WO2006082866A1

WO2006082866A1 - ｐ５３の機能異常の検出方法、癌の分子診断方法及び癌治療に有効な化合物の評価方法

Info

Publication number: WO2006082866A1
Application number: PCT/JP2006/301700
Authority: WO
Inventors: Shinji Mizuarai; Kazunori Yamanaka; Hidehito Kotani
Original assignee: Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2006-02-01
Publication date: 2006-08-10
Also published as: EP1847603A4; EP1847603A1; JPWO2006082866A1; US20090092971A1; CA2596687A1

Abstract

　被検組織又は被検細胞に於ける、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ－Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含む方法により、ｐ５３の機能異常の検出や癌の分子診断を行う。本発明の分子診断方法により、ｐ５３の変異の有無にかかわらず、また、ｐ５３の変異を直接検出することなくｐ５３の機能異常を検出することや、かかる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。

Description

明細書

p53の機能異常の検出方法、癌の分子診断方法及び癌治療に有効な化合物の評価方法

技術分野

[0001] 本発明は、所定の遺伝子の発現等を測定することにより癌抑制遺伝子 p53の機能異常の検出や癌の診断を行う方法に関する。また、所定の遺伝子の発現量等に基づいて化合物の評価を行う方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し、医薬の開発に応用する薬理ゲノミタス（Pharmacogenomics)が急速に進展している。薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、副作用の強い医薬を真に薬効の期待できる患者だけに投与することや、試行錯誤的な投薬を実施することなぐ治療の初期から適切な投薬を実施する、いわゆるオーダーメイド医療が可能となる。その結果、患者に無用の肉体的負担を負わせることもなくなり、また、近年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。中でも、抗癌剤は非常に強い副作用を有する場合が多ぐオーダーメイド医療が強く望まれている。

[0003] また、個々人の疾患関連遺伝子の分子レベルでの解析が可能となることによって、同じ疾患であっても原因となるメカニズムが異なる場合に、そのメカニズムに応じた治療ゃ予防を行うことが可能となる。

[0004] 一方、癌抑制遺伝子として知られる p53は、当初、腫瘍ウィルスである SV40の T抗原と複合体を形成する分子として発見された Ci. Virol.、第 31卷、 463頁、 1979年：非特許文献 1)。その後、 p53遺伝子が多くの癌で欠失が見られる 17番染色体の短腕（17pl3)に存在し、対立遺伝子の双方が欠失と変異により不活性化されている癌抑制遺伝子であることが明ら力となった（N. Engl. J. Med.、第 319卷、 525頁、 19 88年:非特許文献 2)。また、その遺伝子産物は 393アミノ酸力もなる転写制御因子で、 4量体を形成して機能することが明らかとなっている。さらに、細胞周期に関与する p21、 14—3— 3、アポトーシスに関与する bax、 PIG3、 GADD45等、非常に多くの遺伝子が p53の標的遺伝子として同定されており、 p53に異常が生じることにより標的遺伝子の転写制御に異常を来たすと考えられる。

[0005] 実際、 p53遺伝子の変異は、肺癌では 70%、胃癌では 45%、乳癌では 30%、大腸癌では 65%、膀胱癌では 61 %、脾臓癌では 70%にのぼることが明らかとなつており（実験医学、第 19卷、 135頁、 2001年:非特許文献 3)、他の癌抑制遺伝子と比較しても顕著に高い。すなわち、 p53遺伝子の変異による機能異常が癌の発症に大きな影響を及ぼして、ると、える。

[0006] このような状況の下、 p53遺伝子の変異や機能異常と疾患との関連に関する研究が盛んになされている。例えば、 Soussiらは 15000例以上にのぼる p53の変異をデータベース化しており（http：〃 p53.curie.fr/ : Nucleic Acids Res.、第 22卷、 355 1頁、 1994年:非特許文献 4)、 p53の DNA結合ドメイン領域内に位置するコドン 17 5、 245、 248、 273等には変異が頻発することを示している。また、ある種の肝細胞癌では、 DNA結合ドメイン内のコドン 249には Argから Serへの変異が認められることが明らかにされている（Nature、第 350卷、 427頁、 1991年:非特許文献 5)。また、紫外線によって生じる皮膚癌においても p53遺伝子中の CCがチミンダイマー化していることが報告されている（PNAS、第 88卷、 10124頁、 1991年:非特許文献 6)

[0007] 非特許文献 1 :J. Virol.、第 31卷、 463頁、 1979年

非特許文献 2 : N. Engl. J. Med.、第 319卷、 525頁、 1988年

非特許文献 3 :実験医学、第 19卷、 135頁、 2001年

非特許文献 4 : Nucleic Acids Res.，第 22卷、 3551頁、 1994年

非特許文献 5 : Nature,第 350卷、 427頁、 1991年

非特許文献 6 : PNAS、第 88卷、 10124頁、 1991年

非特許文献 7 : Mol. Carcinogenesis,第 19卷、 243頁、 1997年

発明の開示

[0008] し力しながら、 p53の変異が必ずしも機能異常や疾患の原因となるわけではなぐ変異が生じていても P53の機能には何ら影響を及ぼさない場合もある。例えば、 Li— Qurjiaらは、酵母を用いた実験で、リンパ腫由来の A3ZKAW細胞には p53のコドン 213及び 234にミスセンス変異がありながら、転写活性には異常が認められなかつたことを明らかにしている（Mol. Carcinogenesis、第 19卷、 243頁、 1997年：非特許文献 7)。このような場合には、 p53の変異を検出しても機能異常や疾患との関連を推測することができな、と、う問題があった。

[0009] 本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、 p53の変異の有無にかかわらず、また、 p53の変異を直接検出することなく p53の機能異常を検出することや、力かる機能異常に起因する癌の診断を行う方法等を提供することを目的とする。

[0010] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の遺伝子群の発現量力 ¾53の機能異常とリンクして増減することを見出し、本発明を完成した。

[0011] すなわち、本発明の p53の機能異常の検出方法は、被検組織又は被検細胞に於ける、 CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常糸且織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程と、を含むことを特徴とする。

[0012] ここで、前記遺伝子が CARS又は GEF— HIであることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高く P53の機能異常を検出することが可能となる。

[0013] また、本発明の癌の分子診断方法 (癌の評価又は判定方法)は、被検組織又は被検細胞における、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常糸且織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常糸且織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することにより _P53の機能異常を予測する工程と、を含むことを特徴とする。

[0014] ここで、前記遺伝子が CARS又は GEF— HIであることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高く癌の分子診断を行うことが可能となる。

[0015] また、本発明の薬剤感受性の判定方法は、被検組織又は被検細胞における、 CA RS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常糸且織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することにより P53の機能異常を予測する工程と、を含むことを特徴とする。

[0016] ここで、前記遺伝子が CARS又は GEF— HIであることが好ましい。かかる遺伝子を用いることにより、より精度高く薬剤感受性の判定をすることが可能となる。

[0017] さらに、本発明は、上記薬剤感受性の判定方法によって得られた結果に基づき投与する抗癌剤を選択する抗癌剤の投与方法 (抗癌剤の選択方法)をも包含する。

[0018] また、本発明の癌診断キット (検出キット、 p53の機能異常の検出キット）は、 CARS 、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、当該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含むことを特徴とする。

[0019] ここで、前記発現測定手段が、マイクロアレイ、 PCR用プライマーからなる群より選択される、ずれか一つであることが好ま U、。

[0020] また、本発明の癌治療に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検動物又は被検細胞中における、 CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該発現量を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と比較した結果、被検化合物の投与又は接触によって当該遺伝子の発現量が有意に変化したことを確認する工程と、を含むことを特徴とする。

[0021] ここで、前記遺伝子が GEF— HIであることが好ましい。力かる遺伝子を使用することにより、より精度高くィ匕合物の評価を行うことが可能となる。

[0022] さらに、本発明の癌治療に有効な化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検化合物が、 CARS, MOC OS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は当該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、当該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、比較した結果、投与又は接触前後で当該タンパク質の活性が有意に変化している力否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。

[0023] ここで、前記タンパク質力GEF— HIであることが好ましい。力かる遺伝子を使用することにより、より精度高くィ匕合物の評価を行うことが可能となる。

[0024] 本発明によれば、 p53の変異を直接検出することなぐまた、被験者に負担をかけることなく p53の機能異常を検出することや、力かる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、 p53が関与する癌の治療に有効な化合物の評価が可能となる。

図面の簡単な説明

[0025] [図 1]図 1は、各種組換え p53変異体の発現をタンパク質レベルで確認した図である

[図 2]図 2は、各種組換え p53変異体の発現を mRNAレベルで確認した図である。

[図 3]図 3は、各種組換え p53変異体と p21の発現との関係を示す図である。

[図 4]図 4は、各種 _P53変異体の発現と GEF— HIの発現量との関係を示す図である

[図 5]図 5は、 p53変異体の発現誘導によって活性ィ匕される GEF— HIと、 GEF— HI の発現によって活性ィ匕される RhoAとの関係を示す図である。

[図 6]図 6は、種々の癌細胞における GEF— HIの発現量を示す図である。図中、口は変異型 P53を発現する癌細胞を示し、△は野生型 p53を発現する癌細胞を示す。

[図 7]図 7は、野生型 p 53を発現する HCT116細胞につ!/、て GEF— HIの発現を抑制した場合の 3日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble)を示し、◊は GEF -HI siRN Aを導入した場合の生細胞率を示す。

[図 8]図 8は、野生型 p53を発現する A427細胞について GEF— HIの発現を抑制した場合の 3日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble)を示し、◊は GEF -HI siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。

[図 9]図 9は、野生型 p 53を発現する RT4細胞につ、て GEF—HIの発現を抑制した場合の 3日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble)を示し、◊は GEF— H 1 siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。

[図 10]図 10は、変異型 p53を発現する UMCU3細胞について GEF— HIの発現を抑制した場合の 3日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble)を示し、◊ は GEF -HI siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。

[図 11]図 11は、変異型 p 53を発現する SK O V3細胞につ!/、て GEF— HIの発現を抑制した場合の 3日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble)を示し、 ◊は GEF -HI siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。

[図 12]図 12は、変異型 p53を発現する ES— 2細胞について GEF— HIの発現を抑制した場合の 3日後の生細胞率を示す図である。□は対照（Scramble)を示し、◊は GEF -HI siRNAを導入した場合の生細胞率を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0026] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

[0027] 先ず、本発明にかかる用語にっ、て説明する。

本発明における「被検組織」とは、癌の検査対象となる生体カゝら抽出可能な組織であり、 p53の関与を検討する必要のある癌組織や、癌診断の必要があると認められる組織であればその種類は特に限定されない。力かる組織の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、脾臓癌、脾内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の組織が挙げられる。

[0028] また、本発明における「被検細胞」も同様に、癌の検査対象となる生体力も抽出可能な組織であり、 p53の関与を検討する必要のある癌組織由来の細胞や、癌診断の必要があると認められる組織由来の細胞であればその種類は特に限定されない。か力る細胞の例としては、例えば、神経芽腫、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、頭頸部癌、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、口腔が癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、脾臓癌、脾内分泌腫瘍、胆道癌、陰茎癌、外陰癌、腎盂尿管癌、腎臓癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵管癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、菌状息肉症、悪性黒色腫、軟部肉腫、骨腫瘍、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、リンパ浮腫由来の細胞が挙げられる。

[0029] 次に、本発明にお、て被検対象となる遺伝子、 CARS遺伝子、 MOCOS遺伝子、 TNFRSF9遺伝子、 LOC56901遺伝子及び GEF— HI遺伝子について説明する。

CARS遺伝子（cysteinyl—tRNA synthetase :NM— 001751：配列番号 1)によりコードされるタンパク質は、細胞質に存在する酵素であり、 tRNAのアミノアシル化を触媒する。また、 CARS遺伝子は、癌抑制遺伝子の存在部位として知られる染色体の 11ρ15. 5に存在することが明らかにされている（Genomics、第 15卷、 692 頁、 1993年） _Q

[0030] MOCOS遺伝子（molybdenum cofactor sulfurase :NM— 017947 :配列番号 2)は、キサンチン尿症の原因遺伝子として同定された（Biochem. Biophys. Res . Commun.、第 282卷、 1194頁、 2001)。 MOCOSは、コード領域 2667塩基、 8 88アミノ酸力なる分子である。

[0031] TNFRSF9遺子 (tumor necrosis factor receptor superfamily, mem ber 9 :NM— 001561 :配列番号 3)によりコードされるタンパク質は、 Tumor necr osis factor (TNF)受容体ファミリーに属し、 T細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することが知られている（Eur J. Immunol.、第 9卷、 2219頁、 1994年）。

[0032] GEF— HI遺伝子（Rho guanine exchange nucleotide factor— HI :NM —004723 :配列番号 4)によりコードされるタンパク質は、癌遺伝子と知られる Rhoに結合し、不活性型の Rho— GDPカゝら活性型の Rhoに変換する酵素として知られている G. Biol Chem.、第 273卷、 34954頁、 1998年)。

[0033] LOC56901遺伝子（NM 020142 :配列番号 5)によりコードされるタンパク質は、電子を NADHから電子伝達系に輸送する酸化還元酵素 NDUFA4のホモログとして知られる（Proc Natl Acad Sci USA.、第 99卷、 16899頁、 2002年)。

[0034] 本発明において使用される CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901又は GE F—H1は、これらの遺伝子と機能的に等価な遺伝子であってもよい。

[0035] ここで、「CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、当該遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が 70〜 100%であることが好ましぐ 80〜100%であることがより好ましぐ 90〜100%であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応する遺伝子と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。し力しながら、相同性が前記下限未満であっても、対応する遺伝子に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56 901又は GEF— HIにおける 1又は 2以上の塩基が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び Z又は挿入した遺伝子であってもよヽ。

[0036] 次に、本発明の p53の機能異常の検出方法について説明する。

本発明の p53の機能異常の検出方法は、被検組織における、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織における遺伝子の発現量が正常組織における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程とを含むことを特徴とする。

[0037] 本発明において、先ず、被検組織における、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LO C56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量の測定の方法としては特に制限はないが、例えば、被検組織力ゝら抽出したゲノミック DNAを铸型として RT— PCRを行う方法、前記遺伝子がプロットされたマイクロアレイを用いる方法、ノーザンブロットが挙げられる。ここで、遺伝子の「発現量」とは、遺伝子転写産物の絶対量又は相対量をいい、相対量の場合は、後述する正常組織における発現量との相対的な比較において当該遺伝子の発現量を決定すればよい。

[0038] また、本工程において、発現量を測定する遺伝子は一種である必要はなぐ二種以上の遺伝子の発現を測定した結果より P53の機能異常を総合的に判断してもよい。

[0039] 次に、上記の方法により測定した遺伝子の発現量と正常組織における対応遺伝子の発現量とを比較する。

[0040] ここで、「正常組織又は正常細胞」とは、被検組織又は被検細胞と比較の対象となる組織又は細胞であればその由来は特に限定されず、健常人由来であっても癌患者由来であってもよい。また、癌組織の近辺に存在する正常組織又は正常細胞であつてもよい。

[0041] 本工程においては、被検組織又は細胞に発現する CARS、 MOCOS、 TNFRSF 9、LOC56901又は GEF— HI遺伝子と正常糸且織又は細胞に発現するこれらの遺伝子 (対応遺伝子)の発現量を比較するが、発現量の絶対量を比較してもよぐまた、比較による相対値を算出してもよい。

[0042] 次に、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する。

[0043] 前記の有意差の判断手法としては特に制限はないが、当業者に公知の統計学的手法を用いて検定すればょ、。

[0044] 被検組織又は被検細胞と、正常組織又は正常細胞における前記遺伝子の発現量の比較の結果、有意差をもって被検組織又は被検細胞にぉ、て発現が高!、と認められた場合には当該被検組織又は被検細胞における P53に機能異常が認められると判断できる。この場合の p53の機能異常としては、 p53遺伝子における塩基の欠失 (例えばナンセンス変異）、置換 (例えば、ミスセンス変異、ポイントミューテーシヨン）、挿入、フレームシフト等が考えられるが、本発明の対象としては、機能異常の原因は特に限定されず、これらのいずれが原因となった機能異常も含まれる。 [0045] また、 p53の機能異常の具体例としては、 p53タンパク質の転写活性が低下又は活性化する場合や、転写が全く起こらない場合が挙げられるが、活性には異常を認めな、がコードされる遺伝子には変異を生じて、る場合も含まれる。

[0046] 次に、本発明の癌の分子診断方法 (癌の評価又は判定方法）について説明する。

本発明の癌の分子診断方法は、被検組織又は被検細胞における、 CARS, MOC OS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF—H1からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することにより P53の機能異常を予測するェ程と、を含む。

[0047] 本発明の癌の分子診断方法の手順としては、 p53の機能異常を検出するまでは上述した p53の機能異常の検出方法と同様に行う。当該方法によって p53の機能異常が検出された場合、被検組織又は被検細胞力 ¾53の異常によって生じる癌由来の組織又は細胞であると判断できる。すなわち、被検組織又は被検細胞が由来する組織にお、て p53の異常により生じることが知られて、る癌種を特定することができる。具体的には、例えば、 p53との関与が示唆されている Li— Fraumeni Syndrome (Sc ience、第 250卷、 1233頁、 1990年）、肝細胞癌（Nature,第 350卷、 377頁、 199 1年）、骨原性肉腫（Proc Natl Acad Sci USA,第 84卷、 7716頁、 1987年）、横紋筋肉種（Proc Natl Acad Sci USA、第 87卷、 5863頁、 1990年）、結腸癌（Science,第 244卷、 217頁、 1989年）、肺癌（Science,第 246年、 491頁、 19 89年）、グリア芽細胞腫 (Am. J. Hum. Genet.、第 47卷 (suppl.)、 A4、 1990 年）、食道癌（Proc Natl Acad Sci USA、第 87卷、 9958頁、 1990年）、膀胱癌（Science、第 252卷、 706頁、 1991年）、扁平上皮癌（Proc Natl Acad Sci US、第 88卷、 10124頁、 1991年）、子宮頸癌（Lancet、第 339卷、 1070頁、 19 92年）、肺癌（Proc Natl Acad Sci USA、第 89卷、 7262頁、 1992年）、白血病'リンパ腫 Ci Clin Invest.、第 90卷、 653頁、 1992年)等と、被検組織又は被検細胞との関係を診断することが可能となる。 [0048] 次に、本発明の薬剤感受性の判定方法について説明する。

本発明の薬剤感受性の判定方法は、被検組織又は被検細胞における、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断することにより P53の機能異常を予測する工程と、を含む。

[0049] 本発明の癌の分子診断方法の手順としては、 p53の機能異常を検出するまでは上述した p53の機能異常の検出方法と同様に行う。当該方法によって p53の機能異常が検出された場合、被検組織又は被検細胞力 ¾53の異常によって生じる癌由来の組織又は細胞であると判断できる。すなわち、 p53と薬効との関係が知られている薬剤について、その薬剤を投与した場合にどの程度の薬効が期待できるか、あるいは、どのような副作用が生じるかといつた薬剤感受性を予測することができる。その結果、副作用が予想される薬剤の投与は避け、有効であると予想される薬剤を選択的に投与することが可能となる。このような p53と薬効との関係が知られている薬剤としては、例えば、ドキソルビシンやアントラサイクリン系の抗癌剤が挙げられ、 p53の DNA結合領域に遺伝子変異が存在することにより生じる肺癌とこれらの抗癌剤の応答性に一定の関係があることが示唆されている（Nat Med、第 2卷、 811頁、 1996年)。しかしながら、本発明の薬剤感受性の判定方法にお!ヽて対象となる薬剤は前記抗癌剤に限定されず、あらゆる抗癌剤について p53との関連を検討あるいは調査したうえで、薬剤感受性の判断をおこなえばよい。

[0050] すなわち、本発明の薬剤感受性の判定方法により、被検組織又は被検細胞が p53 の関与する癌細胞を含むことが明ら力となった場合に、被検体にこれらの抗癌剤の投与が有効力どうか判断できることとなり、投与すべき力どうかの判定が可能となる。また、当該判定によって適切な薬剤を選択し、投与することにより、副作用を抑え、治療効果の高ヽ投薬を行うことが可能となる。

[0051] また、本発明は、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、当該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含む癌診断キットをも提供する。

[0052] CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段としては特に制限はないが、例えば、当該遺伝子を増幅するためのプライマー、当該遺伝子がプロットされたマイクロアレイ、ノーザンブロット用のプローブが挙げられる。また、当該遺伝子の発現を検出する検出手段としても特に制限はないが、例えば、ノーザンプロット用のプローブを可視化するための蛍光標識試薬やラジオアイソトープ標識試薬が挙げられる。

[0053] このような癌診断キットを使用することにより、被検組織ゃ被検細胞カゝらゲノム DNA を抽出して塩基配列を確認することにより p53の変異を検出するという工程を経ることなぐ簡易 ·迅速に P53が関与する癌の診断をすることが可能となる。

[0054] 次に、本発明の化合物の評価方法について説明する。

本発明の第一の化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検動物又は被検細胞中における、 CARS, M OCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と、正常動物又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、該被検動物又は被検組織における遺伝子の発現量が該正常動物又は正常組織における遺伝子の発現量と有意に差が認められるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。

[0055] 具体的には、以下の手順でィ匕合物の評価を行う。

先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、癌に治療、予防又は診断を目的とする薬剤候補の化合物であれば

、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。

[0056] また、被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなぐその都度好適な投与方法を選択すればよいが、例えば、経口投与、非経口投与 (例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射)が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなぐ例えば、細胞と被検化合物を培養液や緩衝液 (例えば、リン酸緩衝液)等の溶液中で混合し、両者を接触させる方法が挙げられる。

[0057] 次に、被検動物又は被検細胞中における、 CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC 56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する。これらの遺伝子の発現量の測定方法としては、特に制限はなぐ投与又は接触前を対照として、当該遺伝子の発現量の変化を RT—PCRのような遺伝子増幅法、マイクロアレイを用いる方法、ノーザンプロット等によって検出し、比較すればよい。また、発現量の測定には、前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いてもよい。この場合、レポーター遺伝子としては、例えば、 β—ガラタトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルォレツセンスプロテイン遺伝子が挙げられる。

[0058] ここで、「CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、当該遺伝子と塩基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、塩基配列の相同性が 70〜 100%であることが好ましぐ 80〜100%であることがより好ましぐ 90〜100%であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には対応する遺伝子と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。し力しながら、相同性が前記下限未満であっても、対応する遺伝子に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高い遺伝子とは、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56 901又は GEF— HIにおける 1又は 2以上の塩基が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び Z又は挿入した遺伝子であってもよヽ。

[0059] 次に、前工程で測定した当該遺伝子の発現量を、被検化合物の投与又は接触前と比較する。すなわち、本工程では、測定対象の遺伝子の発現量が被検化合物の投与又は接触前後でどのように変化したかを確認する。比較の結果、発現量の差に有意差が認められるカゝ否かを検討し、被検化合物の投与又は接触後で CARS、 MOC OS、 TNFRSF9、 LOC56901又は GEF—H1の発現が優位に高い場合には化合物の効果が低いと判断し、低い場合には有効と判断する。

[0060] 次に、本発明の第二の化合物の評価方法について説明する。

本発明の第二の化合物の評価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、当該被検化合物が、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9 、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、当該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、比較した結果、投与又は接触前後で該タンパク質の活性が有意に変化しているカゝ否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする。

[0061] 具体的には、以下の手順でィ匕合物の評価を行う。

先ず、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、癌に治療、予防又は診断を目的とする薬剤候補の化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定されない。

[0062] また、被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなぐその都度好適な投与方法を選択すればよいが、例えば、経口投与、非経口投与 (例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射)が挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特に制限はなぐ例えば、細胞と被検化合物を培養液や緩衝液 (例えば、リン酸緩衝液)等の溶液中で混合し、両者を接触させる方法が挙げられる。

[0063] 次に、被検動物又は被検細胞中における、 CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC 56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する。これらのタンパク質の活性の測定方法としては、特に制限はなぐ投与又は接触前を対照として、例えば、 C ARSであれば tRNAのアミノアシル化活性を測定すればよい。 [0064] ここで、「CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質と機能的に等価なタンパク質」とは、当該タンパク質とアミノ酸配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、それぞれのタンノ^質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限はないが、アミノ酸配列の相同性が 50〜： LOO%であることが好ましぐ 60〜 100%であることがより好ましぐ 70〜 100%であることが特に好ま、。相同性が前記下限より低、場合には対応するタンパク質と同じ又は類似の活性を示さない可能性が高い傾向にある。し力しながら、相同性が前記下限未満であっても、対応するタンパク質に特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応するアミノ酸配列との相同性が高い場合には同じ又は類似の活性を有する場合がある。このようなタンパク質は、アミノ酸配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比較的相同性の高いタンパク質とは、 CARS、 MOCOS、 TNF RSF9、LOC56901又は GEF— HIにおける 1又は 2以上のアミノ酸が自然若しくは人為的に置換、欠失、付加及び Z又は挿入したタンパク質であってもよい。

[0065] 次に、前工程で測定した当該タンパク質の活性を、被検化合物の投与又は接触前と比較する。すなわち、本工程では、測定対象の遺伝子の活性が被検化合物の投与又は接触前後でどのように変化したかを確認する。比較の結果、活性の差に有意差が認められるカゝ否かを検討し、被検化合物の投与又は接触後で CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、LOC56901又は GEF— HIの活性が優位に高い場合には効果が低いと判断し、低い場合には有効と判断する。

[0066] 以上説明したような本発明の化合物の評価方法によれば、癌治療や予防に有用な化合物のスクリーニングや、これら薬剤の有効性又は安全性の評価が可能となる。実施例

[0067] 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する力本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

[0068] まず、変異型 p53発現ベクタープラスミドを構築した。

野生型及び V157F、 R175H、 R248Qの各変異を持つ p53遺伝子をドキソサイクリン誘導型ベクター pTRE— hygへクローユングした。次に、これらの p53発現べクタ一を癌細胞である U20Sへ導入し、誘導性の p53変異体発現細胞株を榭立した。

[0069] 次に、野生型及び各変異型 p53遺伝子を有する細胞株の p53の発現を確認した。

タンパク質レベルでの発現をウェスタンブロット法にて（図 1)、 mRNAレベルでの発現をリアルタイム RT— PCR法にて測定した (図 2)。 RT— PCRに用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。

フォワードプライマー： 5， -TCCCCGGACGATATTGAACA-3，（配列番号 6) リバースプライマー： 5， - GCATTCTGGGAGCTTCATCTG- 3，（配列番号 7) TaqManプローブ： 5， - TGGTTCACTGAAGACCCA- 3，（配列番号 8)。

[0070] その結果、誘導後は 10倍以上の野生型及び変異体 p53の発現誘導があった。

[0071] 次に、これらの細胞株において導入した変異型 p53により内在性の p53の機能が喪失して!/ヽることを確かめた。

[0072] まず、 p53の転写活性化能を p21の遺伝子発現誘導を測定することにより調べた。

リアルタイム RT— PCR法に用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりである。

フォワードプライマー： 5， -TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3，（配列番号 9) リバースプライマー： 5， -GGCGTTTGGAGTGGTAGAAATC-3，（配列番号 10) TaqManプローブ： 5 ' - CGGCGGCAGACCAGCATGAC- 3 ' (配列番号 11)。

[0073] 調製した細胞株にドキソサイクリンを添加し、野生型及び変異型 p53を誘導したところ、誘導後 10時間において野生型 p53発現細胞では p21が 10倍以上転写活性ィ匕されているのに対して、 3種の変異型細胞では、全く _P21の転写活性ィ匕が見られなかつた（図 3)。このことにより、変異型 _P53では、転写活性ィ匕能は失われていることが確認できた。

[0074] 次に、変異型 p53によって発現が誘導される遺伝子を探索するために、野生型、変異型 P53発現細胞株及びコントロールの U20S細胞株の網羅的遺伝子発現をマイクロアレイを用いて測定した。変異型 _P53発現誘導後 0、 12、 15時間の各細胞力も m RNAを抽出し、逆転写反応によって cDNAに変換後、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Affymetrix社製）でハイブリダィゼーシヨンし、解析を行った。 3種類全ての変異型 P53発現細胞株で遺伝子発現が上昇している遺伝子群を次のように抽出した。すなわち、変異型 p53誘導前と誘導 15時間後を比較して、少なくとも一つの変異体細胞で 1. 5倍以上の発現上昇があり、全ての変異体で有意に発現上昇を示す遺伝子群を抽出した。また、野生型 p53の発現誘導によっては、遺伝子発現は変化をしないことを条件とした。この条件下で以下の 12遺伝子が抽出された。

Gene symbol: C9orf48, CCNB1IP1, MRPL46, ZNF24, CARS,

MOCOS, TNFRSF9, CARS, LOC56901, GEF— HI, SFPQ, CC

NL1

[0075] これらの遺伝子群の発現亢進の有無は、癌細胞において p53の状態が野生型か変異型かを判別することに有用と考えられる。さらに、遺伝子抽出の基準値を全ての変異型 P53により 1. 5倍以上の発現上昇を示す遺伝子群を抽出したところ、 GEF- Hl(Rno guanine nucleotide exchange factor HlJと CAR;5(cysteinyl— t RNA synthetase)の二つであった。

[0076] 次に GEF— HIに注目し、変異型 p53による GEF— HIの誘導をリアルタイム RT— PCR法により確認した。用いたプライマー及びプローブの配列は下記のとおりであるフォワードプライマー： 5， - TGAGATGTACGAGGTGCACACA- 3，（配列番号 12) リバースプライマー： 5， -CGCACGCTCTGCTGAATG-3，（配列番号 13)

TaqManプローブ： 5 ' - CCGGGATGACCGGAGCACCTG- 3 ' (配列番号 14)。

[0077] ドキシサイクリンによる p53発現誘導後の GEF— HI発現の経時変化を調べたところ、 24〜48時間後には全ての変異 p53細胞株において発現量が 5倍以上上昇していた（図 4)。さらに、 GEF— HIは癌遺伝子の RhoAを活性化することが知られているので変異型 p53発現誘導後の RhoAの活性ィ匕状態を測定した。変異型及び野生型 p53の発現誘導時間が 24、 48時間の各細胞株から、細胞抽出液を作成し全体の RhoAの発現量と活性型 RhoAの量をキット（Rho activation assay kit, cyto skeleton, Inc. )を用いて次のように測定した。 GST— Rhotekin—RBD (Rho Binding Domain)は活性型 Rhoに結合するので GST— Rhotekin—RBDを用いてプルダウンした。プルダウンされた活性型 GTPaseは RhoA特異抗体を用いたゥェスタンプロッテイングで検出した。結果として、変異型 p53を発現し GEF—H1が誘導されている細胞株では、 RhoAの活性が 5倍以上上昇していることが判明した（図 5)

[0078] 次に様々なガン細胞（29種類）において p53の変異と GEF—H1遺伝子発現量の相関を調べた。図 6に示すように GEF— H 1の遺伝子発現は変異細胞株群において有意に上昇していることが判った (Pく 0. 01)。

[0079] 次に、変異型 p53による GEF— HIの発現が癌化の進行を促進しているかどうかを調べるため、野生型及び変異型 p 53細胞株にお!/、て GEF -HIの発現を siRNAにて抑制し、細胞増殖能を調べた。すなわち、 GEF—H1の siRNA(Dharmacon社）を Oligofectamineを用いて癌細胞へトランスフエクシヨンし、 3日後に MTT法にて生細胞率を測定した。

[0080] 図 7〜9 (野生型 p53を発現する癌細胞株)及び図 10〜12 (変異型 p53を発現する癌細胞株）に示すように、野生型 p53を発現する細胞群に比して変異型 p53を発現する細胞群では GEF -HIの発現抑制により、有意に細胞増殖能が低下して、ることが明ら力となった。

産業上の利用可能性

[0081] 本発明によれば、 p53の変異を直接検出することなぐまた、被験者に負担をかけることなく p53の機能異常を検出することや、力かる機能異常に起因する癌の診断を行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、 p53が関与する癌の治療に有効な化合物の評価が可能となる。

Claims

請求の範囲

[1] 被検組織又は被検細胞における、 CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901 及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量 (E )を測定する工程と、

発現量 (E )と、正常糸且織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量 (E )とを比

1 0 較する工程と、

比較した結果、発現量 (E )が発現量 (E )より有意に多いか否かを判断する工程と

1 0

、を含む p53の機能異常の検出方法。

[2] 前記遺伝子が CARS又は GEF— HIである請求項 1に記載の p53の機能異常の検出方法。

[3] 被検組織又は被検細胞における、 CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901 及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量 (E )を測定する工程と、

1 0 較する工程と、

比較した結果、発現量 (E )が発現量 (E )より有意に多いか否かを判断することに

1 0

より p53の機能異常を予測する工程と、を含む癌の分子診断方法。

[4] 前記遺伝子が CARS又は GEF— HIである請求項 3に記載の癌の分子診断方法

[5] 被検組織又は被検細胞における、 CARS、 MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901 及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量 (E )を測定する工程と、

1 0 較する工程と、

1 0

より p53の機能異常を予測する工程と、を含む薬剤感受性の判定方法。

[6] 前記遺伝子が CARS又は GEF— HIである請求項 5に記載の薬剤感受性の判定方法。

[7] 請求項 5又は 6に記載の薬剤感受性の判定方法によって得られた結果に基づき投与する抗癌剤を選択する抗癌剤の選択方法。

[8] CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を測定する発現測定手段と、

該遺伝子の発現を検出する検出手段と、を含む癌診断キット。

[9] 前記発現測定手段が、マイクロアレイ及び PCR用プライマーカもなる群より選択される、ずれか一つである請求項 8に記載の癌診断キット。

[10] 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、

該被検動物又は被検細胞中における、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56 901及び GEF— HIからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、

該発現量を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と

比較した結果、被検化合物の投与又は接触によって該遺伝子の発現量が有意に変化したことを確認する工程と、を含む癌治療に有効な化合物の評価方法。

[11] 前記遺伝子が GEF -HIである請求項 10に記載の評価方法。

[12] 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、

該被検化合物が、 CARS, MOCOS、 TNFRSF9、 LOC56901及び GEF— HI 力もなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質と機能的に等価なタンパク質の活性を測定する工程と、

該活性の値を被検化合物の投与又は接触前と比較する工程と、

比較した結果、投与又は接触前後で該タンパク質の活性が有意に変化しているか否かを確認する工程と、を含む癌治療に有効な化合物の評価方法。

[13] 前記タンパク質が GEF -HIである請求項 12に記載の評価方法。