WO2006082854A1 - 移植用軟骨細胞調製物の製造方法 - Google Patents

移植用軟骨細胞調製物の製造方法 Download PDF

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WO2006082854A1
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darcosamine
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Kazuaki Muramatsu
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Japan Medical Materials Corporation
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    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a chondrocyte preparation for transplantation. Specifically, the present invention relates to a method for producing a chondrocyte preparation for transplantation suitable for repairing an articular cartilage defect by promoting the induction of differentiation of cells capable of differentiating into chondrocytes into chondrocytes.
  • Chondrocytes are highly sorted cells that rarely divide and proliferate, and their repair ability is extremely low.
  • the microfracture technique that supplies bone marrow-derived cells with a high ability to repair thread and tissue from bone beneath the cartilage layer has been performed for repairing mild osteoarthritis of the knee and severe cartilage defects. I came.
  • the application of this method is limited to mild cartilage defects, and it is known that it may worsen over time, although transient improvement in symptoms is observed.
  • the collected chondrocytes are dedifferentiated during monolayer culture and lose their original differentiation function, and the cartilage layer repaired by the cultured cartilage cells is not a hyaline cartilage tissue, which is the original articular cartilage, but a fiber. It has disadvantages such as being mainly cartilage tissue.
  • Non-Patent Document 1 J Bone Joint Surg [Br] 1998; 81- B: 1064- 8
  • Non-Patent Document 2 Yonsei Med J. 1994 Dec; 35 (4): 378-87
  • an object of the present invention is to promote or increase the efficiency of differentiation of chondrocyte-differentiable cells into chondrocytes in the process of inducing differentiation of chondrocytes-differentiable cells.
  • the chondrocytes can be differentiated into chondrocytes.
  • the present inventors have found that the differentiation is promoted or made efficient, leading to the present invention.
  • the present invention provides a transplant comprising chondrocytes comprising a step of culturing cells capable of differentiating into chondrocytes in a differentiation-inducing medium containing darcosamine or a derivative thereof for a period sufficient to differentiate into chondrocytes.
  • a cell preparation for cell transplantation and a cell preparation for transplantation containing chondrocytes produced by the method are provided.
  • the present invention also provides use of darcosamine or a derivative thereof as an agent for inducing differentiation of chondrocytes or cells that can differentiate into chondrocytes.
  • the present invention further provides a cell culture method comprising a step of culturing cells capable of differentiating into cartilage cells for a period sufficient to differentiate into chondrocytes in a differentiation-inducing medium containing darcosamine or a derivative thereof. .
  • the invention's effect is a step of culturing cells capable of differentiating into cartilage cells for a period sufficient to differentiate into chondrocytes in a differentiation-inducing medium containing darcosamine or a derivative thereof.
  • FIG. 1 Relative comparison of type ⁇ collagen content in cell lysates of control group, CM chitin addition group, N-acetylene D-darcosamine addition group, D—darcosamine addition group by Western blotting It is a photograph.
  • chondrocytes refers to dedifferentiated chondrocytes, mesenchymal stem cells (including cartilage progenitor cells), and embryonic stem cells.
  • Chondrocytes are cells capable of producing type II collagen constituting cartilage, and have extremely low proliferation ability. Chondrocytes can be obtained by isolating connective tissue force cells by enzymatic treatment of animal (preferably human) cartilage tissue (eg, trypsin treatment and / or collagenase treatment).
  • Decorated chondrocytes are cells in which chondrocytes have lost the ability to produce type II collagen, and instead have produced type I collagen, and have the ability to proliferate.
  • Dedifferentiated chondrocytes are generally obtained by monolayer culture of chondrocytes for a certain period (eg, 2 weeks or more).
  • Mesenchymal stem cells are one of stem cells having the ability to differentiate into mesenchymal cells and can differentiate into bone, cartilage, and adipocytes.
  • the mesenchymal stem cells can be obtained as adherent cells among cells contained in tissues such as bone marrow, periosteum, adipose tissue, peripheral blood and umbilical cord blood of animals (preferably human). It also includes cartilage progenitor cells induced in the body to differentiate into cartilage.
  • Embryonic stem cells (ES cells) are undifferentiated cells that have the potential to differentiate into any organ.
  • cells derived from animals particularly mammals (for example, humans, monkeys, pigs, ushi, hidge, baboons) can be used, but human-derived cells are particularly preferable.
  • These cells are also Particularly preferred are autologous cells that are preferred by the recipient's autologous cells or allogeneic cells of the transplant cell preparation produced by the production method of the present invention. Chondrocytes are preferably collected from unloaded cartilage tissue.
  • the cells capable of differentiating into chondrocytes are cultured in a differentiation-inducing medium containing darcosamine or a derivative thereof for a period sufficient to differentiate into chondrocytes.
  • darcosamine D-darcosamine is preferable.
  • D-Darcosamine may be added as hydrochloride or sulfate.
  • Derivatives of darcosamine include, for example, polymers such as N-acetylyl D-darcosamine, N-propiol D darcosamine, N-butyryl-D-darcosamine, N- sacylated darcosamine, and carboxymethylchitin (dimer, trimmer).
  • Darcosamine or a derivative thereof is in the range of 0.01 to 10 mg / ml, preferably in the range of 0.01 to 5 mg / ml, more preferably in the range of 0.05 to 5 mg / ml in the differentiation-inducing medium. Most preferably, it is added so that it is present in the range of 0.2 to 2 mg / ml.
  • the differentiation-inducing medium may be prepared by adding a differentiation-inducing factor to a basic cell culture medium that can be used in the art.
  • the cell culture medium is preferably an animal cell culture medium, more preferably a serum-free animal cell culture medium.
  • the cell culture medium is not particularly limited, and in general, a medium known in the art can be selected as appropriate for the cells to be used. However, a medium specially formulated for the cells to be used may be used. it can. These media may be appropriately modified as necessary.
  • CMOS minimal essential media
  • MEM minimal essential media
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • a-MEM Ham's F-12 and F-10 media
  • DME M / F12 Medium Williams medium E
  • RPMI-1640 medium RPMI-1640 medium
  • MCDB medium 199 medium
  • Fisher medium Iscove modified Dulbecco medium
  • McCoy modified medium but are not limited to these.
  • antibiotics such as penicillin and streptomycin may be added to these media.
  • various growth factors / growth factors, nutrition factors, adhesion factors, and the like can be added to the medium as needed.
  • the differentiation-inducing factor that can be used in the present invention includes transforming growth factor ⁇ (TGF jS; such as TGF-j81 and TGF-j83), bone morphogenetic factor (BMP) (such as BMP-2, BMP-4, BMP-6) and darcocorticoids (eg dexamethasone), inhibin A, soft bone formation stimulating activator (CSA), chondromodulin (ChM) (ChM-l), cadherin That's it!
  • TGF jS transforming growth factor ⁇
  • BMP bone morphogenetic factor
  • darcocorticoids eg dexamethasone
  • inhibin A eg dexamethasone
  • CSA soft bone formation stimulating activator
  • ChM chondromodulin
  • Differentiation-inducing culture is performed in vitro, that is, in a culture vessel such as a dish, a well, a petri dish, a bottle, or a flask.
  • the culture temperature is 25 ° C to 45 ° C, preferably 30 ° C to 40 ° C, more preferably 35 ° C to 38 ° C.
  • the pH value of the cell culture medium is generally 7-9, preferably 7.5-8.5.
  • the culture is for example a CO incubator
  • the period for differentiation-inducing culture is not particularly limited as long as cells capable of differentiating into chondrocytes are sufficient to differentiate into chondrocytes, but for example, 3 days or more, 4 days or more, 1 week
  • the number of cells to be seeded for differentiation induction is not particularly limited, and is selected as necessary. It is the force for example, typically 1 X 10 4 ⁇ 1 X 10 7 cells / cm 2, preferably 1 X 10 5 ⁇ 1 X 10 7 cells / cm 2, more preferably 1 X 10 6 ⁇ 1 X 10 7 cells / cm 2
  • chondrocytes Differentiation into chondrocytes can be confirmed histologically by using type II collagen characteristic of chondrocytes and chondroitin sulfate proteodarican as indices.
  • the presence of chondrocytes can be confirmed by immunohistochemical staining using an antibody having a specific binding property to type II collagen.
  • detection of chondrocytes can also be confirmed by detecting mRNA of type II collagen and proteodalycan by RT-PCR. Furthermore, it is possible to quantitatively evaluate the amount of the extracellular matrix produced by ELISA.
  • a cell that can be separated into chondrocytes is a period sufficient to differentiate into chondrocytes in a differentiation-inducing medium containing darcosamine or a derivative thereof. Proliferated before being subjected to the culturing step. A proliferation step may be necessary to ensure the number of chondrocytes necessary for transplantation.
  • the growth step can be performed in a medium known in the art as described above. For growth, a factor capable of stimulating the growth of cells that can differentiate into chondrocytes is added to the cell culture medium as described above.
  • Such factors include, for example, serum (eg, human serum or sushi serum), cartilage-derived factor (CDF), platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblasts.
  • the period for the growth culture is not particularly limited as long as it is a period sufficient to ensure the number of cells that can be differentiated into chondrocytes so that the amount of soft bone cells necessary for transplantation can be obtained.
  • the medium is usually replaced with a fresh one week, preferably 5 to 6 days, more preferably 3 to 4 days, even more preferably 2 days, and most preferably daily.
  • chondrocytes differentiated from cells that can differentiate into chondrocytes are three-dimensionally organized. Three-dimensional organization may be performed at the same time in a differentiation-inducing medium, or may be performed as a separate step after the induction of differentiation. To organize soft cells in three dimensions, they are cultured on a substrate that provides a scaffold for cell growth.
  • the substrate can be, for example, an inorganic material such as calcium carbonate, calcium phosphate, hydroxyapatite or a mixture thereof (preferably ceramic); a metal material such as alumina, Ti, Ti alloy, Co—Cr; polylactic acid ( PLA) (Poly-L-lactic acid, Poly-D-lactic acid, Poly-D, L-lactic acid), Polyglycolic acid (PGA), Lactic acid Z-glycolic acid copolymer, Poly ⁇ -cap latataton (PCL), Lactic acid ⁇ ⁇ -Prolacton Copolymers, polymeric materials such as polyethylene glycolic acid; or fibrin, eg collagens such as type I, type II, type IV collagen or their atelocollagen, agar or gelatin forces are also created.
  • PLA polylactic acid
  • PLA Poly-L-lactic acid, Poly-D-lactic acid, Poly-D, L-lactic acid
  • PGA Polyglycolic acid
  • Lactic acid Z-glycolic acid copolymer Poly
  • the substrate is preferably made from a biocompatible and / or biodegradable material.
  • the substrate can be, for example, porous, fibrous, sheet-like, mesh-like, sponge-like, or gel-like.
  • Base material is biocompatible and / or biodegradable, for example, polylactic acid (PLA) (poly-L-lactic acid, poly-D lactic acid, poly D, L lactic acid), polyglycolic acid (PGA), lactic acid ⁇ Glycolic acid copolymer 1, poly ⁇ -force prolatathone (PCL), lactic acid ⁇ ⁇ -force prolatatone copolymer, polymer materials such as polyethylene dallicholic acid, hyaluronic acid, alginic acid; or fibrin such as type I, type II, type IV
  • PVA polylactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • PCL poly ⁇ -force prolatathone
  • lactic acid ⁇ ⁇ -force prolatatone copolymer polymer materials such as polyethylene dallicholic acid, hyaluronic acid, alginic acid
  • fibrin such as type I, type II, type IV
  • the substrate is also made of collagen, such as collagen, or their
  • Chondrocytes are collected from the differentiation-inducing medium.
  • the chondrocytes may be collected in a medium (eg, a differentiation-inducing medium optionally containing darcosamine or a derivative thereof), or other physiologically acceptable solutions such as physiological saline or buffer ( For example, it may be recovered in Dulbecco phosphate buffered saline (Hanks balanced salt solution).
  • the concentration of darcosamine or a derivative thereof is in the range of 0.001 to 10 mg / ml, preferably in the range of 0.01 to 5 mg / ml, more preferably in the range of 0.05 to 5 mg / ml, most preferably Can range from 0.2 to 2 mg / ml. If the chondrocytes are three-dimensionally organized, the chondrocytes may be collected together with the substrate used for the three-dimensional organization.
  • the cell preparation for transplantation of the present invention preferably at least 60%, more preferably at least 70% of the total cells (cells that can differentiate into chondrocytes + chondrocytes) contained in the preparation. More preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more Preferably at least 95%, most preferably at least 99% are chondrocytes.
  • the density of chondrocytes in the cell preparation for transplantation of the present invention is high.
  • the cell density is 1 ⁇ 10 7 cells / cm 3 or more, specifically, for example, 1 ⁇ 10 8.
  • Pieces / cm 3 to 1 ⁇ 10 9 pieces / cm 3 are preferable.
  • the chondrocytes may be suspended in an aqueous medium (for example, a medium or a physiological buffer as described above).
  • the cell preparation for transplantation may contain soluble collagen in addition to chondrocytes.
  • the chondrocyte may be a biocompatible and / or biodegradable carrier (preferably gel or sponge), such as polylactic acid.
  • PVA Poly L-lactic acid, Poly-D lactic acid, Poly-D, L-lactic acid), Polyglycolic acid (PGA), Lactic acid Z-glycolic acid copolymer, Poly ⁇ -force prolacton (PCL), Lactic acid ⁇ -force prolacton copolymer, Polyethylene Embedded in polymer materials such as glycolic acid, hyaluronic acid, alginic acid; or fibrin or fibrin glue, for example collagen such as type I, type II, type IV collagen or their atelocollagen, agar or gelatin It may be.
  • the cell preparation for transplantation of the present invention may further contain 10% human serum (particularly, autologous serum of the patient to be transplanted).
  • dedifferentiated cells were treated with a special differentiation induction medium containing TGF- ⁇ 1 as a differentiation inducer (Chondrocyte Differentiation Bullet Kit CC 3225: Bio Whittaker, USA). At this time, the cells were divided into 4 groups. Among these, 3 groups of CGM media were divided into D lmgZml D-glucosamine (Kikkoman, Japan) and 2) lmgZml N-acetylyl D-darcosamine (CA LBIOCHEM [ Trademark], EMD Biosciences, USA), 3) lmgZml of carboxymethyl chitin (Koyo Chemical, Japan) was added.
  • the amount of type II collagen expressed in the extracellular matrix was evaluated at the protein level by Western blotting.
  • the collected cells were lysed with 10 mM Tris monohydrochloride buffer (pH 7.5), 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 to obtain a cell lysate.
  • 10 mM Tris monohydrochloride buffer pH 7.5
  • 10 mM EDTA 0.1% Triton X-100
  • the PVDF membrane was blocked with BSA (usi serum albumin) and then reacted with anti-human type II collagen-mouse polyclonal antibody (primary antibody; CHEMICON, USA) at 4 ° C. After the reaction, the membrane was washed with PBS (phosphate buffered saline), and further reacted with an ALP-labeled anti-mouse IgG-phase purified antibody (secondary antibody). After washing with PBS, ALP present on the PVDF membrane was developed with NBTZBCIP-based chromogenic substrate.
  • BSA usi serum albumin
  • primary antibody primary antibody
  • PBS phosphate buffered saline
  • ALP-labeled anti-mouse IgG-phase purified antibody secondary antibody
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Abstract

　本発明は、グルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細胞に分化可能な細胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程からなる軟骨細胞を含む移植用細胞調製物の製造方法を提供する。

Description

移植用軟骨細胞調製物の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、移植用軟骨細胞調製物の製造方法に関する。具体的には、軟骨細胞 に分化可能な細胞の軟骨細胞への分化誘導を促進することにより、関節軟骨欠損部 を修復するのに適した移植用軟骨細胞調製物を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 軟骨細胞は、高度に分ィ匕した細胞でありほとんど分裂 ·増殖せず、その修復能力は 極端に低い。従来、軽度の変形性膝関節症や離断性の軟骨欠損の再生'修復には 、軟骨層下の骨から糸且織修復能力が高い骨髄由来細胞を供給するマイクロフラクチ ヤー術が行なわれてきた。しかしながら、本手法の適用は軽度の軟骨欠損に限定さ れ、また一過性の症状改善はみられるものの経時的に悪ィ匕することが知られている。
[0003] また、患者自身の非荷重領域軟骨から健全な軟骨を取出して、欠損部にモザイク 状に移植するモザイクプラスティと呼ばれる治療方法が開発された。し力しながら、こ の治療法も、採取可能な健全軟骨の量に限界があるため、適用が限られ、さらに患 者の負担も大きいという欠点があった。
[0004] 近年、自家軟骨細胞を培養し移植する自家軟骨細胞移植術 (ACI)が開発され、 Ge nzyme社力 SCarticelとして商品化して!/ヽる（J.B. Richardsonら：非特許文献 1； http://w ww.genzymeoiosurgery.com/ prod/ cartilage/ gzbx— p—pt— cartilage. asp¾また参照)。この 手法は、患者力 採取した軟骨細胞を増殖後、軟骨欠損部位に移植するものであり 、移植に必要な量の軟骨細胞を増殖により確保できるため、サイズの大きな軟骨欠 損にも適用可能な治療法として期待されている。しかしながら、採取された軟骨細胞 は、単層培養中に脱分化を起こして本来の分化機能を消失してしまい、培養軟骨細 胞により修復された軟骨層は関節軟骨本来の硝子軟骨組織ではなく線維軟骨組織 が主体である等の欠点を有する。
[0005] 上記 ACI (および Carticel)における欠点である軟骨細胞の脱分ィ匕を抑制する試みと して、 1)マイクロ'マス'カルチャーなどの高密度培養法 (Park JSら:非特許文献 2)や 、 2)ポリマー基材ゃコラーゲンゲル培養等による三次元培養技術 (S.Kawamuraら：非 特許文献 3)が挙げられる。し力しながら、これらの手法においても、埋植に必要な軟 骨細胞の量を確保するためには、依然として、予め単層培養にて増殖させることが必 要であり、この増殖過程中の軟骨細胞の脱分ィ匕が避けられないことが多い。また、一 度脱分化した細胞を軟骨細胞に再分化させるには、三次元培養にお!ヽても長時間 を要する。
非特許文献 1 : J Bone Joint Surg [Br] 1998;81- B:1064- 8
非特許文献 2 :Yonsei Med J. 1994 Dec;35(4):378-87
非特許文献 3 : Acta Orthop Scand 1998;69(1):56- 62
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] したがって、本発明の目的は、軟骨細胞に分化可能な細胞を分化誘導する過程に お 、て、軟骨細胞に分化可能な細胞の軟骨細胞への分化を促進または効率化して
、軟骨の移植処置に適切な移植用細胞調製物を得ることである。
課題を解決するための手段
[0007] 上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、ダルコサミンまたはその誘導体を含む 分化誘導培地中で軟骨細胞に分化可能な細胞を培養することにより、軟骨細胞に分 化可能な細胞の軟骨細胞への分化が促進または効率化されることを見出し、本発明 に至った。
[0008] したがって、本発明は、ダルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、 軟骨細胞に分化可能な細胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程か らなる軟骨細胞を含む移植用細胞調製物の製造方法及び該方法により製造された 軟骨細胞を含む移植用細胞調製物を提供する。
[0009] 本発明はまた、ダルコサミンまたはその誘導体の、軟骨細胞または軟骨細胞に分化 可能な細胞の分化誘導促進剤としての使用を提供する。
[0010] 本発明は更に、ダルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細 胞に分化可能な細胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程からなる 細胞培養方法を提供する。 発明の効果
[0011] 本発明によれば、軟骨細胞に分ィ匕可能な細胞力 軟骨細胞を効率的に得ることが 可能となり、よって正常な軟骨組織の再生に適切な軟骨細胞を含む細胞調製物を容 易に製造することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]コントロール群、 CMキチン添加群、 N—ァセチルー D—ダルコサミン添加群、 D —ダルコサミン添加群の細胞溶解物中のタイプ Πコラーゲン量をウェスタンブロッティ ングにより相対比較で示した写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明に使用し得る「軟骨細胞に分ィ匕可能な細胞」とは、脱分化軟骨細胞、間葉 系幹細胞 (軟骨前駆細胞を含む）、および胚性幹細胞をいう。「軟骨細胞」は、軟骨を 構成する、タイプ IIコラーゲンを産生することができる細胞であり、増殖能が著しく低 い。軟骨細胞は、動物 (好ましくはヒト）の軟骨組織を酵素処理 (例えば、トリプシン処 理および/またはコラゲナーゼ処理)することにより結合組織力 細胞を分離すること によって得ることができる。「脱分化軟骨細胞」は、軟骨細胞がタイプ IIコラーゲン産 生能を失い、代わりにタイプ Iコラーゲンを産生するようになった細胞であり、増殖能を 有する。脱分化軟骨細胞は、一般には、軟骨細胞を一定期間（例えば 2週間以上） 単層培養することにより得られる。「間葉系幹細胞」は、間葉系細胞に分化する能力 を持った幹細胞の一つであり、骨、軟骨、脂肪細胞に分化し得る。間葉系幹細胞は、 動物 (好ましくはヒト)の骨髄、骨膜、脂肪組織、末梢血、さい帯血のような組織に含ま れる細胞のうち付着性を有する細胞として得ることができる。また、あら力じめ軟骨へ 分化するよう体内で誘導された軟骨前駆細胞も含まれる。「胚性幹細胞」（ES細胞）は 、あらゆる臓器へ分化する能力を潜在的に有する未分化な細胞である。胚性幹細胞 は、受精卵がある程度分裂した過程 (約 5〜6日間）で形成される胚盤胞より内部細 胞塊を取り出し、 LIFQeukemia inhibitory factor)の存在下でフィーダ一細胞と共培養 すること〖こより得ることができる。
[0014] 上記細胞は、動物、特に哺乳動物 (例えばヒト、サル、ブタ、ゥシ、ヒッジ、ヒヒ)由来 の細胞を使用することができるが、ヒト由来細胞が特に好ましい。また、これら細胞は 、本発明の製造方法で製造される移植用細胞調製物のレシピエントの自家細胞また は同種細胞が好ましぐ自家細胞が特に好ましい。軟骨細胞は非荷重部軟骨組織か ら採取するのが好ましい。
[0015] 上記軟骨細胞に分化可能な細胞は、ダルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘 導培地中で、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養される。ダルコサミンとしては、 D—ダルコサミンが好ましい。 D—ダルコサミンは塩酸塩あるいは硫酸塩として添加さ れてもよい。ダルコサミンの誘導体は、例えば、 N ァセチルー D—ダルコサミン、 N -プロピオ-ル D ダルコサミン、 N -ブチリル -D-ダルコサミンのような N -ァ シル化ダルコサミン、およびカルボキシメチルキチンのようなポリマー（ダイマー、トリマ 一、テトラマー、オリゴマーのような低重合体を含む）を含み、好ましくは N ァセチル D ダルコサミンまたはカルボキシメチルキチンである。これらの物質は、単独でま たは組合せで使用できる。ダルコサミンまたはその誘導体は、分化誘導培地中に、 0 . 001〜10mg/mlの範囲で、好ましくは 0. 01〜5mg/mlの範囲で、より好ましくは 0 . 05〜5mg/mlの範囲であり、最も好ましくは 0. 2〜2mg/mlの範囲で存在するよう に添カ卩される。
[0016] 分化誘導培地は、当該分野において公知のものを使用できる力 基本の細胞培養 培地に分化誘導因子を添加して作成してもよい。細胞培養用培地は、好ましくは動 物細胞用培地であり、より好ましくは無血清の動物細胞用培養培地である。細胞培 養培地としては、特に限定されず、一般には当該分野において公知の培地力 使用 する細胞に適切な培地を選択できるが、使用する細胞のために特別に処方された培 地を用いることもできる。これらの培地は必要に応じて適切に改変してもよい。当該分 野において公知の培地には、例えばイーグル培地のような最少必須培地 (MEM)、 D ulbecco改変イーグル培地（DMEM)、 a -MEM, Ham's F- 12および F- 10培地、 DME M/F12培地、 Williams培地 E、 RPMI- 1640培地、 MCDB培地、 199培地、 Fisher培地、 I scove改変 Dulbecco培地（IMDM)、 McCoy改変培地が含まれるがこれらに限定されな い。これらの培地には、必要であれば、ペニシリン、ストレプトマイシンなどのような抗 生物質も添加してもよい。また、必要に応じて、種々の成長因子/増殖因子、栄養因 子、接着因子なども培地に添加することができる。このような添加剤には、例えば、塩 基性線維芽細胞成長因子 (bFGFまたは FGF-2)、トランスフェリン、インスリン、インス リン様成長因子（IGF)、ヒアルロン酸、ァスコルビン酸、亜セレン酸、リノレイン酸、ピ ルビン酸が含まれる。
[0017] 本発明において使用可能な分ィ匕誘導因子には、トランスフォーミング増殖因子 β (TGF jS；例えば TGF- j8 1および TGF- j8 3)、骨形成因子（BMP) (例えば BMP- 2、 BMP-4、 BMP-6)およびダルココルチコイド（例えばデキサメタゾン）、インヒビン A、軟 骨形成刺激活性因子 (CSA)、コンドロモジュリン (ChM) (ChM-l)、カドヘリンが挙げ られるがこれらに限定されな!ヽ。
[0018] 分化誘導培養は、 in vitroにおいて、すなわちディッシュ、ゥエル、シャーレ、ボト ル、フラスコなどの培養容器中で行なわれる。培養温度は、 25°C〜45°C、好ましくは 30°C〜40°C、より好ましくは 35°C〜38°Cである。細胞培養培地の pH値は、一般に 7〜9、好ましくは 7. 5〜8. 5である。一般には、培養は、例えば COインキュベータ
2
を用いて、約 3%〜10%の CO雰囲気下で行なう。
2
[0019] 分化誘導培養のための期間は、軟骨細胞に分化可能な細胞が軟骨細胞に分化す るに十分な期間であればよく特に限定されないが、例えば 3日以上、 4日以上、 1週 間以上、 2週間以上、 3週間以上、 4週間以上であり、具体的には、例えば、 3日〜 1 2週間、 3曰〜誦間、 3曰〜8週間、 3曰〜6週間、 3曰〜4週間、 3曰〜3週間、 3 曰〜2週間、 3曰〜1週間、 4曰〜 12週間、 4曰〜10週間、 4曰〜8週間、 4曰〜6週 間、 4曰〜4週間、 4曰〜3週間、 4曰〜2週間、 4曰〜1週間、 4曰〜 12週間、 4曰〜 10週間、 4曰〜8週間、 4曰〜6週間、 4曰〜4週間、 4曰〜3週間、 4曰〜2週間、 4 日〜 1週間、 1週間〜 12週間、 1週間〜 10週間、 1週間〜 8週間、 1週間〜 6週間、 1 週間〜 4週間、 1週間〜 3週間、 1週間〜 2週間、 2週間〜 12週間、 2週間〜 10週間 、 2週間〜 8週間、 2週間〜 6週間、 2週間〜 4週間、 2週間〜 3週間、 3週間〜 12週 間、 3週間〜 10週間、 3週間〜 8週間、 3週間〜 6週間、 3週間〜 4週間、 4週間〜 12 週間、 4週間〜 10週間、 4週間〜 8週間、 4週間〜 6週間、 4週間から 5週間であり得 る。培養期間中、培地は、通常 1週間で、好ましくは 5〜6日で、より好ましくは 3日〜 4 日で、さらに好ましくは 2日で、最も好ましくは毎日、新鮮なものに交換する。
[0020] 分化誘導のために播種する細胞の数もまた、特に限定されず、必要に応じて選択 される力 例えば、一般に 1 X 104〜1 X 107細胞/ cm2、好ましくは 1 X 105〜1 X 107 細胞/ cm2、より好ましくは 1 X 106〜1 X 107細胞/ cm2である
[0021] 軟骨細胞への分化は、軟骨細胞に特徴的なタイプ IIコラーゲンおよびコンドロイチ ン硫酸プロテオダリカンを指標として、組織ィ匕学的に確認することができる。例えば、 タイプ IIコラーゲンに特異的な結合性を有する抗体を用いた免疫組織ィ匕学染色によ り、軟骨細胞の存在を確認できる。また、 RT— PCR法によりタイプ IIコラーゲンおよ びプロテオダリカンの mRNAを検出することによつても軟骨細胞への分ィ匕を確認でき る。さらには、 ELISA法により上記細胞外基質の産生量を定量的に評価することも可 能である。
[0022] 本発明の製造方法の好ま 、実施形態にぉ 、て、軟骨細胞に分ィ匕可能な細胞は 、ダルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で軟骨細胞に分化するに十 分な期間培養する工程に付される前に増殖される。増殖工程は、移植に必要な軟骨 細胞の数を確保するために必要となり得る。増殖工程は、上記のような当該分野にお いて公知の培地中で行なわれ得る。増殖のためには、上記のような細胞培養用培地 に、軟骨細胞に分化可能な細胞の増殖を刺激し得る因子を添加する。このような因 子には、例えば、血清 (例えば、ヒト血清またはゥシ血清）、軟骨由来因子 (CDF)、血 小板由来増殖因子 (PDGF)、血管内皮細胞増殖因子 (VEGF)、繊維芽細胞増殖因 子 (FGF)、インスリン、インスリン用成長因子 (IGF)、肝細胞増殖因子 (HGF)、コロニー 刺激因子 (CSF)、ァスコルビン酸、血清アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸、リノ レイン酸、ピルビン酸が含まれる。増殖培養のための期間は、移植に必要な量の軟 骨細胞を得られるような軟骨細胞に分化可能な細胞の数を確保するに十分な期間で あればよく特に限定されない。培養期間中、培地は、通常 1週間で、好ましくは 5〜6 日で、より好ましくは 3日〜 4日で、さらに好ましくは 2日で、最も好ましくは毎日、新鮮 なものに交換する。
[0023] 本発明の製造方法の別の好ま 、実施形態にお!、て、軟骨細胞に分化可能な細 胞から分化した軟骨細胞は三次元組織化される。三次元組織化は、分化誘導培地 中で同時に行なってもよいし、または分ィ匕誘導後に別工程として行なってもよい。軟 骨細胞を三次元組織化するには、細胞成長の足場を提供する基材上で培養する。 基材は、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトまたはこれ らの混合物のような無機材料 (好ましくはセラミックスとする）；アルミナ、 Ti、 Ti合金、 Co— Crのような金属材料;ポリ乳酸 (PLA) (ポリ—L—乳酸、ポリ—D—乳酸、ポリ D, L 乳酸）、ポリグリコール酸（PGA)、乳酸 Zグリコール酸コポリマー、ポリ εカプ 口ラタトン（PCL)、乳酸 Ζ ε力プロラタトンコポリマー、ポリエチレングリコール酸のよう な高分子材料;あるいはフイブリン、例えばタイプ I、タイプ II、タイプ IVコラーゲンのよ うなコラーゲンまたはこれらのァテロコラーゲン、寒天またはゼラチン力も作成される。 細胞と共に被検体に移植することを意図する場合、基材は生体適合性および/また は生分解性材料カゝら作成されていることが好ましい。基材は、例えば、多孔質、繊維 状、シート状、メッシュ状、スポンジ状、ゲル状であることができる。基材が生体適合性 および/または生分解性の基材、例えば、ポリ乳酸 (PLA) (ポリ—L—乳酸、ポリ—D 乳酸、ポリ D, L 乳酸）、ポリグリコール酸（PGA)、乳酸 Ζグリコール酸コポリマ 一、ポリ ε力プロラタトン（PCL)、乳酸 Ζ ε力プロラタトンコポリマー、ポリエチレンダリ コール酸、ヒアルロン酸、アルギン酸のような高分子材料；あるいはフイブリン、例えば タイプ I、タイプ II、タイプ IVコラーゲンのようなコラーゲンまたはこれらのァテロコラー ゲン、寒天またはゼラチン力も作成された基材であれば、そのような基材は最終的な 移植用細胞調製物中に含まれてもよ ヽ。
[0024] 分化誘導培地から軟骨細胞を回収する。このとき、軟骨細胞は、培地 (例えばダル コサミンまたはその誘導体を任意に含む分化誘導培地）中に回収してもよいし、他の 生理学的に受容可能な溶液、例えば生理食塩水又は緩衝液 (例えば、 Dulbeccoリン 酸緩衝生理食塩水、 Hanks平衡塩溶液）中に回収してもよい。ダルコサミンまたはそ の誘導体の濃度は、 0. 001〜10mg/mlの範囲、好ましくは 0. 01〜5mg/mlの範 囲、より好ましくは 0. 05〜5mg/mlの範囲であり、最も好ましくは 0. 2〜2mg/mlの 範囲であり得る。軟骨細胞が三次元組織ィ匕されている場合には、三次元組織化に使 用した基材とともに軟骨細胞を回収してもよ 、。
[0025] 本発明の移植用細胞調製物においては、好ましくは、その調製物に含まれる全細 胞 (軟骨細胞 +軟骨細胞に分化可能な細胞）の少なくとも 60%、より好ましくは少なく とも 70%、なお好ましくは少なくとも 80%、さらに好ましくは少なくとも 90%、なおさら に好ましくは少なくとも 95%、最も好ましくは少なくとも 99%が軟骨細胞である。
[0026] 本発明の移植用細胞調製物中の軟骨細胞細胞密度は高い状態にすることが好ま しぐ例えば細胞密度を 1 X 107個 /cm3以上、具体的には例えば 1 X 108個 /cm3 〜1 X 109個/ cm3とすることが好ましい。
[0027] 本発明の移植用細胞調製物にお!、て、軟骨細胞は、水性媒体 (例えば上記のよう な培地又は生理学的緩衝液）中で懸濁状態であってもよい。移植用細胞調製物は、 軟骨細胞に加えて、可溶ィ匕コラーゲンを含んで 、てもよ 、。
[0028] 或 、は、本発明の移植用細胞調製物にお!ヽて、軟骨細胞は、生体適合性および/ または生分解性のキャリア (好ましくはゲル状又はスポンジ状）、例えば、ポリ乳酸 (P LA) (ポリ L 乳酸、ポリ D 乳酸、ポリ D, L 乳酸）、ポリグリコール酸（PGA )、乳酸 Zグリコール酸コポリマー、ポリ ε力プロラタトン (PCL)、乳酸 Ζ ε力プロラクト ンコポリマー、ポリエチレングリコール酸、ヒアルロン酸、アルギン酸のような高分子材 料;あるいはフイブリン若しくはフイブリン糊、例えばタイプ I、タイプ II、タイプ IVコラー ゲンのようなコラーゲン若しくはこれらのァテロコラーゲン、寒天またはゼラチン中に 包埋されていてもよい。
[0029] 本発明の移植用細胞調製物は更に、 10%ヒト血清 (特には、移植される患者本人の 自家血清)を含有してもよい。
実施例
[0030] 以下、本発明の内容を実施例に基づいて具体的に説明する力 本発明はこれらに 何ら制限されるものではな 、。
[0031] インビト口におけるヒト軟骨細胞の再分ィ匕
購入したヒト正常軟骨細胞（NHAC— kn, Lot No. 1F2153, BioWhittaker, U SA;入手時点で 2継代）を専用培地（Chondrocyte Growth Medium (CGM [ 商標]) Bullet Kit CC— 3216 : BioWhittaker, USA)で 1継代単層培養し、トリ プシン処理により軟骨細胞を回収した。次いで、 24ゥエルプレートの各ゥエルに 1. 8 X 105細胞/ cm2の細胞密度で播種後、 5%COインキュベータ内に 37. 0°Cで静置
2
した。 3時間後に細胞接着を確認後、脱分化細胞を、分化誘導因子として TGF— β 1を含む専用分化誘導培地（Chondrocyte Differentiation Bullet Kit CC— 3225 : Bio Whittaker, USA)で培養することにより再分化を誘導した。この際、細 胞を 4群に分け、このうち 3群の CGM培地には、それぞれ、 D lmgZmlの D—グル コサミン（キッコーマン， 日本）、 2) lmgZmlの N—ァセチルー D—ダルコサミン（CA LBIOCHEM [商標] , EMD Biosciences, USA)、 3) lmgZmlのカルボキシメ チルキチン（甲陽ケミカル， 日本)を添加した。残る 1群の CGM培地には何も添加せ ず、 4)コントロール群として用いた。 1、 2、 3週間後に細胞をセルスクレーバで回収し て、インビトロ評価の検体とした。細胞を回収する緩衝液には、 10mM EDTA、 0. l %Triton X— 100を含む 10mMトリス一塩酸緩衝液（pH7. 5)を 200 lZゥエル で使用した。
[0032] タイプ IIコラーゲン産生の評価
ウェスタンブロッテイング法により、細胞外基質中に発現されたタイプ IIコラーゲン量 をタンパク質レベルで評価した。まず、回収した細胞を 10mMトリス一塩酸緩衝液 (p H7. 5)、 10mM EDTA、 0. l %TritonX— 100で溶解して細胞溶解物とした。 5 %分離ゲルを用いた SDS— PAGE法により、 1レーンあたり 5 gの細胞溶解物を電 気泳動して分離し、これをセミドライブロッテイング法により PVDF膜に転写した。なお 、転写後のアクリルアミドゲルをクマシ一'ブリリアントブルー R250に染色することによ り、タンパク質の転写効率に検体間で相違が無いことを確認した。転写後の PVDF 膜を BSA (ゥシ血清アルブミン）によるブロッキングした後、抗ヒトタイプ IIコラーゲン— マウスポリクローナル抗体（一次抗体； CHEMICON, USA)と 4°Cでー晚反応させ た。反応後の膜を PBS (リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄後、 ALP標識された抗マウス IgG—ャギアフィ-ティー精製抗体 (二次抗体)とさらに反応させた。 PBSでの洗浄後 、PVDF膜上に存在する ALPを NBTZBCIP系発色基質により発色させた。
[0033] 結果を図 1に示す。使用した一次抗体はタイプ IIコラーゲンを構成する oc 1 (Π)鎖を 特異的に認識するので、図 1中に示された結合活性は、各細胞溶解物中のタイプ II コラーゲンおよびその分解物の存在（およびその量)を証明する。コントロール群では 、分化誘導前 (t = 0)に比べ、分ィ匕誘導後 1週目でわずかにタイプ IIコラーゲン量の 増加がみられるものの、 2週、 3週と経過するに従い減少した（図 1A、左の 3つのレー ン)。一方、カルボキシメチルキチンを分ィ匕誘導培地に添加した群では、 1週目よりコ ントロール群と比べて顕著なタイプ πコラーゲン量の増加が認められ、この高レベル のタイプ IIコラーゲン量は、評価した 3週目まで維持された（図 1Α、右の 3つのレーン ) o D-ダルコサミン添加群および Ν -ァセチル -D-ダルコサミン添加群においても 、カルボキシメチルキチン添加群と同様に、顕著なタイプ IIコラーゲン量の増加およ び増加状態の維持が観察された（図 1Β)。このことは、コントロール群においては、分 化誘導因子により脱分ィ匕軟骨細胞は一旦軟骨細胞に分ィ匕するが、その後の培養継 続により、再び脱分化状態に戻ってしまうことを示す。これに対し、ダルコサミン添カロ 群、 Ν ァセチル D ダルコサミン添加群およびカルボキシメチルキチン添加群に おいては、脱分化軟骨細胞が、タイプ Πコラーゲンを産生する能力を有する軟骨細 胞に効率的に分化し、そしてその分ィ匕状態が長期間（実施例では、 3週間以上)維持 されることを示している。
[0034] 以上の結果より、ダルコサミン、ならびに Ν ァセチルー D ダルコサミンおよび力 ルポキシメチルキチンを含むダルコサミンの誘導体は、軟骨細胞に分ィ匕可能な細胞 の軟骨細胞への分化を促進する効果を有し、よって軟骨細胞に分化可能な細胞の 培養補助剤として有用であることが示された。
[0035] 上記の実施形態および実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記 載されたものであって、本発明は本明細書または添付図面に記載された具体的な構 成および配置のみに限定されるものではないことに留意すべきである。本明細書に 記載した具体的構成、手段、方法、および装置は、本発明の精神および範囲を逸脱 することなぐ変更又は変形が可能であり、そのような変更例及び変形例もまた本発 明に包含されることを、当業者は容易に認識する。
[0036] この出願は、 2005年 2月 3日に出願された日本国特許出願 特願 2005— 02780 8号に関する。
本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、適用される特許法が許 す範囲内で、言及によって、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているの と同様にその内容全体が本明細書に組み込まれているものとみなされる。

Claims

請求の範囲
[1] ダルコサミンまたはその誘導体を含む分化誘導培地中で、軟骨細胞に分化可能な細 胞を、軟骨細胞に分化するに十分な期間培養する工程からなる軟骨細胞を含む移 植用細胞調製物の製造方法。
[2] 前記ダルコサミンまたはその誘導体が分ィ匕誘導培地中に 0. 001〜10mg/mlの範 囲で存在する請求項 1に記載の製造方法。
[3] 前記ダルコサミンまたはその誘導体力 ダルコサミン、 N—ァセチル— D—ダルコサミ ンおよびカルボキシメチルキチン力 なる群より選択される請求項 1または 2に記載の 製造方法。
[4] 前記軟骨細胞に分ィ匕可能な細胞が脱分ィ匕軟骨細胞である請求項 1〜3の 、ずれか に記載の製造方法。
[5] 前記培養工程の前に、前記軟骨細胞に分化可能な細胞を増殖させる工程をさらに 含む請求項 1〜4のいずれかに記載の製造方法。
[6] 前記培養工程中または該工程後に、軟骨細胞が三次元組織化される請求項 1〜5 の！、ずれかに記載の製造方法。
[7] 請求項 1〜6のいずれかに記載の製造方法により製造された、軟骨細胞を含む移植 用細胞調製物。
[8] ダルコサミンまたはその誘導体の、軟骨細胞に分化可能な細胞の分化誘導促進剤と しての使用。
[9] 前記ダルコサミンまたはその誘導体力 ダルコサミン、 N—ァセチル— D—ダルコサミ ンおよびカルボキシメチルキチン力 なる群より選択される請求項 8に記載の使用。
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