JP2012509942A - プライミング細胞療法 - Google Patents
プライミング細胞療法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012509942A JP2012509942A JP2011538703A JP2011538703A JP2012509942A JP 2012509942 A JP2012509942 A JP 2012509942A JP 2011538703 A JP2011538703 A JP 2011538703A JP 2011538703 A JP2011538703 A JP 2011538703A JP 2012509942 A JP2012509942 A JP 2012509942A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- population
- composition
- connective tissue
- chondrocytes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、プライミングした細胞を、哺乳動物においてそれを必要とする部位に投与して、コラーゲン又は硝子軟骨を産生させる、投与することを包含する。プライミングした細胞は典型的には結合組織細胞であり、軟骨細胞又は線維芽細胞を含む。
本発明は、細胞の混合物を哺乳動物においてそれを必要とする部位に投与して、コラーゲン又は硝子軟骨を産生させる、投与することも包含するが、この場合細胞の第1の集団に、哺乳動物における対象の部位で発現させる対象の遺伝子をトランスフェクト又は形質導入する。体遺伝子療法を試みる場合、本発明は、対象の遺伝子をトランスフェクト又は形質導入していない、対象の創傷部位若しくは病変部位、又はそうでなければ衰弱した部位で内因的に減少した、プライミングした細胞である細胞の第2の集団を加えることを提供する。
プライミングした細胞は椎間板の再生に使用することもできる。椎間板は脊柱の長さの4分の1を占める。環椎(C1)、軸椎(C2)及び尾骨の間には椎間板はない。椎間板は血管性ではなく、したがって必要な栄養の拡散を終板に依存する。終板の軟骨層は椎間板を決まった部位に固定する。
実施例1.1−細胞培養及び処理
この研究に使用した細胞は、in vitroで長期間培養した初代ヒト軟骨細胞に由来するものであった。これらの細胞は、その起源にかかわらず、線維芽細胞の特徴を示す形態及び表現型をとっていた。実験はおよそ継代7代目の培養物を用いて行った。細胞を単層及びマイクロマスという2つの異なる培養フォーマットで播種した。培地は10%ウシ胎仔血清(Lonza)及び1%L−グルタミン(Lonza)を添加した、4.5g/Lのグルコースを含むDMEM(Lonza)からなるものであった。細胞は処理期間中、37℃、5%CO2環境下でインキュベートした。細胞を様々な長さのインキュベーション時間中、複数の濃度のTGF−β1(R&D Systems)に、培養プロセスの異なる時点で曝露した。
軟骨細胞を6ウェルコラーゲンコートプレート(BioCoat、BD Biosciences)に5×104細胞/ウェルで播種した。細胞を播種前に6時間の間、100ng/mLの濃度のTGF−β1でプライミングするか、又は研究期間中、1ng/mLの濃度のTGF−β1とインキュベートした。これら2つの処理に加えて、TGF−β1産生細胞とヒト軟骨細胞との共培養物を1:3の比率で調製し、5×104細胞/ウェルで播種し、同様に3週間の研究期間で試験した。細胞はRNA調製及び染色のために毎週採取した。
細胞懸濁液を15μLの液滴(droplet)中に細胞3×105個という播種密度で調製した。細胞液滴を24ウェルコラーゲンコートプレート(BioCoat)のウェルの中央に置いた。細胞マスを37℃で1.5時間インキュベートし、マスが定着した時点で1mLの完全媒体を補充した。細胞を6時間又は18時間の間、10ng/mL又は50ng/mLのTGF−β1で処理することによってプライミングした後、マイクロマスを播種した。これら4つの処理群に加えて、2つの軟骨細胞の群を、1ng/mL又は10ng/mLの濃度のTGF−β1に研究期間中曝露した。最終の実験群は、3:1の比率のTGF−β1産生細胞と非処理軟骨細胞とからなるものであった。マスを最大で4週間培養した。
アルシアンブルー(AB)(アルシアンブルー8GX、イングレインブルー1及びC.I. 74240とも呼ばれる)は、銅を含有するフタロシアニン色素である。この色素は酸性ムコ多糖類及びグリコサミノグリカンを染色するものであり、それらに対し最も広く使用されるカチオン性色素の1つである。染色部分は青色から青みがかった緑色となる。これはH&E染色法及びワンギーソン染色法と組み合わせることができる。この色素は、負に帯電した高分子と静電気力によって結合する。結合した色素の洗浄に使用される電解質の濃度の漸増によって、中性ムコ多糖類、硫酸ムコ多糖類及びリン酸ムコ多糖類が選択的に同定される。
TRIzol(Invitrogen)を使用するフェノール−クロロホルム抽出手順を用いて毎週の細胞採取物からRNAを単離した。単離RNAをSuperScript(商標)逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写し、各々の細胞試料についてcDNA構築物を得た。IDTによって合成された以下のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った:
コラーゲンIIα1フォワードプライマー 5’−GACCTCGTGGCAGAGATGGAG-3’(配列番号1)、
コラーゲンIIα1リバースプライマー 5’−AACCTCTGTGACCTTTGACACCAG−3’(配列番号2)、
コラーゲンIα1フォワードプライマー 5’−TGTGGCCCAGAAGAACTGGTACAT−3’(配列番号3)、
コラーゲンIα1リバースプライマー 5’−AAAGGAGCAGAAAGGGCAGCATTG−3’(配列番号4)、
アグレカンフォワードプライマー 5’−TTCAGTGGCCTACCAAGTGGCATA−3’(配列番号5)、
アグレカンリバースプライマー 5’−ACATCACTGGTGGTGGTGGATTCT−3’(配列番号6)、
βカテニンフォワードプライマー 5’−TGGCCATCTTTAAGTCTGGAGGCA−3’(配列番号7)、
βカテニンリバースプライマー 5’−GATTTGCGGGACAAAGGGCAAGAT−3’(配列番号8)。
実施例2.1−単層細胞培養
バイアル2本の継代5代目の(p5)hChonJ軟骨細胞(2×106細胞/バイアル)を融解し、同数のコラーゲンコートT−75フラスコ及び非コートT−75フラスコに、5×103細胞/cm2の細胞播種密度で播種した。細胞を初めに、10%FBS(Lonza、カタログ番号14−507F)及び1%L−グルタミン(Lonza、カタログ番号17−605E)を添加したDMEM完全培地(Lonza、カタログ番号)で培養した。
7つの異なるサイトカイン処理群をこの研究に使用した。細胞播種の24時間後、全てのフラスコ中の培地を12mLのサイトカインを添加した培地に置き換えた。サイトカイン処理群(表1)は以下の通りであった:50ng/mLのTGFβ1(eBioscience又はPromogen);200ng/mLのBMP−2(eBioscience)及び15μg/mLのインスリン(Sigma Aldrich);200ng/mLのBMP−2(eBioscience)、15μg/mLのインスリン(Sigma Aldrich)及び100nM 3,3’,5−トリヨード−L−サイロニン(T3)(Sigma Aldrich);10ng/mLのFGF(eBioscience)及びTGFβ1(eBioscience又はPromogen);並びに20ng/mLのTGFβ3(Sigma Aldrich)。コラーゲンコート細胞の2本のT−75フラスコ及び2本の非コートT−75フラスコを陰性処理対照(12mLの完全DMEM)に使用した。各々の処理群の細胞培地は3日〜4日毎に置き換えた。サイトカイン処理した二次元培養における細胞成長速度を同様に図2に示す。各々のサイトカイン処理群から、T−75フラスコ中で培養した細胞をコンフルエンスで採取し、計数して、最初の細胞播種数から細胞成長速度を求めた。
コンフルエンスに達した時点で、実施例2.2から得た細胞の一部を2mL/フラスコの1×トリプシン−ベルセン(EDTA)で、37℃で3分間〜4分間処理した。細胞を完全な剥離を確認するために100×の顕微鏡下で検査した。8mLの完全培地を各々のフラスコに添加して、トリプシンを不活性化した。30μLの細胞を全細胞懸濁液から取り出し、細胞計数のために30μLのトリパンブルーに添加した。細胞濃度を算出した後、2.25×105個の細胞を、二次拡大培養のために最終細胞播種密度3×103細胞/cm2で各々のフラスコに添加した。実施例2.2で得られた単層培養物中での結合組織細胞に対するサイトカインの効果を確認するために、継代培養細胞に実施例2.2と同じ細胞のサイトカイン処理を行った(データは示さない)。
実施例2.2で得られた細胞の一部を、実施例2.2で説明した、先のサイトカイン処理スキームに従って24ウェルコラーゲンコート又は非コート培養プレートに播種した。各々の細胞懸濁液についてマイクロマスの所定数を割り当てるが、10〜24マイクロマスと決定した。1つのマイクロマス当たり1.5×105個の細胞が算出され、この量を細胞懸濁液から取り出し、未使用の遠心分離管に入れた。細胞を1500rpm、10℃で7分間遠心分離した。上清を吸引し、残った細胞ペレットを完全培地中に20μL/マイクロマスの量で再懸濁した。マイクロマスを20μLの量(約1.5×105個の細胞)で、ウェル表面に直に直接ピペットで移し、37℃、5%CO2でおよそ1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション期間の後、500μLのサイトカイン馴化培地又は陰性対照完全培地を各々のウェルに添加した。マイクロマスを7日間培養した後、RNA及びタンパク質の含量測定、並びにアルシアンブルー染色、並びにその後のGAG定量化のために細胞を採取した。
実施例2.2で得られた細胞の残りの細胞懸濁液量を等分し、その測定量を用いて調製量当たりの細胞数を算出した。細胞調製物懸濁液を1500rpm、10℃で7分間遠心分離した。ペレットを4mLのPBS培地で洗浄し、再度遠心分離した。最終洗液量(wash volume)を吸引し、細胞ペレットをRNA及びタンパク質を抽出する目的に使用した。RNA調製については、標準的なフェノール−クロロホルム抽出技法を利用した。タンパク質抽出については、RIPAバッファー(Sigma Aldrich)を用いて細胞を溶解し、液体窒素中で急速凍結した(snap frozen)。RNA調製並びにタンパク質の抽出及び解析を、実施例2.3で説明した継代培養による細胞を用いて繰り返した。
1週間の培養期間の後、マイクロマス培養プレートをインキュベーターから取り出し、RNA、タンパク質及びアルシアンブルー染色について同時に処理した。各々のウェルを1ウェル当たり1mLのdPBSで静かに2回洗浄した。マイクロマスの半分は、標準的なフェノール−クロロホルム抽出を用いたRNA調製から除外した。この残りのマイクロマスをRIPA溶解バッファーを用いたタンパク質抽出に使用し、試料を液体窒素中で急速凍結し、−80℃で長期間貯蔵した。実施例2.3の継代培養細胞を用いたマイクロマス播種も行った。RNA及びタンパク質の抽出及び解析を同様にこれらのマイクロマスを用いて繰り返し、この結果により実施例2.2で得られた単層細胞を播種したマイクロマスを用いて得られた結果を確認した。
1.0%アルシアンブルー−8GX染色剤を1N HCL溶液中で調製し、濾過して微粒子残屑を除去した。3つ〜4つのマイクロマスを染色目的のみに取っておいた。マイクロマスを1ウェル当たり1mLのdPBSで静かに2回洗浄した。最終洗液を各々のウェルから完全に除去した。250μL/ウェルの10%ホルマリンを添加して、各々のマイクロマスを固定し、プレートを室温で15分間〜30分間インキュベートした。固定溶液を各々のウェルから完全に吸引し、500uL/ウェルの1%アルシアンブルー−8GX染色剤を添加し、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション期間の後、染色液を除去し、マイクロマスを1ウェル当たり1mLのdPBSで2回洗浄した。マイクロマスのデジタル画像を撮影し、各々のウェルにおける染色の分布(distribuation)を記録した。
250μL/ウェルの4M グアニジンHCl(Gu−HCl)を添加し、4℃で最低でも1時間〜18時間又は一晩インキュベートし、染色剤の完全抽出を確実に行った。100μLの溶液を各々のウェルから取り出し、560nMで観察するために96ウェルアッセイプレートに移した。100uLの4M Gu−HClをブランクとして使用した。マイクロマスのGAG定量化を図4に示す。グリコサミノグリカンの定量化は、アルシアンブルーと結合したプロテオグリカン分子のGAG鎖を沈殿させる塩酸グアニジン(Gu−HCl)の添加によって行うことができる。アルシアンブルー染色したマイクロマスを、250μl/ウェルの4M Gu−HClとインキュベートした。染色剤の大部分がマイクロマスから抽出された時点で溶液を除去し、光学密度を560nmで測定した。
相補的DNA(cDNA)を、プライマーとしてオリゴdTを用いるmRNA(RNA濃度に応じて0.5μg〜1μg)の逆転写によって得た。逆転写反応はサーモサイクラー内で20μLの量で行った。幾つかの軟骨型(chondrotypic)遺伝子(表2)の発現レベルを解析した。単層細胞及びマイクロマス細胞の両方、並びに継代培養した単層細胞及び継代培養細胞に由来するマイクロマスについて遺伝子発現解析を行ったところ、結果は相互に確認し合うものである。
Claims (43)
- プライミングした結合組織細胞及び薬学的に許容可能なその担体を含む組成物。
- 細胞が線維芽細胞、軟骨細胞又は線維芽細胞様軟骨細胞である、請求項1に記載の組成物。
- 細胞がヒト細胞である、請求項2に記載の組成物。
- 注射可能である、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1に記載の組成物を含む、約−70℃〜約−196℃の温度で細胞を貯蔵する貯蔵容器。
- 哺乳動物において標的部位で軟骨の再生を刺激する方法であって、
(i)結合組織細胞をサイトカインを含む組成物とインキュベートし、プライミングした細胞を作り出す、インキュベートすること、
(ii)任意で該サイトカインと該結合組織細胞とを分離すること、及び
(iii)治療的有効量の該プライミングした細胞を、軟骨を生成することが望まれる標的関節部位に注射することを含み、内因的に存在する形態の該結合組織細胞が該標的部位で減少しており、該標的部位での該プライミングした細胞の存在が軟骨の再生を刺激する、方法。 - 結合組織細胞が線維芽細胞、軟骨細胞又は線維芽細胞様軟骨細胞である、請求項6に記載の方法。
- 軟骨細胞が初代ヒト軟骨細胞である、請求項7に記載の方法。
- サイトカインがTGF−βスーパーファミリーに属する成員である、請求項6に記載の方法。
- 結合組織細胞を約1時間〜約40時間インキュベートする、請求項6に記載の方法。
- サイトカインがTGF−βである、請求項9に記載の方法。
- サイトカインが少なくとも1ng/mlの量で存在する、請求項6に記載の方法。
- 発現させようとする遺伝子をトランスフェクト又は形質導入した哺乳動物細胞の第2の集団をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 混合細胞組成物であって、硝子軟骨を生成するのに有効な量で、
(a)プライミングした軟骨細胞又は線維芽細胞の第1の集団、
(b)TGF−βスーパーファミリーの成員をコードする遺伝子をトランスフェクト又は形質導入した線維芽細胞又は軟骨細胞の第2の集団、及び
(c)薬学的に許容可能なその担体を含む、組成物。 - 前記遺伝子がTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−7又はBMP−9である、請求項14に記載の組成物。
- TGF−βスーパーファミリーの成員をコードする遺伝子をトランスフェクト又は形質導入した線維芽細胞又は軟骨細胞の該第2の集団に対する、プライミングした細胞の該第1の集団の比率が約1〜20対1である、請求項14に記載の組成物。
- 前記比率が約1〜10対1である、請求項16に記載の組成物。
- 前記比率が約1〜3対1である、請求項16に記載の組成物。
- 遺伝子をトランスフェクト又は形質導入した細胞の該第2の集団が、照射を受けたものである、請求項14に記載の組成物。
- 細胞の第1の集団及び細胞の第2の集団が、同じ供給源生物に由来するものである、請求項14に記載の組成物。
- 細胞の第1の集団及び細胞の第2の集団が、異なる供給源生物に由来するものである、請求項14に記載の組成物。
- 混合細胞組成物を生成する方法であって、
(A)
(i)結合組織細胞をサイトカインを含む組成物とインキュベートして、プライミングした細胞の第1の集団を作り出す、インキュベートする工程、及び
(ii)任意で該サイトカインと該結合組織細胞とを分離する工程
を含む、細胞の第1の集団を作り出すこと、
(B)
(i)プロモーターと操作可能に結合した、治療用タンパク質をコードするDNA配列を含む組み換えベクターを生成する工程、
(ii)in vitroで細胞の集団に前記組み換えベクターをトランスフェクト又は形質導入して、細胞の第2の集団を作り出す、トランスフェクト又は形質導入する工程
を含む、細胞の第2の集団を作り出すこと、並びに、
(C)細胞の該第1及び第2の集団を混合し、該混合細胞組成物を得る、混合することを含む、方法。 - 哺乳動物において標的部位で軟骨の再生を刺激する方法であって、
(A)
(i)結合組織細胞をサイトカインを含む組成物とインキュベートして、プライミングした細胞の第1の集団を作り出す、インキュベートする工程、及び
(ii)任意で該サイトカインと該結合組織細胞とを分離する工程
を含む、細胞の第1の集団を作り出すこと、
(B)
(i)プロモーターと操作可能に結合した、治療用タンパク質をコードするDNA配列を含む組み換えベクターを生成する工程、
(ii)in vitroで細胞の集団に前記組み換えベクターをトランスフェクト又は形質導入して、細胞の第2の集団を作り出す、トランスフェクト又は形質導入する工程
を含む、細胞の第2の集団を作り出すこと、並びに、
(C)治療的有効量の細胞の該第1及び第2の集団の混合物を、軟骨を生成することが望まれる標的関節部位に注射することを含み、内因的に存在する形態の該結合組織細胞が該標的部位で減少しており、該標的部位での該細胞混合物の存在が軟骨の再生を刺激する、方法。 - 前記遺伝子がTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6又はBMP−7である、請求項23に記載の方法。
- 細胞の第1及び第2の集団が宿主レシピエントに関して同系である、請求項23に記載の方法。
- 第1及び第2の集団の細胞が宿主レシピエントに関して同種異系である、請求項23に記載の方法。
- 第1及び第2の細胞の集団が宿主レシピエントに関して異種である、請求項23に記載の方法。
- 前記組み換えベクターがウイルスベクターである、請求項23に記載の方法。
- 前記組み換えベクターがプラスミドベクターである、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞を移植の前に貯蔵する、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞を移植の前に凍結保存剤中に貯蔵する、請求項30に記載の方法。
- 骨関節炎を治療する方法であって、
(A)
(i)結合組織細胞をサイトカインを含む組成物とインキュベートして、プライミングした細胞の第1の集団を作り出す、インキュベートする工程、及び
(ii)任意で該サイトカインと該結合組織細胞とを分離する工程
を含む、細胞の第1の集団を作り出すこと、
(B)
(i)プロモーターと操作可能に結合した、治療用タンパク質をコードするDNA配列を含む組み換えベクターを生成する工程、
(ii)in vitroで細胞の集団に前記組み換えベクターをトランスフェクト又は形質導入して、細胞の第2の集団を作り出す、トランスフェクト又は形質導入する工程
を含む、細胞の第2の集団を作り出すこと、並びに、
(C)治療的有効量の細胞の該第1及び第2の集団の混合物、並びに非生物三次元構造ではない薬学的に許容可能なその担体を、哺乳動物の関節腔の軟骨を生成することが望まれる標的関節部位に注射することを含み、内因的に存在する形態の該結合組織細胞が該標的部位で減少しており、該標的部位での該細胞混合物の存在が軟骨の再生を刺激して、骨関節炎が治療される、方法。 - 請求項14に記載の混合細胞組成物を含む、約−70℃〜約−196℃の温度で細胞を貯蔵する貯蔵容器。
- 結合組織細胞の倍加時間を短縮する方法であって、結合組織細胞をサイトカインを含む組成物とインキュベートして、プライミングした細胞を作り出す、インキュベートすることを含む、方法。
- 結合組織細胞が線維芽細胞、軟骨細胞又は線維芽細胞様軟骨細胞である、請求項34に記載の方法。
- 軟骨細胞が初代ヒト軟骨細胞である、請求項35に記載の方法。
- サイトカインがTGF−βスーパーファミリーに属する成員である、請求項34に記載の方法。
- 細胞を該サイトカインと約1時間〜約40時間インキュベートする、請求項34に記載の方法。
- 倍加時間が対照のインキュベートしていない細胞の約半分である、請求項34に記載の方法。
- サイトカインがFGFとTGFβ1との組み合わせである、請求項34に記載の方法。
- 組成物が3,3’,5−トリヨード−L−サイロニンをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 被験体が変性性関節炎を患っている、請求項6に記載の方法。
- 標的部位が脊髄である、請求項6に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11788108P | 2008-11-25 | 2008-11-25 | |
US61/117,881 | 2008-11-25 | ||
PCT/US2009/065996 WO2010068510A1 (en) | 2008-11-25 | 2009-11-25 | Primed cell therapy |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016134404A Division JP6349353B2 (ja) | 2008-11-25 | 2016-07-06 | プライミング細胞療法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012509942A true JP2012509942A (ja) | 2012-04-26 |
JP2012509942A5 JP2012509942A5 (ja) | 2012-11-22 |
JP6156968B2 JP6156968B2 (ja) | 2017-07-05 |
Family
ID=42243034
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011538703A Active JP6156968B2 (ja) | 2008-11-25 | 2009-11-25 | プライミング細胞療法 |
JP2016134404A Active JP6349353B2 (ja) | 2008-11-25 | 2016-07-06 | プライミング細胞療法 |
JP2017223383A Pending JP2018083810A (ja) | 2008-11-25 | 2017-11-21 | プライミング細胞療法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016134404A Active JP6349353B2 (ja) | 2008-11-25 | 2016-07-06 | プライミング細胞療法 |
JP2017223383A Pending JP2018083810A (ja) | 2008-11-25 | 2017-11-21 | プライミング細胞療法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11248211B2 (ja) |
EP (2) | EP3243388A1 (ja) |
JP (3) | JP6156968B2 (ja) |
KR (5) | KR102418479B1 (ja) |
CN (1) | CN102292092B (ja) |
AU (4) | AU2009324832A1 (ja) |
CA (1) | CA2744445C (ja) |
SG (1) | SG171800A1 (ja) |
WO (1) | WO2010068510A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201010422D0 (en) * | 2010-06-22 | 2010-08-04 | Univ Cardiff | Cartilage repair |
JPWO2015037120A1 (ja) * | 2013-09-13 | 2017-03-02 | 株式会社メディネット | 細胞懸濁液ろ過器具及び細胞懸濁液を含む点滴用溶液の調製方法 |
CN107338218B (zh) * | 2017-07-28 | 2020-11-24 | 中国人民解放军总医院第一附属医院 | 一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基和方法 |
JP7384793B2 (ja) * | 2018-06-29 | 2023-11-21 | サントリーホールディングス株式会社 | 被検試料に含まれる酸性ムコ多糖又はその塩の分析方法、コンドロイチン硫酸又はその塩の定量方法及び製品の品質管理試験方法 |
WO2020205720A2 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | Kolon Tissuegene, Inc. | Mixed-cell gene therapy |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5783284A (en) * | 1980-11-12 | 1982-05-25 | Olympus Optical Co Ltd | Hermetically sealed freezing of cultivated cell and its preparation |
JP2000515023A (ja) * | 1996-07-25 | 2000-11-14 | ジェンザイム・コーポレーション | 軟骨細胞培地組成および培養方法 |
JP2002078484A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-03-19 | Merck Patent Gmbh | invitroで培養された軟骨細胞によるヒト軟骨移植片の製造方法 |
JP2005521732A (ja) * | 2002-03-29 | 2005-07-21 | ティシュージーン,インク | 混合細胞遺伝子治療 |
WO2006082854A1 (ja) * | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Japan Medical Materials Corporation | 移植用軟骨細胞調製物の製造方法 |
JP2010539905A (ja) * | 2007-09-21 | 2010-12-24 | イスト テクノロジーズ インク | 表現型を保持したまま軟骨細胞を増殖する方法 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5858355A (en) | 1990-12-20 | 1999-01-12 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | IRAP gene as treatment for arthritis |
EP0690673A4 (en) | 1993-12-14 | 1996-05-29 | Univ Pittsburgh | SYSTEMIC GENETIC TREATMENT OF TISSUE DISEASES |
US5842477A (en) | 1996-02-21 | 1998-12-01 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Method for repairing cartilage |
US5700774A (en) | 1996-03-26 | 1997-12-23 | Genetics Institute, Inc. | Compositions comprising bone morphogenic proteins and truncated parathyroid hormone related peptide, and methods of inducing cartilage by administration of same |
US5919702A (en) * | 1996-10-23 | 1999-07-06 | Advanced Tissue Science, Inc. | Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly |
US6835377B2 (en) * | 1998-05-13 | 2004-12-28 | Osiris Therapeutics, Inc. | Osteoarthritis cartilage regeneration |
FR2787714B1 (fr) * | 1998-12-23 | 2003-01-31 | Pharmascience Lab | Utilisation d'insaponifiables d'huiles vegetales pour la preparation d'un medicament stimulant l'expression du tgf-beta ou l'expression de l'inhibiteur pai-1 de l'activateur du plasminogene |
CA2473360A1 (en) * | 2002-01-25 | 2003-08-07 | Genzyme Corporation | Serum-free media for chondrocytes and methods of use thereof |
WO2003077852A2 (en) * | 2002-03-12 | 2003-09-25 | Tissuegene, Inc. | CARTILAGE REGENERATION USING CHONDROCYTE AND TGF-β |
CN101035890B (zh) * | 2004-07-30 | 2012-10-10 | 布赖汉姆妇女医院有限公司 | 经物理/物理化学刺激处理的无定形细胞递送载体 |
US7273756B2 (en) * | 2004-10-01 | 2007-09-25 | Isto Technologies, Inc. | Method for chondrocyte expansion with phenotype retention |
-
2009
- 2009-11-25 EP EP17000101.0A patent/EP3243388A1/en active Pending
- 2009-11-25 KR KR1020207036161A patent/KR102418479B1/ko active IP Right Grant
- 2009-11-25 JP JP2011538703A patent/JP6156968B2/ja active Active
- 2009-11-25 KR KR1020147030632A patent/KR20140136061A/ko active Search and Examination
- 2009-11-25 EP EP09832377A patent/EP2381789A4/en not_active Withdrawn
- 2009-11-25 SG SG2011037371A patent/SG171800A1/en unknown
- 2009-11-25 CA CA2744445A patent/CA2744445C/en active Active
- 2009-11-25 WO PCT/US2009/065996 patent/WO2010068510A1/en active Application Filing
- 2009-11-25 KR KR1020227022743A patent/KR20220100999A/ko active Application Filing
- 2009-11-25 US US12/626,567 patent/US11248211B2/en active Active
- 2009-11-25 CN CN200980155331.XA patent/CN102292092B/zh active Active
- 2009-11-25 AU AU2009324832A patent/AU2009324832A1/en not_active Abandoned
- 2009-11-25 KR KR1020197019444A patent/KR20190084341A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-11-25 KR KR1020117014554A patent/KR20110089876A/ko active Application Filing
-
2016
- 2016-07-06 JP JP2016134404A patent/JP6349353B2/ja active Active
- 2016-09-05 AU AU2016225789A patent/AU2016225789A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-11-21 JP JP2017223383A patent/JP2018083810A/ja active Pending
-
2018
- 2018-05-22 AU AU2018203611A patent/AU2018203611A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-04-17 AU AU2020202622A patent/AU2020202622B2/en active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5783284A (en) * | 1980-11-12 | 1982-05-25 | Olympus Optical Co Ltd | Hermetically sealed freezing of cultivated cell and its preparation |
JP2000515023A (ja) * | 1996-07-25 | 2000-11-14 | ジェンザイム・コーポレーション | 軟骨細胞培地組成および培養方法 |
JP2002078484A (ja) * | 2000-08-29 | 2002-03-19 | Merck Patent Gmbh | invitroで培養された軟骨細胞によるヒト軟骨移植片の製造方法 |
JP2005521732A (ja) * | 2002-03-29 | 2005-07-21 | ティシュージーン,インク | 混合細胞遺伝子治療 |
WO2006082854A1 (ja) * | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Japan Medical Materials Corporation | 移植用軟骨細胞調製物の製造方法 |
JP2010539905A (ja) * | 2007-09-21 | 2010-12-24 | イスト テクノロジーズ インク | 表現型を保持したまま軟骨細胞を増殖する方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BRITTBERG,M. ET AL: "Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation", N ENGL J MED, vol. 331, no. 14, JPN6008007146, 1994, pages 889 - 95, XP002071931, ISSN: 0002556805, DOI: 10.1056/NEJM199410063311401 * |
LEE,J.E. ET AL: "Effects of the controlled-released TGF-beta 1 from chitosan microspheres on chondrocytes cultured in", BIOMATERIALS, vol. 25, no. 18, JPN6013029005, 2004, pages 4163 - 73, XP004497077, ISSN: 0002556804, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2003.10.057 * |
LEE,K.H. ET AL: "Regeneration of hyaline cartilage by cell-mediated gene therapy using transforming growth factor bet", HUM GENE THER, vol. 12, no. 14, JPN6008007151, 2001, pages 1805 - 13, XP001148278, ISSN: 0002556806, DOI: 10.1089/104303401750476294 * |
MATS BRITTBERG, ET AL.: "Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation", N ENGL J MED, vol. 331(14), JPN6014023567, 1994, pages 889 - 95, ISSN: 0002828159 * |
ZIMBER,M.P. ET AL: "Tgf-Beta promotes the growth of bovine chondrocytes in monolayer culture and the formation of cartil", TISSUE ENG, vol. 1, no. 3, JPN6013029001, 1995, pages 289 - 300, ISSN: 0002556803 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20220100999A (ko) | 2022-07-18 |
AU2016225789A1 (en) | 2016-09-22 |
CN102292092B (zh) | 2014-05-07 |
WO2010068510A1 (en) | 2010-06-17 |
EP2381789A4 (en) | 2013-03-13 |
AU2009324832A1 (en) | 2010-06-17 |
AU2020202622B2 (en) | 2022-07-14 |
KR20140136061A (ko) | 2014-11-27 |
KR20190084341A (ko) | 2019-07-16 |
KR20110089876A (ko) | 2011-08-09 |
US11248211B2 (en) | 2022-02-15 |
JP6349353B2 (ja) | 2018-06-27 |
JP6156968B2 (ja) | 2017-07-05 |
US20100316612A1 (en) | 2010-12-16 |
JP2018083810A (ja) | 2018-05-31 |
SG171800A1 (en) | 2011-07-28 |
CA2744445A1 (en) | 2010-06-17 |
JP2017008053A (ja) | 2017-01-12 |
KR102418479B1 (ko) | 2022-07-07 |
EP2381789A1 (en) | 2011-11-02 |
AU2020202622A1 (en) | 2020-05-14 |
AU2018203611A1 (en) | 2018-06-14 |
CA2744445C (en) | 2023-10-24 |
CN102292092A (zh) | 2011-12-21 |
EP3243388A1 (en) | 2017-11-15 |
KR20210005955A (ko) | 2021-01-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6849255B2 (en) | Methods and compositions for enhancing cartilage repair | |
JP6349353B2 (ja) | プライミング細胞療法 | |
US7282200B2 (en) | Mixed-cell gene therapy | |
AU2003218463B2 (en) | Bone generation by gene therapy | |
CN113939322A (zh) | 混合细胞基因疗法 | |
US20080279832A1 (en) | Osteogenic differentiation of preosteoblastic cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120920 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130613 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130913 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130924 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131213 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140609 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141009 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141021 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20141112 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20141226 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160405 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160502 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160603 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160706 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170111 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170605 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6156968 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |