KR20140136061A

KR20140136061A - 감작 세포 치료요법

Info

Publication number: KR20140136061A
Application number: KR1020147030632A
Authority: KR
Inventors: 노문종; 이영석; 이관희
Original assignee: 티슈진, 인코포레이티드
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2009-11-25
Publication date: 2014-11-27
Also published as: US20100316612A1; AU2018203611A1; JP6349353B2; JP2017008053A; KR20110089876A; CA2744445C; KR20190084341A; US11248211B2; AU2020202622A1; JP6156968B2; JP2012509942A; WO2010068510A1; EP2381789A1; CN102292092A; KR102418479B1; SG171800A1; JP2018083810A; KR20220100999A; AU2009324832A1; AU2016225789A1

Abstract

본 발명은 감작 연결 조직 세포 및 이의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

감작 세포 치료요법{PRIMED CELL THERAPY}

본 발명은 체세포 치료요법을 위해 사이토킨과 함께 항온처리함으로써 감작 세포(primed cell)를 사용하는 것에 관한 것이다.

정형외과학 분야에서, 퇴행성 관절염 (degenerative arthritis) 또는 골관절염 (osteoarthritis)은 연골 (cartilage) 손상과 관련하여 가장 흔히 직면하는 질병이다. 무릎, 엉덩이, 어깨, 및 심지어 손목과 같은 신체의 거의 모든 관절이 영향을 받는다. 당해 질병의 발병기전은 유리 (hyaline) 관절 연골의 변성이다 (참조: Mankin et al., J Bone Joint Surg, 52A: 460-466, 1982). 관절의 유리 연골은 변형되기 시작하여, 섬유화되고, 궁극적으로는 함몰된다. 변성된 연골이 어떻게든 재생될 수 있는 경우, 대부분의 환자는 쇠약화 통증(debilitating pain)없이 자신의 삶을 즐길 수 있을 것이다.

약물을 관절내로 운반하기 위한, 경구, 정맥내 또는 근육내 투여와 같은 전통적인 약물 전달 경로는 충분하지 않다. 관절내 주사된 약물의 반감기는 일반적으로 짧다. 약물의 관절내 주사의 또 다른 단점은 관절염과 같은 만성 상태를 치료하기 위한 관절 열극 (joint space)에서 허용되는 약물 수준을 수득하기 위해 빈번하게 반복된 주사가 필요하다는 것이다. 지금까지 치료제가 관절에 선택적으로 표적화할 수 없었으므로, 포유동물 숙주를 전신적으로 고농도의 약물에 노출시켜 지속적인 정맥내 치료학적 투여량을 달성하는 것이 필요하였다. 이러한 방식에 따른 비-표적 기관의 노출은 포유동물 숙주의 위장 장애 및 혈액, 심혈관, 간 및 신장계내의 변화와 같은 심각한 부작용을 생산하는 항-관절염 약물의 경향성을 악화시켰다.

정형외과학 분야에서, 일부 사이토킨은 정형외과학 질병의 치료를 위한 후보물로서 고려되어 왔다. 골 형태발생 단백질은 골 형성의 효과적인 자극인자인 것으로 고려되어 왔으며(참조: Ozkaynak et al., EMBO J, 9:2085-2093, 1990; Sampath and Rueger, Complications in Ortho, 101-107, 1994), TGF-β는 골형성 및 연골형성의 자극인자로 보고되어 왔다(참조: Joyce et al., J. Cell Biology, 110:2195-2207, 1990).

형질전환 성장 인자-β(TGF-β)는 다기능성 사이토킨인 것으로 고려되고 있으며[참조: Sporn and Roberts, Nature (London), 332: 217-219, 1988], 세포 성장, 분화 및 세포외 매트릭스 단백질 합성에서 조절 역할을 담당한다(참조: Madri et al., J. Cell Biology, 106: 1375-1384, 1988). TGF-β는 시험관내에서 상피 세포 및 파골세포-유사 세포의 성장을 억제하지만(참조: Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85: 5683-5687, 1988), 이는 연골 내골화 및 궁극적으로 생체내에서의 골 형성을 자극한다[참조: Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993; and Matsumoto et al., In vivo, 8: 215-220, 1994]. TGF-β-유도된 골 형성은 궁극적으로 연골-형성 세포로 분화되는 골막하 다능성 세포의 자극에 의해 매개된다(참조: Joyce et al., J. Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990; and Miettinen et al., J 세포 Biology, 127-6: 2021-2036, 1994).

정형외과학에서 TGF-β의 생물학적 효과는 보고되어 왔다[참조: Andrew et al., Calcif Tissue In. 52: 74-78, 1993; Borque et al., Int J Dev Biol., 37:573-579, 1993; Carrington et al., J. Cell Biology, 107: 1969-1975, 1988; Lind et al., A Orthop Scand. 64(5):553-556, 1993; Matsumoto et al., In vivo, 8:215-220, 1994]. 마우스 배아에서, 염색은, TGF-β가 연결 조직, 연골 및 골과 같은, 간충직(mesenchyme)으로부터 유래한 조직과 밀접하게 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 발생학상의 발견 외에, TGF-β는 골 형성 및 연골 형성의 부위에 존재한다. 이는 또한 토끼 경골에서 골절 치유를 향상시킬 수 있다. 최근에, TGF-β의 치료학적 가치가 보고되어 있지만[참조: Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; and Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993], 이의 단기간 효과 및 고 비용은 광범위한 임상 적용을 제한하고 있다.

반복된 계대배양을 통한 배양물내 이들의 증식동안에, 연골세포는 글리코사미노글리칸(GAG) 및 제II형 콜라겐(COL2)과 같은 연골로 된 매트릭스를 생산하기 위한 자체의 능력을 필연적으로 상실하고, 탈분화라고 불리는, 제I형 콜라겐(COL1)을 생산하기 시작한다. 인간 관절 연골세포는 시험관내에서 단지 제한된 수의 세포 분열을 겪을 수 있으며, 이들의 증식 잠재력은 나이가 들면서 감소한다는 것이 오랫동안 알려져 왔다.

본 출원인들은, 인간 관절 연골세포의 확장 조건이 분화 프로그램으로 재-도입하여 시험관내에서 세포 성장 잠재력을 증가시키는 세포의 능력을 조절할 수 있음을 입증하여 왔다.

미국 특허 제5,858,355호 및 제5,766,585호는 IRAP(인터류킨-1 수용체 길항제 단백질) 유전자의 바이러스 또는 플라스미드 작제물을 제조하고; 활막 세포(제5,858,355호) 및 골수 세포(제5,766,585호)를 상기 작제물로 형질감염시키며; 형질감염된 세포를 토끼 관절내로 주사하는 것을 기술하고 있으나, 연결 조직을 재생하기 위해 감작 연골세포를 사용하는 것은 기재하고 있지 않다.

미국 특허 제5,846,931호 및 제5,700,774호는 TGFβ "상과(superfamily)"에 속하는 골 형태발생 단백질(BMP)을, 트렁케이트된(truncated) 부갑상샘 호르몬 관련 펩타이드와 함께 포함함으로써 연골 조직 형성의 유지 및, 연골 조직의 유도를 수행하는 조성물을 주사하는 것을 기재하고 있다. 그러나, BMP 유전자를 사용하거나 감작 연골세포를 사용하는 유전자 치료요법 방법을 기재하고 있지 않다.

미국 특허 제5,842,477호는 스캐폴딩(scaffolding), 골막/연골막 조직, 및 연골세포를 포함하는 기질 세포의 조합물을 연골 결함이 있는 부위내로 이식하는 것을 기재하고 있다. 당해 특허의 기재내용은, 이들 성분들 중 3개 모두가 이식된 시스템에 존재하여야 함을 요구하기 때문에, 참조 문헌은, 스캐폴딩 또는 골막/연골막 조직의 이식을 요구하지 않는 본 발명의 단순한 세포 치료요법 방법을 기재하거나 제안하지 않는다.

상기 선행 기술의 기재내용에도 불구하고, 포유동물 숙주내에서 연결조직을 재생하는 것 뿐 아니라, 보다 우수하고 보다 효과적인 체세포 유전자 치료요법 방법에 대한 보다 효과적이고 강력한 치료 방법에 대해 현실적으로 실질적인 요구가 남아 있다.

발명의 요약

본 발명은 본원에서 앞서 기술된 요구사항을 충족시킨다.

하나의 국면에서, 본 발명은 연골 매트릭스를 생산하는 자체의 능력을 상실한 연골세포의 재-분화를 유도하는, 사이토킨 또는 사이토킨의 조합에 관한 것이다. 본 발명은 시험관내에서 초대 (primary) 연골세포의 세포 성장을 촉진할 수 있는 사이토킨에 관한 것이다. 또한, 연골 조직은 3-차원 매트릭스를 사용하지 않고 재-분화된 연골세포를 사용하여 형성시킬 수 있다. 본 발명의 출원인들은 또한, 성장 및 재-분화를 촉진하는 사이토킨을 사용한 세포의 연속적 처리가 연골 조직 재생을 촉진시킴을 발견하였다.

하나의 국면에서, 본 발명은 감작 연결 조직 세포(primed connective tissue cell) 및 이의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 세포는 섬유모세포, 연골세포 또는 섬유모세포성 연골세포일 수 있다. 세포는 인간 세포일 수 있다. 세포는 주사가능할 수 있다. 세포는 세포 저장용 저장 용기 속에 약 -70℃ 내지 약 -196℃의 온도에서 함유될 수 있다.

또 다른 국면에서, 본 발명은

(i) 연결 조직 세포를 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여 감작 세포를 생성시키는 단계;

(ii) 임의로 연결 조직 세포로부터 사이토킨을 임의로 분리하는 단계; 및

(iii) 치료학적 유효량의 감작 세포를, 연골을 생성시키고자 하는 표적 관절 부위내로 주사하는 단계를 포함하는, 포유동물내 표적 부위에서 연골의 재생을 촉진하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 연결 조직 세포의 내인성으로 존재하는 형태는 표적 부위에서 감소되고, 표적 부위에서 감작 세포의 존재는 연골의 재생을 자극한다. 연결 조직 세포는 섬유모세포, 연골세포 또는 섬유모세포성 연골세포일 수 있다. 연골세포는 초대 인간 연골세포일 수 있다. 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원일 수 있다. 연결 세포를 약 1시간 내지 약 2주 동안 항온처리하여 감작 세포를 생성할 수 있다. 사이토킨은 TGF-β일 수 있다. 사이토킨은 적어도 1 ng/ml의 양으로 존재할 수 있다.

다른 국면에서, 본 발명은 감작 세포 외에 발현시키고자 하는 유전자로 형질감염시키거나 형질도입된 포유동물 세포의 제2 집단에 관한 것이다.

여전히 다른 국면에서, 본 발명은 유리 연골을 생성하는 유효량의: (a) 감작 연골세포 또는 섬유모세포의 제1 집단; (b) TGF-β 상과의 구성원을 인코딩하는 유전자로 형질감염되거나 형질도입된 섬유모세포 또는 연골세포성 세포의 제2 집단; 및 (c) 이의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 혼합된 세포 조성물에 관한 것이다. 유전자는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-9일 수 있다. 당해 조성물에서, 감작 세포의 제1 집단 대 TGF-β 상과의 구성원을 인코딩하는 유전자로 형질감염되거나 형질도입된 섬유모세포 또는 연골세포성 세포의 제2 집단의 비는 약 1-20 대 1; 약 1-10 대 1; 또는 약 1-3 대 1이다. 유전자로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 제2 집단이 조사(irradiation)될 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 세포의 제1 집단 및 세포의 제2 집단은 동일한 공급원 유기체 또는 상이한 공급원 유기체로부터 유래할 수 있다.

여전히 다른 측면에서, 본 발명은

(A)(i) 연결 조직 세포를, 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여 감작 세포의 제1 집단을 생성하는 단계, 및 (ii) 임의로 연결 조직 세포로부터 사이토킨을 분리하는 단계를 포함하는, 세포의 제1 집단을 생성하는 단계;

(B)(i) 프로모터에 작동적으로 연결된 치료학적 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합체 벡터를 생성시키는 단계, (ii) 시험관내에서 세포의 집단을 상기 재조합체 벡터로 형질감염시키거나 형질도입시키는 단계를 포함하는 세포의 제2 집단을 생성하는 단계; 및

(C) 세포의 제1 및 제2 집단을 함께 혼합하여 혼합된 세포 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 혼합된 세포 조성물의 생성 방법에 관한 것이다.

여전히 다른 국면에서, 본 발명은

(A)(i) 연결 조직 세포를, 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여 감작 세포의 제1 집단을 생성시키는 단계, 및 (ii) 임의로, 연결 조직 세포로부터 사이토킨을 분리하는 단계를 포함하는, 세포의 제1 집단을 생성하는 단계;

(B)(i) 프로모터에 작동적으로 연결된 치료학적 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합체 벡터를 생성하는 단계, (ii) 시험관내에서 세포의 집단을 상기 재조합체 벡터로 형질감염시키거나 형질도입시켜 세포의 제2 집단을 생성하는 단계; 및

(C) 치료학적 유효량의 세포의 제1 및 제2 집단의 혼합물을, 연골을 생성시키고자 하는 표적 관절 부위 내로 주사하는 단계를 포함하고, 포유동물내 표적 부위에서 연골의 재생을 자극하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 연결 조직 세포의 내인성적으로 존재하는 형태는 표적 부위에서 감소되고, 여기서, 표적 부위에서 세포의 혼합물의 존재는 연골의 재생을 자극한다. 당해 방법에서, 유전자는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7일 수 있다. 당해 방법에서, 세포의 제1 및 제2 집단은 숙주 수용체와 관련하여 동계, 동종이계, 또는 이종발생성일 수 있다. 재조합체 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 세포는 주사하기 전에 동결보존 상태로 임의로 저장될 수 있다.

여전히 다른 국면에서, 본 발명은

(A)(i) 연결 조직 세포를, 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여 감작 세포의 제1 집단을 생성하는 단계; 및 (ii) 임의로 연결 조직 세포로부터 사이토킨을 분리하는 단계를 포함하는, 세포의 제1 집단을 생성하는 단계;

(B)(i) 프로모터에 작동적으로 연결된 치료학적 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합체 벡터를 생성시키는 단계 및 (ii) 시험관내에서 세포의 집단을 상기 재조합체 벡터로 형질감염시키거나 형질도입시켜 세포의 제2 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 세포의 제2 집단을 생성하는 단계; 및

(C) 세포의 제1 및 제2 집단의 혼합물 및, 생존하지 않는 3차원 구조물이 아닌 이의 약제학적으로 허용되는 담체의 치료학적 유효량을, 연골을 생성시키고자 하는 표적 관절 부위내의 포유동물의 관절 열극에 주사하는 단계를 포함하는, 골관절염을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 연결 조직 세포의 내인성적으로 존재하는 형태는 표적 부위에서 감소되고, 표적 부위에서 세포의 혼합물의 존재는 연골의 재생을 자극하여 골관절염을 치료한다.

여전히 또 다른 양태에서, 본 발명은 연결 조직 세포를, 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여 감작 세포를 생성시킴을 포함하여, 연결 조직 세포의 배가 시간(doubling time)을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 연결 조직 세포는 섬유모세포, 연골세포 또는 섬유모세포성 연골세포일 수 있다. 연골세포는 초대 인간 연골세포일 수 있다. 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원일 수 있다. 세포는 사이토킨과 함께 약 1시간 내지 약 2주 동안 항온처리하여 감작 세포를 생성할 수 있다. 배가 시간은 대조군의 항온처리하지 않은 세포의 약 1/2일 수 있다. 사이토킨은 FGF 및 TGF베타1의 조합일 수 있다. 조성물은 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 목적은 본 발명의 다음 기술, 본원에 첨부된 참조 도면 및 본원에 첨부된 특허청구범위로부터 더 완전히 이해될 것이다.

발명의 상세한 설명

본원에 사용된 것으로서, 핵산, 단백질, 단백질 단편 또는 이의 유도체와 관련하여 용어 "생물학적으로 활성인"은 핵산 또는 단백질의 야생형에 의해 야기된 공지된 생물학적 기능을 모사하기 위한 핵산 또는 아미노산 서열의 능력으로 정의된다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "연결 조직"은 다른 조직 또는 기관을 연결하여 이들을 지지하는 특정 조직이며, 포유동물 숙주의 인대, 연골, 힘줄, 골, 및 활막을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "연결 조직 세포" 및 "연결 조직의 세포"는 섬유모세포, 연골 세포(cartilage cell; chondrocyte), 및 골 세포(골모세포/골세포)와 같이 연골 조직내에서 발견되는 세포를 포함하며, 이는 콜라겐성 세포외 매트릭스, 및 또한 지방세포(fat cell; adipocyte) 및 평활근 세포를 분비한다. 바람직하게는, 연결 조직 세포는 섬유모세포, 연골 세포, 및 골 세포이다. 본 발명이 연결 조직 세포와, 단일 유형의 세포의 혼합된 배양물을 사용하여 실시될 수 있음은 인식될 것이다. 조직 세포를 화학적 화합물 또는 조사를 관절 열극내로 주입하기 전에 이들로 예비처리함으로써 세포가 숙주 유기체내에서 목적한 유전자를 안정하게 발현하도록 할 수 있다. 바람직하게는, 연결 조직 세포는 숙주 유기체내로 주사된 경우 부정적인 면역 반응을 유발하지 않는다. 이와 관련하여 동종이계 세포, 및 또한 자가 세포가 세포-매개된 유전자 치료요법 또는 체세포 치료요법을 위해 사용될 수 있다는 것이 이해된다.

본원에 사용된 것으로서, "연결 조직 세포주"는 일반적인 모세포로부터 유래하는 다수의 연결 조직 세포를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 세포의 "감소"는 부위에서 일반적으로 발견될 수 있는 양과 비교하여 세포 집단이 적어지는 것을 말한다. 이는 부위에서 정상 세포 집단과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%와 같은, 세포 집단의 감소 퍼센트를 의미하거나, 부위에서 세포의 손상 또는 고갈을 의미할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 공여체 세포 및 수용체 숙주의 "조직접합성"은, 이식이 허용되고 숙주 포유동물내에서 기능이 잔류하도록 충분한 수의 조직적합성 제제들을 공유하는 것을 말한다. 특히, 공여체 및 수용체 쌍은 인간 백혈구 항원(HLA) A형, B형, 및 C형(제I 부류) 및 HLA DR형(제II 부류)와 같은 HLA에 대해 매치되어야 한다.

본원에 사용된 것으로서, "유리 연골"은 관절 표면을 덮는 연결 조직을 말한다. 단지 예로써, 유리 연골은 관절 연골, 늑연골, 및 코연골을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

특히, 유리 연골은 자가-재생성인 것으로 알려져 있으며, 신호변경에 반응하여 마찰이 거의 없는 안정한 운동을 제공한다. 심지어 동일한 관절내에서 또는 관절 중에서 발견된 유리 연골도 두께, 세포 밀도, 매트릭스 조성 및 기계적 특성에 있어서 상이하며, 여전히 동일한 일반적 구조 및 기능을 보유한다. 유리 연골의 기능 중 일부는 압박에 대한 놀라운 강직성, 탄성 및, 체중 부하를 분산시키는 특출한 능력, 연골하 골에서 최대 응력을 최소화시키는 능력, 및 큰 지속력을 포함한다.

총체적으로 및 조직학적으로, 유리 연골은 변형을 견디는 매끄럽고, 견고한 표면으로 보인다. 연골의 세포외 매트릭스는 연골세포를 포함하지만, 혈관, 림프관 또는 신경을 결여하고 있다. 연골세포와 매트릭스 사이에 상호작용을 유지하는 정교한 고차원 구조는 유리 연골의 구조 및 기능을 유지하기 위해 제공되는 한편, 낮은 수준의 대사 활성을 유지한다. 문헌(참조: O'Driscoll, J. Bone Joint Surg., 8OA: 1795-1812, 1998)에는 유리 연골의 구조 및 기능이 상세하게 기술되어 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.

본원에 사용된 것으로서, "주사가능한" 조성물은, 세포가 이것에 부착하여 세포가 단층보다 더 잘 성장하도록 하는 특정 물질 또는 형태로 제조될 수 있으며, 일반적으로 이식되며, 주사되지 않는 각종의 3차원 스캐폴드, 골격, 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 배제한 조성물을 말한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 주사 방법은 전형적으로 주사기로 수행된다. 그러나, 목적한 조성물의 특정 주사 방식이 사용될 수 있다. 예를 들면, 카테터(catheter), 분무기 또는 온도 의존성 중합체 겔이 또한 사용될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "포유동물 숙주"는 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 동물계의 구성원을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, "혼합 세포" 또는 "세포의 혼합물" 또는 "세포 혼합물"은 발현되는 목적 유전자로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 집단, 및 감작 세포를 포함하는 세포의 적어도 하나의 다른 집단을 포함하는 다수의 세포의 조합을 말한다.

본 발명의 하나의 양태에서, 혼합 세포는 다수의 형질전환 성장 인자 β 상과를 인코딩하는 유전자 또는 DNA로 형질감염되거나 형질도입된 세포 및, 다수의 형질전환성장인자 β 상과를 인코딩하는 유전자로 형질감염되거나 형질도입되지 않은 감작 세포를 포함하는 다수의 연결 조직 세포의 조합을 말할 수 있다. 전형적으로, TGF 상과로 형질감염되거나 형질도입된 세포에 대한 다수의 형질전환 성장 인자 β 상과를 인코딩하는 유전자로 형질감염되거나 형질도입되지 않은 감작 세포의 비는 약 3 내지 20 대 1의 범위일 수 있다. 당해 범위는 약 3 내지 10 대 1을 포함한다. 특히, 상기 범위는 다수의 세포의 측면에서 약 10 대 1일 수 있다. 그러나, 이들 세포의 비는, 이들 세포의 조합이 부분적으로 및 완전히 결함이 있는 관절내에서 유리 연골을 생산하는데 효과적인 한 어떠한 특정 범위로 필수적으로 고정되지 않아야 한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "환자"는 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 동물계의 구성원을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 조성물의 수송 효능을 촉진시키고 조성물의 유효성을 연장시키는 것으로 당해 분야에 공지된 특정의 담체를 말한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "감작" 세포는 특정 유전자를 발현하도록 활성화되거나 변화된 세포를 말한다.

본원에 사용된 것으로서, "체세포" 또는 "세포"는 일반적으로 난자 또는 정자이외의 체내 세포를 말한다.

본원에 사용된 것으로서, "저장된" 세포는 개별적으로 저장되거나 이들이 관절 열극에 투여되기 전에 함께 저장된 감작 세포를 포함하는 혼합 세포의 집단 중 감작 세포의 조성물을 말한다. 상기 세포는 냉장 단위 속에 저장될 수 있다. 이와는 달리, 상기 세포는 약 -70℃ 내지 약 -196℃로 액체 질소 탱크 속에서 또는 동등한 저장 장치 속에서 동결시킬 수 있기 때문에 관절 열극내로 후에 투여하기 위해 세포가 보존된다. 세포를 공지된 프로토콜을 사용하여 해동시킬 수 있다. 동결 및 해동 기간은, 세포의 생존능 및 잠재력이 최적화되는 한, 어떠한 방식으로도 수행할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "형질감염" 및 "형질도입"은 DNA를 숙주 세포로 이전시키는 특수 방법 및 수용체 세포의 염색체 DNA내로 이의 후속적인 통합으로 언급된다. 본 발명을 실시함에 따라, 외부 유전자가 숙주 세포내로 도입되고 외부 유전자가 숙주 세포내에서 안정하게 발현되는 한, 비바이러스 또는 바이러스 유전자 전달 방법을 포함하는, 외부 DNA를 숙주 세포내로 이전하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "형질감염되거나 형질도입된"은 인산칼슘 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 리포좀, 바이러스 중재 등과 같이 세포로의 특정의 유전자 전달 방법을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, "형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상과"는 배아 발달 동안 광범위한 분화 과정에 영향을 미치는, 구조적으로 관련된 단백질의 그룹을 포함한다. 상기 계열은 정상적인 자성(male sex) 발달에 요구되는, 뮐레리안 억제 물질(Mullerian inhibiting substance: MIS)(참조: Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990), 등-배축 형성(dorsal-ventral axis) 및 성충아(imaginal disk)의 형태발생에 요구되는, 드로소필라 데카펜타플레직(Drosophila decapentaplegic)(DPP) 유전자 생성물(참조: Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987), 난자(egg)의 식물극(vegetal pole)에 국지화되는(localized) 제노푸스 Vg-1 유전자 생성물(참조: Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987), 제노푸스 배아내에서 중배엽 및 전방 구조의 형성을 유도할 수 있는(참조: Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990), 악티빈(참조: Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986) 및 새로운(de novo) 연골 및 골 형성을 유도할 수 있는(참조: Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990) 골 형태형성 단백질[BMP-2, 3, 4, 5, 6 및 7과 같은 BMP, 오스테오게닌(osteogenin), OP-1]을 포함한다. TGF-β 유전자 생성물은 지방형성, 근육발생, 연골형성, 조혈 및 내피 세포 분화를 포함하는 각종 분화 과정에 영향을 미칠 수 있다. 고찰을 위해, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌(참조: Massague, Cell 49:437, 1987)을 참조한다.

TGF-β 계열의 단백질은 후속적으로 C-말단으로부터 대략 110 내지 140개의 염기성 잔기의 무리에서 단백분해적 분해를 겪는 거대 전구체 단백질로서 초기에 합성된다. 단백질의 C-말단 영역은 모두 구조적으로 관련되어 있으며 상이한 계열 구성원은 이들의 상동성 정도를 기준으로 명백한 소그룹으로 분류될 수 있다. 비록 특수 소그룹내 상동성이 70% 내지 90%의 아미노산 서열 동질성 범위라고 해도, 소그룹들 사이의 상동성은 일반적으로 단지 20% 내지 50%로 상당히 더 낮다. 각각의 경우에, 활성 종은 C-말단 단편의 이황화물-결합된 이량체인 것으로 여겨진다. 연구된 대부분의 계열 구성원의 경우, 동종이량체 종이 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌으나, 인히빈(참조: Ung, et al., Nature, 321:779, 1986) 및 TGF-β(참조: Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987)와 같은 다른 계열 구성원의 경우, 이종이량체가 또한 검출되어 있으며, 이들은 각각의 동종이량체보다 상이한 생물학적 특성을 가지는 것으로 여겨진다.

TGF-β 유전자의 상과의 구성원은 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4(닭), TGF-β1, TGF-β5(제노푸스), BMP-2, BMP-4, 드로소필라 DPP, BMP-5, BMP-6, Vgrl, OP-l/BMP-7, 드로소필라 6OA, GDF-I, 제노푸스 Vgf, BMP-3, 인히빈-βA, 인히빈- βB, 인히빈-α, 및 MIS를 포함한다. 이들 유전자는, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, 문헌(참조: Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998)에 논의되어 있다.

바람직하게는, TGF-β 유전자 상과의 구성원은 TGF-β 또는 BMP이다. 보다 바람직하게는, 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7이다. 가장 바람직하게는, 구성원은 인간 또는 돼지 TGF-β1 또는 BMP-2이다.

감작 세포 치료요법

본 발명은 감작 세포를 포유동물에서 이를 필요로 하는 부위에 투여함으로써 콜라겐 또는 유리 연골을 생산함을 포함한다. 감작 세포는 전형적으로 연결 조직 세포이며 연골세포 또는 섬유모세포를 포함한다.

예로써, 초대 연골세포의 집단을 약 3 또는 4회 계대배양하는 경우, 이들의 형태학은 전형적으로 섬유모세포성 연골세포로 변화한다. 초대 연골세포가 계대배양되면서, 이들은 자체의 연골세포 특성들 중의 일부를 상실하기 시작하며 섬유모세포성 연골세포의 특성을 취하기 시작한다. 본 발명자들은, 섬유모세포성 연골세포를 TGF-β 상과로부터의 단백질과 같은 사이토킨과 함께 항온처리하거나 이들로 "감작"시키는 경우, 세포는 콜라겐의 생산을 포함하는, 자체의 연골세포 특성을 재획득한다는 것을 발견하였다.

이러한 감작 세포는 TGFβ1과 함께 항온처리되어 그 결과 제II형 콜라겐을 생산하는 연골세포로 전환되는 섬유모세포성 연골세포를 포함한다. 골관절염의 치료 또는 연골의 재생시 감작 세포를 사용하는 것의 장점은 연골세포를, 콜라겐의 생산 및 그외에 연골 매트릭스의 유지를 위해 척추내 추간원판에서와 같이 연골이 생성되는 것이 요구되는 체내의 관절 또는 다른 위치로 도입시키기 위한 이용가능한 연골세포를 생성하는데 있어서의 용이성이다.

세포는 초대 세포 또는 약 1 내지 20회 계대배양을 겪는 세포를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 세포는 연결 조직 세포일 수 있다. 세포는 형태학적 변화를 겪는 세포를 포함할 수 있으며, 여기서, 감작화는 원래의 세포의 특성으로의 전환을 유발한다. 세포는 연골세포, 섬유모세포, 또는 섬유모세포성 연골세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 감작화는 세포를 적어도 1시간, 바람직하게는 1시간 내지 2주; 1 내지 10일, 5 내지 10일 또는 5 내지 7일의 기간 동안 사이토킨과 함께 항온처리한 후, 임의로 사이토킨을 세포로부터 분리하여 감작 세포를 목적한 연골 결함이 있는 부위내로 주사하여 연골, 바람직하게는 유리 연골을 재생하도록 함으로써 일어날 수 있다. 하나의 국면에서, 사이토킨은 TGF-β의 상과의 구성원일 수 있다. 특히, 사이토킨은 TGF-β, 및 특히, TGF-β1일 수 있다.

사이토킨은 항온처리 혼합물 속에 적어도 약 1 ng/ml, 약 1 내지 1000 ng/ml, 약 1 내지 750 ng/ml, 약 1 내지 500 ng/ml, 약 1 내지 400 ng/ml, 약 1 내지 300 ng/ml, 약 1 내지 250 ng/ml, 약 1 내지 200 ng/ml, 약 1 내지 150 ng/ml, 약 1 내지 100 ng/ml, 약 1 내지 75 ng/ml, 약 1 내지 50 ng/ml, 약 10 내지 500 ng/ml, 약 10 내지 400 ng/ml, 약 10 내지 300 ng/ml, 약 10 내지 250 ng/ml, 약 10 내지 200 ng/ml, 약 10 내지 150 ng/ml, 약 10 내지 100 ng/ml, 약 10 내지 75 ng/ml, 약 10 내지 50 ng/ml, 약 15 내지 500 ng/ml, 약 15 내지 400 ng/ml, 약 15 내지 300 ng/ml, 약 15 내지 250 ng/ml, 약 15 내지 200 ng/ml, 약 15 내지 150 ng/ml, 약 15 내지 100 ng/ml, 약 15 내지 75 ng/ml, 약 15 내지 50 ng/ml, 약 20 내지 500 ng/ml, 약 20 내지 400 ng/ml, 약 20 내지 300 ng/ml, 약 20 내지 250 ng/ml, 약 20 내지 200 ng/ml, 약 20 내지 150 ng/ml, 약 20 내지 100 ng/ml, 약 20 내지 75 ng/ml, 약 20 내지 50 ng/ml, 약 25 내지 500 ng/ml, 약 25 내지 400 ng/ml, 약 25 내지 300 ng/ml, 약 25 내지 250 ng/ml, 약 25 내지 200 ng/ml, 약 25 내지 150 ng/ml, 약 25 내지 100 ng/ml, 약 25 내지 75 ng/ml, 약 25 내지 50 ng/ml, 약 30 내지 500 ng/ml, 약 30 내지 400 ng/ml, 약 30 내지 300 ng/ml, 약 30 내지 250 ng/ml, 약 30 내지 200 ng/ml, 약 30 내지 150 ng/ml, 약 30 내지 100 ng/ml, 약 30 내지 75 ng/ml, 약 30 내지 50 ng/ml, 약 35 내지 500 ng/ml, 약 35 내지 400 ng/ml, 약 35 내지 300 ng/ml, 약 35 내지 250 ng/ml, 약 35 내지 200 ng/ml, 약 35 내지 150 ng/ml, 약 35 내지 100 ng/ml, 약 35 내지 75 ng/ml, 약 35 내지 50 ng/ml, 약 40 내지 500 ng/ml, 약 40 내지 400 ng/ml, 약 40 내지 300 ng/ml, 약 40 내지 250 ng/ml, 약 40 내지 200 ng/ml, 약 40 내지 150 ng/ml, 약 40 내지 100 ng/ml, 약 40 내지 75 ng/ml, 또는 약 40 내지 50 ng/ml의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명을 실시하는 하나의 방법은 세포를 사이토킨과 특정 기간의 시간 동안 항온처리하여 감작 세포를 생성하고 임의로 세포로부터 사이토킨을 분리하며, 감작 세포를 목적한 연결 조직 결함이 있는 부위내로 주사하는 것을 포함할 수 있다. 이와는 달리, 세포를 목적한 사이토킨과 함께 일정 시간 동안 항온처리하고 조합물을 사이토킨의 분리없이 연결 조직 결함이 있는 부위에 투여할 수 있다.

스캐폴딩 또는 골격과 같은 물질, 및 또한 각종의 관계없는 조직과 같은 물질을 본 발명의 감작 세포 치료요법 프로토콜에서 함께 이식할 수 있지만, 이러한 스캐폴딩 또는 조직을 본 발명의 주사 시스템에 포함시키지 않는 것도 또한 가능하다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 체세포 치료요법에서, 본 발명은 감작 연결 조직 세포의 집단을 관절 열극에 주사하는 간단한 방법에 관한 것이다.

당해 분야의 숙련가는, 인간 환자를 치료하기 위한 세포의 구성원이 자가 섬유모세포 또는 연골세포 세포와 같은 환자 자신의 연결 조직 세포일 수 있으나, 동종이계 세포 및 또한 이종발생성 세포도 또한 세포의 조직적합성과 상관없이 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 하나의 양태에서, 포유동물 숙주에 대해 조직적합성이 매치하는 동종이계 세포가 사용될 수 있다. 좀더 상세히 설명하면, 공여자 및 환자의 조직적합성을 측정함으로써 조직적합성 세포를 포유동물 숙주에게 투여한다.

기대하지 않게, 사이토킨 처리된 세포의 배가 시간은 처리되지 않은 세포와 비교하여 감소되었다(참조: 도 2). 처리된 세포의 생존 기간 또한 증가하였다. 처리된 세포는 더 오랫동안 생존하였으며 배가 시간은 처리되지 않은 세포보다 더 빨랐다. 처리된 세포는 콜라겐으로 피복된 플라스크 및 콜라겐으로 피복되지 않은 플라스크에서 8회 이상의 계대배양 동안 증식하였으나; 처리되지 않은 세포의 성장은 콜라겐-피복되지 않은 플라스크 내에서 7회 계대배양(p7)으로 정지되었다. 그럼에도 불구하고, FGF-TGF베타1으로 처리한 세포를 함유하는 콜라겐 피복된 플라스크는 가장 강력한 성장을 나타내었다. 8회 계대배양 후에서 조차 이의 성장이 저하되는 세포의 신호는 없었다.

세포를 콜라겐 피복된 또는 피복되지 않은 플라스크로부터 수거한 후, 이들 세포를 다중웰 플레이트(multiwell plate)로 이전하여 미세덩어리를 제조하고, 이를 알시안 염색으로 직접 염색하였다.

감작 세포의 배가 시간은 약 0.8 내지 약 0.2; 약 0.7 내지 약 0.3; 약 0.6 내지 약 0.4; 또는 약 0.5의 인자로 감소될 수 있다. 0.5의 인자에 의해, 이는, 사이토킨과 함께 항온처리된 세포의 배가 시간이 항온처리되지 않은 대조군 세포보다 2배 빠름을 의미한다.

이와 관련하여, TGF-베타1 단독, TGF-베타3 단독, BMP2 및 인슐린 또는 BMP2-인슐린 및 T3와 함께 또는 FGF- TGF-베타1 조합과 같은 사이토킨은 감작 세포에 대한 배가 시간에 있어서 상당한 감소를 초래한다. 콜라겐 피복된 플라스크 및 콜라겐 피복되지 않은 플라스크는 또한 특정의 사이토킨 항온처리에 대해 상당한 차등적 결과를 제공한다(참조: 도 2).

혼합 세포 대체 치료요법

본 발명은 또한 세포의 혼합물을 포유동물내 이를 필요로 하는 부위에 투여함으로써 콜라겐 또는 유리 연골을 생산하는 것을 포함하며, 여기서, 세포의 제1 집단은 포유동물내 목적한 부위에서 발현될 목적 유전자로 형질감염되거나 형질도입된다. 체세포 유전자 치료요법이 시도됨에 따라, 본 발명은 목적 유전자로 형질감염되거나 형질도입되지 않고, 상처입거나 질병이 있거나 또는 기타의 경우 목적한 쇠약화된 부위에서 내인성적으로 감소된 감작 세포인 세포의 제2 집단을 포함시키기 위해 제공된다.

특히, 감작 세포를 사용하는 혼합 세포 치료요법 시도에서, 본 발명은 목적한 DNA 서열의 포유동물 숙주의 연결 조직 세포내로의 전달을 위한 생체외 및 생체내 기술을 기재한다. 생체외 기술은 목적한 유전자 생성물의 생체내 발현을 달성하기 위해, 표적 연결 조직 세포의 배양, 목적한 DNA 서열, 목적한 DNA 벡터 또는 기타 전달 담체의 연결 조직 세포내로의 시험관내 형질감염 또는 형질도입에 이은, 변형된 연결 조직 세포의 포유동물 숙주의 표적 관절로의 이식을 포함한다.

스캐폴딩 또는 골격 및 또한 각종 관련없는(extraneous) 조직과 같은 물질이 본 발명의 유전자 치료요법 프로토콜에서 함께 이식될 수 있는 것이 가능하지만, 이러한 스캐폴딩 또는 조직이 본 발명의 주사 시스템에 포함되지 않는 것도 가능하다. 바람직한 양태에서, 세포 매개된 유전자 치료요법 또는 체세포 치료요법에서, 본 발명은 형질감염되거나 형질도입된 연결 조직 세포의 집단을 관절 열극에 주사함으로써 외인성(exogenous) TGF 상과 단백질이 관절 열극내에서 발현되도록 하는 간단한 방법에 관한 것이다.

본 명세서 전반에 걸쳐 기재된, 감작 세포를 사용한 혼합 세포 접근법을 사용하여 연결 조직 질환을 치료하는 한가지 생체외 방법은 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 재조합체 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 초기에 생성시킴을 포함한다. 이후에, 이러한 재조합체 벡터를 사용하여 시험관내 배양된 연결 조직 세포의 집단을 감염시키거나 형질감염시킴으로써, 상기 벡터를 함유하는 연결 조직 세포의 집단을 수득한다. 이후에, 이는 연결 조직 세포를 포유동물 숙주의 표적 관절 열극에 감작 연결 조직 세포와의 혼합물로서 또는 관절 열극에 별도록 이식함으로써 혼합물이 관절 내부에 있도록 함으로써 후속적으로 단백질 또는 단백질 단편이 관절 열극내에서 발현되도록 한다. 목적한 상기 DNA 서열의 발현은 연결 조직 질환과 관련된 적어도 하나의 유해한 관절 병리학을 실질적으로 감소시키는데 유용하다.

혼합된 세포 접근법에서, 유전자 형질감염된 세포의 경우에, 본 발명의 방법은 유전자로서 형질전환 성장 인자 β 상과의 구성원, 또는 이의 생물학적으로 활성인 유도체 또는 단편 및 선택가능한 마커, 또는 이의 생물학적으로 활성인 유도체 또는 단편을 인코딩할 수 있는 유전자를 사용함을 포함한다.

본 발명의 추가의 양태는 유전자로서 형질전환 성장 인자 β 상과의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 생물학적으로 활성인 유도체 또는 단편을 인코딩할 수 있는 유전자를 사용하고, 이용된 전달 방법에 상관없이, 전달시 표적 세포 또는 조직내에서 안정하게 유지할 수 있는 것으로 당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 DNA 플라스미드 벡터를 벡터로서 사용함을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위한 연결 조직의 적어도 하나의 세포내로 도입시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생성물을 인코딩하는 유전자를 연결 조직 세포내로 도입시키기 위한 비-바이러스 수단을 사용함을 포함한다. 보다 상세하게는, 상기 방법은 리포좀 봉입(encapsulation), 인산칼슘 공침전, 전기천공 또는 DEAE-덱스트란 중재를 포함하며, 유전자로서 형질전환 성장 인자 상과의 구성원 또는 이의 생물학적으로 활성인 유도체 또는 단편, 및 선택가능한 마커, 또는 이의 생물학적으로 활성인 유도체 또는 단편을 인코딩할 수 있는 유전자를 사용함을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 생성물을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자를 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위한 연결 조직의 적어도 하나의 세포내로 도입시키는 추가의 방법을 제공한다. 당해 추가의 방법은 DNA 벡터 분자를 표적 세포 또는 조직으로 전달하기 위해 바이러스를 이용하는 생물학적 수단을 사용함을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스는 슈도(pseudo)-바이러스, 즉, 슈도바이러스가 단지 전달되어 표적 세포내에서 안정하게 유지될 수 있도록 변형되어 있지만 표적 세포 또는 조직내에서 복제할 수 있는 능력을 보유하지 않는 게놈이다. 변경된 바이러스 게놈은 재조합체 DNA 기술에 의해 추가로 조작됨으로써 바이러스 게놈이 표적 세포 또는 조직내에서 발현될 이종의 목적 유전자를 함유하는 DNA 벡터 분자로서 작용한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 방법은 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 헤르페스-단성 바이러스(HSV) 벡터의 사용을 통해 감작 세포와 함께 포유동물 숙주의 연결조직으로 TGF-β 상과 유전자의 생체내 전달을 지시하는 것을 포함한다. 다시 말해서, 기능적 TGF-β 또는 BMP 단백질 또는 단백질 단편을 인코딩하는 목적한 DNA 서열은 각각의 바이러스 벡터내로 서브클로닝(subcloning)된다. TGF-β 또는 BMP를 함유하는 재조합체 바이러스는 이후에 적절한 역가로 성장된 후 바람직하게는, 관절내 주사에 의해 관절 열극내로 전달된다.

DNA 분자를 관절의 표적 연결 조직으로 제시(presenting)하는 방법은 DNA 분자의 양이온성 리포좀내로의 봉입, 레트로바이러스 또는 플라스미드 벡터내에서 목적한 DNA 서열의 서브클로닝 또는, DNA 분자 자체의 관절내로의 직접적인 주사를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. DNA 분자는, 무릎 관절로의 제시 형태에 상관없이, 재조합체 바이러스 DNA 벡터 분자 또는 재조합체 DNA 플라스미드 벡터 분자로서, DNA 벡터 분자로 제시된다. 목적한 이종(heterologous) 유전자의 발현은 진핵 세포내에서 활성인 프로모터 단편을 이종 유전자의 인코딩 영역의 상부에 직접 삽입함으로써 보증된다. 당해 분야의 숙련가는 DNA 분자를 연결 조직내로 도입하기 위해 후속적인 적절한 발현 수준을 보증하기 위한 벡터 작제의 공지된 전략 및 기술을 이용할 수 있다.

바람직한 양태에서, 비-감작 섬유모세포 및 연골세포는 감작 세포와 함께 유전자 치료요법용 전달 시스템으로서의 후속적인 이용을 위해 시험관내에서 배양된다. 출원인이 기재된 특이적인 연결 조직의 사용으로 한정하지 않는다는 것이 명백할 것이다. 시험관내 배양 기술을 위해 다른 조직 공급원을 사용하는 것도 가능할 수 있다. 본 발명의 유전자 또는 사이토킨을 사용하는 방법은 골관절염 및 상처 치유의 예방학적 및 치료학적 치료 둘다에서 사용할 수 있다. 본 발명이 무릎 관절만 치료하기 위한 예방학적 또는 치료학적 적용에 제한되지 않는다는 것도 명백할 것이다. 본 발명이 어떠한 민감한 관절내 골관절염 또는 연골의 열상(tear) 또는 분해(degradation)에 의해 유발된 손상(injury)으로부터 초래되는 어떠한 손상(damage)을 치료하기 위해 예방학적으로 또는 치료학적으로 이용되는 것이 가능할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 감작 세포는 관절 열극에 투여하기 전에 저장된다. 또한, 형질감염되거나 형질도입된 세포만이 저장되거나, 혼합물이 저장될 수 있지만, 필수적으로 동시는 아니다. 또한, 저장 기간은 동일한 기간일 필요는 없다. 따라서, 개별적으로 저장된 세포는 주사 전에 혼합할 수 있다. 이와는 달리, 세포를 저장하여 별개로 주사함으로써 관절 열극내에서 세포의 혼합물을 형성할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은, 상기 세포를 액체 질소 또는 동등한 저장 매질 속에서 약 10% DMSO의 조성물과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 동결보존제 속에 동결된 상태로 저장할 수 있음을 인식할 것이다.

연결 조직은 치료학적으로 표적화하기에 어려운 기관이다. 당해 분야에 공지된 약물 전달의 정맥내 및 경구 경로는 이러한 연결 조직에 대한 불량한 접근을 제공하며 포유동물 숙주 신체를 치료제에 전신적으로 노출시키는 단점을 갖는다. 보다 상세하게, 관절로의 단백질의 공지된 동맥내 주사는 관절로의 직접적인 접근을 제공한다. 그러나, 봉입된 단백질 형태의 주사된 약물 중 대부분은 짧은 동맥내 반감기를 갖는다. 본 발명은 연골세포 또는 섬유모세포 및/또는 포유동물 숙주를 치료하는데 사용될 수 있는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있는, 포유동물 숙주 감작 세포의 연결 조직내로 도입시킴으로써 상기 문제점들을 해결한다. 항-관절염 특성을 가진 단백질을 인코딩하는 유전자를 사용할 수 있다.

감작 세포는 하나 이상의 관절의 연골의 파괴 및 궁극적으로 상실에 의해 유발되는 관절염의 유형인, 골관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 변성 관절염 또는 골관절염 또는 특정의 연골 손상이 감작 세포를 스캐폴딩 또는 어떠한 다른 3차원 구조와 같은 각종의 물리적 장치를 포함하지 않으면서 관절내로 바로 주사하여 치료될 수 있는 경우, 환자가 큰 수술없이 편리하게 치료할 수 있다.

추간원판( intervertebral disc )

감작 세포를 또한 사용하여 추간원판을 재생시킬 수 있다. 추간원판은 척추 길이의 1/4을 구성한다. 환추(Cl), 축(C2), 및 꼬리뼈 사이에는 원판(disc)이 없다. 원판은 혈관이 아니므로 필요한 영양물을 확산시키기 위해 말기 판(end plate)에 의존한다. 말기 판의 연골 층은 제자리에 있는 원판을 정착시킨다.

추간원판은 척추골(vertebrae), 뇌 및 기타 구조물(즉, 신경)을 보호하는, 척추 충격 흡수 시스템으로서 제공되는 섬유연골 쿠션이다. 상기 원판은 일부 척추 운동: 신장 및 굴곡성을 허용한다. 개개의 원판 운동은 매우 제한되어 있으나, 몇개의 원판이 힘을 합하는 경우 상당한 운동이 가능하다.

추간원판은 섬유테와 속질핵으로 구성되어 있다. 섬유테는 층판(lamellae); 척추 말기 판에 연결된 콜라겐 섬유의 동심 시이트(concentric sheet)로 구성된 강력한 방사상-타이어(radial tire)-유사 구조이다. 시이트는 다양한 각도로 배향된다. 섬유테는 속질핵을 둘러싸고 있다.

섬유테(annulus fibrosus) 및 속질핵(nucleus pulposus) 둘다는 물, 콜라겐 및 프로테오글리칸(PG)으로 구성되어 있지만, 유체(물 및 PG)의 양은 속질핵에서 가장 많다. PG 분자는 물을 끌어들여 보유하므로 중요하다. 속질핵은 압박을 견디는 수화된 겔-유사 물질을 함유한다. 핵내 물의 양은 활동에 따라 하루 내내 변한다. 인간들이 나이가 들면서, 속질핵은 탈수되기 시작하고, 이러한 탈수는 충격을 흡수하는 능력을 제한한다. 속질핵은 나이가 들면서 좀더 약해져서 열상되기 시작한다. 이것은 일부 인간에게는 통증을 유발하지 않을 수 있지만, 다른 인간들에서 이들 중 하나 또는 둘다는 만성 통증을 유발할 수 있다.

충격을 흡수하는 탈수되는 속질핵의 불능으로 인한 통증은 축 통증 (axial pain)또는 원판 공간 통증(disk space pain)으로 불린다. 이는 일반적으로 퇴행성 원판 질병으로서 속질핵의 점진적인 탈수를 말한다. 속질핵이 손상 또는 노화 과정으로 인하여 열상되는 경우, 속질핵이 열상을 통해 빠져나올 수 있다. 이는 원판탈출증(disc herniation)이라고 부른다. 각각의 원판의 등쪽 근처, 척추를 따라 모두, 주요 척수 신경(spinal nerve)은 상이한 기관, 조직, 팔다리 등으로 연장된다. 탈출된 척추 원판이 이들 신경[짓눌린(pinched) 신경]에 대해 압력을 가하여 방사 통증(radiating pain), 무감각, 저림 및 감소된 힘 및/또는 감소된 운동 범위를 유발하는 것은 매우 일반적이다. 또한, 염증성 단백질을 함유하는 내부 핵 겔과 신경의 접촉은 또한 상당한 통증을 유발할 수 있다. 신경-관련 통증은 척수신경근통(radicular pain)이라고 부른다.

탈출된 척추 원판은 많은 명칭에 의거하여 판단하며 이들은 상이한 의학 전문가들에게 상이한 것들을 의미할 수 있다. 원판이탈(slipped disc), 원판탈출(ruptured disc) 또는 부푼원판(bulging disc)은 모두 동일한 의학 상태를 언급할 수 있다. 원판 인접한 척추내로의 돌출은 쉬모를 결절(Schmorl's node)로 공지되어 있다.

본 발명은 단지 설명의 방식으로 제공되며, 이에 따라 본 발명을 한정하지 않는, 본원에서 하기 제공된 상세한 설명, 및 첨부되는 도면으로부터 보다 더 완전히 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 섬유모세포성 연골세포를 TGFβ1과 함께 항온처리한 후 다양한 시간(주)에서 세포의 알시안 블루 염색(Alcian Blue staining)의 결과를 나타낸다. 1. 10 ng/mL TGFβ1과 함께 18시간 항온처리; 2. 50 ng/mL TGFβ1과 함께 18시간 항온처리; 3. 10 ng/mL TGFβ1과 함께 6시간 항온처리; 4. 50 ng/mL TGFβ1과 함께 6시간 항온처리; 5. 1ng/mL TGFβ1과 함께 항온처리; 6. 1Ong/mL TGFβ1과 함께 사이토킨의 분리없이 항온처리; 7. 처리되지 않은 대조군 섬유모세포성 연골세포.
도 2는 사이토킨 처리와 함께 2차원 배양시 세포 성장률을 나타낸다. 각각의 사이토킨 처리 그룹으로부터 T-75 플라스크 내에서 배양된 세포를 합치상태에서 수거하고 초기 세포 종균배양 수로부터 세포 성장률을 측정하기 위해 계수하였다.
도 3은 미세덩어리(micromass) 형성을 나타낸다. 미세덩어리는 배양 배지의 부재하에서 배양 플레이트의 표면에 1.5 x 10⁵ 세포/20 μl/질량으로 직접 플레이팅하였다. 세포를 1.5시간 동안 적절한 세포 부착이 일어나도록 하기 위해 항온처리하고 0.5mL/웰의 완전 성장 배지를 가하였다. 세포를 7일 동안 3 내지 4일째에 성장 배지로 1회 완전히 교환하면서 배양하였다. 7일의 항온처리 기간의 말기에, 미세덩어리를 1mL의 dPBS/웰로 2회 세척하고 10% 포르말린 용액으로 30분 동안 고정시켰다. 고정 용액을 제거하고 덩어리를 500μL/웰의 1.0% 알시안 블루 8GX로 1N HCl 속에서 밤새 4℃로 염색하였다. 알시안 염색은 상이한 사이토킨 조건에 노출된 연골세포의 미세덩어리 배양에서 글리코사미노글리칸(GAG)의 분포를 나타낸다.
도 4는 미세덩어리의 GAG 정량화(quantification)를 나타낸다. 글리코사미노글리칸의 정량화는 프로테오글리칸 분자의 알시안 블루 결합된 GAG 쇄를 침전시키는 구아니딘 히드로클로라이드(Gu-HCl)의 첨가를 통해 수행할 수 있다. 알시안 블루 염색된 미세덩어리를 250μl/웰의 4M Gu-HCl과 함께 항온처리하였다. 대부분의 염색이 미세덩어리로부터 추출되면, 용액을 제거하고 광학 밀도를 560 nm에서 측정하였다.
도 5는 사이토킨 처리한 2차원 배양물 속에서의 세포 형태학을 나타낸다. 연골세포 성장의 디지털 영상을 세포가 대략 30 내지 50% 합치를 나타내는 시점(종균접종 후 3일째)에 촬영하였다. 세포 분포, 세포 크기, 및 형태학에 있어서의 관찰은 사이토킨 처리 그룹들 사이에서 변한다. 영상을 100x로 확대하여 촬영하였다.
도 6은 사이토킨 처리한 2차원 배양물 속에서의 세포 형태학을 나타낸다. 연골세포 성장의 디지털 영상을 RNA 제조, 단백질 추출 및 미세덩어리 배양을 위해 세포를 수거하기 직전에 세포가 대략 80 내지 100% 합치를 나타내는 시점(종균접종 후 8일째)에 촬영하였다. 영상을 100x로 확대하여 촬영하였다.

다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며 제한하는 것이 아니다.

실시예

실시예 1 - 감작 연골세포의 제조

실시예 1.1 - 세포 배양 및 처리

당해 연구에 사용된 세포는 시험관내에서 연장된 기간 동안 배양된 초대 인간 연골세포로부터 유래하였다. 이들 세포는 이들의 유래에도 불구하고 섬유모세포의 특징인 형태 및 표현형이 추정되어 왔다. 실험은 대략 7회 계대배양된 배양물로 수행하였다. 세포를 2개의 상이한 배양 형식: 단층 및 미세덩어리로 종균하였다. 배양 배지는 10% 태 송아지 혈청[제조원: 론자(Lonza)] 및 1% L-글루타민(제조원: 론자)이 보충된 DMEM(제조원: 론자)와 4.5 g/L 글루코스로 이루어진다. 세포를 37℃, 5% CO₂ 환경 속에서 처리 동안 항온처리하였다. 세포를 다수 농도의 TGF-β1[제조원: 알 앤드 디 시스템즈(R&D Systems)]에 배양 과정의 상이한 시점에서 몇개의 기간의 항온처리 시간 동안 노출시켰다.

실시예 1.2 - 단층 배양

연골세포를 5 x 10⁴ 세포/웰로 6-웰 콜라겐 피복된 플레이트[제조원: 바이오코트(BioCoat), 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)]내로 종균하였다. 세포를 TGF-β1을 사용하여 1OOng/mL의 농도로 종균하기 전 6시간 동안 감작화시키거나 TGF-β1과 함께 1ng/mL 농도에서 연구 기간 동안 항온처리하였다. 이러한 2회 처리 외에, TGF-β1을 생산하는 세포 및 인간 연골세포의 공-배양물을 1:3의 비로 제조하고, 5 x 10⁴ 세포/웰로 종균하고 3주 연구 기간 동안 유사하게 실험하였다. 세포를 RNA 제조 및 염색을 위해 매주 수거할 수 있었다.

보다 짧은 1주 연구를 또한 수행하였다. 연골세포는 3 x 10³ 세포/cm²에서 콜라겐 피복된 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 종균하였다. 4개의 처리 그룹은 TGF-β1 보충이 일어나는 상이한 시점: - 해당하는 주(week)의 긴 연구의 말기에 세포 수거하기 전 24시간, 48시간, 72시간, 및 2개의 36시간 간격에서 나타내었다.

실시예 1.3 - 미세덩어리 배양

세포 현탁액을 3 x 10⁵ 세포/15μL의 소적(droplet)의 종균 밀도를 위해 제조하였다. 세포 소적을 24-웰 콜라겐 피복된 플레이트[제조원: 바이오코트(BioCoat)]의 웰의 중심에 두었다. 1.5시간 동안 37℃에서 항온처리한 세포 덩어리에, 덩어리가 설정되면 1mL의 완전 배지를 보충하였다. 세포를 1Ong/mL 또는 50ng/mL의 TGF-β1으로 미세덩어리를 종균하기 전 6시간 또는 18시간 동안 처리하여 감작시켰다. 이들 4개의 처리 그룹 외에, 연골세포의 2개 그룹을 TGF-β1에 1ng/mL 또는 1Ong/mL의 농도에서 연구 동안 노출시켰다. 최종 실험 그룹은 3:1 비의 TGF-β1을 생산하는 세포 대 처리되지 않은 연골세포로 이루어진다. 덩어리를 4주까지 배양하였다.

실시예 1.4 - 알시안 블루 염색

알시안 블루 8GX라고도 부르는 알시안 블루(AB), 인그레인 블루(Ingrain blue) 1, 및 C.I. 74240은 구리를 함유하는 프탈로시아닌 염료이다. 당해 염료는 산 점액다당류 및 글리코사미노글리칸을 염색하며; 이 경우 이는 가장 광범위하게 사용된 양이온성 염료들 중의 하나이며; 염색된 부분은 청색 내지 청록색이다. 이는 H&E 염색 및 반 기슨(van Gieson) 염색 방법과 합해질 수 있다. 이는 정전기력에 의해 음성으로 하전된 거대분자와 결합한다. 결합된 염료를 선택적으로 세척하기 위해 사용된 전해질 농도에서 점진적인 증가는 중성, 황산염화된, 및 인산염화된 점액다당류를 선택적으로 확인한다.

알시안 블루 염색은 약한 세포 수거와 함께 일어나서 배양 동안 GAG 축적 수준을 측정한다. 모든 배양 배지는 웰로부터 흡인한 후 4mL의 PBS/웰[제조원: 셀그로(Cellgro), 메디아테크(Mediatech)]로 2회 세척한다. 이후에, 배양물을 10% 포르말린[제조원: 시그마(Sigma)], 24-웰 플레이트의 경우 500μl/웰 및 6-웰 플레이트의 경우 800μl/웰로 15분 동안 고정시켰다. 1mL 내지 2mL의 여과된 알시안 블루 8-GX[제조원: 시그마(Sigma), 3% 아세트산 중 1.0% pH 1.0)를 각각의 웰에 가하고 밤새 실온에서 염색하였다. 염색 기간 경과 후, 각각의 웰을 2 내지 4mL/웰의 3% 아세트산으로 2회 세정하고, 2 내지 4mL/웰의 PBS로 2회 세정하면서 각각의 세척 사이에 완전히 흡인시킨다. 세포를 염색 강도 및 세포 형태에 대해 관찰하였다. 결과는 도 1에 나타낸다.

실시예 1.5 - RT-PCR

RNA는 트리졸[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)]을 사용하는 페놀 클로로포름 추출 공정을 사용하여 매주 세포 수거물로부터 분리하였다. 분리된 RNA를 Superscript™ 역전사효소(제조원: 인비트로겐)를 사용하여 역전사시켜 각각의 세포 시료에 대해 cDNA 작제물을 획득하였다. 중합효소 연쇄 반응을 IDT에 의해 합성된 다음 프라이머를 사용하여 수행하였다:

콜라겐 IIα1 전방 프라이머 5 '-GACCTCGTGGCAGAGATGGAG-3' (서열 번호:1),

콜라겐 IIα1 역방 프라이머 5 '-AACCTCTGTGACCTTTGACACCAG-3' (서열 번호: 2),

콜라겐 Iα1 전방 프라이머 5 '-TGTGGCCCAGAAGAACTGGTACAT-3' (서열 번호: 3),

콜라겐 Iα1 역방 프라이머 5'-AAAGGAGCAGAAAGGGCAGCATTG-3'(서열 번호: 4),

아그레칸 전방 프라이머 5'-TTCAGTGGCCTACCAAGTGGCATA-3' (서열 번호: 5),

아그레칸 역방 프라이머 5'-ACATCACTGGTGGTGGTGGATTCT-3' (서열 번호: 6),

베타-카네닌 전방 프라이머 5'-TGGCCATCTTTAAGTCTGGAGGCA-3' (서열 번호: 7)

베타-카테닌 역방 프라이머 5' -GATTTGCGGGACAAAGGGCAAGAT-3'(서열 번호: 8)

다음 조건을 열순환기 속에서 PCR을 위해 사용하였다: 95℃에서 2분 동안 초기 변성, 이후 95℃에서 45초 동안 변성, 62.5℃에서 1분 동안 어닐링(annealing) 및, 72℃에서 1분 동안의 연장의 35주기. 모든 주기의 완료시 최종 연장 기간을 72℃에서 5분 동안 프로그램화하였다. 최종 PCR 생성물의 겔 전기영동을 대조군 베타-액틴에 대해 수행하여 TGF-β1 처리된 연골세포에 대한 표현형 유전자의 비교 수준을 측정하였다.

실시예 2 - 감작 연골세포의 추가의 제조

실시예 2.1 - 단층 세포 배양

2개 바이알의 hChonJ 계대배양 5(p5) 연골세포(2x1O⁶ 세포/웰)을 해동시키고 짝수개의 콜라겐 피복된 및 피복되지 않은 T-75 플라스크 내로 5x1O³ 세포/cm²의 세포 종균 밀도로 종균하였다. 세포를 초기에 완전 배지, 즉, 10% FBS(제조원: 론자, 제품 번호 14-507F) 및 1% L-글루타민(제조원: 론자, 제품 번호 17-605E)이 보충된 DMEM(론자, 제품 번호)을 사용하여 배양하였다.

실시예 2.2 - 사이토킨 처리

7개의 상이한 사이토킨 처리 그룹을 당해 연구에 사용하였다. 세포 종균 후 24시간 째에, 모든 플라스크내 배양 배지를 12mL의 사이토킨 보충된 배지로 교체하였다. 사이토킨 처리 그룹(표 1)은 다음과 같았다: 50ng/mL TGFβ1[제조원: 이바이오사이언스(eBioscience) 또는 프로모겐(Promogen)], 200ng/mL BMP-2(제조원: 이바이오사이언스) 및 15μg/mL 인슐린[제조원: 시그마 알드리히(Sigma Aldrich)], 200ng/mL BMP-2(제조원: 이바이오사이언스), 15μg/mL 인슐린(제조원: 시그마 알드리히), 및 10OnM 3,3',5-트리요오도-L-티로닌(T3)(제조원: 시그마 알드리히), 1Ong/mL FGF(제조원: 이바이오사이언스) 및 TGFβ1(제조원: 이바이오사이언스 또는 프로모겐), 및 20ng/mL TGFβ3(제조원: 시그마 알드리히). 콜라겐 피복된 세포의 2개의 T-75 플라스크 및 2개의 콜라겐 피복되지 않은 T-75 플라스크를 음성 처리 대조군, 12mL의 완전 DMEM에 대해 사용하였다. 각각의 처리 그룹에 대한 세포 배양 배지를 매 3 내지 4일마다 교체하였다. 도 2는 또한 사이토킨 처리한 2-차원 배양물에서 세포 성장률을 나타낸다. 각각의 사이토킨 처리 그룹으로부터 T-75 플라스크 속에서 배양된 세포를 합치상태에서 수거하고 계수하여 초기 세포 종균 수로부터 세포 성장률을 측정하였다.

비교 사이토킨 연구를 위한 처리 조건

사이토킨 그룹	약어	성분	농도
TGFβ1	TGF-b1_e	TGFβ1	50ng/mL
TGFβ1	TGF-b1_p	TGFβ1	50ng/mL
BMP2 & 인슐린	BI	BMP2	200ng/mL
BMP2 & 인슐린	BI	인슐린	15μg/mL
BMP2, 인슐린 & T3	BIT	BMP2	200ng/mL
		인슐린	15μg/mL
		T3	100nM
FGF & TGFβ1	FGF-TGF-b1_e	FGF	10ng/mL
FGF & TGFβ1	FGF-TGF-b1_e	TGFβ1	50ng/mL
FGF & TGFβ1	FGF-TGF-b1_p	FGF	10ng/mL
FGF & TGFβ1	FGF-TGF-b1_p	TGFβ1	50ng/mL
TGFβ3	TGF-b3	TGFβ3	20ng/mL
음성 대조군	φ	--	--

도 5는 사이토킨 처리한 2-차원 배양물에서 세포 형태를 나타낸다. 연골세포 성장의 디지털 영상을 대략 30 내지 50%의 세포 합치상태(confluence)를 나타내는 시점(종균 후 3일째)에 취하였다. 세포 분포, 세포 크기 및 형태에 있어서의 관찰 결과는 사이토킨 처리 그룹들 사이에서 변한다. 영상을 10Ox 확대로 촬영하였다.

도 6은 사이토킨 처리한 2-차원 배양물에서 세포 형태를 나타낸다. 연골세포 성장의 디지털 영상을 RNA 제조, 단백질 추출 및 미세덩어리 배양을 위해 세포를 수거하기 직전에 대략 80 내지 100%의 세포 합치 상태를 나타내는 시점(종균 후 8일째)에 촬영하였다. 영상을 10Ox의 확대로 촬영하였다.

실시예 2.3 - 제2 단층 팽창 배양을 위한 서브컬처(subculture)

합치상태에 이르면, 실시예 2.2에서 수득한 세포중 일부를 2mL/플라스크의 1x 트립신-베르센(EDTA)으로 3 내지 4분 동안 37℃에서 처리하였다. 세포를 현미경하에 10Ox에서 완전한 탈착의 확인을 위해 점검하였다. 8mL의 완전 배지를 각각의 플라스크에 가하여 트립신을 불활성화하였다. 30μL의 세포를 총 세포 현탁액으로부터 제거하고 30μL의 트립신 블루를 세포 계수를 위해 가하였다. 세포 농도를 계산한 후, 2.25x1O⁵ 세포를 각각의 플라스크에 제2 팽창을 위한 3x1O³ 세포/cm²의 최종 세포 종균 밀도를 위해 가하였다. 서브컬처된 세포를 실시예 2.2에서와 동일하게 세포의 사이토킨 처리를 수행하여 실시예 2.2에서 수득한 단층 배양물내 연결 조직 세포상의 사이토킨의 효과를 확인하였다(데이타는 나타내지 않음)

실시예 2.4 - 미세덩어리 배양 형식에서 세포의 종균

실시예 2.2에서 수득한 세포의 일부를 24웰의 콜라겐 피복되거나 피복되지 않은 배양 플레이트 속에 실시예 2.2에서 설정한 바와 같은 앞서의 사이토킨 처리 개략도에 따라 종균하였다. 1개 세트 수의 미세덩어리를 각각의 세포 현탁액에 대해 허용하고 10 내지 24 미세덩어리 사이로 측정하였다. 미세덩어리당 1.5 x 10⁵개 세포가 계산되었으며, 당해 용적을 세포 현탁액으로부터 제거하여 새로운 원심분리 튜브 내에 넣었다. 세포를 1500 rpm에서, 10℃로, 7분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡입하고 나머지 세포 펠렛을 완전 배지 속에 20μL/미세덩어리를 허용한 용적으로 재현탁시켰다. 미세덩어리를 웰의 벗겨진 표면에 20μL 용적(~1.5x10⁵세포)로 직접 피펫팅하고 37℃, 5% CO₂에서 대략 1시간 동안 항온처리하였다. 1시간의 항온처리 기간 후, 500μL의 배지, 조건화된 사이토킨 또는 음성 대조군 완전 배지를 각각의 웰에 가하였다. 미세덩어리를 7일 동안 배양한 후 RNA 및 단백질 성분을 위해 세포를 수거하고 알시안 염색하며 후속적으로 GAG 정량화하였다.

도 3은 미세덩어리 형성을 나타낸다. 미세덩어리를 1.5 x 10⁵ 세포/20 μl/덩어리에서 배양 플레이트의 표면에 배양 배지의 부재하에서 직접 플레이팅하였다. 세포를 1.5시간 동안 적절한 세포 부착이 일어나도록 항온처리하고, 0.5mL/웰의 완전 성장 배지를 가하였다. 세포를 7일의 기간 동안 3 내지 4일 째에 성장 배지로 1회 완전히 변화시키면서 배양하였다. 7일의 항온처리 기간 말기에, 미세덩어리를 1mL의 dPBS/웰로 2회 세척하고 10% 포르말린 용액으로 30분 동안 고정시켰다. 고정 용액을 제거하고 덩어리를 1N HCl 중의 500μL/웰의 1.0% 알시안 블루 8GX로 밤새 4℃에서 염색하였다. 알시안 블루 염색은, 상이한 사이토킨 조건에 노출된 연골세포의 미세덩어리 배양물내 글리코사미노글리칸(GAG)의 분포를 나타낸다.

실시예 2.5 - 세포 현탁액의 RNA 제조 및 단백질 추출

실시예 2.2에서 수득한 세포로부터의 나머지 세포 현탁액 용적을 동등하게 분할하고 측정된 용적을 사용하여, 제조 용적당 세포 수를 계산하였다. 세포 제조 현탁액을 1500rpm, 10℃에서 7분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 4mL의 PBS 배지로 세척하고 1회 이상 원심분리하였다. 최종 세척 용적을 흡인하고 세포 펠렛을 RNA 및 단백질 추출 목적을 위해 사용하였다. RNA 제조를 위해, 표준 페놀-클로로포름 추출 기술을 사용하였다. 단백질 추출을 위해, 세포를 RIPA 완충제(제조원: 시그마 알드리히)을 사용하여 용해(lysed)하고 액체 질소 속에 스냅(snap) 동결시켰다. RNA 제조 및 단백질 추출 및 분석을 실시예 2.3에 설정된 서브컬처물로부터의 세포를 사용하여 반복하였다.

실시예 2.6 - 미세덩어리의 RNA 제조 및 단백질 추출

1주 배양 기간 후, 미세덩어리 배양 플레이트를 항온처리기로부터 제거하고 동시에 RNA, 단백질, 및 알시안 블루 염색을 진행시켰다. 각각의 웰을 1mL의 dPBS/웰로 2회 부드럽게 세척하였다. 미세덩어리의 1/2을 표준 페놀 클로로포름 추출을 사용하여 RNA 제제 옆에 고정시켰다. 나머지 미세덩어리를 RIPA 용해 완충액을 사용하는 단백질 추출을 위해 사용하고 시료를 액체 질소 속에 스냅 동결시키고 -80℃에서 장기간 동안 저장하였다. 미세덩어리 종균을 또한 실시예 2.3의 서브컬처된 세포를 사용하여 수행하였다. RNA 및 단백질 추출 및 분석을 또한 상기 미세덩어리를 사용하여 반복하였으며 결과는, 실시예 2.2에서 수득한 단층 세포로부터 종균된 미세덩어리를 사용하여 수득한 결과를 확인하였다.

실시예 2.7 - 알시안 블루 염색

1.0% 알시안 블루-8GX 염색을 1N HCl 용액 속에서 제조하고 여과하여 입상체 잔해를 제거하였다. 3 내지 4개의 미세덩어리를 염색 목적으로만 보관하였다. 미세덩어리를 웰당 1mL의 dPBS로 2회 부드럽게 세척하였다. 최종 세척 용액을 각각의 웰로부터 완전히 제거하였다. 250μL/웰의 10% 포르말린을 가하여 각각의 미세덩어리를 고정시키고 플레이트를 실온에서 15 내지 30분 동안 항온처리하였다. 고정 용액을 각각의 웰로부터 완전 흡인하고, 500μL/웰의 1% 알시안 블루-8GX 염색을 가하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 염색 용액을 항온처리 기간 후 제거하고 미세덩어리를 1mL의 dPBS/웰로 2회 세척하였다. 미세덩어리의 디지털 영상을 촬영하여 각각의 웰내 염색의 분포를 기록하였다.

실시예 2.8 - GAG 정량화

250μL/웰의 4M 구아니딘 HCl(Gu-HCl)을 가하고 최소 1시간 내지 18시간 동안 밤새 4℃에서 항온처리하여 염색이 완전 추출되도록 하였다. 1OOμL의 용액을 각각의 웰로부터 제거하고 56OnM에서 관찰하기 위한 96 웰 검정 플레이트로 이전시켰다. 1OOμL의 4M Gu-HCl을 블랭크로 사용하였다. 도 4는 미세덩어리의 GAG 정량화를 나타낸다. 글리코사미노글리칸의 정량화는 프로테오글리칸 분자의 알시안 블루 결합된 GAG 쇄를 침전시키는 구아니딘 하이드로클로라이드(Gu-HCl)를 첨가하여 수행할 수 있다. 알시안 블루 염색된 미세덩어리를 250μl/웰의 4M Gu-HCl과 함께 항온처리하였다. 대부분의 염색이 미세덩어리로부터 추출된 경우, 용액을 제거하고 광학 밀도를 56OnM에서 측정하였다.

실시예 2.9 - 유전자 발현 분석

상보성 DNA(cDNA)를 mRNA(RNA 농도에 따라 0.5 내지 1μg)의 역전사에 의해 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 수득하였다. 역전사 반응을 사용하여 열순환기 속에서 20μL 용적으로 수행하였다. 몇개의 연골유형 유전자의 발현 수준(표 2)을 분석하였다. 유전자 발현 분석을 단층 세포 및 미세덩어리 세포 둘다에 대해서 뿐만 아니라, 서브컬처된 세포로부터 유래한 미세덩어리 및 서브컬처된 단층 세포 둘다에 대해 수행하고, 결과를 서로 확인하였다.

중합효소 연쇄 반응을 다음 조건으로 수행하였다. 95℃에서 2분 동안 초기 변성 후; 변성: 95℃에서 45초; 어닐링: 60℃에서 1분; 및 연장: 72℃에서 1분 5초. 상기 단계들을 35주기 동안 반복하였다. 35 주기의 말기에, 72℃에서 5분 동안 최종 연장을 수행하였다. 겔 전기영동을 4μL의 각각의 반응 시료를 사용하여 1μL의 겔 로딩 완충제(gel loading buffer)로 수행하고 1.5% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분 동안 작동시켰다. 겔을 UV 광하에 가시화하여 양성 밴드의 존재를 측정하였다.

본원에 인용된 참조 문헌 모두는, 이의 전문이 참조로 혼입된다.

본 발명의 특수 양태가 설명할 목적으로 상기 기술하였지만, 당해 분야의 숙련가에게는, 본 발명의 세부사항의 다수의 변형이 첨부된 특허청구범위에서 정의한 본 발명으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다.

<110> TISSUEGENE, INC. <120> PRIMED CELL THERAPY <130> IPA110370-US-D1 <150> US61/117,881 <151> 2008-11-25 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen IIalpha1 forward primer <400> 1 gacctcgtgg cagagatgga g 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen IIalpha1 reverse primer <400> 2 aacctctgtg acctttgaca ccag 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen Ialpha1 forward primer <400> 3 tgtggcccag aagaactggt acat 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen Ialpha1 reverse primer <400> 4 aaaggagcag aaagggcagc attg 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan forward primer <400> 5 ttcagtggcc taccaagtgg cata 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan reverse primer <400> 6 acatcactgg tggtggtgga ttct 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-catenin forward primer <400> 7 tggccatctt taagtctgga ggca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-catenin reverse primer <400> 8 gatttgcggg acaaagggca agat 24 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta Actin 5' <400> 9 atctggcacc acaccttcta caatgagctg cg 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta Actin 3' <400> 10 cgtcatactc ctgcttgctg atccacatct gc 32 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-Col2a1 F <400> 11 ccctgagtgg aagagtggag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-Col2a1 R <400> 12 gaggcgtgag gtcttctgtg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 for <400> 13 cccttcaacc tcccacacta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX9 rev <400> 14 ttaggatcat ctcggccatc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ColXa1 for <400> 15 gaaaatgacc aggtgtggct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ColXa1 rev <400> 16 cgtttttacg ttgctgctca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agg for <400> 17 tgcctcgaaa catcactgag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agg rev <400> 18 ctcttctacg gggacagcag 20

Claims

사이토킨 처리 및 2차원-단층 배양에 의해 제조된, 특정 유전자를 발현하도록 활성화되거나 변화된, 감작 연골 조직 세포 및 이의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 주사가능한 조성물로서,
상기 조성물은 이식되는, 3차원 스캐폴드, 골격, 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 배제한 것이고,
상기 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원이거나 또는 이의 조합인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TGF-β 상과 단백질은 TGF-베타1 단독, TGF-베타3 단독, BMP2 및 인슐린 또는 BMP2-인슐린 및 T3와 함께, 또는 FGF-TGF-베타1인 것인 조성물.
제1항에 있어서 세포가 인간 세포인 조성물.
(i) 연골 조직 세포를 2차원-단층에서 매트릭스 부존재하에, 사이토킨이 유효성분으로 본질적으로 구성되는 조성물과 함께 항온처리하여 감작 세포를 생성시키는 단계로서, 여기서 상기 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원이거나 또는 이의 조합인 것인 단계;
(ii) 상기 연골 조직 세포로부터 상기 사이토킨을 선택적으로 분리하는 단계; 및
(iii) 치료학적 유효량의 감작 세포를 포함하는 조성물을, 연골을 생성시키고자 하는 표적 관절 부위내로 주사하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 이식되는, 3차원 스캐폴드, 골격, 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 배제한 것이고, 여기서 상기 연골 조직 세포의 내인성으로 존재하는 형태는 표적 부위에서 감소되고, 상기 표적 부위에서 감작세포의 존재는 연골의 재생을 촉진하는, 인간을 제외한 포유동물내 표적 부위에서 연골의 재생을 자극하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 TGF-β 상과 단백질은 TGF-베타1 단독, TGF-베타3 단독, BMP2 및 인슐린 또는 BMP2-인슐린 및 T3와 함께, 또는 FGF-TGF-베타1인 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 연골세포가 초대 (primary) 인간 연골세포인 방법.
제4항에 있어서, 상기 연골 조직 세포가 1시간 내지 40시간 동안 항온처리되는 방법.
제4항에 있어서, 상기 사이토킨이 적어도 1 ng/ml의 양으로 존재하는 방법.
제1항에 있어서, 발현시키고자 하는 유전자로 형질감염시키거나 형질도입된 포유동물 세포의 제2 집단을 추가로 포함하는 조성물로서, 상기 유전자는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7인 조성물.
유리 연골을 생성하는 유효량의:
(a) 사이토킨 처리 및 2차원-단층 배양에 의해 제조된, 특정 유전자를 발현하도록 활성화되거나 변화된, 감작 연골세포의 제1 집단으로서, 상기 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원이거나 또는 이의 조합인 제1 집단;
(b) TGF-β 상과의 구성원을 인코딩하는 유전자로 형질감염되거나 형질도입된 연골세포의 제2 집단; 및
(c) 이의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 혼합된 세포 조성물로서,
여기서 상기 조성물은 주사가능한 조성물로,
상기 조성물은 이식되는, 3차원 스캐폴드, 골격, 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 배제한 것인 조성물.
제10항에 있어서, 상기 TGF-β 상과 단백질은 TGF-베타1 단독, TGF-베타3 단독, BMP2 및 인슐린 또는 BMP2-인슐린 및 T3와 함께, 또는 FGF-TGF-베타1인 것인 조성물.
제10항에 있어서, 상기 유전자가 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-9인 조성물.
제10항에 있어서, 상기 유전자로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 제2 집단이 조사(irradiating)되는 조성물.
제10항에 있어서, 세포의 제1 집단 및 세포의 제2 집단이 동일한 공급원 유기체로부터 유래하는 조성물.
제10항에 있어서, 세포의 제1 집단 및 세포의 제2 집단이 상이한 공급원 유기체로부터 유래하는 조성물.
(A)(i) 분리된 연골 조직 세포를, 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여, 2차원-단층 배양에 의해, 감작 세포의 제1 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 상기 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원이거나 또는 이의 조합인 단계, 및
(ii) 연골 조직 세포로부터 사이토킨을 선택적으로 분리하는 단계를 포함하는, 세포의 제1 집단을 생성하는 단계;
(B)(i) 프로모터에 작동적으로 연결된 치료학적 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합체 벡터를 생성시키는 단계로서, 여기서 상기 치료학적 단백질은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7인 단계, 및
(ii) 시험관내에서 세포의 집단을 상기 재조합체 벡터로 형질감염시키거나 형질도입시키는 단계를 포함하는, 세포의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
(C) 세포의 제1 및 제2 집단을 함께 혼합하여 혼합된 세포 조성물을 수득하는 단계를 포함하는, 혼합된 세포 조성물의 생성 방법으로서,
여기서 상기 조성물은 주사가능한 조성물로,
상기 조성물은 이식되는, 3차원 스캐폴드, 골격, 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 배제한 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 TGF-β 상과 단백질은 TGF-베타1 단독, TGF-베타3 단독, BMP2 및 인슐린 또는 BMP2-인슐린 및 T3와 함께, 또는 FGF-TGF-베타1인 것인 방법.
(A)(i) 연골 조직 세포를, 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여, 2차원-단층 배양에 의해, 감작 세포의 제1 집단을 생성시키는 단계로서, 여기서 상기 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원이거나 또는 이의 조합인 단계, 및
(ii) 연골 조직 세포로부터 사이토킨을 선택적으로 분리하는 단계를 포함하는, 세포의 제1 집단을 생성하는 단계;
(B)(i) 프로모터에 작동적으로 연결된 치료학적 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합체 벡터를 생성하는 단계로서, 여기서 상기 치료학적 단백질은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7인 단계, 및
(ii) 시험관내에서 세포의 집단을 상기 재조합체 벡터로 형질감염시키거나 형질도입시켜 세포의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
(C) 치료학적 유효량의 세포의 제1 및 제2 집단의 혼합물을 포함하는 조성물을, 연골을 생성시키고자 하는 표적 관절 부위내로 주사하는 단계를 포함하고, 여기서 연골 조직 세포의 내인성적으로 존재하는 형태가 표적 부위에서 감소되고, 표적 부위에서 세포의 혼합물의 존재가 연골의 재생을 자극하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물내 표적 세포에서 연골의 재생을 자극하는 방법으로서,
여기서 상기 조성물은 주사가능한 조성물로,
상기 조성물은 이식되는, 3차원 스캐폴드, 골격, 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 배제한 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 TGF-β 상과 단백질은 TGF-베타1 단독, TGF-베타3 단독, BMP2 및 인슐린 또는 BMP2-인슐린 및 T3와 함께, 또는 FGF-TGF-베타1인 것인 방법.
제18항에 있어서, 세포의 제1 및 제2 집단이 숙주 수용체와 관련하여 동계(syngeneic)인 방법.
제18항에 있어서, 세포의 제1 및 제2 집단이 숙주 수용체와 관련하여 동종이계(allogeneic)인 방법.
제18항에 있어서, 세포의 제1 및 제2 집단이 숙주 수용체와 관련하여 이종발생성(xenogeneic)인 방법.
제18항에 있어서, 상기 재조합체 벡터가 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터인 방법.
제18항에 있어서, 상기 세포가 이식 전에 저장되는 방법.
제24항에 있어서, 상기 세포가 이식 전에 동결보존 상태로 저장되는 방법.
(A)(i) 연골 조직 세포를, 사이토킨을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하여, 2차원-단층 배양에 의해, 감작 세포의 제1 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 상기 사이토킨은 TGF-β 상과에 속하는 구성원이거나 또는 이의 조합인 단계; 및
(ii) 연골 조직 세포로부터 사이토킨을 선택적으로 분리하는 단계를 포함하는, 세포의 제1 집단을 생성하는 단계;
(B)(i) 프로모터에 작동적으로 연결된 치료학적 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합체 벡터를 생성시키는 단계로서, 여기서 상기 치료학적 단백질은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 또는 BMP-7인 단계, 및
(ii) 시험관내에서 세포의 집단을 상기 재조합체 벡터로 형질감염시키거나 형질도입시켜 세포의 제2 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 세포의 제2 집단을 생성하는 단계; 및
(C) 세포의 제1 및 제2 집단의 혼합물 및, 인공적인 3차원 구조가 아닌 이의 약제학적으로 허용되는 담체의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을, 연골을 생성시키고자 하는 표적 관절 부위내의 포유동물의 관절 열극 (joint space)내로 주사하는 단계를 포함하는, 여기서 연골 조직 세포의 내인성적으로 존재하는 형태는 표적 부위에서 감소되고, 표적 부위에서 세포의 혼합물의 존재는 연골의 재생을 자극하여 골관절염을 치료하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 골관절염의 치료 방법으로서,
여기서 상기 조성물은 주사가능한 조성물로,
상기 조성물은 이식되는, 3차원 스캐폴드, 골격, 메쉬(mesh) 또는 펠트(felt) 구조를 배제한 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 TGF-β 상과 단백질은 TGF-베타1 단독, TGF-베타3 단독, BMP2 및 인슐린 또는 BMP2-인슐린 및 T3와 함께, 또는 FGF-TGF-베타1인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 감작 연골 세포는 대조군인 비처리 연골세포에 비해 배가시간(doubling time)이 감소된 것인 조성물.
제28항에 있어서, 배가시간이 대조군의 항온처리하지 않은 세포의 1/2인 조성물.
제28항에 있어서, 조성물이 3,3',5-트리요오도-L-티로닌을 추가로 포함하는 조성물.
제4항에 있어서, 대상체가 퇴행성 관절염을 앓는 것인 방법.
제4항에 있어서, 표적 부위가 척수 (spinal cord)인 방법.
제4항에 있어서, 상기 (i) 단계의 세포는 콜라겐으로 코팅한 용기에서 배양하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 사이토킨이 TGF-β1인 방법.