage period was 7 days, it was partly soft.
  • Fluorescent platelets are derived from green mouse stem cells engrafted in bone marrow.
  • the cytoplasm of mature megakaryocytes is fragmented and released into peripheral blood.
  • Figure 1 shows the amount of fluorescent platelets that appeared in peripheral blood on days 7 and 15 after transplantation of bone marrow cells stored for various periods. There was an increase on the 15th day compared to the 7th day in all storage periods. On the 15th day when the transplant was established, the increase was about 1.5 times that of the same day transplant (day 0), which was most frequently stored for 2 days.
  • Fluorescent-containing cells are stem cells derived from green mice engrafted in the bone marrow. Red blood cells are leukocyte cells because they do not have fluorescence, and have fluorescence stronger than that of platelets.
  • Figure 2 shows the amount of fluorescent blood cells that appeared in peripheral blood on day 7 and 15 after transplantation of bone marrow cells stored for various periods. In any of the retention periods, the force increased on day 15 compared to day 7 (0 day: 1.2 times, 1 day: 1.9 times, 2 days: 3.5 times, 4 days: 1.1 times). On the 15th day, there was an increase of about 2.4 times compared with the same day transplant (Day 0), which is the most frequently stored for 2 days.
  • FIG. 1 is a transverse central sectional view of a cell storage apparatus that can be used in the present invention.
  • Figure 2 shows the It is front center sectional drawing of the preservation
  • the left side of Fig. 1 is a part of the door.
  • the apparatus consists of a cooling compartment (16), a storage compartment (17) and a communication part (19).
  • the cooling compartment (16) and the storage compartment (17) are distinguished by a semi-open wall having a communication part (19).
  • a storage device (17) for cells and the like that achieves an electrostatic field atmosphere distinguished by a semi-open wall is installed in a so-called cooling device (16).
  • the cooling device is composed entirely of a heat insulating material (10) and an outer wall (9), all of which are equipped with doors (12) for removing stored items.
  • the door (12) is similarly composed of a heat insulating material (10) and an outer wall (9).
  • the cooler (11) includes a normal evaporator and a compressor.
  • a fan (4) is installed in the cooler, causing the air in the cooler to circulate.
  • l causes circulation with wind power of about 5mZs.
  • Earth (18) discharges excess current.
  • the inside of the cooling device can be set to 20-5 ° C.
  • the storage compartment (17) installed in the cooler (11) is a double-structured bulkhead consisting of an inner wall (7) made of current-carrying material and an outer wall (6) made of insulating material.
  • the lower part is open (8).
  • This double-structured partition is insulated from the cooling device (3) and the flow of electricity is interrupted.
  • the insulating part also has the significance of the supporting part (3) of the internal storage device (17), and is installed at the lower four places.
  • Insulation (3) should be installed at the four corners. Actually, it is not displayed in the horizontal center sectional view or front central cross sectional view, but is shown with a broken line to clarify the positional relationship. .
  • a door part (13) which also consists of an inner wall (7) made of current-carrying material and an outer wall (6) made of insulating material. It is a double structure wall.
  • the storage shelf is made of a conductive material.
  • Takigen's shelves for shelf boards and shelves are exemplified.
  • the shelf (5) may be in contact with the inner wall of the double structure partition wall, but may be separated.
  • the gap is 0-15mm.
  • the storage shelf has a number of air gaps (Fig. 3) through which air convection is achieved.
  • Containers (15) for culture etc. will be installed on the storage shelf as appropriate.
  • a high voltage generator (1) applies an AC or DC voltage of about 100V to 5000V to a high voltage cable (2) And apply to the electrode to create an electrostatic field atmosphere in the storage device (17).
  • the cooling device (16) operates at a temperature of -3 ° C or higher and stops at a temperature of 5 ° C or lower, for example, with a temperature range of -5 ° C to 13 ° C. ) Is adjusted by a thermostat linked to the temperature sensor installed in the), and the storage unit is made an electrostatic field atmosphere with an AC voltage of about 3000V.
  • the door 1 (12) and the door 1 (13) are opened and placed on the storage shelf (5) of the storage device (17). Opening the door raises the room temperature in the storage device (17) several degrees.
  • a temperature difference of several degrees occurs between the storage compartment (17) and the cooling compartment (16).
  • slow air convection due to temperature difference occurs.
  • Only the communication part (19) is opened (8) in the partition wall of the storage device (17), and the air slowly rises through the communication part (19) to raise the storage compartment (17), thereby greatly cooling the storage compartment. Can be achieved gently.
  • the apparatus that can be used in the present invention disclosed in FIG. 1 and FIG. 2 is a form in which the storage device (17) is installed in the cooling device (16).
  • the apparatus that can be used in the present invention is not limited to this and is a cooling compartment.
  • the cooling air from the air flows from the communicating part of the storage compartment by convection based on the temperature difference and cools the storage compartment in an electrostatic field atmosphere, it is an object of the present invention.
  • the storage device (17) and the cooling device (16) are left and right, only the communication part (19) is open (8) between the storage device (17) and the cooling device (16).
  • the door 1 is installed only in the storage device, and a high voltage is applied to the conductive material layer of the storage device (17) (Fig. 4).
  • the double structure of each wall is the same force as in Figs. 1 and 2.
  • the door (12) and door (13) in Fig. 1 are integrated into the gap between the door (12) and door (13). It is a thing that lost.
  • the storage compartment is more preferably the structure disclosed in FIGS. 1 and 2 of the structure installed in the cooling compartment. External temperature force 20 number.
  • C the internal temperature rises by 10 or more by opening the door. Since it reaches C, such a structure is more preferable in order to minimize the temperature rise in the storage compartment.
  • the cells for transplantation can be activated and the transplantation efficiency can be improved.
  • the method of the present invention can be used particularly for transplantation areas, regenerative medicine areas, basic experiment areas, and the like.

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Abstract

【課題】移植用細胞の機能を活性化し、生着および増殖効率を増加させる方法の提供することである。 【解決手段】移植用細胞を静電場雰囲気内に置いて保存することによる。静電場雰囲気は、100～10000Ｖの交流又は直流電圧を電極に印加して形成される。静電場雰囲気での保存温度は-30～40°Cであり、静電場雰囲気でなければ移植用細胞が凍結しうる-10～-1°Cでも凍結させることなく活性化することができる。本発明の方法は、特に、移植領域、再生医療領域、遺伝子治療領域、基礎研究領域等に利用することができる。

Description

移植用細胞の機能を活性化する方法
技術分野
[0001] 本発明は、移植用細胞を活性ィ匕する方法に関するものである。さらに詳しくは、移 植用細胞を静電場雰囲気内に置くことを特徴とする、移植用細胞を活性化する方法 に関する。
背景技術
[0002] 骨髄移植は、白血病、リンパ腫、ホジキン病並びに固形癌、特に黒色腫および乳癌 のような血液学的悪性疾患の患者において施行される治療になりつつある。また、最 近 IMF (特発性多発性骨髄線維増殖) 、つた骨髄肥大性疾患の治療にぉ 、て用い られている。さらに、骨髄移植は、エイズ、再生不良性貧血及び自己免疫疾患の治 療にち使用することがでさる。
[0003] 骨髄移植の目的は、化学療法、照射または病気により障害を受けた宿主造血幹細 胞 (全能及び多分ィ匕能)を置換することである。移植された細胞のうち、造血幹細胞 がホストの骨髄内に生着、増殖し、繰り返し複製し分化することで、血液中に存在す る全ての種類の細胞、すなわち赤血球、リンパ球、単球および好中球を含む白血球 が作られる。常在マクロファージ及び破骨細胞も造血全能幹細胞カゝら誘導される。
[0004] 骨髄移植には、骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれら幹細胞が用いられて 、る。ド ナ一力も採取された細胞は、 DMSOを添加した溶液中で凍結保存され、必要に応じ 解凍し用いられている。近年注目されている臍帯血は、その造血幹細胞量が血液の それに比べ 10倍程度多ぐまた採取が簡便なため数多くの HLA (ヒトの組織適合性 抗原）に対応し、臓器移植及び骨髄移植に有用である可能性を包含している。しかし ながら、成人に対する移植には不十分な量の造血幹細胞しか含まれて 、な 、。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 移植用細胞の機能を活性化し、生着率および増殖率を増加させる方法の提供が、 本発明の課題である。 課題を解決するための手段
[0006] 上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らは、移植用細胞を静電 場雰囲気内に置くことで移植用細胞の機能を活性ィ匕することを見出し、本発明を完 成した。
つまり本発明は以下からなる。
1.移植用細胞を静電場雰囲気内に置くことを特徴とする、移植用細胞の機能を活 性化する方法。
2.静電場雰囲気力 100〜10000Vの交流または直流電圧を電極に印加して形成され る前項 1に記載の方法。
3.移植用細胞を、 -30〜40°Cで静電場雰囲気内に置くことを特徴とする前項 1又は 2 に記載の方法。
4.移植用細胞力 骨髄移植用の細胞である前項 1〜4のいずれか 1項に記載の方 法。
5.骨髄移植用の細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれらの幹細胞力 選ばれ る前項 4に記載の方法。
6.移植用細胞の機能の活性化が、被移植組織における移植用細胞の生着率およ び増殖率 7.前項 1〜6のいずれか 1項に記載の方法により調製される移植用細胞。 発明の効果
[0007] 本発明の方法により、移植用細胞を静電場雰囲気に置くことで、移植用細胞の非 移植組織における生着率および増殖率を向上し、移植効率を高めることが可能とな る。また、本発明の方法においては、 o°c以下であっても細胞を凍結させることなく活 性ィ匕することができ、 o°c以上の場合であっても良好な状態で活性ィ匕することができ る。したがって、本発明の方法は、移植領域、再生医療領域、遺伝子治療領域、基 礎実験領域等において非常に有用な手段となりうる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]本発明で使用した装置の横中央断面図である。
[図 2]本発明で使用した装置の正面中央断面図である。
[図 3]本発明で使用した装置の棚図面である。 圆 4]本発明で使用した装置の横断面図である。
[図 5]末梢血内蛍光含有血小板量の推移
[図 6]末梢血内蛍光含有細胞量の推移 符号の説明
1:高電圧発生機
2:高圧ケーブル
3:絶縁部
3:支持部
4:ファン
5:保存棚
6:外側壁
7:内側壁
8:開放
9:外壁
10:断熱材
11:冷却機
12:ドア一
13:ドア一部
14:空隙
15:容器
16:冷却装置
16:冷却区画
17:保存区画
17:保存装置
18:アース
18:棚板留
19:連通部
発明を実施するための最良の形態 [0010] 本発明の静電場雰囲気は、例えば閉鎖系又は開放系の容器内を静電場状態にす ることにより得られる。静電場雰囲気とするために、種々の手段が公知であるが、例え ば容器内の底部に単に電極板を絶縁状態で載置することで達成される。また、通常 の家庭用又は業務用の冷蔵庫を簡便に静電場冷蔵庫に変換することができる。例え ば絶縁材料 (塩ビ板)からなる横板と、この横板の両側にヒンジを介して組立て自在と された側板と、電場箱の底部を閉塞する底板から形成される。そして、その前面と上 面は開放されて冷蔵庫の扉を開 、たときに対象物の出入が容易に行 、得る。接続 線、高電圧発生装置で、高電圧がいずれかの金属棒等に印加され、静電場雰囲気 が形成される。
[0011] 本発明の移植用細胞の活性ィ匕方法に使用することができる装置として、具体的に は、静電場雰囲気を形成させるための電極を備えた容器と、該電極に交流又は直流 電圧を印加する静電場発生用電源と、上記容器に、例えば移植用細胞を冷蔵温度 に保持できる冷却装置とを備えた装置を例示することができる。
[0012] 更に、冷蔵室内の空気を帯電させるためには、導電性カーテンを設けてもよぐこの カーテンは柔軟な布、プラスチック等の表面に導電性塗料を付着させたり、カーテン 自体を薄いアルミ板等にすることにより形成してもよい。そして、カーテンは、レール 等を介して高電圧発生装置に接続される。
[0013] 本発明で使用する装置は、静電場発生装置と冷却装置を備えている。そして、装 置は、少なくとも 2区画に分かれており、微生物、動物の臓器、その細切り、又は細胞 (以下これらを細胞等という）の保存区画と冷却区画が区別及び Z又は分離されてい る。両区画は少なくとも一部の連通部を有し、この連通部を通じて空気の流通が達成 される。連通部の位置は特に限定されないが、好適には下方部にある。空気対流の 制御手段を講じれば下方部には限定する必要はな!、。細胞等の保存区画は少なく とも静電場雰囲気にすることができ、この区画には冷却機能はないように分離される 。細胞等の保存区画の冷却は、細胞等の保存区画と冷却区画が区別及び Z又は分 離されていることにより生じる両者間の温度差による空気の対流によって冷却された 空気力 連通部を経て細胞等の保存区画に緩徐に流入することによっておこなわれ る。つまり、細胞等が保存区画に保存された際には、保存装置のドア（図中 12及び 1 3)を開けることから外部の空気が流入し、保存区画（図中 17)の温度が上昇する。一 方、冷却区画（図中 16)は冷却機によって冷却されており、保存区画と冷却区画に温 度差が生じる。ファン（図中 4)等の作用で空気に循環を起こすと、冷えた空気が連通 部を経て対流し、少し上昇した空気と混ざり合い、緩徐に保存区画の冷却を達成で きる。この結果、細胞等の保存安定性が有意に上昇した。
本発明で使用する装置は、装置内の温度と冷却機の稼動を連動させるためのセン サーを設置する。センサーは、サーモスタットに連動し、冷却機の稼動及び停止を行 う。温度は、例えば— 5〜― 3を所望温度とし、—5以下であればスィッチオフ、—3以 上であればスィッチオンとなる。このセンサーの設置位置は好適には、連通部周辺で ある。あるいは、保存区画全体の温度を感知するためには、保存区画の中央部又は 空気流通の最深到達部に設置することもできる。
[0014] 本発明で使用する装置の好ましい態様は、前記対流する空気が、細胞等に直接及 ばない構造である。たとえば、実施例に示したものは空気の対流が、細胞等の保存 棚の下側のみからおこる構造的設計である。この構造では冷却機によって冷却され た空気は、下方部に設置された連通部（19)を経て、保存区画（図中 17)の下部から 例えば細胞等の保存棚の下側のみ力もおこる。この構造的設計によって、細胞等の 保存安定性が有意に上昇した。しかし、空気の対流はこれに限定されるものではなく 、上側力 或は横側力 冷却区画力 保存区画に流入してきても、一定の遮蔽板等 を使 、、空気流入が細胞等に直接あたり細胞等の冷却を急激に行うのでなければ利 用できる。このような態様も本発明で使用できる装置である。
[0015] 細胞等保存装置の保存区画に設置される細胞等の保存棚は、複数段に上下に設 置される。この保存棚は、空気の通過のために多数の空隙（図中 14)が設けられてい る。空隙は、好ましくは、直角滑面であって、斜めの切れ目でないことがよい。空隙の 直径は、 5mm〜30mmである。なお、棚は網構造であってもよい。つまり空隙でなぐ 網目構造でも同様に目的は達成できる。空瞭部の比率は、 20〜90%が一般的、好 適には 30〜70%である。棚は、内層部例えば金属壁（図中 7)と 0〜15mm程の空隙 を設ける。例えば、前後が 0mmで、左右が 15mm程度が例示される。この空隙及び棚 の空隙を経て、空気は保存区画内を対流し、緩徐に下力 上方向に細胞等の保存 棚を冷やし、保存物を静電場雰囲気下で冷却する。この保存棚は、導電性材料例え ば金属でつくられている。
[0016] 本発明で使用する装置の細胞等の保存棚の保存区画は、静電場雰囲気にある。
保存区画は、細胞等の出し入れ用のドア一部（図中 13)、下部の開放部（図中 8)、 導電性材料 (例えばステンレス、アルミ箔、導電塗料、導電性ゴム、導電性テープ、 導電性インク等の公知の導電性材料で被覆された材料でも良いし、自体でも良 、。 以下本発明で導電性材料は同様の意味。）によって形成された内層部（図中 7)、絶 縁性材料 (例えばポリカーボネート、 ABS榭脂、セラミック、テフロン (登録商標）、プ ラスチック、塩化ビニル榭脂、絶縁ガラス、 PBS、シリコン、木材、紙等の公知の絶縁 材料で被覆された材料でも良いし、自体でも良い。以下本発明で絶縁材は同様の意 味。）によって形成された外層部（図中 6)からなる隔壁等によって構成されている。そ して、保存区画と冷却区画は、この内層部（図中 7)と外層部（図中 6)の隔壁によって 、区別及び Z又は分離され、連通部（19)を通じて連通している。さらに、この隔壁と 冷却区画との接触部は絶縁体 (例えばポリカーボネート、 ABS榭脂、セラミック、テフ ロン (登録商標）、プラスチック、塩化ビュル榭脂、絶縁ガラス、 PBS、シリコン、木材、 紙等の公知の絶縁材料で被覆された材料でも良いし、自体でも良い。以下本発明で 絶縁材は同様の意味。 ) (図中 3)が設置され、漏電を防ぐ。
保存区画の好ましい態様は、容器内を静電場状態にする。静電場雰囲気とするた めに、種々の手段が公知であるが、例えば保存区画内の特定部に単に電極板を絶 縁状態で載置することで達成される。あるいは、内層部例えば金属壁（図中 7)に高 電圧発生装置（図中 1)を高圧ケーブル（図中 2)でつなぐことでも達成できる。
[0017] 本発明で使用する装置の細胞等の保存棚の保存区画は、冷却区画 (冷却装置）内 に半開放 (連通部を通じてのみ開口）的に設置することによってつくることができる。 冷却区画は、断熱材によって形成された内層部（図中 10)、保護材によって形成され た外壁（図中 9)よりなり、ドア一部（図中 12)、空気循環用のファン (図中 4)、蒸発機 と圧縮機を含む冷却機 (図中 11)等を構成要素に含む。通常の家庭用又は業務用 の冷凍冷蔵庫を簡便に利用することもできる。この冷凍冷蔵庫内に上記条件を満た す静電場雰囲気の保存区画を設置すればよい。両側に閉塞性の側板と、電場箱の 上部を閉塞する上板と電場箱の連通部のみを開放し、多数の空隙をもつ保存棚力 形成される。そして、その前面は用事開放されて冷蔵庫の扉を開いたときに対象物 の出入が容易に行い得る。高電圧発生装置で、高電圧がいずれかの金属棒等の導 電性材料部に印加され、静電場雰囲気が形成される。
なお、空気循環用ファンの強さは、例えば、 l〜5mZs程度の強さで十分である。
[0018] 本発明の静電場雰囲気は、 100〜10000V、好ましくは 500〜8000V、より好ましくは 1000〜6000V、さらに好ましくは 2000〜4000Vの交流又は直流電圧を電極に印加し て形成される。印加する電圧は、保存対象物やその保存状態により適宜選択するこ とができる。特に、保存液中で保存する場合や保存容器の材質により、印加する電 圧を選択することができる。電流は交流、直流のいずれであってもよい。本発明の方 法において移植用細胞を活性ィ匕する時間は、 1〜4日間、好ましくは 2〜3日間、より 好ましくは 2日間である。
[0019] 本発明の移植用細胞の活性化方法に適用されうる温度は、 -30〜40°C、好ましくは - 20〜5°C、より好ましくは- 10〜- 1°C、さらに好ましくは- 7〜- 3°Cである。該温度は、 保存対象物やその保存状態により適宜選択することができる。特に例えば 0°C以下で あっても、過冷却現象により、移植用細胞を凍結させることなく活性ィ匕することができ る。ここに過冷却現象とは、液体が凍り始める寸前の温度である氷結点を下回る温度 であっても物質が凍らない現象をいう。氷結点を下回る温度の場合でも、本発明の静 電場雰囲気下では、物質へ温度を伝えると同時に微振動エネルギーが起こり、水溶 液は凍結せず、細胞の凍結も起こらな 、と考えられる。
[0020] 本発明の方法における移植用細胞の活性ィ匕は、移植用細胞を水溶液中に浸漬さ せて実施することができる。浸漬とは、移植用細胞が金属やプラスチック等の容器内 の水溶液中に浸っている状態をいう。該水溶液として、一般的に公知のあらゆる細胞 等の保存液や今後開発される保存液を利用することができる。保存液の代表的なも のとして、例えば今日の移植で用いられているリンゲル液、ユーロコリンズ溶液、 UW 溶液、 SLS溶液、 H—L溶液、 HTK溶液等や、市販品、例えばラタテック（大塚製薬 製)が挙げられる。
[0021] また、本発明の方法における移植用細胞の活性ィ匕は、移植用細胞を静電場雰囲 気内にそのまま存置させて実施することができる。静電場雰囲気内にそのまま存置さ せるとは、移植用細胞が、水溶液中におかれることなくそのまま静電場雰囲気内にお かれることを 、 、、物質そのものが金属やプラスチック等の容器内に収納されて！、て も良い。
[0022] 本発明の方法は、移植領域、再生医療領域、遺伝子治療領域、基礎実験領域で 用いる移植用細胞に適用することができる。移植領域では、骨髄、心臓、肺、肝臓、 腎臓、脾臓、脾臓、腸管、小腸、心臓弁、皮膚、血管、角膜、眼球、硬膜、骨、気管 及び耳小骨等由来の細胞、臍帯血細胞等が挙げられる。再生医療領域では、造血 幹細胞、 ES細胞 (胚性幹細胞）、神経幹細胞、等が挙げられる。遺伝子治療領域で は、遺伝子及び薬剤を導入した細胞が挙げられる。さらに、基礎実験領域では、各 種臓器や摘出生体試料及び検体由来の細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血 液幹細胞などの培養系細胞および再生医療用各種細胞等が挙げられる。また各種 アツセィ等に利用可能な細胞にも適用することができる。例えば、市販の株化細胞や
、生体力 取得した細胞等が挙げられる。
[0023] 本発明の一実施態様は、骨髄移植用細胞の機能の活性ィ匕である。骨髄移植用細 胞として、骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれらの幹細胞が挙げられる。骨髄細胞は 当該分野に公知の方法に従って任意の哺乳動物力 得ることができる。例えば、骨 髄は髄腔に針を挿入し、骨髄を吸引することによってドナー力 得ることができる。
[0024] 本発明に用いられる移植用細胞は、生きたもの（例えば、有核)である必要がある。
使用される細胞はそれが戻される哺乳動物から、または同種または異種 (ドナー）の 別の Z異なる哺乳動物力も採取することができ、レシピエントに導入される。例えば、 該細胞はブタカも採取し、ヒトに導入することができる。本発明に用いられる哺乳動物 の例として、ヒト及び他の霊長類 (サル、チンパンジー等）、げっ歯類 (ラット、マウス、 モルモット等)及び反芻動物（ゥシ、ブタ、ゥマ等）が含まれる。
[0025] ドナーとは、移植用細胞の天然採取源である哺乳動物を意味する。ドナーは健常 な哺乳動物が望ましい。また、レシピエントとは、移植用細胞の非移植哺乳動物を意 味する。本発明の一実施態様においては、ドナー及びレシピエントは組織適合性に ついて適合することが望ましい。一例として、ドナー及びレシピエントは、主要組織適 合遺伝子複合体 (MHC) (ヒト白血球抗原） (HLA) クラス I及びクラス II抗原について 適合することが望ま U、。ドナーとレシピエントの間の組織適合性は当該分野に公知 の方法により決定される。
実施例
[0026] <材料および方法 >
(静電場雰囲気条件）
不凍過冷却インキュベーター（3000V、 -5°C)の網棚 3段の最下層内に Iscove modifi ed Dulbesso medium (IMDM)培地で懸濁した骨髄細胞を入れ、 0、 1、 2、 4、 7日間保 存した。
[0027] (骨髄細胞）
GFP (Green Fluorescent protein)過剰発現マウス（グリーンマウス）を深麻酔後、 心臓力 脱血死させて後、大腿骨と脛骨、計 4本を採取し、 IMDM培地内で骨髄細胞 を採取した。成マウスの場合は 5〜7xl07個の細胞を採取し、細胞密度 5xl07/mlにて I
MDM培地中で調整した。
[0028] (骨髄移植）
レシピエントのマウスは 9週令のォス C57BL/6を用い、移植前日に 86.5 mMの 5-FU (5-fluorouradl)を 750 1腹腔内投与し、骨髄抑制のための前処理を行った。移植当 日、ネンブタールを腹腔内投与し、全身麻酔を施したマウスの鎖骨下静脈から lxlO7/ 200 μ 1骨髄細胞をへパリン処理した注射器で緩徐に静注した。
[0029] (蛍光血小板数および蛍光細胞数の計測）
骨髄移植後の蛍光血小板数および蛍光細胞数は、眼窩採血でへパリン処理した キヤビラリ一で 75 1採取し、フローサイトメトリィー（FACS)で 100,000万個細胞当たり の数で表した。移植後 7日目（移植早期）、 15日目（移植成立期）の 2つの時間ポイント で検討した。
[0030] <結果 >
(骨髄移植と移植成立までの一般的動態）
蛍光含有血液細胞は 100,000個当たりの細胞をフローサイトメトリィーで検出しその 数で表し移植成立の程度を表している。グリーンマウス骨髄細胞を静脈内に投与す ると数十個単位の数で末梢血を循環するが、数時間で末梢血から消失する。次に骨 髄内で移植された蛍光細胞が末梢血中に出現してくるのは 4日目で、 7日目（移植早 期）まで増加する。その後、拒絶反応が出現する場合、 15日目（移植成立期）にはほ ぼ全蛍光含有細胞は末梢血中力 消失するが、拒絶をくぐり抜けて骨髄移植が成立 した場合、ほぼその値で移行してゆく。
[0031] (保存細胞の骨髄移植）
骨髄採取当日（Oday)および不凍過冷却インキュベーターで 1、 2、 4、 7日間保存し た骨髄細胞を前日に 5-FUで骨髄抑制したマウスの静脈内に投与した (各 1匹)。保存 期間が 4日間を越えると細胞の凝集が認められ、 7日間のものでは一部柔らかなゼリ 一状になっていた。 7日間保存の骨髄を移植すると、直後より呼吸が困難となり死亡 したが、他の保存期間のものは全て生存し、実験期間を通し特別な変化はなかった
[0032] (末梢血内蛍光含有血小板の出現頻度）
蛍光含有血小板は骨髄で生着したグリーンマウス由来の幹細胞力 分ィ匕した成熟 巨核球の細胞質が細分断化し、末梢血液中に放出される。図 1は様々な期間保存し た骨髄細胞を移植し、 7日目と 15日目に末梢血中に出現した蛍光血小板量を表す。 いずれの保存期間でも 7日目に比べ 15日目で増加が見られた。移植成立時期である 15日目では、 2日間保存が最も多ぐ当日移植 (0日）に比べ約 1.5倍増加していた。
[0033] (末梢血内蛍光含有細胞の出現頻度）
蛍光含有細胞は骨髄で生着したグリーンマウス由来の幹細胞力 分ィ匕した血液細 胞であり、赤血球は蛍光を持たないため白血球系細胞であり、血小板より強い蛍光を 持つ。図 2は様々な期間保存した骨髄細胞を移植し、 7日目と 15日目に末梢血中に 出現した蛍光血液細胞量を表す。いずれの保存期間でも 7日目に比べ 15日目で増 加（0日： 1.2倍、 1日： 1.9倍、 2日：3.5倍、 4日： 1.1倍）が見られた力 移植成立時期で ある 15日目では、 2日間保存が最も多ぐ当日移植 (0日）に比べ約 2.4倍増加してい た。
[0034] (装置）
図 1は、本発明で使用できる細胞等保存装置の横中央断面図である。図 2は本発 明で使用できる細胞等保存装置の正面中央断面図である。図 1の左側がドア一部で ある。装置は、冷却区画（16)と保存区画（17)と連通部（19)力 構成される。冷却 区画（16)と保存区画（17)は、連通部（19)を有する半開放的な壁で区別されている 。いわゆる冷却装置（16)の中に半開放的な壁で区別された静電場雰囲気が達成さ れる細胞等の保存装置（17)が設置されたのが図 1及び図 2の例示である。冷却装置 は、断熱材（10)と外壁（9)の壁で全面構成されており、全部には保存物の取り出し 用ドア一（12)が設置されている。ドア一（12)は、同様に断熱材（10)と外壁（9)の壁 で構成される。冷却機（11)は、通常の蒸発機と圧縮機を含む。冷却機には、ファン（ 4)が設置され、冷却機内の空気の循環を起こす。 l〜5mZs程度の風力で循環を 起こす。アース（18)は、過剰の通電を放流する。冷却装置内は、 20〜5°Cに設定 可能である。
冷却機（ 11)内に設置された保存区画（ 17)は、通電材料で作られた内側壁 (7)と 絶縁材料で作られた外側壁 (6)からなる 2重構造隔壁で上部、周囲はおおわれ、そ の下部は開放 (8)されている。この 2重構造隔壁は、冷却装置とは絶縁部（3)で電気 の流れは断絶されている。絶縁部は、内部の保存装置（17)の支持部（3)の意義も 有し、下部の 4箇所に設置されている。固定を確実にするためには、上部にも支持部 として絶縁部を有することは好ましい。なお、絶縁部（3)は、 4隅に設置されれば十分 であり、実際には横中央断面図及び正面中央横断面図には表示されないが、位置 関係を明示するために破線で表示した。保存装置（17)の前部には、ドア一部（13) があり、このドア一部も通電材料で作られた内側壁 (7)と絶縁材料で作られた外側壁 (6)からなる 2重構造壁である。保存装置（17)内には、複数段の保存棚が設置され ている。保存棚は導電性材料で構成される。図中では 3段の保存棚（5)が設置され ている。棚の支持は、既存の棚板留（18)を使用することで十分である。例えばタキゲ ン製の棚板用支柱、棚板留が例示される。棚 (5)は、前記 2重構造隔壁の内側壁と 接触していてもよいが、離れていてもよい。その隙間は 0〜 15mmである。保存棚は、 多数の空隙が設けられており（図 3)、この空隙を通じて空気の対流が達成される。保 存棚には適宜培養等の容器 (15)が設置される。
高電圧発生機（1)で約 100V〜5000Vの交流又は直流電圧を高圧ケーブル（2) で電極に印加し、保存装置内（17)を静電場雰囲気にする。
具体的な事例は、冷却装置（16)は、例えば—5°C〜一 3°Cを示摘温度として、 -3 °C以上で稼動、 5°C以下で停止するように連通部（19)に設置された温度センサー に連動するサーモスタットで調節されており、保存装置部は約 3000Vの交流電圧で 静電場雰囲気にされている。培養細胞の保存のために、ドア一（12)及びドア一（13 )が開けられ、保存装置（17)の保存棚（5)におかれる。ドア一を開けることで、保存 装置（17)内の室温が数度上昇する。そしてドア一を閉めることで、装置内は、保存 区画（17)と冷却区画（16)に数度の温度差が生じる。その結果、温度差による緩徐 な空気の対流が生じる。保存装置（17)の隔壁は連通部（19)のみが開放 (8)されて おり、空気は連通部（19)を経て緩徐に保存区画（17)を上昇して、保存区画の冷却 を極めて穏やかに達成できる。
図 1及び図 2に開示の本発明で使用できる装置は、保存装置（17)を冷却装置（16 )内に設置された形態であるが、本発明で使用できる装置はこれに限らず冷却区画 からの冷却空気が温度差に基づく対流によって保存区画の連通部から流入し、保存 区画内を静電場雰囲気下で冷却していく限りは本発明の対象となる。例えば、保存 装置（ 17)と冷却装置（16)を左右にならベ、保存装置（ 17)と冷却装置（ 16)の間は その連通部（19)のみが開放 (8)されており、またドア一は保存装置にのみ設置され 、保存装置（17)の導電材料層に高電圧が印加されて ヽる（図 4)形態が例示される。 各壁の 2重構造は、図 1及び 2と同様である力 図 1におけるドア一（12)とドア一（13 )が一体化されドア一（12)とドア一（13)の間の空隙をなくしたものである。
細胞等の出し入れによる保存区画の温度変化を最小にするためには、保存区画は 、冷却区画内に設置される構造の図 1及び図 2に開示の構造がより好ましい。外部温 度力 20数。 Cの場合、ドア一をあけることで内部の温度上昇は 10数。 Cにまでなること から、保存区画の温度上昇を最小限にするためにもこのような構造がより好ま 、。 産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明の静電場雰囲気内では、移植用細胞を活性ィ匕し、移 植効率を向上させることができる。このことより、本発明の方法は、特に移植領域、再 生医療領域、基礎実験領域等に利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞を静電場雰囲気内に置くことを特徴とする、移植用細胞の機能を活性化する 方法。
[2] 静電場雰囲気が 100〜10000Vの交流または直流電圧を電極に印加して形成され る請求項 1に記載の方法。
[3] 移植用細胞を、 -30〜40°Cで静電場雰囲気内に置くことを特徴とする請求項 1又は
2に記載の方法。
[4] 移植用細胞力 骨髄移植用の細胞である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方 法。
[5] 骨髄移植用の細胞が骨髄細胞、臍帯血細胞、およびそれらの幹細胞力 選ばれる 請求項 4に記載の方法。
[6] 移植用細胞の機能の活性化が、被移植組織における移植用細胞の生着率および 増殖率の向上である請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
[7] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の方法により調製される移植用細胞。
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